KR20200085783A - 초저용량 액체 생검을 위한 장치, 시스템 및 방법 - Google Patents

초저용량 액체 생검을 위한 장치, 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20200085783A
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덴 붐 디르크 반
마티아스 에리치
폴 오우스
짐 차우바푼
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주노 다이어그노스틱스, 인크.
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Abstract

본원에서 초저량의 생물학적 샘플에서 무세포 태아 핵산으로부터 유전 정보를 얻기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법을 제공한다. 초저량의 샘플을 얻는 편리성 때문에, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 필요한 지점에 적어도 부분적으로 이용될 수 있다.

Description

초저용량 액체 생검을 위한 장치, 시스템 및 방법
관련 출원
본 출원은 2017년 10월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/578,179호의 이익을 주장한다. 35 U.S.C. § 119에 따라 우선권을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원은 본원에 전체가 제시된 것처럼 참고로 포함된다.
발명의 배경
유전자 검사는 피험체의 DNA 및/또는 그 DNA의 발현에 관한 정보를 얻기 위한 수단이다. 피험체에 대한 생물학적 정보를 얻기 위해 유전자 검사가 지속적으로 개발되고 있다. 이 생물학적 정보는 개인의 건강 상태 결정, 감염 또는 질환을 가진 개인 진단, 개인에 적합한 치료 결정, 범죄 해결 및 친자 확인 등 많은 용도를 갖는다. 현재, 유전자 검사는 주로 클리닉 및 실험실에서 숙련된 직원이 사용하기 위해서는 기술 훈련과 전문 지식이 필요한 고가의 부피가 큰 장비로 수행한다. 생물학적 샘플이 환자로부터 수득된 시점으로부터 환자에게 유전자 검사 결과를 제공할 때까지는 전형적으로 며칠 내지 몇 주가 걸린다.
무세포(cell-free) 핵산은 다양한 조직 유형으로부터 유래하고 개체의 순환으로 방출된다. 순환하는 무세포 핵산 풀은 종종 기여하는 조직 유형의 유전자 구성을 나타낸다. 건강한 개인일 경우, 많은 변이 없이 매우 동질성의 풀이 될 수 있다. 그러나 조직이 현저하게 상이한 게놈을 함유하는 경우, 이질성이 더 큰 무세포 핵산 풀이 관찰될 수 있다. 현저하게 상이한 게놈을 갖는 조직을 갖는 피험체의 일반적인 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: (a) 종양 DNA가 돌연변이 부위를 함유하는 암 환자, (b) 이식된 기관이 공여자 DNA를 무세포 DNA 풀에 방출하는 이식 환자, 및 (c) 태반이 주로 태아 DNA를 나타내는 무세포 DNA에 기여하는 임산부. 일부 경우에, 후성 유전적 변형으로 인해 게놈이 현저히 상이할 수 있다. 상이한 조직, 기관 및 세포 유형으로부터의 DNA는 별개의 후성 유전적 패턴을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 뇌, 간, 지방, 췌장, 내피 및 면역 세포를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 조직, 기관, 및 세포로부터의 무세포 핵산을 검출하는 것이 가능할 수 있다. 또한, 개체의 조직 또는 세포 유형이 질환 또는 감염에 걸릴 경우, 그 개체에 순환하는, 그 조직 또는 세포 유형으로부터의 더 많은 무세포 DNA가 존재할 수 있다.
발명의 요약
동물(인간 또는 비인간)의 샘플을 포함하여 생물학적 샘플의 성분(예를 들어, 핵산, 단백질)을 분석하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 일반적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 무세포 DNA 단편화를 이용함으로써 초저용량(ultra-low volume)의 샘플로부터 유전 정보를 제공할 수 있다. 간략하게, 이는 "초저용량 액체 생검"이라고 언급될 수 있다. 본 개시 내용 이전에, 초저용량이 검출될 수 있거나 유익한 관심의 특정 조직(예를 들어, 뇌, 간, 태반, 종양)으로부터 충분한 양의 무세포 핵산을 제공할 것으로 믿어지지 않았기 때문에, 초저용량의 샘플로부터 신뢰할 수 있고 유용한 유전 정보를 얻을 수 있을 것으로 기대되지 않았다. 더욱이, 다른 무세포 핵산, 특히 혈액 세포로부터 무세포 핵산의 배경 신호가 많고, 피험체마다 그 배경의 변이로 인해, 검사 피험체와 및 대조군 피험체 간의 재현성 및 신뢰할 만한 비교는 거의 불가능해 보였다.
세포 DNA와 대조적으로, 무세포 DNA는 단편화된다. 초저용량의 샘플로부터의 무세포 DNA를 분석하기 위해, 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트는 통계적으로 독립적인 마커로서 반복 영역(예를 들어, 공통 서열을 갖는 영역) 및/또는 다중 영역으로부터의 무세포 DNA 단편을 이용한다. 반복 영역(예를 들어, 동일하거나 유사한 서열의 다중 복제본을 함유하는 게놈의 영역), 또는 다수의 영역으로부터의 무세포 DNA 단편이 총체적으로 단편화되지 않은 DNA 서열보다 샘플에서 더 높은 유효 농도로 존재하기 때문에 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트가 가능하다. 따라서, 유용한 유전 정보를 얻기에 충분한 다수의 분석물을 함유하는 샘플 용량은 이전에 생각한 것보다 더 낮다. 유리하게는, 반복 영역으로부터의 단편은 단일 쌍의 프라이머로 증폭되거나 단일 프로브로 검출될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 유사한 서열을 공유하지 않는 다수의 검출 영역은, 예를 들어, 범용 프라이머로 이들을 태그하고 증폭시키거나 다수의 프라이머 쌍으로 증폭시킴으로써(예를 들어, 다중화된 형식으로), 저용량으로 검출될 수 있다.
초저용량의 생물학적 샘플로부터 유용한 유전 정보를 얻을 수 있음으로써, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 (1) 최소 침습적이고, (2) 기술 훈련이 거의 또는 전혀 없이 가정에서 적용 가능하고(예를 들어, 복잡한 장비가 필요하지 않음); (3) 병태의 초기 단계에서 유익한 정보(예를 들어, 임신, 감염)를 준다는 이점을 제공한다. 이러한 이점은 실험실 또는 기술자에 대한 요건을 줄이거나 무효화함으로써 환자의 접근성, 순응성, 및 모니터링을 향상시킨다. 이는 궁극적으로 의료 시스템에 대한 더 낮은 비용으로 향상된 건강 결과로 이어진다.
무세포 순환 핵산의 분석은 다수의 기술적 문제에 직면한다. 예를 들어, 혈액에서 순환하는 핵산의 증폭은 전혈 내 일부 성분(예를 들어, 헤모글로빈)에 의해 저해될 수 있다. 본 방법, 시스템 및 장치가 이러한 기술적 문제를 해결하는 방법 중 하나는 전혈 내 성분의 오염을 피하는 방식으로 모세혈로부터 혈장(무세포 핵산 함유)을 얻는 것이다.
적은 샘플 용량의 무세포 순환 핵산을 분석하는 것은 특히 어려운 일이다. 이러한 목표를 달성하려는 과거의 시도에도 불구하고, 본원에 기술된 이유로, 본 분야는 유용하고 정확한 유전 정보가 필요한 지점에서 수집될 수 있는 적은 샘플 용량의 무세포 DNA(예를 들어, 손가락 찌름으로부터 모세혈)로부터 얻을 수 있다는 것에 대해 회의적으로 남아있다. 본원에 개시된 방법, 시스템 및 장치는 이런 기술적 문제를 극복할 뿐만 아니라, 필요한 지점에서 사용될 수 있으며, 이는 최첨단 기술로 볼 때 실제로 상상할 수 없었던 것이다.
예를 들어, 5 밀리리터 이상의 혈액에서 순환하는 무세포 종양 DNA를 분석하려는 과거의 시도는 샘플이 종양 부담이 비교적 높고(예를 들어, 15-20%) 변경된 게놈 비율(FGA: fraction of the genome altered)이 5% 이상이어서 변경이 검출되기 더 쉬워질 때에만 유익했다. 그러나 대부분의 환자에서 종양 부담은 훨씬 낮다. 따라서 과거의 시도는 환자 집단의 상당 부분을 배제한다. 추가 시도에서, 더 적은 양의 생물학적 샘플의 분석은 백혈구 오염으로 인해 실패하였다. 또한, 개인으로부터 5 밀리리터 이상의 혈액을 얻으려면 실험실 기술자가 필요하며, 이는 유전자 분석 비용과 환자에게 불편(예를 들어, 유전자 분석의 시간, 불편함 및 비용으로 인한 불편)을 증가시킨다. 본 방법, 장치 및 시스템은 필요한 지점에서 수집될 수 있는 5 밀리리터보다 훨씬 더 적은 양으로 모세혈과 같은 생물학적 샘플(예를 들어, 손가락 찌름으로부터 모세혈)을 분석하여 유용하고 정확한 유전 정보를 제공하도록 구성된다.
과거의 시도가 더 적은 샘플 용량을 분석하였더라도, 그들은 가짜 결과를 생성하였다. 예를 들어, 더 적은 양의 샘플을 분석하려는 일부 과거의 시도는 세포주로부터의 게놈 DNA를 희석하고 게놈 DNA를 전단하여 무세포(cfDNA) 대리물을 생성하고 검출한다. 세포주 DNA의 다운 샘플링 또는 희석/전단된 DNA 및 인 실리코(in silico) 방법은 분자 입력 수가 낮은 개별 샘플에서 크기 및 길이 분포 및 빈 정보를 반영하지 않기 때문에 가짜 결과를 생성한다. 다른 예에서, 더 적은 양의 생물학적 샘플을 분석하려는 과거의 시도는 "알려진 사건"으로도 불릴 수 있는 예정된 돌연변이를 검출하는 데에 의존하기 때문에 가짜 결과를 생성한다. 본 개시 내용은 비-대리물 cfDNA로부터 정확하고 예정되지 않은 유전 정보를 제공하는 방식으로 소량의 모세혈(예를 들어, 손가락 찌름)로부터 혈장(무세포 핵산 함유)을 얻기 위한 방법, 시스템 및 장치를 제공한다.
본원에 기재된 과거의 시도는 초기 검출 단계에서 저역 통과/낮은 커버리지(low pass/low coverage) 전체 게놈 서열 분석의 조합을 사용해야 하고, 그 후 유전자 분석을 정확하게 수행하기 위해 추가 분석을 더욱 상세하게 수행해야 할 것이다. 저역 통과/낮은 커버리지 전체 게놈 서열은 고민감도로 미지의 사건을 검출하는 데에 최적이 아니며, 아마도 더 상세한 후속 분석이 필요할 것이다. 유전자 분석을 제공하기 위해 다중 분석법을 사용하는 것은 비용이 많이 들고 비효율적이며 필요한 지점에서 대체 가능한 해결책이 아니다. 대조적으로, 본 방법, 장치 및 시스템은 작은 샘플에서도 검출 가능한 총체적으로 고농도로 존재하는 다수의 무세포 DNA 단편을 사용함으로써 초저 샘플 용량으로부터 정확한 유전자 분석을 얻는 방법을 제공함으로써 상기 문제를 해결한다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 다음과 같이 요약된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산을 포함하는 모세혈을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 피험체로부터 무세포 핵산을 포함하는 모세혈을 얻는 단계; 임의로 무세포 핵산을 증폭시키는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 태그하여 태그된 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계; 임의로 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계; 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하는 단계; 및 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부에서 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 방법은 적어도 0.5의 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 크라우딩제의 존재하에서 무세포 핵산 또는 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산의 말단을 수복하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 방법은 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로 생물학적 샘플은 총 무세포 핵산을 함께 구성하는 표적 무세포 핵산 및 비-표적 무세포 핵산을 포함하고, 표적 무세포 핵산은 총 무세포 핵산의 5% 미만인 것인 단계; 표적 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 모세혈을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 본질적으로 모세혈로 이루어질 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 모세혈을 얻는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 본질적으로 모세혈을 얻는 단계로 이루어질 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 정맥혈을 얻는 것을 포함하지 않을 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 정맥 절개술을 수행하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 1 밀리리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 100 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 40 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함할 수 있다. 방법은 적어도 98%의 정확도로 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 전체 게놈 증폭을 포함할 수 있다. 방법은 전체 게놈 증폭을 포함하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 표적 무세포 핵산은 종양으로부터의 무세포 핵산이다. 일부 경우에, 표적 무세포 핵산은 태아로부터의 무세포 핵산이다. 일부 경우에, 표적 무세포 핵산은 이식된 조직 또는 기관으로부터의 무세포 핵산이다.
피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 500 ㎕ 미만의 용량을 갖는 생물학적 유체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 용량을 갖는다. 방법은 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 서열 분석 전 및 증폭 후 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산 분자를 태그한 후 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산 분자를 태그하기 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 단계를 포함할 수 있다. 증폭은 등온 증폭을 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과다 표시를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과소 표시를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 생물학적 유체이다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 간질액, 질 세포, 질액, 협측 세포 또는 타액을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 본질적으로 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 간질액, 질액 또는 타액으로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈청이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈장이다. 방법은 혈액 샘플로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분리 단계는 혈장 샘플을 생성하기 위해 혈액 샘플을 여과하여 혈액 샘플로부터 세포, 세포 단편, 미세 소포 또는 이들의 조합을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 1 ml의 용량을 갖는 혈액 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕의 용량을 갖는 혈액 샘플일 수 있다. 혈액 샘플을 얻는 단계는 손가락을 찌르는 것을 포함할 수 있다. 혈액 샘플을 얻는 단계는 찔린 손가락으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 찔린 손가락으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 혈액 샘플을 얻는 단계는 정맥 절개술을 포함하지 않는다. 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 핵산 분자를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 107개의 무세포 핵산 분자를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 300 pg 미만의 무세포 핵산 분자를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 3 ng 미만의 무세포 핵산 분자를 함유할 수 있다. 방법은 98% 초과의 정확도로 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 99% 초과의 정확도로 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 임신한 피험체이고 무세포 핵산 분자는 무세포 태아 핵산 분자를 포함한다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 참조 번호는 정배수체(euploid) 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임신한 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 참조 번호는 이수체 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임신한 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 샘플은 생물학적 샘플과 동일한 샘플 유형 및 동일한 샘플 용량이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 106 내지 약 1012개의 총 무세포 핵산 분자를 포함하며, 여기서 총 무세포 핵산 분자는 본질적으로 무세포 태아 핵산 분자 및 모체 무세포 핵산 분자로 이루어진다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 적어도 하나의 염색체 영역의 태아의 이수성(aneuploidy)이 존재함을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 동일할 때, 적어도 하나의 염색체 영역의 태아의 이수성이 존재하지 않음을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 중 적어도 하나에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 이외의 염색체 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 5주에 불과하다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 정배수체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 방법은 적어도 2000개의 무세포 태아 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 염색체 영역의 표시는 대조군 태아를 임신 중인 적어도 하나의 대조군 임신 피험체에서의 대조군 표시에 대한 것이다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 이수성을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 유전적 이상을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 염색체 영역에 상응하는 이수성을 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 표적 염색체 영역에 상응하는 유전적 이상을 갖는다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 조직 내 종양으로부터의 핵산을 포함한다. 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 참조 번호는 조직에 종양이 없는 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 참조 번호는 조직에 종양을 가진 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 피험체에 이식된 기관 또는 조직으로부터의 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 기관 또는 조직에 특이적이다. 일부 경우에, 서열 분석은 전체 게놈 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 무작위 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 표적화된 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 나노포어 서열 분석을 포함한다.
피험체로부터 최대 약 1010개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부의 적어도 하나의 염색체 영역에서 후성 유전적 변형을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유한다. 피험체로부터 모세혈을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부의 적어도 하나의 염색체 영역에서 후성 유전적 변형을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 방법은 200 ㎕ 이하의 모세혈을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 100 ㎕ 이하의 모세혈을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
피험체의 유체 샘플을 수집하도록 구성된 샘플 수집기; 유체 샘플로부터 샘플 성분을 단리하도록 구성된 샘플 처리기; 유체 샘플 또는 샘플 성분에서 핵산을 검출하도록 구성된 핵산 검출기; 및 핵산 정보 출력을 포함하는 시스템이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 시스템은 키트로 제시될 수도 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함한다. 일부 경우에, 경피 천자 장치는 바늘, 란셋, 미세바늘, 진공 및 미세바늘 배열 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 성분은 세포, 탄수화물, 인지질, 단백질, 핵산 및 미세 소포로부터 선택된다. 일부 경우에, 샘플 성분은 혈액 세포이다. 일부 경우에, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 샘플 성분은 혈장 또는 혈청이다. 샘플 정제기는 1 밀리리터 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 250 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 150 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 100 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함할 수 있다. 시스템은 유체 샘플에서 관심의 핵산을 표지하도록 구성될 수 있고, 핵산 검출기는 샘플에서 관심의 핵산의 표시를 검출하기 위해 표지를 카운트하는 카운팅 시스템을 포함한다. 시스템은 표지를 포함할 수 있으며, 여기서 표지는 관심의 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 관심의 염색체 영역에 특이적일 수 있다. 관심의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 및 염색체 Y로부터 선택된 염색체상에 위치할 수 있다. 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 서열을 포함할 수 있거나 포함할 가능성이 있을 수 있다. 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 적어도 하나의 후성 유전적 변형을 포함할 수 있거나 포함할 가능성이 있을 수 있다. 병태는 유전적 이상일 수 있다. 병태는 암일 수 있다. 병태는 이식된 조직 또는 기관일 수 있다. 시스템은 프라이머, 폴리머라제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 핵산 증폭 시약을 포함할 수 있다. 적어도 1종의 핵산 증폭 시약은 적어도 1종의 등온 증폭 시약을 포함할 수 있다. 적어도 1종의 등온 증폭 시약은 재조합 효소 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 가닥 치환 폴리머라제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 시스템은 적어도 1종의 핵산 증폭 시약 및 적어도 1종의 크라우딩제(crowding agent)를 포함할 수 있다. 시스템은 유체 샘플로부터 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하기 위한 적어도 제1 표지, 및 적어도 1종의 증폭 시약을 포함할 수 있다. 시스템은 적어도 1종의 증폭 시약으로 무세포 핵산을 증폭시켜 적어도 하나의 앰플리콘을 생성하고 적어도 하나의 앰플리콘을 적어도 제1 표지와 접촉시켜 라이브러리를 생성하도록 구성될 수 있다. 시스템은 적어도 하나의 앰플리콘을 검출 가능한 제2 표지과 접촉시키도록 구성될 수 있다. 시스템은 라이브러리를 생성하고 적어도 1종의 증폭 시약으로 라이브러리의 적어도 하나의 구성원을 증폭시키도록 구성될 수 있다. 핵산 서열 출력은 무선 통신 장치, 유선 통신 장치, 케이블 포트 및 전자 디스플레이로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 위치에 존재한다. 일부 경우에, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 장치에 수용된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 제1 위치에 위치하고 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나는 제2 위치에 위치한다. 일부 경우에, 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나와 샘플 수집기는 동일한 위치에 위치한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 필터를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체를 필터를 통해 밀거나 당기기 위한 위킹(wicking) 물질 또는 모세관 장치를 포함한다. 일부 경우에, 필터는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체 샘플에서 핵산, 단백질, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 세포 외 소포에 결합할 수 있으며, 여기서 세포 외 소포는 여성 피험체의 태아 세포 또는 태반 세포로부터 방출된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 고체 지지체에 부착되며, 여기서 고체 지지체는 나머지 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있거나 생물학적 샘플은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉한 후 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 시스템은 유체 샘플의 적어도 일부를 운반 또는 보관하기 위한 운반 또는 보관 구획을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 운반 또는 보관 구획은 흡수 패드, 유체 용기, 샘플 보존제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 운반 또는 보관 구획에는 운반 또는 보관을 위해 유체 샘플의 세포를 안정화시키는 시약 또는 물질이 들어 있다. 시스템은 그 구성 요소의 장치를 가열 또는 냉각하기 위한 컨테이너, 파우치, 와이어 및 케이블 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 시스템은 무세포 핵산의 수복, 정제, 증폭, 및 서열 분석 중 적어도 하나를 위한 적어도 하나의 완충액을 포함할 수 있다.
피험체의 유체 샘플을 수집하도록 구성된 샘플 수집기; 유체 샘플로부터 샘플 성분을 단리하도록 구성된 샘플 처리기; 유체 샘플 또는 샘플 성분에서 핵산을 검출하도록 구성된 핵산 검출기; 및 핵산 정보 출력을 포함하는 장치가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함한다. 일부 경우에, 경피 천자 장치는 바늘, 란셋, 미세바늘, 진공 및 미세바늘 배열 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 성분은 세포, 탄수화물, 인지질, 단백질, 핵산 및 미세 소포로부터 선택된다. 일부 경우에, 샘플 성분은 혈액 세포이다. 일부 경우에, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 샘플 성분은 혈장 또는 혈청이다. 샘플 정제기는 1 밀리리터 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 250 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 150 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 100 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성될 수 있다. 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함할 수 있다. 장치는 유체 샘플에서 관심의 핵산을 표지하도록 구성될 수 있고, 핵산 검출기는 샘플에서 관심의 핵산의 표시를 검출하기 위해 표지를 카운트하는 카운팅 시스템을 포함한다. 장치는 표지를 포함할 수 있으며, 여기서 표지는 관심의 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 관심의 염색체 영역에 특이적일 수 있다. 관심의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 및 염색체 Y로부터 선택된 염색체상에 위치할 수 있다. 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 서열을 포함할 수 있거나 포함할 가능성이 있을 수 있다. 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 적어도 하나의 후성 유전적 변형을 포함할 수 있거나 포함할 가능성이 있을 수 있다. 병태는 유전적 이상일 수 있다. 병태는 암일 수 있다. 병태는 이식된 조직 또는 기관일 수 있다. 장치는 프라이머, 폴리머라제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 핵산 증폭 시약을 포함할 수 있다. 적어도 1종의 핵산 증폭 시약은 적어도 1종의 등온 증폭 시약을 포함할 수 있다. 적어도 1종의 등온 증폭 시약은 재조합 효소 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 가닥 치환 폴리머라제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 장치는 적어도 1종의 핵산 증폭 시약 및 적어도 1종의 크라우딩제를 포함할 수 있다. 장치는 유체 샘플로부터 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하기 위한 적어도 제1 표지, 및 적어도 1종의 증폭 시약을 포함할 수 있다. 장치는 적어도 1종의 증폭 시약으로 무세포 핵산을 증폭시켜 적어도 하나의 앰플리콘을 생성하고 적어도 하나의 앰플리콘을 적어도 제1 표지와 접촉시켜 라이브러리를 생성하도록 구성될 수 있다. 장치는 적어도 하나의 앰플리콘을 검출 가능한 제2 표지과 접촉시키도록 구성될 수 있다. 장치는 라이브러리를 생성하고 적어도 1종의 증폭 시약으로 라이브러리의 적어도 하나의 구성원을 증폭시키도록 구성될 수 있다. 핵산 서열 출력은 무선 통신 장치, 유선 통신 장치, 케이블 포트 및 전자 디스플레이로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 장치의 모든 구성 요소는 단일 위치에 존재한다. 일부 경우에, 장치의 모든 구성 요소는 단일 장치에 수용된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 제1 위치에 위치하고 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나는 제2 위치에 위치한다. 일부 경우에, 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나와 샘플 수집기는 동일한 위치에 위치한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 필터를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체를 필터를 통해 밀거나 당기기 위한 위킹 물질 또는 모세관 장치를 포함한다. 일부 경우에, 필터는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체 샘플에서 핵산, 단백질, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 세포 외 소포에 결합할 수 있으며, 여기서 세포 외 소포는 여성 피험체의 태아 세포 또는 태반 세포로부터 방출된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 고체 지지체에 부착되며, 여기서 고체 지지체는 나머지 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있거나 생물학적 샘플은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉한 후 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 장치는 유체 샘플의 적어도 일부를 운반 또는 보관하기 위한 운반 또는 보관 구획을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 운반 또는 보관 구획은 흡수 패드, 유체 용기, 샘플 보존제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 운반 또는 보관 구획에는 운반 또는 보관을 위해 유체 샘플의 세포를 안정화시키는 시약 또는 물질이 들어 있다. 장치는 그 구성 요소의 장치를 가열 또는 냉각하기 위한 컨테이너, 파우치, 와이어 및 케이블 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 장치는 무세포 핵산의 수복, 정제, 증폭, 및 서열 분석 중 적어도 하나를 위한 적어도 하나의 완충액을 포함할 수 있다.
피험체에서 종양의 존재를 검출하기 위한 시스템의 용도가 본원에 추가로 개시된다. 피험체에서 태아의 이수성을 검출하기 위한 시스템의 용도가 본원에 개시된다. 피험체에서 이식된 기관의 상태를 검출하기 위한 시스템의 용도가 본원에 추가로 개시된다. 피험체에서 종양의 존재를 검출하기 위한 장치의 용도가 본원에 개시된다. 피험체에서 태아의 이수성을 검출하기 위한 장치의 용도가 본원에 추가로 개시된다. 피험체에서 이식된 기관의 상태를 검출하기 위한 장치의 용도가 본원에 개시된다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 500 ㎕ 미만의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 방법은 서열 분석 전에 무세포 태아 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 서열 분석 전 및 증폭 후 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 서열 분석 전에 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 무세포 태아 핵산 분자를 태그한 후 무세포 태아 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과다 표시를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과소 표시를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 참조 번호는 정배수체 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임신한 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 참조 번호는 이수체 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임신한 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 샘플은 생물학적 샘플과 동일한 샘플 유형 및 동일한 샘플 용량이다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 비-표적 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 적어도 하나의 표적 염색체 영역의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 동일할 때, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재하지 않음을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 생물학적 유체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 간질액, 질 세포, 질액, 협측 세포 또는 타액을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 일부 경우에, 방법은 혈액 샘플로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 분리 단계는 혈장 샘플을 생성하기 위해 혈액 샘플을 여과하여 혈액 샘플로부터 세포, 세포 단편, 미세 소포 또는 이들의 조합을 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 임신한 피험체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 혈액 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 1 ml의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 방법은 임신한 피험체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 혈액 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕의 용량을 갖는다. 일부 경우에, 혈액 샘플을 얻는 단계는 피험체를 경피 천자 장치와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 혈액 샘플을 얻는 단계는 손가락을 찌르는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 찔린 손가락으로부터 혈액을 뽑아내는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 혈액 샘플을 얻는 단계는 정맥 절개술을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 107개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 106 내지 약 1012개의 총 무세포 핵산 분자를 포함하며, 여기서 총 무세포 핵산 분자는 본질적으로 무세포 태아 핵산 분자 및 모체 무세포 핵산 분자로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 3 ng 미만의 총 무세포 핵산 분자를 함유한있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 300 pg 미만의 무세포 태아 핵산 분자를 함유한다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 5주에 불과하다. 일부 경우에, 증폭 단계는 무세포 태아 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 등온 증폭을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 실온에서 일어난다. 일부 경우에, 상태는 98% 초과의 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 상태는 99% 초과의 정확도로 감지된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 중 적어도 하나에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 이외의 염색체 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 정배수체이다. 일부 경우에, 서열 분석은 전체 게놈 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 무작위 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 표적화된 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 2000개의 무세포 태아 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 염색체 영역의 표시는 대조군 태아를 임신 중인 적어도 하나의 대조군 임신 피험체에서의 대조군 표시에 대한 것이다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 이수성을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 유전적 이상을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 염색체 영역에 상응하는 이수성을 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 표적 염색체 영역에 상응하는 유전적 이상을 갖는다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 태그하여 태그된 무세포 태아 핵산 분자를 생성하는 단계; 태그된 무세포 태아 핵산 분자 수를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 태그하는 단계는 표적 염색체 영역으로부터의 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 서열 분석 단계를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 방법은 적어도 하나의 임신한 피험체로부터 각각 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 복수의 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 각각의 생물학적 샘플로부터 무세포 태아 핵산 분자를 상이한 인덱스로 인덱싱함으로써, 무세포 태아 핵산 분자에 샘플 식별자를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 표적 염색체 영역으로부터의 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 임신한 피험체의 유체 샘플을 수집하기 위한 샘플 수집기; 유체 샘플로부터 샘플 성분을 포획하거나 제거하는 샘플 정제기; 핵산 검출기; 및 핵산 정보 출력을 포함하는 시스템이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함한다. 일부 경우에, 경피 천자 장치는 바늘, 란셋, 미세바늘, 및 미세바늘 배열로부터 선택된다. 일부 경우에, 샘플 성분은 세포, 단백질, 핵산 및 미세 소포로부터 선택된다. 일부 경우에, 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 검출기는 유체 샘플에서 관심의 핵산을 표지하고 샘플에서 관심의 핵산의 표시를 검출하기 위해 표지를 카운트하는 카운팅 시스템을 포함한다. 일부 경우에, 카운팅 시스템은 표지를 포함하며, 여기서 표지는 관심의 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열 출력은 무선 통신 장치, 유선 통신 장치, 케이블 포트 및 전자 디스플레이로부터 선택된다. 일부 경우에, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 위치에 존재한다. 일부 경우에, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 장치에 수용된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 제1 위치에 위치하고 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나는 제2 위치에 위치한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 필터를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체를 필터를 통해 밀어내기 위한 위킹 물질 또는 모세관 장치를 포함한다. 일부 경우에, 필터는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 유체 샘플에서 핵산, 단백질, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 세포 외 소포에 결합할 수 있으며, 여기서 세포 외 소포는 여성 피험체의 태아 세포또는 태반 세포로부터 방출된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 고체 지지체에 부착되며, 여기서 고체 지지체는 나머지 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있거나 생물학적 샘플은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉한 후 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 일부 경우에, 시스템은 프라이머, 폴리머라제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 핵산 증폭 시약을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 1종의 핵산 증폭 시약은 적어도 1종의 등온 증폭 시약을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 1종의 등온 증폭 시약은 재조합 효소 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 가닥 치환 폴리머라제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 생물학적 샘플의 적어도 일부를 운반하기 위한 운반 또는 보관 구획을 포함한다. 일부 경우에, 운반 또는 보관 구획은 흡수 패드, 유체 용기, 샘플 보존제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 그 구성 요소의 장치를 가열 또는 냉각하기 위한 컨테이너, 파우치, 와이어 및 케이블 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 무세포 핵산의 수복, 정제, 증폭 및 서열 분석 중 적어도 하나를 위한 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
본 개시 내용의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나 본 개시 내용의 일부 실시 양태들을 나타내면서 상세한 설명 및 구체적인 예들은 제한이 아니라 예시로서 주어진다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 본 개시 내용의 범위 내에서 많은 변경 및 변형이 이루어질 수 있으며, 본 개시 내용은 이러한 모든 변형을 포함한다. 또한, 일 실시 양태의 측면은 다른, 상이한 실시 양태에서 이용될 수 있다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 명시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트의 신규 특징은 첨부된 청구 범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본원에 개시된 본 장치, 시스템 및 키트의 특징 및 장점은 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 원리가 이용되는 예시적인 실시 양태 및 하기의 첨부 도면을 설명하는 다음의 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
[도 1]은 본원 개시된 방법에 대한 선택적 워크 플로우를 도시한다.
[도 2]는 본원에 개시된 방법 및 시스템의 구성 요소가 다양한 위치(물리적 및/또는 전자적) 사이에 분포되거나, 주로 하나의 물리적 위치에 집중될 수 있는 방법의 도면을 도시한다.
[도 3]은 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석에 의해 생성된 초저 샘플 양으로부터의 삼염색체 검출 결과를 보여준다. 참조 및 검사 샘플로부터 염색체 21의 표시에 대한 Z 점수를 도시한다. 점선은 Z 점수 3을 나타낸다. 3 이상의 Z 점수를 나타내는 검사 샘플은 샘플이 염색체 21의 더 높은 표시를 포함하고 염색체 21에 대해 삼염색체로 간주됨을 의미한다. 샘플이 임산부로부터 유래한 경우, 검출된 여분의 염색체 21은 태아에 기인하므로 태아는 염색체 21에 대해 삼염색체로 결론 내린다.
[도 4a]는 원격 시스템 및 개인에 연결된 장치에 대한 프로세스 개요를 도시한다. [도 4b]는 원격 시스템 및 개인에 연결된 장치를 위한 예시적인 인터페이스를 도시한다.
[도 5]는 모바일 장치 및 모바일 애플리케이션이 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트로부터의 유전 정보 및 다른 정보와 연결하고, 통신하고 이들을 수신하도록 구성되는 방법을 도시한다. [도 5a]는 모바일 애플리케이션이 제공하는 다양한 기능을 도시한다. [도 5b]는 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 사용을 통해 사용자를 안내하기 위한 단계별 워크스루(walkthrough)를 도시한다. [도 5c]는 사용자가 검사를 시작하고, 검사 결과를 보고 공유하며, 다른 사람들과 상호 작용할 수 있게 하는 인터페이스 요소를 도시한다. [도 5d]는 검사 상태를 모니터링하기 위한 인터페이스를 보여준다. [도 5e]는 결과가 공유될 수 있는 방법을 보여준다.
[도 6]은 8 내지 10 ml의 정맥혈을 출발량으로 사용하여 낮은 커버리지 전체 게놈 서열 분석의 상이한 공정 단계에서 예상되는 cfDNA 단편의 전형적인 양을 보여준다.
[도 7]은 초저 cfDNA 입력량을 사용하는 적용의 민감도를 크게 향상시키기 위해 서열 분석 라이브러리 효율을 증가시키는 중요성을 보여준다.
[도 8a 내지 c]는 입력된 감소하는 양의 무세포(cfDNA)로부터 생성된 서열 분석 라이브러리의 전기영동도를 도시한다. 무세포 DNA의 입력량은 [도 8a]에서 20 게놈 당량(20 GE)에서 [도 8C]에서 1 게놈 당량(1 GE)까지 다양하였다. 라이브러리의 전체 수율은 감소하지만 어댑터 이량체의 양은 크게 증가하지 않으며 성공적인 서열 분석에 사용할 수 있는 라이브러리의 양과 품질은 여전히 충분하다.
[도 9]는 정맥혈로부터 단리된 초저량(ultra-low amount)의 cfDNA(10 게놈 당량)로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 사용하여 낮은 비율 Y 염색체(2.5% 이상)의 검출을 보여준다.
[도 10]은 여성 및 남성 DNA의 모세혈/혈장 혼합물로부터 단리된 초저 입력량의 cfDNA을 이용한 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 사용하여 낮은 분율 Y 염색체(2.5% 이상)의 검출을 보여준다.
[도 11]은 페어드 엔드(paired end) 서열 분석 데이터에 기초하여 모세혈과 정맥혈로부터의 cfDNA 사이의 cfDNA 단편 크기 분포 비교를 보여준다.
[도 12]는 임산부의 혈액/혈장으로부터 유래된 초저 입력량의 cfDNA를 이용한 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 사용하여 태아 염색체 이수성의 검출을 보여준다. 삼염색체 참조 샘플로부터의 초저 입력량의 cfDNA를 사용하여 염색체 21 표시의 중앙값 및 중앙값 절대 편차를 결정하였다. 검사 샘플은 정상 태아(삼염색체 없음) 또는 염색체 21 삼염색체가 있는 태아를 임신 중인 임산부의 초저량의 cfDNA(10 GE)이었다.
[도 13]은 임산부의 혈액/혈장으로부터 유래된 초저 입력량의 cfDNA를 이용한 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 사용하여 태아 염색체 이수성의 검출을 보여준다. 삼염색체 21 상태를 측정하는 샘플 내부 방법을 사용하여 참조 샘플 세트 없이 분석을 수행하였다. 검사 샘플은 정상 태아(삼염색체 없음) 또는 염색체 21 삼염색체가 있는 태아를 임신 중인 임산부로부터의 초저량의 cfDN(10 GE)이었다.
특정 용어
하기 설명은 본원에 개시된 방법, 시스템 및 키트의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본원에서 사용되는 다음의 용어 설명은 이들 용어의 정의를 제한하려는 것이 아니다. 이들 용어는 본 출원 전체에 걸쳐 추가로 설명되고 예시된다.
일반적으로, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "무세포 폴리뉴클레오티드", "무세포 핵산"은 세포로부터 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 추출하지 않고 샘플로부터 단리될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 지칭한다. 무세포 핵산은 DNA를 포함할 수 있다. 무세포 핵산은 RNA를 포함할 수 있다. 무세포 핵산은 세포막 안에 포함되지 않은, 즉 세포 구획에 싸여 있지 않은 핵산이다. 일부 실시 양태에서, 무세포 핵산은 세포막에 의해 한정되지 않고 혈액 또는 다른 체액 중에 순환하거나 존재하는 핵산이다. 일부 실시 양태에서, 무세포 핵산은 이를 함유하는 생물학적 샘플의 수집 전 및/또는 수집 시 무세포이며, 샘플의 수집 시 및/또는 수집 후의 조작을 포함하여 사람에 의한, 의도적 또는 그 외 샘플 조작의 결과로서 세포로부터 방출되지 않는다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 세포에서 생성되고, 예를 들어 아폽토시스 및 비-아폽토시스 세포 사멸, 괴사, 자가 포식, 자발적 방출(예를 들어, DNA/RNA-지단백질 복합체), 분비, 및/또는 유사 분열 파국(mitotic catastrophe)을 포함하는 생리학적 수단에 의해 세포로부터 방출된다. 일부 실시 양태에서, 무세포 핵산은 생물학적 메카니즘(예를 들어, 아폽토시스, 세포 분비, 소포 방출)에 의해 세포로부터 방출되는 핵산을 포함한다. 다른 또는 추가의 실시 양태에서, 무세포 핵산은 세포의 인간 조작 또는 샘플 처리(예를 들어, 세포막 파괴, 용해, 볼텍스, 전단 등)에 의해 세포로부터 추출된 핵산이 아니다.
일부 경우에, 무세포 핵산은 무세포 태아 핵산이다. 일반적으로, 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "무세포 태아 핵산"은 태아 DNA를 포함하는 세포로부터 유래된, 본원에 기술된 바와 같은 무세포 핵산을 지칭한다. 임산부에서, 태반에서 유래한 무세포 DNA가 무세포 DNA 총량의 상당한 부분에 기여할 수 있다. 태반 DNA는 대부분의 경우 태아의 DNA와 매우 유사하기 때문에 종종 태아 DNA의 좋은 대리물이다. 융모막 융모 샘플링과 같은 적용은 이 사실을 이용하여 진단적 적용을 확립했다. 종종, 태반 조직이 임신한 피험체의 임신 중에 정기적으로 흘러나온 결과, 모체 생물학적 샘플에서 무세포 태아 핵산의 많은 부분이 발견된다. 태반 조직의 많은 세포는 종종 태아 DNA를 포함하는 세포이다. 태반에서 흘러나온 세포는 태아 핵산을 방출한다. 따라서, 일부 경우에, 본원에 개시된 무세포 태아 핵산은 태반 세포로부터 방출되는 핵산이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포 핵산"은 세포에 함유되거나 생물학적 샘플의 조작으로 인해 세포로부터 방출된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 생물학적 샘플의 조작의 비제한적 예는 원심 분리, 볼텍싱, 전단, 혼합, 용해, 및 생물학적 샘플을 얻을 때 그 안에 존재하지 않는 시약(예를 들어, 세제, 완충액, 염, 효소)을 생물학적 샘플에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 세포 핵산은 기계, 인간 또는 로봇에 의한 세포의 파괴 또는 용해로 인해 세포로부터 방출된 핵산이다. 일부 경우에, 세포 핵산(세포에 함유된 핵산)은 본원에 개시된 장치 및 방법에 의해 세포로부터 의도적으로 또는 비의도적으로 방출된다. 그러나 이들은 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 "무세포 핵산"으로 간주되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 생물학적 샘플에서 무세포 핵산의 분석을 제공하고, 그 과정에서 세포 핵산도 분석한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오 마커"는 일반적으로 피험체의 생물학 또는 병태의 임의의 마커를 지칭한다. 바이오 마커는 질환 또는 병태의 지표 또는 결과일 수 있다. 바이오 마커는 건강의 지표일 수 있다. 바이오 마커는 유전적 이상 또는 유전된 병태의 지표일 수 있다. 바이오 마커는 순환하는 바이오 마커일 수 있다(예를 들어, 혈액과 같은 생물학적 유체에서 발견됨). 바이오 마커는 조직 바이오 마커일 수 있다(예를 들어, 간 또는 골수와 같은 고형 기관에서 발견됨). 바이오 마커의 비제한적 예는 핵산, 후성 유전적 변형, 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편, 지질, 지방산, 스테롤, 다당류, 탄수화물, 바이러스 입자, 미생물 입자를 포함한다. 일부 경우에, 바이오 마커는 심지어 전체 세포 또는 세포 단편을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "태그"는 일반적으로 관심의 핵산을 확인, 검출 또는 단리하는데 사용될 수 있는 분자를 지칭한다. "태그"라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 "표지", "어댑터", "올리고" 및 "바코드"와 같은 다른 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나 용어 "어댑터"는 태그로서 작용하지 않고 핵산의 두 말단 또는 다중 핵산을 결찰시키는데 사용될 수 있음에 유의한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 정보"는 일반적으로 하나 이상의 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 유전 정보는 단일 뉴클레오티드 또는 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 유전 정보는 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재(또는 부재)일 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "유전 정보"는 후성 유전적 변형 패턴, 유전자 발현 데이터, 및 단백질 발현 데이터를 지칭할 수도 있다. 일부 경우에, 바이오 마커의 존재, 부재 또는 양은 유전 정보를 제공한다. 예를 들어, 콜레스테롤 수치는 고 콜레스테롤 혈증의 유전적 형태를 나타낼 수 있다. 따라서, 유전 정보는 핵산 서열로 제한되지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전적 돌연변이"는 일반적으로 게놈의 뉴클레오티드 서열의 변경을 지칭한다. 유전적 돌연변이는 자연 변이 또는 대립 유전자 차이와 다르다. 유전적 돌연변이는 피험체 종의 10% 미만에서 발견될 수 있다. 유전적 돌연변이는 피험체 종의 5% 미만에서 발견될 수 있다. 유전적 돌연변이는 피험체 종의 1% 미만에서 발견될 수 있다. 피험체에서의 유전적 돌연변이는 피험체에서 질환 또는 병태를 유발할 수 있다. 유전적 돌연변이는 단백질 코딩 서열의 프레임 시프트를 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 단백질 코딩 서열의 적어도 일부의 결실을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 단백질 코딩 서열에서 정지 코돈의 소실을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 단백질 코딩 서열에서 조기 정지 코돈을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 잘못 접힌 단백질을 코딩하는 서열을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 기능 이상 단백질 또는 비-기능성 단백질(예를 들어, 결합 또는 효소 활성의 소실)을 코딩하는 서열을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 과활성 단백질(예를 들어, 증가된 결합 또는 효소 활성)을 코딩하는 서열을 초래할 수 있다. 유전적 돌연변이는 단일 뉴클레오티드(예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성)에 영향을 미칠 수 있다. 유전적 돌연변이는 다수의 뉴클레오티드(예를 들어, 프레임 시프트, 전위)에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "건강한 개인" 및 "건강한 피험체"는 관심의 병태 또는 질환을 갖지 않는 피험체를 지칭한다. 예를 들어, 기재된 방법 또는 장치가 어떤 유형의 암을 검출하기 위해 사용되는 경우, 건강한 피험체는 그 유형의 암을 갖지 않는다. 건강한 피험체는 암이 전혀 없을 수 있다. 일부 경우에, 건강한 피험체는 질환 또는 병태가 있다고 진단받지 않는다. 일부 경우에, 건강한 피험체는 공지된 유전적 돌연변이를 갖지 않는다. 일부 경우에, 건강한 피험체는 공지된 유전적 돌연변이를 갖지 않는 건강한 피험체와 피험체를 구별할 수 있는 검출 가능한 표현형을 초래하는 유전적 돌연변이를 갖지 않는다. 일부 경우에, 건강한 피험체는 병원체에 의해 감염되지 않는다. 일부 경우에, 건강한 피험체는 병원체에 의해 감염되지만 알려진 유전적 돌연변이는 없다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "게놈 당량"은 일반적으로 모든 유전자가 존재할 것을 보장하기 위해 정제된 샘플에 존재하는 데 필요한 DNA의 양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조직 특이적" 또는 "조직에 특이적"이라는 문구는 일반적으로 특정 조직에서 주로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 종종, 본원에 개시된 방법, 시스템 및 키트는 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 본원에 기재된 무세포 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 이들이 발현되는 조직 또는 기관의 손상 또는 질환에 따라 생물학적 유체에서 정량화될 수 있는 수준으로 발현된 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 생물학적 유체에 본원에 개시된 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 조직 또는 기관의 손상 또는 질환이 있을 때 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 방출에 기인하며, 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 발현의 변화 때문이 아니다. 본원에 개시된 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 수준 상승은 상응하는 조직 또는 기관의 손상을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 무세포 폴리뉴클레오티드는 여러 조직에서, 그러나 이들 조직 중 적어도 하나에서 조직 특이적 수준으로 발현/생성된다. 이들 경우에, 무세포, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 절대적 또는 상대적 양은 특정 조직 또는 기관, 또는 조직 또는 기관의 수집물의 손상 또는 질환을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 조직 특이적 변형을 갖는 핵산이다. 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함할 수 있다. 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 조직 특이적 폴리뉴클레오티드 또는 마커는 조직 특이적 메틸화 패턴을 갖는 DNA 분자(예를 들어, 유전자 또는 비-코딩 영역의 일부)를 포함한다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오티드 및 마커는 많은 조직에서 유사하게, 또는 피험체 전체에서 편재적으로 발현될 수 있지만, 변형은 조직 특이적이다. 일반적으로, 본원에 개시된 조직 특이적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 수준은 질환에 특이적이지 않다. 일반적으로, 본원에 개시된 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 질환 메커니즘에 관련된 단백질을 코딩하지 않는다.
일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 피험체의 혈액에 존재하는 것보다 관심의 조직에 더 많은 양으로 존재한다. 일부 경우에, RNA는 혈액 세포에 존재하는 것보다 관심의 조직에 더 많은 양으로 존재한다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 혈액 세포에 의해 발현되지 않는다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 혈액에서보다 그 조직에서 적어도 2배 더 크다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 혈액에서보다 그 조직에서 적어도 5배 더 크다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 혈액에서보다 그 조직에서 적어도 10배 더 크다.
일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 피험체의 임의의 다른 조직보다 그 조직에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 그 조직에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 그 조직에서 적어도 10배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 2개 이하의 조직에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 2개 이하의 조직에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 2개 이하의 조직에서 적어도 10배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 3개 이하의 조직에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 3개 이하의 조직에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 임의의 다른 조직보다 3개 이하의 조직에서 적어도 10배 더 높다.
일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드는 표적 세포 유형에 특이적이다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 표적 세포 유형에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 다른 세포 유형보다 표적 세포 유형에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 표적 세포 유형에서 적어도 10배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 2개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 2개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, RNA는 비-표적 세포 유형보다 2개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 10배 더 높이 발현된다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 3개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 3배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 3개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 5배 더 높다. 일부 경우에, 조직 특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는 비-표적 세포 유형보다 3개 이하의 표적 세포 유형에서 적어도 10배 더 높다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리하다", "정제하다", "제거하다", "포획하다" 및 "분리하다"는 달리 명시되지 않는 한 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "클리닉", "임상 환경", "실험실" 또는 "실험실 환경"은 생물학적 및/또는 환경 샘플을 처리 및/또는 분석하기 위해 숙련된 직원이 근무하는 병원, 클리닉, 약국, 연구 기관, 병리 실험실, 또는 다른 상업용 비즈니스 환경을 지칭한다. 이들 용어는 현장(point of care), 원격 장소, 가정, 학교 및 기타 비사업적, 비기관적 환경과 대조된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '약' 숫자는 그 숫자에 플러스 또는 마이너스 그 숫자의 10%를 의미한다. 범위와 관련하여 사용될 때 '약'이라는 용어는 그 범위 마이너스 가장 낮은 값의 10%와 그 범위 플러스 그의 가장 큰 값의 10% 범위를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 지시어를 포함한다. 예를 들어, 용어 "샘플"은 복수의 샘플 혼합물을 비롯한 복수의 샘플을 포함한다.
