JP2022548943A - 複数標的化エフェクター細胞およびその使用 - Google Patents

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Abstract

ゲノム操作されたｉＰＳＣの指向された分化から得られた機能的に増強された派生エフェクター細胞を得るための方法および組成物が提供される。本明細書で提供される派生細胞は、改善または増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を有する。機能的に増強された派生エフェクター細胞のみを含む、または抗体もしくはチェックポイント阻害剤との併用療法での治療用組成物およびその使用も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２０１９年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／９４４，１８７号および２０１９年９月２５日に出願された米国仮出願第６２／９０６，０４６号の優先権を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の組み込み
２０２０年９月２５日に作成されたサイズ７３，７２９バイトの「０５６９３２－５１９００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称の配列表の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関係する。より具体的には、本開示は、インビボで治療的に関連性のある特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関係する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処する。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来およびドナー由来の細胞の使用に重点が置かれているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成し、利益を受け得るすべての患者に療法を提供することが特に困難である。患者の良好な転帰を促進するために、養子移入されたリンパ球の効能および持続性を改善する必要もある。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためのこれらの免疫細胞の使用は依然として困難であり、改善への要求は満たされていない。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞およびＮＫ細胞、または他のリンパ球の可能性を最大限に利用する重要な機会が残っている。
応答率、細胞枯渇、輸血された細胞の喪失（生存および／または持続性）、標的喪失または系譜転換による腫瘍エスケープ、腫瘍標的化の精度、標的外傷害性、腫瘍外効果から、固形腫瘍に対する効能、すなわち、腫瘍微小環境および関連する免疫抑制、動員、輸送、および浸潤に及ぶ問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成するための方法および組成物を提供することであり、ｉＰＳＣ株はそのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子修飾を含む。該１つまたはいくつかの遺伝子修飾には、ＤＮＡの挿入、欠失、および置換が含まれ、これらの修飾は、分化、拡大、継代、および／または移植後の、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同じ遺伝子修飾を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子修飾を含む。遺伝子操作された派生細胞を得るための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、指向された分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、および操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することも必要である。さらに、この戦略は、末梢血から得られたＴ細胞またはＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞が、多くの場合、再現性および均一性を欠き、高い細胞死および低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。さらに、この戦略は、最初は不均一な一次細胞源を使用して別の方法で得られる不均一なエフェクター細胞集団の生成を回避する。
本発明のいくつかの態様は、それぞれ、再プログラミングプロセスの後、それと同時、およびその前のゲノム操作の戦略を反映する、（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する。
（Ｉ）：ｉＰＳＣを（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方を任意の順序で遺伝子操作する：（ｉ）１つ以上の構築物をｉＰＳＣに導入して、選択した部位（複数可）で標的化された組み込みを可能にする；（ｉｉ）（ａ）選択された部位の認識が可能な１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位（複数可）に１つ以上の二本鎖切断をｉＰＳＣに導入する；（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養し、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位（複数可）で標的化されたイン／デルを生成できるようにする；それにより、部分的または完全に分化した細胞への分化が可能なゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。
（ＩＩ）：再プログラミング非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得る：これには、（ｉ）非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択で、非多能性細胞の再プログラミングを開始するためのＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させることと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）（ｉ）の再プログラミング非多能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入し、次いで、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位に標的化されたイン／デルを生成することができるようにすることと、が含まれ、したがって、得られるゲノム操作されたｉＰＳＣは少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム編集を含み、該ゲノム操作されたｉＰＳＣは部分的または完全に分化した細胞に分化することができる。
（ＩＩＩ）：再プログラミングするために非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得る：これには、（ｉ）非多能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入する（ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位に標的化されたイン／デルを生成することができるようにする）ことと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞を、１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位に標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、の（ｉ）および（ｉｉ）が含まれ、それにより、少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得、該ゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分的に分化した細胞または完全に分化した細胞に分化することができる。
上述の方法の一実施形態では、１つ以上の選択された部位での少なくとも１つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成的、誘導性、一過性、組織特異性、または細胞型特異性プロモーターを含む１つ以上の外因性プロモーター；あるいは（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択した部位に含まれる１つ以上の内因性プロモーターへと作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、修飾ＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。
いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節および調整、あるいはｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存を抑制するタンパク質に関連する１つ以上の内因性遺伝子におけるイン／デルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。
さらにいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、およびＨ１１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。
またいくつかの他の実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたｉＰＳＣの多能性を維持する。一実施形態では、少なくとも１つの標的化されたゲノム編集を含む得られたゲノム操作されたｉＰＳＣは、機能的であり、分化能があり、同じ機能的ゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。
したがって、一態様では、本発明は、細胞またはその集団を提供し、ここで、（ｉ）細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、またはｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞であり、細胞は、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞は造血細胞であり、造血細胞が、末梢血、臍帯血、もしくは任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較してより長いテロメアを含むか、またはＢＣＭＡ－ＣＡＲが、以下の特徴：（ｉ）Ｔ細胞特異的であること、（ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、（ｉｉｉ）表面ＢＣＭＡに結合すること、（ｉｖ）遺伝子座ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１のうちの１つにおいて挿入されること、または（ｖ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、もしくはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、挿入が、任意選択で、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトすること、のうちの少なくとも１つを有する。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、以下のうちの１つ以上をさらにさらに含む：（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択でＣＩＩＴＡヌルまたは低、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方のノックアウト、（ｉｖ）外因性ＣＤ１６またはそのバリアント、（ｖ）ＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ｖｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体、（ｖｉｉ）表１に列記された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現、ならびに（ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片およびバリアント、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、少なくとも、（ａ）配列番号３３、３５、もしくは３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域、（ｂ）配列番号３４、３６、もしくは３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域、または（ｃ）配列番号３９～４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶ、を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、派生ＮＫまたは派生Ｔ細胞であり、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較して、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）持続性および／もしくは生存の改善、（ｉｉ）天然免疫細胞に対する耐性の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、腫瘍浸潤の改善、ＡＤＣＣの増強もしくは獲得、バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／もしくは活性化もしくは動員する能力の増強、（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる能力の増強、（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープの救済する能力の改善、（ｉｘ）腫瘍抗原を安定させる能力、ならびに（ｘ）フラトリサイドを回避する能力。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアントをさらに含む。