JP2023113960A - Dnaライブラリーの高効率構築 - Google Patents
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Abstract
【課題】DNAライブラリーの高効率構築の提供。【解決手段】本開示は、効率的なDNAライブラリー構築及びライブラリーのターゲット遺伝子解析の方法を提供する。ライブラリーは、対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターに有用である。本発明は概して、DNAライブラリーを構築するための改良された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、定量的遺伝子解析のためのDNAクローンライブラリーの効率的な構築に関するものである。本発明は、概して、DNAアダプターをDNA断片に高効率に接着して、定量的遺伝子解析用のDNAライブラリーを生成するための、組成物及び方法に関する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2015年11月11日に出願された米国仮出願第62/254,110号の優先権を主張し、その全体が参照により本書に組み込まれる。
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電子提出するテキストファイルの説明
本明細書と共に電子提出するテキストファイル、すなわち配列表のコンピューター可読フォーマットコピー(ファイル名:CLFK_003_01WO_ST25、記録日:2016年11月10日、ファイルサイズ:23kB)の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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技術分野
本発明は概して、DNAライブラリーを構築するための改良された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、定量的遺伝子解析のためのDNAクローンライブラリーの効率的な構築に関するものである。
本発明は概して、DNAライブラリーを構築するための改良された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、定量的遺伝子解析のためのDNAクローンライブラリーの効率的な構築に関するものである。
下流解析の対象となる様々なDNA検体は、ほんのわずかな量で収集される。例として、全血の血漿画分から収集されるセルフリーDNA(cfDNA)は、概して、血漿1mL当たりナノグラムレベルの量で存在する。1つの2倍体ヒトゲノムの重さが6ピコグラムであるとすれば、このことは、1回の採取血から単離され得る総ゲノムの情報が数百から数千存在することを意味する。
がん患者において、腫瘍DNAは、全循環DNAの≦0.1%から≧10%の範囲の変動性が高い量で血流に流れる。採取血にはわずか数ナノグラムのDNAしか含まれず、腫瘍ゲノムが全循環DNAの0.1%存在する場合には、腫瘍ゲノムは全部で1~10コピーしか存在しない。配列解析によって腫瘍DNAを明確に同定するためには、2コピー以上の腫瘍特異的遺伝子病変を観察することが必要である。しかし、DNAの検出感度を最大化する必要性、つまり0.1%という範囲での腫瘍DNAを正確に検出する必要性はまだ達成されていない。
これらの考慮事項は、血液を用いての信頼性の高い固形腫瘍の遺伝子解析が、ゲノム断片を単離及び解析する能力によって部分的に左右されるという、根本的な問題を浮かび上がらせるものである。その上、多くの治療的に実行可能な腫瘍病変は、遺伝子融合、DNA配列の顕著な挿入もしくは欠失、及び/または遺伝子コピー数の変化を伴う。このような改変は、PCRによる解析では対応が困難である。というのも、PCRは、2つの隣接するプライマー結合部位が既知でなければならず、かつ多数回ラウンドのターゲット増幅によりコピーバリエーションが不明瞭になるからである。
現在は、循環腫瘍DNAにおける潜在的病変を包括的に解析するためにターゲット検索法が使用されている。このようなターゲット検索法は、DNAクローンライブラリーの創出に依存する。残念ながら、こういったDNAライブラリーの現状の創出方法は非効率的であり、有用なライブラリークローンに首尾よく変換されるDNA断片はわずかなパーセンテージに過ぎない。
本発明は、概して、DNAアダプターをDNA断片に高効率に接着して、定量的遺伝子解析用のDNAライブラリーを生成するための、組成物及び方法に関する。
様々な実施形態では、1つ以上のDNA断片に対するアダプターライゲーションの効率を高める方法であって、1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;ならびに、アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成することを含み、アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化DNA断片に対しライゲーションされる方法よりも高められる、方法が提供される。
様々な実施形態では、DNAライブラリーを構築する方法であって、1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;ならびに、アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること、を含む方法が提供される。
特定の実施形態では、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドは、3’末端において、末端修復DNAの5’末端に対するライゲーション及び/またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む。
あるいくつかの実施形態では、1つ以上のDNA断片の供与源は、ゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、及びセルフリーDNA(cfDNA)からなる群から選択されるDNAである。
さらなる実施形態では、DNAの供与源は、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、***、精漿、前立腺液、***前液(カウパー腺液)、***物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料である。
特定の実施形態では、DNAの供与源は、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である。
さらなる実施形態では、当該方法は、対象の生体試料からDNAを単離することをさらに含む。
一部の実施形態では、当該方法は、対象の生体試料からDNAを断片化することをさらに含む。
あるいくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲーションの前に1つ以上のDNA断片の損傷を修復することをさらに含む。
特定の実施形態では、当該損傷は、脱アミノ化シトシン(ウラシル)、脱塩基部位、グアニンのO6MeGへのメチル化、DNAニック、ギャップ、またはチミンダイマーである。
様々な実施形態では、cfDNAライブラリーを構築する方法であって、対象の生体試料からcfDNAを単離または取得すること;cfDNAの末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化cfDNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復cfDNAを生成し、任意選択によりDNA損傷を修復すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復cfDNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復cfDNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復cfDNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;アダプター/末端修復cfDNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のcfDNAライブラリーを形成すること;ならびにcfDNAライブラリーを増幅して、セルフリーDNAクローンライブラリーを生成すること、を含む方法が提供される。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドはアダプターダイマー形成を防止する1つ以上の修飾を含み、任意選択により、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの3’末端の修飾がアダプターダイマー形成を防止する。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む。
一部の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のPCRプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上のユニークリードコードを含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、試料多重化用の1つ以上の試料コードを含む。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、DNAシークエンシング用の1つ以上の配列を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、アンカー配列を含む。
さらなる実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む。
あるいくつかの実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のプライマー結合部位を含む。
一部の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、1つ以上のユニークリードコードを含む。
あるいくつかの実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、試料多重化用の1つ以上の試料コードを含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、DNAシークエンシング用の1つ以上の配列を含む。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、修復オリゴヌクレオチドに対し相補的である。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列は、修復オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し相補的である。
さらなる実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのPCRプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのPCRプライマー結合部位に対し相補的である。
特定の実施形態では、1つ以上のアダプターは、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種を含む。
一部の実施形態では、1つ以上のアダプターは、複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に対し相補的ではない。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位は、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位とは実質的に異なる。
あるいくつかの実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に結合するプライマーは、修復オリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に実質的に結合しない。
特定の実施形態では、DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成する。
さらなる実施形態では、qPCRをDNAクローンライブラリー上で実施し、qPCR測定値を既知のゲノム当量の標準物質と比較して、DNAクローンライブラリーのゲノム当量を決定する。
特定の実施形態では、qPCRを、Alu配列に結合するプライマー及びアダプター内の配列に結合するプライマーを用いて実施する。
一部の実施形態では、定量的遺伝子解析を、DNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析を、複数のDNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、1つ以上のキャプチャープローブをターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、キャプチャープローブモジュール-DNAクローン複合体を形成することを含む。
あるいくつかの実施形態では、定量的遺伝子解析は、キャプチャープローブ-DNAクローン複合体を単離することを含む。
さらなる実施形態では、定量的遺伝子解析は、単離したキャプチャープローブ-DNAクローン複合体内のDNAクローン配列を増幅することを含む。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、複数のシークエンシングリードを生成するためのDNAシークエンシングを含む。
さらなる実施形態では、当該方法は、複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析はDNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施し、バイオインフォマティクス解析は、DNAクローンライブラリーにおいて解析されるゲノム当量数の定量化;ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出;ターゲット遺伝子座における突然変異の検出;ターゲット遺伝子座における遺伝子融合の検出、及び/またはターゲット遺伝子座におけるコピー数変動測定のために使用する。
あるいくつかの実施形態では、定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、1つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する。
特定の実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
あるいくつかの実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
さらなる実施形態では、定量的遺伝子解析を、胎児cfDNA内の1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を識別または検出するために使用する。
一部の実施形態では、キャプチャープローブは、任意選択によりハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたキャプチャープローブモジュールの構成成分であり、当該ハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドはキャプチャープローブモジュール内のテール配列とハイブリダイズする。
様々な実施形態では、対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターの方法であって、対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;DNAの末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに、DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することを含み、1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、方法が提供される。
あるいくつかの実施形態では、当該DNAは、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである。
特定の実施形態では、cfDNAは、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗の群から選択される生体試料から単離される。
さらなる実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
特定の実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
様々な実施形態では、遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;DNAの末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに、DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、1つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも1つの検出または検出失敗が、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、実施すること、を含むコンパニオン診断が提供される。
さらなる実施形態では、当該DNAは、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである。
特定の実施形態では、cfDNAは、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料から単離される。
特定の実施形態では、バイオマーカーは遺伝子病変である。
さらなる実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
あるいくつかの実施形態では、遺伝子疾患はがんである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
1つ以上のDNA断片に対するアダプターライゲーションの効率を高める方法であって、
(a)1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;ならびに
(e)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
を含み、
アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化DNA断片に対しライゲーションされる方法よりも高められる、前記方法。
(項目2)
DNAライブラリーを構築する方法であって、
(a)1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;ならびに
(e)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
を含む、前記方法。
(項目3)
前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドが、3’末端において、前記末端修復DNAの5’末端に対するライゲーション及び/またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記1つ以上のDNA断片の供与源が、ゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、及びセルフリーDNA(cfDNA)からなる群から選択されるDNAである、項目1~3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記DNAの供与源が、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、***、精漿、前立腺液、***前液(カウパー腺液)、***物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記DNAの供与源が、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である、項目4に記載の方法。
(項目7)
対象の生体試料から前記DNAを単離することをさらに含む、項目5または項目6に記載の方法。
(項目8)
対象の生体試料から前記DNAを断片化することをさらに含む、項目5または項目6に記載の方法。
(項目9)
ステップ(c)の前に前記1つ以上のDNA断片の損傷を修復することをさらに含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記損傷が、脱アミノ化シトシン(ウラシル)、脱塩基部位、グアニンのO6MeGへのメチル化、DNAニック、ギャップ、またはチミンダイマーである、項目9に記載の方法。
(項目11)
cfDNAライブラリーを構築する方法であって、
(a)対象の生体試料からcfDNAを単離または取得すること;
(a)前記cfDNAの末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化cfDNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復cfDNAを生成し、任意選択によりDNA損傷を修復すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復cfDNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復cfDNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復cfDNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(e)前記アダプター/末端修復cfDNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のcfDNAライブラリーを形成すること;ならびに
(f)前記cfDNAライブラリーを増幅して、セルフリーDNAクローンライブラリーを生成すること;
を含む、前記方法。
