JP2023516354A - Ｐｃｒ検出器及びその方法 - Google Patents

Ｐｃｒ検出器及びその方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023516354A
JP2023516354A JP2022552708A JP2022552708A JP2023516354A JP 2023516354 A JP2023516354 A JP 2023516354A JP 2022552708 A JP2022552708 A JP 2022552708A JP 2022552708 A JP2022552708 A JP 2022552708A JP 2023516354 A JP2023516354 A JP 2023516354A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
excitation light
light
optical fiber
light source
reaction chamber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2022552708A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7438580B2 (ja
Inventor
任魯風
蒋鵬▲チュン▼
范東雨
蔡亦梅
高静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Integrated Biosystems Co Ltd
Original Assignee
Integrated Biosystems Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Integrated Biosystems Co Ltd filed Critical Integrated Biosystems Co Ltd
Publication of JP2023516354A publication Critical patent/JP2023516354A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7438580B2 publication Critical patent/JP7438580B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6484—Optical fibres
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、ＰＣＲ検出器を提供し、ＰＣＲ検出技術分野に属し、励起光源モジュールと、チップ装置と、検出部と、を含み、反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、検出部の下方に位置し、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、３４０－８５０ｎｍであり、前記分光器は、前記励起光と前記発射光を検出する。分光器は、複数の異なるスペクトルを同時に検出できることによって、複数の蛍光標識の同時検出を実現させ、即ち、多種の異なる核酸を同時に検出することができる。【選択図】図５