様々な実施形態では、外因性ＣＤ１６またはそのバリアントは、以下のうちの少なくとも１つを含む：（ａ）ＣＤ１６の外部ドメインのドメイン中のＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、（ｂ）ＣＤ６４に由来する完全なまたは部分的な外部ドメイン、（ｃ）非天然（または非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｄ）非天然（または非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｅ）非天然（または非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｆ）非天然の刺激ドメイン、ならびに（ｇ）ＣＤ１６に由来せず、同じまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン。いくつかの実施形態では、（ａ）非天然の膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来し、（ｂ）非天然の刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来し、（ｃ）非天然のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来するか、または（ｄ）非天然の膜貫通ドメインがＮＫＧ２Ｄに由来し、非天然の刺激ドメインが２Ｂ４に由来し、非天然のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、ＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するＣＡＲをさらに含み、ＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異的またはＮＫ細胞特異的である、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲである、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲである、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲである、（ｖ）分割ＣＡＲである、（ｖｉ）多鎖ＣＡＲである、（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲである、（ｖｉｉｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、（ｘｉ）抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、またはチェックポイント阻害剤と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、（ｘｉｉ）ＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つに特異的である、かつ／または（ｘｉｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されている少なくともＣＡＲを含み、かつ／またはＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動される、かつ／またはＴＣＲがＣＡＲ挿入によってノックアウトされる。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む表面発現タンパク質複合体を含み、細胞表面発現タンパク質複合体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、もしくはそのバリアント、およびそのそれぞれの受容体もしくはバリアント、のうちの少なくとも１つを含むか、または（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）切断されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質（共通受容体γＣは天然であるかまたは修飾されている）、ならびに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み（ここで、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、、別個の構築物またはバイシストロン性構築物においてＣＡＲと共発現され得る）、かつ任意選択で（ｃ）一過性に発現される。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞であり、派生ＮＫ細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員および／または遊走させることができ、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤における導入されたまたは増加した発現を含み、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または阻害性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであってもよい。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの１つ以上、または（ｂ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む。
細胞がｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞である上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、派生細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、または派生Ｂ細胞を含む。
上記の細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）１つのセーフハーバー遺伝子座もしくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座もしくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）配列番号１７、１９、もしくは２１に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５△をコードするポリヌクレオチド、を含む。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、任意選択で、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータの定常領域である。
別の態様では、本発明は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲと、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）外因性ＣＤ１６またはそのバリアント、および（ｉｉｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体のうちの１つ以上と、を含む、細胞またはその集団を提供し、本細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、少なくとも、（ａ）配列番号３３、３５、もしくは３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域、（ｂ）配列番号３４、３６、もしくは３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域、または（ｃ）配列番号３９～４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶ、を含む。いくつかの実施形態では、細胞またはその集団は、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較して、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）持続性および／もしくは生存の改善、（ｉｉ）天然免疫細胞に対する耐性の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、（ｉｖ）腫瘍浸潤の改善、（ｖ）ＡＤＣＣの増強もしくは獲得、（ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／または活性化もしくは動員する能力の増強、（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる能力の増強、（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する能力の改善、（ｉｘ）腫瘍抗原を安定させる能力、ならびに（ｘ）フラトリサイドを回避する能力。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ系統またはＮＫ系統細胞である。
さらに別の態様では、本発明は、上文に記載した細胞またはその集団を含む組成物を提供する。さらに別の態様では、本発明は、上文に記載した細胞と１つ以上の治療薬とを含む治療用途のための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体またはその機能的バリアントもしくは断片、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。組成物がチェックポイント阻害剤を含む実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、もしくは阻害性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの１つ以上、または（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む。本組成物の様々な実施形態では、治療薬は、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドミドのうちの１つ以上を含む。本組成物の様々な実施形態では、治療薬は、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を含む。概して、ＧＳＩは、Ｎｏｔｃｈなどのある特定のＩ型内在性膜タンパク質のプロセシングに関与するプロテアーゼ複合体であるガンマセクレターゼの阻害剤である。本組成物の様々な実施形態では、抗体は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、および／もしくは抗ＣＤ３８抗体、（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、およびそれらのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアントもしくは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの１つ以上、または（ｃ）ダラツムマブ、を含む。
さらに別の態様では、本発明は、養子細胞療法のための上文に記載した組成物のうちのいずれかの治療用途を提供し、そのような使用は、本組成物を対象に導入することによるものであり、対象は、（ｉ）自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、もしくはウイルス感染、（ｉｉ）炎症性自己免疫疾患、形質細胞のがん、もしくはＢリンパ球のがん、（ｉｉｉ）自己反応性形質細胞および／もしくは自己反応性メモリーＢ細胞に関連する自己免疫疾患、（ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、またはリウマチ性関節炎、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、もしくはホジキン病、あるいは（ｖ）多発性骨髄腫、を有する。このため、本発明は、以下を治療するための医薬品における、上文に記載した組成物のうちのいずれかの使用を提供する：（ｉ）自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、もしくはウイルス感染、（ｉｉ）炎症性自己免疫疾患、形質細胞のがん、もしくはＢリンパ球のがん、（ｉｉｉ）自己反応性形質細胞および／もしくは自己反応性メモリーＢ細胞に関連する自己免疫疾患、（ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、またはリウマチ性関節炎、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、もしくはホジキン病、あるいは（ｖ）多発性骨髄腫。
さらに別の態様では、本発明は、上文に記載した派生細胞を製造する方法を提供し、ここで、この製造する方法には、ｉＰＳＣを分化させることが含まれ、ｉＰＳＣは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で以下のうちの１つ以上とを含む：（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択でＣＩＩＴＡヌルまたは低、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方のノックアウト、（ｉｖ）高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、（ｖ）ＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ｖｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体、（ｖｉｉ）本明細書に提供される表１に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現、ならびに（ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、エンゲージャー、ならびに二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現。
派生細胞を製造する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインし、任意選択で（ｉ）ＣＤ３８をノックアウトするか、あるいは（ｉｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡをノックアウトするか、ＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方をノックアウトするか、またはＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇ、外因性ＣＤ１６もしくはそのバリアント、第２のＣＡＲ、および／もしくはサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体の発現を導入することをさらに含む。派生細胞を製造する方法のいくつかの実施形態では、ゲノム操作には、標的化された編集が含まれる。いくつかの実施形態では、標的化された編集には、欠失、挿入、またはイン／デルが含まれ、標的化された編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって実行される。