(項目12)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドがアダプターダイマー形成を防止する1つ以上の修飾を含み、任意選択により、前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの3’末端の修飾がアダプターダイマー形成を防止する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、1つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための1つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、DNAシークエンシングのための1つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記修復オリゴヌクレオチドが、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記修復オリゴヌクレオチドが、1つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記修復オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための1つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記修復オリゴヌクレオチドが、DNAシークエンシングのための1つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、前記修復オリゴヌクレオチドに対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列に対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記PCRプライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記PCRプライマー結合部位に対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記1つ以上のアダプターが、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記1つ以上のアダプターが、複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に対し相補的ではない、項目1~26のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位とは実質的に異なる、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に結合するプライマーが、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に実質的に結合しない、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
qPCRを前記DNAクローンライブラリー上で実施し、qPCR測定値を既知のゲノム当量の標準物質と比較して、前記DNAクローンライブラリーのゲノム当量を決定する、項目1~34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記qPCRを、Alu配列に結合するプライマー及びアダプター内の配列に結合するプライマーを用いて実施する、項目34に記載の方法。
(項目37)
定量的遺伝子解析を、前記DNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
定量的遺伝子解析を、複数のDNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
定量的遺伝子解析が、1つ以上のキャプチャープローブをターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、キャプチャープローブモジュール-DNAクローン複合体を形成することを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
定量的遺伝子解析が、前記キャプチャープローブ-DNAクローン複合体を単離することを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記定量的遺伝子解析が、前記単離したキャプチャープローブ-DNAクローン複合体内のDNAクローン配列を増幅することを含む、項目49に記載の方法。
(項目42)
定量的遺伝子解析が、複数のシークエンシングリードを生成するためのDNAシークエンシングを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
定量的遺伝子解析を、前記DNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施し、バイオインフォマティクス解析を、以下の目的:
(a)前記DNAクローンライブラリー内で解析されるゲノム当量数の定量化;
(b)ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出;
(c)ターゲット遺伝子座の中の突然変異の検出;
(d)ターゲット遺伝子座の中の遺伝子融合の検出;及び/または
(e)ターゲット遺伝子座の中のコピー数変動の測定;
で使用する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、1つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記遺伝子疾患ががんである、項目45に記載の方法。
(項目48)
前記定量的遺伝子解析を、胎児cfDNA内の1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目44に記載の方法。
(項目49)
前記キャプチャープローブが、任意選択によりハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたキャプチャープローブモジュールの構成成分であり、前記ハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドが前記キャプチャープローブモジュール内のテール配列とハイブリダイズする、項目38~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターの方法であって、
(a)対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;
(b)前記DNAの末端リン酸残基を除去すること;
(c)前記脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(d)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(e)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(f)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
(g)前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;
(h)前記DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに
(i)前記DNAクローンライブラリーにおける前記遺伝子疾患に関連する1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、前記1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、前記遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、前記実施すること;
を含む、前記方法。
(項目51)
前記DNAが、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記cfDNAが、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗の群から選択される生体試料から単離される、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記遺伝子疾患ががんである、項目50に記載の方法。
(項目55)
遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、
(a)対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;
(b)前記DNAの末端リン酸残基を除去すること;
(c)前記脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(d)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(e)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(f)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
(g)前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;
(h)前記DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに
(i)前記DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、前記1つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも1つの検出または検出失敗が、前記対象に前記遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、前記実施すること;
を含む、前記コンパニオン診断。
(項目56)
前記DNAが、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記cfDNAが、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料から単離される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記バイオマーカーが遺伝子病変である、項目55に記載の方法。
(項目59)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記遺伝子疾患ががんである、項目55に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
1つ以上のDNA断片に対するアダプターライゲーションの効率を高める方法であって、
(a)1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;ならびに
(e)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
を含み、
アダプターライゲーションの効率が、脱リン酸化アダプター分子がリン酸化DNA断片に対しライゲーションされる方法よりも高められる、前記方法。
(項目2)
DNAライブラリーを構築する方法であって、
(a)1つ以上のDNA断片の末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化DNA断片を1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;ならびに
(e)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
を含む、前記方法。
(項目3)
前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドが、3’末端において、前記末端修復DNAの5’末端に対するライゲーション及び/またはアダプターダイマー形成を防止する修飾を含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記1つ以上のDNA断片の供与源が、ゲノムDNA(gDNA)、相補DNA(cDNA)、及びセルフリーDNA(cfDNA)からなる群から選択されるDNAである、項目1~3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記DNAの供与源が、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、***、精漿、前立腺液、***前液(カウパー腺液)、***物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料からなる群から選択される生体試料である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記DNAの供与源が、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である、項目4に記載の方法。
(項目7)
対象の生体試料から前記DNAを単離することをさらに含む、項目5または項目6に記載の方法。
(項目8)
対象の生体試料から前記DNAを断片化することをさらに含む、項目5または項目6に記載の方法。
(項目9)
ステップ(c)の前に前記1つ以上のDNA断片の損傷を修復することをさらに含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記損傷が、脱アミノ化シトシン(ウラシル)、脱塩基部位、グアニンのO6MeGへのメチル化、DNAニック、ギャップ、またはチミンダイマーである、項目9に記載の方法。
(項目11)
cfDNAライブラリーを構築する方法であって、
(a)対象の生体試料からcfDNAを単離または取得すること;
(a)前記cfDNAの末端リン酸残基を除去すること;
(b)前記脱リン酸化cfDNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復cfDNAを生成し、任意選択によりDNA損傷を修復すること;
(c)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復cfDNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復cfDNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(d)前記プレアダプター/末端修復cfDNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復cfDNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(e)前記アダプター/末端修復cfDNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のcfDNAライブラリーを形成すること;ならびに
(f)前記cfDNAライブラリーを増幅して、セルフリーDNAクローンライブラリーを生成すること;
を含む、前記方法。
(項目12)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドがアダプターダイマー形成を防止する1つ以上の修飾を含み、任意選択により、前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの3’末端の修飾がアダプターダイマー形成を防止する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、1つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための1つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、DNAシークエンシングのための1つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、アンカー配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、またはPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記修復オリゴヌクレオチドが、アンカー配列、リードコード、及びPCRプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記修復オリゴヌクレオチドが、1つ以上の連続した二重鎖のDNAライブラリー分子をPCR増幅するための1つ以上のプライマー結合部位を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記修復オリゴヌクレオチドが、1つ以上のユニークリードコードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記修復オリゴヌクレオチドが、試料多重化のための1つ以上の試料コードを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記修復オリゴヌクレオチドが、DNAシークエンシングのための1つ以上の配列を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドが、前記修復オリゴヌクレオチドに対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記アンカー配列に対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記PCRプライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記PCRプライマー結合部位に対し相補的である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記1つ以上のアダプターが、複数のライゲーション鎖オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記1つ以上のアダプターが、複数の修復オリゴヌクレオチド種を含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に対し相補的ではない、項目1~26のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位とは実質的に異なる、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に結合するプライマーが、前記修復オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位に実質的に結合しない、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
qPCRを前記DNAクローンライブラリー上で実施し、qPCR測定値を既知のゲノム当量の標準物質と比較して、前記DNAクローンライブラリーのゲノム当量を決定する、項目1~34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記qPCRを、Alu配列に結合するプライマー及びアダプター内の配列に結合するプライマーを用いて実施する、項目34に記載の方法。
(項目37)
定量的遺伝子解析を、前記DNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
定量的遺伝子解析を、複数のDNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
定量的遺伝子解析が、1つ以上のキャプチャープローブをターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、キャプチャープローブモジュール-DNAクローン複合体を形成することを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
定量的遺伝子解析が、前記キャプチャープローブ-DNAクローン複合体を単離することを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記定量的遺伝子解析が、前記単離したキャプチャープローブ-DNAクローン複合体内のDNAクローン配列を増幅することを含む、項目49に記載の方法。
(項目42)
定量的遺伝子解析が、複数のシークエンシングリードを生成するためのDNAシークエンシングを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析をさらに含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
定量的遺伝子解析を、前記DNAクローンライブラリーにおける複数の遺伝子座上で実施し、バイオインフォマティクス解析を、以下の目的:
(a)前記DNAクローンライブラリー内で解析されるゲノム当量数の定量化;
(b)ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出;
(c)ターゲット遺伝子座の中の突然変異の検出;
(d)ターゲット遺伝子座の中の遺伝子融合の検出;及び/または
(e)ターゲット遺伝子座の中のコピー数変動の測定;
で使用する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記定量的遺伝子解析を、遺伝子疾患の原因となるまたは遺伝子疾患に関連する、1つ以上の遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記遺伝子疾患ががんである、項目45に記載の方法。
(項目48)
前記定量的遺伝子解析を、胎児cfDNA内の1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を識別または検出するために使用する、項目44に記載の方法。
(項目49)
前記キャプチャープローブが、任意選択によりハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたキャプチャープローブモジュールの構成成分であり、前記ハプテン標識パートナーオリゴヌクレオチドが前記キャプチャープローブモジュール内のテール配列とハイブリダイズする、項目38~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
対象における遺伝子疾患の予測、診断、またはモニターの方法であって、
(a)対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;
(b)前記DNAの末端リン酸残基を除去すること;
(c)前記脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(d)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(e)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(f)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
(g)前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;
(h)前記DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに
(i)前記DNAクローンライブラリーにおける前記遺伝子疾患に関連する1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、前記1つ以上のターゲット遺伝子座における1つ以上の遺伝子病変の識別または検出が、前記遺伝子疾患の予後判定、診断、または進行のモニターである、前記実施すること;