Description

本発明は、ＰＣＲ検出分野に関し、具体的にはＰＣＲ検出器及びその方法に関する。
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ技術は、ＰＣＲ反応系に蛍光基を加え、蛍光信号の蓄積を利用してＰＣＲプロセス全体をモニタリングし、最後に、標準曲線を用いて未知のテンプレートを定量分析する方法である。
蛍光定量ＰＣＲ技術において、－Ｃｔ値という極めて重要な概念がある。Ｃは、Ｃｙｃｌｅを代表し、ｔは、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを代表し、Ｃｔ値の意味は、各反応管内の蛍光信号が所定の閾値に達したときに経験するサイクル数である。
特許文献１には、アッセイカートリッジを受容するように適合された診断アッセイシステムで使用するための改善したサブコンポーネント及び制御方法が開示されている。このようなサブコンポーネントは、光学検出／励起装置を含む。そのうち、励起ブロック９１０は、ＬＥＤ光源９１１を含み、ＬＥＤ光源９１１は、光を、フィルタとレンズ９１２を通過してからロッドレンズ９１３を通過するように導くことによって、所望の波長の光を反応容器３３の所望の位置に照射する。光学検出ブロック９２０は、フォトダイオード検出器９２１を含み、該フォトダイオード検出器９２１は、反応容器３３から発射した光を検出し、フォトダイオード検出器９２１によって受信される前に、発射した光は、ロッドレンズ９２３及びフィルタとレンズ９２２を通過することで、特定の波長の検出を確保する、特定の波長は、反応容器３３内のターゲット分析物に対応する反応を指示することができる。それと共に、光学励起部材９１０と光学検出部材９２０は、平面反応容器３３の受容に適する光学マウントに位置決めされる。光学励起部材９１０は、反応容器３３の平坦表面の縁部（サブ表面）から励起エネルギーを発射するるように位置決めされ、そして光学検出部材９２０は、反応容器のメイン平坦表面に沿って位置決めされる。一態様において、光学励起部材と光学検出部材は、互いに直交する。その蛍光サンプリング原理は、従来のアルゴリズム（フィルタによるバンドパスフィルタリング）である。図７に示すように、特許文献２には、ハンドヘルド検出器用励光源が開示されている。それは、ＰＣＢ基板と、発光ランプグループと、フィルタと、光ファイバカプラと、光ファイバと、光ファイバコンバイナと、光ファイバコリメータと、ハウジングと、底板と、を含み、そのうち、並列接続するように設けられる複数組の前記発光ランプグループから発射した波長の異なる光を前記フィルタによってノイズ除去した後、前記光ファイバカプラを通過して対応する前記光ファイバに入り、前記光ファイバコンバイナにおいて混合し、最終的に、前記光ファイバコリメータによってターゲットに対して蛍光励起を行い、その発光ランプグループは、フィルタを有する。
要するに、従来技術において、ターゲット分析物を検出するために、いずれも、励起光源と反射光源を使用した後、いずれもフィルタコンポーネントを利用してフィルタリング処理を行う必要があり、且つフォトダイオード検出器を用いて検出を行う。フィルタリング処理された発射光を検出器に入らせて検出を行う場合、多種の異なる発射光を同時に検出できず、１種の発射光をのみ検出できる。なお、検出時、反応チャンバ内への蛍光検出物質の分配は、不均一であるか、又は反応チャンバ内に分布し得ない現象が有り得る。
ＣＮ１０７９２３９２２Ａ ＣＮ１１１１５７４９７Ａ
従来技術に存在する上記問題を解決するために、本発明は、光の励起と光の発射の後にいずれもフィルタを用いることなく、分光器を用いて発射光に対して検出を行い、波長の異なる発射光を同時に検出することができるＰＣＲ検出器及びその方法を提供する。
本発明による具体的な技術的解決手段は、以下のとおりである。
一態様によれば、本発明は、ＰＣＲ検出器を提供する。前記ＰＣＲ検出器は、励起光源モジュールと、チップ装置と、検出部と、を含み、前記励起光源モジュールは、所定の波長の励起光を前記チップ装置に発射し、増幅反応を行う時、前記検出部は、前記チップ装置の反応チャンバ側に設けられ、 前記チップ装置は、反応チャンバを含み、反応チャンバ内に被検試料を収容でき、そのうち、被検試料は、蛍光標識を含有する核酸断片溶液であり、 前記励起光源モジュールは、励起光を発射するためのものであり、励起光源モジュールから発射した励起光は、反応チャンバに配置される前記被検試料に照射することができ、
前記励起光源モジュールは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、検出部の下方に位置し、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、３４０－８５０ｎｍであり、前記分光器は、前記励起光と前記発射光を検出できる。
好ましくは、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度を検出し、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光及び励起光を被検試料に照射することによって引き起こされる発射光の周波数帯域と強度を検出する。
好ましくは、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域は少なくとも、励起光の第１周波数帯域と励起光の第２周波数帯域を含み、２つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる発射光の周波数帯域は少なくとも、発射光の第１周波数帯域と発射光の第２周波数帯域を含み、前記励起光の第１周波数帯域、励起光の第２周波数帯域、発射光の第１周波数帯域及び発射光の第２周波数帯域の２つずつには、互いに重なり合う周波数帯域範囲がない。
好ましくは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の励起光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がなく、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる前記発射光の異なる発射光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がなく、各励起光周波数帯域及び励起光によって引き起こされる各発射光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がない。
好ましくは、前記励起光源モジュールは、複数の光発射ユニットを含み、前記光発射ユニットは、発光ダイオード又は半導体レーザである。
好ましくは、前記励起光源モジュールは、ＰＣＢ基板と、光ファイバコンバイナと、少なくとも１つの発光ダイオードと、各発光ダイオードに対応する少なくとも１本の光ファイバとを含み、 発光ダイオードは、ＰＣＢ基板の一側に設けられ、各発光ダイオードの出力端に光ファイバカプラが設けられ、各光ファイバカプラは、それぞれ１つの光ファイバに結合され、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光を光ファイバに結合し、光ファイバによって伝送し、
光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
前記少なくとも１つの発光ダイオードは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がない。
好ましくは、前記チップ装置は、試料投入層と、配管層とを含み、前記試料投入層、配管層は、上から下へ順に設けられ、前記試料投入層は、試料投入孔と、試薬管とを含み、前記試料投入孔は、試料を加えるためのものであり、前記試薬管は、ｂｕｆｆｅｒ溶液を移送するためのものであり、前記配管層は、反応チャンバを含み、前記反応チャンバ内に凍結乾燥試薬が予め埋め込まれており、前記凍結乾燥試薬は、蛍光標識物質を含み、そのうち、試料投入孔内の試料とｂｕｆｆｅｒ溶液を混合した後に反応チャンバに入ることによって、被検試料を得る。
好ましくは、前記蛍光標識物質は、ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５のうちの少なくとも２種であり、そのうち、ｃｙ５、ｃｙ５．５蛍光標識された被検試料は、同時に検出されることが不可能であり、ｆａｍ、ｈｅｘ蛍光標識された被検試料も同時に検出されることが不可能である。
好ましくは、前記励起光源モジュールは、光源回転装置を更に含み、前記光源回転装置は、複数の光発射ユニットが設けられているＰＣＢ基板を回転させるためのものであり、即ち、本発明のＰＣＢ基板に光源回転装置を設けることで、励起光によって引き起こされる発射光のスポットを反応チャンバに均一に分布させ、検出部による検出をより正確にすることができる。
好ましくは、光発射ユニットは、ＬＤ光源又はＬＥＤ光源である。
好ましくは、被検試料の蛍光標識は、ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５であり、そのうち、ＬＤ光源である時、ｆａｍとｃｙ５．５蛍光標識された被検試料を同時に検出できる。
別の態様によれば、本発明は、ＰＣＲ検出方法を提供する。前記方法は、
分光器を用いてｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
Figure 2023516354000002
を収集し、
Figure 2023516354000003
であることを含む。
好ましくは、収集されたｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
Figure 2023516354000004
に対して正規化処理を行い、
Figure 2023516354000005
を得ることを更に含む。
好ましくは、収集されたｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
Figure 2023516354000006
に対して正規化処理を行う方法は、具体的には、
基底を差し引くこと：
Figure 2023516354000007
を信号として、基底
Figure 2023516354000008
を差し引くこと、
Figure 2023516354000009
データを平滑化すること：データに対して平滑化処理を行うこと、
Figure 2023516354000010
ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を決定すること：
Figure 2023516354000011
を選択し、最小二乗法に基づいてベースラインとして直線をフィッティングすること、
Figure 2023516354000012
データからベースラインを差し引き、
Figure 2023516354000013
を得ることを含む。
好ましくは、正規化処理後に得られた
Figure 2023516354000014
に対して一次差分、二次差分及び三次差分処理を行うことを更に含み、それぞれ、
一次差分：
Figure 2023516354000015
二次差分：
Figure 2023516354000016
三次差分：
Figure 2023516354000017
である。
好ましくは、二次差分最大値を取ることを更に含み、具体的には、
三次差分のうち、「正負負負」→「正負負」→「正負」の規則に適合する最大点を選び出し、且つ対応するｃｙｃｌｅ一次差分が０よりも大きいことを求め、該座標＋１は、二次差分最大値に対応する座標であり、その他、±１の計３点である。
好ましくは、多項式フィッティングを行い、上記３点を
Figure 2023516354000018
に応じてフィッティングし、
Figure 2023516354000019
を取ることを更に含む。
好ましくは、Ｃｔ値を求めることを更に含み、
Ｘで
Figure 2023516354000020
フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ｃｔ値であり、更に、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを得ることができ、
Figure 2023516354000021
である。
好ましくは、陰／陽性判別を更に含み、
Ｃｔ値≧３８であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断する。
好ましくは、描画を更に含み、
Figure 2023516354000022
に対してｃｙｃｌｅ数に応じて曲線を描画する。
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。
（１）本発明による検出器は、フィルタを用いることなく、分光器を用い、構造の構成を簡略化し、部品を減少させる。
（２）本発明による分光器は、複数の異なるスペクトルを同時に検出できることによって、複数の蛍光標識の同時検出を実現させ、即ち、多種の異なる核酸を同時に検出することができ、検出効率を向上させる。フィルタを用いて一度に１つの発射光しか検出できないという制約を打破しており、且つ本発明による発射光の方向は、検出部に垂直であり、励起光が強すぎることによる露光過度の現象を避ける。
（３）本発明による検出方法、例えば、Ｃｔ値を求める方法において、方法が簡単であり、正確率が高いことを確保し、且つ陰性と陽性の判別の信頼度が高い。
（４）本発明による励起光モジュールに光源回転装置が設けられ、光源回転装置は、ＰＣＢ基板における光発射ユニットを動かして回転させ、発射光のスポットの割り当てをより均一にする。
本発明の検出部によって検出された蛍光スペクトルである。 本発明によるシングルチャネルｆａｍ増幅前後の蛍光値－発射ピークの比較図である。 本発明によるｆａｍチャネル蛍光値と温度サイクルの概略図である。 本発明によるｆａｍチャネルに対してｃｙｃｌｅに応じて発射ピーク蛍光値を取る曲線である。 本発明による光源－チップ－分光器の構造図である。 本発明による光源－チップ－分光器の光路図である。 従来技術による励起光源モジュールの構造概略図である。 本発明によるチップ装置の構造概略図である。 本発明による励起光源モジュール全体の試料投入層の構造概略図である。 本発明の実施例による励起光源モジュール全体の試料投入層の配管層の構造概略図である。 本発明の実施例で得られたＣｔ値である。 本発明による発射光のスポットにおける蛍光標識物質の分布状況である。 本発明による光源回転装置が調整された後の蛍光標識物質の、発射光のスポットにおける分布状況である。
以下、図面を参照しながら、本発明によるＰＣＲ検出器及びその方法を具体的に説明する。
本発明は、ＰＣＲ検出器を提供する。前記ＰＣＲ検出器は、励起光源モジュールと、チップと、検出部と、を含み、前記励起光源モジュールは、所定の波長の励起光を前記チップ装置に発射し、増幅反応を行う時、前記検出部は、前記チップ装置の反応チャンバの上方に設けられ、
前記チップ装置は、反応チャンバを含み、反応チャンバ内に被検試料を収容でき、そのうち、被検試料は、蛍光標識を含有する核酸断片溶液であり、
前記励起光源モジュールは、励起光を発射するためのものであり、励起光源モジュールから発射した励起光は、反応チャンバに配置される前記被検試料に照射することができ、
前記励起光源モジュールは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、水平方向であり、その励起光の発射方向は、検出部に垂直であり、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
そのうち、本発明による前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、３４０－８５０ｎｍであり、前記分光器は、励起光と発射光を検出する。
前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度を検出し、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度、及び引き起こされる発射光の周波数帯域と強度を検出する。
図１に示すように、図１は、本発明において分光器によって蛍光標識物質Ｆａｍとｃｙ５．５の二つのチャネルに対して同時に検出を行った結果の概略図である。そのうち、図１におけるＥＸ１は、ｆａｍ励起光のピーク値であり、ＥＭ１は、ｆａｍ発射光のピーク値であり、ＥＸ１は、ｃｙ５．５励起光のピーク値であり、ＥＭ１は、ｃｙ５．５発射光のピーク値である。２つの異なる周波数帯域の励起光は、励起光の第１周波数帯域と励起光の第２周波数帯域を含み、前記励起光の第１周波数帯域、励起光の第２周波数帯域、発射光の第１周波数帯域及び発射光の第２周波数帯域という周波数帯域は、互いに重なり合わないか又は部分的に重なり合う。即ち、分光器は、ｆａｍ励起光、ｆａｍ発射光、ｃｙ５．５励起光及びｃｙ５．５発射光を同時に検出することができ、そのうち、蛍光標識物質は、ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５などであってもよい。下記表に示すように、そのうち、光源は、ＬＤ光源である。ＬＤ光源である時、ｆａｍとｃｙ５．５蛍光標識された被検試料を同時に検出することができ、ｃｙ５、ｃｙ５．５蛍光標識された被検試料は、同時に検出されることが不可能であり、ｆａｍ、 ｈｅｘ蛍光標識された被検試料も同時に検出されることが不可能である。
そのうち、ｆａｍとｃｙ５．５蛍光標識された被検試料について、ｆａｍ蛍光標識された励起波長は、４９４ｎｍであり、発射波長は、５１８ｎｍであり、ｃｙ５．５蛍光標識された励起波長は、６７５ｎｍであり、発射波長は、６９５ｎｍであり、即ち、該ｆａｍ蛍光標識された励起波長及び発射波長と、ｃｙ５．５蛍光標識された励起波長及び発射波長とは、完全に重なり合う周波数帯域を有しない。
例えば、励起光の第１周波数帯域範囲は、４５０－４８０ｎｍであるが、励起光の第２周波数帯域範囲は、５４０－５６０ｎｍであり、即ち、励起光の第１周波数帯域範囲と励起光の第２周波数帯域範囲は、全く重なり合わない周波数帯域範囲である。
励起光の第１周波数帯域範囲は、５２０－５５０ｎｍであるが、励起光の第２周波数帯域範囲は、５４０－５６０ｎｍであり、即ち、励起光の第１周波数帯域範囲と励起光の第２周波数帯域範囲は、部分的に重なり合わない周波数帯域範囲である。
そのうち、本発明による励起光光源がＬＤ光源であってもよい場合の波長、蛍光標識物質ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５の励起波長及び発射波長のリストは、下記表１に示すとおりである。
表１は、ＬＤ光源の波長、蛍光標識物質ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５の励起波長と発射波長のリストである。
Figure 2023516354000023
好ましい実施形態として、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度を検出し、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光及び励起光を検出試料に照射することによって引き起こされる発射光の周波数帯域と強度を検出する。
前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域は少なくとも、励起光の第１周波数帯域と励起光の第２周波数帯域を含み、２つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる発射光の周波数帯域は少なくとも、発射光の第１周波数帯域と発射光の第２周波数帯域を含み、前記励起光の第１周波数帯域、励起光の第２周波数帯域、発射光の第１周波数帯域及び発射光の第２周波数帯域の２つずつには、互いに重なり合う周波数帯域範囲がない。
少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の励起光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がなく、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる前記発射光の異なる発射光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がなく、各励起光周波数帯域及び励起光によって引き起こされる各発射光周波数帯域には、互いに重なり合う周波数帯域範囲がない。