용어 "정확도"는 본 명세서에 비추어 가장 넓은 정의로 주어져야 한다. 그러나 용어 "정확도"는 이항 분류 검정이 조건을 올바르게 식별하거나 배제하는 정도의 통계적 척도를 지칭하는 데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "정확도"는 또한 검사된 모든 샘플 중 실제 결과(진 양성 및 진 음성 모두)의 비율을 지칭할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "정확도"는 "랜드(Rand) 정확도" 또는 "랜드 지수"로 결정되는 바와 같은 정확도를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성의", "상동성" 또는 "상동성 백분율"은 제2 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 대한 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 서열 유사성을 기술한다. 일부 경우에, 상동성은 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990](문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993]에서와 같이 변형됨)에 기술된 식을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 식은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990]의 기본 국소 정렬 검색 도구(BLAST: basic local alignment search tool) 프로그램에 통합된다. 서열의 상동성 백분율은 본 출원의 출원일 기준으로 최신 버전의 BLAST를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 서열은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이, 비교 창, 또는 지정된 영역에 대한 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때 적어도 20%, 25%, 30%. 35%, 40%, 45% 50%, 55%, 60% 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 경우 상동성일 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 서열은 최대 20%, 25%, 30%. 35%, 40%, 45% 50%, 55%, 60% 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 공유하는 경우 상동성일 수 있다. 바람직하게는, % 동일성 또는 상동성은 적어도 16개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역 또는 일부 경우에 약 50 내지 약 100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 존재한다. 일부 경우에, % 동일성 또는 상동성은 약 100 내지 약 1000개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 존재한다. 일부 경우에, 2개 이상의 서열은 서열에서 적어도 100개의 아미노산에 대해 상동성일 수 있고 적어도 20%의 동일성을 공유할 수 있다. 서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열은 검사 서열을 비교할 수 있는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 검사 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력될 수 있고, 필요한 경우 후속 좌표가 지정될 수 있으며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정될 수 있다. 스미스-워터만(Smith-Waterman) 정렬 알고리즘, 비터비(Viterbi), 베이지안(Bayesians), 은닉 마코프(Hidden Markov) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 알고리즘이 사용될 수 있다. 기본 프로그램 매개 변수가 사용되거나 대체 매개 변수가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘을 사용하여 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 검사 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산할 수 있다. 임의의 적합한 알고리즘이 사용될 수 있으며, 이에 의해 퍼센트 동일성이 계산된다. 예를 들어, 일부 프로그램은 동일한 잔기의 정렬된 위치의 개수를 정렬된 위치의 총 개수로 나눈 것으로 퍼센트 동일성을 계산한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "비교 창"은 10 내지 600개 위치의 범위일 수 있는 다수의 연속 또는 비연속 위치 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함한다. 일부 경우에, 비교 창은 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 600개 위치를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비교 창은 최대 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 600개 위치를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비교 창은 서열이 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 개수의 연속 또는 비연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는 적어도 50 내지 200개 위치, 또는 적어도 100 내지 적어도 150개 위치를 포함할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우에, 비교 창은 1차 서열의 인접한 위치, 3차 공간에서는 인접하지만 1차 서열에서는 불연속적인 위치인 전체 정렬의 임의의 하위 집합, 또는 정렬에서 1개에서 모든 잔기까지의 임의의 다른 하위 집합을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 과다 표시 및 과소 표시가라는 용어는 일반적으로 샘플과 표적 핵산의 대조군 표시 간의 차이를 지칭한다. 표시는 대조군 표시보다 유의하게 작을 수 있으며, 따라서 표시는 과소 표시된다. 표시는 대조군 표시보다 훨씬 많을 수 있으며, 따라서 과소 표시된다. 유의성은 통계적일 수 있다. 통계적 유의성을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져있다. 비제한적인 예로서, 표준 양측 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 수행하였다(*: p<0.05; **p<0.01).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "클라우드"는 전자 데이터의 공유된 또는 공유 가능한 저장소를 지칭한다. 클라우드는 전자 데이터를 보관하고 전자 데이터를 공유하며 전자 데이터를 분석하는 데 사용될 수 있다.
출원 전반에 걸쳐, "염색체에 상응하는 핵산" 및 "염색체에 상응하는 서열"이라는 문구가 언급된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들 문구는 "염색체에 상응하는 핵산"이 그 염색체에서 발견된 서열과 동일하거나 상동인 핵산 서열로 표시됨을 전달하고자 한다. "상동성"이라는 용어는 상기 설명에서 기술되어 있다.
발명의 상세한 설명
유전자 검사는 전통적으로 실험실 또는 임상 환경에서 수행된다. 그러나 유전자 검사가 유용한 많은 경우에 실험실이나 클리닉에 대한 접근이 불가능하거나 비현실적이다. 순환하는 종양 DNA 또는 태아 DNA 검사와 같은 고도의 복잡성 검사는 그러한 검사에 대한 제한된 접근(예를 들어, 정맥 절개술 요구, 시기, 진료 예약의 필요, 진료소/실험실까지의 거리) 및 이러한 검사 비용(예를 들어, 정맥 절개술 수행 비용, 밀리리터의 샘플, 샘플 튜브 및 시약의 처리, 배송, 특히 냉장 배송) 때문에 여전히 드물다. 따라서, 필요한 지점(예를 들어, 실험실 및 진료소에서 떨어진 위치)에 시행 가능한 유전자 검사가 바람직하다. 필요한 지점(예를 들어, 가정, 학교, 농장)에서 시행하기 위한 유전자 검사는 훈련받지 않은 개인이 수행하기에 비용 효율적이고 간단한 것이 바람직하다. 필요한 지점의 유전자 검사는 바람직하게는 소량의 생물학적 샘플만 필요로 한다. 전통적으로, 유전자 검사는 분석하기에 충분한 DNA를 포함하는 밀리리터의 혈액을 얻기 위해 정맥혈 채혈(정맥 절개술)이 필요하다. 그러나 정맥 절개술은 필요한 지점에서 실용적이지 않는다. 이상적으로, 유전자 검사는 모세혈의 채혈, 예를 들어 경피 천자 장치를 통해 달성되는 양의 혈액만을 필요로 한다. 이는 유전자 검사를 위한 필요 지점 장치 및 방법이 샘플의 초저 입력 및 검출하려는 표적 분자의 낮은 존재비로 기능을 하도록 설계되어야 함을 의미한다.
샘플의 초저 입력을 수용하는 것 외에도, 순환하는 무세포 핵산(DNA 및 RNA), 예를 들어 순환하는 무세포 태아 DNA, 순환하는 종양 DNA, 이식된 공여자 장기로부터의 순환하는 DNA, 및 건강 관련 문제, 질환 진행 또는 치료 반응의 일환으로 특정 조직으로부터 방출된 순환하는 DNA를 분석할 수 있는 유전자 검사를 하는 것이 바람직하다. 그러나 순환하는 무세포 핵산의 분석은 짧은 반감기, 따라서 낮은 존재비로 인해 어려움이 있다. 또한, 혈액 내 순환하는 무세포 핵산은 백혈구 세포 용해를 피하기 위해 샘플에 주의를 기울이지 않으면 백혈구에서 방출되는 DNA로 희석될 수 있다. 백혈구 DNA는 순환하는 무세포 핵산을 검출하는 동안 배경 잡음을 생성하여 분석 민감도와 특이성을 감소시킨다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적은 샘플 용량(예를 들어, 1 ml 미만)의 가볍고 효율적인 처리와 순환하는 무세포 DNA(cfDNA)의 고도로 단편화된 성질을 이용하는 고유한 표적 영역 선택 및 분석 설계를 조합함으로써 이러한 어려움을 극복한다. 예를 들어, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 한 번의 손가락 찌름으로부터 신뢰할 수 있는 유전 정보를 제공할 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 표적 유전자가 순환 중에 단편화될 때 표적 영역이 물리적으로 분리될 수 있을 정도로 충분히 이격된 표적 유전자를 따라 다수의 표적 영역의 분석을 가능하게 한다. 따라서, 전술한 통계적 샘플링 한계는 유전자 검사에서 전통적으로 분석되는 개별의 긴 DNA 단편에 대해 존재하지만, 샘플링 통계는 cfDNA 단편에 대해 유리하게 변화한다. 모세혈 샘플에는 1 게놈 당량만의 응집체가 존재할 수 있지만 많은 개별 cfDNA 단편이 존재한다. 결과적으로 초저 입력량으로 민감한 증폭을 달성할 수 있다.
예로서, 20개의 표적 영역이 게놈 영역을 따라 존재하고 영역이 단편화될 때 이들이 독립적으로 분석되고 검출될 수 있도록 충분히 이격된 경우, 모든 샘플의 99%에서 적어도 하나의 표적 영역을 갖도록 요구되는 입력 용량은 140 ㎕에서 25 ㎕로 변경되어 민감도가 크게 증가한다. 일부 경우에, 표적 영역은 동일한 서열 또는 유사한 서열을 함유한다. 이러한 표적 영역을 복제본이라고 지칭할 수 있다.
다른 경우에, 표적 영역은 유사한 서열을 공유하지 않지만, 유사한 후성 유전적 상태와 같은 다른 특성을 공유할 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 상이한 서열을 가질 수 있지만 모두 과메틸화된다. 영역들 간의 유사성에 대한 기준에 관계없이, 이들은 적절하게 이격되어 있어, 많은 순환하는 cfDNA 단편을 생성하고 이들 중 적어도 하나는 소용량으로 검출될 수 있는 순환하는 무세포 DNA의 단편화 패턴을 활용한다. 비제한적인 예로서, 별개의 cfDNA 단편에 있을 정도로 서로 충분히 떨어져 있고 피험체에게 암이 있을 때 모두 과메틸화되는 선택된 표적 영역은 비술파이트 서열 분석으로 검출될 수 있다. 적은 샘플 용량(예를 들어, 혈액의 손가락 찌름)에서, 이들 모든 단편이 존재할 가능성은 낮지만(이는 단편화되지 않은 DNA와 동일), 적어도 하나의 단편이 존재할 가능성은 높고, 암이 검출될 수 있다.
또 다른 경우에, 표적 영역은 유사한 서열을 포함하지 않을 수 있고 유사한 후성 유전적 상태를 포함하지 않을 수 있다. 이 경우, 검출에는 다수의 프라이머 세트 또는 라이브러리 제조, 이어서 여러 가지 고유한 표적 영역을 검출하기 위해 범용 프라이머를 이용한 증폭이 필요할 수 있다. 비제한적인 예로서, RHD 음성 임신 모체에서 태아 RHD 유전자의 검출은 다수의 프라이머 세트를 사용하여 무세포 태아 DNA 단편에서 RHD 유전자의 다수의 상이한 엑손을 검출함으로써 손가락 찌르기 양의 혈액으로부터 달성될 수 있다. RHD 유전자에서 물리적으로 떨어져 있고 따라서 다른 무세포 DNA 단편에 존재할 가능성이 있는 영역을 증폭시키는 프라이머를 선택함으로써 민감도를 증가시킬 수 있다. RHD 음성 임산부에서 태아 RHD 유전자를 검출하는 것은 아이의 혈액에 대한 항체를 가진 모체에 의한 신생아의 용혈성 질환을 예방하는 데 중요하다. RHD 검사는 충분한 혈액 채취(8 밀리리터의 혈액)로부터 오늘 현재 수행되어 적절한 신뢰성 있는 결과를 얻는다. 이 용량은 전체 RHD 유전자가 샘플에 존재할 가능성에 기초하기 때문에 신뢰할 수 있는 결과를 달성하기 위해 필요한 것으로 여겨진다. 이 가정을 바탕으로, 손가락 찌르기 양의 혈액에서 전체 RHD 유전자를 얻을 가능성은 낮으며 쉽게 거짓 음성 결과를 초래할 수 있다.
표적 영역이 어떻게 선택되는지에 관계없이, 이들 영역은 증폭 또는 검출이 무세포 단편화된 DNA상에서 수행될 때 개별 바이오 마커로서 샘플에 존재한다. 표적 영역을 함유하는 단편의 농도는 상응하는 단편화되지 않은 DNA 또는 그룹으로서 분석될 수 없는 단편보다 크다. 따라서, 단편화되지 않은 DNA로부터 또는 표적 영역의 하나의 복제본에 대한 분석으로부터 얻는 것보다 표적 영역으로부터 더 많은 신호가 있을 것이다. 반복되지 않거나 다른 영역과 어떤 공통점을 공유하지 않는 비-표적 영역보다 초저용량의 샘플에 존재하는 표적 영역을 검출할 가능성이 더 클 것이다. 다수의 DNA 단편에서 다수의 표적 영역을 분석함으로써, 종래의 검사에 비해 분석 민감도가 증가한다.
혈액은 무세포 핵산의 신뢰할 만한 공급원이다. 혈액으로부터 무세포 핵산을 분석하기 위한 본원에 개시된 방법은 무세포 핵산을 함유하는 혈장 또는 혈청 분획을 단리하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 필요한 지점에서 혈액 샘플을 가볍게 처리할 수 있게 한다. 이것은 백혈구 용해를 피하거나 방지하거나 줄일 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 필요한 지점에서 혈액 샘플의 신속한 처리를 가능하게 한다. 이것은 혈액 세포 용해로 이어질 수 있는 샘플의 장기 보관 및 배송을 피한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치는 세포 용해를 피하고, 감소 또는 방지하기 위해 통합된 분리, 예를 들어 여과를 통한 혈장의 즉각적인 분리를 수행한다. 시약(예를 들어, 프로브, 프라이머, 항체) 또는 검출 방법이 많은 특이성을 제공하지 않는 경우 cfDNA와 세포를 즉시 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에는, 백혈구 세포 용해를 피하기 위한 노력으로 전혈로 방법을 수행한다. 비교적 높은 특이성이 달성될 수 있는 경우, 전혈 분석이 더 바람직할 수 있다.
적은 용량의 샘플만을 요구하는 것 외에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 다음과 같은 이유로 매우 바람직하다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 일반적으로 기술 훈련이 거의 또는 전혀 필요하지 않다. 따라서, 유전자 검사 수행 비용은 숙련된 직원에 의해 수행되는 검사 비용에 비해 감소하며, 이 검사는 숙련된 직원에게 접근할 수 없는 피험체에게 이용 가능하다. 또한, 결과는 수분 내에(예를 들어, 1시간 미만) 얻을 수 있다. 이것은 감염을 검사할 때 특히 중요할 수 있다. 검사가 감염에 양성인 개인 또는 동물은 신속하게 격리되고 치료되어 감염 확산을 방지할 수 있다. 또한, 결과는 개인적으로 얻을 수 있다. 일부 경우에, 검사중인 환자만 획득한 유전 정보를 볼 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 일반적으로 가볍고 소형이므로 원격 위치에 적합하고 접근이 쉽다. 따라서 집, 학교, 직장, 전장, 농장, 또는 실험실 또는 임상 환경을 방문하는 것이 비현실적이거나 불편한 경우 임의의 다른 장소에서 이용될 수 있다. 또한, 샘플은 현장에 분석될 수 있기 때문에, 샘플은 보관되거나 배송될 필요가 없어서, 샘플 분해 및 오식(예를 들어, 샘플 교환)의 위험을 감소시킨다 .
[도 1]은 본원에 개시된 방법, 장치 및 시스템이 따라갈 수 있는 다양한 경로를 갖는 일반적인 흐름도를 도시한다. 처음에 단계 (110)에서 샘플을 얻는다. 샘플로부터 유용한 정보를 수집하기 위해 최소량의 샘플을 얻어야 한다. 샘플은 본원에 개시된 생물학적 샘플일 수 있다. 샘플은 처리되지 않은 조 샘플(예를 들어, 전혈)일 수 있다. 샘플은 처리된 샘플(예를 들어, 혈장)일 수 있다. 샘플의 양은 샘플 유형을 기반으로 할 수 있다. 전형적으로, 단계 (120)에서 샘플을 처리하거나 샘플로부터 분석물(예를 들어, 핵산 또는 다른 바이오 마커)을 정제하여 증폭 및/또는 검출될 수 있는 분석물을 생성한다. 처리는 샘플을 여과하고, 분석물을 함유하는 샘플의 성분을 결합시키거나, 분석물을 결합시키거나, 분석물을 안정화시키거나, 분석물을 정제하거나, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 샘플 성분의 비제한적인 예는 세포, 바이러스 입자, 박테리아 입자, 엑소솜, 및 뉴클레오솜이다. 일부 경우에, 분석물은 핵산이고 단계 (130)에서 이를 증폭시켜 분석을 위한 앰플리콘을 생성한다. 다른 경우에, 분석물은 핵산일 수도 있고 아닐 수도 있지만, 상관없이 증폭시키지 않는다. 분석물 또는 앰플리콘은 검출 및 분석 전에 임의로 변형시킨다(140). 일부 경우에는, 변형은 증폭 중에 발생한다(미제시). 예를 들어, 분석물 또는 앰플리콘은 태그 또는 표지될 수 있다. 검출은 서열 분석, 표적 특이적 프로브, 등온 증폭 및 검출 방법, 정량 PCR, 또는 단일 분자 검출을 포함할 수 있다. [도 1]은 본원에 개시된 장치 및 방법의 광범위한 개요로서 제공하며, 본원 개시된 장치 및 방법은 [도 1]로 제한되지 않는다. 장치 및 방법은 각각 [도 1]에 도시되지 않은 추가 구성 요소 및 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 유전 정보가 사용자에게 비공개로 유지될 수 있기 때문에 바람직하다. 실제로 장치의 사용조차도 비공개로 유지할 수 있다. 대안적으로, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 다른 사람들과 정보를 공유하도록 구성되거나 정보를 공유하도록 사용자에 의해 쉽게 적응될 수 있다(예를 들어, 블루투스 신호 켜기). 예를 들어, 정보는 간호사나 의사와 쉽게 공유될 수 있다. 일부 경우에, 장치 또는 시스템은 보안 포털 또는 응용 프로그래밍 인터페이스(API: application programming interface)를 통해 사무실 또는 병원의 의사 또는 직원에게 검사 결과를 보내거나 공유할 수 있다. 일부 경우에, 사용자는 결과를 받은 후 의사와 직접 정보를 공유하도록 선택할 수 있다. 일부 경우에, 정보는 실시간으로 공유될 수도 있다. 이러한 종류의 의사소통은 예를 들어, 군사적 책무, 고용 의무, 이주 정책, 또는 건강 문제 등으로 분리된 커플이나 가족에게 바람직하다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법에 대한 무수한 적용 분야가 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 질병을 진단 및 모니터링할 수 있게 한다. 질병의 비제한적인 예는 자가 면역 질환, 대사 질환, 암 및 신경학적 질환을 포함한다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 마이크로 바이옴 검사, 적절한 개인 의료 투여량 결정 및/또는 약물 또는 이의 용량에 대한 반응의 검출을 포함하는 개인 맞춤형 의료를 허용한다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 병원체에 의한 감염 및/또는 감염을 치료하는데 사용될 수 있는 약물에 대한 피험체의 내성의 검출을 가능하게 한다. 거의 모든 경우에, 기술 훈련이나 크고 값 비싼 실험실 장비가 거의 또는 전혀 필요하지 않는다.
[도 1]은 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 또는 방법을 사용하는 것이 피험체로부터의 생물학적 샘플의 마이크로 용량(예를 들어, 밀리리터 미만)으로 시작할 수 있음을 보여준다. 생물학적 샘플은 일반적으로 5000 미만의 게놈 당량의 무세포 DNA를 함유한다. 샘플은 분석을 가능하게 하기 위해 여과, 안정화, 정제 또는 이들의 조합에 의해 처리될 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 여과, 안정화 또는 정제와 같은 처리를 필요로 하지 않는다. 샘플 내의 몇몇 상이한 분석물, 예를 들어 무세포 DNA, 무세포 RNA, 미세 소포 관련 핵산 및 무세포 DNA 상의 후성 유전적 마커는 유익할 수 있다. 이들 분석물 중 하나 이상이 분석될 수 있다. 일부 경우에, 분석물은 증폭되지 않는다. 일부 경우에, 분석물은 분석물의 증폭 또는 변형 없이 서열 분석된다. 일부 경우에, 분석물은 증폭되어(예를 들어, 폴리머라제 매개 핵산 증폭) 분석물의 앰플리콘을 생성한다. 일부 경우에, 앰플리콘이 서열 분석된다. 일부 경우에, 앰플리콘은 추가 제조 또는 변형 없이 서열 분석된다. 일부 경우에, 앰플리콘 또는 표적 영역 내의 다형성, 돌연변이, 후성 유전적 마크 또는 이상과 같은 특징이 추가 분석을 위해 사용된다.
일부 경우에, 분석물, 앰플리콘, 또는 이들의 조합은 분석물을 표지, 바코드 또는 태그로 표지함으로써 라이브러리로 변환된다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 표지, 바코드 및 태그는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원을 증폭시켜 증폭된 라이브러리 구성원을 생성한다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 전체 게놈 증폭에 적용된다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 전체 게놈 증폭의 산물이다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 증폭된 라이브러리 구성원을 생성하기 위해 증폭되지 않는다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 전체 게놈 증폭에 적용되지 않는다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 전체 게놈 증폭의 산물이 아니다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원을 포획하여 포획된 라이브러리 구성원을 생성한다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원을 포획하고 증폭시켜 포획되고 증폭된 라이브러리 구성원을 생성한다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원이 서열 분석된다. 일부 경우에, 증폭된 라이브러리 구성원이 서열 분석된다. 일부 경우에, 포획된 라이브러리 구성원이 서열 분석된다. 일부 경우에, 포획되고 증폭된 라이브러리 구성원이 서열 분석된다. 일부 경우에, 라이브러리 구성원은 서열 분석되지 않는다. 예를 들어, 라이브러리 구성원은 프로브 배열 또는 단일 분자 카운팅에 의해 검출되거나 정량화될 수 있다. 일부 경우에, 증폭된 라이브러리 구성원이 프로브 배열 또는 단일 분자 카운팅에 의해 검출되거나 정량화된다. 일부 경우에, 포획된 라이브러리 구성원이 프로브 어레이 또는 단일 분자 카운팅에 의해 검출되거나 정량화된다. 일부 경우에, 포획되고 증폭된 라이브러리 구성원이 프로브 배열 또는 단일 분자 카운팅에 의해 검출되거나 정량화된다.
[도 2]는 본원에 개시된 방법, 시스템, 장치 및 키트가 여러 위치에 배치될 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 가정환경 또는 다른 필요 지점에서 완전히 수행될 수 있다. 이것은 실험실, 핵산 처리 및 분석 장비, 또는 기술자 또는 의사에게 (예를 들어, 신체적, 재정적으로) 접근할 수 없는 피험체에게 특히 중요하다. 일부 경우에, 샘플은 실험실에서 처리될 수 있다(예를 들어, 실험실 장비 필요). 그러나, 본원에 개시된 방법, 시스템, 장치 및 키트는 여전히 가정에서 샘플 수집 및 보고를 허용할 수 있다. 예로서, 샘플은 가정에서 수집되고, 처리가 발생하는 실험실로 배송될 수 있고, 결과는 전자 통신을 통해 가정에 있는 피험체에게 전달될 수 있다. 따라서, 실험실에서 처리가 필요한 경우에도, 본원에 개시된 방법, 시스템, 장치 및 키트는 여전히 사용자에게 편리하며, 샘플을 배송/운반하는 수단만 있으면 된다. 일부 경우에, 데이터 처리는 검사 결과를 피험체에게 전달할 수 있는 클라우드 또는 서버에서 발생하는 것이 편리하다. 일부 경우에, 데이터 처리는 실험실에서 발생하는 결과는 클라우드나 인터넷 서버에 의존하지 않고 자신의 가정에서 피험체에게 보고되는 것이 편리하다.
비침습적 산전 검사
본원에 개시된 방법, 장치 및 시스템에 대한 하나의 적용 분야는 비침습적 산전 검사(NIPT: non-invasive prenatal testing)이다. 태아의 건강은 임신의 초기 인식과 확인 후 임신한 부모의 주요 관심사 중 하나이다. 다른 일반적인 임신 관련 건강 검사 외에도, 태아 염색체 또는 유전적 이상의 위험을 평가하는 것은 많은 국가에서 임신 관리의 표준이 되었다. 현재, 태아로부터 유전 정보를 결정하는 몇 가지 방법이 있다. 첫 삼분기(1 내지 12주) 동안, 태아 후경부 투명대에 대한 초음파 검사는 삼염색체 18 또는 삼염색체 21과 같은 염색체 이상 가능성이 있는 지의 여부를 밝혀낼 수 있다. 또한, 임신 관련 혈장 단백질 및 인간 융모성 성선 자극 호르몬 수준 검사를 위해 모체 정맥 절개술이 수행될 수 있다. 이들 단백질의 수준증가는 염색체 이상을 나타낼 수도 있다. 그러나 이러한 검사는 결정적이지 않으며 일반적으로 이상이 실제 있는지 확인하기 위해 추가적인, 더 침습적 검사(예를 들어, 융모막 융모 샘플링(태반 조직 샘플링) 또는 양수 천자(바늘이 양막낭에 침투함))가 필요하다. 두 번째 삼분기 동안 추가 검사를 수행할 수 있지만, 더 명확한 결정을 위해서는 일반적으로 더 많은 검사, 추가 초음파 및 양수 천자가 필요하다.
전술한 스크리닝은 임상 환경에서 기술 훈련을 받은 의료 제공자가 필요하다. 이 검사 중 다수는 침습적(예를 들어, 양수 천자)으로 태아와 산모에게 건강상의 위험을 초래한다. 전형적으로, 전술한 스크리닝은 염색체 이상을 검출하기 위해 두 임신 삼분기 모두에 필요하다. 따라서, 염색체 이상의 검출은 전형적으로 태아가 임신 중반에 도달할 때까지는 당분야의 현재의 방법을 사용하여 염색체 이상의 검출이 달성될 수 없다.
임산부의 혈액에서 순환하는 무세포 태아 DNA의 존재를 발견한 이후로, 산전 관리는 상당한 개선을 보였다. 모체 혈액에서 순환하는 태아 DNA의 존재는 태아의 유전적 구성을 연구하고 융모막 융모 표본 추출 및 양수 천자와 같은 절차와 관련된 위험없이 잠재적인 건강상 위험 또는 임신 합병증을 식별하는 수단을 제공하였다. 순환하는 무세포 태아 DNA를 이용하는 다수의 의학적으로 관련된 많은 검사가 개발되었지만, 가장 두드러지는 것은 태아 염색체 이상에 대한 NIPT이다.
기존의 NIPT는 2가지 주요 카테고리로 분류될 수 있다. 이들은 특정 염색체 또는 염색체 영역을 단지 증폭 및 분석하는 표적화된 분석법이거나 전체 게놈 분석법이다. 불행하게도, 기존의 NIPT는 적절한 스크리닝 성능을 달성하기에 충분한 양의 모체 혈액/혈장을 얻기 위해 정맥 천자(예를 들어, 정맥 절개술)를 필요로 한다. 예를 들어, 기존 NIPT는 종종 16 ml의 혈액을 수집해야 한다. 기존 NIPT에는 많은 양의 혈액이 필요하기 때문에 편의성과 검사에 대한 접근이 크게 제한된다. 또한, 검사 비용 및 시약 비용뿐만 아니라 샘플 취급 물류는 부담이 된다.
이전에는, NIPT는 정맥 절제술로 얻은 것(예를 들어, 밀리리터의 혈액)과 같은 다량의 cfDNA 복제본 수(게놈 당량)만으로 실현 가능한 것으로 생각되었다. 몇 가지 통계적 이유(매우 작은 차이를 해결하려면 많은 샘플 수가 필요함)와 전통적인 이유(FISH에 대한 제한된 마커 가용성)가 이 관행을 공고히 하였다. 본 출원은 초저 입력량에서 cfDNA 분석에 의한 NIPT가 어떻게 가능한지를 보여준다. 실시예 1 내지 5를 참조한다. 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트는 최소한의 샘플 용량으로부터 NIPT를 가능하게 하는 새로운 방식으로 저수준 DNA 증폭(예를 들어, 8 내지 10 사이클)과 고효율 라이브러리 생성을 위한 기존의 방법을 결합한다.
기존의 NIPT와 달리, 본원에 개시된 방법, 시스템 및 장치는 태아 염색체 이상의 정확한 스크리닝에 필요한 무세포 태아 DNA의 양을 최소화하여, 큰 샘플 용량의 필요성을 피한다. 샘플이 혈액일 경우, 손가락 찌름으로 충분한 양의 혈액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 실시예 3을 참조한다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 정맥 천자의 필요성을 없애므로, 검사 비용의 상당한 감소로 현장에서 NIPT를 가능하게 한다. 모체 혈액에서의 태아 분율이 낮을 수 있고 모체 무세포 핵산이 다양할 수 있기 때문에, 본원에 개시된 방법, 시스템 및 장치가 태아에 대한 신뢰성 있고 유용한 유전 정보를 성공적으로 밝힐 것이라는 것은 예상치 못한 일이었다. 모체 생물학은 항상 변하고 모체 피험체의 모체 무세포 핵산에는 많은 가변성이 있다. 순환하는 무세포 핵산에 기여하는 모체의 다양한 기관(예를 들어, 간, 피부)의 무세포 핵산이 있으며, 이들 기관의 생물학은 나이, 질환, 감염 및 심지어 시각에 따라 변할 수 있다. 모체 표시가 검사 피험체로부터의 무세포 태아 핵산을 참조/대조군 피험체로부터의 무세포 태아 핵산과 비교하기에 충분히 재현 가능하다는 것은 예측할 수 없었다. 숙주 배경 DNA가 실제로 안정된 충분한 분포를 제공하여 삼염색체 또는 다른 게놈 변이가 정확하게 검출될 수 있다는 것을 실험적으로 입증해야 한다.
태아의 유전 정보를 얻기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 유리하게는 임신 초기 단계에서 유전 정보를 얻을 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 실험실 장비가 필요 없고 샘플 교환의 위험 없이 가정에서 개인적으로 태아의 유전 정보를 얻을 수 있다. 유전 정보는 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법으로 수 분 또는 수 초 내에 검출될 수 있다.
임신한 피험체의 생물학적 유체 샘플로부터 무세포 태아 핵산을 분석하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 무세포 순환 핵산의 분석은 많은 기술적 과제에 직면한다. 예를 들어, 혈액 내 순환 핵산의 증폭은 전혈의 일부 성분에 의해 저해될 수 있다. 전혈 성분의 비제한적인 예는 헤모글로빈 및 관련 철이다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 이러한 많은 기술적 과제를 극복하는 것을 목표로 한다. 또한, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 (1) 최소 침습적이고, (2) 기술 훈련이 거의 또는 전혀 없이 가정에서 적용 가능하고; (3) 병태의 초기 단계에서 유익한 정보(예를 들어, 임신, 감염)를 준다는 이점을 제공한다. 또한, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 일반적으로 복잡하거나 고가의 장비가 필요하지 않다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 본원에서 "무세포 태아 핵산"으로 지칭되는 태아로부터의 무세포 핵산을 분석하는데 유용하다. 일부 경우에, 무세포 태아 핵산은 태아의 적어도 하나의 세포, 태반의 적어도 하나의 세포 또는 이들의 조합으로부터 유래한다. 모체 혈액에서 무세포 태아 핵산의 산전 적용은 무세포 모체 핵산의 존재하에 무세포 태아 핵산을 분석해야 하는 추가적인 과제를 제시하는데, 후자는 전자에 대해 큰 배경 신호를 생성한다. 예를 들어, 모체 혈액의 샘플은 전혈 밀리리터당 총 무세포 DNA(모체 및 태아)의 약 500 내지 2000 게놈 당량을 함유할 수 있다. 임산부로부터 샘플링된 혈액 내 태아 분율은 ml당 대략 10%, 약 50 내지 200 태아 게놈 당량일 수 있다. 또한, 무세포 핵산을 얻는 공정은 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 조심스럽게 수행하지 않으면 혈액 세포가 파괴되어 샘플에 추가 세포 핵산이 방출되어 태아 무세포 핵산에 추가 배경 신호를 생성할 수 있다. 전형적인 백혈구 수는 혈액 ml당 약 4*10^6 내지 10*10^6개 세포이므로 이용 가능한 핵 DNA는 전체 무세포 DNA(cfDNA)보다 약 10,000배 더 높다. 결과적으로, 모체 백혈구의 적은 일부만이 파괴되어 핵 DNA를 혈장 또는 혈청으로 방출하더라도 태아 분율이 급격히 감소한다. 예를 들어, 0.01%의 백혈구 분해는 태아 분율을 10%에서 약 5%로 감소시킬 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 이러한 배경 신호를 감소시키는 것을 목표로 한다.
방법
일반적으로, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플을 얻는 단계 및 이의 성분을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 본원에 기재된 장치, 시스템 또는 키트로 수행된다. 생물학적 샘플을 얻는 단계는 임상 또는 실험실 환경, 예컨대, 비제한적인 예로서, 의료 클리닉, 병원, 과학 연구 실험실, 병리 실험실. 또는 임상 검사실에서 발생할 수 있다. 대안적으로, 얻는 단계는 임상 또는 실험실 환경으로부터 원격 장소, 예컨대, 비제한적인 예로서, 가정, 가족계획 센터, 직장, 학교, 농장 또는 전장에서 발생할 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 방법은 임상 환경 또는 원격 위치에서 수집이 발생하는지에 관계없이, 상대적으로 적은 용량의 생물학적 샘플을 수집 및 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 검출 단계는 임상 또는 실험실 환경에서 발생한다. 다른 경우에, 검출 단계는 임상 또는 실험실 환경의 원격 위치에서 발생한다. 본원에 개시된 방법의 다른 단계, 예를 들어 핵산 증폭 단계는 임상/실험실 환경 또는 원격 위치에서 발생할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피험체에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 해당 방법을 수행하는 데 필요한 기술 훈련을 받지 않은 사용자에 의해 수행된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물할적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 관심 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 생물학적 샘플은 약 1010개 미만의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 105 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 103 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 102 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 105 내지 약 109개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 105 내지 약 108개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 105 내지 약 107개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 106 내지 약 1011개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 106 내지 약 109개의 무세포 DNA를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 약 107 내지 약 109개의 무세포 핵산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 과다 표시 또는 과소 표시는 적어도 하나의 대조군 피험체에서의 관심 영역의 표시에 대한 검사 피험체로부터의 검사 샘플에서 관심 영역의 표시이다. 일부 경우에, 대조군 피험체는 건강한 피험체이다. 일부 경우에, 대조군 피험체는 관심 영역에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 대조군 피험체는 관심 영역의 야생형 복제본 수를 갖는다. 일부 경우에, 관심 영역의 후성 유전적으로 변형된 형태의 과다 표시 또는 과소 표시가 존재한다. 일부 경우에, 과다 표시 또는 과소 표시는 적어도 하나의 참조 샘플에서 관심 영역의 표시에 대한 검사 샘플에서 관심 영역의 표시이다. 참조 샘플은 검사 샘플과 동시에 분석될 수 있다. 참조 샘플은 검사 샘플을 분석하기 전에 분석될 수 있다. 적어도 하나의 참조 샘플은 복수의 참조 샘플을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 과다 표시 또는 과소 표시는 복수의 참조 샘플에서 관심 영역의 평균 표시에 대한 검사 샘플에서 관심 영역의 표시이다.
일부 경우에, 방법은 대조군 샘플에서 유전 정보를 분석하고 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 대조군 샘플에서 유전 정보를 분석 및 검출하는 단계를 포함하고, 대신 대조 참조 데이터로부터 수득한 예정된 대조 참조 값을 사용한다. 이것은 피험체가 자신의 가정에서 샘플을 분석하고 대조군 샘플에 접근할 수 없을 때 특히 유용하다. 그러나 종종 피험체는 대조군 샘플(예를 들어, 친척, 배우자, 친구로부터)을 쉽게 얻을 수도 있다. 또한, 본원 기술된 바와 같은 시스템 및 방법은 각각의 샘플을 인덱싱함으로써 다수의 샘플을 동시에 분석하는 것을 가능하게 한다.
일부 측면에서, 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 표적 서열에 이상이 있음을 98% 초과의 정확도로 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 이상은 건강한 피험체에 존재하지 않는 특징 또는 특성일 수 있다. 이상은 야생형 피험체에 존재하지 않는 특징 또는 특성일 수 있다. 이상은 대조군 피험체에 존재하지 않는 특징 또는 특성일 수 있다. 이상은 유전적 돌연변이일 수 있다. 이상은 복수의 유전적 돌연변이일 수 있다. 유전적 돌연변이는 본원 및 전체에 걸쳐 기술되어 있다. 이상은 후성 유전적 변형일 수 있다. 이상은 복수의 후성 유전적 변형일 수 있다.
일부 측면에서, 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 야생형 복제본 수에 비해 표적 서열의 비정상적인 복제본 수가 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 증폭시켜 증폭된 핵산을 생성하는 단계; 증폭된 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제1 부분을 측정하는 단계; 비-표적 서열의 적어도 하나의 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제2 부분을 측정하는 단계; 및 서열 분석 리드의 제1 부분 대 서열 분석 리드의 제2 부분의 비율이 대조군 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 표적 서열에 이상이 있음을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 방법은 증폭 전, 중 또는 후 및 서열 분석 전에 무세포 핵산을 바코드 또는 태그하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플에 존재하는 무세포 핵산의 적어도 일부를 바코드 및/또는 태그하여 태그된 핵산을 생성하는 단계; 태그된 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제1 부분을 측정하는 단계; 비-표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제2 부분을 측정하는 단계; 및 서열 분석 리드의 제1 부분 대 서열 분석 리드의 제2 부분의 비율이 대조군 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 표적 서열에 이상이 있음을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제1 부분을 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 제2 부분을 측정하는 단계; 및 서열 분석 리드의 제1 부분 대 서열 분석 리드의 제2 부분의 비율이 대조군 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 적어도 하나의 표적 서열에 이상이 있음을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 무세포 핵산을 포함하는 모세혈을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 기재된다.
일부 측면에서, 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로 생물학적 샘플은 총 무세포 핵산을 함께 구성하는 표적 무세포 핵산 및 비-표적 무세포 핵산을 포함하고, 표적 무세포 핵산은 총 무세포 핵산의 5% 미만인 단계; 표적 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일반적으로, 얻는 단계는 정맥 절개술을 수행하거나 정맥 절개술로부터 샘플을 받는 것을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 정맥혈을 포함하지 않는다. 생물학적 샘플은 모세혈을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 본질적으로 모세혈로 이루어질 수 있다.
일부 측면에서, 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 기재된다. 방법은 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 서열 분석 전 및 증폭 후 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산 분자를 태그한 후 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무세포 핵산 분자를 태그하기 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
비침습적 산전 검사(NIPT)
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 경우에, 과다 표시 또는 과소 표시는 적어도 하나의 대조군 임신 피험체에서의 염색체 또는 염색체 영역의 표시에 대한 것이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 대조군 임신 피험체는 임신한 정배수체 피험체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 대조군 임신 피험체는 임신한 이수체 피험체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 대조군 임신 피험체는 염색체 이상이 없는 임신한 피험체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 대조군 임신 피험체는 적어도 하나의 염색체 이상을 갖는 임신한 피험체이다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 정배수체 태아를 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 이수체 태아를 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 유전적 이상이 없는 태아를 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 적어도 하나의 유전적 이상을 갖는 태아를 갖는다. 일부 경우에, 적어도 하나의 대조군 임신 피험체는 염색체 이상의 존재 또는 부재가 동일한 복수의 임신한 피험체를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트는 추가 대조군을 이용한다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 정배수체일 경우에 예상되는 염색체의 표시이다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 이수체일 경우에 예상되는 염색체의 표시이다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 정배수체일 경우에 예상되는 염색체의 양이다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 이수체일 경우에 예상되는 염색체의 양이다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 정배수체일 경우에 예상되는 염색체에 상응하는 양의 서열 분석 리드의 양이다. 일부 경우에, 대조군은 태아가 이수체일 경우에 예상되는 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 양이다. 일부 경우에, 방법은 대조군 샘플에서 유전 정보를 분석하고 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 대조군 샘플에서 유전 정보를 분석 및 검출하는 단계를 포함하고, 대신 대조 참조 데이터로부터 수득한 예정된 대조 기준 값을 사용한다. 이것은 임신한 피험체가 자신의 가정에서 샘플을 분석하고 대조군 샘플에 접근할 수 없을 때 특히 유용하다. 그러나 종종 임신한 피험체는 또한 대조군 샘플(예를 들어, 친척, 배우자, 친구로부터)을 쉽게 얻을 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 시스템 및 방법은 각각의 샘플을 인덱싱함으로써 다수의 샘플을 동시에 분석하는 것을 가능하게 한다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 적어도 2000개의 무세포 태아 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 생물학적 샘플의 총 무세포 핵산 분자에서 무세포 태아 핵산 분자의 분율이 낮을 때에도 이러한 서열 분석 리드 수는 충분하다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시켜 증폭된 핵산을 생성하는 단계; 적어도 2000개의 증폭된 태아 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이한 경우, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 방법은 증폭 전, 증폭 중 또는 증폭 후 및 적어도 2000개의 증폭된 태아 핵산을 서열 분석하기 전에 핵산을 바코드 또는 태그하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 핵산이다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플에 존재하는 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 바코드 및/또는 태그하여 태그된 핵산을 생성하는 단계; 적어도 2000개의 태그된 핵산을 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이한 경우, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 방법은 적어도 8000개의 태그된 핵산을 서열 분석하기 전에 바코드 및/또는 태그된 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 1010개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 적어도 8000개의 무세포 핵산 분자를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이한 경우, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 혈액 세포로부터 유래하지 않는다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 혈액 세포로부터 유래한 핵산을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 혈액 세포로부터 유래한 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 1010개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자를 증폭시켜 증폭된 무세포 핵산 분자를 생성하는 단계; 적어도 8000개의 증폭된 무세포 핵산 분자를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이한 경우, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 방법은 적어도 8000개의 증폭된 무세포 핵산 분자를 서열 분석하기 전에 증폭된 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 임신한 피험체로부터 최대 약 1010개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자를 태그하여 태그된 무세포 핵산 분자를 생성하는 단계; 적어도 8000개의 태그된 무세포 핵산 분자를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 적어도 4000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이한 경우, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 98% 초과의 정확도로 측정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 방법은 적어도 8000개의 태그된 무세포 핵산 분자를 서열 분석하기 전에 태그된 무세포 DNA 단편을 증폭시키는 단계를 포함한다.
샘플 얻기
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 본원에 기재된 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 샘플은 직접 얻을 수 있다(예를 들어, 의사가 피험체로부터 혈액 샘플을 채취함). 샘플은 간접적으로 얻을 수 있다(예를 들어, 의사 또는 피험체로부터로부터 기술자에 의한 배송을 통해). 일부 경우에, 생물학적 샘플은 생물학적 유체이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 면봉 채취 샘플(예를 들어, 구강 면봉, 질 면봉)이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 간질액, 또는 질액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 손가락 찌름을 통해 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 단일 손가락 찌름을 통해 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 많아야 단일 손가락 찌름으로 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 모세혈(예를 들어, 손가락 또는 피부 찌름으로부터 얻은 혈액)을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 원하는 용량의 혈액을 얻기 위해 찌름으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 포함한다. 다른 경우에, 방법은 원하는 양의 혈액을 얻기 위해 찌름으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 포함하지 않는다. 손가락 찌름은 모세혈을 얻는 일반적인 방법이지만 신체의 다른 위치, 예를 들어 발가락, 발뒤꿈치, 팔, 손바닥, 어깨, 귓불도 적합하다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 정맥 절개술 없이 혈액 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 모세혈을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 정맥혈을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 정맥혈(예를 들어, 정맥으로부터 얻은 혈액)을 얻는 단계를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 방법은 생검을 통해 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 액체 생검을 통해 생물학적 유체를 얻는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 단편화된 핵산을 가진 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 샘플은 핵산의 완전성을 보존하는데 도움이 되지 않는 조건에 노출되었을 수 있다. 비제한적인 예로서, 샘플은 법의학적 샘플일 수 있다. 법의학 샘플은 종종 오염되고 공기, 열, 빛 등에 노출된다. 샘플이 동결 및 해동되었을 수 있다. 샘플은 핵산을 분해하는 화학 물질 또는 효소에 노출되었을 수 있다. 일부 경우에, 방법은 단편화된 핵산을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 핵산을 포함하는 조직 샘플을 얻는 단계 및 핵산을 단편화하여 단편화된 핵산을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 조직 샘플은 냉동 샘플이다. 일부 경우에, 샘플은 보존된 샘플이다. 일부 경우에, 조직 샘플은 고정 샘플(예를 들어, 포름알데히드 고정됨)이다. 방법은 샘플로부터 (단편화된) 핵산을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 유전자 분석을 위해 용액 중 단편화된 핵산을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 50 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 75 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 100 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 125 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 150 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 200 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 300 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 400 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 500 ㎕ 이하의 생물학적 유체 샘플로 수행된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 초저용량은 샘플 용량의 일정 범위 내에 속한다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 1 밀리리터이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 900 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 800 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 700 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 600 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 400 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 300 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 200 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 5 ㎕ 내지 약 100 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 90 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 85 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 75 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 70 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 65 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 60 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 55 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 150 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 120 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 100 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 90 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 85 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 80 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 75 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 70 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 65 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 60 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 55 ㎕이다. 일부 경우에, 샘플 용량의 범위는 약 15 ㎕ 내지 약 50 ㎕이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 초저용량은 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 초저용량은 약 100 ㎕ 내지 약 1000 ㎕이다. 일부 경우에, 초저용량은 약 500 ㎕ 내지 약 1 ml이다. 일부 경우에, 초저용량은 약 500 ㎕ 내지 약 2 ml이다. 일부 경우에, 초저용량은 약 500 ㎕ 내지 약 3 ml이다. 일부 경우에, 초저용량은 약 500 ㎕ 내지 약 5 ml이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플은 전혈이다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 250 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 250 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 25 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 35 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 45 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 80 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 120 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 140 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 150 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 160 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 180 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플은 혈장 또는 혈청이다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 200 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 190 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 180 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 160 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 150 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 1 ㎕ 내지 약 140 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 15 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 25 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 35 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 45 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 60 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 70 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 90 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 100 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 125 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 175 ㎕일 수 있다. 초저용량은 약 5 ㎕ 내지 약 200 ㎕일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 초저용량의 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플은 소변이다. 일반적으로, 소변 중의 DNA 농도는 약 40 ng/ml 내지 약 200 ng/ml이다. 일부 경우에는, 초저용량의 소변은 약 0.25 ㎕ 내지 1 밀리리터이다. 일부 경우에는, 초저용량의 소변은 약 0.25 ㎕ 내지 약 1 밀리리터이다. 일부 경우에는, 초저용량의 소변은 최소 약 0.25 ㎕이다. 일부 경우에는, 초저용량의 소변은 최대 약 1 밀리리터이다. 일부 경우에는, 초저용량의 소변은 약 0.25 ㎕ 내지 약 0.5 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 0.75 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 1 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 5 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 10 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 0.25 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 0.5 ㎕ 내지 약 0.75 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 1 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 5 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 10 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 0.5 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 0.75 ㎕ 내지 약 1 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 5 ㎕, 약 0.75 ㎕ 약 10 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 0.75 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 1 ㎕ 내지 약 5 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 10 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 1 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 5 ㎕ 내지 약 10 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 5 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 10 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 10 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 50 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 100 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 150 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 약 200 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 200 ㎕ 내지 약 1 밀리리터, 또는 약 500 ㎕ 내지 약 1 밀리리터이다. 일부 경우에, 사용되는 소변의 용량은 약 0.25 ㎕, 약 0.5 ㎕, 약 0.75 ㎕, 약 1 ㎕, 약 5 ㎕, 약 10 ㎕, 약 50 ㎕, 약 100 ㎕, 약 150 ㎕, 약 200 ㎕, 약 500 ㎕, 또는 약 1 밀리리터이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 5 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 10 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 15 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 97%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99.5%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 20 ㎕ 내지 약 120 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 혈장 또는 혈청이다. 혈장 또는 혈청은 전혈의 대략 55%를 구성한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 10 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 10 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 12 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 12 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 12 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 적어도 약 12 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 90%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈장 또는 혈청 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 97%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 99.5%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해서 단지 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 일정량의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 결과적으로 생물학적 샘플에서 세포를 파괴하거나 용해시킨다. 따라서, 일부 경우에, 생물학적 샘플은 세포 핵산 분자를 포함한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 1% 미만을 구성한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 5% 미만을 구성한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 10% 미만을 구성한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 20% 미만을 구성한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 50% 미만을 구성한다. 일부 경우에, 세포 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 총 세포 핵산 분자의 약 90% 미만을 구성한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 초저량의 무세포 핵산을 함유하는 초저량의 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 100 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 150 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 200 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 300 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 400 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 500 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 4 pg 내지 약 1 ng이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 100 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10pg 내지 약 150pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 200 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 300 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 400 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 500 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 10 pg 내지 약 1 ng이다. 일부 경우에, 초저량은 약 20 pg 내지 약 100 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 20 pg 내지 약 200 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 20 pg 내지 약 500 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 20 pg 내지 약 1 ng이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 150 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 180 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 200 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 300 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 400 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 500 pg이다. 일부 경우에, 초저량은 약 30 pg 내지 약 1 ng이다. 일부 경우에, 피험체는 임신한 피험체이고, 무세포 핵산은 무세포 태아 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 피험체는 종양을 갖고, 무세포 핵산은 무세포 종양 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 피험체는 장기 이식 수여자이고 무세포 핵산은 장기 공여자 DNA를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 약 1 ng 미만의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 500 pg 미만의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 100 pg 미만의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 3.5 pg의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 10 pg의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 100 pg 이하의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 500 pg 이하의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 약 1 ng 이하의 무세포 태아 핵산을 얻는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 적어도 1 게놈 당량의 무세포 DNA를 함유하는 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 당업자는 게놈 당량이 모든 유전자가 존재할 것이라는 것을 보장하기 위해 샘플에 존재하는 데 필요한 DNA의 양이라는 것을 이해한다. 본원에 개시된 초저용량의 생물학적 유체 샘플은 극소수의 게놈 당량을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 1 미만의 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 5 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 10 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 15 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 20 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 약 5 내지 약 50 게놈 당량을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 약 10 내지 약 50 게놈 당량을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 약 10 내지 약 100 게놈 당량을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 50 이하의 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 60 이하의 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 80 이하의 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 100 이하의 게놈 당량의 무세포 핵산을 함유한다.