を含む、前記方法。
(項目51)
前記DNAが、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記cfDNAが、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗の群から選択される生体試料から単離される、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記遺伝子疾患ががんである、項目50に記載の方法。
(項目55)
遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、
(a)対象の生体試料からDNAを単離または取得すること;
(b)前記DNAの末端リン酸残基を除去すること;
(c)前記脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;
(d)1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを前記末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、前記末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、前記ライゲーションすること;
(e)前記プレアダプター/末端修復DNA複合体から前記非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターが前記ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び前記修復オリゴヌクレオチドを含む、前記置き換えること;
(f)前記アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;
(g)前記DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;
(h)前記DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに
(i)前記DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、前記1つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも1つの検出または検出失敗が、前記対象に前記遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、前記実施すること;
を含む、前記コンパニオン診断。
(項目56)
前記DNAが、ゲノムDNA、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からのDNA、cDNA、またはcfDNAである、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記cfDNAが、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料から単離される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記バイオマーカーが遺伝子病変である、項目55に記載の方法。
(項目59)
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記遺伝子疾患ががんである、項目55に記載の方法。
A.概要
本発明は、その一部として、定量的遺伝子解析の分野における、このような下流解析用DNA断片をクローニングする改良された効率の高い方法への深刻な必要性に対処するための、組成物及び方法を企図している。
本発明は、その一部として、定量的遺伝子解析の分野における、このような下流解析用DNA断片をクローニングする改良された効率の高い方法への深刻な必要性に対処するための、組成物及び方法を企図している。
現状のDNA解析方法は、専用のアダプターをDNA断片にライゲーションすることを含む(図1)。従来の技術では、DNAライゲーションの前にターゲットDNA断片を5’リン酸化して、非リン酸化二重鎖アダプターとの共有結合的ライゲーションができるようにする。ターゲットDNA断片及びアダプターは、ブラントエンドであり得るか、または相補的オーバーハング(例えば、T/A)を共有し得る(図1A)。これは重篤な欠陥である。なぜなら、全てのターゲットDNA断片の両端をリン酸化することを保証できず、非リン酸化末端のライゲーションが不可能となり、これらのターゲット断片が後続のライブラリーから失われるからである(図1B)。非限定的な例として、ターゲットDNA断片末端の70%が5’リン酸を所持する場合、断片の両端にライゲーションされ得るのは、最大で断片の49%(0.7x0.7x100%)に過ぎないと考えられるが、クローニングには両端へのライゲーションが必要である。さらに、ターゲットDNA断片上に5’リン酸が存在することで、DNA断片が互いにライゲーションする恐れのある、ばらばらになった望ましくないアーティファクトが促進される(図1C)。これにより、疾患特有の染色体再編の検出と混同する可能性のある、人為的な染色体配列融合事象がもたらされる。
様々な実施形態では、本発明は、その一部として、効率的にアダプター配列をターゲットDNA断片に接着するための組成物及び方法を企図している。特定の実施形態では、ターゲットDNA断片の5’及び3’末端両方からリン酸が除去される。次に、この脱リン酸化断片を、DNAのブラントエンドを創出する酵素と、任意選択により、DNAが受けた可能性のある多数のタイプのDNA損傷(例えば、脱アミノ化シトシン(ウラシル)、脱塩基部位、グアニンのO6MeGへのメチル化、ニック、二重鎖切断、またはチミンダイマー)を修復する酵素と、を用いて処理する。アダプターは、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドと共に二重鎖形成されたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドを含む。アダプターのライゲーション鎖は、ターゲットDNA断片に対するライゲーションに必要となる5’リン酸基を保有し、パートナー鎖は3’ブロッキング基を含む(図1D)。3’ブロッキング基は、アダプター:アダプターダイマーの形成を防止する(図1E)。DNA断片と同様、全てのアダプター配列が5’リン酸を所持することになるわけではない(溶媒に曝露された末端のリン酸結合は、本来化学的に不安定である)。このような非リン酸化アダプターが存在することにはなるが、これらは一時的にライゲーション機構に関与するに過ぎず(図1F)、このようなアダプターと断片との非生産的ペアリングは急速に分離し、生産的な共有結合的接着をもたらし得るアダプター:ターゲットDNA断片ペアリングに置き換えられる。最終的には、約100%のターゲットDNA断片の両端がアダプター分子と接着する。これは、本明細書で企図するDNAライブラリー構築用の組成物及び方法の高効率性を説明するものである。
様々な実施形態では、本明細書で企図するDNAライブラリーの高効率構築のための組成物及び方法は、様々な生物供与源から入手可能なDNAを用いて分子遺伝子解析に対処する、新規の包括的フレームワークを提供する。精製されたDNAのクローニングで、タグ付きのDNA配列が導入される。これは、下流解析に情報を与え、また得られたクローンライブラリーの増幅を可能にする。ターゲット特異的オリゴヌクレオチドによるハイブリッドキャプチャーが、後続の解析用の特定配列を捕捉するために使用される。ライブラリー内に存在するゲノム数の単独測定が各試料に適用される。これらのアッセイにより、アッセイの感度を推定するための手段が提供される。本明細書で企図するアッセイは、遺伝子の様相、状態、または疾患における解析、検出、診断、またはモニターのための、信頼性が高く再生可能でありロバストな方法を提供する。
反対のことが明示されない限り、本発明における特定の実施形態の実施には、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学における当業者の技能範囲内の従来的な方法が用いられることになり、これらの多くを、例示の目的で後に説明する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,Eds.,1984);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);及びHarlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)を参照。
B.定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することは可能であるが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料について説明する。本発明の目的のために、以下の用語は下記のように定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することは可能であるが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料について説明する。本発明の目的のために、以下の用語は下記のように定義する。
冠詞「a」、「an」、及び「the」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すように使用している。例として、「要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
選択肢(例えば、「または」)の使用は、選択肢のうちの1つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味するものと理解されたい。
「及び/または」という用語は、選択肢のうちの1つまたは両方のいずれかを意味するものと理解されたい。
本明細書で使用する「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対し、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%の分変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「comprise(含む)」、「comprises(含む)」、及び「comprising(含む)」という語は、述べられるステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味し、ただし任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。特定の実施形態では、「include(含む)」、「有する」、「含有する」、及び「comprise(含む)」は同義語として使用される。
「~からなる」は、「~からなる」というフレーズの後に来る任意のものを含み、かつそれに限定することを意味する。したがって、「~からなる」というフレーズは、挙げられる要素が必要または必須であり、かつ他の要素は存在しない場合があることを示す。
「本質的に~からなる」は、このフレーズの後に挙げられる任意の要素を含み、他の要素については、挙げられる要素の開示内容で指定された活性または作用を妨げず、寄与もしない要素に限定することを意味する。したがって、「本質的に~からなる」というフレーズは、挙げられる要素は必要または必須であるが、他の要素については任意選択ではなく、挙げられる要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、他の要素が存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示す。
本明細書全体における「one embodiment(一実施形態)」、「an enbodiment(一実施形態)」、「特定の実施形態」、「あるいくつかの実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特色が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所で出現する上記フレーズが、必ずしも全て同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特色は、1つ以上の実施形態における任意の好適な方法で組み合わせることができる。
本明細書で使用する「単離した」という用語は、天然の状態において通常は付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態では、「取得した」または「導き出した」という用語は、「単離した」の同義語として使用される。
本明細書で使用する「DNA」という用語は、デオキシリボ核酸を指す。様々な実施形態では、DNAという用語は、ゲノムDNA、組換えDNA、合成DNA、相補的DNA(cDNA)、またはセルフリーDNA(cfDNA)を指す。一実施形態では、DNAはゲノムDNAまたはcDNAを指す。一実施形態では、DNAはcDNAを指す。特定の実施形態では、当該DNAは、「ターゲット領域」を含むDNA断片であり、あるいくつかの実施形態ではターゲット領域はターゲットDNA断片とも呼ばれる。本明細書で企図するDNAライブラリーには、ゲノムDNAライブラリー、cfDNAライブラリー、及びRNAから構築するcDNAライブラリー(例えば、RNA発現ライブラリー)が含まれる。様々な実施形態では、DNAライブラリーは1つ以上の追加的なDNA配列及び/またはタグを含む。
「ターゲット遺伝子座」または「DNAターゲット領域」とは、DNA配列内の対象となる領域を指す。様々な実施形態では、ターゲット遺伝子座に対しターゲット遺伝子解析を実施する。特定の実施形態では、DNAターゲット領域は、特定の遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝子疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、または臓器移植モニタリングに関連する遺伝子の領域である
本明細書で使用する「循環DNA」、「循環セルフリーDNA」、及び「セルフリーDNA」という用語は、しばしば互換的に使用され、細胞外DNAであるDNA、細胞から押し出されたDNA、またはネクローシス性細胞もしくはアポトーシス性細胞から放出されたDNAを指す。
本明細書で使用する「対象」、「個体」、または「患者」には、本明細書で企図する組成物により検出または識別され得る状態の症状を示す任意の動物が含まれる。好適な対象としては、実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット)、家畜(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ)、飼育動物、すなわちペット(例えば、ネコまたはイヌ)が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳類である。あるいくつかの実施形態では、対象は非ヒト霊長類であり、好ましい実施形態では、対象はヒトである。
「反応容器」とは、本明細書で企図する反応のうちの1つを実行するのに好適な容器を意味する。特定の実施形態での使用に好適な反応容器の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、試験管、マイクロチューブ(例えば、PCRチューブ)、マイクロタイタープレート(例えば、96ウェルプレート、384ウェルプレート、1536ウェルプレート)、スライド、プレート、アレイ、及びマイクロアレイが挙げられる。
C.DNAライブラリーの高効率構築
特定の実施形態では、本明細書で企図するDNAライブラリーの構築方法は、ターゲットDNA断片に対するアダプターの高効率ライゲーションを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図するDNAライブラリーの構築方法は、ターゲットDNA断片に対するアダプターの高効率ライゲーションを含む。
(a)DNA供与源
本明細書で企図する方法及び組成物は、DNAをアナライトに使用して、遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝子疾患、遺伝子モザイク、胎児診断、父子鑑定、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植モニタリングを、効率的に解析、検出、診断、及び/またはモニターするように設計されている。本明細書で企図する組成物及び方法での使用に好適なDNAは、当業者に既知の任意の供与源に由来することができる。特定の実施形態では、当該DNAは、任意の供与源から単離されたゲノムDNA、RNAから合成されたコピーDNA(cDNA)、またはセルフリーDNA(cfDNA)である。
本明細書で企図する方法及び組成物は、DNAをアナライトに使用して、遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝子疾患、遺伝子モザイク、胎児診断、父子鑑定、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植モニタリングを、効率的に解析、検出、診断、及び/またはモニターするように設計されている。本明細書で企図する組成物及び方法での使用に好適なDNAは、当業者に既知の任意の供与源に由来することができる。特定の実施形態では、当該DNAは、任意の供与源から単離されたゲノムDNA、RNAから合成されたコピーDNA(cDNA)、またはセルフリーDNA(cfDNA)である。
一部の実施形態では、当該DNAは、高分子量DNA(>1000bp)である。本明細書で企図する組成物及び方法における高分子量DNAの使用は、断片化ステップを含む場合が多い。高分子量DNAは、約25~約750塩基対、約25~約500塩基対、約25~約250塩基対、約25~約200塩基対、約25~約150塩基対、約25~約100塩基対、約25~約50塩基対、約100~約200塩基対、約150~約180塩基対、約150塩基対、約155塩基対、約160塩基対、約165塩基対、約170塩基対、約175塩基対、または約180塩基対に断片化され得る。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、DNA断片化の例示的な方法としては、以下に限定するものではないが、剪断、超音波処理、酵素消化(制限消化を含む)、さらに他の方法も挙げられる。特定の実施形態では、当技術分野で公知の任意のDNA断片化方法を本発明と共に用いることができる。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、ゲノムDNA及び(cDNA生成用の)RNAの例示的な供与源としては、以下に限定するものではないが、脳組織、骨組織、眼組織、嗅覚組織、筋肉組織、心臓組織、肺組織、肝組織、膵組織、腎組織、胃組織、腸組織、結腸組織、血液、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、***、精漿、前立腺液、***前液(カウパー腺液)、***物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料などからなる群から選択される生体試料が挙げられる。
特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。cfDNAのサイズ分布は、約150bp~約180bp断片の範囲である。断片化は、エンドヌクレアーゼ及び/またはエキソヌクレアーゼ活性の結果であり得るものであり、この断片化により、正確で信頼性の高いロバストなcfDNA解析に対する困難な課題が提示される。cfDNA解析に関するもう1つの課題は、血流における半減期が約15分程度と短いことである。いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、本発明は、その一部として、cfDNAの解析が「リキッドバイオプシー」に類似するものであり、現在の生体プロセスのリアルタイムスナップショットであることを企図している。
一部の実施形態では、血漿画分から単離したcfDNAは、収集プロトコル中に溶解する有核血球から遊離した長い(>10キロ塩基対)高分子量ゲノムDNAにより、実質的に混入され得る。この長い混入DNAは、断片化されないままであれば、十分にクローニング及び増幅しないため、下流ライブラリー調製中に失われる。しかし、特定の実施形態では、DNA断片化がない場合、本明細書で企図する高効率DNAライブラリー構築法は、DNA検体に存在する断片サイズの集合から、より短い(<1000bp)断片を選択的にクローニングする。いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、長い断片と短い断片とのブレンドであるDNA検体から短いcfDNA断片を選択的にクローニングすることは、リキッドバイオプシーの構築に有利である。
特定の実施形態においてcfDNAを単離するための好適な供与源となる生体試料の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、羊水、血液、血漿、血清、***、リンパ液、脳脊髄液、眼球液、尿、唾液、便、粘液、及び汗が挙げられる。
特定の実施形態では、生体試料は血液または血漿である。
あるいくつかの実施形態では、DNA試料は、包埋組織(例えば、FFPEまたは穿刺吸引物)、存在するマイクロバイオーム配列を調べる目的でのスワブ、法医学的試料(例えば、毛髪、衣服、指紋など)、または低入力DNA試料からのライブラリー構築に特に効率的な、本明細書で企図するライブラリー構築法を必要とする任意の他のDNA供与源に由来し得る。
あるいくつかの実施形態では、市販されているキット及び当業者に知られた他の方法を使用して、患者の生体試料から、または過去に取得し、任意選択により安定化させた生体試料(例えば、凍結及び/または酵素キレート剤(EDTA、EGTA、または2価カチオンに特異的な他のキレート剤を含むが、これに限定されない)の添加による安定化)から、直接cfDNAを単離することができる。
(b)インプットDNAの脱リン酸化
特定の実施形態では、インプットDNA(例えばターゲットDNA断片)を、まず、末端のリン酸残基を除去する熱不安定性ホスファターゼで処理する。例えば、図4Aを参照。
特定の実施形態では、インプットDNA(例えばターゲットDNA断片)を、まず、末端のリン酸残基を除去する熱不安定性ホスファターゼで処理する。例えば、図4Aを参照。
本明細書で企図する組成物及び方法における特定の実施形態での使用に好適な、熱不安定性ホスファターゼの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、APex(商標)熱不安定性アルカリホスファターゼ(Epicentre Biotechnologies)、NTPhos(商標)熱不安定性ホスファターゼ(Epicentre Biotechnologies)、HK(商標)熱不安定性ホスファターゼ(Epicentre Biotechnologies)、及びエビ由来アルカリホスファターゼ(SAP;NEB)が挙げられる。