さらに別の態様では、本発明は、クローンｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ媒介編集を提供し、編集には、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのノックインが含まれ、編集されたクローンｉＰＳＣは、本明細書に提供される表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、クローンｉＰＳＣの編集には、ＣＤ３８のノックアウトがさらに含まれるか、またはＢＣＭＡ－ＣＡＲは、少なくとも、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）Ｔ細胞特異的であること、（ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、（ｉｉｉ）表面ＢＣＭＡに結合すること、（ｉｖ）配列番号３３、３５、または３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域を含むこと、（ｖｉ）配列番号３４、３６、または３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域を含むこと、（ｖｉｉ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含むこと、および（ｖｉｉｉ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、この挿入により、遺伝子座における遺伝子の発現がノックアウトされること。いくつかの実施形態では、編集は、ＴＣＲ遺伝子座の定常領域でのＢＣＭＡ－ＣＡＲもしくは第２のＣＡＲの挿入をさらに含み、かつ／またはＣＡＲは、ＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動され、かつ／またはＴＣＲは、ＣＡＲの挿入によってノックアウトされる。
さらに別の態様では、本発明は、多発性骨髄腫の治療を改善する方法が提供され、本方法は、治療を受けている対象に、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト、および高親和性の切断不可能なＣＤ１６またはそのバリアントを含むエフェクター細胞を投与することを含み、ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）Ｔ細胞特異的であること、（ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、（ｉｉｉ）表面ＢＣＭＡに結合し、それを安定させること、（ｉｖ）配列番号３３、３５、または３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域を含むこと、（ｖｉ）配列番号３４、３６、または３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域を含むこと、（ｖｉｉ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含むこと、および（ｖｉｉｉ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、この挿入により、遺伝子座における遺伝子の発現がノックアウトされること。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞を含む派生造血細胞を含み、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞は、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（ｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方のノックアウト、（ｉｉｉ）第２のＣＡＲ、および／またはサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体の発現の導入、ならびに／あるいは（ｉｖ）本明細書に提供される表１に列記された表現型のうちの少なくとも１つ。いくつかの実施形態では、本方法は、抗ＣＤ３８抗体および／またはガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト、高親和性の切断不可能なＣＤ１６またはそのバリアントを含み、ＧＳＩと接触したか、または接触している。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫は、再発性または難治性型の多発性骨髄腫である。
本明細書で提供される組成物および方法の様々な目的および利点は、例示および例として、本発明のある特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
ｉＰＳＣ由来細胞における細胞表面発現のサイトカインのためのいくつかの構築物設計の図解である。ＩＬ１５は例示的な例として使用されており、他の望ましいサイトカインに置き換えることができる。 ＣＤ３８－／－導入遺伝子＋多能性幹細胞およびそれらに由来するエフェクター細胞を生成するための、外因性プロモーターまたはＣＤ３８内因性プロモーター（ＢおよびＤ対ＡおよびＣ）によって駆動される、１つ以上の導入遺伝子を有する、ＣＤ３８標的化導入遺伝子ノックイン構築物の様々な組成物を示す（ＡおよびＢ対ＣおよびＤ）。 同上。 同上。 同上。 構築物およびそのバリアントを使用して操作された多能性幹細胞から誘導されるＣＤ３８－／－ＣＤ１６ ＩＬ１５エフェクター細胞を生成するための、外因性プロモーターによって駆動されるＣＤ３８標的化ＩＬ１５／ＩＬ１５ｒａ－２Ａ－ｈｎＣＤ１６ノックイン構築物に含まれる例示的な核酸配列を示す。 同上。 同上。 同上。 構築物およびそのバリアントを使用して操作された多能性幹細胞から誘導されるＣＤ３８－／－ＣＤ１６＋ ＩＬ１５＋エフェクター細胞を生成するための、ＣＤ３８内因性プロモーターによって駆動されるＣＤ３８標的化ＩＬ１５／ＩＬ１５ｒａ－２Ａ－ｈｎＣＤ１６ノックイン構築物に含まれる例示的な核酸配列を示す。 同上。 同上。 ＤＡＰ１０が２９３Ｔ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ表面発現を促進することを示す。 ＤＡＰ１０発現の存在下であるか非存在下であるかにかかわらず、操作されたｉＰＳ細胞中でＢＣＭＡ－ＣＡＲ表面発現が検出されなかったことを示す。 示される各ｉＮＫ細胞株におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＩＬ１５Δの表面発現を示し、ＤＡＰ１０は、同じＣＡＲを含むがその検出可能な表面がないｉＰＳＣから分化したＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ表面発現に影響を及ぼさない。 同上。 同上。 フローサイトメトリーにより決定したテロメア長のグラフ表示であり、ｉＰＳＣからの成熟派生ＮＫ細胞は、成体末梢血ＮＫ細胞と比較して長いテロメアを維持する。 示されるように、ｉＮＫ細胞株上のＢＣＭＡ－ＣＡＲ表面発現を図示する。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現するＴ細胞が４時間の殺滅アッセイで特異的な細胞傷害性を有することを示す。 ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲとダラツムマブとが４８時間の殺滅アッセイで相乗作用して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＩＬ１５Δ、ＣＤ３８ヌル、およびｈｎＣＤ１６を含む複数抗原標的化ｉＮＫ細胞によって多発性骨髄腫がん細胞を効果的に排除することを示す。 ダラツムマブとＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞との組み合わせにより、多発性骨髄腫の播種性マウスモデルにおける腫瘍負荷が排除されることを示す。５×１０５のＭＭ．１Ｓ－ルシフェラーゼ（ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃ）細胞を免疫不全ＮＳＧマウスに静脈内注射した。２日後、マウスを未処理のままにするか、単独のまたは１×１０７の該ｉＮＫ細胞と組み合わせた２００μｇのダラツムマブ（Ｄａｒａ）で処理し、最初の１週間にマウスにｈＩＬ－１５（５μｇ）を３回静脈内注射して、ＮＫ細胞の持続性を支援した。図１２Ａは、代表的な生物発光画像を示し、図１２Ｂは、群当たりｎ＝１０マウスの累積データを示し、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞のインビボ効能を実証する。 同上。 ｉＮＫ細胞が、ＣＡＲ媒介性機序およびＡＤＣＣ機序の両方を介してＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫腫瘍細胞株を効果的に標的化することを示す。２ｕｇ／ｍｌのダラツムマブを加えたまたは加えない、３：１のエフェクター：標的比での、（Ａ）ＲＰＭＩ－８２６６および（Ｂ）Ｕ２６６多発性骨髄腫腫瘍株に対するＦＴ５７６の細胞傷害性。試料を４時間３７℃でインキュベートし、標的細胞のアポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した。ＣＡＲ発現を欠くｉＮＫ細胞と比較して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞は、ダラツムマブの非存在下で細胞傷害性の増強を示し、ダラツムマブの存在下で両方の細胞型について追加のＡＤＣＣが観察された。バーの各対において、左側のバーが非ＣＡＲ対照である。 ＣＡＲ陰性親細胞と比較した、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞をエフェクター細胞として１：１のＥ：Ｔ比で使用して、ダラツムマブの存在下または非存在下でＭＭ．１Ｓ細胞に対して行った再刺激細胞傷害性アッセイの例示的な結果を示す。Ｘ軸は１２単位の増分で示される。Ｙ軸は０．５単位の増分で示される。 ＣＡＲおよびＣＤ１６刺激に応答したＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ｉＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す。 同じサイトカイン処理を有するまたは有しないＣＡＲ Ｔ細胞と比較した、外因性サイトカイン支援の存在下または非存在下での、ＭＭ．１Ｓ－Ｌｕｃ細胞を移植し、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６エフェクター細胞の複数回用量で処理したＮＳＧマウスの例示的なＢＬＩ画像を示す。 ガンマセクレターゼ阻害剤がＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６エフェクター細胞のインビボでの効能を増加させることを示す。未反応のマウスを破線で白抜きの四角の記号の中に示し、移植しなかった対照マウスを白抜きの記号および破線で示す。
ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）のゲノム修飾には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含まれる。ゲノム操作されたｉＰＳＣにおける外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期クローン拡大後、細胞分化後、およびゲノム操作されたｉＰＳＣに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子発現の低下などの問題に遭遇することが多い。一方、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製および送達に障害をもたらす。本発明は、自殺遺伝子および他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、および／または生存率に関する改善された治療的特性を、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞を含むが、これらに限定されないｉＰＳＣ派生細胞にもたらす。
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
「および／または」という用語は、代替案の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％まで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」および「本質的に含まない」という用語は交換可能に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物を説明するために使用される場合、特定の物質またはその供給源を含まない、例えば、特定の物質またはその供給源を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まないか、または従来の手段によって測定されるとき検出不能である組成物を指す。組成物中のある特定の成分または物質を「含まない」または「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分または物質が、（１）任意の濃度で組成物に含まれない、または（２）機能的に不活性だが、低濃度で組成物に含まれることを意味する。同様の意味は、「非存在」という用語に適用することができ、特定の物質または組成物のその供給源が存在しないことを指す。
本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外することを意味しないと理解される。特定の実施形態では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「含有する」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義語として使用される。
「からなる」とは、「からなる」という句に続くものを含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列記された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
