JP2023516354A - Pcr検出器及びその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1には、アッセイカートリッジを受容するように適合された診断アッセイシステムで使用するための改善したサブコンポーネント及び制御方法が開示されている。このようなサブコンポーネントは、光学検出/励起装置を含む。そのうち、励起ブロック910は、LED光源911を含み、LED光源911は、光を、フィルタとレンズ912を通過してからロッドレンズ913を通過するように導くことによって、所望の波長の光を反応容器33の所望の位置に照射する。光学検出ブロック920は、フォトダイオード検出器921を含み、該フォトダイオード検出器921は、反応容器33から発射した光を検出し、フォトダイオード検出器921によって受信される前に、発射した光は、ロッドレンズ923及びフィルタとレンズ922を通過することで、特定の波長の検出を確保する、特定の波長は、反応容器33内のターゲット分析物に対応する反応を指示することができる。それと共に、光学励起部材910と光学検出部材920は、平面反応容器33の受容に適する光学マウントに位置決めされる。光学励起部材910は、反応容器33の平坦表面の縁部(サブ表面)から励起エネルギーを発射するるように位置決めされ、そして光学検出部材920は、反応容器のメイン平坦表面に沿って位置決めされる。一態様において、光学励起部材と光学検出部材は、互いに直交する。その蛍光サンプリング原理は、従来のアルゴリズム(フィルタによるバンドパスフィルタリング)である。図7に示すように、特許文献2には、ハンドヘルド検出器用励光源が開示されている。それは、PCB基板と、発光ランプグループと、フィルタと、光ファイバカプラと、光ファイバと、光ファイバコンバイナと、光ファイバコリメータと、ハウジングと、底板と、を含み、そのうち、並列接続するように設けられる複数組の前記発光ランプグループから発射した波長の異なる光を前記フィルタによってノイズ除去した後、前記光ファイバカプラを通過して対応する前記光ファイバに入り、前記光ファイバコンバイナにおいて混合し、最終的に、前記光ファイバコリメータによってターゲットに対して蛍光励起を行い、その発光ランプグループは、フィルタを有する。
前記励起光源モジュールは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、検出部の下方に位置し、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、340-850nmであり、前記分光器は、前記励起光と前記発射光を検出できる。
光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
前記少なくとも1つの発光ダイオードは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がない。
に対して正規化処理を行う方法は、具体的には、
基底を差し引くこと:
を信号として、基底
を差し引くこと、
データを平滑化すること:データに対して平滑化処理を行うこと、
ベースライン(baseline)を決定すること:
を選択し、最小二乗法に基づいてベースラインとして直線をフィッティングすること、
データからベースラインを差し引き、
を得ることを含む。
三次差分のうち、「正負負負」→「正負負」→「正負」の規則に適合する最大点を選び出し、且つ対応するcycle一次差分が0よりも大きいことを求め、該座標+1は、二次差分最大値に対応する座標であり、その他、±1の計3点である。
に応じてフィッティングし、
を取ることを更に含む。
好ましくは、Ct値を求めることを更に含み、
Xで
フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ct値であり、更に、thresholdを得ることができ、
である。
Ct値≧38であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断する。
前記チップ装置は、反応チャンバを含み、反応チャンバ内に被検試料を収容でき、そのうち、被検試料は、蛍光標識を含有する核酸断片溶液であり、
前記励起光源モジュールは、励起光を発射するためのものであり、励起光源モジュールから発射した励起光は、反応チャンバに配置される前記被検試料に照射することができ、
前記励起光源モジュールは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、水平方向であり、その励起光の発射方向は、検出部に垂直であり、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
そのうち、本発明による前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、340-850nmであり、前記分光器は、励起光と発射光を検出する。
発光ダイオードは、PCB基板の一側に設けられ、各発光ダイオードの出力端に光ファイバカプラが設けられ、各光ファイバカプラは、それぞれ1つの光ファイバに結合され、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光を光ファイバに結合し、光ファイバによって伝送し、
光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
前記少なくとも1つの発光ダイオードは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がない。
元データ:
浜松製マイクロ分光器によって収集されたcycle 0~40蛍光強度。
基底を差し引く:
を信号として、基底
を差し引く。
データを平滑化する:
matlab内蔵関数smoothdata(パラメータmethod:sgolay、winsize:9)によってデータに対して平滑化処理を行い、
又は、Savitzky-Golay平滑アルゴリズム関数sg_smoothによって基底が差し引かされたデータ
を平滑化処理し、そのうち、パラメータは、ウィンドウサイズwinsize:3であり、次数degree:6である。
ベースラインを決定する:
(インデックスが選択可能である)を選択し、最小二乗法に基づいてベースラインとして直線をフィッティングする。
正規化:
データからベースラインを差し引く。
一次差分:
二次差分:
三次差分:
二次差分最大値を取る(二次差分の最大値を計算する。その三次差分を計算することで得られる)。
具体的には、三次差分のうち、「正負負負」又は「正負負」又は「正負」の規則に適合する最大点を選び出し(二次差分から最大点を選び出し、この点に対応する三次差分の前中後の各点を比較してもよい)、且つ対応するcycle一次差分が0よりも大きいことを求め(3つの規則に応じて順に選別し、1つの規則に応じる選別に成功すれば、次の規則に応じる選別を行わず、逆に選別を行う、該座標+1は、二次差分最大値に対応する座標であり、なお、二次差分最大値に対応する座標±1は、計3点である。 多項式フィッティングを行う:
上記3点を
に応じてフィッティングし、
を取り、