一実施形態では、熱不安定性ホスファターゼはSAPである。
(c)ターゲットDNA断片内のDNA損傷の回復
特定の実施形態では、インプットDNAまたは脱リン酸化DNAに対し1種以上の酵素による処理も行い、DNA損傷の一般的原因(例えば、シトシンのウラシルへの脱アミノ化、グアニンの酸化的付加、チミジンダイマー、脱塩基部位をもたらす塩基の喪失、二重鎖DNAの1本鎖におけるニックまたはギャップなど)を回復させる。例えば、図4Aを参照。
特定の実施形態では、インプットDNAまたは脱リン酸化DNAに対し1種以上の酵素による処理も行い、DNA損傷の一般的原因(例えば、シトシンのウラシルへの脱アミノ化、グアニンの酸化的付加、チミジンダイマー、脱塩基部位をもたらす塩基の喪失、二重鎖DNAの1本鎖におけるニックまたはギャップなど)を回復させる。例えば、図4Aを参照。
一実施形態では、DNAに対する内部損傷を、以下の酵素のうちの1種以上を含む組成物を用いて回復させる:Taq DNAリガーゼ、エンドヌクレアーゼIV、Bst DNAポリメラーゼ、Fpg(8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ)、ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)、T4 PDG(T4エンドヌクレアーゼV)、エンドヌクレアーゼVIII、及びT4 DNAポリメラーゼ。
一実施形態では、DNAに対する内部損傷を、Taq DNAリガーゼ、エンドヌクレアーゼIV、Bst DNAポリメラーゼ、Fpg、ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)、T4 PDG(T4エンドヌクレアーゼV)、エンドヌクレアーゼVIII、及びT4 DNAポリメラーゼを含む組成物を用いて回復させる。
(d)末端修復DNAの生成
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、末端修復DNA断片を生成することを含む。あるいくつかの実施形態では、DNA断片を末端修復して、ブラントエンド、5’-オーバーハング、または3’-オーバーハングを有する末端修復DNA断片を生成する。例えば、図4Aを参照。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、末端修復DNA断片を生成することを含む。あるいくつかの実施形態では、DNA断片を末端修復して、ブラントエンド、5’-オーバーハング、または3’-オーバーハングを有する末端修復DNA断片を生成する。例えば、図4Aを参照。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。
一部の実施形態では、末端修復DNAはブラントエンドを含有する。一部の実施形態では、末端修復DNAがブラントエンドを含有するように処理を行う。好ましい実施形態では、DNA断片を1種以上の末端修復酵素で末端修復して、ブラントエンドを有する末端修復DNA断片を生成する。
本明細書で企図する組成物及び方法の特定の実施形態における、ブランドエンドDNA断片の生成に好適な末端修復酵素の例示的な例としては、重合活性及び3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を保持するが、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているDNAポリメラーゼ(例えば、T4 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片など)が挙げられる。DNAポリメラーゼは、5’オーバーハングを満たすか、または3’オーバーハングを「チューバック」し、ブラントエンドを有するDNA断片のままにする。
一部の実施形態では、末端修復DNAのブラントエンドが単一塩基対オーバーハングを含有するように、さらに修飾する。一部の実施形態では、ブラントエンドを含む末端修復DNAがアデニン(A)/チミン(T)オーバーハングを含有するようにさらに処理してもよい。一部の実施形態では、ブラントエンドを含む末端修復DNAが、単一塩基対オーバーハングとしてアデニン(A)/チミン(T)オーバーハングを含有するように、さらに処理してもよい。一部の実施形態では、末端修復DNAは非鋳型化3’オーバーハングを有する。一部の実施形態では、末端修復DNAが3’オーバーハングを含有するように処理を行う。一部の実施形態では、末端修復DNAが3’オーバーハングを含有するように末端トランスフェラーゼ(TdT)で処理を行う。一部の実施形態では、TdTによりGテールを付加してもよい。一部の実施形態では、末端修復DNAがオーバーハング末端を含有するように、任意の公知の制限酵素(例えば、Sau3A酵素など)による部分的消化を用いて処理を行う。
(e)末端修復DNAに対するプレアダプターのライゲーション
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、二重鎖DNAプレアダプターを末端修復DNAの各末端にライゲーションすることを含む。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、二重鎖DNAプレアダプターを末端修復DNAの各末端にライゲーションすることを含む。
本明細書で使用する「プレアダプター」という用語は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及びパートナー鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖DNA分子またはDNA二重鎖を指す。プレアダプターは、任意の好適なリガーゼを用いて末端修復DNA断片にライゲーションすることができる。一実施形態では、当該リガーゼはT4 DNAリガーゼである。例えば、図4B及び5を参照。
「ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド」とは、5’リン酸を含み、末端修復DNA断片の各3’末端にライゲーション可能なポリヌクレオチドである。
「パートナー鎖オリゴヌクレオチド」は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの一部または全てに対し相補的であり、かつそれにアニーリングする。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは自らの3’末端に修飾を含み、この修飾は、パートナー鎖オリゴヌクレオチドが他のアダプターまたはターゲットDNA断片のリン酸化5’末端にライゲーションすることを防止または実質的に阻害する。ライゲーションをブロックすることができる、パートナー鎖の3’末端における化学的修飾としては、以下に限定するものではないが、ジデオキシリボースヌクレオチド類似体、2-ヒドロキシデオキシリボースリボース類似体、及びリボース糖に対する広範にわたる化学的修飾が挙げられる。
プレアダプターで使用するライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの配列設計及び内容について、いくつかの考慮事項を検討する。ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの長さは、DNAリガーゼの活性温度における安定なDNA二重鎖形成に必要な最小の長さ(約5nt)から、現状の合成能力の限界に及ぶオリゴヌクレオチド(>200nt)まで、様々であり得る。特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、約8~約60ヌクレオチドまたは約8~約15ヌクレオチドである。
DNA断片のNGS解析に関するさらなる考慮事項として、ライゲーション鎖により組み込まれるDNA塩基は、シークエンシング装置がDNAシークエンシング実行時全体にわたってDNA塩基コールを校正するのに使用される。装置及びこのような装置のソフトウェアは、シークエンシングする最初の8~15ヌクレオチドの長さにわたって各塩基位置に4つ全てのDNA塩基が存在することを必要とし、これにはライゲーションアダプター鎖に埋め込まれた塩基が含まれる場合が多い。このため、ライゲーション鎖配列の全体にわたって4つ全ての塩基を相互に所持する4つのライゲーション鎖のセットがしばしば使用される。このようなライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの非限定的な例を表1及び2に示す。
様々な他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、以下の要素を含む:(i)単一プライマーライブラリー増幅用のPCRプライマー結合部位;(ii)一意に識別される各シークエンシングリードに作用する5ヌクレオチドのリードコード;(iii)試料識別配列として作用し、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にし、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ用のアンカーとして作用する、8~15ヌクレオチドのアンカー配列。
様々な他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、試料識別配列として作用し、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にし、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ用のアンカーとして作用する、8~15ヌクレオチドのアンカー配列を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上のPCRプライマー配列、1つ以上のリードコード、1つ以上の試料コード、1つ以上のアンカー配列、または効率的なライゲーション基質である2つ以上の3’ヌクレオチドを含む。追加的な実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドはさらに、1つ以上のシークエンシングプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、DNAライブラリー増幅用の1つ以上のPCRプライマー結合配列を含む。一実施形態では、PCRプライマー結合配列は、約12~約40ヌクレオチド、約18~約40ヌクレオチド、約20~約35ヌクレオチド、または約20~約30ヌクレオチドである。別の実施形態では、PCRプライマー結合配列は、約12ヌクレオチド、約13ヌクレオチド、約14ヌクレオチド、約15ヌクレオチド、約16ヌクレオチド、約17ヌクレオチド、約18ヌクレオチド、約19ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約21ヌクレオチド、約22ヌクレオチド、約23ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約31ヌクレオチド、約32ヌクレオチド、約33ヌクレオチド、約34ヌクレオチド、約35ヌクレオチド、約36ヌクレオチド、約37ヌクレオチド、約38ヌクレオチド、約39ヌクレオチド、または約40ヌクレオチド、またはそれ以上である。
一実施形態では、PCRプライマー結合配列は約25ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上のリードコード配列を含む。本明細書で使用する「リードコード」という用語は、ユニークシークエンシングリードの識別に使用するポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、リードコードはヌクレオチドのランダム配列である。一実施形態では、リードコードは、約1ヌクレオチド、約2ヌクレオチド、約3ヌクレオチド、約4ヌクレオチド、約5ヌクレオチド、約6ヌクレオチド、約7ヌクレオチド、約8ヌクレオチド、約9ヌクレオチド、約10ヌクレオチド、またはそれ以上である。
非限定的な例として、5ヌクレオチドのリードコードは256の可能な一意の配列からなり、選ばれる各コードは、セット内の他の全てのコードとは2ヌクレオチド異なる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となる。特定の実施形態では、特定の配列の組合せに起因して実験上アダプター機能を妨害することが特定されているコードを使用から除外することができる。例えば256のうちの7コードはGヌクレオチドの過剰出現があり、これらを除外した。
他の実施形態では、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のヌクレオチドの各リードコードは、他の全てのリードコードに対し2、3、4、または5ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、リードコードは約5ヌクレオチドであり、任意選択により、他の全てのコードに対し2ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上の試料コード配列を含む。本明細書で使用する「試料コード」という用語は、試料の識別に使用するポリヌクレオチドを指す。試料コードは、多重シークエンシング反応の確立にも有用である。なぜなら、各試料コードは試料に対し一意であることから、多重化シークエンシング反応中に特定の試料からリードを識別するために使用することができるからである。
一実施形態では、試料コードは、約1、約2ヌクレオチド、約3ヌクレオチド、約4ヌクレオチド、または約5ヌクレオチド、またはそれ以上である配列を含む。別の実施形態では、2、3、4、5、またはそれ以上のヌクレオチドの各試料コードは、他の全ての試料コードに対し2、3、4、または5ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、試料コードは約3ヌクレオチドであり、他の試料で使用される他の全てのコードに対し、2ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、1つ以上のアンカー配列を含む。本明細書で使用する「アンカー配列」とは、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも16ヌクレオチドを有し、パートナー鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、以下の特性を含むヌクレオチド配列を指す:(1)各アンカー配列が、一括的に伸長中の各部位における4つの可能なDNA塩基の各々に相当する、4つのアンカー配列のファミリーの一部であること(このバランスの取れた塩基提示の特徴は、特定の実施形態においてシークエンシングリード内の適正な塩基コーリングを校正するのに有用である);(2)各アンカー配列が同じ数のA+C及びG+Tから構成され、そのために各アンカー配列が、4つからなるセット内の他の全てのアンカー配列とおおよそ同じ融解温度及び二重鎖安定性を共有すること。一実施形態では、アンカー配列またはその一部は、試料を識別する働きをしたり、シークエンシング実行中の試料多重化を可能にしたり、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にしたり、パートナー鎖オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイズ用のアンカーとして作用したりもする。
加えて、非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドの設計にはいくつかの考慮を伴う。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、リン酸化されたブラントエンドを形成する領域内のライゲーション鎖オリゴヌクレオチドに対し、少なくとも部分的に相補的(>5nt)である。第二に、パートナー鎖オリゴヌクレオチドの3’末端を修飾して、オリゴヌクレオチドが(特に、自己ライゲーションされたアダプターダイマー形成で)ライゲーション基質になるのをブロックまたは実質的に阻害するようにする。パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、ライゲーションを実施する温度(≦22℃)で、ライゲーション鎖と共に安定した二重鎖を形成するように設計し、それと同時に、修復オリゴヌクレオチドをアダプターに組み込む温度(≧37℃)では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドから分離するように設計する。この設計考慮は、図4B及び5に示す、アダプター/末端修復DNA複合体の生成において、反応がライゲーションから修復オリゴヌクレオチドが介在するアダプター完成ステップにシフトする際の、分離したパートナー鎖オリゴヌクレオチドとして表されている。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、プレアダプターを末端修復DNAにライゲーションして「タグ付き」DNAライブラリーを生成するライゲーションステップを含む。一部の実施形態では、単一種のプレアダプターを用いる。一部の実施形態では、2種、3種、4種、または5種のプレアダプターを用いる。一部の実施形態では、同一配列のプレアダプターを、断片化した末端修復DNAの各末端にライゲーションする。
一実施形態では、複数種のプレアダプターを末端修復DNAライブラリーにライゲーションする。この複数種のプレアダプターのそれぞれは、1つ以上のDNAライブラリー増幅用プライマー結合部位、1つ以上のリードコード配列、1つ以上の試料多重化用配列、1つ以上のアンカー配列、または1つ以上のDNAシークエンシング用配列を含み得る。
(f)アダプター/末端修復DNA複合体の形成
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、プレアダプター/末端修復DNA複合体からパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、離したパートナー鎖オリゴヌクレオチドの代わりに修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を生成することを含む。例えば、図3を参照。特定の実施形態では、アダプターの設計は、単一プライマーまたは二重プライマーの増幅戦略を可能にするように操作することができる。例えば、図4A及び5を参照。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、プレアダプター/末端修復DNA複合体からパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、離したパートナー鎖オリゴヌクレオチドの代わりに修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を生成することを含む。例えば、図3を参照。特定の実施形態では、アダプターの設計は、単一プライマーまたは二重プライマーの増幅戦略を可能にするように操作することができる。例えば、図4A及び5を参照。
特定の実施形態では、本明細書で企図する組成物及び方法は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含むアダプターを末端修復DNAにライゲーションして「タグ付き」DNAライブラリーを生成するライゲーションステップを含む。一部の実施形態では、単一種のアダプターを用いる。一部の実施形態では、2種、3種、4種、または5種のアダプターを用いる。一部の実施形態では、同一配列のプレアダプターを、断片化した末端修復DNAの各末端にライゲーションする。
パートナー鎖オリゴヌクレオチドの設計考慮により、パートナー鎖オリゴヌクレオチドは、修復オリゴヌクレオチドがライゲーション鎖オリゴヌクレオチドにアニールする温度(例えば、>37℃)や、酵素ステップを行って修復オリゴヌクレオチドをアダプター/末端修復DNA複合体に組み込み連続した二重鎖DNAライブラリーモジュールを生成する温度(例えば、>37℃)で、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドから分離するため、プレアダプター/末端修復DNA複合体から離れることが可能となる。
本明細書で使用する「修復オリゴヌクレオチド」という用語は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの一部または全てに対し相補的であり、かつそれにアニーリングするポリヌクレオチド配列を指す。修復オリゴヌクレオチドの長さは、DNAリガーゼの活性温度における安定なDNA二重鎖形成に必要な最小の長さ(約8nt)から、現状の合成能力の限界に及ぶオリゴヌクレオチド(>200nt)まで、様々であり得る。特定の実施形態では、「修復オリゴヌクレオチド」は、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドには必ずしも存在するわけではない付加的な機能的DNA配列を含む。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約8~約15ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドは35~60ヌクレオチドである。この設計では、リガンド鎖オリゴヌクレオチドの配列をプライマー伸長によって伸長し、修復オリゴヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチド配列を生成する。この設計であれば、同一のPCRプライマー結合部位がもたらされると考えられる。同一のPCRプライマー結合部位は、単一プライマーライブラリー増幅戦略を可能にする。例えば、図3D及び4Aを参照。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約35~約60ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドはライゲーション鎖オリゴヌクレオチドに対し完全に相補的である。同一のPCRプライマー結合部位は、単一プライマーライブラリーの増幅戦略を可能にする。例えば、図4Aを参照。
特定の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは約35~約60ヌクレオチドであり、修復オリゴヌクレオチドは約35~約60ヌクレオチドであり、この2つのオリゴヌクレオチドはPCRプライマー結合部位を除いて相補的である。相違するPCRプライマー結合部位は、二重プライマーライブラリー増幅戦略を可能にする。例えば、図5を参照。
好ましい実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、以下の要素を含む:(i)単一プライマーライブラリー増幅用のPCRプライマー結合部位;(ii)一意に識別される各シークエンシングリードに作用する5ヌクレオチドのリードコード;(iii)ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し部分的にまたは完全に相補的な、8~15ヌクレオチドのアンカー配列。