好ましい実施形態として、本発明による前記チップ装置は、試料投入層と、配管層とを含み、前記試料投入層、配管層は、上から下へ順に設けられ、前記試料投入層は、試料投入孔と、試薬管とを含み、前記試料投入孔は、試料を加えるためのものであり、前記試薬管は、ｂｕｆｆｅｒ溶液を移送するためのものであり、前記配管層は、反応チャンバを含み、前記反応チャンバ内に凍結乾燥試薬が予め埋め込まれており、前記凍結乾燥試薬は、蛍光標識物質を含み、そのうち、試料投入孔内の試料とｂｕｆｆｅｒ溶液を混合した後に反応チャンバに入ることによって、被検試料を得る。そのうち、ｂｕｆｆｅｒ溶液は、緩衝溶液であり、緩衝溶液は、弱酸及びその塩、弱塩基及びその塩からなる混合溶液であり、強酸又は強塩基を添加することによる溶液中の酸塩基度への影響をある程度相殺、緩和することができ、溶液のｐＨ値を比較的安定に保つことができる。
好ましい実施形態として、本発明による励起光源モジュールは、光源回転装置を更に含み、前記光源回転装置は、複数の光発射ユニットが設けられているＰＣＢ基板を回転させるためのものであり、即ち、本発明のＰＣＢ基板に光源回転装置を設けることで、励起光によって引き起こされる発射光のスポットを反応チャンバに均一に分布させ、検出部による検出をより正確にすることができる。
図５を参照すると、図５は、本発明の実施例の光源－チップ－分光器の光路図の概略図である。本実施例のシステムは、チップ装置３０と、励起光モジュール６と、温度制御モジュール４と、検出部５とを含み、前記励起光モジュール６は、所定の波長の励起光を前記チップ装置に発射し、反応が発生した後、蛍光検出部５によって蛍光情報を取得して検出を完了し、前記温度制御モジュール４は、前記チップ装置内の温度を制御し、チップ装置内の試薬を最適な反応状態に達させる。本実施例において、増幅反応を行う時、前記検出部５は、前記チップ装置の反応チャンバの上方に設けられる。
図６に示すように、本発明の実施例による発射光検出方法に用いられる装置は、励起光源モジュール６と、被検試料２１と、検出部５とを含み、光発射ユニットは、前記被検試料２１に照射し、前記被検試料２１を励起し、前記検出部５を、前記被検試料から発生した発射光を検出するようにするために用いられ、前記被検試料２１は、蛍光基を含み、励起光による励起で発射光を生成するために用いられ、前記検出部は、前記発射光の光路に設けられ、前記発射光を捕捉して検出するために用いられ、具体的には、図６に光路図が示されるが、励起光の光路と発射光の光路を異なる矢印で表すことで、二種の光が異なることを示す。
具体的には、当業者であれば理解できるように、検出部６の役割は、発射光を捕捉して検出することであり、実際の応用プロセスにおいて、分光器は、蛍光分光器であってもよく、それは、複数の発射光と励起光を同時に読み取ることを許容し、それによって検出を行うことができる。そのうち、本発明による分光器は、フィルタを含まない。従って、複数の異なる周波数帯域の励起光と励起光によって引き起こされる発射光を同時に検出することができる。例えば、分光器は、浜松製Ｃ１２８８９ＭＡであってもよい。
好ましい実施形態として、前記励起光源モジュールは、複数の光発射ユニットを含み、前記光発射ユニットは、発光ダイオード又は半導体レーザである。
前記励起光源モジュールは、ＰＣＢ基板と、光ファイバコンバイナと、少なくとも１つの発光ダイオードと、各発光ダイオードに対応する少なくとも１本の光ファイバとを含み、
発光ダイオードは、ＰＣＢ基板の一側に設けられ、各発光ダイオードの出力端に光ファイバカプラが設けられ、各光ファイバカプラは、それぞれ１つの光ファイバに結合され、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光を光ファイバに結合し、光ファイバによって伝送し、
光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
前記少なくとも１つの発光ダイオードは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がない。
具体的には、図７に示すように、本発明と従来技術の励起光源モジュールの相違点は、本発明による励起光源モジュールがフィルタ６３を含まないが、従来技術における励起光源モジュールがフィルタ６３を含まなければならないことである。具体的には、図７に示すように、本発明による光学励起部材は、励起光源モジュールを含み、励起光モジュール６として、体積が小さい発光モジュールを用いる。スイッチを用いることで、励起光源モジュールにおける励起光源に対して切り替えを行い、波長の異なる励起光を生成する。励起光モジュール６は、励起光源を載せるためのＰＣＢ基板６１を含み、この励起光源は、例えば、ＬＥＤ光源又はＬＤ光源であり、他の光源であってもよく、ＬＥＤ光源は、ＰＣＢ基板の一側に設けられる。実施例において、ＬＥＤ光源は、設けられる複数のＬＥＤランプ６２を含み、各ＬＥＤランプのフロントに１つの光ファイバカプラ６４が設けられ、各光ファイバカプラ６４はそれぞれ光ファイバ６５に結合され、光ファイバカプラ６４によって、対応する波長の励起光を光ファイルに結合し、光ファイルによって伝送する。光ファイバコンバイナ６６を更に含み、それは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナ６６の出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータ６７が更に設けられる。
好ましい実施形態として、本発明による前記励起光源モジュールは、光源回転装置を更に含み、前記光源回転装置は、複数の光発射ユニットが設けられているＰＣＢ基板を回転させるためのものであり、即ち、光源回転装置は、ＰＣＢ基板を回転させることによって、光発射ユニットであるＬＥＤ光源又はＬＤ光源を動かして回転させることができ、即ち、本発明のＰＣＢ基板に光源回転装置を設けることで、励起光によって引き起こされる発射光のスポットを反応チャンバに均一に分布させ、検出部による検出をより正確にすることができる。
そのうち、図１２－１３に示すように、図１２は、本発明による励起光源モジュールが回転していない場合、即ち、調整されていない場合、反応チャンバ１１２における蛍光標識物質の分布状況であり、即ち、分布が不均一であり、ひいては反応チャンバに分布できないか又は蛍光標識物質が反応チャンバに分布していない。図１２に示すように、図１３は、本発明による光源回転装置が調整された後の蛍光標識物質の、反応チャンバ１１２における分布状況である。光源回転装置が調整された後、反応チャンバ１１２における蛍光標識物質の分布状況が均一であり、且つ同一の反応チャンバに分布することができるため、図１３に示すように、従来技術における分布が不均一であるという技術的課題を解決する。
励起光源モジュールの作動プロセスは、以下のとおりである。ＬＥＤランプ６２を起動し、ＬＥＤ光源を発し、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光源を光ファイバに導入し、複数の光ファイバを光ファイバコンバイナ６６によって収束し、そのうち、伝達されている励起光源を一つにまとめ、最終的に、光ファイバコリメータによって、伝送光をコリメート励起光に変換してターゲットに照射し、検出を行う。そのうち、ＬＥＤランプは、複数であり、波長の異なる励起光を同時に発することができ、且つフィルタを必要としない。本発明において、分光器を用いることで、波長の異なる発射光を認識することができるため、フィルタを必要としない。
そのうち、図８に示すように、本発明による反応器は、チップ装置であり、具体的には、本発明のチップ装置は、最上端に設けられる試料投入層３と、試料投入層３の下側に設けられるガスケット２と、ガスケット２の下側に設けられる配管層１０１と、最下側に設けられる封止膜１０４とを含み、そのうち、前記試料投入層３の上側に、チップ内に試料を加えるための試料投入孔３０２が設けられ、チップ内に注入された試料に対して、抽出、精製、増幅反応を行う。そのうち、本実施例の試料投入層と配管層は、ステー３０４を介して、配管層１０１の側部に設けられるストッパ１０６に可動に接続され、これに対応して、ストッパ１０６の内側に第１スロット１０７が設けられ、第１スロットは、ステーを介して互いに嵌合されて接続され、試料投入層と配管層との相対的位置の切り替えと固定を実現させる。そのうち、封止膜が配管層１０１の下側に貼り付けられることで、封止を実現させる。
本発明の第１スロット１０７の下側のストッパの側面に第２スロット１０９が更に設けられ、これに対応して、ガスケット２の側壁に第２ステー（図示されず）が更に設けられ、第２ステーと第２スロットが互いに嵌合されて接続されることで、ガスケット２と配管層１０１との摺動可能な接続を実現させ、両者の相対的位置の切り替え及び固定を実現させることができる。本発明の実施例のガスケット２の下側に第１スライドレール２０２が更に設けられ、これに対応して、配管層１０１の上側面には、第２シュート１０８が設けられ、第１スライドレール２０２と第２シュート１０８との嵌合接続によって、ガスケットと配管層１０１との摺動可能な接続を実現させ、両者の相対的位置の切り替え及び固定を実現させることができる。本実施例の第２シュート１０８は、配管層におけるストッパ１０６の内側に設けられる。前記ガスケット２の端部に、複数の凹部と凸部が交互に設けられ、そのうち、前記第１スライドレール２０２は、最外側の凸部の底面に設けられる。
図８に示すように、本発明の試料投入孔に、封止を行うための試料投入孔蓋３０３が設けられる。試料投入層と配管層にバックル構造が更に設けられ、試料投入層の一側に第１バックル３０１が設けられ、第１バックル３０１の下側突出端は、前記試料投入層の底端から突出する。試料投入層と配管層を嵌合して取り付けた後、第１バックルを介して配管層の側面に係合接続することで、試料投入層と配管層の分離を防止する。本実施例の配管層に、配管に試料及び反応試薬をそれぞれ注入するための２つの第１単一弁１０２が設けられ、配管層に、試薬及び試料を注入するための二重弁１０３が更に設けられ、二重弁１０３は、配管を介して反応チャンバ１１２に連通し、図５に示すように、前記ガスケット２の両側に、チップ装置に対する抽出を容易にするためのグリップ２０１が更に設けられる。本発明の実施例において、前記反応チャンバは、配管層の縁に設けられ、且つ反応チャンバは、半楕円形構造であり、反応試薬を反応させることができるだけでなく、使用時、突出した半楕円形構造によって容易な位置決め及び取り付けを実現させることもできる。
図８に示すように、本発明の配管層に一列のスパイク１０５が設けられ、ガスケットを抜き取った後、スパイクと試料投入層内の試薬を連通させ、試薬中に標識された蛍光配列と対応する位置の核酸スパイクとの相補的整合を起こさせると、最も蛍光強度の強いプローブの位置を特定することにより、配列が完全に相補的な１組のプローブ配列を得る。前記スパイクの外側にバッフルが更に設けられ、このバッフルは、試料投入層と配管層との嵌合に際して遮断及び位置決めの役目を果たす。