본원에 개시된 초저용량의 생물학적 유체 샘플은 극소수의 세포 당량을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 생물학적 유체 샘플을 얻는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 유체 샘플은 적어도 1 세포 당량의 무세포 DNA를 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 2 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 5 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 약 5 세포 당량 내지 약 40 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 적어도 5 세포 당량 내지 약 100 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 30 이하의 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 50 이하의 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 80 이하의 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 유체 샘플은 100 이하의 세포 당량의 무세포 핵산을 함유한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 적어도 하나의 관심의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 비제한적인 예로서, 관심의 무세포 핵산은 무세포 태아 핵산, 무세포 종양 DNA, 또는 이식된 기관으로부터의 DNA일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 1 내지 약 5개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 1 내지 약 15개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 1 내지 약 25개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 1 내지 약 100개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 5 내지 약 100개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 무세포 핵산은 본원에 개시된 표적 염색체에 고유한 서열로 표시된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 109개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 108개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 107개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 106개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 102개의 무세포 핵산 내지 약 105개의 무세포 핵산을 함유한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 1010개의 무세포 핵산을 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 109개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 108개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 107개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 106개의 무세포 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 약 103개의 무세포 핵산 내지 약 105개의 무세포 핵산을 함유한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 피험체로부터 전형적인 샘플 유형 용량에 해당하는 다수의 무세포 핵산을 갖는 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 비제한적인 예로서, 임신한 피험체로부터의 인간 혈액 4 ml는 전형적으로 약 1010 무세포 태아 핵산을 함유한다. 그러나 샘플에서 무세포 태아 핵산의 농도, 따라서 태아 유전학에 대한 정보를 주는 데 필요한 샘플 용량은 샘플 유형에 따라 달라질 것이다. 본원에 제공된 실시예 7은 또한 당업자가 충분한 수의 무세포 태아 핵산을 얻는데 필요한 최소 부피를 결정할 수 있는 방법을 입증한다.
샘플 처리
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 무세포 핵산 분자를 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 무세포 태아 핵산 분자를 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 본원에 기재된 생물학적 샘플로부터 비-핵산 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분을 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제하는 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 95%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 97%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 98%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 99%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 95%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 97%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제하는 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 98%를 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분의 적어도 99%를 제거하는 것을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플의 하나 이상의 비-핵산 성분으로부터 핵산을 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다. 비-핵산 성분은 또한 원하지 않는 물질로 간주될 수 있다. 비-핵산 성분의 비제한적 예는 세포(예를 들어, 혈액 세포), 세포 단편, 세포 외 소포, 지질, 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가의 비-핵산 성분은 본원 및 전체에 기재되어 있다. 방법은 핵산을 단리/정제하는 단계를 포함할 수 있지만, 핵산 정제 단계에서 원하지 않는 물질로 간주되는 샘플의 비-핵산 성분을 분석하는 단계도 포함할 수 있음에 알아야 한다. 단리 또는 정제 단계는 후반 공정 단계, 예를 들어 핵산 증폭 또는 검출을 저해하거나, 방해하거나 그에 해가 되는 생물학적 샘플의 성분을 제거하는 것을 포함할 수 있다.
단리 또는 정제 단계는 본원에 개시된 장치 또는 시스템으로 수행될 수 있다. 단리 또는 정제 단계는 본원에 개시된 장치 또는 시스템 내에서 수행될 수 있다. 단리 및/또는 정제 단계는 본원에 개시된 샘플 정제기를 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 본원에 기재된 생물학적 샘플로부터 비-핵산 성분을 제거하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 비-핵산 성분을 폐기하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 비-핵산 성분을 수집, 처리 및 분석하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 비-핵산 성분은 피험체에 대한 추가 정보를 제공하기 때문에 바이오 마커로 간주될 수 있다.
일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 세포를 용해시키는 것을 피한다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 세포를 용해시키기 것을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 세포를 용해시키기 위해 의도된 활성 단계를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 의도적으로 세포를 용해시키는 것을 포함하지 않는다. 의도적으로 세포를 용해시키는 것은 세포막을 기계적으로 파괴하는 것(예를 들어, 전단)을 포함할 수 있다. 의도적으로 세포를 용해시키는 단계는 세포를 용해 시약과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 용해 시약이 본원에 기재되어 있다.
일부 경우에, 핵산의 단리 또는 정제 단계는 용해시키는 단계 및 용액에서 "미끼"로 표적 핵산의 서열 특이적 포획을 수행하는 단계, 이어서 "미끼"를 자성 비드(예를 들어, Legler et al., Specific magnetic bead-based capture of free fetal DNA from maternal plasma, Transfusion and Apheresis Science 40 (2009), 153-157)와 같은 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 재조합 효소 또는 헬리카제의 존재하에 서열 특이적 포획을 수행하는 단계를 포함한다. 재조합 효소 또는 헬리카제를 사용하면 핵산의 열 변성이 필요하지 않을 수 있고 검출 단계를 가속화할 수 있다.
일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 본원에 개시된 생물학적 샘플의 성분을 분리하는 것을 포함한다. 비제한적 예로서, 단리 또는 정제 단계는 혈액으로부터 혈장을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플을 원심분리하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플의 성분을 분리하기 위해서 생물학적 샘플을 여과하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 비-핵산 성분을 제거하기 위해서 생물학적 샘플을 여과하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플로부터 핵산을 포획하기 위해서 생물학적 샘플을 여과하는 것을 포함한다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈액이며, 핵산을 단리 또는 정제하는 단계는 혈액으로부터 혈장을 얻거나 단리하는 것을 포함한다. 혈장을 얻는 단계는 혈액 샘플의 세포 성분으로부터 혈장을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 혈장을 얻는 단계는 혈액을 원심 분리하는 단계, 혈액을 여과하는 단계, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 혈장을 얻는 단계는 혈액이 중력을 받도록 하는 단계(예를 들어, 침강)를 포함할 수 있다. 혈장을 얻는 단계는 혈액의 비-핵산 성분으로부터 혈액의 일부를 위킹하는 물질에 혈액을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 혈액을 수직 여과하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 전혈을 수용하기 위한 필터 매트릭스를 포함하는 샘플 정제기에 혈액을 적용하는 단계를 포함하며, 필터 매트릭스는 세포가 통과하는 것을 금지하는 기공 크기를 갖는 반면, 혈장은 필터 매트릭스를 통해 금지되지 않고 통과할 수 있다. 이러한 수직 여과 및 필터 매트릭스는 개시된 장치를 위해 설명된다.
일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플, 또는 이의 분획, 또는 이의 변형된 형태를 결합 모이어티에 적용하는 것을 포함한다. 결합 모이어티는 생물학적 샘플의 성분에 결합하고 이를 제거하여 원하지 않거나 관심이 없는 세포, 세포 단편, 핵산 또는 단백질이 고갈된 변형된 샘플을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플에서 원하지 않는 물질 또는 비-핵산 성분을 감소시키기 위해 생물학적 샘플을 결합 모이어티에 적용하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플을 결합 모이어티에 적용하여 표적 세포, 표적 세포 단편, 표적 핵산 또는 표적 단백질이 농축된 변형된 샘플을 생성하는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 단리 또는 정제 단계는 태아 DNA 또는 RNA 단편을 함유할 수 있는 태반 교육된 혈소판을 포획하기 위해 생물학적 샘플을 결합 모이어티에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 생성된 세포-결합 결합 모이어티는 항체 또는 다른 방법, 예를 들어 저속 원심 분리로 포획/농축될 수 있다.
단리 또는 정제 단계는 생물학적 샘플에서 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 결합 모이어티로 포획하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 DNA 및 RNA 중 적어도 하나를 함유한다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 태아/태반 기원이다. 방법은 모체 세포로부터 유래한 생물학적 샘플에서 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 포획하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 모체 세포로부터 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 포획 및 폐기하여 태아/태반 핵산에 대한 샘플을 농축하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 생물학적 샘플에서 뉴클레오솜을 포획하고 뉴클레오솜에 부착된 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 생물학적 샘플에서 엑소솜을 포획하고 엑소솜에 부착된 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 뉴클레오솜 및/또는 엑소솜의 포획은 용해 단계 또는 시약의 필요성을 배제할 수 있어, 방법을 단순화하고 샘플 수집에서 검출까지의 시간을 단축할 수 있다.
일부 경우에, 방법은 태아 DNA 또는 RNA 단편을 함유할 수 있는 태반 교육된 혈소판을 포획하기 위해 생물학적 샘플을 세포 결합 모이어티에 적용하는 단계를 포함한다. 포획 단계는 태반 단련된(placenta educated) 혈소판을 결합 모이어티(예를 들어, 세포 표면 마커에 대한 항체)와 접촉시키는 단계, 생물학적 샘플을 저속 원심 분리에 적용시키는 단계, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 본원에 개시된 고체 지지체에 부착되고, 방법은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉된 후 나머지 생물학적 샘플로부터 고체 지지체를 분리하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 비-핵산 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 비-핵산 성분을 제거하고 폐기하는 단계를 포함한다. 비-핵산 성분의 비제한적 예는 세포(예를 들어, 혈액 세포), 세포 단편, 세포 외 소포, 지질, 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 비-핵산 성분을 제거하는 단계는 생물학적 샘플을 원심 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비-핵산 성분을 제거하는 단계는 생물학적 유체 샘플을 여과하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비-핵산 성분을 제거하는 단계는 생물학적 샘플을 본원에 기재된 결합 모이어티와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플에서 핵산을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 정제 단계는 세척 완충액으로 핵산을 세척하는 것을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 태아 핵산이다. 일부 실시 양태에서, 정제는 핵산 포획 모이어티로 핵산을 포획하여 포획된 핵산을 생성하는 단계를 포함한다. 핵산 포획 모이어티의 비제한적 예는 실리카 입자 및 상자성 입자이다. 일부 실시 양태에서, 정제 단계는 포획된 핵산을 함유하는 샘플을 소수성 상(예를 들어, 액체 또는 왁스)을 통과시키는 것을 포함한다. 소수성 상은 그렇지 않으면 핵산의 추가 조작(예를 들어, 증폭, 서열 분석)을 저해하는 샘플 내의 불순물을 보유한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 본원에 기재된 생물학적 샘플로부터 핵산 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 제거된 핵산 성분은 폐기된다. 비제한적인 예로서, 방법은 DNA만을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서 RNA는 원치 않으며 DNA에 바람직하지 않은 배경 소음이나 오염을 일으킨다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 RNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 mRNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 마이크로 RNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 모체 RNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 DNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 임신한 피험체의 생물학적 샘플로부터 모체 DNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 성분을 제거하는 단계는 핵산 성분을 핵산에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 포획 장치(예를 들어, 비드, 칼럼, 매트릭스, 나노 입자, 자성 입자 등)에 접합, 부착 또는 결합된다. 일부 경우에, 제거된 핵산 성분은 폐기된다.
일부 경우에, 핵산 성분을 제거하는 단계는 핵산 성분을 겔에서 크기별로 분리하는 것을 포함한다. 예를 들어, 순환하는 무세포 태아 DNA 단편은 일반적으로 길이가 200 염기쌍 미만이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 무세포 DNA를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 무세포 DNA를 포획하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플로부터 무세포 DNA를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 무세포 DNA는 최소 길이를 갖는다. 일부 경우에, 최소 길이는 약 50 염기쌍이다. 일부 경우에, 최소 길이는 약 100 염기쌍이다. 일부 경우에, 최소 길이는 약 110 염기쌍이다. 일부 경우에, 최소 길이는 약 120 염기쌍이다. 일부 경우에, 최소 길이는 약 140 염기쌍이다. 일부 경우에, 무세포 DNA는 최대 길이를 갖는다. 일부 경우에, 최대 길이는 약 180 염기쌍이다. 일부 경우에, 최대 길이는 약 200 염기쌍이다. 일부 경우에, 최대 길이는 약 220 염기쌍이다. 일부 경우에, 최대 길이는 약 240 염기쌍이다. 일부 경우에, 최대 길이는 약 300 염기쌍이다. 크기 기반 분리는 제한된 크기 범위를 갖는 다른 카테고리의 핵산에 유용할 것이며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 마이크로 RNA).
핵산 증폭
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 샘플에서 적어도 하나의 핵산을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 핵산은 무세포 핵산일 수 있다. 샘플은 본원에 개시된 생물학적 샘플 또는 이의 분획 또는 일부일 수 있다. 일부 경우에, 방법은 샘플에서 핵산의 복제본을 생성하는 단계 및 복제본을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 샘플에서 핵산의 역전사체를 생성하는 단계 및 역전사체를 증폭시켜 적어도 하나의 증폭 산물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 전체 게놈 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 전체 게놈 증폭을 수행하는 단계를 포함하지 않는다. 용어 "전체 게놈 증폭"은 생물학적 샘플에서 모든 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 지칭할 수 있다. 용어 "전체 게놈 증폭"은 생물학적 샘플에서 무세포 핵산의 적어도 90%을 증폭시키는 단계를 지칭할 수 있다. 전체 게놈은 다중 게놈을 지칭할 수 있다. 전체 게놈 증폭은 피험체의 생물학적 샘플로부터 무세포 핵산을 증폭시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 생물학적 샘플은 피험체로부터의 무세포 핵산 및 외래 조직을 포함한다. 예를 들어, 전체 게놈 증폭은 피험체(숙주 게놈) 및 피험체에 이식된 기관 또는 조직(공여자 게놈) 둘 다로부터 무세포 핵산을 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 또한 비제한적인 예로서, 전체 게놈 증폭은 임신한 피험체의 생물학적 샘플로부터 무세포 핵산을 증폭시키는 것을 포함할 수 있며, 여기서 생물학적 샘플은 임신한 피험체 및 그녀의 태아로부터의 무세포 핵산을 포함한다. 전체 게놈 증폭은 암을 갖는 피험체의 생물학적 샘플로부터 무세포 핵산을 증폭시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 생물학적 샘플은 피험체의 양성 조직 및 피험체의 종양으로부터의 무세포 핵산을 포함한다. 전체 게놈 증폭은 감염된 피험체의 생물학적 샘플로부터 무세포 핵산을 증폭시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 생물학적 샘플은 피험체 및 병원체로부터 무세포 핵산를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하고, 증폭 단계는 핵산의 등온 증폭을 수행하는 것을 포함한다. 등온 증폭의 비제한적 예는 다음과 같다: 루프 매개 등온 증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 가닥 치환 증폭(SDA: strand displacement amplification), 헬리카제 의존적 증폭(HDA: helicase dependent amplification), 닉킹 효소 증폭 반응(NEAR: nicking enzyme amplification reaction) 및 재조합 효소 폴리머라제 증폭(RPA: recombinase polymerase amplification).
당업계에 공지된 임의의 적절한 핵산 증폭 방법이 본원에 기재된 장치 및 방법에 사용하는 데 고려된다. 일부 경우에, 등온 증폭이 사용된다. 일부 경우에, 등온 증폭이 시작되기 전에 초기 가열 단계를 제외하고 증폭은 등온이다. 각각 다른 고려 사항을 갖고 다른 장점을 제공하는 다수의 등온 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌, 예를 들어 문헌[Zanoli and Spoto, 2013, "Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in Microfluidic Devices, "Biosensors 3: 18-43, and Fakruddin, et al., 2013, "Alternative Methods of Polymerase Chain Reaction (PCR)," Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 5(4): 245-252, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨]에 논의되어 있다. 일부 경우에, 임의의 적절한 등온 증폭 방법이 사용된다. 일부 경우에, 사용된 등온 증폭 방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP); 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: Nucleic Acid Sequence Based Amplification); 다중 치환 증폭(MDA: Multiple Displacement Amplification); 롤링 서클 증폭(RCA: Rolling Circle Amplification); 헬리카제 의존 증폭(HDA); 가닥 치환 증폭(SDA); 닉킹 효소 증폭 반응(NEAR); 래미피케이션 증폭 방법(RAM: Ramification Amplification Method); 및 재조합 효소 폴리머라제 증폭(RPA)으로부터 선택된다.
일부 경우에, 사용된 증폭 방법은 LAMP이다(예를 들어, 문헌[Notomi, et al., 2000, "Loop Mediated Isothermal Amplification" NAR 28(12): e63 i-vii, 및 미국 특허 제6,410,278호, "Process for synthesizing nucleic acid", 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨] 참조). LAMP는 자동 순환 가닥 치환 데옥시리보핵산(DNA) 합성을 사용하는 한 단계 증폭 시스템이다. 일부 경우에, LAMP는 열 안정성 폴리머라제, 예를 들어 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus)(Bst) DNA 폴리머라제 I, 데옥시리보 뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 특정 프라이머 및 표적 DNA 주형의 존재하에 60-65℃에서 45-60분 동안 수행된다. 일부 경우에, 주형은 RNA이고 역전사 효소 활성 및 가닥 치환형 DNA 폴리머라제 활성을 모두 갖는 폴리머라제, 예를 들어 Bca DNA 폴리머라제가 사용되거나, 역전사 효소 활성을 갖는 폴리머라제가 역전사 효소 단계에 사용되고 역전사 효소 활성을 갖지 않는 폴리머라제가 가닥 치환 DNA 합성 단계에 사용된다.
일부 경우에, 증폭 방법은 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)이다. NASBA(3SR 및 전사 매개 증폭으로도 알려짐)는 등온 전사 기반 RNA 증폭 시스템이다. 단일 가닥 RNA를 생성하기 위해 3가지 효소(조류 골수아세포증 바이러스 역전사 효소, RNase H 및 T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라제)가 사용된다. 특정 경우에, NASBA를 사용하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 증폭 반응은 41℃에서 수행되며, 일반적으로 약 60 내지 약 90분 동안 일정한 온도를 유지한다(예를 들어, 문헌[Fakruddin, et al., 2012, "Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Prospects and Applications, " Int. J. of Life Science and Pharma Res. 2(1):L106-L121, 본원에 참고로 포함됨] 참조).
일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃ 내지 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 41℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 최대 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃ 내지 약 41℃, 약 40℃ 내지 약 42℃, 또는 약 41℃ 내지 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃, 약 41℃, 또는 약 42℃에서 수행된다.
일부 경우에, 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(SDA)이다. SDA는 4가지 다른 프라이머를 사용하는 등온 증폭 방법이다. 제한 부위(HincII 엑소뉴클레아제에 대한 인식 서열)를 함유하는 프라이머를 DNA 주형에 어닐링한다. 에쉐리키아 콜라이(Eschericia coli) DNA 폴리머라제 1(엑소-클레노브(exo-Klenow))의 엑소뉴클레아제 결핍 단편은 프라이머를 신장시킨다. 각각의 SDA 사이클은 (1) 치환된 표적 단편에 프라이머 결합, (2) 엑소-클레노브에 의한 프라이머/표적 복합체의 연장, (3) 생성된 헤미포스포티오에이트 HincII 부위의 닉킹, (4) HincII의 닉 부위로부터의 해리 및 (5) 닉의 연장 및 엑소-클레노브에 의한 하류 가닥의 치환으로 이루어진다.
일부 경우에, 방법은 샘플에서 DNA를 헬리카제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 증폭 방법은 헬리카제 의존적 증폭(HDA)이다. HDA는 열 대신 헬리카제를 사용하여 DNA를 변성시키기 때문에 등온 반응이다.
일부 경우에, 증폭 방법은 다중 치환 증폭(MDA)이다. MDA는 전체 게놈을 고 충실도로 증폭시키기 위해 변형된 무작위 프라이머와 함께 박테리오파지 Φ29의 고가공성 및 가닥 치환 DNA 폴리머라제의 사용에 기초한 등온 가닥 치환 방법이다. 매우 적은 양의 출발 물질로부터 샘플의 모든 DNA를 증폭시키기 위해 개발되었다. MDA에서 Φ29 DNA 폴리머라제는 dNTP, 무작위 헥사머 및 변성된 주형 DNA와 함께 30℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션되며 효소는 10분 동안 고온(65℃)에서 불활성화되어야 한다. 반복되는 재순환은 필요하지 않지만, 짧은 초기 변성 단계, 증폭 단계, 및 효소의 최종 불활성화가 필요하다.
일부 경우에, 증폭 방법은 롤링 서클 증폭(RCA)이다. RCA는 단일 온도, 전형적으로 약 30℃에서 109배 초과의 프로브 DNA 서열의 증폭을 허용하는 등온 핵산 증폭 방법이다. 수많은 라운드의 등온 효소 합성은 Φ29 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는데, 이는 원형 DNA 프로브 주위에서 연속적으로 진행함으로써 원형-혼성화된 프라이머를 연장시킨다. 일부 경우에, 증폭 반응은 RCA를 사용하여 약 28℃ 내지 약 32℃에서 수행된다.
본원에 개시된 장치 및 방법에 포함될 수 있는 추가 증폭 방법이 당업계에서 발견될 수 있다. 이상적으로, 증폭 방법은 종래의 PCR에 비해 등온적이고 빠르다. 일부 경우에, 증폭 단계는 하나의 반응 생성물이 동일한 생성물을 생성하는 추가 반응을 촉매한다는 점에서 등온 분자 연쇄 반응인 지수 증폭 반응(EXPAR: exponential amplification reaction)을 수행하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭은 엔도뉴클레아제의 존재하에 일어난다. 엔도뉴클레아제는 닉킹 엔도뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wu et al., "Aligner-Mediated Cleavage of Nucleic Acids, " Chemical Science (2018)]을 참조한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 표적 DNA의 초기 열 변성을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 문헌[Toley et al., "Isothermal strand displacement amplification (iSDA): a rapid and sensitive method of nucleic acid amplification for point-of-care diagnosis, " The Analyst (2015)]을 참조한다. 초고속 증폭 방법에서 펄스 제어 증폭(Pulse controlled amplification)이 GNA Biosolutions GmbH에 의해 개발되었다.
일부 경우에, 방법은 한 쌍의 프라이머로 다중 사이클의 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 증폭 사이클의 수는 증폭이 영역의 표시에 편향을 도입할 수 있기 때문에 중요하다. 입력량이 매우 적으면 증폭이 편향을 일으키기 더 쉬우므로 증폭 전에 효율을 높이는 것이 높은 정확도에 중요하다. 모든 영역이 동일한 효율로 증폭되는 것은 아니므로 전체적인 표시가 균일하지 않아 분석의 정확도에 영향을 줄 수 있다. 증폭이 전혀 필요하지 않을 경우 일반적으로 더 적은 사이클이 이상적이다. 일부 경우에, 방법은 30 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 25 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 20 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 15 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 12 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 11 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 10 사이클 미만의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 3 사이클의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 5 사이클의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 8 사이클의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 10 사이클의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 증폭 반응은 약 30 내지 약 90분 동안 수행된다. 일부 경우에, 증폭 반응은 적어도 약 30분 동안 수행된다. 일부 경우에, 증폭 반응은 최대 약 90분 동안 수행된다. 일부 경우에, 증폭 반응은 약 30분 내지 약 35분, 약 30분 내지 약 40분, 약 30분 내지 약 45분, 약 30분 내지 약 50분, 약 30분 내지 약 55분, 약 30분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 65분, 약 30분 내지 약 70분, 약 30분 내지 약 75분, 약 30분 내지 약 80분, 약 30분 내지 약 90분, 약 35분 내지 약 40분, 약 35분 내지 약 45분, 약 35분 내지 약 50분, 약 35분 내지 약 55분, 약 35분 내지 약 60분, 약 35분 내지 약 65분, 약 35분 내지 약 70분, 약 35분 내지 약 75분, 약 35분 내지 약 80분, 약 35분 내지 약 90분, 약 40분 내지 약 45분, 약 40분 내지 약 50분, 약 40분 내지 약 55분, 약 40분 내지 약 60분, 약 40분 내지 약 65분, 약 40분 내지 약 70분, 약 40분 내지 약 75분, 약 40분 내지 약 80분, 약 40분 내지 약 90분, 약 45분 내지 약 50분, 약 45분 내지 약 55분, 약 45분 내지 약 60분, 약 45분 내지 약 65분, 약 45분 내지 약 70분, 약 45분 내지 약 75분, 약 45분 내지 약 80분, 약 45분 내지 약 90분, 약 50분 내지 약 55분, 약 50분 내지 약 60분, 약 50분 내지 약 65분, 약 50분 내지 약 70분, 약 50분 내지 약 75분, 약 50분 내지 약 80분, 약 50분 내지 약 90분, 약 55분 내지 약 60분, 약 55분 내지 약 65분, 약 55분 내지 약 70분, 약 55분 내지 약 75분, 약 55분 내지 약 80분, 약 55분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 65분, 약 60분 내지 약 70분, 약 60분 내지 약 75분, 약 60분 내지 약 80분, 약 60분 내지 약 90분, 약 65분 내지 약 70분, 약 65분 내지 약 75분, 약 65분 내지 약 80분, 약 65분 내지 약 90분, 약 70분 내지 약 75분, 약 70분 내지 약 80분, 약 70분 내지 약 90분, 약 75분 내지 약 80분, 약 75분 내지 약 90분, 또는 약 80분 내지 약 90 분 동안 수행된다. 일부 경우에, 증폭 반응은 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 또는 약 90분 동안 수행된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 온도에서 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 단일 온도에서 핵산을 증폭시키는 단계(예를 들어, 등온 증폭)를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며, 여기서 증폭은 2개 이하의 온도에서 일어난다. 증폭은 한 단계 또는 여러 단계에서 발생할 수 있다. 증폭 단계의 비제한적 예는 이중 가닥 변성, 프라이머 혼성화 및 프라이머 연장을 포함한다.
일부 경우에, 증폭의 적어도 하나의 단계는 실온에서 발생한다. 일부 경우에, 모든 증폭 단계는 실온에서 발생한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 증폭 단계는 일정 온도 범위에서 발생한다. 일부 경우에, 모든 증폭 단계는 일정 온도 범위에서 발생한다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 25℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 35℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 55℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 65℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 25℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 35℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 55℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 65℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 25℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 35℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -20℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -20℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -20℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -20℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -20℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 20℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 10℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 냉각, 동결 또는 가열을 요구하지 않고 실온에서 수행된다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 본원에 개시된 무세포 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 본원에 개시된 무세포 태아 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 본원에 개시된 태그된 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 복수의 무작위 프라이머로 증폭시키는 단계는 일반적으로 상이한 서열의 다수의 핵산의 비표적화된 증폭 또는 샘플에서 대부분의 핵산의 전체적인 증폭을 초래한다.
일부 경우에, 증폭 단계는 표적화된 증폭(예를 들어, 셀렉터 방법(US6558928호에 기재됨), 분자 역위 프로브)을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 증폭 단계는 핵산을 표적 염색체 서열에 상응하는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 예시적인 염색체 서열이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 증폭 단계는 핵산을 비-표적 염색체 서열에 상응하는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 핵산을 단지 한 쌍의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 본원에 개시된 표적 염색체상의 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 핵산을 여러 세트의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 세트에서 제1 쌍의 각각과 제2 세트에서 한 쌍의 각각은 모두 상이하다.
일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 본원에 개시된 표적 염색체상의 서열에 상응하는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 본원에 개시된 비-표적 염색체상의 서열에 상응하는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 단지 한 쌍의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 프라이머 쌍의 각 프라이머는 본원에 개시된 표적 염색체상의 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 여러 세트의 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 세트에서 제1 쌍의 각각과 제2 세트에서 한 쌍의 각각은 모두 상이하다.
일부 경우에, 증폭 단계는 다중화(하나의 반응에서 복수의 핵산의 핵산 증폭)를 포함한다. 일부 경우에, 다중화는 생물학적 샘플의 핵산을 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 다중화는 제1 핵산 및 제2 핵산을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 핵산은 제1 서열에 상응하고 제2 핵산은 제2 서열에 상응한다. 일부 경우에, 제1 서열과 제2 서열은 동일하다. 일부 경우에, 제1 서열과 제2 서열은 상이하다. 일부 경우에, 증폭 단계는 다중화를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 증폭 단계는 다중화가 필요하지 않다. 일부 경우에, 증폭은 네스티드(nested) 프라이머 증폭을 포함한다. 방법은 다중 영역의 다중 PCR을 포함할 수 있으며, 여기서 각 영역은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)을 포함한다. 다중화는 단일 튜브에서 발생할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 100개 초과의 영역의 다중 PCR을 포함하며, 여기서 각 영역은 SNP를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 500개 초과의 영역의 다중 PCR을 포함하며, 여기서 각 영역은 SNP를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 1000개 초과의 영역의 다중 PCR을 포함하며, 여기서 각 영역은 SNP를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 2000개 초과의 영역의 다중 PCR을 포함하며, 여기서 각 영역은 SNP를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 300개 초과의 영역의 다중 PCR을 포함하며, 여기서 각 영역은 SNP를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 샘플에서 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며, 여기서 증폭 단계는 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 샘플과 접촉할 때까지 활성 또는 연장성이 없다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 선택된 온도에 노출될 때까지 활성 또는 연장성이 없다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 활성화 시약과 접촉될 때까지 활성 또는 연장성이 없다. 비제한적인 예로서, 적어도 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 차단 기를 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하면 프라이머 이량체를 최소화하고, 사용되지 않는 프라이머를 인식할 수 있으며, 사용하지 않는 프라이머로 인한 거짓 결과를 피할 수 있다. 일부 경우에, 증폭 단계는 샘플을 본원에 개시된 표적 염색체상의 서열에 상응하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 태그의 사용을 포함한다. 하나 이상의 태그의 사용은 본원에 개시된 방법의 효율, 속도 및 정확도 중 적어도 하나를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 태그를 포함하며, 여기서 태그는 표적 서열에 특이적이지 않다. 이러한 태그는 범용 태그라고 할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 표적 서열에 특이적이지 않은 태그로 샘플 내 표적 서열 또는 이의 단편을 태그하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 태그는 인간 염색체의 서열에 특이적이지 않다. 대안적으로 또는 추가로, 방법은 샘플을 태그 및 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 태그는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 별개이다. 일부 경우에, 태그는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표적 서열에 혼성화한 후 올리고뉴클레오티드 프라이머의 연장에 의해 생성된 증폭 산물에 혼입된다. 태그는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 또는 펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 태그는 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 태그는 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 태그는 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 태그는 펩티드를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 태그는 서열 특이적이다. 일부 경우에, 태그는 임의의 특정 표적 서열에 상응하지 않는 일반적인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 태그는 증폭된 서열에 상관없이 증폭 산물이 생성될 때 검출될 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 태그 중 적어도 하나는 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid)을 포함한다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 태그 중 적어도 하나는 잠금 핵산(LNA: locked nucleic acid)을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 복수의 태그의 사용을 포함하여, 방법의 정확도, 방법의 속도 및 방법에 의해 얻어진 정보 중 적어도 하나를 증가시킨다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 복수의 태그를 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 필요한 샘플의 용량을 줄인다. 일부 경우에, 복수의 태그는 적어도 하나의 포획 태그를 포함한다. 일부 경우에, 복수의 태그는 적어도 하나의 검출 태그를 포함한다. 일부 경우에, 복수의 태그는 적어도 하나의 포획 태그와 적어도 하나의 검출 태그의 조합을 포함한다. 포획 태그는 일반적으로 특정 서열 또는 영역을 다른 영역으로부터 단리하거나 분리하는 데 사용된다. 포획 태그의 전형적인 예는 비오틴(예를 들어 스트렙타비딘 코팅된 표면을 사용하여 포획될 수 있음)이다. 검출 태그의 예는 디곡시게닌 및 형광 태그이다. 검출 태그는 직접적으로(예를 들어, 레이저 조사 및/또는 방출된 광 측정) 검출될 수 있거나 발광 분석 또는 효소 분석과 같은 이차 검출 시스템을 보유하거나 이와 상호 작용하는 항체를 통해 간접적으로 검출될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 태그는 적어도 하나의 포획 태그(분석물을 단리하는데 사용되는 태그)와 적어도 하나의 검출 태그(분석물을 검출하는데 사용되는 태그)의 조합을 포함한다. 일부 경우에는 단일 태그가 검출 태그 및 포획 태그 역할을 한다.
일부 경우에, 방법은 샘플에서 적어도 하나의 순환하는 무세포 핵산을 제1 태그 및 제2 태그와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 태그는 순환하는 무세포 핵산의 센스 가닥에 상보적인 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제2 포획 태그는 순환하는 무세포 핵산의 안티센스 가닥에 상보적인 제2 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 샘플에서 적어도 하나의 순환하는 무세포 핵산을 제1 태그 및 제2 태그와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 태그는 제2 태그와 동일한 표지를 보유한다. 일부 경우에, 방법은 샘플에서 적어도 하나의 순환하는 무세포 핵산을 제1 태그 및 제2 태그와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 태그는 제2 태그와 상이한 표지를 보유한다. 일부 경우에, 태그는 동일하며 검출된 모든 프로브/영역의 응집체인 단일의 정성적 또는 정량적 신호가 있다. 일부 경우에, 태그는 상이하다. 하나의 태그는 정제에 사용될 수 있고 하나의 태그는 검출에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 제1 올리고뉴클레오티드 태그는 영역(예를 들어, cfDNA 단편)에 특이적이고 형광 표지를 보유하고, 제2 올리고뉴클레오티드는 인접 영역에 특이적이고 동일한 형광 표지를 보유하는데, 그 이유는 응집 신호만이 요구되기 때문이다. 다른 경우에, 제1 올리고뉴클레오타이드 태그는 영역(예를 들어, cfDNA 단편)에 특이적이며, 형광 표지를 보유하고, 제2 올리고뉴클레오티드는 인접 영역에 특이적이며 상이한 형광 표지를 보유하여 2개의 별개의 영역을 검출한다.
일부 경우에, 방법은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 증폭 산물은 본원에 개시된 표적 염색체의 적어도 일부, 또는 그의 단편을 증폭함으로써 생성된다. 표적 염색체의 일부 또는 단편은 적어도 5 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 염색체의 일부 또는 단편은 적어도 약 10 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 염색체의 일부 또는 단편은 적어도 약 15 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 증폭 산물을 검출하는 단계는 증폭 산물을 태그 또는 표지하는 것을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 방법은 증폭 산물을 그 양에 기초하여 검출한다. 예를 들어, 상기 방법은 샘플에서 이중 가닥 DNA의 양의 증가를 검출할 수 있다. 일부 경우에, 증폭 산물을 검출하는 단계는 그 크기에 적어도 부분적으로 기초한다. 일부 경우에, 증폭 산물은 약 50 염기쌍 내지 약 500 염기쌍의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 증폭 산물을 검출하는 단계는 증폭 산물을 태그와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 태그는 증폭 산물의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우에, 태그는 증폭 산물의 서열에 상보적인 서열을 포함하지 않는다. 태그의 비제한적인 예는 상기 및 하기 개시에 기재되어 있다.
일부 경우에, 태그되거나 태그되지 않은 증폭 산물을 검출하는 단계는 증폭 산물을 본원에 개시된 장치, 시스템, 또는 키트의 신호 검출기 또는 분석 어셈블리에 적용하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 본원에 개시된 장치, 시스템, 또는 키트의 분석 어셈블리에서 증폭 및 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 분석 어셈블리는 증폭 시약을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 측방 유동 분석을 통한 생물학적 샘플, 용액, 또는 이들의 조합의 유동을 제어하기 위해 본원에 개시된 분석 어셈블리(예를 들어, 측방 유동 분석)에 기기 또는 시약을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 기기는 진공, 피펫, 펌프, 또는 이들의 조합이다.
서열 분석
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 핵산 서열 분석 단계를 포함한다. 핵산은 본원에 개시된 핵산, 예컨대 태그된 핵산, 증폭된 핵산, 무세포 핵산, 무세포 태아 핵산, 표적 염색체에 상응하는 서열, 표적 염색체의 영역에 상응하는 서열을 갖는 핵산, 비-표적 염색체에 상응하는 서열을 갖는 핵산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 DNA이다. 일부 경우에, 핵산은 RNA이다. 일부 경우에, 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 RNA를 포함한다.
일부 경우에, 서열 분석은 표적화된 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 전체 게놈 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 표적화된 서열 분석 및 전체 게놈 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 전체 게놈 서열 분석은 당업계에서 차세대 서열 분석 또는 2세대 서열 분석이라고도 하는 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 전체 게놈 서열 분석은 무작위 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석은 전체 게놈 라이브러리로부터 포획된 표적 영역의 무작위 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다.
일부 경우에, 방법은 본원에 개시된 증폭된 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 증폭된 핵산은 표적화된 증폭에 의해(예를 들어, 관심의 표적 서열에 특이적인 프라이머 이용) 생성된다. 일부 경우에, 증폭된 핵산은 비-표적화된 증폭에 의해 (예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머 이용) 생성된다. 일부 경우에, 방법은 증폭된 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함하며, 서열 분석은 대규모 병렬 서열 분석을 포함한다.
일부 경우에, 방법은 알고리즘을 사용하여 게놈 서열 정렬을 수행하는 단계를 포함한다. 비제한적인 예로서, 알고리즘은 염색체 복제본 수를 인식하도록 설계될 수 있다. 알고리즘은 다양한 SNP 유전자 좌에서 각각의 관련 대립 유전자와 관련된 관찰된 수의 서열 리드를 나타내도록 설계될 수 있다. 알고리즘은 부모 유전자형 및 교차 빈도 데이터를 사용하여 인 실리코로 측정된 유전자 좌에서 일염색체, 이염색체 및 삼염색체 태아 유전자형을 생성할 수 있으며, 이는 이후 각 유전자형에 대한 서열 분석 데이터를 예측하는 데 사용된다. 베이지안 모델을 사용하여, 복제본 수 및 태아 분율로서 최대 우도를 갖는 서열 분석 데이터를 선택하는데 우도는 계산된 정확도이다. 각각의 SNP에 대해 2개의 가능한 대립 유전자 각각에 대해 상이한 확률 분포를 예상하고 관찰된 대립 유전자를 비교할 수 있다. 이것은 문헌[Zimmermann et al., Prenat Diagn (2012) 32:1233-1241]에 기술되어 있다. 그러나 연구자들[Zimmermann et al.]은 4.0% 미만의 태아 분율을 함유하는 샘플이 유익하지 않을 수 있으며, 이러한 유형의 분석을 수행하기에 충분한 무세포 DNA를 얻기 위해서는 적어도 20 ml의 혈액이 필요하다고 믿었다. 대조적으로, 본 출원의 방법은 4% 미만의 태아 분율을 갖는 샘플 및 거의 많은 샘플로서 거의 필요로 하지 않는 샘플에 대해 이 분석을 이용할 수 있다.
라이브러리 제조
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플에서 무세포 핵산을 변형시켜 검출을 위한 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 핵산 서열 분석을 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 검출을 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 검출은 핵산 서열 분석을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 방법은 검출을 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 검출은 태그 검출의 발생에 기초하여 태그된 무세포 핵산을 카운팅하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플에서 무세포 핵산을 변형시켜 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 방법은 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 변형 단계는 증폭 단계 전에 일어난다. 일부 경우에, 변형 단계는 증폭 단계 후에 일어난다.
일부 경우에, 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 핵산의 단편인 무세포 핵산의 말단을 수복하는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 말단 수복 단계는 무세포 핵산에 5' 포스페이트 기, 3' 히드록시 기, 또는 이들의 조합을 수복하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 수복 단계는 5' 인산화, A 테일링, 갭 충전, 닉 부위 폐쇄 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 수복 단계는 돌출부를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 수복은 상보적 뉴클레오티드로 돌출부를 충전하는 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 라이브러리를 제조하기 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 어댑터의 사용을 포함한다. 어댑터는 또한 본원에서 서열 분석 어댑터로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 어댑터는 서열 분석을 돕는다. 일반적으로, 어댑터는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 비제한적인 예로서, 어댑터는 증폭, 정제, 및 서열 분석과 같은 방법에서 다른 단계를 단순화할 수 있는데, 변형 후 샘플에서 다수의 (모두는 아니더라도) 무세포 핵산에 보편적인 서열이기 때문이다. 일부 경우에, 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 무세포 핵산에 어댑터를 결찰시키는 것을 포함한다. 결찰 단계는 무딘 결찰을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 어댑터를 핵산에 혼성화하는 것을 포함한다.
라이브러리 제조 단계(예를 들어, 말단 수복, 테일링, 및 어댑터의 결찰) 및 증폭 단계의 효율은 샘플에 크라우딩제를 첨가하거나 증폭 반응을 함으로써 이점을 얻을 수 있다. 자연환경에서 효소 공정(예를 들어, 세포의 DNA 복제)은 종종 과밀한 환경에서 발생한다. 이러한 효소 공정 중 일부는 과밀한 환경에서 더 효율적이다. 예를 들어, 과밀한 환경은 DNA 헬리카제의 활성 및 DNA 폴리머라제의 민감성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 과밀한 환경을 모방하기 위해 크라우딩제를 첨가할 수 있다. 크라우딩제는 중합체일 수 있다. 크라우딩제는 단백질일 수 있다. 크라우딩제는 다당류일 수 있다. 크라우딩제의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 및 피콜이다. 생체 내에서 과밀한 상태를 모방하는 농도가 종종 바람직하다. 예를 들어, 4%(40 mg/ml) PEG 1 kDa는 생체 내에서 발견되는 대략적인 과밀 효과를 제공한다. 일부 경우에, 크라우딩제의 농도는 증폭 반응에서 약 2% 내지 약 20% w/v이다. 일부 경우에, 크라우딩제의 농도는 증폭 반응에서 약 2% 내지 약 15% w/v이다. 일부 경우에, 크라우딩제의 농도는 증폭 반응에서 약 2% 내지 약 10% w/v이다. 일부 경우에, 크라우딩제의 농도는 증폭 반응에서 약 2% 내지 약 8% w/v이다. 일부 경우에, 크라우딩제의 농도는 증폭 반응에서 약 3% 내지 약 6% w/v이다.
일부 경우에, 라이브러리를 제조하기 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 태그의 사용을 포함한다. 태그는 본원에서 바코드로 지칭될 수도 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 관심의 염색체 영역에 상응하는 태그로 무세포 핵산을 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 관심이 없는 염색체 영역에 특이적인 태그로 무세포 핵산을 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 관심의 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 제1 태그로 상응하는 무세포 핵산의 적어도 제1 부분을 변형시키고 관심이 없는 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 제2 태그로 무세포 핵산의 제2 부분을 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 무세포 핵산에 태그를 결찰시키는 것을 포함한다. 결찰 단계는 무딘 결찰을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 태그를 핵산에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 태그는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 태그는 핵산 분석 이외의 수단에 의해 검출될 수 있는 비-올리고뉴클레오티드 마커 또는 표지를 포함한다. 비제한적인 예로서, 비-올리고뉴클레오티드 마커 또는 표지는 형광 분자, 나노 입자, 염료, 펩티드, 또는 다른 검출 가능한/정량 가능한 소분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 라이브러리를 제조하기 위해 무세포 핵산을 변형시키는 단계는 본원에서 간단히 인덱스라고도 하는 샘플 인덱스의 사용을 포함한다. 비제한적인 예로서, 인덱스는는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 나노 입자, 펩티드, 형광 분자, 염료, 또는 다른 검출 가능한/정량 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제1 생물학적 샘플로부터의 제1 무세포 핵산 그룹은 제1 인덱스로 표지되고, 제1 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산의 제1 그룹은 제2 인덱스로 표지되며, 여기서 제1 인덱스와 제2 인덱스는 상이하다. 따라서, 다수의 인덱스는 다수의 샘플이 한 번에 분석될 때 무세포 핵산을 다수의 샘플과 구별할 수 있게 한다. 일부 경우에, 방법은 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 개시하며, 여기서 무세포 핵산을 증폭시키는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인덱스를 포함한다.
DNA 단리 및 분석의 모든 단계에서 DNA 손실이 발생할 수 있지만, 가장 큰 손실은 전형적으로 라이브러리 제조 단계에서 나타난다. 종래의 방법은 물질의 80% 내지 90%의 손실을 나타낸다. 종종 이러한 손실은 후속 증폭 단계에 의해 보상되어 DNA의 농도를 차세대 서열 분석에 필요한 수준까지 올릴 수 있지만, 증폭은 이전 단계에서 발생한 정보의 손실을 보상할 수 없다. 샘플에서 초기 DNA의 80%의 손실을 겪는 라이브러리는 20%의 효율 또는 0.2의 효율을 갖는 라이브러리로서 기술될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 0.2, 적어도 약 0.3, 적어도 약 0.4, 적어도 약 0.5, 적어도 약 0.6 또는 적어도 약 0.8의 효율로 라이브러리를 달성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 0.4의 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 0.5의 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 이러한 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 방법은 본원에 기술된 바와 같이 크라우딩제의 사용, 무세포 DNA 단편 말단 수복, 결찰 방법, 정제 방법, 사이클링 파라미터 및 화학량론적 비율에 의해 이러한 효율을 달성할 수 있다.
유전 정보의 검출
일반적으로, 본원에 개시된 방법은 바이오 마커, 분석물 또는 그의 변형된 형태를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 무세포 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 핵산의 태그를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 핵산의 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 방법은 비-핵산 성분을 검출하는 단계를 포함한다. 비제한적인 예로서, 비-핵산 성분은 단백질, 펩티드, 지질, 지방산, 스테롤, 인지질, 탄수화물, 바이러스 성분, 미생물 성분, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 바이러스 성분 또는 미생물 성분일 경우에, 방법은 검출 전에 바이러스 또는 박테리아로부터 핵산을 방출, 정제, 및/또는 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
검출 단계는 관심 핵산을 서열 분석하는 것을 포함할 수 있다. 검출 단계는 관심의 핵산 상의 태그를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출 단계는 관심 바이오 마커 상의 태그를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 바이오 마커는 후성 유전적 변형일 수 있다. 바이오 마커는 후성 유전적 프로파일(복수의 후성 유전적 변형)일 수 있다. 바이오 마커는 후생 유전적으로 변형된 핵산일 수 있다. 검출 단계는 비술파이트 서열 분석을 포함할 수 있다. 검출 단계는 염색질 면역 침전(ChIP) 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 검출 단계는 관심의 바이오 마커 상의 태그를 서열 분석하는 것을 포함할 수 있다.
검출 단계는 본원에 기술된 바와 같이 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들어, 증폭 단계는 표적 분석물의 존재 또는 부재에 기초하여 신호가 생성되는 qPCR을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 증폭 단계는 PCR을 포함한다. 일부 경우에, 증폭 단계는 PCR을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 증폭 단계는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함한다. 일부 경우에, cfDNA는 cfDNA에 혼성화하도록 설계된 DNA 리가아제 및 프로브와 접촉된다. 일부 경우에, cfDNA는 먼저 절단되어(예를 들어, 제한 효소 처리되어) cfDNA 단편을 생성하고 cfDNA 단편은 리가아제 및 프로브와 접촉된다. 리가아제는 프로브로 표지된 원형 cfDNA를 생성한다. 임의로 골격 올리고는 cfDNA 또는 cfDNA 단편을 원형화하는 데 사용된다. 이들 원형화된 단편은 RCA에 의해 복제되어 연쇄체(concatamer)를 생성한다. 프로브는 검출 가능한 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 형광)로 인식되고 영상화될 수 있다.