他の実施形態では、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドは、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドのアンカー配列に対し部分的にまたは完全に相補的な、8~15ヌクレオチドのアンカー配列を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、1つ以上のPCRプライマー配列、1つ以上のリードコード、1つ以上の試料コード、1つ以上のアンカー配列、または効率的なライゲーション基質である2つ以上の3’ヌクレオチドを含む。追加的な実施形態では、修復オリゴヌクレオチドはさらに、1つ以上のシークエンシングプライマー結合部位を含む。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、(i)ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド内のPCRプライマー結合部位に対し相補的な1つ以上のPCRプライマー結合配列(単一プライマーDNAライブラリー増幅を可能にする)、または(ii)ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド内のPCRプライマー結合部位に対し相補的ではない1つ以上のPCRプライマー結合配列(二重プライマーDNAライブラリー増幅を可能にする)を含む。一実施形態では、PCRプライマー結合配列は、約12~約40ヌクレオチド、約18~約40ヌクレオチド、約20~約35ヌクレオチド、または約20~約30ヌクレオチドである。別の実施形態では、PCRプライマー結合配列は、約12ヌクレオチド、約13ヌクレオチド、約14ヌクレオチド、約15ヌクレオチド、約16ヌクレオチド、約17ヌクレオチド、約18ヌクレオチド、約19ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約21ヌクレオチド、約22ヌクレオチド、約23ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約31ヌクレオチド、約32ヌクレオチド、約33ヌクレオチド、約34ヌクレオチド、約35ヌクレオチド、約36ヌクレオチド、約37ヌクレオチド、約38ヌクレオチド、約39ヌクレオチド、または約40ヌクレオチド、またはそれ以上である。
一実施形態では、PCRプライマー結合配列は約25ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、1つ以上のリードコード配列を含む。一実施形態では、リードコードはヌクレオチドのランダム配列である。一実施形態では、リードコードは、約1ヌクレオチド、約2ヌクレオチド、約3ヌクレオチド、約4ヌクレオチド、約5ヌクレオチド、約6ヌクレオチド、約7ヌクレオチド、約8ヌクレオチド、約9ヌクレオチド、約10ヌクレオチド、またはそれ以上である。
非限定的な例として、5ヌクレオチドのリードコードは256の可能な一意の配列からなり、選ばれる各コードは、セット内の他の全てのコードとは2ヌクレオチド異なる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となる。特定の実施形態では、特定の配列の組合せに起因して実験上アダプター機能を妨害することが特定されているコードを使用から除外することができる。例えば256のうちの7コードはGヌクレオチドの過剰出現があり、これらを除外した。
他の実施形態では、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のヌクレオチドの各リードコードは、他の全てのリードコードに対し2、3、4、または5ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、リードコードは約5ヌクレオチドであり、任意選択により、他の全てのコードに対し2ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、1つ以上の試料コード配列を含む。一実施形態では、試料コードは、約1、約2ヌクレオチド、約3ヌクレオチド、約4ヌクレオチド、または約5ヌクレオチド、またはそれ以上である配列を含む。別の実施形態では、2、3、4、5、またはそれ以上のヌクレオチドの各試料コードは、他の全ての試料コードに対し2、3、4、または5ヌクレオチド分異なり得る。
一実施形態では、試料コードは約3ヌクレオチドであり、他の試料で使用される他の全てのコードに対し、2ヌクレオチド分異なる。
特定の実施形態では、修復オリゴヌクレオチドは、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの1つ以上のアンカー配列に対し相補的な1つ以上のアンカー配列を含む。
いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、修復オリゴヌクレオチドをアダプター/末端修復DNA複合体に組み込むための少なくとも2つの代表的な戦略が企図されている。
一実施形態では、パートナー鎖オリゴヌクレオチドをプレアダプター/末端修復DNA複合体から離し、修復オリゴヌクレオチドを付加しライゲーション鎖にアニールさせ、ポリヌクレオチドキナーゼ(例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ)を使用して末端修復DNA断片の5’末端にリン酸基を付加し、そしてDNAリガーゼを使用して、修復オリゴヌクレオチドの5’末端と末端修復DNA断片の3’末端との間に存在するニックを修復する。特定の実施形態では、DNAリガーゼは、広範囲の温度にわたり活性を有する熱安定性のニック特異的リガーゼであり、以下に限定するものではないが、Taq DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、9°Northリガーゼ(NEB)、及びリン酸化されたニックを塞ぐことができる他の任意のリガーゼがこれに含まれる。例えば、図3A及び3Bを参照。
別の実施形態では、パートナー鎖オリゴヌクレオチドをプレアダプター/末端修復DNA複合体から離し、修復オリゴヌクレオチドを付加しライゲーション鎖にアニールさせ、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する(そして内在的3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有しない)低処理能力DNAポリメラーゼによってライゲーション鎖オリゴヌクレオチドの3’末端を伸長させ、さらに5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、脱リン酸化された5’末端ヌクレオチド及び隣接するヌクレオチドを除去し、それによってライゲーション可能な5’リン酸基を露出し、酵素が分離する際にニックを残す組み込まれた塩基でこれらを置き換え、そしてDNAリガーゼ(例えば、Taq DNAリガーゼ)を使用してニックを修復する。
本明細書で企図する組成物及び方法の特定の実施形態における使用に好適な、低処理能力DNAポリメラーゼの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Taq DNAポリメラーゼ及びBstI DNAポリメラーゼが挙げられる。
D.DNAライブラリー増幅
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法は、DNAクローンライブラリー、すなわちDNAクローンのライブラリーを生成するためのDNAライブラリーの増幅を含む。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。DNAライブラリーの各分子は、末端修復DNAの各末端にライゲーションしたアダプターを含み、各アダプターは1つ以上のPCRプライマー結合部位を含む。一実施形態では、異なるアダプターを末端修復DNAの異なる末端にライゲーションする。
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法は、DNAクローンライブラリー、すなわちDNAクローンのライブラリーを生成するためのDNAライブラリーの増幅を含む。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。DNAライブラリーの各分子は、末端修復DNAの各末端にライゲーションしたアダプターを含み、各アダプターは1つ以上のPCRプライマー結合部位を含む。一実施形態では、異なるアダプターを末端修復DNAの異なる末端にライゲーションする。
一実施形態では、DNAの両方の末端に同じアダプターをライゲーションする。末端修復DNAの両方の末端に同じアダプターをライゲーションすることで、単一プライマー配列によるPCR増幅が可能になる。特定の実施形態では、アダプターをライゲーションしたDNAライブラリーの一部を、単一プライマー配列駆動増幅による標準的なPCR手法を用いて増幅することになる。一実施形態では、単一プライマー配列は、約25ヌクレオチドであり、任意選択により、標準的なイオン強度条件下で≧55℃の推定Tmを有する。
一実施形態では、末端修復DNA断片の3’末端にライゲーションしたアダプターは、末端修復DNA断片の5’末端にライゲーションしたアダプターとは異なるPCRプライマー結合部位を含む。特定の実施形態では、アダプターをライゲーションしたDNAライブラリーの一部を、2つのプライマー駆動増幅による標準的なPCR手法を用いて増幅することになる。
特定の実施形態では、ピコグラム単位の初期DNAライブラリーをマイクログラム単位のDNAクローンに増幅、つまり10,000倍に増幅する。増幅産物の量は、当技術分野で公知の方法(例えば、Qubit2.0またはNanodrop装置での定量化)を用いて測定することができる。
E.DNAの遺伝子解析方法
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法が提供される。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。cfDNAは、血漿または他の体液に見いだされるセルフリーDNAである。
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法が提供される。特定の実施形態では、当該DNAはcfDNAである。cfDNAは、血漿または他の体液に見いだされるセルフリーDNAである。
特定の実施形態では、DNAの遺伝子解析方法は、DNAライブラリーを生成及び増幅すること、DNAライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること、ならびに1つ以上のゲノムターゲット座位の定量的遺伝子解析を実施することを含む。
1.ゲノム当量数の決定
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法は、DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定することを含む。本明細書で使用する「ゲノム当量」という用語は、各ライブラリーにおけるゲノムコピー数を指す。本明細書で企図する組成物及び方法が遭遇する重要な課題は、遺伝子配列における希少な遺伝子突然変異または相違を検出し解析するのに十分なアッセイ感度を達成することである。試料ごとのアッセイ感度の値を決定するために、シークエンシングライブラリー内に存在するゲノム当量数を測定することにより、各試料内に存在する異なる別々の配列の数を測定する。感度を確立するため、ゲノム当量数は試料ライブラリーごとに測定しなければならない。
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法は、DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定することを含む。本明細書で使用する「ゲノム当量」という用語は、各ライブラリーにおけるゲノムコピー数を指す。本明細書で企図する組成物及び方法が遭遇する重要な課題は、遺伝子配列における希少な遺伝子突然変異または相違を検出し解析するのに十分なアッセイ感度を達成することである。試料ごとのアッセイ感度の値を決定するために、シークエンシングライブラリー内に存在するゲノム当量数を測定することにより、各試料内に存在する異なる別々の配列の数を測定する。感度を確立するため、ゲノム当量数は試料ライブラリーごとに測定しなければならない。
ゲノム当量数は、qPCRアッセイにより、またはシークエンシング実施後のバイオインフォマティクスに基づくカウントにより決定することができる。臨床試料のプロセスフローでは、ゲノム当量のqPCR測定は、DNAライブラリーのQCステップとして使用する。qPCRにより、配列解析の前にアッセイ感度の期待値を確立させ、試料に対応するDNAクローンライブラリーがゲノム当量の要求深度を欠く場合は、その試料を解析から除外することが可能になる。最終的には、バイオインフォマティクスに基づくゲノム当量カウントも使用してゲノム当量を特定する。そのため、それぞれの所与のDNAクローンライブラリーに対するアッセイ感度及び偽陰性推定値も特定される。
実験的qPCRアッセイ及び統計的カウントアッセイは十分に相互関係を有するべきである。シークエンシングによってDNAクローンライブラリーにおける配列深度が明らかにならない場合は、DNAクローンライブラリーの再処理及び/または追加的なシークエンシングが必要となり得る。
一実施形態では、DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量は、定量的PCR(qPCR)アッセイを用いて決定する。特定の実施形態では、既知濃度の標準的なライブラリーを使用して標準曲線を構築し、この得られた標準曲線にqPCRアッセイの測定値を適合させ、適合度からゲノム当量の値を導き出す。反復に基づくアッセイにより測定されるゲノム当量数は、より一貫したライブラリー間パフォーマンスをもたらし、またゲノム当量のqPCR推定値とシークエンシング実行時にバイオインフォマティクス的にカウントしたタグ当量との間のアラインメントをより良好なものにする。
本明細書で企図する反復に基づくゲノム当量アッセイでの使用に好適な、反復の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、短散在型核内反復配列(SINE)(例えば、Alu反復)、長散在型反復配列(LINE)(例えば、LINE1、LINE2、LINE3)、マイクロサテライト反復配列(例えば、短いタンデム反復(STR)、単純反復配列(SSR))、及び哺乳類散在型反復(MIR)が挙げられる。
一実施形態では、当該反復はAlu反復である。
2.定量的遺伝子解析
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法は、DNAライブラリークローンにおける1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を含む。定量的遺伝子解析は、以下のステップの1つ以上、または全てを含む:ターゲット遺伝子座を含むDNAクローンのキャプチャー;キャプチャーしたターゲット遺伝子座の増幅;キャプチャーし増幅したターゲット遺伝子座のシークエンシング;及び得られたシークエンスリードのバイオインフォマティクス解析。
様々な実施形態では、DNAの遺伝子解析方法は、DNAライブラリークローンにおける1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を含む。定量的遺伝子解析は、以下のステップの1つ以上、または全てを含む:ターゲット遺伝子座を含むDNAクローンのキャプチャー;キャプチャーしたターゲット遺伝子座の増幅;キャプチャーし増幅したターゲット遺伝子座のシークエンシング;及び得られたシークエンスリードのバイオインフォマティクス解析。
(a)ターゲット遺伝子座のキャプチャー
本発明は、その一部として、多機能であり、比較的大きいプローブの効率及び信頼性を保持するように設計され、ただしDNAクローンライブラリーにおける情報価値のない配列の生成を最小限にとどめる、キャプチャープローブモジュールを企図している。「キャプチャープローブモジュール」とは、キャプチャープローブ配列及びテール配列を含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュール配列またはその一部は、1つ以上のシークエンシングプライマーのためのプライマー結合部位として働く。
本発明は、その一部として、多機能であり、比較的大きいプローブの効率及び信頼性を保持するように設計され、ただしDNAクローンライブラリーにおける情報価値のない配列の生成を最小限にとどめる、キャプチャープローブモジュールを企図している。「キャプチャープローブモジュール」とは、キャプチャープローブ配列及びテール配列を含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュール配列またはその一部は、1つ以上のシークエンシングプライマーのためのプライマー結合部位として働く。
特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールはキャプチャープローブを含む。本明細書で使用する「キャプチャープローブ」とは、特定のDNAターゲット領域とハイブリダイズする領域を含むポリヌクレオチドを指す。DNAの平均サイズが比較的小さく、また高度に断片化しているため、本明細書で企図する組成物及び方法は、対象となるDNAターゲット領域を調べるための高密度及び比較的短いキャプチャープローブの使用を含む。
特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールを、任意選択によりハプテンを含み、かつテール配列とハイブリダイズするパートナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて、キャプチャープローブモジュール複合体を生成する。
高密度キャプチャープローブの使用に関する特定の懸念の1つは、概して、キャプチャープローブが明確な「配列規則」を用いて設計されていることである。例えば、冗長な配列の領域、または極端な塩基組成バイアスを示す領域は、概して、キャプチャープローブの設計では除外される。しかし、発明者らは、キャプチャープローブの設計規則が柔軟性に欠けることで、プローブの性能に対する実質的影響が生じるわけではないことを発見した。対照的に、位置的な制約により厳密に選ばれたキャプチャープローブは、的確な配列情報を提供し、的確でないマッピング不可能なリードキャプチャーはごくわずかしか示さず、少数の例外を除いて均一で有用で的確なリードをもたらす。その上、近接したプローブ間隔での高冗長性は、時として低性能となるキャプチャープローブを補って余りあるものである。
特定の実施形態では、1つのターゲット領域を複数のキャプチャープローブがターゲットとし、任意の2つ以上のキャプチャープローブは、当該ターゲット領域に対し、互いの10ヌクレオチド以内、互いの15ヌクレオチド以内、互いの20ヌクレオチド以内、互いの25ヌクレオチド以内、互いの30ヌクレオチド以内、互いの35ヌクレオチド以内、互いの40ヌクレオチド以内、互いの45ヌクレオチド以内、または互いの50ヌクレオチド以内、またはそれ以上の数のヌクレオチド以内、さらにこれらの間にある全てのヌクレオチド長で結合するように設計する。
一実施形態では、キャプチャープローブは、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約31ヌクレオチド、約32ヌクレオチド、約33ヌクレオチド、約34ヌクレオチド、約35ヌクレオチド、約36ヌクレオチド、約37ヌクレオチド、約38ヌクレオチド、約39ヌクレオチド、約40ヌクレオチド、約41ヌクレオチド、約42ヌクレオチド、約43ヌクレオチド、約44ヌクレオチド、または約45ヌクレオチドである。
一実施形態では、キャプチャープローブは、約100ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、約400ヌクレオチド、または約100ヌクレオチドである。別の実施形態では、キャプチャープローブは、約100ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、約200ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、約300ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、もしくは約400ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、またはこれらの間にある任意の範囲である。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは60ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは60ヌクレオチドではない。
別の実施形態では、キャプチャープローブは、実質的に60ヌクレオチドより小さいが、同じDNAターゲット領域をターゲットとする60ヌクレオチドのキャプチャープローブと同等に、同様に、またはより良好にハイブリダイズする。
あるいくつかの実施形態では、キャプチャープローブは40ヌクレオチドである。
あるいくつかの実施形態では、キャプチャープローブモジュールはテール配列を含む。本明細書で使用する「テール配列」という用語は、キャプチャープローブモジュールの5’末端におけるポリヌクレオチドを指し、これは特定の実施形態においてプライマー結合部位として働き得る。特定の実施形態では、シークエンシングプライマーは、テール領域内のプライマー結合部位に結合する。
特定の実施形態では、テール配列は、約5~約100ヌクレオチド、約10~約100ヌクレオチド、約5~約75ヌクレオチド、約5~約50ヌクレオチド、約5~約25ヌクレオチド、または約5~約20ヌクレオチドである。あるいくつかの実施形態では、第3の領域は、約10~約50ヌクレオチド、約15~約40ヌクレオチド、約20~約30ヌクレオチド、もしくは約20ヌクレオチド、または間にある任意の数のヌクレオチドである。
特定の実施形態では、テール配列は、約30ヌクレオチド、約31ヌクレオチド、約32ヌクレオチド、約33ヌクレオチド、約34ヌクレオチド、約35ヌクレオチド、約36ヌクレオチド、約37ヌクレオチド、約38ヌクレオチド、約39ヌクレオチド、または約40ヌクレオチドである。
様々な実施形態では、キャプチャープローブモジュールは、キャプチャープローブとハイブリダイズするタグ付き及び/または増幅したDNAライブラリーにおける1つ以上のキャプチャーした断片の単離及び/または精製を可能にする、特定のメンバーの結合ペアを含む。特定の実施形態では、キャプチャープローブモジュールは、ビオチンまたは他の好適なハプテン(例えば、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン)に結合する。
様々な実施形態では、キャプチャープローブモジュールを、タグ付きの、任意選択により増幅したDNAライブラリーとハイブリダイズして、複合体を形成する。一部の実施形態では、多機能のキャプチャープローブモジュールは、DNAライブラリーにおける特定のゲノムターゲット領域と実質的にハイブリダイズする。