具体的には、本発明の実施例において、試料投入状態では、前記試料投入層内に複数組の試薬管が設けられ、前記試料投入層３は、それにおけるステー３０４を介して第１スロット１０７に係合接続され、初期取り付け状態では、試料投入層３は、上から下へ配管層１０１に嵌合し、ガスケット２によって、スパイクと試薬管内の試薬を仕切り、運搬プロセスにおける振動によるスパイクと試薬の混合を防止し、突き刺しを避ける。試験を行う必要がある場合、ガスケット２を第２シュート１０８に沿って外へ抜き取る。ガスケット２を第２シュートに沿って外へ抜き取った後、試料投入層３を下へ押圧し、試料投入層におけるステー３０４と第２スロット１０９を係合接続させる。この時、配管層に設けられるスパイクと試料投入層の試薬が混合され、試薬を配管層に導入して測定を行う。
具体的には、本発明は、ガスケット構造を設けることとで、チップ装置が試薬を貯蔵して運搬するプロセスにおいて、完璧に保存することができ、使用時、ガスケットを抜き取れば、試薬を配管層に導入することができる。
図９を参照すると、図９は、本発明の実施例の試料投入層の構造概略図である。本実施例の試料投入孔３０２の下方は、試料投入チャンバであり、試料投入チャンバは、試薬が収容されている試薬管に接続可能であり、試料投入チャンバの下部に試薬出口３１２が設けられ、試薬出口３１２と試料投入チャンバとの間に、封止を行うための封止構造が設けられる。前記試料投入チャンバの一側に加圧構造が更に設けられ、この加圧構造は、管壁３０５を含み、管壁の内部にピストン３０８が設けられ、ピストン３０８は、試料投入チャンバへ移動し、そのうちの試薬を出口へ流出するように動かす。前記ピストン３０８のピストンロッドの端部に、封止を行うためのシールリング３１１が設けられる。
図９に示すように、本実施例のピストンロッドにナット３０７が更に設けられ、ネット３０７とのネジ接続によって、相対的回転運動を実現させる。これに対応して、ピストンロッドの一端に、出力構造、例えば、エアシリンダ、油圧シリンダが設けられる。出力構造、例えば、モータ、スクリューを回転することでピストンロッドに接続してもよい。この時、ピストンロッドは、回転運動を行い、試薬を試薬出口へ流出するように動けばよい。これに対応して、ナットの外側にガイドスリーブ３０６が外嵌され、管壁の内側に、ガイドスリーブ３０６に対して位置決め及び固定を行うための対応するショルダが設けられる。ガイドスリーブ３０６の両端の外側に、対応するガイドスリーブ３０６を係止するための係止環３１４が更に設けられる。ガイドスリーブ３０６の外側に、ピストンロッド、ナット及びガイドスリーブに対して保護を行うための保護カバー３０９が更に設けられる。配管層に対して試薬注射を行う時、ピストンが試料投入チャンバへ移動することで、そのうちの圧力を増加させ、試薬を出口へ流動するように動かし、試薬の注入を実現させる。実際の応用プロセスにおいて、試薬の注入に適合し、試薬注入効率を向上させるために、他の試薬管による外への吸引によって、現在の実際の管の押し上げに合わせて、試薬の効率的な注入を実現させることもできる。本発明の実施例において、複数組の試薬管が設けられる。本実施例において、５組の試薬管を設けることで、配管層に試薬を加え、試薬は、溶解液、溶出液又は洗浄液などであってもよく、使用効率を大幅に向上させることができる。
図９に示すように、試料投入層の下方に第２バックル３１０が設けられ、第２バックルは、第１バックルに対向する１つの側面に設けられ、試料投入層の摺動を防止する。
図１０を参照すると、図１０は、本発明の実施例による配管層の構造概略図である。本実施例の配管層に前記反応チャンバ１１２、第１緩衝チャンバ１１０、第２緩衝チャンバ１１１及び試料を精製するための精製チャンバ１１４が設けられ、そのうち、二重弁の第１端は、第１配管１１８、第２配管１１５を介して精製チャンバ１１４に接続され、二重弁の第２端は、第２緩衝チャンバ１１１に連通し、第２緩衝チャンバ１１１は、配管を介して第１緩衝チャンバ１１０に接続され、第１緩衝チャンバと第２緩衝チャンバとの間の配管に配管分岐が更に設けられ、該配管分岐に第２単一弁が設けられ、該配管分岐の他端は、前記精製チャンバ１１４に接続され、第１緩衝チャンバは、第３配管１１６、第４配管１１７を介して精製チャンバ１１４に接続され、配管層に、接続するための複数の接続孔１１９が更に設けられる。
具体的には、前記第１配管１１８は、縦方向配管と横方向配管を含み、溶出後の核酸物質を増幅チャンバに入るように長距離で輸送し、第２配管１１５は、縦方向配管と横方向配管を含み、その一端は、精製チャンバに接続され、他端は、第１配管と一体に接続される。
具体的には、前記第３配管１１６は、多方向屈曲管であり、その一端は、第１緩衝チャンバに接続され、他端は、第１給液口に接続され、前記第４配管１１７の一端は、第１給液口に接続され、他端は、精製チャンバに接続され、第４配管１１７に、試料投入口と第１単一弁が更に設けられる。
具体的には、試料投入口は、試料を加えるために用いられ、第１給液口は、溶解液を加えるために用いられ、続いて、第１単一弁を開放し、試料と溶解液を混合反応させ、混合プロセスにおいて、試料口に接続されたピストンロッドと第１給液口に接続されたピストンロッドとを用いて、吸引操作を行うことにより、試料と溶解液とを十分に混合し、第１反応物を生成し、第１反応物は、液体であり、前記液体は、第４配管１１７によって前記精製チャンバに入り、チャンバ内に配置される磁気ビーズを精製し、精製チャンバは、核酸抽出と精製を行うための反応チャンバである。続いて、第１単一弁を閉鎖し、第２単一弁を開放し、前記第２給液口に第２試薬を注入し、第２試薬は、洗浄液であり、前記第２試薬は、第２試薬口に接続される配管によって前記精製チャンバ内に入り、精製チャンバ内の物質を洗浄し、第３給液口に第３試薬を注入し、第３試薬は、洗浄液であり、前記第３試薬は、それに接続される前記配管によって前記精製チャンバ内に入り、精製チャンバ内の核酸物質に対して再洗浄を行い、第４給液口に第４試薬を注入し、第４試薬は、溶出液であり、前記第４試薬は、それに接続される配管によって前記精製チャンバ内に入り、精製チャンバ内の核酸物質を、それに設けられる磁気ビーズから溶出し、核酸物質を得て、前記核酸物質を第１配管１１５と第２配管１１８によって前記反応チャンバ１１２内に導入し、増幅反応を行う。本発明は、配管層に対して試薬注射を行う時、ピストンが試料投入チャンバへ移動することで、そのうちの圧力を増加させ、試薬を出口へ流動するように動かし、試薬又は試料の注入を実現させる。本発明は、複数組のピストン構造を設け、配管層に試料又は試薬を定時的に加えることで、使用効率を大幅に向上させることができる。前記増幅チャンバは、配管層の縁に設けられ、且つ反応チャンバ１１２は、半楕円形構造であり、反応試薬を反応させることができるだけでなく、使用時、突出した半楕円形構造によって容易な位置決め及び取り付けを実現させることもできる。そのうち、チップ装置は、透明である。
特に、本発明において、ガスケット及び関連する接続構造が設けられ、一方では、試料投入層と配管層を完璧に接続し、振動の発生を避けることができ、他方では、スパイクに、優れた配置空間を持たせることができ、ガスケット及び試料投入層は、摺動可能に取り付けられ、取り出しが容易である。初期取り付け状態では、試料投入層は、上から下へ配管層に嵌合し、ガスケットによって、スパイクと試薬管内の試薬を仕切り、運搬プロセスにおける振動によるスパイクと試薬の混合を防止し、突き刺しを避ける。試験を行う必要がある場合、ガスケットを第２シュートに沿って外へ抜き取る。ガスケットを第２シュートに沿って外へ抜き取った後、試料投入層を下へ押圧し、試料投入層におけるステーと第２スロットを係合接続させる。この時、配管層に設けられるスパイクと試料投入層の試薬が混合され、試薬を配管層に導入して測定を行う。本発明は、ガスケット構造を設けることとで、チップ装置が試薬を貯蔵して運搬するプロセスにおいて、完璧に保存することができ、使用時、ガスケットを抜き取れば、試薬を配管層に導入することができる。
図２に示すように、本発明による図２は、シングルチャネルｆａｍ増幅前後の蛍光値－発射ピークの比較図である。そのうち、Ｃｙｃｌｅ ０は、増幅していない蛍光スペクトル曲線であり、ｃｙｃｌｅ ４５は、４５個のサイクルが増幅した後の蛍光スペクトル曲線である。図３に示すように、本発明による図３は、ｆａｍチャネル蛍光値と温度サイクルの概略図である。そのうち、横座標は、時間であり、縦座標は、ｆａｍチャネル発射ピークでの蛍光値であり、これにより、温度に対する蛍光曲線の変化傾向が見られる。Ｆ５は、蛍光値の経時的変化曲線であり、Ｆ６は、温度の経時的変化曲線であり、図３は、図４に示される、ｃｙｃｌｅに応じて蛍光値を取る曲線を導き出す。図４は、本発明によるＦａｍチャネルに対してｃｙｃｌｅに応じて発射ピーク蛍光値を取る曲線である。採光の時点はＰＣＲ増幅過程の伸長段階終了３ｓ前であり、曲線を得た後、ＰＣＲ機器による検出方法のデータ処理プロセスを行うことができる。
具体的には、ＰＣＲ検出方法は、以下を含む
元データ：
浜松製マイクロ分光器によって収集されたｃｙｃｌｅ ０～４０蛍光強度。
Figure 2023516354000024
基底を差し引く：
Figure 2023516354000025
を信号として、基底
Figure 2023516354000026
を差し引く。
Figure 2023516354000027
データを平滑化する：
ｍａｔｌａｂ内蔵関数ｓｍｏｏｔｈｄａｔａ（パラメータｍｅｔｈｏｄ：ｓｇｏｌａｙ、ｗｉｎｓｉｚｅ：９）によってデータに対して平滑化処理を行い、
Figure 2023516354000028
又は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙ平滑アルゴリズム関数ｓｇ＿ｓｍｏｏｔｈによって基底が差し引かされたデータ
Figure 2023516354000029
を平滑化処理し、そのうち、パラメータは、ウィンドウサイズｗｉｎｓｉｚｅ：３であり、次数ｄｅｇｒｅｅ：６である。
Figure 2023516354000030
ベースラインを決定する：
Figure 2023516354000031
（インデックスが選択可能である）を選択し、最小二乗法に基づいてベースラインとして直線をフィッティングする。
Figure 2023516354000032
正規化：
データからベースラインを差し引く。
Figure 2023516354000033
一次差分：
Figure 2023516354000034