「本質的にからなる」とは、句の後に列記された任意の要素を含むことを意味し、列記される要素の開示において特定された活性または動作に干渉または寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列記される要素が必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、列記された要素の活性または動作に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても存在しなくてもよい。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特色、構造、または特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれる。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件の改変を最小限に抑えて、生体外の人工環境の生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常は無菌条件下で、典型的には数時間または最大約２４時間（しかしながら、状況に応じて最大４８または７２時間以上を含む）実験装置で培養された生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集して凍結し、後にエクスビボ処理のために解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日より長く続く組織培養実験または手順は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、概して、生体内で行われる活動を指す。
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「分化能の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の分化能を増加させるか、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、分化能が増加した細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より大きな発生可塑性を有する（つまり、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えれば、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりもあまり分化しない状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットしていない」）またはあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞または筋細胞などの特殊化された細胞の特色を獲得するプロセスである。分化したまたは分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化した（「コミットした」）位置をとった細胞である。「コミットした」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続ける点まで分化経路を進んでおり、通常の状況下では、異なる細胞型に分化するか、またはあまり分化しない細胞型に戻ることができない細胞を指す。本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、体または体細胞のすべての系統（すなわち、胚そのもの）を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉の３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生み出すことができない不完全または部分的に多能性の細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物（例えば、胚性幹細胞）を生み出すことができるより原始的でより多能性の細胞に及ぶ発生能の連続体である。
本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、誘導または変更された、分化した成人、新生児または胎児細胞から産生された、すなわち、３つのすべての胚葉または真皮層：中胚葉、内胚葉、および外胚葉のすべての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界に見られる細胞を指さない。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に外胚葉、内胚葉、中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体を生じさせる。それらは胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用される場合、「多分化能幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞に分化するが、３つすべてにではない発生の可能性を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞は「部分的に分化した細胞」とも呼ばれる。多分化能細胞は当該技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が所与の系統で多くの細胞型を形成する可能性があるが、他の系統の細胞は形成しない可能性があることを示す。例えば、多分化能造血細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤、白、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、部分的に、細胞の多能性の特徴を評価することによって決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、および／またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、ならびに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が含まれるが、これらに限定されない。
後期胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した多能性の「プライミング」または「準安定」状態、および初期／着床前胚盤胞の細胞塊に類似した多能性の「ナイーブ」または「グラウンド」状態の２種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態は上述のような特徴を呈するが、ナイーブまたはグラウンド状態はさらに、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の事前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性および生存の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な低下、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーターへのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低下、および（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現の低下を呈する。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、サイレンシングされるか、または結果として得られる多能性細胞から除去される細胞再プログラミングの標準的な方法論は、概して、多能性のプライミング状態の特徴を有するとみなされる。標準的な多能性細胞培養条件下では、そのような細胞は、グラウンド状態の特徴が観察される外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、プライミング状態のままであり、グラウンド状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特色を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、核と細胞質の比率が高く、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または他の飼育動物を指す。
「多能性因子」または「再プログラミング因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子および小分子再プログラミング剤が含まれる。
「培養」または「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、成長、および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（それぞれの場合において単数の「培地」）、「補充成分」および「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」または「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）細胞培養皿またはフラスコ内で、組織外または体外で細胞を維持、増殖（成長）、および／または分化させることを指す。「培養」または「維持」は、細胞を増殖および／または維持するのに役立つ栄養素、ホルモン、および／または他の因子の供給源として培養培地を利用し得る。
本明細書で使用される場合、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に現れ、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、ならびに他の支持組織および結合組織を含む様々な特殊化した細胞型を生じさせる３つの胚葉のうちの１つを指す。
本明細書で使用される場合、「二次造血内皮細胞」（ＨＥ）または「多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞」（ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞および前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発達は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て二次造血内皮細胞および造血前駆細胞へと順次進行する。
「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、または「造血前駆細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、さらなる造血分化が可能であり、多分化能造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞型を生じさせる多分化能幹細胞である。本明細書で使用される「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を含む成熟骨髄およびリンパ系細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞には、原始赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットも含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、交換可能に使用され、胸腺で成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の特定ならびに他の免疫細胞の活性化および非活性化を含む、免疫系において様々な役割を有する主要な型の白血球を指す。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、もしくは培養されたＴ細胞株、例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などを含むがこれらに限定されない任意の発生段階のものであり得る。追加の型のヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加の型のメモリーＴ細胞には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指し得る。Ｔ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化され得る。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、表面にＣＤ４を発現し、細胞媒介性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは、刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、これには、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」は、最初はＴリンパ球上の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見られる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ制限免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、それらはヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限され、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞、ならびに細胞傷害性およびサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限相互作用における関連認識要素である。
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用される場合、「適応ＮＫ細胞」および「メモリーＮＫ細胞」という用語は、交換可能であり、表現型的にＣＤ３－およびＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、および任意選択でＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、およびＥＡＴ－２のうちの１つ以上の表現に欠くＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化および阻害性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、ならびに／またはＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、暗いまたは明るい発現であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＫＴ細胞」または「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的なＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つの型のＮＫＴ細胞が認識されている。インバリアントまたはＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリー、つまり、限られたスペクトルのβ鎖（ヒトではＶβ１１）に関連する標準的なα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的または非インバリアントＩＩ型ＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の２番目の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を示す。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫療法に好適であると考えられる。適応またはインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、以下のマーカー：ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、およびＣＤ５６のうちの少なくとも１つ以上の発現により特定され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境で見出される少なくとも１つの構成要素を実質的に含まない細胞または細胞の集団を指す。この用語には、自然環境で見出される一部またはすべての構成要素から取り出された、例えば、組織や生検試料から単離された細胞が含まれる。この用語はまた、細胞が天然に存在しない環境で見出される、例えば、細胞培養または細胞懸濁液から単離されるため、少なくとも１つ、いくつか、またはすべての構成要素から取り出される細胞を含む。したがって、単離された細胞は、自然界に見られる場合、または天然に存在しない環境で成長するか、保存されるか、もしくは生存する場合、他の物質、細胞、または細胞集団を含む少なくとも１つの構成要素から部分的または完全に分離される。単離された細胞の特定の例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、および天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞またはその集団を環境中の他の物質または細胞から分離することから、または環境から１つ以上の他の細胞集団もしくは亜集団を取り除くことから得ることができる。