ハイブリダイズまたはハイブリダイズ条件には、2つのヌクレオチド配列が安定した複合体を形成する(例えば、タグ付きDNAライブラリー及びキャプチャープローブモジュールが安定したタグ付きDNAライブラリー-キャプチャープローブモジュール複合体を形成する)任意の反応条件が含まれ得る。このような反応条件は、当技術分野において周知であり、当業者であれば、このような条件は、例えばアニーリング温度を低くし長さの短いキャプチャープローブを用いるというように、必要に応じて、かつ本発明の範囲内で改変することができることを理解することになる。キャプチャープローブ複合体の第2の領域が、タグ付きDNAライブラリーの領域に対し、100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92% 91%、90%、89%、88%、85%、80%、75%、または70%の配列同一性、相同性、または相補性を示す場合、実質的なハイブリダイズが起こり得る。
特定の実施形態では、キャプチャープローブは約40ヌクレオチドであり、約44℃~約47℃の最適アニーリング温度を有する。
あるいくつかの実施形態では、本明細書で企図する方法は、タグ付きDNAライブラリー-キャプチャープローブモジュール複合体を単離することを含む。特定の実施形態では、DNA複合体を単離する方法は当業者に周知であり、当業者が適切とみなす任意の方法を本発明の方法で用いることができる(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,2007-2012)。特定の実施形態では、ビオチン-ストレプトアビジン単離技術を用いて複合体を単離する。一部の実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列とハイブリダイズ可能なキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾して、5’末端または3’末端にビオチンを含有するようにする。このビオチンは、DNA複合体の単離方法で使用するカラム、ビーズ、または基質に連結させたストレプトアビジンと相互作用可能である。
一実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列とハイブリダイズ可能なキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾して、3’末端にビオチンを含有するようにする。このビオチンは、DNA複合体の単離方法で使用するカラム、ビーズ、または基質に連結させたストレプトアビジンと相互作用可能である。
特定の実施形態では、多機能キャプチャープローブモジュールのテール配列をキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きDNAライブラリー-多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成する前に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きDNAライブラリー-多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成した後に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、タグ付きDNAライブラリー-多機能キャプチャープローブモジュール複合体を形成するのと同時に、多機能キャプチャープローブモジュールをキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、キャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを化学的に修飾する。一実施形態では、ハプテンを5’または3’末端に付加することによりキャプチャーパートナーオリゴヌクレオチドを修飾する。一実施形態では、当該ハプテンはビオチンである。
特定の実施形態では、単離したタグ付きDNAライブラリー-キャプチャープローブモジュール複合体からの1本鎖の3’末端除去を企図している。あるいくつかの実施形態では、当該方法は、1本鎖の3’末端を除去するための、単離したタグ付きDNAライブラリー-多機能キャプチャープローブモジュール複合体の3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素処理を含む。
あるいくつかの他の実施形態では、当該方法は、単離したタグ付きDNAライブラリー断片を鋳型として利用して多機能キャプチャープローブの5’-3’DNAポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
あるいくつかの他の実施形態では、当該方法は、5’FLAPエンドヌクレアーゼ、DNA重合、及びDNAリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、ハイブリッドキャプチャープローブ-単離したタグ付きDNAターゲット分子を創出することを含む。
単離したタグ付きDNAライブラリー-多機能キャプチャープローブモジュール複合体の3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素処理用に様々な酵素を用いることができる。3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、特定の実施形態で使用することができる好適な酵素の例示的例としては、以下に限定するものではないが、T4またはエキソヌクレアーゼI、III、Vが挙げられる(Shevelev IV,Hubscher U.,“The 3’ 5’ exonucleases,”Nat Rev Mol Cell Biol.3(5):364-76(2002)も参照)。特定の実施形態では、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を備える酵素はT4である。特定の実施形態では、3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、プライマー鋳型伸長が可能な酵素を使用することができ、これには、例えばT4またはエキソヌクレアーゼI、III、V(同上)が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書で企図する方法は、上記または本明細書の他の箇所で論じられている3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素処理をした複合体に、シークエンシング及び/またはPCRを実施することを含む。特定の実施形態では、ハイブリッド核酸分子を生成するために、キャプチャープローブ分子のテール部分を複製する。一実施形態では、生成したハイブリッド核酸分子は、キャプチャープローブモジュールとハイブリダイズ可能なターゲット領域と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む。
特定の実施形態では、遺伝子解析は、a)1つ以上のキャプチャープローブモジュールを複数のDNAライブラリークローンにおける1つ以上のターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、1つ以上のキャプチャープローブモジュール-DNAクローン複合体を形成すること;b)a)からの1つ以上のキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体を単離すること;c)ステップb)からの1つ以上の単離したキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体を酵素処理すること;d)c)からの酵素処理した複合体にPCRを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャープローブ分子のテール部分を複製し、増幅したハイブリッド核酸分子が、キャプチャープローブとハイブリダイズ可能なターゲットゲノム座位内のターゲット配列と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること;及びe)d)からの増幅したハイブリッド核酸分子に定量的遺伝子解析を実施すること、を含む。
特定の実施形態では、特定のターゲット遺伝子座のコピー数を決定する方法が企図され、当該方法は、a)1つ以上のキャプチャープローブモジュールを複数のDNAライブラリークローンにおける1つ以上のターゲット遺伝子座とハイブリダイズして、1つ以上のキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体を形成すること;b)a)からの1つ以上のキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体を単離すること;c)ステップb)からの1つ以上の単離したキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体を酵素処理すること;d)c)からの酵素処理した複合体にPCRを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャープローブ分子のテール部分を複製し、増幅したハイブリッド核酸分子が、キャプチャープローブとハイブリダイズ可能なターゲット遺伝子座内のターゲット配列と、キャプチャープローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること;e)d)における増幅したハイブリッド核酸分子にPCR増幅を実施すること;及びf)e)におけるPCR反応を定量化すること、を含み、当該定量化によって、特定のターゲット領域のコピー数を決定することができる。
一実施形態では、ステップc)の酵素処理は、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、b)からの1つ以上のキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン複合体に3’-5’エキソヌクレアーゼ酵素処理を実施して1本鎖の3’末端を除去すること;5’FLAPエンドヌクレアーゼ、DNA重合、及びDNAリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、1つ以上のハイブリッドキャプチャープローブモジュール-DNAライブラリークローン分子を創出すること;または、複合体内の単離したDNAクローンを鋳型として用いてキャプチャープローブの5’-3’DNAポリメラーゼ伸長を実施すること、を含む。
一実施形態では、ステップc)の酵素処理は、複合体内の単離したDNAクローンを鋳型として用いてキャプチャープローブの5’-3’DNAポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
特定の実施形態では、当業者に周知である任意の標準的なPCR反応条件を用いてPCRを実施することができる。あるいくつかの実施形態では、e)におけるPCR反応は、2つのPCRプライマーを用いる。一実施形態では、e)におけるPCR反応は、ターゲット遺伝子座内の反復とハイブリダイズする第1のPCRプライマーを用いる。特定の実施形態では、e)におけるPCR反応は、ターゲット遺伝子座/テール接合部におけるハイブリッド核酸分子とハイブリダイズする第2のPCRプライマーを用いる。あるいくつかの実施形態では、e)におけるPCR反応は、ターゲット遺伝子座とハイブリダイズする第1のPCRプライマーを用い、第2のPCRプライマーはターゲット遺伝子座/テール接合部における増幅したハイブリッド核酸分子とハイブリダイズする。特定の実施形態では、第2のプライマーはターゲット遺伝子座/テール接合部とハイブリダイズして、プライマーの少なくとも1つ以上のヌクレオチドがターゲット遺伝子座とハイブリダイズし、プライマーの少なくとも1つ以上のヌクレオチドがテール配列とハイブリダイズする。
あるいくつかの実施形態では、ステップe)から取得する増幅したハイブリッド核酸分子をシークエンシングし、配列を水平方向にアラインメントする。すなわち、参照配列に対してではなく、互いに対しアラインメントする。特定の実施形態では、a)~e)のステップを1つ以上のキャプチャープローブモジュールで1回以上反復する。キャプチャープローブモジュールは同じであっても異なっていてもよく、ターゲット遺伝子座のいずれかのDNA鎖をターゲットとするように設計され得る。一部の実施形態では、キャプチャープローブが異なる場合、これらのキャプチャープローブは、タグ付きDNAクローンライブラリーにおけるターゲット遺伝子座内のオーバーラップまたは隣接するターゲット配列でハイブリダイズする。一実施形態では、高密度キャプチャープローブ戦略を使用し、複数のキャプチャープローブはターゲット遺伝子座にハイブリダイズし、複数のキャプチャープローブのそれぞれは、タグ付きDNAクローンライブラリーにおけるターゲット遺伝子座とハイブリダイズする任意の他のキャプチャープローブから約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200bp以内(間にある全ての距離を含む)のターゲット遺伝子座とハイブリダイズする。
一部の実施形態では、当該方法は、ターゲット遺伝子座ごとに2つのキャプチャープローブモジュールを用いて実施することができ、この一方がターゲット領域の上流にある「ワトソン」鎖(非コード鎖または鋳型鎖)とハイブリダイズし、一方がターゲット領域の下流にある「クリック」鎖(コード鎖または非鋳型鎖)とハイブリダイズする。
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法はさらに、ターゲット遺伝子座ごとに、任意の組合せでワトソン鎖またはクリック鎖とハイブリダイズする任意の数のキャプチャープローブモジュール、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、またはそれ以上のキャプチャープローブモジュールを用いて、複数回実施することができる。一部の実施形態では、取得した配列は、複数の相違のいずれかを識別するために相互にアラインメントすることができる。
あるいくつかの実施形態では、複数のターゲット遺伝子座を、1つ以上のキャプチャープローブモジュールを用いた1回の反応で、例えば100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、50000、100000、500000またはそれ以上調べる。
(b)シークエンシング
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、本明細書の他の箇所、上記で論じているように複数のハイブリッド核酸分子をシークエンシングして、複数のユニークシークエンシングリードを取得するのに十分なシークエンシング深度を生成することを含む。ユニークリードは、いずれもがDNA内で同じリードコード及び配列開始点を共有するリードの「ファミリー」からの単一の共通リードとして定義される。各キャプチャープローブは、ファミリーに分類することにより全リードから計算的に抽出されるユニークリードのセットをもたらす。次に所与の試料におけるユニークリードを、プローブごとに観察される全てのユニークリードの平均値として計算する。明らかなコピー数の変化がある場合は、平均値の計算に使用するデータセットから除外する。ユニークリードは、それぞれがユニークDNAクローンから導き出されなければならないため、重要である。それぞれのユニークリードは、ゲノムDNAの半数体相当物の入力及び解析を表す。ユニークリードの和は、解析した半数体ゲノムの和である。そして解析したゲノムの数は、シークエンシングアッセイの感度を定義する。非限定的な例として、ユニークリードの平均カウントが100ゲノム当量である場合、この特定のアッセイは100のうちの1つの突然変異リード、すなわち1%を検出することができる感度を有する。これを下回るいかなる観察も防御可能ではない。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、本明細書の他の箇所、上記で論じているように複数のハイブリッド核酸分子をシークエンシングして、複数のユニークシークエンシングリードを取得するのに十分なシークエンシング深度を生成することを含む。ユニークリードは、いずれもがDNA内で同じリードコード及び配列開始点を共有するリードの「ファミリー」からの単一の共通リードとして定義される。各キャプチャープローブは、ファミリーに分類することにより全リードから計算的に抽出されるユニークリードのセットをもたらす。次に所与の試料におけるユニークリードを、プローブごとに観察される全てのユニークリードの平均値として計算する。明らかなコピー数の変化がある場合は、平均値の計算に使用するデータセットから除外する。ユニークリードは、それぞれがユニークDNAクローンから導き出されなければならないため、重要である。それぞれのユニークリードは、ゲノムDNAの半数体相当物の入力及び解析を表す。ユニークリードの和は、解析した半数体ゲノムの和である。そして解析したゲノムの数は、シークエンシングアッセイの感度を定義する。非限定的な例として、ユニークリードの平均カウントが100ゲノム当量である場合、この特定のアッセイは100のうちの1つの突然変異リード、すなわち1%を検出することができる感度を有する。これを下回るいかなる観察も防御可能ではない。
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は複数の試料に由来するハイブリッド核酸分子の多重シークエンシングを含む。
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析は、それぞれが第1のDNA配列及び第2のDNA配列を含む、1つ以上または複数のタグ付きDNAライブラリーのクローンを取得することであって、第1のDNA配列がターゲットとする遺伝子座内に配列を含み、第2のDNA配列がキャプチャープローブ配列を含む、取得すること;1つ以上のクローンに対し、ペアリングした末端のシークエンス反応を実施し1つ以上のシークエンシングリードを取得すること、または、1つ以上のクローンに対し、約100、200、300、400、500またはそれ以上のヌクレオチドを上回る単一の長いシークエンシングリードを取得するシークエンシング反応を実施することであって、リードが第1のDNA配列及び第2のDNA配列の両方を識別するのに十分である、実施すること;ならびに、1つ以上のクローンのシークエンシングリードをシークエンシングリードのプローブ配列に従って序列化またはクラスター化すること、を含む。
(c)バイオインフォマティクス解析
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析はさらに、シークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。バイオインフォマティクス解析により、シークエンシングのための組成物または方法が不在の場合に実施されるいかなる純粋な精神的解析も除外される。あるいくつかの実施形態では、バイオインフォマティクス解析には、以下に限定するものではないが、配列アラインメント、ゲノム当量解析、一塩基変異(SNV)解析、遺伝子コピー数多型(CNV)解析、及び遺伝子病変の検出が含まれる。特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、DNAクローンライブラリーにおいて解析するゲノム当量数の定量化、ターゲット遺伝子座における遺伝子様相の検出、ターゲット遺伝子座における遺伝子病変の検出、及びターゲット遺伝子座におけるコピー数変動の測定に有用である。
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析はさらに、シークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。バイオインフォマティクス解析により、シークエンシングのための組成物または方法が不在の場合に実施されるいかなる純粋な精神的解析も除外される。あるいくつかの実施形態では、バイオインフォマティクス解析には、以下に限定するものではないが、配列アラインメント、ゲノム当量解析、一塩基変異(SNV)解析、遺伝子コピー数多型(CNV)解析、及び遺伝子病変の検出が含まれる。特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、DNAクローンライブラリーにおいて解析するゲノム当量数の定量化、ターゲット遺伝子座における遺伝子様相の検出、ターゲット遺伝子座における遺伝子病変の検出、及びターゲット遺伝子座におけるコピー数変動の測定に有用である。
配列アラインメントは、配列リードと1つ以上のヒト参照DNA配列との間で実施することができる。特定の実施形態では、シークエンシングアラインメントは、ターゲット遺伝子座における遺伝子病変の検出に使用することができ、遺伝子病変の検出には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子病変の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患に対する診断、予後判定、治療、及び/またはモニターに有用であり得る。
本明細書では、参照配列に対するアラインメントの必要なしに実施することができる配列アラインメント解析の方法も企図されており、本明細書ではこの方法を水平配列解析と呼ぶ。このような解析は、本明細書で企図する方法または他の任意の方法によって生成した任意の配列に対し実施することができる。特定の実施形態では、当該配列解析は、本明細書で企図する方法によって取得したリードに対し、配列アラインメントを実施することを含む。
一実施形態では、DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量は、シークエンシングの実施後にバイオインフォマティクスに基づくカウントを用いて決定する。各シークエンシングリードは特定のキャプチャープローブに関連づけられており、各キャプチャープローブに割り当てられたリードの集合を構文解析して群に分ける。群内における個々のリードのセットは、ゲノム配列内で同じリードコード及び同じDNA配列の開始位置を共有する。これらの個々のリードは「ファミリー」に分類され、このファミリーを代表する1つのコンセンサスを「ユニークリード」として進める。ファミリーを構成する個々のリードの全ては、1つのライゲーション事象から導き出されるため、これらは互いに増幅由来の「兄弟」である。それぞれのユニークリードは一意のライゲーション事象とみなされ、ユニークリードの和は、解析ゲノム当量数に相当するとみなされる。
ユニーククローンの数が、可能な配列組合せの総数に近づくにつれ、独立した事象により同じコード及び開始部位の組合せが創出され、これらの独立した事象が不適切な形で1つのファミリーに分類される可能性が生じる。最終結果は、解析ゲノム当量より少ない見積もりとなり、希少な突然変異リードは、同じ識別子を有する野生型リードと重複するという理由からシークエンシングエラーとして廃棄される場合がある。
特定の実施形態では、DNAクローンライブラリーの正確な解析を提供するため、解析ゲノム当量数は、可能なユニーククローンの数の約1/10、約1/12、約1/14、約1/16、約1/18、約1/20、約1/25またはそれ以下である。上で概説されている手順は例示的なものに過ぎず、非限定的であることを理解されたい。