二次差分：
Figure 2023516354000035
三次差分：
Figure 2023516354000036
二次差分最大値を取る（二次差分の最大値を計算する。その三次差分を計算することで得られる）。
具体的には、三次差分のうち、「正負負負」又は「正負負」又は「正負」の規則に適合する最大点を選び出し（二次差分から最大点を選び出し、この点に対応する三次差分の前中後の各点を比較してもよい）、且つ対応するｃｙｃｌｅ一次差分が０よりも大きいことを求め（３つの規則に応じて順に選別し、１つの規則に応じる選別に成功すれば、次の規則に応じる選別を行わず、逆に選別を行う、該座標＋１は、二次差分最大値に対応する座標であり、なお、二次差分最大値に対応する座標±１は、計３点である。 多項式フィッティングを行う：
上記３点を
Figure 2023516354000037
に応じてフィッティングし、
Figure 2023516354000038
を取り、
接線に対してＣｔ値を求め、
Ｘで
Figure 2023516354000039
フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ｃｔ値であり、更に、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを得ることができ、
Figure 2023516354000040
陰／陽性判別：
Ｃｔ値≧３８であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断する。
描画：
Figure 2023516354000041
に対してｃｙｃｌｅ数に応じて図１１における曲線を描画する。
以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとっては、本発明に対して種々の変更及び変化を行うことができる。本発明の精神と原則内で行われるいかなる修正、等価置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれる。