本明細書で使用される場合、「精製する」などの用語は、純度を高めることを指す。例えば、純度を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％に増加させることができる。
本明細書で使用される場合、「コード化」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。
「構築物」は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外来遺伝子材料の標的細胞への送達または移動を指向することができる任意の核酸構築物を指し、標的細胞で複製および／または発現することができる。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子であり得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みであり得る。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
「組み込み」とは、構築物の１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位または「組み込み部位」で細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用される場合、「組み込み」という用語はさらに、組み込み部位での内因性配列またはヌクレオチドの欠失の有無にかかわらず、構築物の１つ以上の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を伴うプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、欠失される内因性配列またはヌクレオチドを１つ以上の挿入されたヌクレオチドに置き換えることをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照される活性が宿主細胞に導入されるか、または宿主細胞に非天然であることを意味することを意図する。分子は、例えば、コード化核酸を宿主の遺伝子材料に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、またはプラスミドなどの非染色体遺伝子材料として導入され得る。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、コード化核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照される分子または活性を指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード化核酸の発現を指す。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）からのＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、自然界に見られるポリペプチド）またはそれらの断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）またはその断片；操作されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療用ペプチドまたはポリペプチド、撮像マーカー、選択可能なマーカーなどをコードし得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンに対してウラシル（Ｕ）で構成される。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、これらの用語は、例えば、当該技術分野で概してペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当該技術分野で概してポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）、コード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子インプリント」という用語は、供給源細胞またはｉＰＳＣにおける優先的な治療属性に寄与し、供給源細胞由来のｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣ由来の造血系統細胞において保持可能な遺伝的または後成的情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、再プログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、供給源細胞由来のｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型にさらに分化され得る。供給源細胞由来のｉＰＳＣ、およびそれから分化した細胞は、時折、状況に応じて、まとめて「由来」または「派生」細胞と呼ばれる。例えば、本明細書全体を通して使用される派生エフェクター細胞、または派生ＮＫ細胞もしくは派生Ｔ細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源から得られた一次対応物と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性を付与する遺伝子インプリントは、ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的な選択された供給源細胞を再プログラミングすることによって、またはゲノム編集を使用して、遺伝子修飾されたモダリティをｉＰＳＣに導入することによってのいずれかでｉＰＳＣに組み込まれる。具体的に選択されたドナー、疾患、または治療状況から得られた供給源細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝子インプリントは、基礎となる分子事象が特定されているかどうかに関係なく、選択された供給源細胞の派生細胞に伝えられる保持可能な表現型、すなわち、優先的な治療属性を示す任意の状況特異的な遺伝的または後成的修飾を含み得る。ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的供給源細胞は、ｉＰＳＣおよび由来造血系統細胞において保持可能な遺伝子インプリントを含み得、これらの遺伝子インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞またはインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの予め配置された単一特異性ＴＣＲ；追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーの高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点突然変異のためのホモ接合性；所定のＨＬＡ要件、すなわち、集団が増加したハプロタイプを呈する選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性には、由来細胞の改善された生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の調節および調整、生存、ならびに細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性にも関係している可能性がある。
本明細書で使用される場合、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な、未修飾の、および／または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強、改善、および／または増大された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の調節および調整、生存、ならびに細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性よっても示される。
本明細書で使用される場合、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、および腫瘍細胞間の連結を形成し、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発または開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは関係なく、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重または多重特異性抗体の結合を容易にする。このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、次いでそのようなｉＰＳＣを、ユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が、細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現および活性化され得、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。したがって、１つまたは複数のエフェクター細胞型を使用して、特定の型の腫瘍細胞を殺滅する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺滅する場合もある。表面トリガー受容体は、概して、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的なエピトープ結合領域とを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面トリガー受容体のエピトープ結合領域に特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用される場合、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性またはさもなければ有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。場合によっては、安全スイッチタンパク質の発現は、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノムに恒久的に組み込んだ、移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処するために条件付きで制御される。この条件付き調節は可変であってよく、小分子を介した翻訳後活性化ならびに組織特異的および／または一時的な転写調節による制御が含まれ得る。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、成長停止、転写および転写後の遺伝子調節、ならびに／または抗体を介した枯渇を媒介し得る。場合によっては、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、修飾されたＥＧＦＲ、およびそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これに限定されない。