방법은 생물학적 샘플의 핵산에서 유전적 돌연변이를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 핵산에서 복수의 유전적 돌연변이를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 복수의 핵산 각각에서 유전적 돌연변이를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 복수의 핵산에서 복수의 유전적 돌연변이를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 생물학적 샘플의 핵산의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 후성 유전적 변형을 검출하는 단계는 비술파이트 서열 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 후성 유전적 변형을 검출하는 단계는 염색질 면역 침전(ChIP) 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 후성 유전적 변형은 유전될 수 있는 변형이다. 일부 경우에, 후성 유전적 변형은 세포가 하나 이상의 환경 자극에 반응하여 전사에 영향을 줄 수 있는 변경이다. 비제한적인 예로서, 후성 유전적 변형은 시토신 또는 아데닌 잔기의 메틸화일 수 있다. 일부 경우에, 후성 유전적 변형은 메틸기의 부재이다. 일반적으로 메틸화는 유전자의 침묵을 촉진한다. 후성 유전적 변형은 또한 히스톤의 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화 및 인산화를 포함한다. 후성 유전적 변형은 생물학적 과정(예를 들어, 면역 반응, 세포 증식)을 촉진, 억제, 방지 또는 감소시킬 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 핵산의 복수의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 복수의 핵산 각각의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 샘플의 복수의 핵산의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검사 샘플과 대조/참조 샘플 사이의 차등적으로 메틸화된 영역을 식별하기 위해 후성 유전적 변형의 게놈 전체 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 조직에 특이적인 하나 이상의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조직은 무세포 핵산의 기원을 추적하는데 사용될 수 있는 특징적인 메틸화 프로파일을 갖는다. 이는 무세포 핵산이 어디서 유래했는지를 결정하는데 유용할 수 있다. 비제한적인 예로서, 후성 유전적 변형은 뇌에 특이적일 수 있으며 그 후성 유전적 변형을 보유하는 무세포 핵산은 신경 퇴행성 질환 또는 뇌종양을 나타낼 수 있다. 방법은 이러한 무세포 핵산이 검출되는 경우 조직의 검사, 생검, 영상화, 또는 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 단지 2개의 조직에 특이적인 하나 이상의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 3개 미만의 조직에 특이적인 하나 이상의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 5개 미만의 조직에 특이적인 하나 이상의 후성 유전적 변형을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 핵산 또는 비-핵산 성분의 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 핵산 또는 비-핵산 성분에 결합하는 결합 모이어티(예를 들어, 소분자, 펩티드, 앱타머, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편)의 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 검출 가능한 표지 또는 신호는 형광 분자, 생물 발광 분자, 발광 분자, 방사성 신호, 자기 신호, 전기 신호, 또는 염료일 수 있다. 예를 들어, 방법은 결합 모이어티와 관심의 단백질 사이의 상호 작용을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 검출 단계는 IPCR 또는 PLA를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
검출 단계는 검사 결과가 디스플레이되는 본원에 개시된 장치 또는 시스템의 인터페이스를 보는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, [도 4] 및 [도 5a-e]를 참조한다. 검출 단계는 측방 유동 장치상에서 컬러 외관 또는 형광 신호를 보는 것을 포함할 수 있다. 검출 단계는 본원에 개시된 장치에서 검사 결과를 수신하는 것을 포함할 수 있다. 검출 단계는 본원에 개시된 시스템의 장치와 통신하는 모바일 장치, 컴퓨터, 노트패드, 또는 다른 전자 장치에서 검사 결과를 수신하는 것을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 방법, 키트, 시스템 및 장치는 짧은 시간 내에 유전 정보를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 1분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 2분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 5분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 10분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 15분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 20분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 30분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 45분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 60분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 90분 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 방법은 약 2시간 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 3시간 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 약 4시간 내에 수행될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 최소한의 기술 훈련이 필요하다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 어떠한 기술 훈련도 필요하지 않다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 방법을 수행하는 개인이 샘플 및 용액을 옮기고 혼합하는 간단한 프로토콜을 따를 것만을 요구한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 기술자 또는 의료 제공자의 도움 없이 임신한 피험체가 자신의 가정에서 사용할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 의료 교육이나 기술 훈련이 없는 사용자가 수행할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법, 키트, 시스템 및 장치는 간단하게 사용자가 생물학적 샘플을 시스템 또는 장치에 추가하고 유전 정보를 얻기 위해 결과를 볼 것을 요구한다.
방법은 검출에 기초하여 질환 또는 병태의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 질환 또는 병태의 위험을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 질환 또는 병태의 상태를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 질환 또는 상태의 상태를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 요법을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 대상에게 투여되는 약물의 용량을 수정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 검출에 기초하여 요법에 대한 피험체의 반응을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 질환은 암일 수 있고 요법은 화학 요법일 수 있다. 다른 암 치료법에는 항체, 항체-약물 컨쥬게이트, 안티센스 분자, 조작된 T 세포, 및 방사선이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 방법은 검출에 기초하여 피험체를 추가로 검사하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 질환은 암일 수 있고, 추가의 검사 단계는 영상화(예를 들어, CAT-SCAN, PET-SCAN) 및 생검 수행을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 서열 분석 리드의 양이 본원에 개시된 샘플에서 검출될 때 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 양은 본원에 기재된 바와 같이 인간 집단에서 이수성을 나타내는 것으로 공지된 염색체 또는 염색체 영역으로부터의 서열에 상응한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이하기 때문에, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이하지 않기 때문에, 적어도 하나의 표적 염색체의 태아의 이수성이 존재하지 않음을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드는 적어도 하나의 표적 염색체의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체에 해당하는 서열 분석 리드는 비-표적 염색체의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드를 포함한다. 일부 경우에, 염색체 영역은 적어도 약 10 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 염색체 영역은 적어도 약 20 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 염색체 영역은 적어도 약 50 염기쌍 길이이다.
일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13, 염색체 18, 및 염색체 21 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13, 염색체 18, 염색체 21, 및 염색체 X 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13, 염색체 18, 염색체 21, 및 염색체 Y 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 X, 및 염색체 Y 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 16이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 18이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 21이다. 일부 경우에, 표적 염색체는 염색체 22이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 성 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 X이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 Y이다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 이외의 염색체 중 적어도 하나이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y가 아니다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 1, 염색체 2, 염색체 3, 염색체 4, 염색체 5, 염색체 6, 염색체 7, 염색체 8, 염색체 9, 염색체 10, 염색체 11, 염색체 12, 염색체 14, 염색체 15, 염색체 17, 염색체 19, 및 염색체 20으로부터 선택된다. 일부 경우에, 비-표적 염색체는 염색체 1이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 2이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 3이다. 일부 경우에, 비-표적 염색체는 염색체 4이더. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 5이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 6이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 7이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 8이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 9이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 10. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 11이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 12이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 14이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 15이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 17이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 19이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 20이다.
일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 13이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 13 이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 16이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 16 이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 18이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 18 이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 21이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 21 이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 22이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체 22이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 X이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 X 이외의 염색체이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 염색체는 염색체 Y이고, 적어도 하나의 비-표적 염색체는 염색체 Y 이외의 염색체이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 임신한 피험체의 태아가 유전적 이상을 갖는 것을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 표적 염색체 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입에 기인한 것이다. 일부 경우에, 유전적 이상은 표적 염색체 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실에 기인한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 제1 표적 염색체 영역과 제2 염색체 표적 영역 사이의 뉴클레오티드의 전위로 인한 것이다. 일반적으로, 제1 표적 염색체 영역 및 제2 염색체 표적 영역은 상이한 염색체상에 위치한다.
일부 경우에, 표적 염색체 영역은 최소 길이로 정의된다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 50 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 100 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 200 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 300 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 500 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 적어도 약 1000 염기쌍 길이이다.
일부 경우에, 표적 염색체 영역은 최대 길이로 정의된다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 100,000 염기쌍만큼 길다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 500,000 염기쌍만큼 길다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 1,000,000 염기쌍만큼 길다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 10,000,000 염기쌍만큼 길다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 100,000,000 염기쌍만큼 길다. 일부 경우에, 표적 염색체 영역은 약 200,000,000 염기쌍만큼 길다.
일부 경우에, 유전적 이상은 복제본 수 변이이다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체에서 유전자의 결실을 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체상의 유전자의 중복을 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체상의 유전자의 삼중 중복을 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 3개 초과의 유전자 복제본을 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체상의 비-단백질 코딩 서열의 중복을 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체상의 비-코딩 영역의 삼중 복제를 포함한다. 일부 경우에, 복제본 수 변이는 적어도 하나의 염색체상의 비-코딩 영역의 중복을 포함한다.
일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.001%가 중복되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.01%가 중복되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.1%가 중복되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 1%가 중복되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 10%가 중복되게 한다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 20%가 중복된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 약 30% 이상이 중복된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 50%가 중복된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 70%가 중복된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 90%가 중복된다. 일부 경우에, 전체 염색체 아암이 중복된다.
일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.001%가 결실되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.01%가 결실되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 0.1%가 결실되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 1%가 결실되게 한다. 일부 경우에, 유전적 이상은 염색체 아암의 적어도 약 10%가 결실되게 한다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 20%가 결실된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 30%가 결실된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 50%가 결실된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 70%가 결실된다. 일부 경우에, 염색체 아암의 적어도 약 90%가 결실된다. 일부 경우에, 전체 염색체 아암이 결실된다.
일부 경우에, 방법은 표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 양이 검출되고, 여기서, 그 양이 유전적 이상을 나타낼 경우, 태아가 유전적 이상을 가짐을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 핵산이다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 태아 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 태아 핵산이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 최소량의 서열 분석 리드를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 100이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 1000이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 2000이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 3000이다. 일부 경우 서열 분석 리드의 최소량은 약 4000이다. 일부 경우 서열 분석 리드의 최소량은 약 5000이다. 일부 경우 서열 분석 리드의 최소량은 약 6000이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 7000이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 8000이다. 일부 경우에, 서열 분석 리드의 최소량은 약 9000이다. 어떤 경우에는 서열 분석 리드의 최소량 약 10,000이다.
일부 경우에, 방법은 (1) 표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 (2) 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 유전적 이상을 갖지 않은 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 태아가 유전적 이상을 가짐을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (1) 표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 (2) 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 유전적 이상을 갖지 않은 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이하기 때문에, 태아가 유전적 이상을 가짐을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (1) 표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 (2) 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 유전적 이상을 갖지 않은 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이하지 않을 때, 태아가 유전적 이상을 갖지 않음을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 염색체 영역과 비-표적 염색체 영역이 동일한 염색체상에 있다. 일부 경우에, 염색체 영역과 비-표적 염색체 영역은 상이한 염색체상에 있다.
일부 경우에, 유전 정보는 특정한 정도의 정확도로 검출된다. 유전 정보의 비제한적인 예에는 태아의 이수성, 유전적 이상, 종양 DNA의 존재/양, 및 이식된 기관/조직 DNA의 존재/양이 포함된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 95% 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 96% 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 97% 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 98% 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 99% 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 99.5%의 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 99.9%의 정확도로 검출된다. 일부 경우에, 유전 정보는 적어도 약 99.99%의 정확도로 검출된다.
각 염색체로부터의 리드는 염색체의 길이에 따라 대략적으로 표시된다. 대부분의 리드는 염색체 1에서 얻는 반면, 오토솜으로부터의 가장 적은 리드는 염색체 21에서 유래할 것이다. 삼염색체 샘플을 검출하는 일반적인 방법은 정배수체 샘플 집단에서 염색체로부터 유래하는 리드의 백분율을 측정하는 것이다. 다음으로, 이 세트의 염색체 백분율 값에 대한 평균 및 표준 편차를 계산한다. 컷오프 값은 평균에 3 표준 편차를 더하여 결정한다. 새로운 샘플이 컷오프 값보다 높은 염색체 백분율 값을 갖는 경우, 그 염색체의 과다 표시가 가정될 수 있으며, 이는 종종 염색체의 삼염색체와 일치한다. 염색체의 과다 표시를 검출하는 예언적 실시예가 실시예 13에 제시되어 있다.
일부 경우에, 태아의 이수성은 (1) 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드 대 (2) 적어도 하나의 비-표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 적어도 약 0.1% 상이할 때 검출된다. 일부 경우에, 비율은 적어도 1% 상이하다.
일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 정배수체 임신한 피험체이다. 일부 경우에, 대조군은 임신한 피험체 그룹으로부터의 평균값 또는 중앙값이다. 일부 경우에, 대조군은 임신한 피험체로부터의 혈장 샘플 풀로부터의 평균값 또는 중앙값이다. 일부 경우에, 대조군은 정배수체 태아를 가진 임신한 피험체를 모방한 인공 핵산 혼합물로부터 유사하게 수득된 값이다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 정배수체 염색체 세트를 갖는 태아를 임신 중인 정배수체 임신한 피험체이다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 유전자 이상, 예를 들어 복제본 수 변이를 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체가 임신한 태아는 유전적 이상, 예를 들어 복제본 수 변이를 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체는 본원에 개시된 표적 염색체에서 유전적 이상을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체가 임신한 태아는 본원에 개시된 표적 염색체에서 유전적 이상을 갖지 않는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 그녀의 태아 중 적어도 하나는 이수성을 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 그녀의 태아 중 적어도 하나는 본원에 개시된 유전적 이상을 갖는다. 일부 경우에, 대조군 임신 피험체 및 그녀의 태아 중 적어도 하나는 본원에 개시된 표적 염색체에서 유전적 이상을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 대조군 임신 집단으로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 비율은 대조군 임신 집단에서의 각각의 평균 비율로부터의 유래한다. 일부 경우에, 각각의 비율은 대조군 임신 집단에서의 각각의 중간값 비율로부터 유래한다.
일부 경우에, 여기에 개시된 방법은 하기 장치, 시스템 및 키트를 사용한다.
시스템 및 키트
본원에 개시된 일부 측면에서, 생물학적 샘플로부터 유전 정보를 얻기 위한 장치, 시스템 및 키트가 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 사용자가 샘플에서 표적 분석물의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 선택된 위치에서 생물학적 샘플을 수집하고 검사할 수 있게 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 전술한 방법에 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 피험체의 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 성분(예를 들어, 세포, 세포 단편, 단백질)를 제거하는 샘플 정제기; 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 핵산을 서열 분석하기 위한 핵산 서열 분석기; 및 서열 정보를 장치, 시스템 또는 키트의 사용자에게 전달하기 위한 핵산 서열 출력을 포함한다.
일반적으로, 본 개시 내용의 장치, 시스템 및 키트는 다수의 기능, 예를 들어 표적 분석물(예를 들어, 증폭 산물을 포함)의 정제, 증폭, 및 검출, 및 이들의 조합을 통합한다. 일부 경우에, 다중 기능은 단일 분석 어셈블리 유닛 또는 단일 장치에 수용된다. 일부 경우에, 모든 기능은 단일 유닛 또는 장치의 외부에서 발생한다. 일부 경우에, 기능 중 적어도 하나는 단일 유닛 또는 장치의 외부에서 발생한다. 일부 경우에, 기능 중 하나만이 단일 유닛 또는 장치의 외부에서 발생한다. 일부 경우에, 샘플 정제기, 핵산 증폭 시약, 올리고뉴클레오티드, 및 검출 시약 또는 구성 요소는 단일 장치에 수용된다. 일반적으로, 본 발명의 장치, 시스템, 및 키트는 생물학적 샘플에 관한 정보를 하나 이상의 사람들에게 전달하기 위해 디스플레이, 디스플레이에 대한 연결, 또는 디스플레이와의 통신을 포함한다.
일부 경우에, 장치, 시스템 및 키트는 본원에 개시된 추가 구성 요소를 포함한다. 추가 구성 요소의 비제한적인 예에는 샘플 운반 구획, 샘플 보관 구획, 샘플 및/또는 시약 용기, 온도 표시기, 전자 포트, 통신 연결, 통신 장치, 샘플 수집 장치, 및 하우징 유닛이 포함된다. 일부 경우에, 추가 구성 요소가 장치와 통합된다. 일부 경우에, 추가 구성 요소가 장치와 통합되지 않는다. 일부 경우에, 추가 구성 요소는 단일 장치에 샘플 정제기, 핵산 증폭 시약, 올리고뉴클레오티드, 및 검출 시약 또는 성분과 함께 수용된다. 일부 경우에, 추가 구성 요소가 단일 장치 내에 포함되지 않는다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플을 얻고, 무세포 핵산을 추출하고, 무세포 핵산을 정제하기 위한 구성 요소를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플을 얻고, 무세포 핵산을 추출하고, 무세포 핵산을 정제하고, 무세포 핵산의 라이브러리를 제조하기 위한 구성 요소를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플을 얻고, 무세포 핵산을 추출하고, 무세포 핵산을 정제하고, 무세포 핵산을 서열 분석하기 위한 구성 요소를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플을 얻고, 무세포 핵산을 추출하고, 무세포 핵산을 정제하고, 무세포 핵산의 라이브러리를 제조하고, 무세포 핵산을 서열 분석하기 위한 구성 요소를 포함한다. 비제한적인 예로서, 샘플을 얻기 위한 구성 요소는 경피 천자 장치 및 혈액으로부터 혈장을 얻기 위한 필터이다. 또한, 비제한적인 예로서, 무세포 핵산을 추출 및 정제하기 위한 구성 요소는 완충액, 비드 및 자석을 포함한다. 완충액, 비드 및 자석은 손가락 찌름(예를 들어, 혈액 50-150 ㎕)으로부터 일반적인 샘플 용량을 수용하기에 적절한 용량으로 공급될 수 있다.
일부 경우에, 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플을 수용하기 위한 용기를 포함한다. 용기는 1 ㎕ 내지 1 ml의 용량의 생물학적 샘플을 보유하도록 구성될 수 있다. 용기는 1 ㎕ 내지 500 ㎕의 용량의 생물학적 샘플을 보유하도록 구성될 수 있다. 용기는 1 ㎕ 내지 200 ㎕의 용량의 생물학적 샘플을 보유하도록 구성될 수 있다. 용기는 나머지 장치/시스템 구성 요소에 의한 처리 및 분석을 위해 적합한 샘플 용량과 동일한 정해진 용량을 가질 수 있다. 이것은 장치, 시스템 또는 키트의 사용자가 지정된 용량의 샘플을 측정할 필요가 없게 한다. 사용자는 용기를 채우기만 하면 되므로 적절한 용량의 샘플이 장치/시스템으로 전달되었음을 확신할 수 있다. 일부 경우에, 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플을 수용하기 위한 용기를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 샘플을 직접 수용한다. 용기에 대한 상기 설명과 유사하게, 샘플 정제기는 나머지 장치/시스템 구성 요소에 의한 처리 및 분석에 적합한 정해진 용량을 가질 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 전적으로 현장에서 사용되도록 의도된다. 그러나 일부 경우에, 사용자는 현장에서 얻은 결과의 추가 분석 또는 확인을 위해 분석된 샘플을 보존하거나 다른 위치(예를 들어, 실험실, 클리닉)로 보내기를 원할 수 있다. 비제한적인 예로서, 장치/시스템은 혈장과 혈액을 분리할 수 있다. 혈장은 현장에 분석될 수 있고 혈액으로부터의 세포는 분석을 위해 다른 위치로 배송된다. 일부 경우에, 장치, 시스템 및 키트는 이러한 목적을 위한 운반 구획 또는 보관 구획을 포함한다. 운반 구획 또는 보관 구획은 생물학적 샘플, 이의 성분 또는 이의 일부를 담을 수 있다. 운반 구획 또는 보관 구획은 생물학적 샘플, 이의 일부 또는 이의 성분을 바로 옆의 사용자에게 먼 위치로 운반하는 동안 담을 수 있다. 운반 구획 또는 보관 구획은 생물학적 샘플로부터 제거된 세포를 담는 것이 가능할 수 있어서, 세포는 검사를 위해 바로 옆 사용자에게 먼 위치로 보내질 수 있다. 바로 옆 사용자에게 먼 위치의 비제한적인 예는 바로 옆 사용자가 집에 있을 때 실험실 또는 클리닉일 수 있다. 일부 경우에, 집에는 생물학적 샘플의 추가 분석을 수행하기 위한 기계 또는 추가 장치가 없다. 운반 구획 또는 보관 구획은 생물학적 샘플을 장치에 첨가함으로써 생성된 반응 또는 공정의 산물을 담는 것이 가능할 수 있다. 일부 경우에, 반응 또는 공정의 산물은 핵산 증폭 산물 또는 역전사 산물이다. 일부 경우에, 반응 또는 공정의 산물은 본원에 기재된 결합 모이어티에 결합된 생물학적 샘플 성분이다. 생물학적 샘플 성분은 핵산, 세포 단편, 세포 외 소포, 단백질, 펩티드, 스테롤, 지질, 비타민, 또는 글루코오스를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 사용자에게 원격 위치에서 분석될 수 있다. 일부 경우에, 운송 구획 또는 보관 구획은 흡수 패드, 종이, 유리 용기, 플라스틱 용기, 중합체 매트릭스, 액체 용액, 겔, 보존제 또는 이들의 조합을 포함한다. 흡수 패드 또는 종이는 스크리닝을 위해 단백질 또는 다른 바이오 마커와 함께 건조된 생물학적 유체를 안정화시키고 운반하는데 유용할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치 및 시스템은 샘플의 무세포 핵산(예를 들어, 순환하는 RNA 및/또는 DNA) 및 비-핵산 성분의 분석을 가능하게 한다. 무세포 핵산 및 비-핵산 성분 둘 모두의 분석은 필요한 지점에 발생할 수 있다. 일부 경우에, 시스템 및 장치는 필요한 지점에서 무세포 핵산을 분석하고 필요한 지점으로부터 원격 부위에서 비-핵산 성분을 분석하기 위해 샘플의 적어도 일부 또는 성분을 보존한다. 일부 경우에, 시스템 및 장치는 필요한 지점에서 비-핵산 성분을 분석하고, 필요한 지점으로부터 원격 부위에서 무세포 핵산의 분석을 위해 샘플의 적어도 일부 또는 성분을 보존한다. 이들 장치 및 시스템은 보유자 검사 및 본원에 개시된 것과 같은 유전병을 검출하는데 유용할 수 있다.
일부 경우에, 운반 구획 또는 보관 구획은 보존제를 포함한다. 보존제는 또한 본원에서 안정화제 또는 생물학적 안정화제로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 장치, 시스템 또는 키트는 보관 및/또는 운반 중 효소 활성을 감소시키는 보존제를 포함한다. 일부 경우에, 보존제는 전혈 보존제이다. 전혈 보존제 또는 이의 성분의 비제한적인 예는 글루코오스, 아데닌, 시트르산, 시트르산삼나트륨, 덱스트로스, 이인산나트륨, 및 제일인산나트륨이다. 일부 경우에, 보존제는 EDTA를 포함한다. EDTA는 달리 핵산을 분해하는 효소 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 보존제는 포름알데히드를 포함한다. 일부 경우에, 보존제는 포름알데히드의 공지된 유도체이다. 포름알데히드, 또는 이의 유도체는 단백질을 가교시켜 세포를 안정화시키고 세포 용해를 방지할 수 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 장치 및 시스템은 한 사람이 휴대할 수 있다. 일부 경우에, 장치와 시스템은 소형이다. 일부 경우에, 장치 및 시스템의 최대 길이, 최대 너비 또는 최대 높이를 갖는다. 일부 경우에, 장치 및 시스템은 최대 길이, 최대 너비 또는 최대 높이를 갖는 단일 유닛에 수용된다. 일부 경우에, 최대 길이는 12인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 길이는 10인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 길이는 8인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 길이는 6인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 너비는 12인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 너비는 10인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 너비는 8인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 너비는 6인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 너비는 4인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 2인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 12인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 10인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 8인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 6인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 4인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 2인치 이하이다. 일부 경우에, 최대 높이는 1인치 이하이다.
샘플 수집
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플 수집기를 포함한다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 나머지 장치, 시스템 또는 키트와 별도로 제공된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 장치, 시스템 또는 키트 또는 그 구성 요소와 물리적으로 통합된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 본원에 기술된 용기과 통합된다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 생물학적 유체를 적용하기 위한 컵, 튜브, 모세관, 또는 웰일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 소변을 적용하기 위한 컵일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 컵 안 소변을 장치, 시스템 또는 키트에 적용하기 위한 피펫을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 혈액을 적용하기 위해 본원에 개시된 장치와 통합된 모세관일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 침을 적용하기 위해 본원에 개시된 장치와 통합된 튜브, 웰, 패드 또는 종이일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 땀을 적용하기 위한 패드 또는 종이일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 경피 천자 장치를 포함한다. 경피 천자 장치의 비제한적인 예는 바늘 및 란셋이다. 일부 경우에, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 마이크로니들, 마이크로니들 어레이 또는 마이크로니들 패치를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 중공 마이크로니들을 포함한다. 비제한적인 예로서, 경피 천자 장치는 웰 또는 모세관과 통합되어 피험체가 손가락을 천자할 때 혈액이 웰 또는 모세관으로 방출되고, 거기에서 그 성분 분석을 위해 시스템 또는 장치에서 이용될 것이다. 일부 경우에, 경피 천자 장치는 오목한 표면에 바늘 또는 란셋을 갖는 푸시 버튼 장치이다. 일부 경우에, 바늘은 마이크로니들이다. 일부 경우에, 경피 천자 장치는 마이크로니들 어레이를 포함한다. 오목한 표면의 니들이 아닌 쪽의 액추에이터, 버튼 또는 위치를 누름으로써, 바늘은 란셋보다 더 제어된 방식으로 피험체의 피부를 천자한다. 또한, 푸시 버튼 장치는 천자 부위로부터 채혈하는 것을 돕기 위해 진공 공급원 또는 플런저를 포함할 수 있다.
샘플 처리 및 정제
샘플 처리기를 포함하는 장치, 시스템 및 키트가 본원에 개시되며, 여기서 샘플 처리기는 샘플의 성분을 제거하거나 샘플을 다수의 분획(예를 들어, 혈액 세포 분획 및 혈장 또는 혈청)으로 분리하기 위해 생물학적 샘플을 변형시킨다. 샘플 처리기는 샘플 정제기를 포함할 수 있으며, 여기서 샘플 정제기는 생물학적 샘플의 원하지 않는 물질 또는 비-표적 성분을 제거하여 샘플을 변형시키도록 구성된다. 생물학적 샘플의 공급원에 따라, 원하지 않는 물질은 단백질(예를 들어, 항체, 호르몬, 효소, 혈청 알부민, 지단백질), 유리 아미노산 및 기타 대사 산물, 미세 소포체, 핵산, 지질, 전해질, 요소, 우로빌린, 약제, 점액, 박테리아, 및 기타 미생물, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 본원에 개시된 생물학적 샘플의 성분을 분리한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 샘플 정제기는 후반 공정 단계, 예컨대 핵산 증폭 또는 검출을 저해하거나, 방해하거나 달리 그에 해가 되는 샘플의 성분을 제거한다. 일부 경우에, 생성된 변형된 샘플은 표적 분석 물을 위해 농축된다. 이는 표적 분석물의 간접 농축으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적 분석물은 직접 포획될 수 있으며, 이는 표적 분석물의 직접적인 농축으로 간주된다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 생물학적 샘플에서 환자 세포 이외의 원하지 않는 물질을 제거하기 위한 분리 재료를 포함한다. 유용한 분리 재료는 물질에 결합하거나 물질과 연관된 특정 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합은 공유 또는 비공유일 수 있다. 특정 물질을 제거하기 위해 당업계에 공지된 임의의 적합한 결합 모이어티가 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 및 이의 단편은 샘플로부터 단백질을 제거하기 위해 일반적으로 사용된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 샘플 정제기는 생물학적 샘플에서 핵산, 단백질, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 펩티드, 소분자 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 샘플 정제기는 필터를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 샘플 정제기는 막을 포함한다. 일반적으로 필터 또는 막은 본원에 개시된 생물학적 샘플로부터 세포, 세포 입자, 세포 단편, 무세포 핵산 이외의 혈액 성분, 또는 이들의 조합을 분리 또는 제거할 수 있다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 혈액 샘플의 세포 성분과 혈장 또는 혈청의 분리를 용이하게 한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 분자 증폭 반응 또는 서열 분석 반응을 시작하기 전에 혈액 샘플의 세포 성분과 혈장 또는 혈청의 분리를 용이하게 한다. 혈장 또는 혈청 분리는 원심 분리, 침강 또는 여과와 같은 여러 가지 다른 방법으로 달성될 수 있다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 전혈을 수용하기 위한 필터 매트릭스를 포함하고, 필터 매트릭스는 세포가 통과하는 것을 금지하는 기공 크기를 갖는 반면, 혈장 또는 혈청은 금지되지 않고 필터 매트릭스를 통과할 수 있다. 일부 경우에, 필터 매트릭스는 상단의 큰 기공 크기와 필터 하단의 작은 기공 크기를 결합하여, 여과 공정 중에 세포 분해 또는 용해를 방지하는 세포의 매우 가벼운 처리를 유도한다. 이는 세포 분해 또는 용해가 표적 무세포 핵산을 오염시키는 혈액 세포 또는 모체 세포로부터 핵산의 방출을 초래하기 때문에 유리하다. 이러한 필터의 비제한적 예는 Pall VividTM GR 막, Munktell Ahlstrom 여과지(예를 들어, WO2017017314호 참조), TeraPore 필터를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 샘플(예를 들어, 혈액으로부터의 혈장)로부터 성분 또는 분획을 분리하기 위해 모세관 힘에 의해 구동되는 수직 여과를 사용한다. 비제한적인 예로서, 수직 여과는 중력 보조 혈장 분리를 포함할 수 있다. 고효율 초 소수성 혈장 분리기는 예를 들어 문헌[Liu et al., A High Efficiency Superhydrophobic Plasma Separation, Lab Chip 2015]에 의해 기술되어 있다.
샘플 정제기는 측면 필터를 포함할 수 있다(예를 들어, 샘플은 중력 방향으로 이동하지 않거나 샘플은 중력 방향에 수직으로 이동함). 샘플 정제기는 수직 필터(예를 들어, 샘플이 중력 방향으로 이동함)를 포함할 수 있다. 샘플 정제기는 수직 필터 및 측면 필터를 포함할 수 있다. 샘플 정제기는 수직 필터, 이어서 측면 필터로 샘플 또는 이의 일부를 수용하도록 구성될 수 있다. 샘플 정제기는 측면 필터, 이어서 수직 필터로 샘플 또는 이의 일부를 수용하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 수직 필터는 필터 매트릭스를 포함한다. 일부 경우에, 수직 필터의 필터 매트릭스는 세포가 통과하는 것을 금지하는 기공 크기를 갖는 기공을 포함하는 반면, 혈장은 금지되지 않고 필터 매트릭스를 통과할 수 있다. 일부 경우에, 필터 매트릭스는 상부의 큰 기공 크기와 필터의 하부의 작은 기공 크기를 결합하여 여과 공정 중에 세포 분해를 방지하는 세포의 매우 가벼운 처리를 유도하기 때문에 본 출원에 특히 적합한 막을 포함한다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 무세포 핵산을 제거하지 않으면서 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 물질을 제거하는 적절한 분리 재료, 예를 들어 필터 또는 막을 포함한다. 일부 경우에, 분리 재료는 크기에 기초하여 생물학적 샘플로부터 물질을 분리하며, 예를 들어, 분리 재료는 세포를 배제하지만 무세포 핵산에는 투과성인 기공 크기를 갖는다. 따라서, 생물학적 샘플이 혈액일 경우, 혈장 또는 혈청은 샘플 정제기에서 분리 재료를 통하여 혈액 세포보다 더 빠르게 이동할 수 있고, 임의의 무세포 핵산을 함유하는 혈장 또는 혈청은 분리 재료의 구멍에 침투한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈액이고, 분리 재료에서 둔화되고/거나 트랩되는 세포는 적혈구, 백혈구 또는 혈소판이다. 일부 경우에, 세포는 방광 또는 요로 상피 세포(소변) 또는 협측 세포(타액)를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 체 내의 생물학적 샘플과 접촉한 조직으로부터 유래한다. 일부 경우에, 세포는 박테리아 또는 다른 미생물이다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 세포를 손상시키지 않으면서 세포를 둔화시키고/시키거나 세포를 트랩하여 무세포 핵산의 후속 평가를 방해할 수 있는 세포 핵산 및 기타 단백질 또는 세포 단편의 방출을 피할 수 있다. 이는 예를 들어 측면 유동 스트립 또는 다른 적합한 분석 포맷의 경로를 따라 기공 크기가 완만하고 점진적으로 감소함으로써 달성될 수 있어서, 세포 이동의 서서히 둔화시켜, 세포에 대한 힘을 최소화할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 세포의 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 최대 100%가 분리 재료에 트랩될 때 온전한 상태로 유지된다. 크기 분리에 부가하여 또는 독립적으로, 분리 재료는 크기 이외의 세포 특성에 기초하여 원하지 않는 물질을 트랩하거나 분리할 수 있으며, 예를 들어 분리 재료는 세포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체 또는 항원 결합 항체 단편이다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 혈액 세포 또는 미세 소포의 수용체에 대한 리간드 또는 수용체 결합 단백질이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 시스템 및 장치는 샘플 정제기, 필터 및/또는 막을 통해 생물학적 샘플을 이동시키거나, 끌어당기거나 밀거나 당기는 분리 재료를 포함한다. 일부 경우에, 재료는 위킹 물질이다. 세포를 제거하기 위해 샘플 정제기에서 사용되는 적절한 분리 재료의 예는 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 아세틸셀룰로스, 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 유리 섬유, 붕규산, 염화비닐, 은을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 분리 재료는 세포의 통과를 방지하는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 경우에, 분리 재료는 적혈구의 통과를 방지할 수 있는 특성이 있기만 한다면 제한되지 않는다. 일부 경우에, 분리 재료는 소수성 필터, 예를 들어 유리 섬유 필터, 복합 필터, 예를 들어 Cytosep(예를 들어, Ahlstrom Filtration 또는 Pall Specialty Materials, 미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재), 또는 친수성 필터, 예를 들어 셀룰로오스(예를 들어, Pall Specialty Materials)이다. 일부 경우에, 전혈은 시판 키트(예를 들어, Arrayit Blood Card Serum Isolation Kit, Cat. ABCS, Arrayit Corporation, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 추가 처리를 위해 적혈구, 백혈구 및 혈청 성분으로 분별될 수 있다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 하나 이상의 기공 크기를 특징으로 하는 하나 이상의 필터 또는 하나 이상의 막을 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 다중 필터 및/또는 막을 포함하며, 여기서 적어도 제1 필터 또는 막의 기공 크기는 제2 필터 또는 막과 상이하다. 일부 경우에, 하나 이상의 필터/막의 하나 이상의 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 10 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 8 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 6 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 4 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.05 미크론 내지 약 1 미크론이다. 일부 경우에, 하나 이상의 필터/막의 하나 이상의 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 10 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 8 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 6 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 4 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 2 미크론이다. 일부 경우에, 기공 크기는 약 0.1 미크론 내지 약 1 미크론이다.
일부 경우에, 샘플 정제기는 다루기 쉬운 샘플 정제기이다. 필터 매트릭스, 수직 필터, 위킹 물질, 또는 세포의 통과를 허용하지 않는 기공을 갖는 막을 포함하는 것과 같은 다루기 쉬운 샘플 정제기는 무세포 핵산을 분석하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 모체 혈액에서 무세포 태아 핵산의 산전 적용은 무세포 모체 핵산의 존재하에 무세포 태아 핵산을 분석해야 하는 추가적인 과제를 제시하며, 전자는 후자에 큰 배경 신호를 생성한다. 비제한적인 예로서, 모체 혈액 샘플은 샘플 수집 방법에 의해 야기되는 세포 용해 또는 다른 세포 파괴 없이 샘플을 얻을 때 전혈 1 밀리리터당 500 내지 750 게놈 당량의 총 무세포 DNA(모체 및 태아)를 함유할 수 있다. 임산부로부터 샘플링한 혈액의 태아 분율은 ml당 약 10%, 약 50 내지 75 게놈 당량일 수 있다. 무세포 핵산을 얻는 과정은 일반적으로 혈액으로부터 혈장을 얻는 단계를 포함한다. 조심스럽게 수행하지 않으면 모체 백혈구가 파괴되어 샘플에 추가 세포 핵산이 방출되어 태아 무세포 핵산에 많은 배경 소음이 발생할 수 있다. 전형적인 백혈구 수는 혈액 ml당 약 4*106 내지 10*106 세포이므로 이용 가능한 핵 DNA는 전체 무세포 DNA(cfDNA)보다 약 4,000 내지 10,000배 더 높다. 결과적으로, 작은 분율의 모계 백혈구만이 파괴되어 핵 DNA를 혈장으로 방출하더라도 태아 분율이 급격히 감소한다. 예를 들어, 0.01%의 백혈구 분해는 태아 분율을 10%에서 약 5%로 감소시킬 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 이러한 배경 신호를 감소시키는 것을 목표로 한다.
일부 경우에, 샘플 처리기는 전혈로부터 혈액 세포를 분리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 전혈로부터 혈장을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 전혈로부터 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 1 밀리리터 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 1 밀리리터 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 500 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 400 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 300 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 200 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 150 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다. 일부 경우에, 샘플 처리기는 100 ㎕ 미만의 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 단리하도록 구성된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 원하지 않거나 관심이 없는 세포, 세포 단편, 핵산 또는 단백질이 고갈된 변형된 샘플을 생성하기 위한 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플에서 원하지 않거나 관심이 없는 세포, 세포 단편, 핵산 또는 단백질을 감소시키기 위한 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 표적 세포, 표적 세포 단편, 표적 핵산 또는 표적 단백질이 농축된 변형된 샘플을 생성하기 위한 결합 모이어티를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산, 단백질, 펩티드, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합할 수 있는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플에서 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 포획하기 위한 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 DNA 및 RNA 중 적어도 하나를 함유한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 세포 외 소포에 함유된 DNA 또는 RNA를 분석하기 위한 시약 또는 구성 요소를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 단백질, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 세포로부터 방출된 세포 외 소포와 상호 작용하거나 이를 포획할 수 있는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 세포는 태아 세포이다. 일부 경우에, 세포는 태반 세포이다. 태아 세포 또는 태반 세포는 임신한 여성 피험체의 생물학적 유체(예를 들어, 혈액)에서 순환 중일 수 있다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 기관, 샘 또는 조직으로부터 방출된다. 비제한적인 예로서, 기관, 샘 또는 조직은 이환, 노화, 감염되거나 성장할 수 있다. 기관, 샘 및 조직의 비제한적인 예는 뇌, 간, 심장, 신장, 결장, 췌장, 근육, 지방, 갑상선, 전립선, 유방 조직, 및 골수이다.
비제한적인 예로서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 모체 샘플로부터 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 포획 및 폐기하여 태아/태반 핵산에 대한 샘플을 농축할 수 있다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 태아/태반 기원이다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 태아 세포로부터 유래한다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 태아 세포에 의해 방출된다. 일부 경우에, 세포 외 소포는 태반 세포에 의해 방출된다. 태반 세포는 영양막 세포일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 태아 DNA 또는 RNA 단편을 함유할 수 있는 태반 교육된 혈소판을 포획하기 위한 세포 결합 모이어티를 포함한다. 이들은 항체 또는 다른 방법(저속 원심 분리)으로 포획/농축될 수 있다. 이러한 경우에, 태아 DNA 또는 RNA 단편은 염색체 정보(예를 들어, 성별)를 검출하거나 나타내기 위해 본원에 기재된 바와 같이 분석될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 모체 세포로부터 유래한 생물학적 샘플에서 세포 외 소포 또는 세포 외 미세 입자를 포획하기 위한 결합 모이어티를 포함한다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 고체 지지체에 부착되며, 여기서 고체 지지체는 나머지 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있거나 생물학적 샘플은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉된 후 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 고체 지지체의 비제한적 예는 비드, 나노 입자, 자성 입자, 칩, 마이크로 칩, 섬유질 스트립, 중합체 스트립, 막, 매트릭스, 칼럼, 플레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 세포 용해 시약을 포함할 수 있다. 세포 용해 시약의 비제한적 예는 NP-40과 같은 세제, 소듐 도데실 술페이트 및 암모늄, 클로라이드 또는 칼륨을 포함하는 염 용액을 포함한다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 세포 용해 성분을 가질 수 있다. 세포 용해 성분은 구조적이거나 기계적일 수 있고 세포를 용해시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포 용해 성분은 세포를 전단하여 핵산과 같은 세포 내 성분을 방출할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 세포 용해 시약을 포함하지 않는다. 본원에 개시된 일부 장치, 시스템 및 키트는 무세포 핵산을 분석하기 위한 것이다.
핵산 증폭
일반적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 종종 DNA 폴리머라제를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 본원에 개시된 생물학적 샘플에서 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 생성하기 위한 역전사 효소를 포함하며, 여기서 cDNA는 본원에 기술된 바와 같이 게놈 DNA와 유사하게 증폭 및/또는 분석될 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 종종 DNA 폴리머라제 및 헬리카제와 같은 효소의 효율을 증가시킬 수 있는 크라우딩제를 함유한다. 크라우딩제는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 라이브러리의 효율을 증가시킬 수 있다. 크라우딩제는 중합체, 단백질, 다당류, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트에 사용될 수 있는 크라우딩제의 비제한적 예는 덱스트란, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 덱스트란이다.
종래의 폴리머라제 연쇄 반응은 열 순환을 필요로 한다. 이것은 가능하지만 열 순환기가 없는 일반 가정 사용자에게는 불편하다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 장치 또는 시스템 또는 그 구성 요소의 온도를 변경하지 않으면서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 등온적으로 핵산을 증폭시킬 수 있다. 등온 증폭의 비제한적 예는 다음과 같다: 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 가닥 치환 증폭(SDA), 헬리카제 의존적 증폭(HDA), 닉킹 효소 증폭 반응(NEAR), 및 재조합 효소 폴리머라제 증폭(RPA). 따라서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 등온 증폭을 수행하는데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 등온 증폭 시약의 비제한적인 예는 재조합 효소 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 및 가닥 치환 폴리머라제를 포함한다. 일반적으로, 재조합 효소 폴리머라제 증폭(RPA)을 사용한 등온 증폭은 3개의 핵심 효소, 재조합 효소, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 및 가닥 치환 폴리머라제를 이용하여 (1) DNA에서 상동성 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 쌍을 이루고, (2) 치환된 DNA 가닥을 안정화하여 프라이머 치환을 방지하고, (3) 가닥 치환 DNA 폴리머라제를 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시킨다. 쌍을 이루는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 실온에서 인큐베이션(37℃에서 최적)으로 지수 DNA 증폭이 일어날 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 한 온도에서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 2개 이하의 온도에서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 3개 이하의 온도에서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 초기에 장치, 시스템 또는 키트의 하나의 시약 또는 구성 요소를 가열하기만 하면된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 일정 범위의 온도에서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 20℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 20℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 10℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트, 이의 모든 구성 요소, 및 이의 모든 시약은 냉각, 냉동 또는 가열을 요구하지 않고 실온에서 완전히 작동할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 적어도 일부는 약 20℃ 내지 약 50℃에서 작동한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 적어도 일부는 약 37℃에서 작동한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 적어도 일부는 약 42℃에서 작동한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 유리하게는 실온에서 작동된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 적어도 일부는 약 20℃ 내지 약 30℃에서 등온적으로 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 적어도 일부는 약 23℃ 내지 약 27℃에서 등온적으로 핵산을 증폭시킬 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 증폭을 모니터링하기 위해 무염기 부위, 형광단 및 소광제를 갖는 혼성화 프로브를 포함한다. 엑소 뉴클레아제 III이 포함되어 무염기 부위를 절단하고 소광제를 방출하여 형광 여기를 허용할 수 있다. 일부 경우에, 증폭 산물은 증폭 프라이머 중 하나에 포획 분자(예를 들어, 비오틴)를 부착시키고 검출을 허용하는 포획을 위한 5' 항원성 분자(예를 들어, 플루오레세인 유도체 FAM)로 혼성화 프라이머를 표지함으로써 측방 유동을 통해 검출 또는 모니터링된다. 이와 같이, 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트, 및 방법은 측방 유동 장치에서 핵산 및 증폭 산물의 검출을 가능하게 한다. 측방 유동 장치는 본원에 기술되어 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 게놈에서 제1 서열 및 게놈에서 제2 서열을 증폭시킬 수 있는 적어도 1종의 핵산 증폭 시약 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 제1 서열 및 제2 서열은 유사하고, 제1 서열은 피험체의 제1 무세포 핵산 상에 존재하고 제2 서열은 피험체의 제2 무세포 핵산 상에 존재하도록 제1 서열은 제2 서열로부터 물리적으로 충분히 떨어져 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 바로 인접해 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 적어도 1 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 적어도 2 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 또는 적어도 약 100 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 적어도 약 50% 동일하다. 일부 경우에, 적어도 2개의 서열은 적어도 약 60% 동일하거나, 적어도 약 60% 동일하거나, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, 제1 서열 및 제2 서열은 각각 적어도 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 서열 및 제2 서열은 각각 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 50, 또는 적어도 약 100 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 서열 및 제2 서열은 동일한 염색체상에 있다. 일부 경우에, 제1 서열은 제1 염색체상에 있고 제2 서열은 제2 염색체상에 있다. 일부 경우에, 제1 서열과 제2 서열은 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 유전자 AOX1의 프로모터 영역의 모든 CpG 부위는 전립선암에서 동일한 과메틸화를 나타내므로, 이들 부위는 기능적으로 동일한 정보를 보유하기 때문에 기능적으로 연결되어 있지만 하나 이상의 뉴클레오티드가 떨어져 위치한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 무세포 핵산의 가닥에 어닐링할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 무세포 핵산은 관심 영역 또는 이의 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 관심 영역은 Y 염색체의 영역이다. 일부 경우에, 관심 영역은 X 염색체의 영역이다. 일부 경우에, 관심 영역은 오토솜의 영역이다. 일부 경우에, 관심 영역 또는 이의 일부는 게놈에 1회 초과로 존재하는 본원에 기재된 바와 같은 반복 서열을 포함한다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 1,000,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 적어도 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 적어도 100 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 영역은 적어도 1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 500,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 300,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 100 뉴클레오티드 내지 약 1,000,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 100 뉴클레오티드 내지 약 500,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 100 뉴클레오티드 내지 약 300,000 염기쌍 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 1000 뉴클레오티드 내지 약 1,000,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 1000 뉴클레오티드 내지 약 500,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 1000 뉴클레오티드 내지 약 300,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10,000 뉴클레오티드 내지 약 1, 000,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10,000 뉴클레오티드 내지 약 500,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 10,000 뉴클레오티드 내지 약 300,000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역은 약 300,000 뉴클레오티드 길이이다.
일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 5 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 8 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 15 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 관심 영역에 상응하는 서열은 적어도 약 100 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 5 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 500 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 400 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 300 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 50 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 서열은 약 50 뉴클레오티드 내지 약 500 뉴클레오티드 길이이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 무세포 핵산의 가닥에 어닐링할 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 무세포 핵산은 본원에 개시된 관심의 부분 영역에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 하위 영역은 관심 영역에 1회 초과로 존재하는 서열로 표시된다. 일부 경우에, 하위 영역은 약 10 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 하위 영역은 약 50 내지 약 500 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 하위 영역은 약 50 내지 약 250 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 하위 영역은 약 50 내지 약 150 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 하위 영역은 약 100 뉴클레오티드 길이이다.
당업계에 공지된 임의의 적절한 핵산 증폭 방법이 본원에 기재된 장치 및 방법에 사용하기 위해 고려된다. 일부 경우에, 등온 증폭이 사용된다. 일부 경우에, 등온 증폭이 시작되기 전에 초기 가열 단계를 제외하고 증폭은 등온이다. 각각 다른 고려 사항을 갖고 다른 장점을 제공하는 다수의 등온 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌, 예를 들어 문헌[Zanoli and Spoto, 2013, "Isothermal Amplification Methods for the Detection of Nucleic Acids in Microfluidic Devices, " Biosensors 3: 18-43, and Fakruddin, et al., 2013, "Alternative Methods of Polymerase Chain Reaction (PCR), " Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences 5(4): 245-252, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨]에 논의되었다. 일부 경우에, 임의의 적절한 등온 증폭 방법이 사용된다. 일부 경우에, 사용되는 등온 증폭 방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP); 핵산 서열 기반 증폭(NASBA); 다중 치환 증폭(MDA); 롤링 서클 증폭(RCA); 헬리카제 의존 증폭(HDA); 가닥 치환 증폭(SDA); 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR); 래미피케이션 증폭 방법(RAM); 및 재조합 효소 폴리머라제 증폭(RPA)으로부터 선택된다.