Claims (13)

  1. ＰＣＲ検出器であって、励起光源モジュールと、チップ装置と、検出部と、を含み、前記励起光源モジュールは、所定の波長の励起光を前記チップ装置に発射し、増幅反応を行う時、前記検出部は、前記チップ装置の反応チャンバ側に設けられ、
    前記チップ装置は、反応チャンバを含み、反応チャンバ内に被検試料を収容でき、そのうち、被検試料は、蛍光標識を含有する核酸断片溶液であり、
    前記励起光源モジュールは、励起光を発射するためのものであり、励起光源モジュールから発射した励起光は、反応チャンバに配置される前記被検試料に照射することができ、
    前記励起光源モジュールは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射することができ、
    そのうち、前記反応チャンバは、前記励起光源モジュールの励起光発射方向に設けられ、前記検出部は、反応チャンバの一側に設けられ、前記励起光は、前記反応チャンバに照射した後に形成する発射光は、検出部によって検出可能であり、そのうち、励起光の発射方向は、検出部の下方に位置し、前記検出部は、被検試料に励起光を照射することによってこの被検試料から発射する、垂直方向における発射光を検出するためのものであり、
    前記検出部は、分光器を含み、前記分光器の検出スペクトルの波長範囲は、３４０－８５０ｎｍであり、前記分光器は、前記励起光と前記発射光を検出できることを特徴とする、ＰＣＲ検出器。
  2. 前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域と強度を検出し、前記分光器は、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光及び励起光を被検試料に照射することによって引き起こされる発射光の周波数帯域と強度を検出することを特徴とする
    請求項１に記載のＰＣＲ検出器。
  3. 前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数帯域は少なくとも、励起光の第１周波数帯域と励起光の第２周波数帯域を含み、２つの異なる周波数帯域の励起光によって引き起こされる発射光の周波数帯域は少なくとも、発射光の第１周波数帯域と発射光の第２周波数帯域を含み、前記励起光の第１周波数帯域、励起光の第２周波数帯域、発射光の第１周波数帯域及び発射光の第２周波数帯域の２つずつには、互いに重なり合う周波数帯域範囲がないことを特徴とする
    請求項２に記載のＰＣＲ検出器。
  4. 前記励起光源モジュールは、複数の光発射ユニットを含み、前記光発射ユニットは、発光ダイオード又は半導体レーザである
    請求項３に記載のＰＣＲ検出器。
  5. 前記光発射ユニットは、ＬＤ光源又はＬＥＤ光源である請求項４に記載のＰＣＲ検出器。
  6. 前記励起光源モジュールは、ＰＣＢ基板と、光ファイバコンバイナと、少なくとも１つの発光ダイオードと、各発光ダイオードに対応する少なくとも１本の光ファイバとを含み、
    発光ダイオードは、ＰＣＢ基板の一側に設けられ、各発光ダイオードの出力端に光ファイバカプラが設けられ、各光ファイバカプラは、それぞれ１つの光ファイバに結合され、光ファイバカプラによって、対応する波長の励起光を光ファイバに結合し、光ファイバによって伝送し、
    光ファイバコンバイナは、各光ファイバを所定の方式で配列して一体に収束し、前記光ファイバコンバイナの出力端に、光ファイバ内の励起光をコリメート光に変換するための光ファイバコリメータが更に設けられ、
    前記少なくとも１つの発光ダイオードは、少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光を発射するためのものであり、前記少なくとも２つの異なる周波数帯域の励起光の周波数範囲には、互いに重なり合う周波数範囲がないことを特徴とする
    請求項４に記載のＰＣＲ検出器。
  7. 前記チップ装置は、試料投入層と、配管層とを含み、前記試料投入層、配管層は、上から下へ順に設けられ、前記試料投入層は、試料投入孔と、試薬管とを含み、前記試料投入孔は、試料を加えるためのものであり、前記試薬管は、ｂｕｆｆｅｒ溶液を移送するためのものであり、前記配管層は、反応チャンバを含み、前記反応チャンバ内に凍結乾燥試薬が予め埋め込まれており、前記凍結乾燥試薬は、蛍光標識物質を含み、そのうち、試料投入孔内の試料とｂｕｆｆｅｒ溶液を混合した後に反応チャンバに入ることによって、被検試料を得ることを特徴とする
    請求項１に記載のＰＣＲ検出器。
  8. 前記蛍光標識物質は、ｆａｍ、ｈｅｘ、ｃｙ５、ｃｙ５．５のうちの少なくとも２種であり、そのうち、ｃｙ５、ｃｙ５．５蛍光標識された被検試料は、同時に検出されることが不可能であり、ｆａｍ、ｈｅｘ蛍光標識された被検試料も同時に検出されることが不可能である
    請求項１に記載のＰＣＲ検出器。
  9. ＰＣＲ検出方法であって、
    分光器を用いて、ｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
    Figure 2023516354000042
    を収集し、
    Figure 2023516354000043
    であるステップＳ１と、
    収集されたｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
    Figure 2023516354000044
    に対して正規化処理を行い、正規化処理後のデータ
    Figure 2023516354000045
    を得て、
    Figure 2023516354000046
    であり、
    Figure 2023516354000047
    は、ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）であり、
    Figure 2023516354000048
    は、平滑化処理後のデータであるステップＳ２と、
    ステップＳ２で得られた正規化処理後のデータ
    Figure 2023516354000049
    に対して、一次差分、二次差分及び三次差分を順に行うステップＳ３と、
    二次差分最大値を取り、三次差分のうち、「正負負負」又は「正負負」又は「正負」の規則に適合する最大点を選び出し、且つ対応するｃｙｃｌｅ一次差分が０よりも大きいことを求め、該座標＋１は、二次差分最大値に対応する座標であり、その他、±１の計３点であるステップＳ４と、
    多項式フィッティングを行い、上記ステップＳ４で得られた３点を二次関数
    Figure 2023516354000050
    に応じてフィッティングし、
    Figure 2023516354000051
    を取り、そのうち、ａは、二次項係数であり、ｂは、一次項係数であり、ｃは、定数であるステップＳ５と、
    接線に対してＣｔ値を求め、Ｘで
    Figure 2023516354000052
    フィッティング曲線の接線を作成し、それとベースラインとの交点の横座標は、Ｃｔ値であり、更に、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを得ることができるステップＳ６と、
    Figure 2023516354000053
    ；
    陰／陽性判別：
    Ｃｔ値≧３８であれば、陰性と判断し、逆に陽性と判断するステップＳ６と、を含むことを特徴とする、ＰＣＲ検出方法。
  10. 描画を行い、
    Figure 2023516354000054
    に対してｃｙｃｌｅ数に応じて曲線を描画するステップＳ７を更に含むことを特徴とする
    請求項９に記載のＰＣＲ検出方法。
  11. 収集されたｃｙｃｌｅ ０－４０蛍光強度
    Figure 2023516354000055
    に対して正規化処理を行う方法は、具体的には、
    基底を差し引くこと：
    Figure 2023516354000056
    を信号として、基底
    Figure 2023516354000057
    を差し引き、
    Figure 2023516354000058
    であり、そのうち、
    Figure 2023516354000059
    は、基底が差し引かされたデータであるステップＳ１１と
    データを平滑化すること：基底が差し引かされたデータ
    Figure 2023516354000060
    に対して平滑化処理を行い、平滑化処理後のデータ
    Figure 2023516354000061
    を得るステップＳ１２と、
    Figure 2023516354000062
    ベースラインを決定すること：
    Figure 2023516354000063
    を選択し、最小二乗法に基づいてベースライン
    Figure 2023516354000064
    として直線をフィッティングし、
    Figure 2023516354000065
    であり、そのうち、
    Figure 2023516354000066
    は、一次項係数であり、
    Figure 2023516354000067
    は、定数項であるステップＳ１３と、
    データからベースラインを差し引き、
    Figure 2023516354000068
    を得るステップＳ１４と、を含むことを特徴とする
    請求項９に記載のＰＣＲ検出方法。
  12. Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム関数ｓｇ＿ｓｍｏｏｔｈで、基底が差し引かされたデータ
    Figure 2023516354000069
    に対して平滑化処理を行い、そのうち、パラメータは、ウィンドウサイズｗｉｎｓｉｚｅ：３であり、次数ｄｅｇｒｅｅ：６であることを特徴とする
    請求項１１に記載のＰＣＲ検出方法。
  13. 一次差分、二次差分及び三次差分処理のそれぞれにおいて、具体的には、
    Ｓ３１：一次差分：
    Figure 2023516354000070
    であり、そのうち、
    Figure 2023516354000071
    は、ｉ番目の点の１次差分値であり、
    Figure 2023516354000072
    は、正規化処理後のｉ＋１番目の点であり、
    Figure 2023516354000073
    は、正規化処理後のｉ－１番目の点であり、
    Ｓ３２：二次差分：
    Figure 2023516354000074
    であり、そのうち、
    Figure 2023516354000075
    は、ｉ番目の点の二次差分値であり、
    Figure 2023516354000076
    は、一次差分値におけるｉ＋２番目の点の値であり、
    Figure 2023516354000077
    は、一次差分値におけるｉ－２番目の点の値であり、
    Ｓ３３：三次差分：
    Figure 2023516354000078
    であり、そのうち、
    Figure 2023516354000079
    は、ｉ番目の点の三次差分値であり、
    Figure 2023516354000080
    は、二次差分におけるｉ＋１番目の点の値であることを特徴とする
    請求項９に記載のＰＣＲ検出方法。
JP2022552708A 2020-12-30 2021-01-14 Ｐｃｒ検出器及びその方法 Active JP7438580B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011643279.7A CN112782395B (zh) 2020-12-30 2020-12-30 一种pcr检测仪及其方法
CN202011643279.7 2020-12-30
PCT/CN2021/071820 WO2022141674A1 (zh) 2020-12-30 2021-01-14 一种pcr检测仪及其方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023516354A true JP2023516354A (ja) 2023-04-19
JP7438580B2 JP7438580B2 (ja) 2024-02-27