この戦略では、有害事象が発生した場合に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺滅する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に活性なタンパク質またはペプチド」という用語は、生物に対して生物学的および／または薬学的効果を達成することができるタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対して治癒的、根治的、または姑息的特性を有し、疾患の重症度を回復させる、緩和する、軽減する、逆転させる、または和らげるために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防的特性を有し、疾患の発症を予防するため、またはそれが出現したときにそのような疾患もしくは病的状態の重症度を和らげるために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、全タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質もしくはペプチドの薬学的に活性な類似体、またはタンパク質もしくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的または相乗的に作用して治療上の利益を提供する複数のタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体もしくはその断片、成長因子、および／またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節する、それに関与する、阻害する、活性化する、低減する、または増加させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、最終的に細胞内の生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学修飾の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質結合受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、およびＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）独特のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連する場合、抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関連する場合、エンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換された細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、およびｖ）特定の抗原または表面分子の非存在下での他の標的化戦略が含まれるがこれらに限定されない抗原および／またはエピトープ特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「特異的」または「特異性」という用語は、非特異的または非選択的結合とは対照的に、分子、例えば、受容体またはエンゲージャーが標的分子に選択的に結合する能力を指すために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子修飾されているか否かにかかわらず、注入前にインビボで拡大されたＴ細胞またはＢ細胞として特定される、自家または同種異系リンパ球の該注入に関連する細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用される場合、「治療的に十分な量」は、その意味の範囲内で、非毒性であるが、それが言及する特定の治療および／または薬学的組成物の十分なおよび／または有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要な正確な量は、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、ならびに状態の段階および重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療される対象の疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を回復させる、低減する、および／または改善するのに十分である、および／または効果的である。
多能性幹細胞の分化には、培養培地中の刺激剤または細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要である。最も一般的な戦略は、系統特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」は、三次元領域内に多数の系統を生じさせるため、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発する凝集した多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、その時点で（典型的には数日から数週間）、さらに処理されて分化を続ける。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を三次元の多層細胞クラスター内で互いに近接させることによって開始され、典型的には、これは多能性細胞を液滴に沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させるか、または機械的攪拌などによるものを含む、いくつかの方法のうちの１つによって達成される。多能性培養維持培地中で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体はさらなる分化の手掛かりが必要である。したがって、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統に向けて誘発の手掛かりを提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内で中程度の増殖を伴う分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、および内胚葉の胚葉）の生成をもたらす。細胞分化を促進することが証明されているが、ＥＢは、三次元構造の細胞が環境からの分化の手掛かりに一貫して曝されていないため、異なる分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、ＥＢは作製および維持が困難である。さらに、ＥＢを介した細胞分化は、適度な細胞拡大を伴い、これも分化効率の低下に寄与する。
対照的に、「ＥＢ形成」とは異なる「凝集体形成」は、多能性幹細胞由来細胞の集団を拡大するために使用することができる。例えば、凝集体ベースの多能性幹細胞の拡大中に、増殖および多能性を維持するための培養培地が選択される。細胞増殖は概して、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増加させるために、日常的に機械的または酵素的に小さな凝集体に解離され得る。ＥＢ培養とは異なり、維持培養下の凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化の手掛かりを必要とする。
本明細書で使用される場合、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化とは異なる分化方法、すなわち「ＥＢ形成」を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも、単層分化は、分化開始のためのＥＢ形成の必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つすべての胚葉分化と比較して最小限であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞から、または表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法によって動物または組織から解離され得る。あるいは、インビトロで凝集する細胞は、クラスターの懸濁液、単一細胞、または単一細胞とクラスターとの混合物への解離などによって、酵素的または機械的に互いに解離することができる。さらに別の代替の実施形態では、付着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（例えば、培養表面）との細胞相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊を伴い得る。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、フィーダー細胞が、第２の細胞型を支持するための刺激、成長因子、および栄養素を提供するため、第２の型の細胞が成長、拡大、または分化することができる環境を提供するために第２の型の細胞と共培養される１つの型の細胞を説明する用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが支持する細胞とは異なる種からである。例えば、幹細胞を含むある特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞または形質転換された白血病細胞がナチュラルキラー細胞の拡大および成熟を支持する。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養するときに、それらが支持している細胞よりも成長するのを防ぐために、照射またはマイトマイシンなどの有糸***剤アンタゴニストで処理することによって不活化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病細胞を含み得る。前述のことを制限することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。概して、様々なフィーダー細胞を部分的に使用して、多能性を維持し、ある特定の系統への分化を指向し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化された細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、フィーダー細胞または間質細胞を本質的に含まない、および／またはフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない培養条件、細胞培養物、または培養培地などの環境を指す。「予め条件付けされた」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。予め条件付けされた培地には、培地で培養されたフィーダー細胞によって分泌される成長因子およびサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含む。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞または間質細胞の両方を含まず、またフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない。
ｉＰＳＣおよびそれから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集もしくは修飾、または非多能性細胞およびそれから再プログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集または修飾の文脈で使用される場合、「機能的」は、（１）直接的なゲノム編集もしくは修飾により、または最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により達成される、遺伝子レベルでの良好なノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニックもしくは制御された遺伝子発現、例えば、所望の細胞の発達段階での誘導性もしくは一時的な発現、あるいは（２）（ｉ）直接的なゲノム編集により該細胞において得られた遺伝子発現の修飾、（ｉｉ）最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により該細胞で維持される遺伝子発現の修飾、（ｉｉｉ）該細胞の初期の発生段階でのみ現れる、または分化または再プログラミングを介して該細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる遺伝子発現の修飾の結果としての該細胞における下流の遺伝子調節、または（ｉｖ）最初に、ｉＰＳＣ、前駆細胞、もしくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集もしくは修飾に由来する、成熟細胞産物内に提示される、増強されたもしくは新たに獲得された細胞機能もしくは属性による、細胞レベルでの良好な細胞機能／特性の除去、追加、または改変を指す。
ＨＬＡクラスＩ欠損、ＨＬＡクラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＨＬＡクラスＩＩのヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現が欠如しているか、またはもはや維持されていないか、またはレベルの減少もしくは低下が他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低いようなレベルの低下を有するいずれかの細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、「修飾されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、走化性、および細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによってさらに修飾されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「修飾されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。
ＦｃＲと略される「Ｆｃ受容体」は、それらが認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体であるＩｇＧに結合するものは、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞）および各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいくつかのメンバーが含まれ、これらは、分子構造が異なるため抗体親和性が異なる。
ＣＦｃＲと略される「キメラＦｃ受容体」は、それらの天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインが修飾されたか、または非天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を説明するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインの一方または両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発により細胞活性化、拡大、および機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、または抗体のＦｃ領域、またはエンゲージャーもしくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的化された細胞を近接させるかどうかに関係なく細胞を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する、細胞内領域内の選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって生成される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性をさらに改善するために、ＣＤ６４の細胞外ドメインまたはＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインを伴うＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解切断部位が排除されるか、または受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられる、すなわち、シェディングの影響を受けず、それにより、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが得られる。
ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームを有することが特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を容易にする。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、または「高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）」は、ＣＤ１６の天然または非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６ＶおよびＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９～２１２位）における切断部位（１９５～１９８位）が改変または排除されているＣＤ１６バリアントは、シェディングに供されない。切断部位および膜近位領域は、ＷＯ２０１５／１４８９２６に詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６ Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の設計された切断不可能なバージョンである。Ｆ１５８ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能である。別の例示的な高親和性で切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエキソンのうちの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。
Ｉ．増強された特性を有する養子細胞療法に有用な細胞および組成物
ｉＰＳＣの分化能ならびにｉＰＳＣおよびその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなく、クローンｉＰＳＣの調節回路を系統的に操作する一方で、派生細胞の治療特性を増強する戦略が本明細書で提供される。派生細胞は、機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。本発明以前は、１つ以上の提供された遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが、細胞発生に入る能力、および／または調節された活性を保持しながら機能的分化細胞を成熟および生成する能力を依然として有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣからの指向された細胞分化中の予期せぬ失敗は、発生段階特異的遺伝子発現またはその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、ならびに細胞の表現型および／または機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない態様に起因している。本出願は、本明細書で提供される１つ以上の選択されたゲノム修飾がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさず、操作されたｉＰＳＣに由来する機能的エフェクター細胞がｉＰＳＣ分化後のエフェクター細胞において保持された個々のまたは組み合わされたゲノム修飾に起因する治療特性を増強および／または獲得したことを示した。
１．ＢＣＭＡ－ＣＡＲ
遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞に適用されるのは、１つ以上のＣＡＲ設計であり得る。キメラ抗原受容体であるＣＡＲは、抗原認識領域、膜貫通ドメイン、および内部ドメインを含む概して外部ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドもしくはリーダー配列、および／またはスペーサーをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患または病原体に関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液性または固形腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、該ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞を活性化するのに好適である。いくつかの実施形態では、ＮＫ特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫＴ細胞特異的である。ある特定の実施形態では、該Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来し、派生Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、該ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。ある特定の実施形態では、該ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。
ある特定の実施形態では、該抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはその抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。
一例では、本明細書は、腫瘍抗原ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）を標的化する抗原認識領域を含むＣＡＲを提供する。ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７またはＣＤ２６９）の膜貫通糖タンパク質であり、すべての患者の多発性骨髄腫細胞で有意に高いレベルで発現するが、正常な形質細胞を除く他の正常な組織では発現しない。ＣＡＲを標的化するＢＣＭＡのいくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＣＤ２６９の細胞外ドメインに特異的に結合するｓｃＦＶである。一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号３３、３５、および３７に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖（ＶＨ）の可変領域と、配列番号３４、３６、および３８に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖（ＶＬ）の可変領域と、を含む。ＣＡＲ構築物のためのＢＣＭＡ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ、配列番号３３および配列番号３４に対して、またはそれぞれ、配列番号３５および配列番号３６、または配列番号３７および配列番号３８に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるＶＨおよびＶＬを含む。ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のうちのいずれか１つに対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される。本明細書の別の態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生細胞を提供し、ここで、細胞は、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。他のいくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、ＮＫＴ細胞である。他のいくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、Ｔ、ＮＫ、もしくはＮＫＴ細胞または天然源の任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能的または構造的特徴を有する。一例では、本明細書は、腫瘍抗原ＢＣＭＡを標的化する抗原認識領域を含むＣＡＲを提供する。
配列番号３３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＦＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＧＥＩＮＰＳＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＹＹＤＹＧＤＡＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－１（ＶＨ））
配列番号３４
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＳＶＥＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＡＬＩＹＳＡＳＬＲＦＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－１（ＶＬ））
配列番号３５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－２（ＶＨ））
配列番号３６
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＳＱＳＳＩＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－２（ＶＬ））
配列番号３７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－３（ＶＨ））
配列番号３８
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦ ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＥＴＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－３（ＶＬ））
配列番号３９
Figure 2022548943000002
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－１；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４０
Figure 2022548943000003
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－２；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４１
Figure 2022548943000004
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－３；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４２
Figure 2022548943000005
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－４；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４３
Figure 2022548943000006
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－５；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４４
Figure 2022548943000007
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－６；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
本明細書の別の態様では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＢＣＭＡ以外の抗原を標的化する追加のＣＡＲ細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加のＣＡＲは、腫瘍抗原ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）を標的化する。ＭＩＣＡ／Ｂ標的化ＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの保存されたα３ドメインに特異的に結合するｓｃＦＶである。一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号４５に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖の可変領域と、配列番号４６に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖の可変領域と、を含む。ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号４７に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される。ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶの別の実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号４８に対して、少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、または少なくとも約８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される。
配列番号４５
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＮＹＡＭＮＷＶＫＱＡＰＥＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＤＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＴＹＧＮＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
（１１８ＡＡ．ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ重鎖（ＨＣ））
配列番号４６
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＤＴＳＩＬＨＬＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＫＦＰＲＴＦＧＧＧＴＴＬＥＩＫ
（１０７ＡＡ．ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ軽鎖（ＬＣ））
配列番号４７
Figure 2022548943000008
（ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ；ＨＣ－リンカー－ＬＣ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
配列番号４８
Figure 2022548943000009
（ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ；ＬＣ－リンカー－ＨＣ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