일부 경우에, 사용되는 증폭 방법은 LAMP이다(예를 들어, 문헌[Notomi, et al., 2000, "Loop Mediated Isothermal Amplification" NAR 28(12): e63 i-vii, 및 미국 특허 제6,410,278허, "Process for synthesizing nucleic acid", 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨] 참조). LAMP는 자동 순환 가닥 치환 데옥시리보핵산(DNA) 합성을 이용하는 1단계 증폭 시스템이다. 일부 경우에, LAMP는 열 안정성 폴리머라제, 예를 들어 바실러스 스테아로서모필러스(Bst) DNA 폴리머라제 I, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 특정 프라이머 및 표적 DNA 주형의 존재하에 60-65℃에서 45-60분 동안 수행된다. 일부 경우에, 주형은 RNA이고 역전사 효소 활성 및 가닥 치환형 DNA 폴리머라제 활성을 모두 갖는 폴리머라제, 예를 들어 Bca DNA 폴리머라제가 사용되거나, 역전사 효소 활성을 갖는 폴리머라제가 역전사 효소 단계에 사용되고 역전사 효소 활성을 갖지 않는 폴리머라제는 가닥 치환 DNA 합성 단계에 사용된다.
일부 경우에, 증폭 반응은 약 55℃ 내지 약 70℃에서 LAMP를 이용하여 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 55℃ 이상에서 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 70℃ 이하에서 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 55℃ 내지 약 57℃, 약 55℃ 내지 약 59℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 약 55℃ 내지 약 61℃, 약 55℃ 내지 약 62℃, 약 55℃ 내지 약 63℃, 약 55℃ 내지 약 64℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 약 55℃ 내지 약 66℃, 약 55℃ 내지 약 68℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 57℃ 내지 약 59℃, 약 57℃ 내지 약 60℃, 약 57℃ 내지 약 61℃, 약 57℃ 내지 약 62℃, 약 57℃ 내지 약 63℃, 약 57℃ 내지 약 64℃, 약 57℃ 내지 약 65℃, 약 57℃ 내지 약 66℃, 약 57℃ 내지 약 68℃, 약 57℃ 내지 약 70℃, 약 59℃ 내지 약 60℃, 약 59℃ 내지 약 61℃, 약 59℃ 내지 약 62℃, 약 59℃ 내지 약 63℃, 약 59℃ 내지 약 64℃, 약 59℃ 내지 약 65℃, 약 59℃ 내지 약 66℃, 약 59℃ 내지 약 68℃, 약 59℃ 내지 약 70℃, 약 60℃ 내지 약 61℃, 약 60℃ 내지 약 62℃, 약 60℃ 내지 약 63℃, 약 60℃ 내지 약 64℃, 약 60℃ 내지 약 65℃, 약 60℃ 내지 약 66℃, 약 60℃ 내지 약 68℃, 약 60℃ 내지 약 70℃, 약 61℃ 내지 약 62℃, 약 61℃ 내지 약 63℃, 약 61℃ 내지 약 64℃, 약 61℃ 내지 약 65℃, 약 61℃ 내지 약 66℃, 약 61℃ 내지 약 68℃, 약 61℃ 내지 약 70℃, 약 62℃ 내지 약 63℃, 약 62℃ 내지 약 64℃, 약 62℃ 내지 약 65℃, 약 62℃ 내지 약 66℃, 약 62℃ 내지 약 68℃, 약 62℃ 내지 약 70℃, 약 63℃ 내지 약 64℃, 약 63℃ 내지 약 65℃, 약 63℃ 내지 약 66℃, 약 63℃ 내지 약 68℃, 약 63℃ 내지 약 70℃, 약 64℃ 내지 약 65℃, 약 64℃ 내지 약 66℃, 약 64℃ 내지 약 68℃, 약 64℃ 내지 약 70℃, 약 65℃ 내지 약 66℃, 약 65℃ 내지 약 68℃, 약 65℃ 내지 약 70℃, 약 66℃ 내지 약 68℃, 약 66℃ 내지 약 70℃, 또는 약 68℃ 내지 약 70℃에 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 55℃, 약 57℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 68℃, 또는 약 70℃에서 수행된다.
일부 경우에, 증폭 반응은 LAMP를 이용하여 약 30 내지 약 90분 동안 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 적어도 약 30분 동안 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 최대 약 90분 동안 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 약 30분 내지 약 35분, 약 30분 내지 약 40분, 약 30분 내지 약 45분, 약 30분 내지 약 50분, 약 30분 내지 약 55분, 약 30분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 65분, 약 30분 내지 약 70분, 약 30분 내지 약 75분, 약 30분 내지 약 80분, 약 30분 내지 약 90분, 약 35분 내지 약 40분, 약 35분 내지 약 45분, 약 35분 내지 약 50분, 약 35분 내지 약 55분, 약 35분 내지 약 60분, 약 35분 내지 약 65분, 약 35분 내지 약 70분, 약 35분 내지 약 75분, 약 35분 내지 약 80분, 약 35분 내지 약 90분, 약 40분 내지 약 45분, 약 40분 내지 약 50분, 약 40분 내지 약 55분, 약 40분 내지 약 60분, 약 40분 내지 약 65분, 약 40분 내지 약 70분, 약 40분 내지 약 75분, 약 40분 내지 약 80분, 약 40분 내지 약 90분, 약 45분 내지 약 50분, 약 45분 내지 약 55분, 약 45분 내지 약 60분, 약 45분 내지 약 65분, 약 45분 내지 약 70분, 약 45분 내지 약 75분, 약 45분 내지 약 80분, 약 45분 내지 약 90분, 약 50분 내지 약 55분, 약 50분 내지 약 60분, 약 50분 내지 약 65분, 약 50분 내지 약 70분, 약 50분 내지 약 75분, 약 50분 내지 약 80분, 약 50분 내지 약 90분, 약 55분 내지 약 60분, 약 55분 내지 약 65분, 약 55분 내지 약 70분, 약 55분 내지 약 75분, 약 55분 내지 약 80분, 약 55분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 65분, 약 60분 내지 약 70분, 약 60분 내지 약 75분, 약 60분 내지 약 80분, 약 60분 내지 약 90분, 약 65분 내지 약 70분, 약 65분 내지 약 75분, 약 65분 내지 약 80분, 약 65분 내지 약 90분, 약 70분 내지 약 75분, 약 70분 내지 약 80분, 약 70분 내지 약 90분, 약 75분 내지 약 80분, 약 75분 내지 약 90분, 또는 약 80분 내지 약 90분 동안 수행된다. 일부 경우에, LAMP 반응은 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 또는 약 90분 동안 수행된다.
일부 경우에, 증폭 방법은 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)이다. NASBA(3SR 및 전사 매개 증폭으로도 알려짐)는 등온 전사 기반 RNA 증폭 시스템이다. 단일 가닥 RNA를 생성하기 위해 3가지 효소(조류 골수아세포증 바이러스 역전사 효소, RNase H 및 T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라제)가 사용된다. 특정 경우에, NASBA를 이용하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 증폭 반응은 41℃에서 수행되며, 일반적으로 약 60 내지 약 90분 동안 일정한 온도를 유지한다(예를 들어, 문헌[Fakruddin, et al., 2012, "Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Prospects and Applications, " Int. J. of Life Science and Pharma Res. 2(1):L106-L121, 본원에 참고로 포함됨] 참조).
일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃ 내지 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 41℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 최대 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃ 내지 약 41℃, 약 40℃ 내지 약 42℃, 또는 약 41℃ 내지 약 42℃에서 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 40℃, 약 41℃, 또는 약 42℃에서 수행된다.
일부 경우에, 증폭 반응은 NASBA를 이용하여 약 45 내지 약 120분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 30분 내지 약 120분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 적어도 약 30분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 최대 약 120분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 최대 180분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 30분 내지 약 45분, 약 30분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 65분, 약 30분 내지 약 70분, 약 30분 내지 약 75분, 약 30분 내지 약 80분, 약 30분 내지 약 85분, 약 30분 내지 약 90분, 약 30분 내지 약 95분, 약 30분 내지 약 100분, 약 30분 내지 약 120분, 약 45분 내지 약 60분, 약 45분 내지 약 65분, 약 45분 내지 약 70분, 약 45분 내지 약 75분, 약 45분 내지 약 80분, 약 45분 내지 약 85분, 약 45분 내지 약 90분, 약 45분 내지 약 95분, 약 45분 내지 약 100분, 약 45분 내지 약 120분, 약 60분 내지 약 65분, 약 60분 내지 약 70분, 약 60분 내지 약 75분, 약 60분 내지 약 80분, 약 60분 내지 약 85분, 약 60분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 95분, 약 60분 내지 약 100분, 약 60분 내지 약 120분, 약 65분 내지 약 70분, 약 65분 내지 약 75분, 약 65분 내지 약 80분, 약 65분 내지 약 85분, 약 65분 내지 약 90분, 약 65분 내지 약 95분, 약 65분 내지 약 100분, 약 65분 내지 약 120분, 약 70분 내지 약 75분, 약 70분 내지 약 80분, 약 70분 내지 약 85분, 약 70분 내지 약 90분, 약 70분 내지 약 95분, 약 70분 내지 약 100분, 약 70분 내지 약 120분, 약 75분 내지 약 80분, 약 75분 내지 약 85분, 약 75분 내지 약 90분, 약 75분 내지 약 95분, 약 75분 내지 약 100분, 약 75분 내지 약 120분, 약 80분 내지 약 85분, 약 80분 내지 약 90분, 약 80분 내지 약 95분, 약 80분 내지 약 100분, 약 80분 내지 약 120분, 약 85분 내지 약 90분, 약 85분 내지 약 95분, 약 85분 내지 약 100분, 약 85분 내지 약 120분, 약 90분 내지 약 95분, 약 90분 내지 약 100분, 약 90분 내지 약 120분, 약 95분 내지 약 100분, 약 95분 내지 약 120분, 또는 약 100분 내지 약 120분 동안 수행된다. 일부 경우에, NASBA 반응은 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 120분, 약 150분, 또는 약 180분 동안 수행된다.
일부 경우에, 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(SDA)이다. SDA는 4가지 다른 프라이머를 사용하는 등온 증폭 방법이다. 제한 부위(HincII 엑소뉴클레아제에 대한 인식 서열)를 함유하는 프라이머를 DNA 주형에 어닐링한다. 에쉐리키아 콜라이 DNA 폴리머라제 1(엑소-클레노브)의 엑소뉴클레아제 결핍 단편은 프라이머를 신장시킨다. 각각의 SDA 사이클은 (1) 치환된 표적 단편에 프라이머 결합, (2) 엑소-클레노브에 의한 프라이머/표적 복합체의 연장, (3) 생성된 헤미포스포티오에이트 HincII 부위의 닉킹, (4) HincII의 닉 부위로부터의 해리 및 (5) 닉의 연장 및 엑소-클레노브에 의한 하류 가닥의 치환으로 이루어진다.
일부 경우에, 증폭 방법은 다중 치환 증폭(MDA)이다. MDA는 전체 게놈을 고 충실도로 증폭시키기 위해 변형된 무작위 프라이머와 함께 박테리오파지 Φ29의 고가공성 및 가닥 치환 DNA 폴리머라제의 사용에 기초한 등온 가닥 치환 방법이다. 매우 적은 양의 출발 물질로부터 샘플의 모든 DNA를 증폭시키기 위해 개발되었다. MDA에서 Φ29 DNA 폴리머라제는 dNTP, 무작위 헥사머 및 변성된 주형 DNA와 함께 30℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션되며 효소는 10분 동안 고온(65℃)에서 불활성화되어야 한다. 반복되는 재순환은 필요하지 않지만, 짧은 초기 변성 단계, 증폭 단계, 및 효소의 최종 불활성화가 필요하다.
일부 경우에, 증폭 방법은 RCA(Rolling Circle Amplification)이다. RCA는 단일 온도, 전형적으로 약 30℃에서 109배 초과의 프로브 DNA 서열의 증폭을 허용하는 등온 핵산 증폭 방법이다. 수많은 라운드의 등온 효소 합성은 Φ29 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는데, 이는 원형 DNA 프로브 주위에서 연속적으로 진행함으로써 원형-혼성화된 프라이머를 연장시킨다. 일부 경우에, 증폭 반응은 RCA를 사용하여 약 28℃ 내지 약 32℃에서 수행된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, 여기서 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하며, 여기서 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열로 이루어진다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 75% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 80% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 85% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 80% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 90% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 95% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열에 대해 적어도 97% 상동성이다. 일부 경우에, Y 염색체 서열에 상보적이거나 상응하는 서열(들)은 야생형 인간 Y 염색체 서열과 100% 상동성이다.
핵산 검출기
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산 검출기를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산을 증폭시키고, 그 결과 증폭된 핵산을 서열 분석하도록 구성된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산을 증폭시키지 않고 핵산을 서열 분석하도록 구성된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산 서열 분석기를 포함하지만 핵산 증폭 시약 또는 핵산 증폭 성분을 포함하지는 않는다. 일부 경우에, 핵산 서열 분석기는 성공적인 증폭 또는 실패한 증폭을 반영하는 신호를 검출하는 신호 검출기를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열 분석기는 신호 검출기이다. 일부 경우에, 신호 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함한다.
일부 경우에, 핵산 서열 분석기는 핵산 서열 분석기로부터의 서열 분석 리드를 분석하는 전자 장치와의 통신 연결을 갖는다. 일부 경우에, 통신 연결은 유선으로 연결된다. 일부 경우에, 통신 연결은 무선이다. 예를 들어, 본원에 개시된 것들과 같은 모바일 장치 앱 또는 컴퓨터 소프트웨어는 서열 분석 리드를 수신할 수 있고, 서열 분석 리드에 기초하여 샘플에 대한 유전 정보(예를 들어, 질환/감염의 존재, 약물에 대한 반응, 유전적 이상 또는 태아의 돌연변이)를 디스플레이하거나 보고한다.
일부 경우에, 핵산 서열 분석기는 나노포어 서열 분석기를 포함한다. 일부 경우에, 나노포어 서열 분석기는 나노포어를 포함한다. 일부 경우에, 나노포어 서열 분석기는 막을 가로 질러 전류를 생성하고 나노포어를 통한 하전 분자(예를 들어, 핵산)의 이동을 유도하는 용액 및 막을 포함한다. 일부 경우에, 나노포어 서열 분석기는 막 관통 단백질, 이의 일부, 또는 이의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 막 횡단 단백질은 박테리아 단백질이다. 일부 경우에, 막 횡단 단백질은 박테리아 단백질이 아니다. 일부 경우에, 나노포어는 합성적이다. 일부 경우에, 나노포어는 고체 상태 나노포어 서열 분석을 수행한다. 일부 경우에, 나노포어 서열 분석기는 포켓 크기, 휴대용, 또는 대략 휴대 전화의 크기와 같은 것으로 기술된다. 일부 경우에, 나노포어 서열 분석기는 RNA 및 DNA 중 적어도 하나를 서열 분석하도록 구성된다. 나노포어 서열 분석 장치의 비제한적인 예는 옥스포드 나노포어 테크노로지(Oxford Nanopore Technologies) MinION 및 SmidgION 나노포어 서열 분석 USB 장치를 포함한다. 이 두 장치는 모두 휴대하기에 충분히 작다. 나노포어 서열 분석 장치 및 구성 요소는 문헌[Howorka, Nat Nanotechnol. 2017 Jul 6;12(7):619-630), 및 Garrido-Cardenas et al., Sensors (Basel). 2017 Mar 14;17(3), 둘 다 본원에 참고로 포함됨]에 의한 리뷰에 추가로 기술되어 있다. 나노포어 서열 분석 장치의 다른 비제한적인 예는 일렉트로닉 바이오사이언스(Electronic Biosciences), 투 포어 가이스(Two Pore Guys), 스트라토스(Stratos), 및 애질런트(Agilent)(원래 Genia의 기술)에 의해 제공된다.
일부 경우에, 핵산 검출기는 후성 유전적 변형을 검출하기 위해 비술파이트 서열 분석에 필요한 시약 및 구성 요소를 포함한다. 예를 들어, 메틸화 마커가 많은 긴 영역이 단편화될 수 있다. 여기서, 메틸화 마커를 보유하는 각각의 단편은 독립적 인 신호일 수 있다. 모든 단편으로부터의 신호는 조합하여 유용한 유전 정보를 얻기에 충분하다.
일부 경우에, 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 핵산 검출기는 태그된 핵산을 카운트하도록 구성되며, 여기서 핵산 검출기는 하나 이상의 태그로부터의 총체적인 신호를 정량화한다.
포획 및 검출
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 핵산 검출기, 포획 성분, 신호 검출기, 검출 시약, 또는 이들의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 포획 성분 및 신호 검출기가 통합된다. 일부 경우에, 포획 성분은 고체 지지체를 포함한다. 일부 경우에, 고체 지지체는 비드, 칩, 스트립, 막, 매트릭스, 칼럼, 플레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 염색체 또는 이의 단편의 후성 유전적으로 변형된 영역에 대한 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 일부 경우에, 염색체의 후성 유전적으로 변형된 영역의 후성 유전적 변형은 성별 또는 성별의 마커를 나타낸다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 모체 DNA에 존재하지 않는 부계 유전된 서열에 대한 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 부계 유전된 단일 뉴클레오티드 다형성에 대한 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 일부 경우에, 염색체는 Y 염색체이다. 일부 경우에, 염색체는 X 염색체이다. 일부 경우에, 염색체는 Y 염색체이다. 일부 경우에, 염색체는 오토솜이다. 일부 경우에, 프로브는 펩티드, 항체, 항원 결합 항체 단편, 핵산 또는 소분자를 포함한다.
일부 경우에, 장치, 시스템 및 키트는 본원에 개시된 샘플 정제기와 본원에 개시된 포획 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기는 포획 성분을 포함한다. 일부 경우에, 샘플 정제기와 포획 성분은 통합된다. 일부 경우에는 샘플 정제기와 포획 성분은 분리되어 있다.
일부 경우에, 포획 성분은 본원에 기술된 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 측방 유동 분석에 존재한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 샘플이 측방 유동 분석에 첨가되기 전에 샘플에 첨가된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 신호 전달 분자를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 신호 전달 분자와 물리적으로 결합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 신호 전달 분자와 물리적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 신호 전달 분자에 연결된다. 신호 전달 분자의 비제한적인 예는 금 입자, 형광 입자, 발광 입자, 및 염료 분자를 포함한다. 일부 경우에, 포획 성분은 본원에 기재된 증폭 산물과 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 포획 성분은 본원에 기재된 증폭 산물상의 태그와 상호 작용할 수 있는 결합 모이어티를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 검출 시스템을 포함한다. 일부 경우에, 검출 시스템은 신호 검출기를 포함한다. 신호 검출기의 비제한적인 예는 형광 판독기, 비색계, 센서, 와이어, 회로, 수신기를 포함한다. 일부 경우에, 검출 시스템은 검출 시약을 포함한다. 검출 시약의 비제한적인 예는 형광단, 화학 물질, 나노 입자, 항체, 및 핵산 프로브를 포함한다. 일부 경우에, 검출 시스템은 pH 센서 및 상보성 금속 산화물 반도체를 포함하고, 이는 pH 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 또는 방법에 의한 증폭 산물의 생성은 pH를 변화시켜 유전 정보를 나타낸다.
일부 경우에, 검출 시스템은 신호 검출기를 포함한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 광자를 검출하는 광 검출기이다. 일부 경우에, 신호 검출기는 형광을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 화학 물질 또는 화합물을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 증폭 산물이 생성될 때 방출되는 화학 물질을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 증폭 산물이 검출 시스템에 첨가될 때 방출되는 화학 물질을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 증폭 산물이 생성될 때 생성되는 화합물을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 증폭 산물이 검출 시스템에 첨가될 때 생성되는 화합물을 검출한다.
일부 경우에, 신호 검출기는 전기 신호를 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 전극을 포함한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 회로 전류, 또는 전류 생성기를 포함한다. 일부 경우에, 회로 또는 전류는 둘 이상의 용액 또는 중합체의 구배에 의해 제공된다. 일부 경우에, 회로 또는 전류는 에너지원(예를 들어, 배터리, 휴대폰, 전기 콘센트로부터의 와이어)에 의해 제공된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 핵산, 증폭 산물, 화학 물질 또는 화합물은 전류를 차단함으로써 전기 신호를 제공하고 신호 검출기는 전기 신호를 검출한다.
일부 경우에, 신호 검출기는 광을 검출한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 광 센서를 포함한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 카메라를 포함한다. 일부 경우에, 신호 검출기는 휴대폰 카메라 또는 그 구성 요소를 포함한다.
일부 경우에, 신호 검출기는 핵산에서 상이한 염기의 전하를 검출하는 나노 와이어를 포함한다. 일부 경우에, 나노 와이어는 약 1 nm 내지 약 99 nm의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 나노 와이어는 약 1 nm 내지 약 999 nm의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 나노 와이어는 무기 분자, 예를 들어 니켈, 백금, 실리콘, 금, 아연, 그래핀, 또는 티타늄을 포함한다. 일부 경우에, 나노 와이어는 유기 분자(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함한다.
일부 경우에, 검출 시스템은 분석 어셈블리를 포함하며, 여기서 분석 어셈블리는 표적 분석물(예를 들어, 핵산 증폭 산물)을 검출할 수 있다. 일부 경우에, 분석 어셈블리는 본원 및 현장에서 측방 유동 분석, 측방 유동 검사 또는 측방 유동 장치라고도 하는 측방 유동 스트립을 포함한다. 일부 경우에, 측방 유동 분석법은 본원에 개시된 증폭 산물을 검출하기 위한 빠르고 저렴하며 기술적으로 간단한 방법을 제공한다. 일반적으로, 본원에 개시된 측방 유동 분석은 유체를 운반하는 다공성 재료 또는 다공성 매트릭스, 및 증폭 산물이 존재할 때 이를 검출하는 검출기를 포함한다. 다공성 재료는 다공성 종이, 중합체 구조, 소결된 중합체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 측방 유동 분석은 생물학적 유체 또는 이의 일부(예를 들어, 혈액 샘플의 혈장)를 운반한다. 일부 경우에, 측방 유동 분석은 생물학적 유체 또는 이의 일부를 함유하는 용액을 운반한다. 예를 들어, 방법은 샘플을 장치 또는 시스템에 첨가하기 전 또는 중에 생물학적 유체에 용액을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 용액은 측방 유동 분석을 통한 샘플 및/또는 증폭 산물의 운반을 용이하게 하는 염, 중합체, 또는 임의의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 측방 유동 스트립을 통해 이동한 후에 증폭된다.
일부 경우에, 장치, 검출 시스템은 측방 유동 장치를 포함하며, 여기서 측방 유동 장치는 다수의 섹터 또는 구역을 포함하고, 각각의 원하는 기능은 별도의 섹터 또는 구역에 존재할 수 있다. 일반적으로, 측방 유동 장치에서, 표적 분석물을 함유하는 액체 샘플, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 체액 샘플은 측방 유동 장치의 섹터 또는 구역을 통한 외부 힘의 도움을 받거나 받지 않고 이동한다. 일부 경우에, 표적 분석물은 외부 힘의 도움 없이, 예를 들어 모세관 작용에 의해 이동한다. 일부 경우에, 표적 분석물은 외부 힘의 도움으로, 예를 들어 측방 유동 장치의 이동에 의한 모세관 작용의 촉진에 의해 이동한다. 이동은 외부 입력, 예를 들어 진탕, 회전, 원심 분리, 전기장 또는 자기장의 적용, 펌프의 적용, 진공의 적용, 또는 측면 유동 장치의 요동에 의해 야기된 임의의 움직임을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 측방 유동 장치는 측방으로, 예를 들어 서로 뒤 또는 앞에 위치하는 구역 또는 섹터를 포함하는 측방 유동 검사 스트립이다. 일반적으로, 측방 유동 검사 스트립은 각 기능 구역 또는 섹터의 넓은 표면적의 노출 결과로서 검사 스트립의 각 면(예를 들어, 위와 아래)으로부터 기능 구역 또는 섹터의 접근성을 허용한다. 이는 샘플 정제 또는 표적 분석물 증폭, 및/또는 검출에 사용되는 것을 포함하여 시약의 첨가를 용이하게 한다.
당업자에게 공지된 임의의 적합한 측방 유동 검사 스트립 검출 포맷이 본 발명의 분석 어셈블리에 사용하기 위해 고려된다. 측방 유동 검사 스트립 검출 포맷은 널리 공지되어 있고 문헌에 기술되어 있다. 측방 유동 검사 스트립 분석 포맷은 일반적으로 예를 들어, 문헌[Sharma et al., (2015) Biosensors 5:577-601, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨]에 의해 기술되어 있다. 측면 유동 검사 스트립 샌드위치 분석 포맷을 사용하는 핵산의 검출은 예를 들어 미국 특허 제9,121,849호("Lateral Flow Assays," 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 측방 유동 검사 스트립 경쟁 분석 포맷을 사용하는 핵산의 검출은 예를 들어 미국 특허 제9,423, 399호("Lateral Flow Assays for Tagged Analytes," 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 경우에, 측방 유동 검사 스트립은 샌드위치 포맷, 경쟁 포맷, 또는 다중 검출 포맷을 사용하여 검사 샘플에서 표적 분석물을 검출한다. 전통적인 샌드위치 분석 포맷에서, 검출된 신호는 샘플에 존재하는 표적 분석물의 양에 정비례하므로, 표적 분석물의 양이 증가하면 신호 강도가 증가한다. 전통적인 경쟁 분석 형식에서, 검출된 신호는 존재하는 분석물의 양과 역의 관계를 가지며, 분석물의 양이 증가하면 신호 강도가 감소한다.
"샌드위치 분석"으로도 지칭되는 측방 유동 샌드위치 포맷에서, 검사 샘플은 전형적으로 검사 스트립의 한 단부에서 샘플 적용 패드에 적용된다. 적용된 검사 샘플은 검사 스트립을 통해 샘플 적용 패드로부터 샘플 적용 패드에 인접하여 위치한 컨쥬게이트 패드로 흐르며, 여기서 컨쥬게이트 패드는 샘플 유동 방향으로 하류에 있다. 일부 경우에, 컨쥬게이트 패드는 표지된 가역적으로 고정된 프로브, 예를 들어 염료, 효소, 또는 나노 입자로 표지된 항체 또는 앱타머를 포함한다. 표적 분석물이 검사 샘플에 존재하는 경우, 표지된 프로브-표적 분석물 복합체가 형성된다. 이어서, 이 복합체는 표적 분석물에 특이적인 고정된 제2 프로브를 포함하는 제1 검사 구역 또는 섹터(예를 들어, 검사 라인)로 흐르고, 이로써 임의의 표지된 프로브-표적 분석물 복합체를 포획한다. 일부 경우에, 제1 검사 구역 또는 섹터에서 신호, 예를 들어, 색상의 강도 또는 크기는 검사 샘플에서 표적 분석물의 존재 또는 부재, 양, 또는 존재 및 양을 나타내는데 사용된다. 제2 검사 구역 또는 섹터는 표지된 과도한 프로브에 결합하는 제 3 프로브를 포함할 수 있다. 적용된 검사 샘플이 표적 분석물을 포함하는 경우, 컨쥬게이트 패드 상의 표지된 프로브에 의해 표적 분석물을 포획한 후에 검사 스트립 상에 표지된 과량의 프로브가 존재하지 않을 것이다. 결과적으로, 제2 검사 구역 또는 섹터는 임의의 표지된 프로브에 결합하지 않을 것이고, 제2 검사 구역 또는 섹터에서의 신호(예를 들어, 색상)가 거의 또는 전혀 관찰되지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 제2 검사 구역 또는 섹터에서 신호가 없으면 제1 검사 구역 또는 섹터에서 관찰된 신호가 표적 분석물의 존재로 인한 것이라는 확신을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치 및 시스템은 샌드위치 분석법을 포함한다. 일부 경우에, 샌드위치 분석은 본원에 개시된 생물학적 샘플을 수용하고 샘플 성분(예를 들어, 핵산, 세포, 미세 입자)을 보유하도록 구성된다. 일부 경우에, 샌드위치 분석은 생물학적 샘플의 핵산을 뒤에 남기고 생물학적 샘플의 비-핵산 성분(예를 들어, 단백질, 세포, 미세 입자)을 플러시하는 유동 용액을 수용하도록 구성된다. 일부 경우에, 샌드위치 분석은 유동 용액이 적용될 때 핵산을 보유하는 것을 돕기 위해 핵산에 결합하는 막을 포함한다. 핵산에 결합하는 막의 비제한적 예는 키토산 개질된 니트로셀룰로오스를 포함한다.
유사하게, 측방 유동 경쟁 포맷에서, 검사 샘플은 검사 스트립의 한 단부에서 샘플 적용 패드에 적용되고, 표적 분석물은 표지된 프로브에 결합하여 샘플 적용 패드의 하류 컨쥬게이트 패드에서 프로브-표적 분석물 복합체를 형성한다. 경쟁 포맷에서, 제1 검사 구역 또는 섹터는 전형적으로 표적 분석물 또는 표적 분석물의 유사체를 포함한다. 제1 검사 구역 또는 섹터에서의 표적 분석물은 컨쥬게이트 패드에서 검사 분석물에 결합하지 않은 임의의 유리의 표지된 프로브에 결합한다. 따라서, 제1 검사 구역 또는 섹터에서 관찰되는 신호의 양은 표적 분석물이 존재할 때보다 적용된 검사 샘플에 표적 분석물이 없을 때 더 높다. 제2 검사 구역 또는 섹터는 프로브-표적 분석물 복합체에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함한다. 제2 검사 구역 또는 섹터에서 관찰되는 신호의 양은 표적 분석물이 적용된 검사 샘플에 존재할 때 더 높다.
측방 유동 검사 스트립 다중 검출 포맷에서, 하나 초과의 표적 분석물은 예를 들어 각각의 표적 분석물에 특이적인 프로브를 포함하는 추가 검사 구역 또는 섹터의 사용을 통해 검사 스트립을 사용하여 검출된다.
일부 경우에, 측방 유동 장치는 층상 측방 유동 장치이며, 내측에 예를 들어 서로 위 또는 아래에 위치한 층에 존재하는 구역 또는 섹터를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 구역 또는 섹터가 주어진 층에 존재한다. 일부 경우에, 각 구역 또는 섹터는 개별 층에 존재한다. 일부 경우에, 층은 다수의 구역 또는 섹터를 포함한다. 일부 경우에, 층은 적층된다. 층상 측방 유동 장치에서, 확산에 의해 제어되고 농도 구배에 의해 지시되는 공정이 가능한 구동력이다. 예를 들어, 샘플 액체에 함유된 분석물의 형광 분석 또는 형광 정량 분석을 위한 다층 분석 요소가 EP0097952호("Multilayer analytical element," 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
측방 유동 장치는 하나 이상의 기능 영역 또는 섹터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 검사 어셈블리는 1 내지 20개의 기능 구역 또는 섹터를 포함한다. 일부 경우에, 기능 구역 또는 섹터는 적어도 하나의 샘플 정제 구역 또는 섹터, 적어도 하나의 표적 분석물 증폭 구역 또는 섹터, 적어도 하나의 표적 분석물 검출 구역 또는 섹터, 및 적어도 하나의 표적 분석물 검출 구역 또는 섹터를 포함한다.
일부 경우에, 표적 분석물은 핵산 서열이고, 측방 유동 장치는 핵산 측방 유동 분석이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산 측방 유동 분석을 포함하며, 여기서 핵산 측방 유동 분석은 핵산 증폭 기능을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 증폭 기능에 의해 수행되는 표적 핵산 증폭은 증폭된 핵산 종의 검출 전에 또는 이와 동시에 일어난다. 일부 경우에, 검출은 표적 분석물의 존재에 대한 정성적, 반정량적 또는 정량적 검출 중 하나 이상을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 표적 핵산 분석물이 측방 유동 검사 스트립에서 증폭되어 표지된 증폭 산물, 또는 증폭 후 표지될 수 있는 증폭 산물을 생성하는 분석 어셈블리를 포함한다. 일부 경우에, 표지는 하나 이상의 증폭 프라이머에 존재하거나, 이어서 증폭 후 하나 이상의 증폭 프라이머에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 표적 핵산 증폭 산물은 측방 유동 검사 스트립에서 검출된다. 예를 들어, 측방 유동 검사 스트립 상의 하나 이상의 구역 또는 섹터는 표적 핵산 증폭 산물에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 검출기를 포함하며, 여기서 검출기는 그래핀 바이오 센서를 포함한다. 그래핀 바이오 센서는 예를 들어 문헌[Afsahi et al., 논문 명칭, "Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection, Biosensor and Bioelectronics, " (2018) 100:85-88]에 의해 기술되어 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 검출기는 나노포어, 나노 센서, 또는 나노 스위치를 포함한다. 예를 들어, 검출기는 나노포어 서열 분석, 막을 가로지르는 전류에 기초하여 나노포어를 통해 핵산을 운반하는 방법인 나노포어 서열 분석이 가능할 수 있으며, 검출기는 특정 뉴클레오티드에 상응하는 전류의 차단을 측정한다. 나노 스위치 또는 나노 센서는 검출 가능한 신호에 노출되면 구조적 변화를 겪는다. 예를 들어, 문헌[Koussa et al., "DNA nanoswitches: A quantitative platform for gel-based biomolecular interaction analysis, " (2015) Nature Methods, 12(2): 123-126]을 참조한다.
일부 경우에, 검출기는 실시간 검출에 사용되는 칩에서 관심의 분석물에 대한 프로브가 생성되는 신속한 다중 바이오 마커 분석법을 포함한다. 따라서 태그, 표지 또는 리포터가 필요하지 않다. 이들 프로브에 분석물의 결합은 분석물의 농도에 상응하는 굴절률의 변화를 야기한다. 모든 단계는 자동화될 수 있다. 인큐베이션이 필요하지 않을 수 있다. 1시간 내(예를 들어, 10-30분)에 결과를 얻을 수 있다. 이러한 검출기의 비제한적인 예는 Genalyte Maverick 검출 시스템이다.
추가 검사
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산 이외의 생물학적 성분의 검출 또는 분석을 위한 추가의 특징, 시약, 검사 또는 분석을 포함한다. 비제한적인 예로서, 생물학적 성분은 펩티드, 지질, 지방산, 스테롤, 탄수화물, 바이러스 성분, 미생물 성분, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 생물학적 성분은 항체일 수 있다. 생물학적 성분은 피험체에서 펩티드에 반응하여 생성된 항체일 수 있다. 이들 추가 분석은 본원에 그리고 전체에 걸쳐 개시된 작은 용량 또는 샘플 크기로 생물학적 성분의 검출 또는 분석이 가능할 수 있다. 추가 검사는 관심의 생물학적 성분과 상호 작용할 수 있는 시약을 포함할 수 있다. 이러한 시약의 비제한적인 예는 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 및 소분자, 및 이들의 조합을 포함한다. 시약은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 시약은 검출 가능한 표지과 상호 작용이 가능할 수 있다. 시약은 검출 가능한 신호의 제공이 가능할 수 있다.
추가 검사에는 하나 이상의 항체가 필요할 수 있다. 예를 들어, 추가 검사는 면역 PCR(IPCR:Immuno-PCR) 수행을 가능하게 하는 시약 또는 성분을 포함할 수 있다. IPCR은 관심의 단백질에 대한 제1 항체가 고정되어 샘플에 노출되는 방법이다. 샘플에 관심의 단백질이 함유되어 있으면 제1 항체에 의해 포획될 것이다. 이어서, 포획된 관심의 단백질은 관심의 단백질에 결합하는 제2 항체에 노출된다. 제2 항체는 실시간 PCR에 의해 검출될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 커플링되었다. 대안적으로 또는 추가로, 추가의 검사는 근접 결찰 분석(PLA) 수행을 가능하게 하는 시약 또는 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 샘플은 관심의 단백질에 특이적인 2개의 항체에 노출되며, 각각의 항체는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 두 항체 모두가 관심의 단백질에 결합하는 경우, 각 항체의 올리고뉴클레오티드는 증폭 및/또는 검출되기에 충분히 가까울 것이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 피험체가 임신을 확인하기 위한 임신 검사를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 Y 염색체의 존재 또는 Y 염색체의 부재에 대한 검사(성별 검사)를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 임신 나이(gestational age)에 대한 검사를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 다태임신, 예를 들어 쌍둥이 또는 세쌍둥이에 대한 검사를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 모체 샘플에서 태아 핵산의 총량, 및 다양한 오토솜, X 및 Y 염색체로 표시되는 서열의 양을 정량화(절대 또는 상대)하여, 태아 중 하나 또는 둘 다 또는 모든 태아가 남아 또는 여아인지, 정배수체 또는 이수체인 지 등을 검출한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 피험체가 임신함을 나타내거나, 검출하거나 확인하기 위한 임신 검사를 포함한다. 일부 경우에, 임신 검사는 임신 관련 인자를 측정하기 위한 시약 또는 성분을 포함한다. 비제한적인 예로서, 임신 관련 인자는 인간 융모성 생식선 자극 호르몬 단백질(hCG) 및 항-hCG 항체를 포함하는 hCG의 시약 또는 성분일 수 있다. 또한, 비제한적인 예로서, 임신 관련 인자는 hCG 전사체일 수 있고, hCG 전사체를 측정하기 위한 시약 또는 성분은 hCG 전사체에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머이다. 일부 경우에, 임신 관련 인자는 열 충격 단백질 10 kDa 단백질 1이며, 조기 임신 인자(EPF: early-pregnancy factor)로도 알려져 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 태아의 나이를 전달할 수 있다. 예를 들어, 신호는 장치 또는 시스템에서 생성될 수 있으며, 여기서 신호의 수준은 피험체의 샘플에서 hCG의 양에 해당한다. 이 신호 수준 또는 강도는 샘플에서 hCG의 양을 나타내는 수치로 변형되거나 변환될 수 있다. hCG의 양은 태아의 대략적인 나이를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 임신의 표시 또는 검증, 임신 나이의 표시 또는 검증, 및 성별의 표시 또는 검증을 제공한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 90% 신뢰도(예를 들어, 시간의 90%, 표시가 정확함)로 임신, 임신 나이 및/또는 성별의 표시를 제공한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 임신, 임신 나이 및/또는 성별을 적어도 약 95% 신뢰도로 나타낸다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 임신, 임신 나이 및/또는 성별을 적어도 약 99%의 신뢰도로 나타낸다.
성능 매개 변수
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 하나 이상의 온도에서 작동할 수 있다. 일부 경우에, 장치 시스템 또는 키트이 작동 가능하게 하기 위해 장치 시스템 또는 키트의 구성 요소 또는 시약의 온도를 변경해야 한다. 일반적으로, 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플에서 바이오 마커(예를 들어, RNA/DNA, 펩티드)에 의해 전달되는 정보를 제공할 수 있을 때 "작동 가능"한 것으로 간주된다. 일부 경우에, 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소, 또는 이의 시약이 작동 가능한 온도는 일반적인 가정에서 얻는다. 비제한적인 예로서, 일반적인 가정에서 얻는 온도(들)는 실온, 냉장고, 냉동고, 전자레인지, 스토브, 전기 포트, 냉온수 조, 또는 오븐에 의해 제공될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소, 또는 이의 시약은 단일 온도에서 작동될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소, 또는 이의 시약은 작동하기 위해 단일 온도만을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소, 또는 이의 시약은 작동하기 위해서 단지 2개의 온도만을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소 또는 이의 시약은 작동하기 위해서 3개의 온도만을 필요로 한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트는 사용자가 적어도 하나의 온도를 얻을 수 있게 하는 가열 장치 또는 냉각 장치를 포함한다. 가열 장치 및 냉각 장치의 비제한적인 예는 냉장고 또는 냉동고에서 냉각될 수 있거나, 마이크로웨이브되거나 스토브 탑에서 비등되거나, 전기 소켓에 꽂힌 후 본원에 개시된 장치 또는 그 구성 요소에 적용될 수 있는 재료의 파우치 또는 백이며, 이로써 장치 또는 이의 구성 요소에 열을 전달하거나 장치를 냉각시킨다. 가열 장치의 다른 비제한적인 예는 장치 또는 이의 일부를 통과하는 전선 또는 전기 코일이다. 전선 또는 코일은 장치 또는 이의 일부로 열을 전달하기 위해 외부(예를 들어, 태양열, 콘센트) 또는 내부(예를 들어, 배터리, 휴대폰) 전력에 의해 활성화될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트는 사용자가 온도 범위 내의 온도를 평가하는 것을 돕도록 온도계 또는 온도 표시기를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 사용자는 온도를 평가하기 위해 전형적인 가정환경에서 장치(예를 들어, 온도계, 휴대폰 등)를 사용한다.
일부 경우에, 장치, 시스템, 키트, 이의 구성 요소 또는 이의 시약은 일정 온도 범위 또는 일정 온도 범위 내에 있는 적어도 하나의 온도에서 작동할 수 있다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 20℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 -50℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 20℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 10℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 100℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 90℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 80℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 70℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 60℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 50℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 40℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 15℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 온도 범위는 약 10℃ 내지 약 30℃이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트, 이의 모든 구성 요소 및 이의 모든 시약은 냉각, 냉동 또는 가열을 요구하지 않고 실온에서 완전히 작동 가능하다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플을 수용하는 시간 범위 내에서 생물학적 샘플 또는 이의 산물(예를 들어, 증폭 산물, 컨쥬게이션 산물, 결합 산물)의 성분을 검출한다. 일부 경우에, 검출은 본원에 기재된 신호 전달 분자를 통해 일어난다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1초 내지 약 1분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 1분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 1분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 1분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 2분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 3분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 5분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 10분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 15분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 10초 내지 약 20분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 2분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 5분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 10분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 15분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 20분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30초 내지 약 30분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 2분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 3분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 5분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 10분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 20분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1분 내지 약 30분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 5분 내지 약 10분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 5분 내지 약 15분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 5분 내지 약 20분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 5분 내지 약 30분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 5분 내지 약 60분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30분 내지 약 60분이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 30분 내지 약 2시간이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1시간 내지 약 2시간이다. 일부 경우에, 시간 범위는 약 1시간 내지 약 4시간이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생물학적 샘플의 성분 또는 이의 산물(예를 들어, 증폭 산물, 컨쥬게이션 산물, 결합 산물)을 주어진 시간 내로 검출한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 주어진 시간 내에 생물학적 샘플 또는 이의 산물의 성분을 분석한다. 일부 경우에, 시간은 1분 미만이다. 일부 경우에, 시간은 5분 미만이다. 일부 경우에, 시간은 10분 미만이다. 일부 경우에, 시간은 15분이다. 일부 경우에, 시간은 20분 미만이다. 일부 경우에, 시간은 30분 미만이다. 일부 경우에, 시간은 60분 미만이다. 일부 경우에, 시간이 2시간 미만이다. 일부 경우에, 시간은 8시간 미만이다.
통신 및 정보 저장
일반적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 핵산 정보 출력을 포함한다. 핵산 정보 출력은 샘플로부터 사용자에게 유전 정보를 전달하도록 구성된다. 일부 경우에, 핵산 정보 출력은 획득된 유전 정보가 물리적으로 존재하지 않는 다른 사람(예를 들어, 가족 구성원, 의사, 또는 유전자 상담자)과 공유될 수 있도록 통신 연결 또는 인터페이스를 포함한다. 통신 연결 또는 인터페이스는 다른 공급원로부터의 입력을 허용할 수도 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 획득된 유전 정보에 기초하여 정보를 수신하기 위한 인터페이스를 포함한다. 인터페이스 또는 통신 연결은 또한 사용자로부터 비유전 정보(예를 들어, 병력, 질병, 연령, 체중, 심박수, 혈압, 신체 활동 등)를 수신할 수 있다. 인터페이스 또는 통신 연결은 또한 사용자 이외의 누군가 또는 다른 것에 의해 제공되는 정보를 수신할 수 있다. 비제한적인 예로서, 여기에는 웹 기반 정보, 의사로부터의 정보, 및 보험 회사로부터의 정보가 포함된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 획득된 유전 정보에 기초하여 정보를 전달하기 위한 인터페이스를 포함한다. 일부 경우에, 인터페이스는 유전적 또는 염색체 이상에 대한 설명을 제공한다. 일부 경우에, 인터페이스는 유전적 또는 염색체 이상이 있는 아동의 가족을 지원하는 의사, 지원 그룹, 상점 및 서비스 제공업체와 같은 지역 연락처 목록을 제공한다. 일부 경우에, 인터페이스는 유전적 또는 염색체 이상이 있는 어린이에게 유용한 제품 또는 서비스의 온라인 목록을 제공한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 정보 저장 유닛, 예를 들어 컴퓨터 칩을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 유전 정보를 안전하게 저장하는 수단을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 하드 드라이브, 서버, 데이터베이스 또는 클라우드에 대한 연결(유선 또는 무선) 또는 데이터 칩을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 장치 및 시스템을 위한 인터페이스의 비제한적인 예가 [도 4b] 및 [도 5a-e]에 도시되어 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 사용자로부터 정보를 안전한 방식으로 수집, 암호화, 및/또는 저장할 수 있다. 이러한 정보의 비제한적인 예에는 건강 정보, 웨어러블 정보, 그들이 수행했거나 수행할 다른 검사, 인구 통계 정보 등이 포함된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 생체 샘플의 바이오 마커에 대한 정보를 통신 장치에 전달할 수 있다. 일부 경우에, 통신 장치는 인터넷에 연결될 수 있다(예를 들어, 포트 또는 무선 연결을 통해). 일부 경우에, 통신 장치는 인터넷에 연결된다. 일부 경우에, 통신 장치는 인터넷에 연결되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 통신 장치를 통해 생체 샘플의 바이오 마커에 대한 정보를 인터넷으로 전달할 수 있다. 통신 장치의 비제한적인 예는 휴대폰, 전자 노트패드, 및 컴퓨터이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 통신 연결 또는 통신 인터페이스를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 통신 인터페이스는 유선 인터페이스를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 유선 통신 인터페이스는 범용 직렬 버스(USB: Universal Serial Bus)(미니 USB, 마이크로 USB, USB 타입 A, USB 타입 B 및 USB 타입 C 포함), IEEE 1394(FireWire), 썬더볼트(Thunderbolt), 이더넷 및 광학 인터커넥트를 이용한다.
일부 실시 양태에서, 통신 인터페이스는 무선 인터페이스를 제공한다. 예를 들어, [도 5a-e]를 참조한다. 다른 실시 양태에서, 무선 통신 인터페이스는 적외선, 근거리 통신(NFC: near-field communications)(RFID 포함), 블루투스, 저전력 블루투스(BLE: Bluetooth Low Energy), 지그비(ZigBee), ANT, IEEE 802.11(와이파이), 무선 근거리 통신망(WLAN: Wireless Local Area Network), 개인 무선 통신망(WPAN Wireless Personal Area Network), 무선 광역 통신망(WWAN: Wireless Wide Area Network), WiMAX, IEEE 802.16(Worldwide Interoperability for Microwave Access(WiMAX)) 또는 3G/4G/LTE/5G 셀룰러 통신 방법과 같은 무선 통신 프로토콜을 이용한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 디지털 처리 장치, 또는 이의 용도를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 장치의 기능을 수행하는 하나 이상의 하드웨어 중앙 처리 장치(CPU) 또는 범용 그래픽 처리 장치(GPGPU)를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체제를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 하나 이상의 주변 장치, 하나 이상의 별개의 디지털 처리 장치, 하나 이상의 컴퓨팅 시스템, 하나 이상의 컴퓨터 네트워크, 및/또는 하나 이상의 통신 네트워크와 통신하기 위한 통신 인터페이스(예를 들어, 네트워크 어댑터)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크("네트워크")에 통신 가능하게 연결된다. 적합한 네트워크에는 개인 통신망(PAN: Personal Area Network), 근거리 통신망(LAN: Local Area Network), 광역 통신망(WAN: Wide Area Network), 인트라넷, 엑스트라넷, 인터넷(월드 와이드 웹(World Wide Web)에 대한 액세스 제공) 및 이들의 조합이 포함된다. 일부 경우에, 네트워크는 텔레커뮤니케이션 및/또는 데이터 네트워크이다. 다양한 경우에, 네트워크는 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산형 컴퓨팅을 가능하게 하는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함한다. 네트워크는 일부 경우에 장치의 도움으로 피어투피어 네트워크(peer-to-peer network)를 구현하여 장치에 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로 작동할 수 있도록 한다.