一部の実施形態では、解析するゲノム当量数を増加させる必要があり得る。ゲノム当量の深度を拡大するため、少なくとも2つの解決策が企図されている。第1の解決策は、試料ごとに2つ以上のアダプターセットを使用することである。アダプターを組み合わせることにより、可能なクローンの総数を乗法的に拡大し、そのためゲノム入力の無理のない限界を拡大することが可能である。第2の解決策は、リードコードを1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つ、またはそれ以上の塩基の分拡大することである。他の全てのリードコードから少なくとも2塩基の分異なる可能なリードコードの数は、4(n-1)のスケールであり、式中、nはリードコード内の塩基の数である。したがって、非限定的な例において、リードコードが5ヌクレオチドであれば4(5-1)=256であるから、追加的な塩基を含めることで、利用可能なレパートリーは追加塩基1つにつき4倍拡大する。
一実施形態では、定量的遺伝子解析は、希少な一塩基変異(SNV)を識別するための、シークエンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。
次世代シークエンシングは、大まかに0.02~0.02%の固有のエラー率を有し、これは1/200~1/500のいずれかの塩基コールが不正確であることを意味する。これより低い頻度(例えば、1000配列当たり1の頻度)で発生するバリアント及び他の突然変異を検出するため、分子アノテーション戦略を援用する必要がある。非限定的な例として、ターゲット化配列キャプチャー技術を用いて5000の一意の分子を解析すれば、>50,000リードの十分なシークエンシング深度で、5000ユニークリードの集合(各ユニークリードは、いずれもが同じリードコードを所持しているリードの「ファミリー」に属する)が生成されることになる。ファミリー内で発生するSNVは、希少バリアントとしての候補である。この同じバリアントが2つ以上のファミリーで観察される場合、開始試料内に存在する希少バリアントとしての非常に有力な候補となる。これに対し、複数ファミリー内で散発的に生じるバリアントはシークエンシングエラーである可能性があり、1つのみのファミリー内で生じるバリアントは、希少であるかまたはex vivoで生じる塩基変更(例えば、DNA塩基の酸化またはPCRにより導入されたエラー)の結果である。
一実施形態では、SNVを検出する方法は、アッセイにおける所望ターゲット感度の10倍多いゲノム入力(ゲノムまたはゲノム当量)を導入することを含む。非限定的な一例では、所望の感度が2%(100のうち2)である場合、実験的ターゲットは2000ゲノムの入力である。
特定の実施形態では、シークエンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、遺伝子の様相、状態、または疾患、遺伝子モザイク、胎児試験、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連するSNVの検出または識別に使用する。
様々な実施形態では、コピー数決定解析の方法であって、それぞれが第1のDNA配列及び第2のDNA配列を含む、1つ以上または複数のクローンを取得することを含み、第1のDNA配列がターゲットとする遺伝子座内に配列を含み、第2のDNA配列がキャプチャープローブ配列を含む、方法が提供される。関係する実施形態では、1つ以上のクローンに対し、ペアリングした末端のシークエンシング反応を実施し、1つ以上のシークエンシングリードを取得する。別の実施形態では、1つ以上のクローンに対し、約100のヌクレオチドを上回る単一の長いシークエンシングリードを取得するシークエンシング反応を実施し、このリードは、第1のDNA配列及び第2のDNA配列の両方を識別するのに十分である。1つ以上のクローンのシークエンシングリードは、シークエンシングリードのプローブ配列に従って序列化またはクラスター化することができる。
コピー数解析には、以下に限定するものではないが、所与のゲノムDNA試料で生じる特定の遺伝子または突然変異のコピー数を調べる解析が含まれ、またさらに、所与の遺伝子のコピー数または所与の試料における配列相違数の定量的決定も含まれ得る。特定の実施形態では、コピー数解析は、遺伝子の様相、状態、または疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連する遺伝子増幅の検出または識別に使用する。
特定の実施形態では、シークエンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、ターゲット座位における1つ以上の配列または遺伝子病変の検出または識別に使用することができ、これらの検出には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子病変の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患に対する診断、予後判定、治療、及び/またはモニターに有用であり得る。一実施形態では、遺伝子病変は、遺伝子の様相、状態、または疾患、胎児試験、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターに関連する。
F.定量的遺伝子解析の臨床応用
様々な実施形態では、本発明は、対象における状態または疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法を企図している。
様々な実施形態では、本発明は、対象における状態または疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法を企図している。
特定の実施形態では、対象における遺伝子の様相、状態、または疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法は、DNAクローンライブラリーにおける1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施して、1つ以上のターゲット遺伝子座の配列における変化を検出または識別することを含む。一実施形態では、当該DNAはcfDNAである。
特定の実施形態では、遺伝子疾患、遺伝子モザイク、胎児試験、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断またはモニター、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植のモニターからなる群から選択される、遺伝子様相、または遺伝子の状態もしくは疾患を検出、識別、予測、診断、またはモニターする方法は、DNAクローンライブラリーにおける1つ以上のターゲット遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施して、1つ以上のターゲット遺伝子座の配列におけるヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再構成、コピー数の変化、または遺伝子融合を検出または識別することを含む。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる遺伝子疾患の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、がん、アルツハイマー病(APOE1)、シャルコー・マリー・トゥース病、レーバー遺伝性視覚性ニューロパシー(LHON)、アンジェルマン症候群(UBE3A、ユビキチン-タンパク質リガーゼE3A)、プラダー・ウィリー症候群(15番染色体における領域)、β-地中海貧血症(HBB、β-グロビン)、ゴーシェ病(I型)(GBA、グルコセレブロシダーゼ)、嚢胞性線維症(CFTR上皮性塩素イオンチャネル)、鎌状赤血球症(HBB、β-グロビン)、テイ・サックス病(HEXA、ヘキソサミニダーゼA)、フェニルケトン尿症(PAH、フェニルアラニンヒドロリアーゼ)、家族性高コレステロール血症(LDLR、低密度リポタンパク質受容体)、成人型嚢胞腎(PKD1、ポリシスチン)、ハンチントン病(HDD、ハンチンチン)、神経線維腫症I型(NF1、NF1腫瘍抑制遺伝子)、筋緊張性ジストロフィー(DM、ミオトニン)、結節性硬化症(TSC1、ツベリン)、軟骨形成不全(FGFR3、線維芽細胞増殖因子受容体)、脆弱X染色体症候群(FMR1、RNA結合タンパク質)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD、ジストロフィン)、血友病A(F8C、血液血液凝固第VIII因子)、レッシュ・ナイハン症候群(HPRT1、ヒポキサンチングアニンリボシルトランスフェラーゼ1)、及び副腎白質ジストロフィー(ABCD1)が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができるがんの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、B細胞がん(例えば、多発骨髄腫)、黒色腫、乳がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん、すなわちNSCLC)、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜のがん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂のがん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、結腸がん、多発骨髄腫(MM)、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性障害(MPD)、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、真性多血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝臓がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胚性がん、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上皮腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頚部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性過好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、カルチノイド腫瘍などが挙げられる。
一実施形態では、遺伝子病変は、Cosmicデータベースで注釈が付けられた病変(病変及び配列データはcancer.sanger.ac.uk/cosmic/censusからダウンロード可能)またはCancer Genome Atlasで注釈が付けられた病変(病変及び配列データはtcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jspからダウンロード可能)である。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができるがんに関連する1つ以上の遺伝子病変を有する遺伝子の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ABCB1、ABCC2、ABCC4、ABCG2、ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、AKT3、ALDH4A1、ALK、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ATM、ATR、AURKA、AURKB、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BRAF、BRCA1、BRCA2、Clorf144、CARD11、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDH1、CDH2、CDH20、CDH5、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、CTNNB1、CYP1B1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DNMT3A、DOT1L、DPYD、EGFR、EPHA3、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHB1、EPHB4、EPHB6、EPHX1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERG、ESR1、ESR2、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZH2、FANCA、FBXW7、FCGR3A、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FOXP4、GATA1、GNA11、GNAQ、GNAS、GPR124、GSTP1、GUCY1A2、HOXA3、HRAS、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2R、IKBKE、IKZF1、INHBA、IRS2、ITPA、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KDR、KIT、KRAS、LRP1B、LRP2、LTK、MAN1B1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTHFR、MTOR、MUTYH、MYC、MYCL1、MYCN、NF1、NF2、NKX2-1、NOTCH1、NPM1、NQO1、NRAS、NRP2、NTRK1、NTRK3、PAK3、PAX5、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PIK3R1、PKHD1、PLCG1、PRKDC、PTCH1、PTEN、PTPN11、PTPRD、RAF1、RARA、RB1、RET、RICTOR、RPTOR、RUNX1、SLC19A1、SLC22A2、SLCO1B3、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SOD2、SOX10、SOX2、SRC、STK11、SULT1A1、TBX22、TET2、TGFBR2、TMPRSS2、TNFRSF14、TOP1、TP53、TPMT、TSC1、TSC2、TYMS、UGT1A1、UMPS、USP9X、VHL、及びWT1が挙げられる。
特定の実施形態では、遺伝子病変は、ヌクレオチドのトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
一実施形態では、遺伝子病変は、ALK遺伝子の3’コード領域を別の遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
一実施形態では、遺伝子病変は、ALK遺伝子の3’コード領域をEML4遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる胎児試験に好適な条件の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ダウン症候群(トリソミー21)、エドワード症候群(トリソミー18)、パトー症候群(トリソミー13)、クラインフェルター症候群(XXY)、トリプルX症候群、XYY症候群、トリソミー8、トリソミー16、ターナー症候群(XO)、ロバートソン転座、ディジョージ症候群、及びウォルフ・ヒルショルン症候群が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる父子鑑定に好適なアレルの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、D20S1082、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D4S2364、D9S1122、D2S1776、D10S1425、D3S3053、D5S2500、D1S1627、D3S4529、D2S441、D17S974、D6S1017、D4S2408、D9S2157、アメロゲニン、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、及びD14S1434のうちの16以上が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる、薬物に対する応答の予測に好適な遺伝子の例示的な例としては、以下の遺伝子のうちの1つ以上が挙げられるが、これに限定されない:ABCB1(ATP結合カセット、サブファミリーB(MDR/TAP)、メンバー1)、ACE(アンギオテンシンI変換酵素)、ADH1A(アルコールデヒドロゲナーゼ1A(クラスI)、アルファポリペプチド)、ADH1B(アルコールデヒドロゲナーゼIB(クラスI)、ベータポリペプチド)、ADH1C(アルコールデヒドロゲナーゼ1C(クラスI)、ガンマポリペプチド)、ADRB1(アドレナリン性、ベータ1-、受容体)、ADRB2(アドレナリン性、ベータ2-、受容体、表面)、AHR(アリール炭化水素受容体)、ALDH1A1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1)、ALOX5(アラキドン酸5-リポキシゲナーゼ)、BRCA1(乳がん1、早発性)、COMT(カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ)、CYP2A6(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーA、ポリペプチド6)、CYP2B6(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーB、ポリペプチド6)、CYP2C9(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーC、ポリペプチド9)、CYP2C19(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーC、ポリペプチド19)、CYP2D6(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーD、ポリペプチド6)、CYP2J2(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーJ、ポリペプチド2)、CYP3A4(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド4)、CYP3A5(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド5)、DPYD(ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ)、DRD2(ドーパミン受容体D2)、F5(凝固因子V)、GSTP1(グルタチオンS-トランスフェラーゼパイ)、HMGCR(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼ)、KCNH2(カリウム電位開口型チャネル、サブファミリーH(eag関連)、メンバー2)、KCNJ11(カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーJ、メンバー11)、MTHFR(5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(NADPH))、NQO1(NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ、キノン1)、P2RY1(プリン性受容体P2Y、Gタンパク質共役、1)、P2RY12(プリン性受容体P2Y、Gタンパク質共役、12)、PTGIS(プロスタグランジンI2(プロスタサイクリン)シンターゼ)、SCN5A(ナトリウムチャネル、電位開口型、V型、アルファ(QT延長症候群3))、SLC19A1(溶質担体ファミリー19(葉酸輸送体)、メンバー1)、SLCO1B1(溶質担体有機アニオン輸送体ファミリー、メンバー1B1)、SULT1A1(スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞基質、1A、フェノール選好、メンバー1)、TPMT(チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ)、TYMS(チミジル酸シンターゼ)、UGT1A1(UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1)、VDR(ビタミンD(1,25-ジヒドロキシビタミンD3)受容体)、VKORC1(ビタミンKエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット1)。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる医学的状態の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、脳卒中、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、心疾患、心臓発作、アンギナ、粥状動脈硬化、及び高血圧が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる病原体の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、細菌、真菌、及びウイルスが挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる細菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Mycobacterium種、Pneumococcus種、Escherichia種、Campylobacter種、Corynebacterium種、Clostridium種、Streptococcus種、Staphylococcus種、Pseudomonas種、Shigella種、Treponema種、またはSalmonella種が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができる真菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Aspergillis種、Blastomyces種、Candida種、Coccicioides種、Cryptococcus種、皮膚糸状菌、Tinea種、Trichophyton種、Microsporum種、Fusarium種、Histoplasma種、Mucoromycotina種、Pneumocystis種、Sporothrix種、Exserophilum種、またはCladosporium種が挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーンすることができるウイルスの例示的な例としては、以下に限定するものではないが、A型インフルエンザ(例えば、H1N1、H1N2、H3N2、及びH5N1(トリインフルエンザ))、B型インフルエンザ、C型インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス(例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥーベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス1&2、及びオーストラリアコウモリウイルス)、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス(HHV)、ヒトヘルペスウイルス6型及び8型)、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳がんウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)及びラウス肉腫ウイルス(RSV)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス;1型HIV及び2型HIVを含む)、ビスナ・マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、及びサル免疫不全ウイルス(SIV)、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス(例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV))、Bunyaviridiae(例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱の原因ウイルス、リフトバレー出血熱ウイルス)、Filoviridae(フィロウイルス)(エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含む)、Flaviviridae(キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスを含む)、ならびにParamyxoviridae(例えば、ヘンドラウイルス及びニパーウイルス、大痘瘡及び小痘瘡(天然痘))、アルファウイルス(例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎)、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)、西ナイルウイルス、ならびに任意の脳炎原因ウイルスが挙げられる。