Family

ID=75753548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022552708A Active JP7438580B2 (ja) 2020-12-30 2021-01-14 Ｐｃｒ検出器及びその方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4273547A4 (ja)
JP (1) JP7438580B2 (ja)
CN (2) CN113607937B (ja)
WO (1) WO2022141674A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008261842A (ja) * 2007-02-21 2008-10-30 F Hoffmann La Roche Ag 光線を放射及び検出するための装置
CN104677870A (zh) * 2015-02-06 2015-06-03 余家昌 一种超小型化多通道实时荧光光谱检测装置
CN104792722A (zh) * 2015-04-30 2015-07-22 华南农业大学 一种沉香含油率近红外光谱预测模型的建立
JP2018029586A (ja) * 2007-04-04 2018-03-01 ネットバイオ・インコーポレーテッドＮｅｔＢｉｏ， Ｉｎ 集積化された核酸分析
CN209836152U (zh) * 2019-04-01 2019-12-24 无锡百泰克生物技术有限公司 一种用于多通道荧光定量pcr扩增的微流控芯片
CN111157497A (zh) * 2019-12-27 2020-05-15 北京中科生仪科技有限公司 一种手持式检测仪用激发光源

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6320196B1 (en) * 1999-01-28 2001-11-20 Agilent Technologies, Inc. Multichannel high dynamic range scanner
US7248360B2 (en) * 2004-04-02 2007-07-24 Ppd Biomarker Discovery Sciences, Llc Polychronic laser scanning system and method of use
KR100738073B1 (ko) * 2004-09-01 2007-07-12 삼성전자주식회사 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 초기 핵산 농도를정량화하는 방법
EP1955241B1 (en) * 2005-11-14 2011-03-30 Gen-Probe Incorporated Parametric calibration method
US20080209978A1 (en) * 2007-01-29 2008-09-04 Applera Corporation System and Method for Instrument Calibration
US8219324B2 (en) * 2008-09-12 2012-07-10 Roche Molecular Systems, Inc. Real-time PCR elbow calling by equation-less algorithm
US8219366B2 (en) * 2009-08-26 2012-07-10 Roche Molecular Sytems, Inc. Determination of elbow values for PCR for parabolic shaped curves
US10176293B2 (en) * 2012-10-02 2019-01-08 Roche Molecular Systems, Inc. Universal method to determine real-time PCR cycle threshold values
ES2832544T3 (es) * 2014-08-27 2021-06-10 Hoffmann La Roche Un procedimiento de análisis y sistema para analizar una reacción de amplificación de ácido nucleico
GB201503775D0 (en) * 2015-03-05 2015-04-22 Bg Res Ltd Multiplexed detection of nucleic acid targets directly from samples containing blood
CN114740213A (zh) 2015-07-24 2022-07-12 塞弗德公司 分子诊断化验***
CN107016258B (zh) * 2016-01-27 2020-06-05 应清界 一种基于重组酶介导等温核酸扩增（raa）法进行荧光定量计算的方法
CN110619927B (zh) * 2019-03-27 2022-06-28 北京中科生仪科技有限公司 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008261842A (ja) * 2007-02-21 2008-10-30 F Hoffmann La Roche Ag 光線を放射及び検出するための装置
JP2018029586A (ja) * 2007-04-04 2018-03-01 ネットバイオ・インコーポレーテッドＮｅｔＢｉｏ， Ｉｎ 集積化された核酸分析
CN104677870A (zh) * 2015-02-06 2015-06-03 余家昌 一种超小型化多通道实时荧光光谱检测装置
CN104792722A (zh) * 2015-04-30 2015-07-22 华南农业大学 一种沉香含油率近红外光谱预测模型的建立
CN209836152U (zh) * 2019-04-01 2019-12-24 无锡百泰克生物技术有限公司 一种用于多通道荧光定量pcr扩增的微流控芯片
CN111157497A (zh) * 2019-12-27 2020-05-15 北京中科生仪科技有限公司 一种手持式检测仪用激发光源

Also Published As

Publication number Publication date
CN113607937B (zh) 2022-07-12
CN112782395A (zh) 2021-05-11
EP4273547A1 (en) 2023-11-08
WO2022141674A1 (zh) 2022-07-07
CN112782395B (zh) 2021-11-09
JP7438580B2 (ja) 2024-02-27
CN113607937A (zh) 2021-11-05
EP4273547A4 (en) 2024-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210293709A1 (en) Device and associated methods for performing luminescence and fluorescence measurements of a sample
CN104677870A (zh) 一种超小型化多通道实时荧光光谱检测装置
EP1634062B1 (en) Readhead for optical inspection apparatus
US20170038299A1 (en) Online process monitoring
CN101881724B (zh) 用于自动分析样本的***和方法
US20110035160A1 (en) Multi-Channel Bio Reactor with Fluorescence Detector and On-Line Monitoring Apparatus of It
CN204462019U (zh) 一种超小型化多通道实时荧光光谱检测装置
JP2020536223A (ja) 光エネルギー蛍光励起
CN112432934B (zh) 发射光检测方法
US10175171B2 (en) Compact multi-UV-LED probe system and methods of use thereof
JP2023516354A (ja) Ｐｃｒ検出器及びその方法
CN112414983A (zh) 一种基于激发光源的生物检测方法
CN204661702U (zh) 一种pcr激发探测***
CN214781826U (zh) 一种pcr检测仪
US20090170214A1 (en) Luminescent Reporter Modality for Analyzing an Assay
CN113358622A (zh) 基于荧光标记和微流控芯片的病毒核酸检测***
CN210123401U (zh) 多通道微流控荧光检测装置
CN219891083U (zh) 生物芯片检测装置
CN221174405U (zh) 一种荧光采集装置及荧光检测设备
CN207557109U (zh) 一种荧光光学检测装置
Richards et al. Miniaturized detection system for handheld PCR assays
DE50214061D1 (de) Vorrichtung zur Erfassung der Konzentration einer fluoreszierenden Substanz in einem Fluid, insbesondere in einem Kraftstoff

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220831

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220831

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230905

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231107

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240116

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240206

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7438580

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150