본원의 설명에 따르면, 적합한 디지털 처리 장치는 비제한적 예로서, 서버 컴퓨터, 데스크 탑 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 노트북 컴퓨터, 서브 노트북 컴퓨터, 넷 북 컴퓨터, 넷 패드 컴퓨터, 셋톱 컴퓨터, 미디어 스트리밍 장치, 핸드헬드 컴퓨터, 인터넷 어플라이언스, 피트니스 트래커, 스마트 시계, 모바일 스마트폰, 태블릿 컴퓨터 및 개인 디지털 비서를 포함한다. 당업자는 많은 스마트폰이 본 명세서에 기술된 시스템에 사용하기에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 선택적인 컴퓨터 네트워크 연결성을 갖는 선택된 텔레비전, 비디오 플레이어, 및 디지털 음악 플레이어가 본원에 기술된 시스템에서 사용하기에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 적합한 태블릿 컴퓨터는 당업자에게 알려진 소책자, 슬레이트, 및 컨버터블 구성을 갖는 것들을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 실행 가능한 명령을 수행하도록 구성된 운영 체제를 포함한다. 예를 들어 운영 체제는 장치의 하드웨어를 관리하고 응용 프로그램 실행을 위한 서비스를 제공하는 프로그램 및 데이터를 포함한 소프트웨어이다. 당업자는 적합한 서버 운영 체제가 비제한적 예로서, FreeBSD, OpenBSD, NetBSD®, Linux, Apple® Mac OS X Server®, Oracle® Solaris®, Windows Server®, 및 Novell® NetWare®을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 적합한 개인용 컴퓨터 운영 체제가 비제한적 예로서, Microsoft® Windows®, Apple® Mac OS X®, UNIX®, 및 UNIX 유사 운영 체제, 예컨대 GNU/Linux®를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시 양태에서, 운영 체제는 클라우드 컴퓨팅에 의해 제공된다. 당업자는 또한 적합한 모바일 스마트폰 운영 체제가 비제한적 예로서, Nokia® Symbian® OS, Apple® iOS®, Research In Motion® BlackBerry OS®, Google® Android®, Microsoft® Windows Phone® OS, Microsoft® Windows Mobile® OS, Linux®, 및 Palm® WebOS®을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 적합한 미디어 스트리밍 장치 운영 체제가 비제한적인 예로서, Apple TV®, Roku®, Boxee®, Google TV®, Google Chromecast®, Amazon Fire®, 및 Samsung® HomeSync®을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 일부 경우에, 운영 체제는 사물 인터넷(IoT: Internet of Things) 장치를 포함한다. IoT 장치의 비제한적인 예로는 Amazon의 Alexa®, Microsoft의 Cortana®, Apple Home Pod®, 및 Google Speaker®를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 가상현실 및/또는 증강 현실 시스템을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 저장 및/또는 메모리 장치를 포함한다. 저장 및/또는 메모리 장치는 데이터 또는 프로그램을 일시적 또는 영구적으로 저장하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 장치이다. 일부 실시 양태에서, 장치는 휘발성 메모리이고 저장된 정보를 유지하기 위해 전력을 필요로 한다. 일부 실시 양태에서, 장치는 비휘발성 메모리이고, 디지털 처리 장치에 전력이 공급되지 않을 때 저장된 정보를 유지한다. 다른 실시 양태에서, 비휘발성 메모리는 플래시 메모리를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비휘발성 메모리는 동적 임의 접근 메모리(DRAM: Dynamic random-access memory)를 포함한다. 일부 실시 양태서, 비휘발성 메모리는 강유전체 임의 접근 메모리(FRAM: ferroelectric random access memory)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비휘발성 메모리는 위상 변화 임의 접근 메모리(PRAM: phase-change random access memory)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 장치는 비제한적인 예로서, CD-ROM, DVD, 플래시 메모리 장치, 자기 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광디스크 드라이브, 및 클라우드 컴퓨팅 기반 저장소를 포함하는 저장 장치이다. 다른 실시 양태에서, 저장 및/또는 메모리 장치는 본원에 개시된 것과 같은 장치들의 조합이다.
일부 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 시각 정보를 사용자에게 전송하기 위한 디스플레이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 디스플레이는 액정 디스플레이(LCD: liquid crystal display)이다. 다른 실시 양태에서, 디스플레이는 박막 트랜지스터 액정 디스플레이(TFT-LCD: thin film transistor LCD)이다. 일부 실시 양태에서, 디스플레이는 유기 발광 다이오드(OLED: organic light emitting diode) 디스플레이이다. 다양한 추가 실시 양태에서, OLED 디스플레이에는 수동 매트릭스 OLED(PMOLED: Passive-Matrix OLED) 또는 능동 매트릭스 OLED(AMOLED: Active-Matrix OLED) 디스플레이가 있다. 일부 실시 양태에서, 디스플레이는 플라스마 디스플레이이다. 다른 실시 양태에서, 디스플레이는 비디오 프로젝터이다. 또 다른 실시 양태에서, 디스플레이는 VR 헤드셋과 같은 디지털 처리 장치와 통신하는 헤드 마운트형 디스플레이이다.
일부 실시 양태에서, 디지털 처리 장치는 사용자로부터 정보를 수신하기 위한 입력 장치를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 입력 장치는 키보드이다. 일부 실시 양태에서, 입력 장치는 비제한적 예로서, 마우스, 트랙볼, 트랙 패드, 조이스틱, 게임 컨트롤러, 또는 스타일러스를 포함하는 포인팅 장치이다. 일부 실시 양태에서, 입력 장치는 터치 스크린 또는 멀티 터치 스크린이다. 다른 실시 양태에서, 입력 장치는 음성 또는 다른 사운드 입력을 포획하기 위한 마이크로폰이다. 다른 실시 양태에서, 입력 장치는 움직임 또는 시각적 입력을 포획하기 위한 비디오카메라 또는 다른 센서이다. 다른 실시 양태에서, 입력 장치는 키넥트(Kinect), 립모션(Leap Motion) 등이다. 또 다른 실시 양태에서, 입력 장치는 본원에 개시된 장치와 같은 장치의 조합이다.
모바일 애플리케이션
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 디지털 처리 장치, 또는 이의 용도를 포함하며, 여기서 디지털 처리 장치에는 모바일 애플리케이션 형태의 실행 가능한 명령이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 그것이 제작될 때 모바일 디지털 처리 장치에 제공된다. 다른 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 본원에 기재된 컴퓨터 네트워크를 통해 모바일 디지털 처리 장치에 제공된다. 본원에 개시된 모바일 애플리케이션은 정보를 찾고, 암호화하고, 인덱싱하고/거나 액세스하도록 구성될 수 있다. 본원에 개시된 모바일 애플리케이션은 데이터를 획득, 암호화, 생성, 조작, 인덱싱, 및 열람하도록 구성될 수 있다.
[도 5a]를 참조하면, 특정 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트로부터의 유전 정보 및 다른 정보와 연결하고, 통신하고 이들을 수신하도록 구성된다. [도 5a]는 모바일 애플리케이션이 임의로 사용자에게 제공하는 다양한 기능을 도시하는 도면이다. 이 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 임의로 1) 개인 정보 및 사용자의 선호도에 기초하여 개인화된 맞춤형 사용자 경험(UX); 2) 사용자에게 장치, 시스템 및 키트를 활용하는 방법을 알려주는 대화형 텍스트, 오디오 및/또는 비디오 중심의 교육 경험; 3) 사용자에게 기사, 뉴스, 미디어, 게임 등에 대한 액세스를 제공하는 콘텐츠 플랫폼; 및 4) 정보, 검사 결과, 및 이벤트를 추적하고 공유하기 위한 도구를 제공한다.
[도 5b]를 참조하면, 특정 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 임의로 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 사용을 통해 사용자를 안내하기 위한 단계별 워크스루(walkthrough)를 제공하는 대화형 인터페이스를 포함한다. 다양한 실시 양태에서, 대화형 워크스루는 사용자에게 알리고 지시하기 위해 텍스트, 이미지, 애니메이션, 오디오, 비디오 등을 포함한다.
[도 5c]를 참조하면, 특정 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 사용자가 본원에 개시된 모바일 애플리케이션 기능에 액세스할 수 있게 하는 홈 스크린을 임의로 포함한다. 이 실시 양태에서, 홈 스크린은 개별화된 인사말뿐 아니라, 사용자가 검사를 시작하고, 현재 및 과거 검사 결과를 보고, 검사 결과를 공유하며, 더 큰 사용자 커뮤니티와 상호 작용할 수 있게 하는 인터페이스 요소를 포함한다.
[도 5d]를 참조하면, 특정 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 본원에 개시된 장치, 시스템 또는 키트에 연결하기 위한 프로세스의 상태를 사용자에게 알리는 진행도를 임의로 포함한다. 이 실시 양태에서, 다이어그램은 모든 단계를 보여주고 현재 단계를 표시한다. 단계는 1) 예를 들어 블루투스를 통해 장치와 페어링하는 단계; 2) 장치에서 샘플을 검출하는 단계, 및 3) 샘플이 처리될 때까지 기다리는 단계이다. 일부 실시 양태에서, 다이어그램은 대화형, 애니메이션화 또는 미디어 또는 다른 콘텐츠로 증강된다.
[도 5e]를 참조하면, 특정 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 사용자가 검사 결과를 공유하기 위해 피처에 액세스할 수 있게 하는 소셜 공유 스크린을 임의로 포함한다. 많은 서비스, 플랫폼 및 네트워크는 검사 결과 및 기타 정보 및 이벤트를 공유하기에 적합하다. 적합한 소셜 네트워킹 및 공유 플랫폼에는 비제한적인 예로서 Facebook, YouTube, Twitter, LinkedIn, Pinterest, Google Plus+, Tumblr, Instagram, Reddit, VK, Snapchat, Flickr, Vine, Meetup, Ask.fm, Classmates, QQ, WeChat, Swarm by Foursquare, Kik, Yik Yak, Shots, Periscope, Medium, Soundcloud, Tinder, WhatsApp, Snap Chat, Slack, Musical.ly, Peach, Blab, Renren, Sina Weibo, Renren, Line, 및 Momo가 포함된다. 일부 실시 양태서, 검사 결과는 SMS, MMS, 또는 인스턴트 메시지에 의해 공유된다. 일부 실시 양태에서, 검사 결과는 이메일로 공유된다.
일부 실시 양태에서, 모바일 애플리케이션은 사용자가 임의로 공유되는 검사 결과와 관련된 중요 정보 및 이벤트의 블로그 및 타임 라인과 같은 추가 피처에 액세스할 수 있게 하는 홈 스크린을 임의로 포함한다. 다양한 실시 양태에서, 적합한 정보 및 이벤트는 임상 검사 결과, 새로 시판된 치료제, 영양, 운동, 태아 발달, 건강 등에 관한 것들을 포함한다. 이 실시 양태에서, 홈 스크린은 사용자 선호도 및 설정에 대한 액세스를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치 및 시스템은 모바일 애플리케이션과 통신한다. 모바일 애플리케이션은 환자 ID 및 전자 건강 기록(EHR: electronic health record)을 획득하고, (사용자에게 및/또는 사용자로부터) 장치 배송을 계획하고, 검사 결과의 온라인 주문을 가능하게 할 수 있다. 모바일 애플리케이션은 장치 또는 이의 일부(예를 들어, 배송/보관 구획), 또는 장치로 획득된 정보를 한 지점에서 다른 지점으로 추적하는 것을 가능하게 할 수 있다. 배송, 가정, 샘플 처리 실험실 및 의사 사무실로부터 다양한 지점이 선택될 수 있다.
본원에 제공된 개시 내용의 관점에서, 모바일 애플리케이션은 당업자에게 공지된 하드웨어, 언어, 및 개발 환경을 이용하여 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성된다. 당업자는 모바일 애플리케이션이 여러 언어로 작성되었음을 인식할 것이다. 적합한 프로그래밍 언어는 비제한적 예로서 C, C++, C#, Objective-C, Java™, Javascript, Pascal, Object Pascal, Python™, Ruby, VB.NET, WML, 및 XHTML/HTML(CSS 이용하거나 이용하지 않음), 또는 이들의 조합을 포함한다.
적합한 모바일 애플리케이션 개발 환경은 몇몇 소스로부터 이용 가능하다. 상업적으로 이용 가능한 개발 환경에는 비제한적인 예로서 AirplaySDK, alcheMo, Appcelerator®, Celsius, Bedrock, Flash Lite, .NET Compact Framework, Rhomobile, 및 WorkLight Mobile Platform이 포함된다. 비제한적인 예로서, Lazarus, MobiFlex, MoSync, 및 Phonegap을 포함한 다른 개발 환경이 비용 없이 이용 가능하다. 또한, 모바일 장치 제조자는 비제한적 예로서 iPhone 및 iPad(iOS) SDK, Androi™ SDK, BlackBerry® SDK, BREW SDK, Palm® OS SDK, Symbian SDK, webOS SDK, 및 Windows® Mobile SDK를 포함하는 소프트웨어 개발자 키트를 배포한다.
당업자는 비제한적인 예로서, Apple® App Store, Google® Play, Chrome WebStore, BlackBerry® App World, Palm 장치용 App Store, webOS용 App Catalog, 모바일용 Windows® Marketplace, Nokia® 장치용 Ovi Store, 및 Samsung® App을 포함하여 몇몇 상용 포럼이 모바일 애플리케이션의 배포를 위해 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
장치, 시스템, 키트 및 방법과 관련된 양태
다음의 측면은 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 일반적으로 여성 피험체의 생물학적 샘플에서 무세포 핵산을 처리하고 분석하도록 설계된다. 무세포 핵산, 생물학적 샘플 및 피험체에 대한 하기 설명은 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법의 유용성을 이해하는데 도움을 줄 수 있다.
질환 및 병태
피험체에서 질환 또는 병태의 존재, 부재, 또는 중증도를 검출하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 질환 또는 병태는 유전적 돌연변이에 기인한다. 유전적 돌연변이는 유전될 수 있다(예를 들어, 돌연변이는 조상 또는 친척에 존재하였음). 유전적 돌연변이는 자발적 돌연변이일 수 있다(예를 들어, DNA 복제 또는 수복에서의 오류). 유전적 돌연변이는 환경적 요인(예를 들어, 자외선, 발암 물질)에 대한 노출에 기인할 수 있다. 비제한적인 예로서, 유전적 돌연변이는 프레임 시프트 돌연변이, 삽입 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 복제본 수 변이, 및 염색체 전위로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 환경적 요인(예를 들어, 발암 물질, 식이, 스트레스, 병원체)에 기인한다. 일부 경우에, 환경적 요인이 유전적 돌연변이를 일으킨다. 다른 경우에, 환경적 요인은 유전적 돌연변이를 유발하지 않는다. 일부 경우에, 환경적 요인은 건강한 개인에 비해 피험체에서 하나 이상의 후성 유전적 변형에서 변화를 일으킨다. 일부 경우에, 환경적 요인은 초기 시점에서 피험체에 비해 피험체에서 하나 이상의 후성 유전적 변형에서의 변화를 일으킨다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 하나 이상의 조직, 기관 또는 세포 유형에 영향을 미치는 질환 또는 병태를 검출 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다. 질환 또는 병태는 하나 이상의 조직, 기관 또는 세포 유형으로부터 핵산의 방출을 야기할 수 있다. 질환 또는 병태는 건강한 개체에서 발생하는 상응하는 방출에 비해 하나 이상의 조직, 기관 또는 세포 유형으로부터 핵산의 방출을 증가시킬 수 있다. 조직은 상피, 결합, 근육, 또는 신경 조직으로 분류될 수 있다. 조직의 비제한적인 예는 지방, 근육, 결합 조직, 유방 조직, 및 골수이다. 기관의 비제한적인 예는 뇌, 흉선, 갑상선, 폐, 심장, 비장, 간, 신장, 췌장, 위, 소장, 대장, 결장, 전립선, 난소, 자궁, 및 방광이다. 세포 유형의 비제한적 예는 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 심근 세포, 간세포, 췌장 베타 세포, 지방 세포, 뉴런, 자궁 내막 세포, 면역 세포(T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 쿠퍼 세포, 미세아교 세포)이다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 일반적인 건강을 검출 또는 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 건강을 검출 또는 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 장기 이식 수여자의 건강 및/또는 이식된 기관의 건강을 검출 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
질환 또는 병태는 비정상적인 세포 성장 또는 증식을 포함할 수 있다. 질환 또는 병태는 백혈병을 포함할 수 있다. 비제한적 유형의 백혈병에는 급성 림프모구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL: hronic lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(AML: acute myelogenous leukemia), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia) 및 털세포 백혈병(HCL: hairy cell leukemia)이 포함된다. 질환 또는 병태는 림프종을 포함할 수 있다. 림프종은 비호지킨 림프종(예를 들어, B 세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, T 세포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린 혈증), 또는 호지킨 림프종일 수 있다. 질환 또는 병태는 암을 포함할 수 있다. 암은 유방암일 수 있다. 암은 폐암일 수 있다. 암은 식도암일 수 있다. 암은 췌장암일 수 있다. 암은 난소암일 수 있다. 암은 자궁암일 수 있다. 암은 자궁 경부암일 수 있다. 암은 고환암일 수 있다. 암은 전립선암일 수 있다. 암은 방광암일 수 있다. 암은 결장암일 수 있다. 암은 육종일 수 있다. 암은 선암종일 수 있다. 암은 고립될 수 있는데, 즉 암이 유래한 기관 또는 조직 이외의 다른 조직으로 퍼지지 않았다. 암은 전이성일 수 있다. 암이 주변 조직으로 퍼졌을 수 있다. 암은 암이 유래한 기관 또는 조직과 물리적으로 접촉한 세포, 조직 또는 기관으로 퍼졌을 수 있다. 암은 암이 유래한 기관 또는 조직과 물리적으로 접촉하지 않는 세포, 조직 또는 기관으로 퍼졌을 수 있다. 암은 단계 0(암이 될 가능성이 있는 비정상 세포) 또는 단계 1(작고 하나의 조직에 국한됨)과 같은 초기 단계일 수 있다. 암은 원래 종양의 조직과 물리적으로 접촉하여 조직 및 림프절로 성장된 단계 2 또는 단계 3과 같은 중간 단계일 수 있다. 암은 단계 4 또는 단계 5와 같이 진행될 수 있으며, 여기서 암은 원래 종양의 조직에 먼(예를 들어, 인접하거나 물리적으로 접촉하지 않는) 조직으로 전이된다. 일부 경우에, 암은 진행되지 않는다. 일부 경우에, 암은 전이성이 아니다. 일부 경우에는 암은 전이성이다.
질환 또는 병태는 자가 면역 장애를 포함할 수 있다. 자가 면역 및 면역 장애는 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 다발성 경화증, 루푸스, 염증성 장 질환, 애디슨병, 그레이브스병, 크론병 및 셀리악병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
질환 또는 병태는 대사 장애를 포함할 수 있다. 대사성 병태 및 질환은 비만, 갑상선 장애, 고혈압, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비알코올성 지방 간염, 관상 동맥 질환 및 죽상 동맥 경화증을 포함지만, 이에 제한되지는 않는다.
질환 또는 상태는 심혈관 질환을 포함할 수 있다. 심혈관 질환의 비제한적인 예는 죽상 경화증, 심근 경색증, 심낭염, 심근염, 허혈성 뇌졸중, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근 병증, 선천성 심장 질환, 판막성 심장 질환, 심장염, 대동맥 동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전 색전성 질환, 정맥 혈전증이다.
질환 또는 병태는 신경계 장애를 포함할 수 있다. 신경계 장애는 신경 퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 신경 퇴행성 및 신경계 장애의 비제한적인 예는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 척수 소뇌 실조증, 근위축성 측삭 경화증(ALS: amyotrophic lateral sclerosis), 운동 뉴런 질환, 만성 통증, 및 척수성 근위축증이다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체에서 정신 장애 및/또는 정신 장애를 치료하기 위한 약물에 대한 반응을 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다.
질환 또는 상태는 감염을 포함할 수 있다. 질환 또는 병태는 감염으로 인해 발생할 수 있다. 질환 또는 병태는 감염에 의해 악화될 수 있다. 감염은 바이러스 감염일 수 있다. 감염은 박테리아 감염일 수 있다. 감염은 진균 감염일 수 있다.
질환 또는 병태는 노화와 관련될 수 있다. 노화와 관련된 질환 및 병태는 암, 골다공증, 치매, 황반 변성, 대사 질환, 및 신경 퇴행성 장애를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
질환 또는 병태는 혈액 장애일 수 있다. 혈액 장애의 비제한적인 예는 빈혈, 혈우병, 혈액 응고 및 혈전 성향증이다. 예를 들어, 혈전 성향증의 검출 단계는 인자 V 레이덴(FVL: Factor V Leiden), 프로트롬빈 유전자(PT G20210A) 및 메틸렌테트라 히드로폴레이트 리덕타제(MTHFR: methylenetetrahydrofolate reductase)로부터 선택된 유전자에 존재하는 다형성을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
질환 또는 병태는 음식, 액체 또는 약물에 대한 알레르기 또는 불내성(intolerance)일 수 있다. 비제한적인 예로서, 피험체는 락토오스, 밀, 콩, 유제품, 카페인, 알코올, 견과류, 갑각류, 및 계란에 대해 알레르기성이거나 불내성일 수 있다. 피험체는 또한 약물, 보충제 또는 화장품에 대해 알레르기성이거나 불내성일 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부 유형 또는 피부 건강을 예측하는 유전적 마커를 분석하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 병태는 알레르기와 관련이 있다. 일부 경우에, 피험체는 질환 또는 병태로 진단되지 않지만 질환 또는 병태가 있음을 나타내는 증상을 경험하고 있다. 다른 경우에, 피험체는 질환 또는 병태로 이미 진단되었고, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태에 대한 약물의 효과를 모니터링하는데 유용하다.
염색체 이상
염색체 이상(abnormality)을 검출하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 당업자는 또한 염색체 이상을 염색체 이상(abberration)으로 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 염색체 이상은 염색체 중복이다. 일부 경우에, 염색체 이상은 염색체 결실이다. 일부 경우에, 염색체 이상은 염색체의 아암의 결실이다. 일부 경우에, 염색체 이상은 염색체의 아암의 부분 결실이다. 일부 경우에, 염색체 이상은 적어도 하나의 유전자 복제본을 포함한다. 일부 경우에, 염색체 이상은 염색체의 파손으로 인한 것이다. 일부 경우에, 염색체 이상은 제1 염색체의 일부가 제2 염색체의 일부로 전위되기 때문이다.
공지된 많은 염색체 이상은 염색체 장애를 초래한다. 따라서, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 염색체 장애를 검출하는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 염색체 장애는 다운 증후군(삼염색체 21), 에드워드 증후군(삼염색체 18), 파타우 증후군(삼염색체 13), 묘성 증후군(염색체 5의 짧은 아암 부분 결실), 월프-허쉬호른 증후군(염색체 4의 짧은 아암의 결실), 야곱센 증후군(염색체 11의 긴 아암의 결실), 디 조지 증후군(염색체 22의 작은 결실), 클라인펠터 증후군(남성에서 추가 X 염색체 존재), 및 터너 증후군(여성에서 단일 X 염색체만 존재)을 포함한다.
생물학적 샘플
생물학적 샘플에서 무세포 핵산을 분석하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 땀, 눈물 및 질액의 샘플을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 전혈을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 생물학적 물질을 함유하는 환경 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 바이러스, 박테리아 또는 이의 단편/입자를 함유하는 식품 샘플 또는 물 샘플일 수 있다.
본원에 기재된 방법, 시스템 및 키트는 일반적으로 무세포 핵산을 검출하고 정량화한다. 이러한 이유로, 본원에 기술된 생물학적 샘플은 일반적으로 실질적으로 비세포성이거나 비세포성 생물학적 유체로 변형될 수 있는 생물학적 유체이다. 비제한적 예로서, 피험체로부터의 샘플은 세포가 제거된 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 또는 질액일 수 있다. 예를 들어, 무세포 핵산은 피험체의 혈류에서 순환할 수 있으므로, 검출 시약은 피험체로부터의 혈액 또는 혈청 샘플에서 마커를 검출하거나 정량화하는데 사용될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "혈장" 및 "혈청"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 그러나 일부 경우에 이들은 두 가지 모두 설명 또는 청구 범위에 포함됨을 나타내는 단일 샘플 종 목록에 포함된다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 양수를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 생물학적 샘플에서 세포를 제거할 수 있다. 생성된 샘플은 세포가 고갈된 샘플로 지칭될 수 있다. 세포가 고갈된 샘플은 생물학적 샘플보다 적어도 95% 더 적은 온전한 전세포를 가질 수 있다. 세포가 고갈된 샘플은 생물학적 샘플보다 적어도 90% 더 적은 온전한 전세포를 가질 수 있다. 세포가 고갈된 샘플은 생물학적 샘플보다 적어도 80% 더 적은 온전한 전세포를 가질 수 있다. 세포가 고갈된 샘플은 생물학적 샘플보다 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 25% 더 적은 온전한 전세포를 가질 수 있다. 세포가 고갈된 샘플에는 온전한 전세포가 전혀 없을 수 있다.
모세관(예를 들어, 손가락, 발가락과 같은 말단 혈관)으로부터 얻은 혈액은 본원에서 "모세혈"로 지칭될 수 있다. 정맥으로부터 얻은 혈액(예를 들어, 팔, 손 가운데)은 본원에서 "정맥혈"로 지칭될 수 있다. 정맥혈을 얻기 위한 정맥 천자를 위한 일반적인 정맥은 주정 중피 정맥, 요측피 정맥, 척측피 정맥, 및 배측 중수 정맥이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 모세혈을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 본질적으로 모세혈로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 모세혈로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 정맥혈을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈장을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 본질적으로 혈장으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈장으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈청을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 본질적으로 혈청으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈청으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 소변을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 본질적으로 소변으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 소변으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 타액을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 본질적으로 타액으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 타액으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 질액을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 본질적으로 질액으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 질액으로 이루어진다. 일부 경우에, 질액은 임신한 피험체의 질 면봉을 수행함으로써 수득된다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 간질액을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 간질액으로 본질적으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 활액을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 본질적으로 활액으로 이루어진다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 액체 생검으로부터의 유체를 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 유체는 본질적으로 액체 생검으로부터의 유체로 이루어진다. 액체 생검의 예는 암 환자로부터 혈액을 얻고 종양 또는 암세포로부터 혈류로 방출된 핵산을 검사하는 것이다. 핵산은 암세포의 사멸/손상을 야기하는 괴사, 아폽토시스, 자가 포식, 및 암 요법으로 인해 종양 또는 암 세포로부터 방출될 수 있다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 전혈이다. 일반적으로, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 전혈의 매우 작은 샘플로부터 무세포 핵산을 분석할 수 있다. 일부 경우에, 전혈의 작은 샘플은 란셋 또는 핀/바늘로 수행되는 것과 같이 손가락 찌름으로 얻을 수 있다. 일부 경우에, 전혈의 작은 샘플은 정맥 절개술 없이 얻을 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 공개된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 1 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 10 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 30 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 40 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 50 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 60 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 70 ㎕의 혈액을 필요로 한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 1 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 10 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 20 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 30 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 40 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 60 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 80 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 100 ㎕의 혈액을 필요로 한다.
일부 경우에, 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 1 ㎕ 내지 약 500 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 10 ㎕ 내지 약 200 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 15 ㎕ 내지 약 150 ㎕의 혈액을 얻는는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 혈액을 얻는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 98%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99.5%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 혈액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트는 적어도 약 99.9%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 혈액을 필요로 한다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 혈장 또는 혈청이다. 혈장 또는 혈청은 전혈의 약 55%를 구성한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 1 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 10 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 20 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 30 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 40 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 10 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 20 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 30 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 40 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 10 ㎕ 내지 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 20 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 99%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 단지 약 10 ㎕ 내지 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 필요로 한다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 타액이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 100 ㎕의 타액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 200 ㎕의 타액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 500 ㎕의 타액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 1 ml의 타액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 2 ml의 타액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 3 ml의 타액을 필요로 한다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 질액이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 50 ㎕의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 100 ㎕의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 200 ㎕의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 500 ㎕의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 1 ml의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 2 ml의 질액을 필요로 한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 적어도 약 95%의 신뢰도 또는 정확도로 검사 결과를 제공하기 위해 적어도 약 3 ml의 질액을 필요로 한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 생물학적 샘플은 무세포 핵산을 포함하며, 여기서 일정 분율의 무세포 핵산은 외래 조직 또는 비정상 조직으로부터 유래한다. 그 분율의 무세포 핵산은 "외래 무세포 핵산" 또는 "외래 무세포 핵산"으로 지칭될 수 있다. 비제한적인 예로서, 외래 또는 비정상 조직은 피험체에 이식된 조직 또는 기관을 포함할 수 있다. 외래 또는 비정상 조직은 공여자 조직으로 지칭될 수 있고 피험체는 숙주 조직으로 지칭될 수 있다. 또한, 비제한적인 예로서, 비정상 조직은 종양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분율은 생물학적 샘플에서 모든(총) 무세포 핵산의 분율이며, 여기서 분율은 외래 또는 비정상 무세포 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 분율은 본질적으로 외래 또는 비정상적인 무세포 핵산으로 이루어진다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 무세포 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 무세포 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 무세포 핵산은 본질적으로 DNA로 이루어진다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 무세포 핵산은 본질적으로 RNA로 이루어진다.
외래 또는 비정상 조직으로부터 유래한 무세포 핵산의 분율은 샘플에서 총 무세포 핵산의 백분율로 특성화될 수 있다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 조직으로부터 유래한 무세포 핵산의 분율은 25% 미만이다. 일부 경우에, 외래 또는 비정상 조직으로부터 유래한 무세포 핵산의 분율은 20% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 15% 미만이다. 경우에 따라, 분율은 10% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 8% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 6% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 5% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 4% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 2% 미만이다. 일부 경우에, 분율은 적어도 1%이다. 일부 경우에, 분율은 약 1.5% 내지 약 15%이다. 일부 경우에, 분율은 약 2% 내지 약 12%이다. 일부 경우에, 분율은 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 경우에, 분율은 약 4% 내지 약 9%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 약 4% 내지 약 8%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 약 1% 내지 약 5%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 약 1% 내지 약 4%이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 생물학적 샘플은 무세포 핵산을 포함하며, 여기서 일정 분율의 무세포 핵산은 태아로부터 유래한다. 이 분율은 태아 분율로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 모든 (총) 핵산의 분율이며, 여기서 분율은 태아 핵산으로 이루어진다. 일부 경우에, 핵산 및/또는 태아 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 및/또는 태아 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 및/또는 태아 핵산은 본질적으로 DNA로 이루어진다. 일부 경우에, 핵산 및/또는 태아 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 1.5% 내지 약 15%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 2% 내지 약 12%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 4% 내지 약 9%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 4% 내지 약 8%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 1% 내지 약 5%이다. 일부 경우에, 태아 분율은 생물학적 샘플에서 총 무세포 핵산의 약 1% 내지 약 4%이다. 일부 경우에, 태아 핵산의 적어도 일부는 태아로부터 유래한다. 일부 경우에, 태아 핵산의 적어도 일부는 태반으로부터 유래한다. 일부 경우에, 태아 핵산의 적어도 일부는 태아로부터 유래하고 태아 핵산의 적어도 일부는 태반으로부터 유래한다. 일부 경우에, 태아 핵산은 태아로부터만 유래한다. 일부 경우에, 태아 핵산이 태반으로부터만 유래한다. 일부 경우에, 태아 핵산은 태아 및 태반으로부터의 모든 핵산이다. 일부 경우에, 태아 핵산은 모체 조직 또는 모체 유체로부터 유래하지 않는다. 일부 경우에, 모체 조직은 태반 이외의 모체 조직이다. 일부 경우에, 모체 체액은 양수 이외의 모체 체액이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플을 증폭 또는 서열 분석에 적합하도록 생물학적 유체를 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 완충제, 염, 단백질 또는 핵산을 생물학적 샘플에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, EDTA는 혈액 샘플에 첨가되어 응고를 방지할 수 있다. 간략하게, 이러한 변형된 생물학적 샘플을 여전히 '생물학적 샘플'이라고 지칭한다.
무세포 핵산
일부 경우에, 본 개시 내용의 조성물 및 방법은 생물학적 샘플에서 무세포 핵산을 평가하는데 유용하다. 무세포 핵산은 동물로부터 유래할 수 있다. 무세포 핵산은 포유동물로부터 유래할 수 있다. 무세포 핵산은 인간 피험체로부터 유래할 수 있다. 무세포 핵산은 식물로부터 유래할 수 있다. 무세포 핵산은 병원체로부터 유래할 수 있다. 무세포 핵산은 생물학적 샘플에 존재하는 병원체로부터 유래할 수 있으며, 여기서 생물학적 샘플은 동물로부터 유래한다. 무세포 핵산은 생물학적 샘플에 존재하는 병원체로부터 유래할 수 있으며, 여기서 생물학적 샘플은 인간 피험체로부터 유래한다. 병원체는 박테리아 또는 이의 구성 요소를 포함할 수 있다. 병원체는 바이러스 또는 이의 구성 요소일 수 있다. 병원체는 진균 또는 이의 구성 요소일 수 있다.
일부 경우에, 무세포 핵산은 DNA(cf-DNA)이다. 일부 경우에는, 무세포 핵산은 게놈 DNA이다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 RNA(cf-RNA)이다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 본원에서 무세포 태아 핵산으로 지칭되는 태아의 세포로부터의 핵산이다. 일부 경우에, 무세포 태아 핵산은 무세포 태아 DNA(cff-DNA) 또는 무세포 태아 RNA(cff-RNA)이다. 일부 경우에, cf-DNA 또는 cff-DNA는 게놈 DNA이다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 cf-RNA 또는 cff-RNA의 역전사에 의해 생성된 상보적 DNA(cDNA)의 형태이다. 일부 경우에, cf-DNA는 미토콘드리아 DNA를 포함한다. 일부 경우에, cf-RNA 또는 cff-RNA는 전령 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 미토콘드리아 RNA 또는 천연 안티센스 RNA(NAS-RNA)이다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 모체 및 태아 핵산의 혼합물이다. 모체 혈류에서 순환하는 무세포 태아 핵산은 "순환하는 무세포 핵산" 또는 "순환하는 세포 외 DNA"로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 후성 유전적 변형을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 성별 또는 관심의 다른 유전 정보에 해당하는 후성 유전적 변형 패턴을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 메틸화된 시토신을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 성별 또는 관심의 다른 유전 정보에 해당하는 시토신 메틸화 패턴을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트는 세포의 핵산, 예컨대 파괴된 세포 또는 용해된 세포로부터의 핵산을 검출 또는 정량화하도록 구성된다. 일부 경우에, 세포 핵산은 의도적으로 파괴되거나 용해된 세포로부터 유래한다. 일부 경우에, 세포 핵산은 의도하지 않게 파괴되거나 용해된 세포로부터 유래한다. 본원에 개시된 방법, 장치, 시스템 및 키트는 의도적으로 파괴되거나 용해된 세포를 분석하도록 구성될 수 있지만, 의도하지 않게 파괴되거나 용해된 세포를 분석하도록 구성되지는 않을 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 0.1% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 1% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 5% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 10% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 20% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 30% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 40% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 50% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 60% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 70% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 80% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 총 핵산의 약 90% 미만이 세포 핵산이다. 일부 경우에, 장치, 시스템, 키트 및 방법은 실험 대조군 또는 이의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 실험 대조군은 핵산, 단백질, 펩티드, 항체, 항원 결합 항체 단편, 결합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 실험 대조군은 실험 대조군을 검출하기 위한 신호를 포함한다. 신호의 비제한적인 예는 형광 분자, 염료 분자, 나노 입자, 및 비색 지표이다. 일부 경우에, 실험 대조군은 무세포 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 무세포 태아 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 모체 무세포 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 모체 무세포 핵산을 포함한다(예를 들어, 샘플 처리 중에 발생하는 세포 파괴/용해의 양을 평가하기 위해). 일부 경우에, 무세포 핵산은 오토솜에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 성염색체에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 이수성일 가능성이 있는 염색체(예를 들어, 염색체 13, 16, 18, 21, 22, X, Y)에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 무세포 핵산은 이수성일 가능성이 거의 없는 염색체(예를 들어, 염색체 1~12, 14, 15, 17, 19 또는 20)에 상응하는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 모체 체액 샘플을 포함한다. 일부 경우에, 모체 체액 샘플은 혈액, 예를 들어 전혈, 말초 혈액 샘플, 또는 혈액 분획(혈장, 혈청)을 포함한다. 일부 경우에, 모체 체액 샘플은 땀, 눈물, 가래, 소변, 귓바퀴 혈류, 림프, 타액, 뇌척수액, 골수 현탁액, 질액, 경경부 세척, 뇌액, 복수, 또는 모유를 포함한다. 일부 경우에, 모체 체액 샘플은 호흡기, 장 및 비뇨관의 분비액, 양수, 또는 백혈구 성분 채집 샘플을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 비침습적 절차에 의해 쉽게 얻을 수 있는 모체 체액 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 눈물, 가래, 소변, 귓바퀴, 혈류, 또는 타액이다. 일부 경우에, 샘플은 두 개 이상의 체액 샘플의 조합이다. 일부 경우에, 무세포 태아 핵산은 모체 태반, 예를 들어 아폽토시스된 태반 세포로부터 유래한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 태반 혈액이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법에 의해 평가되거나 분석된 핵산은 바람직한 길이를 갖는다. 일부 경우에, 핵산은 무세포 태아 DNA 단편이다. 일부 경우에, 무세포 태아 DNA 단편은 Y 염색체로부터 유래한다. 일부 경우에, 핵산은 약 15 bp 내지 약 500 bp 길이이다. 일부 경우에, 핵산은 약 50 bp 내지 약 200 bp 길이이다. 일부 경우에, 핵산은 적어도 약 15 bp 길이이다. 일부 경우에, 핵산은 최대 약 500 bp 길이이다. 경우에 따라, 핵산은 약 15 bp 길이 내지 약 50 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 75 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 100 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 75 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 100 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 50 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 100 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 75 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 400 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 400 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 또는 약 450 bp 길이 내지 약 500 bp 길이이다. 일부 경우에, 핵산은 약 15 bp 길이, 약 50 bp 길이, 약 75 bp 길이, 약 100 bp 길이, 약 150 bp 길이, 약 200 bp 길이, 약 250 bp 길이, 약 300 bp 길이, 약 350 bp 길이, 약 400 bp 길이, 약 450 bp 길이, 또는 약 500 bp 길이이다.
본 개시 내용의 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 평가된 무세포 핵산의 크기는 예를 들어 사용된 특정 체액 샘플에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, cff-DNA 서열은 모체 cf-DNA 서열보다 짧은 것으로 관찰되었으며, cff-DNA 및 모체 cf-DNA는 혈장 샘플에서보다 소변에서 더 짧다.
일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 길이가 약 20 bp 내지 약 300 bp 범위이다. 일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 15 bp 내지 약 300 bp 길이이다. 일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 적어도 약 15 bp 길이이다. 일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 최대 약 300 bp 길이이다. 일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 15 bp 길이 내지 약 20 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 30 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 60 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 90 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 120 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 15 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 30 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 60 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 90 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 120 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 20 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 60 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 90 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 120 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 30 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 90 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 120 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 60 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 120 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 90 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 120 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 180 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 180 bp 길이 내지 약 210 bp 길이, 약 180 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 180 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 180 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 210 bp 길이 내지 약 240 bp 길이, 약 210 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 210 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 240 bp 길이 내지 약 270 bp 길이, 약 240 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 또는 약 270 bp 길이 내지 약 300 bp 길이이다. 일부 경우에, 소변 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 15 bp 길이, 약 20 bp 길이, 약 30 bp 길이, 약 60 bp 길이, 약 90 bp 길이, 약 120 bp 길이, 약 150 bp 길이, 약 180 bp 길이, 약 210 bp 길이, 약 240 bp 길이, 약 270 bp 길이, 또는 약 300 bp 길이이다.
일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 적어도 약 20 bp 길이이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 적어도 약 40 bp 길이이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 적어도 약 80 bp 길이이다. 일부 경우에,혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 최대 약 500 bp 길이이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 100 bp 내지 약 500 bp 길이 범위이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 50 bp 길이 내지 약 500 bp 길이이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 80 bp 길이 내지 약 100 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 125 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 175 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 80 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 125 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 175 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 100 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 150 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 175 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 125 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 175 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 150 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 200 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 175 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 250 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 200 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 300 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 250 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 350 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 300 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 400 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 350 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 약 400 bp 길이 내지 약 450 bp 길이, 약 400 bp 길이 내지 약 500 bp 길이, 또는 약 450 bp 길이 내지 약 500 bp 길이이다. 일부 경우에, 혈장 또는 혈청 샘플에서 평가된 cff-DNA 서열은 약 80 bp 길이, 약 100 bp 길이, 약 125 bp 길이, 약 150 bp 길이, 약 175 bp 길이, 약 200 bp 길이, 약 250 bp 길이, 약 300 bp 길이, 약 350 bp 길이, 약 400 bp 길이, 약 450 bp 길이, 또는 약 500 bp 길이이다.
피험체
피험체로부터의 샘플에서 생물학적 성분을 분석하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 피험체는 인간일 수 있다. 피험체는 비인간일 수도 있다. 피험체는 비-포유동물(예를 들어, 조류, 파충류, 곤충)일 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 포유동물이다. 일부 경우에, 포유동물은 암컷이다. 일부 경우에, 피험체는 인간 피험체이다. 일부 경우에, 포유동물은 영장류(예를 들어, 인간, 유인원, 긴 팔 원숭이, 원숭이)이다. 일부 경우에, 포유동물은 개과(예를 들어, 개, 여우, 늑대)이다. 일부 경우에, 포유동물은 고양잇과(예를 들어, 집 고양이, 대형 고양잇과 동물)이다. 일부 경우에, 포유동물은 말과(예를 들어, 말)이다. 일부 경우에, 포유동물은 소과(예를 들어, 소, 버팔로, 들소)이다. 일부 경우에, 포유동물이 양이다. 일부 경우에, 포유동물은 염소이다. 일부 경우에, 포유동물은 돼지이다. 일부 경우에, 포유동물은 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그)이다.
일부 경우에, 본원에 기술된 피험체는 질환 또는 병태에 걸려 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 질환 또는 병태를 검사하고, 질환 또는 병태를 검출하고/하거나, 질환 또는 병태를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 유전된 특성의 존재를 검사하고, 적응도를 모니터링하고, 가족 관계를 알아내는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체에서 암을 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 암의 비제한적인 예는 유방암, 전립선 암, 피부암, 폐암, 결장 직장암/결장암, 방광암, 췌장암, 림프종, 및 백혈병을 포함한다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체에서 면역 장애 또는 자가 면역 장애를 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 자가 면역 및 면역 장애는 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 다발성 경화증, 루푸스, 염증성 장 질환, 애디슨병, 그레이브스병, 크론병 및 셀리악병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체의 노화와 관련된 질환 또는 병태를 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 노화와 관련된 질환 및 병태는 암, 골다공증, 치매, 황반 변성, 대사 질환 및 신경 퇴행성 장애를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 혈액 장애를 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 혈액 장애의 비제한적인 예는 빈혈, 혈우병, 혈액 응고 및 혈전 성향증이다. 예를 들어, 혈전 성향증의 검출은 인자 V 레이덴(FVL), 프로트롬빈 유전자(PT G20210A), 및 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제(MTHFR)로부터 선택된 유전자에 존재하는 다형성을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체에서 신경계 장애 또는 신경 퇴행성 장애를 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 신경 퇴행성 및 신경계 장애의 비제한적인 예는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 척수 소뇌 실조증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 운동 뉴런 질환, 만성 통증, 및 척수성 근위축증이다. 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 피험체에서 정신 장애 및/또는 정신 장애를 치료하기 위한 약물에 대한 반응을 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 대사성 병태 또는 질환을 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 대사성 병태 및 질환은 비만, 갑상선 장애, 고혈압, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비알코올성 지방 간염, 관상 동맥 질환 및 죽상 동맥 경화증을 포함지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법을 사용하여 음식, 액체 또는 약물에 대한 알레르기 또는 불내성을 검사, 검출 및/또는 모니터링할 수 있다. 비제한적인 예로서, 피험체는 락토오스, 밀, 콩, 유제품, 카페인, 알코올, 견과류, 갑각류, 및 계란에 대해 알레르기성이거나 불내성일 수 있다. 피험체는 또한 약물, 보충제 또는 화장품에 대해 알레르기성이거나 불내성일 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부 유형 또는 피부 건강을 예측하는 유전적 마커를 분석하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 병태는 알레르기와 관련이 있다. 일부 경우에, 피험체는 질환 또는 병태로 진단되지 않지만 질환 또는 병태가 있음을 나타내는 증상을 경험하고 있다. 다른 경우에, 피험체는 질환 또는 병태로 이미 진단되고, 본원에 개시된 장치, 시스템, 키트 및 방법은 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태에 대한 약물의 효과를 모니터링하는데 유용하다.
임신한 피험체의 모체 생물학적 샘플에서 태아로부터의 무세포 핵산을 분석하기 위한 장치, 시스템, 키트 및 방법이 본원에 개시된다. 일반적으로, 임신한 피험체는 인간 임신한 피험체이다. 그러나 당업자는 본 개시 내용이 다른 포유동물, 아마도 농장 또는 동물원에서의 육종 목적으로 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 정배수체이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 이수성을 포함한다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 유전자 또는 그의 일부의 복제본 변이를 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 유전자 삽입 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 유전자 결실 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 유전자 미스센스 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 단일 뉴클레오티드 다형성을 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 단일 뉴클레오티드 다형성을 갖는다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 전위 돌연변이를 가짐으로 융합 유전자를 초래한다. 비제한적인 예로서, BCR-ABL 유전자는 많은 백혈병 환자의 염색체 22에서 발견될 수 있는 융합 유전자이다. 변경된 염색체 22는 필라델피아 염색체로 지칭된다.
일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 2주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 3주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 4주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 5주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 6주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 7주 내지 임신 약 42주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 8주 내지 임신 약 42주이다.
일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 12주, 약 16주, 약 20주, 약 21 주, 약 22주, 약 24주, 약 26주, 또는 약 28주 미만이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 임신 5주에 불과하다. 일부 경우에, 인간 피험체는 임신 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 또는 적어도 약 8주에 도달한 임신한 인간 여성이다. 일부 경우에, 인간 피험체는 임신 적어도 약 5 내지 약 8주에 도달한 임신한 인간 여성이다. 일부 경우에, 인간 피험체는 임신 적어도 약 5 내지 약 8, 적어도 약 5 내지 약 12, 적어도 약 5 내지 약 16, 적어도 약 5 내지 약 20, 적어도 약 6 내지 약 21, 적어도 약 6 내지 약 22, 적어도 약 6 내지 약 24, 적어도 약 6 내지 약 26, 적어도 약 6 내지 약 28, 적어도 약 6 내지 약 9, 적어도 약 6 내지 약 12, 적어도 약 6 내지 약 16, 적어도 약 6 내지 약 20, 적어도 약 6 내지 약 21, 적어도 약 6 내지 약 22, 적어도 약 6 내지 약 24, 적어도 약 6 내지 약 26, 또는 적어도 약 6 내지 약 28주에 도달한 임신한 인간 여성이다. 일부 경우에, 인간 피험체는 임신 적어도 약 7 내지 약 8, 적어도 약 7 내지 약 12, 적어도 약 7 내지 약 16, 적어도 약 7 내지 약 20, 적어도 약 7 내지 약 21, 적어도 약 7 내지 약 22, 적어도 약 7 내지 약 24, 적어도 약 7 내지 약 26, 적어도 약 7 내지 약 28, 적어도 약 8 내지 약 9, 적어도 약 8 내지 약 12, 적어도 약 6 내지 약 16, 적어도 약 8 내지 약 20, 적어도 약 8 내지 약 21, 적어도 약 6 내지 약 22, 적어도 약 8 내지 약 24, 적어도 약 8 내지 약 26, 또는 적어도 약 8 내지 약 28주에 도달한 임신한 인간 여성이다. 일부 경우에, 임신 기간은 마지막 월경 기간의 첫날부터 임신 기간을 측정하여 알아낸다.