接線に対してCt値を求め、
Xで
フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ct値であり、更に、thresholdを得ることができ、
陰/陽性判別:
Ct値≧38であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断する。
描画:
に対してcycle数に応じて図11における曲線を描画する。
Claims (13)
- PCR検出器であって、励起光源モジュールと、チップ装置と、検出部と、を含み、前記励起光源モジュールは、所定の波長の励起光を前記チップ装置に発射し、増幅反応を行う時、前記検出部は、前記チップ装置の反応チャンバ側に設けられ、
前記チップ装置は、反応チャンバを含み、反応チャンバ内に被検試料を収容でき、そのうち、被検試料は、蛍光標識を含有する核酸断片溶液であり、
前記励起光源モジュールは、励起光を発射するためのものであり、励起光源モジュールから発射した励起光は、反応チャンバに配置される前記被検試料に照射することができ、
前記励起光源モジュールは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、検出部の下方に位置し、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、340-850nmであり、前記分光器は、前記励起光と前記発射光を検出できることを特徴とする、PCR検出器。 - 前記分光器は、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度を検出し、前記分光器は、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光及び励起光を被検試料に照射することによって引き起こされる発射光の周波数帯域と強度を検出することを特徴とする
請求項1に記載のPCR検出器。 - 前記少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域は少なくとも、励起光の第1周波数帯域と励起光の第2周波数帯域を含み、2つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる発射光の周波数帯域は少なくとも、発射光の第1周波数帯域と発射光の第2周波数帯域を含み、前記励起光の第1周波数帯域、励起光の第2周波数帯域、発射光の第1周波数帯域及び発射光の第2周波数帯域の2つずつには、互いに重なり合う周波数帯域範囲がないことを特徴とする
請求項2に記載のPCR検出器。 - 前記励起光源モジュールは、複数の光発射ユニットを含み、前記光発射ユニットは、発光ダイオード又は半導体レーザである
請求項3に記載のPCR検出器。 - 前記光発射ユニットは、LD光源又はLED光源である請求項4に記載のPCR検出器。
- 前記励起光源モジュールは、PCB基板と、光ファイバコンバイナと、少なくとも1つの発光ダイオードと、各発光ダイオードに対応する少なくとも1本の光ファイバとを含み、
発光ダイオードは、PCB基板の一側に設けられ、各発光ダイオードの出力端に光ファイバカプラが設けられ、各光ファイバカプラは、それぞれ1つの光ファイバに結合され、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光を光ファイバに結合し、光ファイバによって伝送し、
光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
前記少なくとも1つの発光ダイオードは、少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも2つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がないことを特徴とする
請求項4に記載のPCR検出器。 - 前記チップ装置は、試料投入層と、配管層とを含み、前記試料投入層、配管層は、上から下へ順に設けられ、前記試料投入層は、試料投入孔と、試薬管とを含み、前記試料投入孔は、試料を加えるためのものであり、前記試薬管は、buffer溶液を移送するためのものであり、前記配管層は、反応チャンバを含み、前記反応チャンバ内に凍結乾燥試薬が予め埋め込まれており、前記凍結乾燥試薬は、蛍光標識物質を含み、そのうち、試料投入孔内の試料とbuffer溶液を混合した後に反応チャンバに入ることによって、被検試料を得ることを特徴とする
請求項1に記載のPCR検出器。 - 前記蛍光標識物質は、fam、hex、cy5、cy5.5のうちの少なくとも2種であり、そのうち、cy5、cy5.5蛍光標識された被検試料は、同時に検出されることが不可能であり、fam、hex蛍光標識された被検試料も同時に検出されることが不可能である
請求項1に記載のPCR検出器。 - PCR検出方法であって、
分光器を用いて、cycle 0-40蛍光強度
を収集し、
であるステップS1と、
収集されたcycle 0-40蛍光強度
に対して正規化処理を行い、正規化処理後のデータ
を得て、
であり、
は、ベースライン(baseline)であり、
は、平滑化処理後のデータであるステップS2と、
ステップS2で得られた正規化処理後のデータ
に対して、一次差分、二次差分及び三次差分を順に行うステップS3と、
二次差分最大値を取り、三次差分のうち、「正負負負」又は「正負負」又は「正負」の規則に適合する最大点を選び出し、且つ対応するcycle一次差分が0よりも大きいことを求め、該座標+1は、二次差分最大値に対応する座標であり、その他、±1の計3点であるステップS4と、
多項式フィッティングを行い、上記ステップS4で得られた3点を二次関数
に応じてフィッティングし、
を取り、そのうち、aは、二次項係数であり、bは、一次項係数であり、cは、定数であるステップS5と、
接線に対してCt値を求め、Xで
フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ct値であり、更に、thresholdを得ることができるステップS6と、
;
陰/陽性判別:
Ct値≧38であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断するステップS6と、を含むことを特徴とする、PCR検出方法。 - 収集されたcycle 0-40蛍光強度
に対して正規化処理を行う方法は、具体的には、
基底を差し引くこと:
を信号として、基底
を差し引き、
であり、そのうち、
は、基底が差し引かされたデータであるステップS11と
データを平滑化すること:基底が差し引かされたデータ
に対して平滑化処理を行い、平滑化処理後のデータ
を得るステップS12と、
ベースラインを決定すること:
を選択し、最小二乗法に基づいてベースライン
として直線をフィッティングし、
であり、そのうち、
は、一次項係数であり、
は、定数項であるステップS13と、
データからベースラインを差し引き、
を得るステップS14と、を含むことを特徴とする
請求項9に記載のPCR検出方法。
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