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、またはモニターすることができる、被移植者における臓器移植のモニターに好適な遺伝子の例示的な例としては、以下の遺伝子のうちの1つ以上が挙げられるが、これに限定されない:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP、及びHLA-DQ。
特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、DNAクローンライブラリーにおいて解析されるゲノム当量数の定量化;ターゲット遺伝子座における遺伝子バリアントの検出;ターゲット遺伝子座における突然変異の検出;ターゲット遺伝子座における遺伝子融合の検出、またはターゲット遺伝子座におけるコピー数変動測定のために使用する。
G.コンパニオン診断
様々な実施形態では、遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、対象の生体試料からDNA(例えば、cfDNA)を単離または取得すること;DNAの末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに、DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、1つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも1つの検出または検出失敗が、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、実施すること、を含むコンパニオン診断が提供される。
様々な実施形態では、遺伝子疾患のコンパニオン診断であって、対象の生体試料からDNA(例えば、cfDNA)を単離または取得すること;DNAの末端リン酸残基を除去すること;脱リン酸化DNAを1種以上の末端修復酵素で処理して、末端修復DNAを生成すること;1つ以上の二重鎖DNA(dsDNA)プレアダプターを末端修復DNAの各鎖の3’末端に対しライゲーションして、プレアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各dsDNAプレアダプターが、末端修復DNAの各鎖の3’末端にライゲーションされたライゲーション鎖オリゴヌクレオチドと非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ライゲーションすること;プレアダプター/末端修復DNA複合体から非ライゲーションパートナー鎖オリゴヌクレオチドを離し、修復オリゴヌクレオチドで置き換えてアダプター/末端修復DNA複合体を形成することであって、各アダプターがライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び修復オリゴヌクレオチドを含む、置き換えること;アダプター/末端修復DNA複合体を1種以上の酵素で処理して、連続した二重鎖のDNAライブラリーを形成すること;DNAライブラリーを増幅してDNAクローンライブラリーを生成すること;DNAクローンライブラリーにおけるゲノム当量数を決定すること;ならびに、DNAクローンライブラリーにおける遺伝子疾患に関連する1つ以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することであって、1つ以上のバイオマーカーのうちの少なくとも1つの検出または検出失敗が、対象に遺伝子疾患の治療をすべきかどうかを指示するものである、実施すること、を含むコンパニオン診断が提供される。
本明細書で使用する「コンパニオン診断」という用語は、特定の抗がん療法に結びついた診断検査を指す。特定の実施形態では、当該診断方法は、生体試料に関連するバイオマーカーにおける遺伝子病変の検出を含み、これによって患者を抗がん療法で治療すべきかそうでないかの迅速な識別が可能になる。
抗がん療法としては、以下に限定するものではないが、手術、放射線照射、化学療法、抗がん剤、及び免疫調節剤が挙げられる。
抗がん薬の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標));アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ;エチレンイミン及びメチラメラミン(アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルオロメラミンレジュームを含む);ナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード);ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン);抗生剤(例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン及びそのペグ化製剤、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピュロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン);代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU));葉酸類似体(例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート);プリン類似体(例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン);ピリミジン類似体(例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU);アンドロゲン(例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン);抗アドレナリン剤(例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン);葉酸補充物(例えば、フォリン酸);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミン;デメコルチン;ジアジクオン;エルホルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2”-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド(例えば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及びドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France));クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金類似体(例えば、シスプラチン及びカルボプラチン);ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸誘導体(例えば、Targretin(商標)(ベキサロテン)、Panretin(商標)(アリトレチノイン));ONTAK(商標)(デニロイキンジフチトクス);エスペラミシン;カペシタビン;ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体、が挙げられる。この定義にさらに含まれるものとして、がんに対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤(例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びトレミフェン(Fareston)を含む)、ならびに抗アンドロゲン剤(例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン)、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体がある。
免疫調節剤の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、シクロスポリン、タクロリムス、トレスペリムス、ピメクロリムス、シロリムス、ベロリムス、ラフルニムス、ラキニモド及びイミキモド、ならびにこれらの類似体、誘導体、塩、イオン、及び複合体が挙げられる。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許出願及び発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が、明確に及び個々に参照により組み込まれていると示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。2013年12月10日に出願された米国特許出願第14/102,285号及び2014年8月22日に出願された同第14/466,741号はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
上記の発明を、明快に理解するための例示及び例を通じてある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示を踏まえた上で、添付の請求項の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明にあるいくつかの変化及び変更を施してもよいことは、当業者には直ちに明らかになることである。以下の実施例は、単に例として提供するものであり、限定として提供するものではない。当業者であれば、本質的に同様な結果をもたらすために変化または変更ができるであろう様々な重要性の低いパラメーターがあることを容易に認識することになる。
実施例1
高効率アダプターライゲーションの原理証明
本実施例では、本明細書で企図する高効率ライゲーション戦略が、アダプターダイマーを形成することなくDNA断片の両方の末端にライゲーションをもたらすという、直接的な定量的根拠を提供する(図2)。
高効率アダプターライゲーションの原理証明
本実施例では、本明細書で企図する高効率ライゲーション戦略が、アダプターダイマーを形成することなくDNA断片の両方の末端にライゲーションをもたらすという、直接的な定量的根拠を提供する(図2)。
クローニングベクターpUC19からのプラスミドDNAを、制限酵素RsaIで消化させてブラントエンドを生成し、Antarcticアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これらのブラントエンドの脱リン酸化DNA断片を、9つの異なる高効率アダプターの集合にライゲーションした(表1)。全ての場合において、ライゲーション反応(矢印)の後に断片移動の定量的シフトが観察され、移動シフトは、各DNA断片の各末端に対するアダプター接着と同等であった。本実施例では、本明細書で企図する組成物及び方法が、DNA断片に対するアダプターの高効率ライゲーションをもたらし、それによってDNAライブラリー構築の全体的効率を高めるという原理証明を提供する。
実施例2
高効率DNAライブラリー構築
I.断片末端の修復
セルフリーDNA(cfDNA)断片の末端を脱リン酸化し、DNA二重鎖に対する内部損傷を修復し、DNA末端を「磨いて」ブラントエンドにした。得られた断片を「末端修復断片」と称する。
高効率DNAライブラリー構築
I.断片末端の修復
セルフリーDNA(cfDNA)断片の末端を脱リン酸化し、DNA二重鎖に対する内部損傷を修復し、DNA末端を「磨いて」ブラントエンドにした。得られた断片を「末端修復断片」と称する。
81μlの精製cfDNA、10μlのNew England Biolabs(NEB)のCutSmart緩衝液(B7204S)、及び5μlのNEBのエビ由来アルカリホスファターゼ(M0371)を合わせることにより、cfDNA断片の末端を脱リン酸化した。反応混合物を37℃で15分間インキュベートし、次に65℃で5分間インキュベートした。
氷上で調製した4μlの以下の混合物:1.1μlの10mM dNTP混合物(NEB N0447)、2.2μlのPreCR酵素混合物(M0309)、及び1.1μlのT4 DNAポリメラーゼ(M0203)、を添加することにより、脱リン酸化cfDNA断片に対する内部損傷を修復した。この反応混合物を20℃で15分間インキュベートし、次に70℃で10分間インキュベートした。このようにして修復し磨いたcfDNA断片は、DNAライゲーション反応に直接使用することができる。
II.プレアダプター設計
いくつかの設計考慮事項を用いて、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び3’末端がブロックされた相補的なパートナー鎖オリゴヌクレオチドから構成されるプレアダプターを生成した。
いくつかの設計考慮事項を用いて、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチド及び3’末端がブロックされた相補的なパートナー鎖オリゴヌクレオチドから構成されるプレアダプターを生成した。
本実施例で使用するプレアダプターは、以下の特徴を有するように設計した:長さ10ntのライゲーション鎖オリゴヌクレオチド;同じバランスのA/TまたはG/C残基;4つのDNA塩基のそれぞれが、プレアダプター各セット内の各塩基位置に表される;10塩基配列の予測融解温度が50mM Na+(またはK+)、10mM MgCl2において約37℃である;A/T及びG/C ntの両方が各プレアダプター配列における最初の2つの塩基である;相補的パートナーオリゴヌクレオチド配列は、長さが8ntであり、2-ヒドロキシリボース修飾DNA塩基(MWG Eurofins)を使用することにより化学的にブロックされ、融解温度が50 mM Na+またはK+、10 mM MgCl2において約25℃である。
設計制約を施した上で、アダプターセットの実験的性能スクリーニングを実施した。本実験において、許容される性能を有する5セットのアダプター4つを特定した(例えば、表2を参照)。「スコア」と表示された列は、各アダプターを最良の性能のアダプター(セット6-2)と比較したときのクローニング効率パーセントを示す。
III.プレアダプターのライゲーション
プレアダプターを、本実施例のステップIで生成した末端修復断片にライゲーションした。25μlの末端修復断片を10μlの10μMアダプターと合わせた。典型的には、反応物に添加する個別のアダプターの数に応じて、1~4のライゲーション反応を実施した。15μlのライゲーションカクテル(5μlの10X T4-DNAライゲーション緩衝液、7.5μlの50% PEG8000、及び2.5μlのHC T4 DNAリガーゼ(NEB;M0202))を、最終体積50μlで各ライゲーション反応物に添加した。反応物を混合し、20℃で60分間インキュベートし、次に65℃で10分間インキュベートし、次に室温まで冷却した。
プレアダプターを、本実施例のステップIで生成した末端修復断片にライゲーションした。25μlの末端修復断片を10μlの10μMアダプターと合わせた。典型的には、反応物に添加する個別のアダプターの数に応じて、1~4のライゲーション反応を実施した。15μlのライゲーションカクテル(5μlの10X T4-DNAライゲーション緩衝液、7.5μlの50% PEG8000、及び2.5μlのHC T4 DNAリガーゼ(NEB;M0202))を、最終体積50μlで各ライゲーション反応物に添加した。反応物を混合し、20℃で60分間インキュベートし、次に65℃で10分間インキュベートし、次に室温まで冷却した。
ライゲーション反応後、50μlのTEzero(10mMトリスpH 8.0、0.1mM EDTA、0.05% Tween20)及び120μlのDNA精製ビーズを各反応物に添加し、十分に混合した。反応物を10分間室温でインキュベートし、次にビーズを200μlの70%エタノール/水(v/v)で2回洗浄し、短時間(約5分)風乾し、20μlのTEzeroで溶離した。
IV.修復オリゴヌクレオチド
本実施例で使用した修復オリゴヌクレオチドの完全なリストを表3に示す。各修復オリゴヌクレオチドは、249の個別オリゴヌクレオチドのプールである。各修復オリゴヌクレオチドの不変の配列はPCRプライマー結合部位に相当し、表3の左側に示されている。
本実施例で使用した修復オリゴヌクレオチドの完全なリストを表3に示す。各修復オリゴヌクレオチドは、249の個別オリゴヌクレオチドのプールである。各修復オリゴヌクレオチドの不変の配列はPCRプライマー結合部位に相当し、表3の左側に示されている。
249オリゴヌクレオチドのそれぞれは、修復オリゴヌクレオチド配列内に「XXXXX」として示されている5ヌクレオチドの試料コードを含む。5ヌクレオチド試料は、表3の右側に示されている。5ヌクレオチドコードは、セット内の他の全てのコードと異なる2塩基の変化となるように選ばれた、256の可能な一意の配列からなる。この特徴により、一意で別々のリードと、コード領域におけるシークエンシングエラーに起因して一意であるように見えるリードとを区別することが可能となった。G残基が過剰出現し、かつアダプター機能を妨害することが実験的に示された7つのコードを除去し、249のランダムコードを残した。
V.修復オリゴヌクレオチドのプレアダプターライブラリーへの付加
修復オリゴヌクレオチドをアダプターに付加することにより、ライブラリー構築を完成した。本実施例で例示する修復オリゴヌクレオチドは、PCRプライマー結合部位、試料コード、及びアンカー配列を含有する。アンカー配列は、ランダム配列標識であり、配列を識別する手段として作用し、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズのためのアンカーとして作用する。
修復オリゴヌクレオチドをアダプターに付加することにより、ライブラリー構築を完成した。本実施例で例示する修復オリゴヌクレオチドは、PCRプライマー結合部位、試料コード、及びアンカー配列を含有する。アンカー配列は、ランダム配列標識であり、配列を識別する手段として作用し、シークエンシングリードにおける適正な塩基コールの校正を可能にし、ライゲーション鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズのためのアンカーとして作用する。
4μlの1μMプールの修復オリゴヌクレオチド(例えば、表3を参照)を、本実施例のステップIIIからの20μlの精製したライゲーション混合物に添加した。
次に、24μlの修復オリゴヌクレオチド/リガーゼ混合物を、16μlの以下の混合物:11μlの水、4.4μlの緩衝液「B」(190μlのCutSmart緩衝液(NEB;B7204)及び10μlの1M ジチオトレイトール(DTT;Sigma-Aldrich 646563))、1.32μlのヌクレオチド混合物「N」(50μlの10 mM dNTP混合物(NEB;N0447)を25μlの100X NAD+(NEB;B9007)と合わせる)、ならびに0.88μlの酵素混合物「E」(20μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB;M0201)、10μlの全長BstIポリメラーゼ(NEB;M0328)、及び10μlのTaq DNAリガーゼ(NEB;M0208)を合わせる)と、氷上で合わせることにより、40μlの修復オリゴヌクレオチド反応物を調製した。反応物を混合し、37℃で15分間インキュベートし、次に60℃で15分間インキュベートした。
反応物をサーマルサイクラーから取り出し、48ulのビーズ再懸濁溶液(19% PEG8000、2M NaCl、10mM Tris pH8.0、10mM EDTA、0.1% Tween20)を反応物に添加し、室温で10分間インキュベートした。ビーズを200μlの70%エタノールで2回洗浄し、短時間(約5分)風乾し、25μlのTEzeroに再懸濁した。マグネットを使用してビーズを局在化し、清澄化したDNAライブラリーを新たな反応容器に移した。
VI.概括
本明細書の全体にわたって企図し実施例1で説明した方法を用いて構築した、得られたDNAライブラリーは増幅可能であり、1つ以上のターゲット遺伝子座に対する次世代シークエンシング、qPCR解析、及び他の定量的遺伝子解析に好適である。
本明細書の全体にわたって企図し実施例1で説明した方法を用いて構築した、得られたDNAライブラリーは増幅可能であり、1つ以上のターゲット遺伝子座に対する次世代シークエンシング、qPCR解析、及び他の定量的遺伝子解析に好適である。
概して、以下の請求項において、使用する用語は、明細書及び請求項で開示する特定の実施形態に請求項を限定するように解釈すべきではなく、請求項が権利を有する全ての範囲の相当物と共に、全ての可能な実施形態を含めるように解釈すべきである。したがって、請求項は本開示による限定を受けない。
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