일부 경우에, 생물학적 샘플은 임신한 피험체, 임신이 의심되는 피험체 또는 최근에 예를 들어, 지난 하루 이내에 출산한 피험체로부터 얻은 모체 체액 샘플이다. 일부 경우에, 피험체는 포유동물이다. 일부 경우에, 포유동물은 암컷이다. 일부 경우에, 포유동물은 영장류(예를 들어, 인간, 유인원, 긴 팔 원숭이, 원숭이), 개과(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 고양잇과(예를 들어, 집 고양이, 대형 고양잇과 동물), 말과(예를 들어, 말), 소과(예를 들어, 소, 버팔로, 들소), 양과(예를 들어, 양), 염소과(예를 들어, 염소), 돼지과(예를 들어, 돼지), 코뿔소, 또는 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그)이다. 일부 경우에, 피험체는 임신 제1, 제2, 또는 제3 삼분기의 임신한 인간 여성이다. 일부 경우에, 인간 피험체는 임신 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39 또는 약 40주 미만의 임신한 인간 여성이다.
번호가 매겨진 실시 양태
본 개시 내용은 본원에 열거된 번호가 매겨진 실시 양태의 검토를 통해 이해된다. 1. 피험체로부터 무세포 핵산을 포함하는 모세혈을 얻는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 2. 피험체로부터 무세포 핵산을 포함하는 모세혈을 얻는 단계; 임의로 무세포 핵산을 증폭시키는 단계; 무세포 핵산의 적어도 일부를 태그하여 태그된 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계; 임의로 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계; 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하는 단계; 및 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부에서 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 3. 실시 양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 0.5의 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는 방법. 4. 실시 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 크라우딩제의 존재하에서 무세포 핵산 또는 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법. 5. 실시 양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산의 말단을 수복하는 단계를 포함하는 방법. 6. 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계로 생물학적 샘플은 총 무세포 핵산을 함께 구성하는 표적 무세포 핵산 및 비-표적 무세포 핵산을 포함하고, 표적 무세포 핵산은 총 무세포 핵산의 5% 미만인 것인 단계; 표적 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 관심의 표적 서열에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 7. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플은 모세혈을 포함하는 방법 8. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플은 본질적으로 모세혈로 이루어지는 방법 9. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 모세혈을 얻는 것을 포함하는 방법 10. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 모세혈을 얻는 것을 포함하는 방법 11. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 본질적으로 모세혈을 얻는 단계로 이루어지는 방법 12. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 정맥혈을 얻는 것을 포함하지 않는 방법 13. 실시 양태 6에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 정맥 절개술을 수행하는 것을 포함하지 않는 방법 14. 실시 양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 1 밀리리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법 15. 실시 양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 100 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법 16. 실시 양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플을 얻는 단계는 40 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법 17. 실시 양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 표적 무세포 핵산은 종양으로부터의 무세포 핵산인 방법. 18. 실시 양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 표적 무세포 핵산은 태아로부터의 무세포 핵산인 방법. 19. 실시 양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 표적 무세포 핵산은 이식된 조직 또는 기관으로부터의 무세포 핵산인 방법. 20. 실시 양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 방법은 적어도 98%의 정확도로 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 21. 실시 양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 방법은 전체 게놈 증폭을 포함하지 않는 방법. 22. 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드를 생성하는 단계; 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 23. 실시 양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 500 ㎕ 미만의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법. 24. 실시 양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법. 25. 실시 양태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법. 26. 실시 양태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 60 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법. 27. 실시 양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법. 28. 실시 양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석 전 및 증폭 후 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함하는 방법. 29. 실시 양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석 전에 무세포 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함하는 방법. 30. 실시 양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산 분자를 태그한 후 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법. 31. 실시 양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산 분자를 태그하기 전에 무세포 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법. 32. 실시 양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계는 무세포 핵산 분자를 무작위 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 것을 포함하는 방법 33. 실시 양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 증폭 단계는 등온 증폭을 포함하는 방법 34. 실시 양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과다 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 35. 실시 양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 36. 실시 양태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 표적 염색체에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함하는 방법. 37. 실시 양태 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함하는 방법. 38. 실시 양태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 해당하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함하는 방법. 39. 실시 양태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체인 방법. 40. 실시 양태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 간질액, 질 세포, 질액, 협측 세포 또는 타액을 포함하는 방법 41. 실시 양태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장인 방법. 42. 실시 양태 41에 있어서, 혈액 샘플로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 43. 실시 양태 41에 있어서, 분리 단계는 혈장 샘플을 생성하기 위해 혈액 샘플을 여과하여 혈액 샘플로부터 세포, 세포 단편, 미세 소포 또는 이들의 조합을 제거하는 것을 포함하는 방법 44. 실시 양태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 1 ml의 용량을 갖는 혈액 샘플인 방법. 45. 실시 양태 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 150 ㎕의 용량을 갖는 혈액 샘플인 방법. 46. 실시 양태 44 또는 45에 있어서, 혈액 샘플을 얻는 단계는 손가락을 찌르는 것을 포함하는 방법 47. 실시 양태 46에 있어서, 찔린 손가락으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 추가로 포함하는 방법 48. 실시 양태 46에 있어서, 방법은 찔린 손가락으로부터 혈액을 뽑아내거나 짜내는 단계를 포함하지 않는 방법. 49. 실시 양태 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 혈액 샘플을 얻는 단계는 정맥 절개술을 포함하지 않는 방법 50. 실시 양태 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법 51. 실시 양태 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법 52. 실시 양태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 107개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법 53. 실시 양태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 300 pg 미만의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법 54. 실시 양태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 3 ng 미만의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법 55. 실시 양태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 98% 초과의 정확도로 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 56. 실시 양태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 99% 초과의 정확도로 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 57. 실시 양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 피험체는 임신한 피험체이고 무세포 핵산 분자는 무세포 태아 핵산 분자를 포함하는 방법 58. 실시 양태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함하는 방법. 59. 실시 양태 58에 있어서, 참조 번호는 정배수체 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임신한 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 하는 방법 60. 실시 양태 58에 있어서, 참조 번호는 이수체 태아를 갖는 적어도 하나의 정배수체 임산부로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 하는 방법 61. 실시 양태 60에 있어서, 적어도 하나의 샘플은 생물학적 샘플과 동일한 샘플 유형 및 동일한 샘플 용량인 방법. 62. 실시 양태 57에 있어서, 생물학적 샘플은 약 106 내지 약 1012개의 총 무세포 핵산 분자를 포함하며, 총 무세포 핵산 분자는 본질적으로 무세포 태아 핵산 분자 및 모체 무세포 핵산 분자로 이루어지는 방법 63. 실시 양태 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 상이할 때, 적어도 하나의 염색체 영역의 태아의 이수성이 존재함을 검출하는 단계를 포함하는 방법. 64. 실시 양태 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드 대 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 비율이 정배수체 태아를 가진 대조군 임신한 정배수체 피험체로부터의 대조 생물학적 샘플에서 각각의 비율과 동일할 때, 적어도 하나의 염색체 영역의 태아의 이수성이 존재하지 않음을 검출하는 단계를 포함하는 방법. 65. 실시 양태 63 또는 64에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 중 적어도 하나에 위치하는 방법 66. 실시 양태 64 또는 65에 있어서, 적어도 하나의 비-표적 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 또는 염색체 Y 이외의 염색체 중 적어도 하나인 방법. 67. 실시 양태 57 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 임신한 피험체는 임신 5주에 불과한 방법 68. 실시 양태 57에 있어서, 임신한 피험체는 정배수체인 방법. 69. 실시 양태 57에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 109개의 무세포 태아 핵산을 함유하는 방법 70. 실시 양태 57에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104 내지 약 108개의 무세포 태아 핵산을 함유하는 방법 71. 실시 양태 57에 있어서, 적어도 2000개의 무세포 태아 핵산을 서열 분석하는 단계를 포함하는 방법. 72. 실시 양태 58에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 적어도 1000개의 서열 분석 리드를 측정하는 단계를 포함하는 방법. 73. 실시 양태 58에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역의 표시는 대조군 태아를 임신 중인 적어도 하나의 대조군 임신 피험체에서의 대조군 표시에 대한 방법 74. 실시 양태 73에 있어서, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 이수성을 갖지 않는 방법 74. 실시 양태 73에 있어서, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 유전적 이상을 갖지 않는 방법 75. 실시 양태 73에 있어서, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 염색체 영역에 상응하는 이수성을 갖는 방법 76. 실시 양태 73에 있어서, 대조군 임신 피험체 및 대조군 태아 중 적어도 하나는 표적 염색체 영역에 상응하는 유전적 이상을 갖는 방법 77. 실시 양태 1 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산은 조직 내 종양으로부터의 핵산을 포함하는 방법 78. 실시 양태 77에 있어서, 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 번호를 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 참조 번호와 비교하는 단계를 포함하는 방법. 79. 실시 양태 78에 있어서, 참조 번호는 조직에 종양이 없는 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 하는 방법 80. 실시 양태 78에 있어서, 참조 번호는 조직에 종양을 가진 피험체로부터의 적어도 하나의 샘플을 기준으로 하는 방법 81. 실시 양태 1 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산은 피험체에 이식된 기관 또는 조직으로부터의 핵산을 포함하는 방법 82. 실시 양태 1 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 무세포 핵산은 기관 또는 조직에 특이적인 방법 83. 실시 양태 1 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석은 전체 게놈 서열 분석을 포함하는 방법 84. 실시 양태 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석은 무작위 대규모 병렬 서열 분석을 포함하는 방법 85. 실시 양태 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석은 표적화된 서열 분석을 포함하는 방법 86. 실시 양태 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석은 나노포어 서열 분석을 포함하는 방법 87. 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부의 적어도 하나의 염색체 영역에서 후성 유전적 변형을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 88. 피험체로부터 모세혈을 얻는 단계; 무세포 핵산 분자의 적어도 일부의 적어도 하나의 염색체 영역에서 후성 유전적 변형을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 89. 실시 양태 88에 있어서, 200 ㎕ 이하의 모세혈을 얻는 단계를 포함하는 방법. 90. 실시 양태 88에 있어서, 100 ㎕ 이하의 모세혈을 얻는 단계를 포함하는 방법. 91. 임신한 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 태그하여 태그된 무세포 태아 핵산 분자를 생성하는 단계; 태그된 무세포 태아 핵산 분자 수를 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 92. 실시 양태 91에 있어서, 생물학적 샘풀에서 각각의 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함하는 방법. 93. 실시 양태 91에 있어서, 무세포 태아 핵산 분자의 적어도 일부를 태그하는 단계는 표적 염색체 영역으로부터의 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 것을 포함하는 방법 94. 실시 양태 91에 있어서, 방법은 서열 분석 단계를 포함하지 않는 방법 95. 실시 양태 91에 있어서, 적어도 하나의 임신한 피험체로부터 각각 최대 약 109개의 무세포 태아 핵산 분자를 함유하는 복수의 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 각각의 생물학적 샘플로부터 무세포 태아 핵산 분자를 상이한 인덱스로 인덱싱함으로써, 무세포 태아 핵산 분자에 샘플 식별자를 제공하는 단계를 포함하는 방법. 96. 실시 양태 91에 있어서, 표적 염색체 영역으로부터의 무세포 태아 핵산 분자를 태그하는 단계를 포함하는 방법. 97. 피험체의 유체 샘플을 수집하도록 구성된 샘플 수집기; 유체 샘플로부터 샘플 성분을 단리하도록 구성된 샘플 처리기; 유체 샘플 또는 샘플 성분에서 핵산을 검출하도록 구성된 핵산 검출기; 및 핵산 정보 출력을 포함하는 시스템. 98. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함하는 시스템. 99. 실시 양태 97에 있어서, 경피 천자 장치는 바늘, 란셋, 미세바늘, 진공 및 미세바늘 배열 중 적어도 하나를 포함하는 시스템. 100. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 성분은 세포, 탄수화물, 인지질, 단백질, 핵산 및 미세 소포로부터 선택되는 시스템. 101. 실시 양태 100 또는 101에 있어서, 샘플 성분은 혈액 세포인 시스템. 102. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하지 않는 시스템. 103. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하는 시스템. 104. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 성분은 혈장 또는 혈청인 시스템. 105. 실시 양태 104에 있어서, 샘플 정제기는 1 밀리리터 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템. 106. 실시 양태 105에 있어서, 샘플 정제기는 250 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템. 107. 실시 양태 105에 있어서, 샘플 정제기는 150 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템. 108. 실시 양태 105에 있어서, 샘플 정제기는 100 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템. 109. 실시 양태 97에 있어서, 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함하는 시스템. 110. 실시 양태 97에 있어서, 표지를 포함하며, 유체 샘플에서 관심의 핵산을 표지하도록 구성되고, 핵산 검출기는 샘플에서 관심의 핵산의 표시를 검출하기 위해 표지를 카운트하는 카운팅 시스템을 포함하는 시스템. 111. 실시 양태 110에 있어서, 시스템은 표지를 포함하며, 표지는 관심의 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 시스템. 112. 실시 양태 111에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 관심의 염색체 영역에 특이적인 시스템. 113. 실시 양태 112에 있어서, 관심의 염색체 영역은 염색체 13, 염색체 16, 염색체 18, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X, 및 염색체 Y로부터 선택된 염색체상에 위치하는 시스템. 114. 실시 양태 112에 있어서, 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 서열을 포함하거나, 포함할 수 있는 시스템. 115. 실시 양태 112에 있어서, 관심의 염색체 영역은 질환 또는 병태를 나타내는 적어도 하나의 후성 유전적 변형을 포함하거나 포함할 수 있는 시스템. 116. 실시 양태 114 또는 115에 있어서, 병태는 유전적 이상인 시스템. 117. 실시 양태 114 또는 115에 있어서, 질환은 암인 시스템. 118. 실시 양태 114 또는 115에 있어서, 병태는 이식된 조직 또는 기관인 시스템. 119. 실시 양태 97에 있어서, 프라이머, 폴리머라제, 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 핵산 증폭 시약을 포함하는 시스템. 120. 실시 양태 119에 있어서, 적어도 1종의 핵산 증폭 시약은 적어도 1종의 등온 증폭 시약을 포함하는 시스템. 121. 실시 양태 119에 있어서, 적어도 1종의 등온 증폭 시약은 재조합 효소 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 가닥 치환 폴리머라제 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템. 122. 실시 양태 97 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1종의 핵산 증폭 시약 및 적어도 1종의 크라우딩제를 포함하는 시스템. 123. 실시 양태 97에 있어서, 유체 샘플로부터 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하기 위한 적어도 제1 표지, 및 적어도 1종의 증폭 시약을 포함하는 시스템. 124. 실시 양태 123에 있어서, 시스템은 적어도 1종의 증폭 시약으로 무세포 핵산을 증폭시켜 적어도 하나의 앰플리콘을 생성하고 적어도 하나의 앰플리콘을 적어도 제1 표지와 접촉시켜 라이브러리를 생성하도록 구성되는 시스템. 125. 실시 양태 124에 있어서, 시스템은 적어도 하나의 앰플리콘을 검출 가능한 제2 표지과 접촉시키도록 구성되는 시스템. 126. 실시 양태 97에 있어서, 시스템은 라이브러리를 생성하고 적어도 1종의 증폭 시약으로 라이브러리의 적어도 하나의 구성원을 증폭시키도록 구성되는 시스템. 127. 실시 양태 97에 있어서, 핵산 서열 출력은 무선 통신 장치, 유선 통신 장치, 케이블 포트 및 전자 디스플레이로부터 선택되는 시스템. 128. 실시 양태 97에 있어서, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 위치에 존재하는 시스템. 129. 실시 양태 97에 있어서, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 장치에 수용되는 시스템. 130. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 수집기는 제1 위치에 위치하고 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나는 제2 위치에 위치하는 시스템. 131. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나와 샘플 수집기는 동일한 위치에 위치하는 시스템. 132. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 정제기는 필터를 포함하는 시스템. 133. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 정제기는 생물학적 유체를 필터를 통해 밀거나 당기기 위한 위킹 물질 또는 모세관 장치를 포함하는 시스템. 134. 실시 양태 147에 있어서, 필터는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는 시스템. 135. 실시 양태 97에 있어서, 샘플 정제기는 생물학적 유체 샘플에서 핵산, 단백질, 세포 표면 마커, 또는 미세 소포 표면 마커에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 시스템. 136. 실시 양태 135에 있어서, 결합 모이어티는 항체, 항원 결합 항체 단편, 리간드, 수용체, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템. 137. 실시 양태 135에 있어서, 결합 모이어티는 세포 외 소포에 결합할 수 있으며, 세포 외 소포는 여성 피험체의 태아 세포 또는 태반 세포로부터 방출되는 시스템. 138. 실시 양태 135에 있어서, 결합 모이어티는 고체 지지체에 부착되며, 고체 지지체는 나머지 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있거나 생물학적 샘플은 결합 모이어티가 생물학적 샘플과 접촉한 후 고체 지지체로부터 분리될 수 있는 시스템. 139. 실시 양태 97에 있어서, 유체 샘플의 적어도 일부를 운반 또는 보관하기 위한 운반 또는 보관 구획을 포함하는 시스템. 140. 실시 양태 139에 있어서, 운반 또는 보관 구획은 흡수 패드, 유체 용기, 샘플 보존제 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템. 141. 실시 양태 139에 있어서, 운반 또는 보관 구획에는 운반 또는 보관을 위해 유체 샘플의 세포를 안정화시키는 시약 또는 물질이 들어 있는 시스템. 142. 실시 양태 97에 있어서, 그의 구성 요소의 장치를 가열 또는 냉각하기 위한 컨테이너, 파우치, 와이어 및 케이블 중 적어도 하나를 포함하는 시스템. 143. 실시 양태 97에 있어서, 시스템은 무세포 핵산의 수복, 정제, 증폭, 및 서열 분석 중 적어도 하나를 위한 적어도 하나의 완충액을 포함하는 시스템. 145. 피험체에서 종양의 존재를 검출하기 위한 실시 양태 97에 따른 시스템의 용도. 146. 피험체에서 태아의 이수성을 검출하기 위한 실시 양태 97에 따른 시스템의 용도. 147. 피험체에서 이식된 기관의 상태를 검출하기 위한 실시 양태 97에 따른 시스템의 용도.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 다양한 실시 양태를 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 본 장치, 시스템 및 키트를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 현재 바람직한 실시 양태를 대표하고, 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자라면 그 안에서의 변경 및 청구 범위의 범주에 의해 정의된 바와 같이 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 취지 내에 포함된 다른 용도를 생각해 낼 것이다.
실시예 1: 초저량(~20 ㎕)의 모체 혈액에서 삼염색체 검출,
삼염색체 검출은 다른 염색체에서 유래한 유전 물질과 비교되는 염색체에서 유래한 유전 물질의 정확한 표시에 의존한다. 이 비율은 정배수체 집단에서의 비율의 분포와 비교된다. ((chr21/chr.all)-중앙값(chr21))/MAD(chr21)의 비율이 해당 분포와 통계적으로 충분히 다른 경우 삼염색체라고 한다.
10% 태아 분율은 임신 나이 9주 이상의 전형적인 집단의 중앙값이지만, 모든 샘플이 태아 분율 수준이 10%만큼 높지는 않을 것이고 일부는 훨씬 더 높은 수준을 가질 수 있다. 태아 분율의 전형적인 컷오프는 4%이다. 전형적인 집단에서 태아 분율의 분포를 고려하고 특이성(99.9%) 및 민감도(99%)에 대해 더 일반적인 컷오프 값이 필요한 모델은 이 방법의 입력 요건을 설명하는 데 도움이 될 수 있다. 약 500만 개의 마커 카운트(서열 리드)로 이 민감도가 달성될 수 있다. 그러나 염색체당 하나의 마커를 분석하는 경우 30,000의 세포 당량이 필요하며 이는 실현 가능하지 않다.
본원에 개시된 방법 및 시스템은 각각의 게놈 당량이 아폽토시스 과정을 통해 본질적으로 2천만 개의 cfDNA 단편으로 나뉜다는 사실에 기초한다(게놈당 30억 염기쌍이 평균 크기 150 염기쌍의 cfDNA로 나뉨). cfDNA의 모든 단일 분자를 혈액에서 서열 분석기로 옮길 수 있는 경우, 1/4 배의 정배수체 게놈의 당량이 분석에 충분하다는 의미이다.
그러나 실제로 공정의 모든 단계는 다양한 양의 DNA 손실에 의해 저해된다. 따라서 훨씬 더 많은 양이 샘플링되고 라이브러리 생성 및 서열 분석 공정을 통해 이동된다. DNA 손실은 공정의 모든 단계에서 발생하지만, 가장 큰 손실은 일반적으로 라이브러리 제조 단계에서 나타난다. 종래의 방법은 물질의 80% 내지 90%의 손실을 보여준다. 종종 이러한 손실은 후속 증폭 단계(보편적(Universal) PCR)에 의해 보상되어 DNA의 농도를 차세대 서열 분석에 필요한 수준까지 끌어올린다. 증폭은 서열 분석에 이용 가능한 전체 핵산 물질을 증가시키는 좋은 방법이지만, 특정 조건하에서 증폭은 이전 단계에서 발생한 정보의 손실을 보상할 수 없다. 정보의 손실을 이해하기 위해 간단한 사고 실험이 도움이 될 수 있다. 20*109개의 cfDNA 단편을 나타내는 1000 게놈 당량으로 시작한다고 가정하자. 막대한 손실을 가정하고 증폭을 위해 두 개의 단편만이 사용 가능한 경우. 참조 영역에서 하나의 단편과 표적 영역에서 하나의 단편. 2개의 단편만으로는 서열 분석 장비를 로딩하기에 충분하지 않지만, 증폭(PCR)을 통해 각 단편을 수십억 번 쉽게 복제할 수 있다. 이제 증폭 후 서열 분석 공정을 시작하기에 충분한 물질을 사용할 수 있지만 샘플의 정보는 이 두 복제본에 유지된 정보로 축소되었다. 그리고 이 경우 두 가지 유형의 샘플 모두 구별할 수 없는 50% 비율을 나타낼 것이기 때문에 정배수체 및 삼염색체 샘플의 분류에는 정보가 충분하지 않는다.
전형적인 차세대 서열 분석기의 사양은 5 ㎕의 4 nM 용액을 995 ㎕ NaOH에 희석하여 20 pM 용액을 만들어 그의 600 ㎕를 서열 분석기 상에 로딩할 것을 요구한다. 결과적으로, 2천만 서열 분석 카운트를 생성하기 위해 총 1.2*1010개의 DNA 단편이 필요하다. 전술한 바와 같이, 4개의 샘플에는 2천만 카운트가 충분하므로 각 샘플은 ~3*109개의 DNA 단편을 제공해야 한다(각 게놈 당량은 2천만 개의 DNA 단편을 제공하기 때문에 손실이 없이 증폭이 일어나지 않을 때 총 150 게놈 당량이 필요할 것이다. 이는 [도 6]에 개략적으로 설명되어 있다.
전형적인 NIPT 프로토콜은 많은 양의 cfDNA(6000 게놈 당량)로 시작하며, 이는 라이브러리 제조 중에 많은 양의 손실을 허용한다. 이어서, 물질은 서열 분석에 적합하도록 증폭시키고 고도로 희석한다. 전형적인 NIPT 프로토콜의 문제점은 라이브러리 제조 중에 많은 양의 손실에 이어서 고도로 희석되어 염색체에서 유래하는 유전 물질의 부정확한 표시으로 이어진다는 점이다.
예를 들어, 전형적인 샘플은 ml의 혈장에 1500 게놈 당량의 cfDNA를 함유한다. 보통 8 내지 10 ml의 채혈로 약 4 ml의 혈장이 생성되며 결과적으로 6000 게놈 당량의 cfDNA를 생성한다. DNA 추출 효율(90%) 및 라이브러리 제조 효율(10%)에 대한 전형적인 수치를 가정하면 약 540 게놈 당량이 증폭(일반적으로 8 내지 10 사이클, 여기서 예시로서 1000배 증폭)으로 이동했다. 증폭 후, 총 540000 게놈 당량 또는 1.08*1013개의 DNA 단편이 서열 분석에 이용 가능하다. 증폭된 라이브러리를 필요한 4nM로 조정하기 위해 1000배 초과하여 희석한다. 표 1을 참조한다.
Figure pct00001
이 데이터는 공정에서 생성된 과량의 DNA 단편으로 인해, 100 ㎕ 미만의 혈액 용량을 수용하도록 반응 규모를 간단히 축소할 수 있음을 잘못 암시할 수 있다. 그러나 앞에서 언급한 정보 손실로 인해 가능하지 않다. 표 2를 참조한다. PCR 증폭(~10 사이클)뿐만 아니라 DNA 추출(효율 90%) 및 라이브러리 제조(효율 10%) 중의 손실을 고려한 태아 분율의 하한(4%)에서 모의실험을 수행하면 그 민감도가 입력 DNA 물질의 25개(10의 변곡점) 복제본 미만으로 감소함을 보인다. 10개의 복제본에서의 민감도는 89%로 감소하고 5개의 복제본에서 81%로 감소하며, 두 개의 값 모두는 4% 태아 분율의 샘플에 대해 ~ 95%의 이론적 민감도가 요구되는 시장에서는 허용되지 않을 것이다. [도 7]을 참조한다.
Figure pct00002
대조적으로, 본 개시 내용은 라이브러리 제조 효율을 증가시켜 라이브러리 제조 중에 많은 양의 손실을 방지하고 과증폭 및 높은 희석의 필요성을 제거하는 방법, 시스템 및 장치를 제공한다. 따라서, 본 개시 내용은 염색체에서 유래하는 유전 물질의 정확한 표시를 유지함으로써 전형적인 NIPT 프로토콜과 관련된 문제를 해결한다. 본 실시 양태에 따라 라이브러리 효율을 증가시키고 증폭을 감소시킴으로(예를 들어, 크라우딩제, 말단 수복으로) 5 미만의 복제본 수(게놈 당량)에서도 보존되고 95% 초과의 민감도를 갖는 더 많은 유전 정보를 초래한다. 표 3 및 [도 7]을 참조한다.
Figure pct00003
실시예 2. 초저 입력량의 ccfDNA(1-20 게놈 당량)을 이용한 낮은 커버리지 의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석의 실행 가능성.
정맥 천자를 통해 남성 전혈(10 ml)을 Streck 무세포 DNA BCT에 수집하고 다음과 같이 이중 스핀 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다:
스핀 1 - 브레이크 없이 1330 rpm 20분
스핀 2 - 3300 rpm 10분
혈장은 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관하였다. 55 ㎕의 EB에서 용리시키면서 제조자의 프로토콜에 따라 Quiagen 순환 핵산 추출 키트의 4 ml 프로토콜을 사용하여 혈장으로부터 순환하는 무세포 DNA를 추출하였다. Quantstudio 6 실시간 기기에서 SRY/RNase P Taqman biplex qPCR 분석(Life Technologies)을 사용하여 각 샘플에 대한 게놈 당량을 결정하였다. Illumina를 위한 NEBNext Multiplex Oligos(인덱스 세트 프라이머 1)(New England Biolabs)와 함께 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리 제조를 위한 주형 ccfDNA를 라이브러리당 96 GE에서 1GE로 줄여 1:5로 적정하였다. 더 적은 주형 양의 화학량론을 설명하기 위해 감소된 용량을 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 사용된 용량은 주형의 입력량에 따라 달랐다. 라이브러리 제조는 다음과 같이 이루어진다:
1. 20℃에서 30분간 65℃에서 30분간의 인큐베이션에 의한 말단 수복, 5'-인산화 및 A 테일링.
2. 20℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 어댑터 결찰 후, 37℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 결찰된 어댑터 루프의 절단. 어댑터는 1:25로 0.6 μM 작용 농도로 희석하였다. 이어서, 절단된 어댑터 결찰된 라이브러리를 SPRISelect 비드를 사용하여 비드 기반 정제를 수행하였다. 어댑터 결찰 후 고도로 단편화된 저농도 ccfDNA의 결합을 더 향상시키기 위해 비드의 용량을 116 ㎕로 증가시켰다.
3. 98℃에서 1분간의 초기 변성, 이어서 10초간의 98℃ 변성의 13 사이클의 라이브러리 증폭/인덱싱, 및 65℃에서 5분간의 최종 연장을 포함한 65℃에서 75초간의 어닐링/연장. 이어서 증폭된 라이브러리를 SPRISelect 비드(45 ㎕)를 사용하여 정제하였다.
모든 라이브러리는 High-Sensitivity DNA Chip(Agilent Technologies)과 함께 Agilent Bioanalyzer 2100을 사용하여 크기를 정하고 특성화하였다. 서열 분석 전에 라이브러리 희석을 위해 Qubit v3.0(Life Technologies)을 사용하여 농도를 결정하였다. 각각의 라이브러리를 2 nM의 농도로 정규화하고 서열 분석 전에 변성 및 희석을 위해 풀링하였다. 1.5 pM의 로딩 농도에서 Illumina NextSeq 550을 사용하여 합성에 의한 서열 분석을 수행하였다. 각각의 인덱스/샘플에 대해 75 사이클의 페어드 엔드 서열 분석(2x75)을 수행하였다. 일반적으로 각 샘플은 각 방향으로 약 4백만 개의 통과된 필터 리드를 생성했다. 모든 서열 분석 데이터(fasta.gz 파일)는 정렬 매개 변수 "-k 1-n 0"에 의한 Bowtie를 사용하여 인간 참조 게놈 구축 hg38에 대해 정렬하였다. 추가 분석을 위해, 인간 게놈을 50 kb 빈으로도 불리는 연속 50,000 염기쌍 영역으로 나누고, 염기 "G" 및 "C"의 분율을 각 빈에 대해 최대 소수점 3자리까지 계산하였다. 각 빈에 대해, 빈에서 시작하는 정렬된 서열 리드를 카운트하였다. 추가 분석을 위해, 염색체 1 내지 22가 아닌 빈(예를 들어, 염색체 X 및 Y는 제외됨)을 필터링하여 데이터를 감소시켰다. 이 필터링 후, 빈당 GC 함량과 리드 카운트 사이의 뢰스 회귀 분석을 수행하고 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 뢰스 회귀 분석은 각 GC 함량 값에 대해 기댓값이라고도 하는 예상되는 빈 카운트를 제공하였다. 이 기댓값을 빈 카운트의 중앙값으로 나누어 보정 계수를 얻었다. 이어서 측정된 빈 카운트를 보정 계수로 나누어 GC 보정된 빈 카운트를 산출하고 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 모든 50 kb 빈을 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값으로 나눠서 GC 정규화된 빈 카운트를 산출하고 각 빈에 대해 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD: median absolute deviation)를 계산하였다. MAD가 낮고 대략 기댓값이 1인 중앙값을 가진 빈을 선택하였다(MAD> = 0.25 또는 중앙값 <0.7 또는 중앙값> 1.3인 빈을 필터링함).
감소한 양의 ccfDNA 입력으로부터 라이브러리의 전기영동도를 생성하였고, 입력에 따라 총 라이브러리 산물은 감소하지만, 어댑터 이량체 양은 크게 증가하지는 않음을 보였다. [도 8a-8c]를 참조한다. y 축은 상대 형광 단위(강도)를 나타내고 x 축은 시간을 초 단위로 나타낸다. 70초에서의 1차 피크는 원하는 300bp 라이브러리 산물이다. [도 8a], [도 8b] 및 [도 8c]에서, 입력 게놈 당량은 20 GE로부터 1:5로 적정한다. 1 GE로 입력을 낮추어 훨씬 높은 주형 입력을 가진 다른 정배수체 샘플과 비교하여 허용 가능한 서열 분석 메트릭스(metrics)를 사용하여 합성에 의해 실행 가능한 서열 분석을 위한 충분한 라이브러리를 생성하였다.
실시예 3. 모세혈로부터 단리된 초저 입력량의 ccfDNA(10 게놈 당량)로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 이용한 낮은 분율 Y-염색체(2.5% 이상)의 검출.
접촉 활성화된 란셋(BD Microtainer) 및 SAFE-T_FILL 모세혈 수집 장치(KABE Labortechnik, GMBH)로의 혈액 수집을 이용하여 손가락 끝 모세관상 천자에 의해 여성 또는 남성 전혈을 수집하였다. 모세혈을 다음과 같이 이중 스핀 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다:
스핀 1 - 1330 rpm 20분
스핀 2 - 3300 rpm 10분
혈장은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 남성 혈장은 2.5%-20 부피% 범위의 다양한 백분율로 여성 혈장에 섞었다. 이어서, MagMax 무세포 DNA 단리 키트(Life Technologies)로 10 ㎕의 혈장에 대한 변형된 프로토콜을 사용하여 혈장으로부터 순환하는 무세포 DNA를 추출하였다. 단리는 다음 단계로 이루어졌다:
1. 프로테이나아제 K(출발 입력에 따른 용량)와 혈장의 60℃에서 20분간의 인큐베이션.
2. 실온에서 10분간의 결합으로 혈장의 용해/DynaBeads MyOne Silane 상자성 비드(2.5-5 ㎕)와의 결합.
3. 비드/ccfDNA 복합체의 세척(출발 입력에 따른 용량).
4. 80% 에탄올(출발 입력에 따른 용량)로 비드/ccfDNA 복합체의 헹굼.
5. 실온에서 2분간의 인큐베이션으로 비드로부터 ccfDNA의 용리(출발 입력에 따른 용량).
각 샘플의 게놈 당량은 10 ㎕-4000 ㎕ 범위의 용량의 이전의 추출 및 공개된 데이터를 기준으로 추정하여 ㎕의 혈장당 1 GE가 되도록 하였다. 용리된 모든 ccfDNA를 라이브러리 생성을 위한 입력으로서 사용하였다. Illumina를 위한 NEBNext Multiplex Oligos(인덱스 세트 프라이머 1)(New England Biolabs)와 함께 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하였다. 더 적은 주형 양의 화학량론을 설명하기 위해 감소된 용량을 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 사용된 용량은 주형의 입력량에 따라 달랐다. 라이브러리 제조는 다음과 같이 이루어진다:
1. 20℃에서 30분간 65℃에서 30분간의 인큐베이션에 의한 말단 수복, 5'-인산화 및 A 테일링.
2. 20℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 어댑터 결찰 후, 37℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 결찰된 어댑터 루프의 절단. 어댑터는 1:25로 0.6 μM 작용 농도로 희석하였다. 이어서, 절단된 어댑터 결찰된 라이브러리를 SPRISelect 비드를 사용하여 비드 기반 정제를 수행하였다. 어댑터 결찰 후 고도로 단편하된 저농도 ccfDNA의 결합을 더 향상시키기 위해 비드의 부피를 116 ㎕로 증가시켰다.
3. 98℃에서 1분간의 초기 변성, 이어서 10초간의 98℃ 변성의 13 사이클의 라이브러리 증폭/인덱싱, 및 65℃에서 5분간의 최종 연장을 포함한 65℃에서 75초간의 어닐링/연장. 이어서 증폭된 라이브러리를 SPRISelect 비드(45 ㎕)를 사용하여 정제하였다.
모든 라이브러리는 High-Sensitivity DNA Chip(Agilent Technologies)과 함께 Agilent Bioanalyzer 2100을 사용하여 크기를 정하고 특성화하였다. 서열 분석 전에 라이브러리 희석을 위해 Qubit v3.0(Life Technologies)을 사용하여 농도를 결정하였다. 각각의 라이브러리를 2 nM의 농도로 정규화하고 서열 분석 전에 변성 및 희석을 위해 풀링하였다. 1.5 pM의 로딩 농도에서 Illumina NextSeq 550을 사용하여 합성에 의한 서열 분석을 수행하였다. 각각의 인덱스/샘플에 대해 75 사이클의 페어드 엔드 서열 분석(2x75)을 수행하였다. 일반적으로 각 샘플은 약 4백만 개의 통과된 필터 리드를 생성했다. 모든 서열 분석 데이터(fasta.gz 파일)는 정렬 매개 변수 "-k 1-n 0"에 의한 Bowtie를 사용하여 인간 참조 게놈 구축 hg38에 대해 정렬하였다. 추가 분석을 위해, 인간 게놈을 50 kb 빈으로도 불리는 연속 50,000 염기쌍 영역으로 나누고, 염기 "G" 및 "C"의 분율을 각 빈에 대해 최대 소수점 3자리까지 계산하였다. 각 빈에 대해, 빈에서 시작하는 정렬된 서열 리드를 계산하였다. 추가 분석을 위해, 염색체 1 내지 22가 아닌 빈(예를 들어, 염색체 X 및 Y는 제외됨)을 필터링하여 데이터를 감소시켰다. 이 필터링 후, 빈당 GC 함량과 리드 카운트 사이의 뢰스 회귀 분석을 수행하고 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 뢰스 회귀 분석은 각 GC 함량 값에 대해 기댓값이라고도 하는 예상되는 빈 카운트를 제공하였다. 이 기댓값을 빈 카운트의 중앙값으로 나누어 보정 계수를 얻었다. 이어서 측정된 빈 카운트를 보정 계수로 나누어 GC 보정된 빈 카운트를 산출하고 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 모든 50 kb 빈을 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값으로 나눠서 GC 정규화된 빈 카운트를 산출하고 각 빈에 대해 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD)를 계산하였다. MAD가 낮고 대략 기댓값이 1인 중앙값을 가진 빈을 선택하였다(MAD> = 0.25 또는 중앙값 <0.7 또는 중앙값> 1.3인 빈을 필터링함). 구체적으로, Y 염색체 표시의 계산을 위해, 염색체 Y에서 유래하는 빈에 대해 뢰스 회귀 분석을 수행하였다. [도 10] 및 [도 11]을 참조한다. [도 10]은 남성 및 여성 DNA의 모세혈/혈장 혼합물로부터 단리된 초저 입력량의 cfDNA로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 이용한 낮은 분율 Y 염색체(2.5% 이상)의 검출을 보여준다. 손가락 찌름에 의해 수집된 모세혈로부터 유래된 여성/남성 혈장의 혼합물에서 초저용량의 cfDNA로, 여전히 남성 모세혈 유래 혈장의 양이 증가함에 따라 염색체 Y 표시의 상응하는 증가를 나타낸다. [도 11]은 페어드 엔드 서열 분석 데이터에 기초하여 모세혈 및 정맥혈로부터의 cfDNA 사이의 cfDNA 단편 크기 분포 비교를 보여준다. 정맥혈 및 모세혈에서 유래한 초저량의 혈장으로부터 cfDNA의 크기 프로파일은 비슷해 보인다. 염색체 Y에서 유래한 서열 리드의 백분율 표시는 염색체 Y에서 유래한 빈에 대한 모든 GC 정규화된 값을 합산하고 염색체 21과 19에서 유래한 값을 제외한 모든 GC 정규화된 값의 합계로 나누어 계산하였다.
실시예 4. 초저 입력량의 ccfDNA(10 게놈 당량)로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈의 서열 분석을 이용한 낮은 분율 Y-염색체(2.5% 이상)의 검출.
정맥 천자에 의해 여성 또는 남성 전혈(10 ml)을 Streck 무세포 DNA BCT에 수집하고, 다음과 같이 이중 스핀 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다:
스핀 1 - 브레이크 없이 1330 rpm 20분
스핀 2 - 3300 rpm 10분
혈장은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 남성 혈장은 2.5%-20 부피% 범위의 다양한 백분율로 여성 혈장에 섞었다. 이어서, MagMax 무세포 DNA 단리 키트(Life Technologies)로 10 ㎕ 또는 20 ㎕의 혈장에 대한 변형된 프로토콜을 사용하여 혈장으로부터 순환하는 무세포 DNA를 추출하였다. 단리는 다음 단계로 이루어졌다:
1. 프로테이나아제 K(출발 입력에 따른 용량)와 혈장의 60℃에서 20분간의 인큐베이션.
2. 실온에서 10분간의 결합으로 혈장의 용해/DynaBeads MyOne Silane 상자성 비드(2.5-5 ㎕)와의 결합.
3. 비드/ccfDNA 복합체의 세척(출발 입력에 따른 용량).
4. 80% 에탄올(출발 입력에 따른 용량)로 비드/ccfDNA 복합체의 헹굼.
5. 실온에서 2분간의 인큐베이션으로 비드로부터 ccfDNA의 용리(출발 입력에 따른 용량).
각 샘플의 게놈 당량은 10 ㎕-4000 ㎕ 범위의 용량의 이전의 추출 및 공개된 데이터를 기준으로 추정하여 ㎕의 혈장당 1 GE가 되도록 하였다. 용리된 모든 ccfDNA를 라이브러리 생성을 위한 입력으로서 사용하였다. Illumina를 위한 NEBNext Multiplex Oligos(인덱스 세트 프라이머 1)(New England Biolabs)와 함께 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하였다. 더 적은 주형 양의 화학량론을 설명하기 위해 감소된 용량을 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 사용된 용량은 주형의 입력량에 따라 달랐다. 라이브러리 제조는 다음과 같이 이루어진다:
1. 20℃에서 30분간 65℃에서 30분간의 인큐베이션에 의한 말단 수복, 5'-인산화 및 A 테일링.
2. 20℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 어댑터 결찰 후, 37℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 결찰된 어댑터 루프의 절단. 어댑터는 1:25로 0.6 μM 작용 농도로 희석하였다. 이어서, 절단된 어댑터 결찰된 라이브러리를 SPRISelect 비드를 사용하여 비드 기반 정제를 수행하였다. 어댑터 결찰 후 고도로 단편하된 저농도 ccfDNA의 결합을 더 향상시키기 위해 비드의 부피를 116 ㎕로 증가시켰다.
3. 98℃에서 1분간의 초기 변성, 이어서 10초간의 98℃ 변성의 13 사이클의 라이브러리 증폭/인덱싱, 및 65℃에서 5분간의 최종 연장을 포함한 65℃에서 75초간의 어닐링/연장. 이어서 증폭된 라이브러리를 SPRISelect 비드(45 ㎕)를 사용하여 정제하였다.
모든 라이브러리는 High-Sensitivity DNA Chip(Agilent Technologies)과 함께 Agilent Bioanalyzer 2100을 사용하여 크기를 정하고 특성화하였다. 서열 분석 전에 라이브러리 희석을 위해 Qubit v3.0(Life Technologies)을 사용하여 농도를 결정하였다. 각각의 라이브러리를 2 nM의 농도로 정규화하고 서열 분석 전에 변성 및 희석을 위해 풀링하였다. 1.5 pM의 로딩 농도에서 Illumina NextSeq 550을 사용하여 합성에 의한 서열 분석을 수행하였다. 각각의 인덱스/샘플에 대해 75 사이클의 페어드 엔드 서열 분석(2x75)을 수행하였다. 일반적으로 각 샘플은 약 4백만 개의 통과된 필터 리드를 생성했다. 모든 서열 분석 데이터(fasta.gz 파일)는 정렬 매개 변수 "-k 1-n 0"에 의한 Bowtie를 사용하여 인간 참조 게놈 구축 hg38에 대해 정렬하였다. 추가 분석을 위해, 인간 게놈을 50 kb 빈으로도 불리는 연속 50,000 염기쌍 영역으로 나누고, 염기 "G" 및 "C"의 분율을 각 빈에 대해 최대 소수점 3자리까지 계산하였다. 각 빈에 대해, 빈에서 시작하는 정렬된 서열 리드를 카운트하였다. 추가 분석을 위해, 염색체 1 내지 22가 아닌 빈(예를 들어, 염색체 X 및 Y는 제외됨)을 필터링하여 데이터를 감소시켰다. 이 필터링 후, 빈당 GC 함량과 리드 카운트 사이의 뢰스 회귀 분석을 수행하고 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 뢰스 회귀 분석은 각 GC 함량 값에 대해 기댓값이라고도 하는 예상되는 빈 카운트를 제공하였다. 이 기댓값을 빈 카운트의 중앙값으로 나누어 보정 계수를 얻었다. 이어서 측정된 빈 카운트를 보정 계수로 나누어 GC 보정된 빈 카운트를 산출하고 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 모든 50 kb 빈을 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값으로 나눠서 GC 정규화된 빈 카운트를 산출하고 각 빈에 대해 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD)를 계산하였다. MAD가 낮고 대략 기댓값이 1인 중앙값을 가진 빈을 선택하였다(MAD> = 0.25 또는 중앙값 <0.7 또는 중앙값> 1.3인 빈을 필터링함).
구체적으로 Y 염색체 표시의 계산을 위해, 염색체 Y로부터 유래하는 빈에 대해 뢰스 회귀 분석을 또한 수행하였다. 염색체 Y에서 유래한 서열 리드의 백분율 표시는 염색체 Y에서 유래한 빈에 대한 모든 GC 정규화된 값을 합산하고 염색체 21과 19에서 유래한 값을 제외한 모든 GC 정규화된 값의 합계로 나누어 계산하였다. [도 9]를 참조한다. [도 9]는 정맥혈로부터 단리된 초저 입력량의 cfDNA(10 게놈 당량)로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 이용한 낮은 분율 Y 염색체(2.5% 이상)의 검출을 보여준다. 남성 혈장을 고정된 양으로 여성 혈장에 혼합하여 여성/남성 혈장 혼합물을 생성하였다. cfDNA를 혈장 혼합물로부터 추출하고 서열 분석하였다. 염색체 Y의 표시를 결정하여 여성 혈장에 혼합된 남성 혈장의 양이 증가함에 따라 염색체 Y 표시의 상응하는 증가가 초저 입력량의 cfDNA로부터 여전히 정확하게 검출될 수 있음을 보였다.
실시예 5. 초저 입력량의 ccfDNA(10 게놈 당량)로 낮은 커버리지의 합성에 의한 전체 게놈 서열 분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 검출.
정맥 천자에 의해 전혈(10 ml)을 Streck 무세포 DNA BCT에 수집하고, 이중 스핀 원심 분리에 의해 혈장으로 처리하였다. 혈장을 신선하게 처리하고, 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관하였다. 이어서, 상자성 비드를 갖는 1.2 ml의 혈장에 대한 변형된 프로토콜을 사용하여 혈장으로부터 순환하는 무세포 DNA를 추출하였다. 단리는 다음 단계로 이루어졌다:
1. 용해/결합을 위해 프로테이나아제 K, 글리코겐 및 용해 완충액 및 비드와 혈장의 60℃에서 20분간의 인큐베이션.
2. 비드/ccfDNA 복합체의 세척.
3. 55℃에서 10분간의 인큐베이션으로 비드(42 ㎕)로부터 ccfDNA의 용리.
상류 적용을 위해 추출된 DNA를 정량화하였다. 모든 샘플을 라이브러리당 33pg(10GE)의 총 입력에 정규화하였다. Illumina를 위한 NEBNext Multiplex Oligos(인덱스 세트 프라이머 1)(New England Biolabs)와 함께 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하였다. 더 적은 주형 양의 화학량론을 설명하기 위해 감소된 용량을 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 사용된 용량은 주형의 입력량에 따라 달랐다. 라이브러리 제조는 다음과 같이 이루어진다:
1. 20℃에서 30분간 65℃에서 30분간의 인큐베이션에 의한 말단 수복, 5'-인산화 및 A 테일링.
2. 20℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 어댑터 결찰 후, 37℃에서 15분간의 인큐베이션에 의한 결찰된 어댑터 루프의 절단. 어댑터는 1:25로 0.6 μM 작용 농도로 희석하였다. 이어서, 절단된 어댑터 결찰된 라이브러리를 SPRISelect 비드를 사용하여 비드 기반 정제를 수행하였다. 어댑터 결찰 후 고도로 단편화된 저농도 ccfDNA의 결합을 더 향상시키기 위해 비드의 부피를 116 ㎕로 증가시켰다.
3. 98℃에서 1분간의 초기 변성, 이어서 10초간의 98℃ 변성의 13 사이클의 라이브러리 증폭/인덱싱, 및 65℃에서 5분간의 최종 연장을 포함한 65℃에서 75초간의 어닐링/연장. 이어서 증폭된 라이브러리를 SPRISelect 비드(45 ㎕)를 사용하여 정제하였다.
모든 라이브러리는 High-Sensitivity DNA Chip(Agilent Technologies)과 함께 Agilent Bioanalyzer 2100을 사용하여 크기를 정하고 특성화하였다. 서열 분석 전에 라이브러리 희석을 위해 Qubit v3.0(Life Technologies)을 사용하여 농도를 결정하였다. 각각의 라이브러리를 2 nM의 농도로 정규화하고 서열 분석 전에 변성 및 희석을 위해 풀링하였다. 1.5 pM의 로딩 농도에서 Illumina NextSeq 550을 사용하여 합성에 의한 서열 분석을 수행하였다. 각각의 인덱스/샘플에 대해 75 사이클의 페어드 엔드 서열 분석(2x75)을 수행하였다. 일반적으로 각 샘플은 약 4백만 개의 통과된 필터 리드를 생성했다. 모든 서열 분석 데이터(fasta.gz 파일)는 정렬 매개 변수 "-k 1-n 0"에 의한 Bowtie를 사용하여 인간 참조 게놈 구축 hg38에 대해 정렬하였다. 추가 분석을 위해, 인간 게놈을 50 kb 빈으로도 불리는 연속 50,000 염기쌍 영역으로 나누고, 염기 "G" 및 "C"의 분율을 각 빈에 대해 최대 소수점 3자리까지 계산하였다. 각 빈에 대해, 빈에서 시작하는 정렬된 서열 리드를 카운트하였다. 추가 분석을 위해, 염색체 1 내지 22가 아닌 빈(예를 들어, 염색체 X 및 Y는 제외됨)을 필터링하여 데이터를 감소시켰다. 이 필터링 후, 빈당 GC 함량과 리드 카운트 사이의 뢰스 회귀 분석을 수행하고 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 뢰스 회귀 분석은 각 GC 함량 값에 대해 기댓값이라고도 하는 예상되는 빈 카운트를 제공하였다. 이 기댓값을 빈 카운트의 중앙값으로 나누어 보정 계수를 얻었다. 이어서 측정된 빈 카운트를 보정 계수로 나누어 GC 보정된 빈 카운트를 산출하고 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 모든 50 kb 빈을 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값으로 나눠서 GC 정규화된 빈 카운트를 산출하고 각 빈에 대해 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD)를 계산하였다. MAD가 낮고 대략 기댓값이 1인 중앙값을 가진 빈을 선택하였다(MAD> = 0.25 또는 중앙값 <0.7 또는 중앙값> 1.3인 빈을 필터링함).
감소되고 정규화된 데이터로부터, 염색체 21에서 유래하는 모든 서열 빈을 확인하였다. 염색체 21에서 유래한 서열 리드의 백분율 표시는 모든 GC 정규화된 값을 합산하고 그 합계를 염색체 21 및 19(게다가 이전 단계에서 이미 배제된 다른 염색체, 예를 들어 X 및 Y, 1-22 이외의 염색체)에서 유래한 빈의 GC 정규화된 값을 제외하고 모든 GC 정규화된 값의 합계로 나누어 계산하였다. 이어서 염색체 21 표시의 중앙값 및 MAD를 일련의 공지된 정배수체 샘플(참조 샘플)로부터 계산하였다. 각각의 샘플에 대해 중앙값 염색체 21 표시를 샘플 특이적 염색체 21 표시에서 차감하여 샘플 특이적 차이를 얻었다. 이 샘플 특이적 차이를 염색체 21 표시 MAD로 나누고, Z 점수로 지칭되는 값을 제공하였다. 그런 다음 Z 점수를 기준으로 검사 샘플을 분류하며, 여기서 Z 점수가 3 이상인 샘플은 삼염색체로 분류하고 Z 점수가 3 미만인 샘플은 정배수체로 분류하였다. [도 12]를 참조한다. 사용된 참조 샘플 세트는 전체적으로 36개의 서열 분석 결과로 이루어졌다. 한 남성 개체로부터 20개를 얻었다. 순환하는 무세포 DNA(cfDNA)에 대해 다양한 양의 초저 입력량으로 라이브러리를 생성하였다: 1 게놈 당량(GE: Genomes Equivalent)의 cfDNA 입력량(~3.5pg의 cfDNA)으로부터 2개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 4 GE의 cfDNA(~14pg의 cfDNA)으로부터 2개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 10 GE의 cfDNA(~35pg의 cfDNA)으로부터 4개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 19 GE의 cfDNA로부터 2개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고: 25 GE의 cfDNA로부터 3개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 50 GE의 cfDNA로부터 3개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 96 GE의 cfDNA로부터 1개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 100 GE의 cfDNA로부터 2개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였고; 2000 GE의 cfDNA로부터 1개의 서열 분석 라이브러리를 생성하였다.
또한, 임산부의 혈액으로부터 초저 입력의 순환하는 무세포 DNA로부터 태아 삼염색체의 존재를 결정하기 위한 참조 샘플 독립 방법을 확립하기 위해 데이터를 분석하였다. 모든 서열 분석 데이터(fasta.gz 파일)는 정렬 매개 변수 "-k 1-n 0"에 의한 Bowtie를 사용하여 인간 참조 게놈 구축 hg38에 대해 정렬하였다. 추가 분석을 위해, 인간 게놈을 50 kb 빈으로도 불리는 연속 50,000 염기쌍 영역으로 나누고, 염기 "G" 및 "C"의 분율을 각 빈에 대해 최대 소수점 3자리까지 계산하였다. 각 빈에 대해, 빈에서 시작하는 정렬된 서열 리드를 카운트하였다.
추가 분석을 위해, 염색체 1 내지 22가 아닌 빈(예를 들어, 염색체 X 및 Y는 제외됨)을 필터링하여 데이터를 감소시켰다. 이 필터링 후, 빈당 GC 함량과 리드 카운트 사이의 뢰스 회귀 분석을 수행하고 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다. 뢰스 회귀 분석은 각 GC 함량 값에 대해 기댓값이라고도 하는 예상되는 빈 카운트를 제공하였다. 이 기댓값을 빈 카운트의 중앙값으로 나누어 보정 계수를 얻었다. 이어서 측정된 빈 카운트를 보정 계수로 나누어 GC 보정된 빈 카운트를 산출하고 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값을 계산하였다.
모든 50 kb 빈을 GC 보정된 빈 카운트의 중앙값으로 나눠서 GC 정규화된 빈 카운트를 산출하고 각 빈에 대해 중앙값 및 중앙값 절대 편차(MAD)를 계산하였다. MAD가 낮고 대략 기댓값이 1인 중앙값을 가진 빈을 선택하였다(MAD> = 0.25 또는 중앙값 <0.7 또는 중앙값> 1.3인 빈을 필터링함).
잠재적 염색체 이상(예를 들어, 삼염색체)를 검출하기 위해, 각각의 검사 샘플에 대해 하나의 염색체에서 유래한 모든 빈을 선택하고 보정 계수를 차감하였다. 이 분석에 사용된 구체적인 보정 값은 다음과 같다:
Chr1 　0.018246891, Chr2　0.020434185, Chr3　0.011982353, Chr4　0.001049686, Chr5　0.020581150, Chr6　0.009152075, Chr7　0.005677261, Chr8　0.022754399, Chr9　0.015059119, Chr10　0.021188753, Chr11 0.017143964, Chr12 0.007069202, Chr13 0.002157471, Chr14 0.010356892, Chr15 0.019037573, Chr16 0.009929239, Chr17 0.004990359, Chr18 0.023177486, Chr19 -0.063998368, Chr20 0.042335516, Chr21 0.00498782, Chr22 0.025008553.
이어서, 이 필터링된 세트(이 데이터 세트의 657)에서 염색체 21로부터 유래하는 빈의 수를 카운트한 후, 여러 상이한 염색체로부터 유래한 빈을 함유하도록 모든 이용 가능한 빈으로부터 동일한 양의 빈(657)을 무작위로 선택하였다. 그런 다음 무작위로 선택된 이 빈 세트에 대한 백분율 표시를 계산하였다. 무작위로 선택된 이 빈 세트에 대해 모든 GC 정규화된 값을 합산하고 모든 GC 정규화된 값의 합계로 나누었다. 마지막 단계를 만 번 반복하고 각 값을 저장하였다. 그런 다음 염색체 21로부터 유래한 빈에 대한 모든 GC 정규화된 값을 합산하여 염색체 21로부터 유래한 서열 리드의 백분율 표시를 계산하고 이 수를 모든 GC 정규화된 값의 합으로 나누었다. 염색체 21로부터 유래한 빈의 백분율 표시가 무작위로 선택된 빈의 만회 반복으로부터의 염색체 표시보다 몇 배나 높은지 계산하였다. [도 13]를 참조한다. 합계를 10,000으로 나눈 값은 여기서 "백분위 수"라고 하는 0과 1 사이의 값이다. 백분위 수 값을 기준으로 샘플을 분류하였다. 만의 값(백분위 수 1)은 샘플을 삼염색체로 분류하고, 만 미만(백분위 수 1 미만)은 샘플을 정배수체로 분류한다.
실시예 6. 가정에서 비침습적 산전 검사
유산의 병력이 있는 임산부는 그녀가 다시 임신하였고 아마도 임신 약 6주일 것이라고 짐작한다. 그녀는 실제로 임신했는지와 태아에게 위험을 초래할 수 있는 유전적 이상이 있는지 가능한 한 빨리 알고 싶어한다. 그녀는 본원에 개시된 비침습성 산전 검사 장치를 구입하여 집으로 가져간다. 존재하는 가장 가까운 가족 및 친구의 정서적 지원으로 그녀는 손가락을 장치의 웰에 있는 마이크로니들 배열에 대고 눌러 검사를 시작한다. 장치 내의 나노포어 서열 분석기는 혈액 샘플에서 충분한 양의 핵산(109개 미만의 태아 핵산)을 서열 분석하여 약 1시간 내에 원하는 유전 정보를 밝힌다. USB 포트 또는 무선 기술은 서열 정보를 전화기의 앱 또는 컴퓨터의 웹 사이트로 전달한다. 앱 또는 웹 사이트는 소프트웨어를 사용하여 서열 분석 리드로부터 유전 정보를 가져와 여성이 검토할 결과 패널을 보여준다. 대안적으로, 장치 자체는 서열을 판독하고 장치의 창에서 패널을 생성하는 소프트웨어를 갖는다. 패널은 여성의 임신 여부를 확인하며 태아에 공지된 염색체 이상(예를 들어, 염색체 13, 16, 18, 21, 22 및/또는 X/Y의 삼염색체)이 있는지 또는 다른 유전적 이상이 있는지에 대한 정보를 포함한다. 패널은 또한 그녀가 임신하고 있고 아들을 기대하고 있음을 확인해준다.
실시예 7: 마이크로 용량의 모체 샘플의 비침습적 산전 검사.
PCR 증폭(~10 사이클)뿐만 아니라 DNA 추출(효율 90%) 및 라이브러리 제조(효율 10%) 중의 손실을 고려한 태아 분율의 하한(4%)에서 모의실험을 수행하면 그 정확도가 입력 DNA 물질의 25개(10의 변곡점) 복제본 미만으로 감소함을 보인다. 10개의 복제본에서의 정확도는 89%로 감소하고 5개의 복제본에서 81%로 감소하며, 두 개의 값 모두는 4% 태아 분율의 샘플에 대해 ~ 95%의 이론적 정확도가 요구되는 시장에서는 허용되지 않을 것이다. [도 7] 연회색 선을 참조한다.
라이브러리 효율을 (50% 대 10%로) 증가시키고 증폭을 감소시킬 때, 5 미만의 복제본 수(게놈 당량)에서도 더 많은 정보가 보존되고 95% 초과의 민감도가 달성될 수 있다. [도 7] 진회색 선 참조.
Figure pct00004
실시예 8: 임산부로부터의 무세포 DNA의 전체 게놈 서열 분석에 의한 태아 염색체 이상의 분석
임산부의 생물학적 유체로부터 180 pg의 무세포 DNA를 얻었으며, 그 양은 약 100 ㎕의 혈액 내 무세포 DNA의 양에 해당한다. DNA 수복 키트로 무세포 DNA를 정제하고 완충 용액에 함유시켜 완전성을 보존하였다.
서열 분석을 위한 무세포 DNA를 제조하기 위해, 무세포 DNA 단편의 말단을 DNA 단편 말단 수복 키트로 수복하였다. 다음으로, 수복된 말단을 어댑터에 결찰시켜 어댑터 결찰된 DNA를 생성하였다.
DNA에 결합할 수 있는 비드와 어댑터 결찰된 DNA를 인큐베이션하여 어댑터 결찰된 DNA를 정제하였다. 자석을 사용하여 비드를 트랩하고, DNA가 있는 비드를 에탄올 용액으로 수회 세척한 후 어댑터 결찰된 DNA를 비드로부터 용리시켰다.
어댑터 결찰된 DNA의 순환 증폭은 98℃에서 30초간의 초기 변성 단계, 이어서 98℃에서 10초간 및 65℃에서 75초간의 10 사이클, 65℃에서 5분간의 최종 연장으로 수행하였다. 임의로, 어댑터 결찰된 DNA는 인덱스 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있으며, 이는 동일한 서열 분석기 실행 시 다수의 샘플을 실행하는 경우에 유용할 수 있다. 이는 라이브러리 증폭 이전에 도입된 고유 바코드/태그와 상이하였다. 어댑터 결찰된 DNA와 유사하게, 증폭된 DNA를 비드 및 자석 시스템으로 정제하였다. 생성된 정제된 증폭 DNA를 서열 분석하였다.
30 내지 500 염기쌍의 판독 길이를 갖는 수백만 서열 분석 리드를 생성하는 고 처리량 서열 분석 기기로 서열 분석을 수행하였다. 이 인덱스는 여러 샘플에서 동시에 서열 분석 리드를 얻을 수 있다. 서열 분석 실행마다 샘플당 약 4 백만 건의 리드를 얻었다.
각각의 샘플에 대해 다음 단계를 수행하였다:
모든 서열 리드의 게놈 기원을 검출하기 위한 서열 정렬.
게놈의 서브 세트를 50kb 길이의 비중첩 빈에 넣었다. GC 함량은 참조 게놈을 기준으로 각 빈에 대해 계산하였다. 각 빈 영역에 위치한 서열 리드 수를 카운트하였다. GC 함량과 빈 카운트 사이의 관계에 대한 선형 모델은 y = ax + b (y: 예상 카운트, a: 기울기, x: GC 함량, b: 절편)에 따라 계산하였다. 선형 모델을 기반으로 빈당 카운트를 조정하여 GC 편향을 감소시켰다. 각 빈에 대해 중앙값 카운트의 모든 빈 사이의 차이를 계산하고 예상 카운트 값을 선형 맞춤으로부터 차감하였다. 이 차이를 각각의 빈마다 관찰된 카운트 값에 더했다. 관심의 염색체로부터 유래한 서열 리드의 백분율을 계산하였다. 이 실시예에서, 관심의 염색체는 염색체 21이었다.
염색체 21로부터 유래한 서열 리드의 백분율(ref,p21로 지칭됨)을 계산하기 위해 일련의 참조 샘플을 사용하였다. ref.p21 샘플 세트에 대한 중앙값 절대 편차(MAD)(ref.mad로 지칭됨)로 중앙값(ref.mad로 지칭됨)을 계산하였다.
적어도 하나의 검사 샘플에서 유사한 값이 측정되었다(상기 기재된 바와 동일한 프로토콜). 염색체 21로부터 유래한 서열 리드의 백분율(test.p21로 지칭됨)을 계산하였다. 각 샘플에 대해 Z 점수는 염색체 21로부터 유래한 서열 리드의 검사 샘플 백분율과 참조의 중앙값 사이의 차이(test.p21-ref.med)를 계산하고 이 차이를 참조 세트의 중앙값 절대 편차로 나눔으로써 계산하였다([test.p21-ref.med] /mad.ref). 결과는 [도 3]을 참조한다.
Z 점수 값이 예정된 컷오프보다 높은 것(일반적으로 컷오프는 3과 같음)으로 밝혀지면, 샘플은 염색체 21로부터 유래한 게놈 물질의 과다 표시를 갖는 것으로 해석될 수 있다. 이 과다 표시는 태아 삼염색체 21을 나타낸다. 반대로, Z 점수가 예정된 컷오프 미만일 경우, 샘플은 게놈 물질의 정상 또는 과소 표시를 갖는 것으로 해석될 수 있다. 이 분석은 다른 염색체 또는 염색체 영역에 적용될 수 있다.
실시예 9. 모체 혈장 내 무세포 태아 핵산을 서열 분석하여 유전적 이상 검출하기
임신한 피험체로부터 혈액 샘플을 수집한다. 임신한 피험체는 임신 기간이 불과 5주일 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 임신 기간이 불과 7주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 가정에서 장치에 손가락을 찔러, 스스로 혈액을 수집한다. 임신한 피험체는 장치 또는 용기에 있는 자신의 샘플을 샘플 처리 및 서열 장비가 있는 실험실로 보낸다. 대안적으로, 장치가 샘플 처리(예를 들어, 정제, 표적 농축) 및/또는 서열 분석을 수행하고, 따라서 임신한 피험체는 자신의 샘플을 실험실로 보낼 필요가 없다. 손가락 찌름으로 약 100 ㎕의 혈액을 얻으며, 이들 중 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청을 얻는다. 50 ㎕의 혈장에는 약 1.5 x 108개의 무세포 태아 핵산이 함유되어 있는데, 이는 샘플링시 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율이 평균 10%이기 때문이다. 일부 경우에, 태아 분율은 단지 4%이고, 100 ㎕의 혈액 샘플은 약 6 x 107개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율은 1%로 낮을 수 있기 때문에, 임신의 어느 단계에서나 신뢰할 수 있는 정보를 보장하기 위해 피험체로부터 얻어야 하는 최소 혈액 용량은 약 2 ㎕이다.
실시예 10. 모체 소변 내 무세포 태아 핵산을 서열 분석하여 유전적 이상 검출하기
임신한 피험체로부터 소변 샘플을 수집한다. 임신한 피험체는 임신 기간이 불과 5주일 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 임신 기간이 불과 7주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 가정에서 스스로 소변을 수집한다. 임신한 피험체는 장치 또는 용기에 있는 자신의 샘플을 샘플 처리 및 서열 분석 장비가 있는 실험실로 보낸다. 대안적으로, 임신한 피험체는 샘플 처리(예를 들어, 정제, 표적 농축) 및/또는 서열 분석을 수행하는 가정용 장치에 소변 샘플을 넣고, 따라서 임신한 피험체는 자신의 샘플을 실험실로 보낼 필요가 없다. 일부 경우에, 소변 샘플의 용량이 약 100 ㎕이다. 100 ㎕의 소변에는 약 8 x 1010개의 무세포 태아 핵산이 함유되어 있는데, 이는 샘플링시 소변 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율이 약 4%이기 때문이며, 소변 내 무세포 핵산의 전형적인 농도는 ml당 8 x 1011개의 단편이다. 일부 경우에, 태아 분율은 4%이고, 소변 샘플은 약 3.2 x 109개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 소변 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율은 1%로 낮을 수 있기 때문에, 임신의 어느 단계에서나 신뢰할 수 있는 정보를 보장하기 위해 피험체로부터 얻어야 하는 최소 소변 용량은 약 2 ㎕이다.
실시예 11. 가정에서 수집된 샘플로부터 실험실에서 모체 혈장 내 무세포 태아 핵산을 카운트하여 유전적 이상 검출하기
임신한 피험체로부터 혈액 샘플을 수집한다. 임신한 피험체는 임신 기간이 불과 5주일 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 임신 기간이 불과 7주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 예를 들어 가정에서 장치에 손가락을 찔러, 스스로 모세혈을 수집한다. 일부 경우에, 장치는 혈액을 혈장으로 분리한다. 임신한 피험체는 장치 또는 용기에 있는 혈액(또는 혈장 샘플)을 샘플 처리, 핵산 라이브러리 제조 및 서열 분석을 위한 시약 및 장비가 있는 실험실로 보낸다. 일부 경우에, 라이브러리 제조는 무세포 태아 핵산을 카운트 또는 정량화되는 표지 또는 신호를 태그하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 표지 또는 신호는 특정 무세포 태아 핵산에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드에 연결된다.
특정 무세포 태아 핵산의 양은 신호 또는 표지를 통해 양으로 변환되고, 분석을 수행하는 임신한 피험체, 장치 또는 기술자에 의해 검출된다. 손가락을 찔러 약 100 ㎕의 혈액을 얻고, 이 중 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청이 얻어진다. 50 ㎕의 혈장은 약 1.5 x 108개의 무세포 태아 핵산을 함유하는데, 이는 샘플링시 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율이 약 10%이기 때문이다. 일부 경우에, 태아 분율은 약 4%이고, 100 ㎕ 혈액 샘플은 약 6 x 107개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율은 1%로 낮을 수 있기 때문에, 임신의 어느 단계에서나 신뢰할 수 있는 정보를 보장하기 위해 피험체로부터 얻어야 하는 최소 혈액 용량은 약 2 ㎕이다.
실험실에서의 분석 결과는 임신한 피험체에게 전자적으로 전송된다.
실시예 12. 가정에서 처리된 샘플로부터 실험실에서 모체 혈장 내 무세포 태아 핵산을 카운트하여 유전적 이상 검출하기
임신한 피험체로부터 혈액 샘플을 수집한다. 임신한 피험체는 임신 기간이 불과 5주일 수 있다. 일부 경우에, 피험체는 임신 기간이 불과 7주이다. 일부 경우에, 임신한 피험체는 가정에서 장치에 손가락을 찔러 스스로 혈액을 수집한다. 장치는 샘플 처리(예를 들어, 정제, 표적 농축) 및 라이브러리 제조를 수행한다. 따라서, 임신한 피험체는 처리되고 제조된 샘플을 서열 분석 시설 또는 핵산을 서열 분석할 수 있는 시설로 보내기만 하면 된다.
특정 무세포 태아 핵산의 양은 신호 또는 표지를 통해 양으로 변환되고, 분석을 수행하는 임신한 피험체, 장치 또는 기술자에 의해 검출된다. 손가락을 찔러 약 100 ㎕의 혈액을 얻고, 이 중 약 50 ㎕의 혈장 또는 혈청이 얻어진다. 50 ㎕의 혈장은 약 1.5 x 108개의 무세포 태아 핵산을 함유하는데, 이는 샘플링시 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율이 약 10%이기 때문이다. 일부 경우에, 태아 분율은 약 4%이고, 100 ㎕ 혈액 샘플은 약 6 x 107개의 무세포 태아 핵산을 함유한다. 혈장 샘플의 총 무세포 핵산에서 무세포 태아 핵산의 백분율은 1%로 낮을 수 있기 때문에, 임신의 어느 단계에서나 신뢰할 수 있는 정보를 보장하기 위해 피험체로부터 얻어야 하는 최소 혈액 용량은 약 2 ㎕이다.
실험실에서의 분석 결과는 임신한 피험체에게 전자적으로 전송된다.
실시예 13. 태아 삼염색체 검출
각각의 염색체로부터의 리드는 염색체의 길이에 따라 대략적으로 표시된다. 대부분의 리드는 염색체 1에서 얻는 반면, 오토솜에서 가장 적은 리드는 염색체 21에서 유래할 것이다. 삼염색체 샘플을 검출하는 일반적인 방법은 정배수체 샘플 집단에서 염색체로부터 유래하는 리드의 백분율을 측정하는 것이다. 다음 이 염색체 백분율 값 세트의 평균 및 표준 편차를 계산한다. 컷오프 값은 평균에 3 표준 편차를 더하여 결정한다. 새로운 샘플이 컷오프 값보다 높은 염색체 백분율 값을 갖는 경우, 그 염색체의 과다 표시가 가정될 수 있으며, 이는 종종 염색체의 삼염색체와 일치한다.
정배수체 태아를 갖는 임신한 피험체의 경우, 염색체 21로부터 수득한 리드의 백분율의 평균값은 1.27%이고 표준 편차는 0.01%이다. 따라서 삼염색체를 나타내는 컷오프는 1.30%이다. 이 이론적 예는 태아 분율이 10%이고 염색체 21이 1.34%인 삼염색체 샘플을 보여준다. 샘플이 컷오프보다 높으면 삼염색체 샘플로 정확하게 분류된다. 정배수체 태아를 갖는 정배수체 피험체 샘플의 모든 염색체에 대한 예시적인 염색체 백분율의 평균 및 이수체 태아를 갖는 정배수체 피험체 샘플의 모든 염색체에 대한 백분율을 표 5에 제시한다.
Figure pct00005
실시예 14: 모체 혈액으로부터의 태아 무세포 핵산 분석 장치
무세포 핵산 분석을 위해 전혈로부터 혈장을 분리하기 위한 장치는 6개의 층을 포함한다. 아래에서 위로:
(1) 하부 접착 시트
(2) 하부 분리 디스크: 하부 접착 시트를 향한 면에 접착제가 있는 접착 시트 재료(DNA 또는 혈장에 불활성인 중합체 재료)의 16mm 직경 디스크
(3) 다양한 크기, 전형적으로 6 내지 16 mm의 폴리에테르술폰(PES) 막, 바람직한 설계는 10 mm PES 막을 특징으로 한다. 막은 모세관 힘을 통해 필터로부터 혈장을 끌어당기는 위킹 물질로서 작용한다.
(4) 필터 디스크(예를 들어, Pall Vivid™ 막), 16mm 직경, 거친 면이 위를 향하고, 반짝이는 면이 PES 막을 향한다.
(5) 상부 분리 디스크: 재료는 하부 분리 디스크와 동일하며, 중심에 4mm 구멍을 포함하며, 직경 12 또는 14 mm임. 접착 시트 재료를 사용할 때, 이제 접착 면이 위로 향해 상부 접착 시트와 만난다. 상단 분리 디스크는 직경이 필터 디스크보다 작다. 이를 통해 상단 접착 시트의 접착제가 필터 디스크의 가장자리와 상호 작용하여 가장자리에서 이를 밀봉할 수 있다.
(6) 상부 접착 시트, 장치의 중심이 위치할 위치에 6 mm 구멍을 펀칭한다.
모든 층을 그 중심에 정렬시킨 후 표준 사무용 라미네이션 기계를 사용하여 적층시킨다.
실시예 6에 기술된 검사를 수행하도록 장치를 구성한다.
다음과 같이 장치에 혈액의 적용 및 여과를 실시한다:
100 ㎕의 전혈을 상부 접착 시트의 구멍 및 상부 분리 디스크의 구멍을 통해 장치의 중앙에 적용한다. 혈액은 모세관 힘에 의해 필터 디스크 전체에 구심적으로 분포된다. 혈장은 또한 모세관 힘에 의해 필터 디스크를 통해 PES 막으로 위킹된다. 약 2분 후, 최대량의 혈장이 PES 막으로 이동되었다. PES 막이 있는 장치 또는 그의 일부를 DNA 검사를 위해 실험실로 배송한다.
무세포 핵산을 함유하는 PES 막은 다음과 같이 회수한다:
PES 막을 장치로부터 제거한다. 예를 들어, 장치를 PES 막의 가장자리 주위에서 절단한다. 막은 필터 및 하부 디스크로부터 쉽게 분리된다.
DNA를 다음과 같이 막으로부터 용리시킨다:
혈장을 함유하는 PES 막을 에펜도르프 튜브(0.5 ml)로 옮기고 100 ㎕의 용리 완충액을 첨가한다(용리 완충액은 H2O, EB 완충액(QGEN), PBS, TE 또는 후속 분자 분석에 적합한 기타일 수 있음). 막으로부터 DNA를 용리시킨 후, 용리된 cfDNA를 함유하는 완충액에 핵산 증폭, 태그, 서열 분석 또는 이들의 조합을 포함하는 유전자 분석을 실시한다.
본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 바람직한 실시 양태를 본원에 도시하고 설명하였지만, 이러한 실시 양태는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자라면 이제 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트를 벗어나지 않으면서 많은 변형, 변경 및 대체를 생각해 낼 것이다. 본원에 개시된 장치, 시스템 및 키트의 실시 양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구 범위는 장치, 시스템 및 키트의 범위를 정의하고 이로써 이들 청구 범위의 범위 내에서의 방법 및 구조 및 그 등가물이 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (48)

  1. a) 피험체로부터 무세포(cell-free) 핵산을 포함하는 모세혈(capillary blood)을 얻는 단계;
    b) 임의로 무세포 핵산을 증폭시키는 단계;
    c) 무세포 핵산의 적어도 일부를 태그하여 태그된 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계;
    d) 임의로 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계;
    e) 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부를 서열 분석하는 단계; 및
    f) 태그된 무세포 핵산의 적어도 일부에서 적어도 하나의 표적 서열의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 0.5의 효율을 갖는 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 크라우딩제(crowding agent)의 존재하에서 무세포 핵산 또는 태그된 무세포 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 무세포 핵산의 말단을 수복하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 모세혈을 얻는 단계는 1 밀리리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 모세혈을 얻는 단계는 100 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 모세혈을 얻는 단계는 40 마이크로리터 이하의 혈액을 얻는 것을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적 무세포 핵산은 종양으로부터의 무세포 핵산인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적 무세포 핵산은 태아로부터의 무세포 핵산인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 표적 무세포 핵산은 이식된 조직 또는 기관으로부터의 무세포 핵산인 방법.
  11. a) 피험체로부터 최대 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b) 무세포 핵산 분자의 적어도 일부를 서열 분석하여 서열 분석 리드(read)를 생성하는 단계;
    c) 적어도 하나의 염색체 영역에 상응하는 서열 분석 리드의 적어도 일부를 측정하는 단계; 및
    d) 적어도 하나의 염색체 영역의 정상 표시, 과다 표시 또는 과소 표시를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 약 500 ㎕ 미만의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 약 5 ㎕ 내지 약 80 ㎕의 용량을 갖는 생물학적 유체인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 간질액, 질 세포, 질액, 협측 세포 또는 타액을 포함하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 혈액 샘플로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 분리 단계는 혈장 샘플을 생성하기 위해 혈액 샘플을 여과하여 혈액 샘플로부터 세포, 세포 단편, 미세 소포(microvesicle) 또는 이들의 조합을 제거하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 혈액 샘플을 얻는 단계는 손가락을 찌르는 것을 포함하는 방법.
  20. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104개 내지 약 109개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법.
  21. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 약 104개 내지 약 107개의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법.
  22. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 300 pg 미만의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법.
  23. 제11항에 있어서, 생물학적 샘플은 3 ng 미만의 무세포 핵산 분자를 함유하는 방법.
  24. 제11항에 있어서, 피험체는 임신한 피험체이고, 무세포 핵산 분자는 무세포 태아 핵산 분자를 포함하는 방법.
  25. 제11항에 있어서, 무세포 핵산은 조직 내 종양으로부터의 핵산을 포함하는 방법.
  26. a) 피험체의 유체 샘플을 수집하도록 구성된 샘플 수집기;
    b) 유체 샘플로부터 샘플 성분을 단리하도록 구성된 샘플 처리기;
    c) 유체 샘플 또는 샘플 성분에서 핵산을 검출하도록 구성된 핵산 검출기; 및
    d) 핵산 정보 출력
    을 포함하는 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 샘플 수집기는 경피 천자 장치를 포함하는 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 경피 천자 장치는 바늘, 란셋, 미세바늘, 진공 및 미세바늘 배열 중 적어도 하나를 포함하는 시스템.
  29. 제26항에 있어서, 샘플 성분은 세포, 탄수화물, 인지질, 단백질, 핵산 및 미세 소포로부터 선택되는 시스템.
  30. 제26항에 있어서, 샘플 성분은 혈액 세포인 시스템.
  31. 제26항에 있어서, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하지 않는 시스템.
  32. 제26항에 있어서, 샘플 성분은 무세포 핵산을 포함하는 시스템.
  33. 제26항에 있어서, 샘플 성분은 혈장 또는 혈청인 시스템.
  34. 제33항에 있어서, 샘플 정제기가 1 밀리리터 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템.
  35. 제33항에 있어서, 샘플 정제기가 250 ㎕ 미만의 혈액으로부터 혈장을 단리하도록 구성되는 시스템.
  36. 제26항에 있어서, 핵산 검출기는 핵산 서열 분석기를 포함하는 시스템.
  37. 제26항에 있어서, 시스템은 유체 샘플에서 관심의 핵산을 표지하도록 구성되고, 핵산 검출기는 샘플에서 관심의 핵산의 표시를 검출하기 위해 표지를 카운트하는 카운팅 시스템을 포함하는 시스템.
  38. 제26항에 있어서, 적어도 1종의 핵산 증폭 시약 및 적어도 1종의 크라우딩제를 포함하는 시스템.
  39. 제26항에 있어서, 유체 샘플로부터 무세포 핵산의 라이브러리를 생성하기 위한 적어도 제1 표지 및 적어도 1종의 증폭 시약을 포함하는 시스템.
  40. 제26항에 있어서, 핵산 서열 출력은 무선 통신 장치, 유선 통신 장치, 케이블 포트 및 전자 디스플레이로부터 선택되는 시스템.
  41. 제26항에 있어서, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 위치에 존재하는 시스템.
  42. 제26항에 있어서, 시스템의 모든 구성 요소는 단일 장치에 수용되는 시스템.
  43. 제26항에 있어서, 샘플 수집기는 제1 위치에 위치하고, 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나는 제2 위치에 위치하는 시스템.
  44. 제26항에 있어서, 샘플 정제기 및 핵산 검출기 중 적어도 하나 및 샘플 수집기는 동일한 위치에 위치하는 시스템.
  45. 제26항에 있어서, 샘플 정제기는 필터를 포함하는 시스템.
  46. 제45항에 있어서, 필터는 약 0.05 미크론 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는 시스템.
  47. 제26항에 있어서, 유체 샘플의 적어도 일부를 운반 또는 보관하기 위한 운반 또는 보관 구획을 포함하는 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 운반 또는 보관 구획은 흡수 패드, 유체 용기, 샘플 보존제 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220132800A (ko) 2021-03-24 2022-10-04 재단법인대구경북과학기술원 액체생검 유래 생체물질 분석용 기판, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석방법

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018355575A1 (en) 2017-10-27 2020-05-21 Juno Diagnostics, Inc. Devices, systems and methods for ultra-low volume liquid biopsy
WO2019133756A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Clear Labs, Inc. Automated priming and library loading device
AU2020394370A1 (en) * 2019-11-27 2022-06-23 Juno Diagnostics, Inc. Systems and devices for sample preparation and analyte detection
WO2021231862A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Georgia Tech Research Corporation Methods of detecting the efficacy of anticancer agents
WO2024016016A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Life Magnetics, Inc. Stable composition for storing and transporting single strand nucleic acid material
WO2024091509A1 (en) * 2022-10-24 2024-05-02 Definitive Biotechnologies Llc Rapid, microfluidic diagnostic device and method for biological sex determination

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5977356A (ja) 1982-06-30 1984-05-02 Fuji Photo Film Co Ltd 螢光アツセイ用多層分析要素およびそれを用いる螢光アツセイ法
US20010051341A1 (en) 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
EP0994936A1 (en) 1997-07-02 2000-04-26 The Procter & Gamble Company Dishwashing compositions comprising a phospholipase and an amylase
EP1066414B1 (en) 1998-03-25 2009-06-10 Olink AB Rolling circle replication of padlock probes
US6156879A (en) 1998-06-03 2000-12-05 The Regents Of The University Of California Human minor vault protein p193
ES2320814T3 (es) 1998-11-09 2009-05-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procedimiento de sintesis de acido nucleico.
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6749575B2 (en) 2001-08-20 2004-06-15 Alza Corporation Method for transdermal nucleic acid sampling
CA2367636C (en) 2001-04-12 2010-05-04 Lisa Mckerracher Fusion proteins
US8980568B2 (en) 2001-10-11 2015-03-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7442506B2 (en) 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
CN1325061C (zh) 2002-10-16 2007-07-11 旭化成医疗株式会社 血浆制剂或血清制剂及其制造方法
DE10252223A1 (de) 2002-11-11 2004-05-27 Roche Diagnostics Gmbh Vorrichtung zur Separierung und Ausgabe von Plasma
DE10305050A1 (de) 2003-02-07 2004-08-19 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches Testelement und Verfahren für Blutuntersuchungen
EP1610809A4 (en) 2003-03-10 2008-02-20 Univ California WOVEN AND CROCHETED CARRIER MOLECULES
US7604592B2 (en) 2003-06-13 2009-10-20 Pelikan Technologies, Inc. Method and apparatus for a point of care device
BRPI0413350B8 (pt) 2003-08-05 2021-07-27 Becton Dickinson Co “dispositivo para coleta de amostra biológica e método para coleta e preparação de um espécime”
ATE435301T1 (de) 2003-10-16 2009-07-15 Sequenom Inc Nicht invasiver nachweis fötaler genetischer merkmale
US20100216153A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
DE102004027422A1 (de) 2004-06-04 2005-12-29 Boehringer Ingelheim Microparts Gmbh Vorrichtung zur Aufnahme von Blut und Abtrennung von Blutbestandteilen
CA2507323A1 (en) 2005-05-13 2006-11-13 Chromedx Inc. Diagnostic whole blood and plasma apparatus
GB2428093A (en) 2005-07-06 2007-01-17 Christopher Paul Hancock A non-invasive monitoring system
US8532930B2 (en) 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
EP2423334A3 (en) 2006-02-02 2012-04-18 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
US20080113357A1 (en) 2006-06-29 2008-05-15 Millipore Corporation Filter device for the isolation of a nucleic acid
NL1033365C2 (nl) 2007-02-09 2008-08-12 Medavinci Dev B V Inrichting en werkwijze voor scheiden en analyseren van bloed.
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
EA028642B1 (ru) 2007-07-23 2017-12-29 Те Чайниз Юниверсити Ов Гонгконг Способ пренатальной диагностики фетальной хромосомной анэуплоидии
FR2923151B1 (fr) 2007-11-02 2010-09-03 Commissariat Energie Atomique Dispositif de prelevement sanguin comportant au moins un filtre .
KR101608749B1 (ko) 2008-01-21 2016-04-06 삼성전자주식회사 박막 원심분리 분석 장치 및 이를 이용한 분석 방법
US8709726B2 (en) 2008-03-11 2014-04-29 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
EP2113574A1 (en) 2008-04-28 2009-11-04 Biotype AG Substances and methods for a DNA based profiling assay
US8124109B2 (en) 2008-05-15 2012-02-28 The Regents Of The University Of California Vault compositions for immunization against chlamydia genital infection
US8895240B2 (en) * 2008-05-19 2014-11-25 E I Du Pont De Nemours And Company Method, kit and system for collecting and processing samples for DNA and RNA detection
US20110086359A1 (en) 2008-06-10 2011-04-14 Rapid Pathogen Screening, Inc. Lateral flow assays
EP3751005A3 (en) 2008-09-20 2021-02-24 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
WO2010065470A2 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Consumer Genetics, Inc. Compositions and methods for detecting background male dna during fetal sex determination
SG176669A1 (en) 2009-06-05 2012-01-30 Integenx Inc Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
EP2264453B1 (en) 2009-06-17 2013-04-03 Leukocare Ag Method for filtering blood
US8862448B2 (en) 2009-10-19 2014-10-14 Theranos, Inc. Integrated health data capture and analysis system
WO2011053790A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Fluidigm Corporation Assay of closely linked targets in fetal diagnosis and coincidence detection assay for genetic analysis
CN105031618A (zh) 2009-11-02 2015-11-11 加利福尼亚大学董事会 用于细胞因子递送的穹窿体复合物
HUE052213T2 (hu) 2009-11-06 2021-04-28 Univ Leland Stanford Junior Grafitkilökõdés nem invazív diagnosztizálása szervátültetett betegekben
WO2011063324A2 (en) 2009-11-20 2011-05-26 The General Hospital Corporation Microfluidic systems for isolating microvesicles
AU2010336017B2 (en) 2009-12-23 2016-04-28 Genetic Technologies Limited Methods of enriching and detecting fetal nucleic acids
WO2011090558A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
US8720036B2 (en) 2010-03-09 2014-05-13 Netbio, Inc. Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture
US20120003201A1 (en) 2010-04-21 2012-01-05 Nicholas Susanne B Vault agents for chronic kidney disease
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2854057B1 (en) 2010-05-18 2018-03-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
WO2012064802A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Seventh Sense Biosystems, Inc. Systems and interfaces for blood sampling
RU2620959C2 (ru) 2010-12-22 2017-05-30 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления отцовства
US20120184449A1 (en) * 2010-12-23 2012-07-19 Sequenom, Inc. Fetal genetic variation detection
AU2012204748C1 (en) 2011-01-05 2021-12-23 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal genotyping of fetal sex chromosomes
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
WO2012108920A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20120219950A1 (en) 2011-02-28 2012-08-30 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
WO2012174256A2 (en) 2011-06-17 2012-12-20 The Regents Of The University Of Michigan Dna methylation profiles in cancer
DE102011078961B4 (de) 2011-07-11 2021-02-18 Robert Bosch Gmbh System zum Separieren von Körperflüssigkeitsbestandteilen und Verfahren zum Herstellen eines derartigen Systems
CA2850785C (en) 2011-10-06 2022-12-13 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
SG10201906331TA (en) * 2012-01-27 2019-08-27 Univ Leland Stanford Junior Methods for profiling and quantitating cell-free rna
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
CA2866324C (en) 2012-03-13 2019-01-15 The Chinese University Of Hong Kong Methods for analyzing massively parallel sequencing data for noninvasive prenatal diagnosis
US11360076B2 (en) 2012-03-30 2022-06-14 Weavr Health Corp. Methods and systems to collect a biological sample
ES2635596T3 (es) 2012-06-20 2017-10-04 Fabpulous B.v Dispositivo y método de prueba rápida
US20150150821A1 (en) 2012-07-09 2015-06-04 The Regents Of The University Of California Vault Immunotherapy
US9423399B2 (en) 2012-09-28 2016-08-23 Takara Bio Usa, Inc. Lateral flow assays for tagged analytes
US20140342371A1 (en) * 2012-12-05 2014-11-20 Theranos, Inc. Bodily Fluid Sample Collection and Transport
CA2904593A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Instrumentation Laboratory Company Plasma separation from blood using a filtration device and methods thereof
AU2014233373B2 (en) * 2013-03-15 2019-10-24 Verinata Health, Inc. Generating cell-free DNA libraries directly from blood
US10154808B2 (en) 2013-04-15 2018-12-18 Becton, Dickinson And Company Biological fluid separation device and biological fluid separation and testing system
CA2904658C (en) * 2013-04-19 2023-10-17 Epiontis Gmbh Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample
US11358138B2 (en) 2013-07-19 2022-06-14 Boston Microfluidics Inc. Fluid sample collection device
US9644232B2 (en) 2013-07-26 2017-05-09 General Electric Company Method and device for collection and amplification of circulating nucleic acids
DE102013012677A1 (de) 2013-07-31 2015-02-05 Mann + Hummel Gmbh Verfahren zum abtrennen von blutplasma/serum von vollblut
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
WO2015048535A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Natera, Inc. Prenatal diagnostic resting standards
US20170014450A1 (en) 2014-02-28 2017-01-19 Exosome Sciences, Inc. Brain specific exosome based diagnostics and extracorporeal therapies
EP3119197A1 (en) 2014-03-18 2017-01-25 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
EP3598452B1 (en) 2014-05-30 2023-07-26 Sequenom, Inc. Chromosome representation determinations
WO2015187959A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Pepex Biomedical, Inc. Electrochemical sensors and methods for making electrochemical sensors using advanced printing technology
US10472620B2 (en) 2014-07-01 2019-11-12 General Electric Company Method, substrate and device for separating nucleic acids
WO2016004539A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Advanced Theranostics Inc. Point of care polymerase chain reaction device for disease detection
US20160034640A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
MX2017001368A (es) 2014-08-01 2017-05-11 Siemens Healthcare Diagnostics Inc Separacion de plasma asistido por vacio.
US10335078B2 (en) 2014-08-04 2019-07-02 General Electric Company Device for separation and collection of plasma
WO2016097251A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Danmarks Tekniske Universitet Method for identification of tissue or organ localization of a tumour
US20190111423A1 (en) 2014-12-23 2019-04-18 California Institute Of Technology Devices and methods for autonomous measurements
WO2016148646A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Nanyang Technological University Testing device, microfluidic chip and nucleic acid testing method
CN104830986B (zh) * 2015-05-07 2018-08-03 深圳承启生物科技有限公司 一种检测胎儿基因信息的方法、装置和***
AU2016273418A1 (en) 2015-06-02 2017-12-07 Ecocraft Systems Pty Ltd Personal safety device
US20160371428A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Natera, Inc. Systems and methods for determining aneuploidy risk using sample fetal fraction
EP3325126B1 (en) 2015-07-24 2019-11-20 Ahlstrom-Munksjö Oyj Blood separation media and lateral flow devices for blood samples
CN108138209B (zh) * 2015-08-12 2022-06-10 环基因治疗诊断有限责任公司 通过原位扩增制备细胞游离核酸分子的方法
EP4289356A3 (en) * 2015-09-09 2024-02-28 Drawbridge Health, Inc. Devices for sample collection, stabilization and preservation
WO2017062867A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Helmy Eltoukhy Population based treatment recommender using cell free dna
RU2018121254A (ru) 2015-11-11 2019-12-16 Резолюшн Байосайенс, Инк. Высокоэффективное построение библиотек днк
US11073511B2 (en) 2016-02-01 2021-07-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Exosome-Total-Isolation-Chip (ExoTIC) device for isolation of exosome-based biomarkers
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
AU2017246480B2 (en) 2016-04-06 2023-06-01 Wayne State University Isolation and analysis of fetal DNA from extravillous trophoblast cells retrieved from the endocervical canal
JP7143221B2 (ja) 2016-04-07 2022-09-28 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー ５－ヒドロキシメチル化無細胞系ｄｎａをシーケンシングすることによる非侵襲性診断
WO2017214338A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Drawbridge Health, Inc. Metods and devices for strong or stabilizing molecules
EP3760122B1 (en) 2016-08-24 2023-05-10 Becton, Dickinson and Company A device for obtaining a blood sample
WO2018057888A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Driver, Inc. Integrated systems and methods for automated processing and analysis of biological samples, clinical information processing and clinical trial matching
US11854666B2 (en) 2016-09-29 2023-12-26 Myriad Women's Health, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
GB2576635B (en) 2017-01-10 2020-08-05 Drawbridge Health Inc Devices, systems, and methods for sample collection
EP3596233B1 (en) 2017-03-17 2022-05-18 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic mosaicism
WO2018194757A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 Counsyl, Inc. Systems and methods for performing and optimizing performance of dna-based noninvasive prenatal screens
WO2018212496A2 (ko) 2017-05-16 2018-11-22 에스케이텔레콤 주식회사 카트리지를 이용한 핵산 분석 장치
KR20200031612A (ko) 2017-07-17 2020-03-24 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 개질된 필터 막 및 그 사용
WO2019067567A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 Juno Diagnostics, Inc. DEVICES, SYSTEMS AND METHODS FOR BIOMARKER ANALYSIS
KR20200085789A (ko) 2017-10-27 2020-07-15 보스턴 마이크로플루이딕스, 인크. 유체 샘플 수집 장치
AU2018355575A1 (en) 2017-10-27 2020-05-21 Juno Diagnostics, Inc. Devices, systems and methods for ultra-low volume liquid biopsy
US20210020314A1 (en) 2018-03-30 2021-01-21 Juno Diagnostics, Inc. Deep learning-based methods, devices, and systems for prenatal testing
DE102018111834A1 (de) 2018-05-16 2019-11-21 Mildendo Gesellschaft für mikrofluidische Systeme mbH Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Nutzung derselben zur Trennung, Aufreinigung und Konzentration von Komponenten von fluidischen Medien,
US20200015725A1 (en) 2018-05-24 2020-01-16 Boston Microfluidics, Inc. Cassette for blood sample measurement collection and storage
US20210327538A1 (en) 2018-07-17 2021-10-21 Natera, Inc. Methods and systems for calling ploidy states using a neural network
EP3847275A4 (en) 2018-09-03 2022-06-15 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. METHOD AND SYSTEM FOR IDENTIFYING A GENETIC DISORDER IN MATERNAL BLOOD
US20200121234A1 (en) 2018-10-23 2020-04-23 Boston Microfluidics, Inc. Blood sample collection device with time stamp and simultaneous environmental sample
CN109971846A (zh) 2018-11-29 2019-07-05 时代基因检测中心有限公司 使用双等位基因snp靶向下一代测序的非侵入性产前测定非整倍体的方法
JP2022525953A (ja) 2019-03-27 2022-05-20 ジュノ ダイアグノスティックス，インク． 最適化された超微量リキッドバイオプシーの方法、システム、およびデバイス
WO2021046391A2 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Boston Microfluidics, Inc. Medium with hydrophobic patterns and break lines defining a blood collection volume
EP4034673A4 (en) 2019-09-23 2024-03-06 Gateway Genomics, LLC METHODS, COMPOSITIONS AND KITS FOR DETERMINING THE SEX OF A FETU
AU2020394370A1 (en) 2019-11-27 2022-06-23 Juno Diagnostics, Inc. Systems and devices for sample preparation and analyte detection
WO2021188594A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Drawbridge Health, Inc. Systems and methods for sample collection

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220132800A (ko) 2021-03-24 2022-10-04 재단법인대구경북과학기술원 액체생검 유래 생체물질 분석용 기판, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석방법

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