本明細書に示されるように、提供されるＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲによるＭＩＣＡ／Ｂ腫瘍抗原標的化は、多くのヒトおよびマウス腫瘍細胞株で観察される表面ＭＩＣＡ／Ｂシェディングを阻害し、ＭＩＣＡ／Ｂ細胞表面密度の増加を、可溶性シェディングしたＭＩＣＡ／Ｂの減少、ならびにＮＫ細胞媒介腫瘍殺滅の増強をもたらす。腫瘍細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂを標的化し、安定させることができる提供されるＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄの腫瘍ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢへの結合を妨害しない。
遺伝子操作されたｉＰＳＣおよび派生エフェクター細胞に含まれるＭＩＣＡ／Ｂ以外の追加のＣＡＲ（複数可）によって標的化され得る抗原の非限定的な例としては、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリーＡ １（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例としては、病気を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および原生動物が挙げられる。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞の一実施形態では、該細胞はＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲをさらに含む。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞の別の実施形態では、該細胞はＣＤ１９－ＣＡＲをさらに含む。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞のさらに別の実施形態では、該細胞はＨＥＲ２ ＣＡＲをさらに含む。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞のなお別の実施形態では、該細胞はＭＳＬＮ ＣＡＲをさらに含む。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞のさらなる実施形態では、該細胞はＰＳＭＡ ＣＡＲも含む。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生エフェクター細胞のさらに別の実施形態では、該細胞はＶＥＧＦ－Ｒ２ ＣＡＲも含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドの天然または修飾された膜貫通領域の完全長または少なくとも一部を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび／または追加のＣＡＲ（ＢＣＭＡ以外の標的抗原）は、ＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび／または追加のＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、内部ドメイン（または細胞内ドメイン）のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの完全長または少なくとも一部を含む。一実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのシグナル伝達ペプチドは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、該内部ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。該共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ４、もしくはＮＫＧ２Ｄ、またはそれらの任意の組み合わせのポリヌクレオチドの完全長または少なくとも一部を含み得る。
一実施形態では、本出願で提供されるＢＣＭＡ－ＣＡＲは、ＣＤ３ζの天然のまたは修飾されたＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインを含み、配列番号１３に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表される。さらなる実施形態では、ＣＤ２８に由来する共刺激ドメインと、ＣＤ３ζの天然または修飾されたＩＴＡＭ１とを含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８に由来するヒンジドメインと、膜貫通ドメインとを含み、ｓｃＦｖは、ヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号１４に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。
配列番号１３
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱ
ＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥ
ＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
（１５３ ａ．ａ．ＣＤ２８共刺激＋ＣＤ３ζＩＴＡＭ）
配列番号１４
Figure 2022548943000010
（２１９ ａ．ａ．ＣＤ２８ヒンジ＋ＣＤ２８のＴＭ＋ＣＤ２８共刺激＋ＣＤ３ζＩＴＡＭ）
別の実施形態では、本出願で提供されるＢＣＭＡ－ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメインと、２Ｂ４に由来する共刺激ドメインと、天然または修飾されたＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインとを含み、配列番号１５に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のアミノ酸配列によって表される。ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメインと、２Ｂ４に由来する共刺激ドメインと、天然または修飾されたＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインとを含む該ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジをさらに含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号１６に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性のものである。
配列番号１５
Figure 2022548943000011
（２６３ ａ．ａ ＮＫＧ２Ｄ ＴＭ＋２Ｂ４＋ＣＤ３ζ）
配列番号１６
Figure 2022548943000012
（３０８ ａ．ａ ＣＤ８ヒンジ＋ＮＫＧ２Ｄ ＴＭ＋２Ｂ４＋ＣＤ３ζ）
非限定的なＣＡＲ戦略には、細胞内ドメインのペアの二量体化によるヘテロ二量体の条件付き活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９５８７０２０号を参照されたい）、ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、および内部ドメインの相同組換えである分割ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）、抗原結合ドメインとシグナル伝達ドメインにそれぞれ接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有リンクを可能にする多鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）、二重特異性抗原結合ドメインを有する（例えば、米国特許第９４４７１９４号を参照されたい）、または同一のもしくは異なる抗原もしくはエピトープを認識する抗原結合ドメインのペアを有する（例えば、米国特許第８４０９５７７号を参照されたい）ＣＡＲ、またはタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２を参照されたい）、誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）、切り替え可能なＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）、および、当該技術分野で知られている他の設計がさらに含まれる。
ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび／または追加のＣＡＲ（ＢＣＭＡ以外の標的抗原）の挿入に好適なゲノム遺伝子座には、本明細書で提供されるゲノムセーフハーバーの基準を満たす遺伝子座、および組換えの結果として選択された遺伝子座での遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが望まれる遺伝子座が含まれる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲ挿入のための好適なゲノム遺伝子座としては、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＴＣＲ定常領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＣＲノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモーターの制御下に置く。ＴＣＲヌルおよびＢＣＭＡ ＣＡＲを含むｉＰＳＣ派生細胞の１つの特定の実施形態では、該派生細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座またはＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入されたＣＡＲを有し、ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄプロモーターの制御下に置く。ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２ＤヌルおよびＢＣＭＡ ＣＡＲを含むｉＰＳＣ派生細胞の１つの特定の実施形態では、該派生細胞はＮＫ細胞である。さらなる実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ３８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ３８ノックアウトをもたらし、任意選択でＣＡＲ発現を内因性ＣＤ３８プロモーターの制御下に置く。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５８ノックアウトをもたらす。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５４コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５４ノックアウトをもたらす。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＩＳ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＩＳノックアウトをもたらす。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＢＬ－Ｂ（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＣＢＬ－Ｂ）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＢＬ－Ｂノックアウトをもたらす。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＳＯＣＳ２（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＣＢＬ－Ｂ）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＳＯＣＳ２ノックアウトをもたらす。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）コード領域に挿入されたＣＡＲを有する。別の実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３のいずれか１つのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、挿入部位での遺伝子ノックアウトをもたらす。さらなる実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＴＩＧＩＴのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＩＧＩＴノックアウトをもたらす。
したがって、本明細書で提供されるものには、分化中のゲノム操作されたｉＰＳＣから得られた派生細胞が含まれ、ここで、ｉＰＳＣと派生細胞との両方は、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲを含む。また、本明細書でさらに詳しく説明されるように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲと、ＢＣＭＡ以外の標的に特異的な第２のＣＡＲ；ＣＤ３８ノックアウト；ｈｎＣＤ１６；外因性サイトカインシグナル伝達成分；ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ５８、およびＣＤ５４の少なくとも１つの過剰発現を伴うＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ欠損；ＴＣＲヌル；ＣＤ３を提示する表面；抗原特異的ＴＣＲ；ＮＫＧ２Ｃ；ＤＡＰ１０／１２；ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の修飾モダリティを含むｉＰＳＣおよび派生細胞も提供される。
２．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫およびＣＤ２０陰性Ｂ細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統および骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方調節されており、がん細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導と、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）などの免疫エフェクター機構の活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と協調する免疫エフェクター機構には、食作用（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）も含まれる場合がある。
悪性細胞上で高度に発現する以外に、ＣＤ３８は、形質細胞およびＮＫ細胞、ならびに活性化Ｔ細胞およびＢ細胞でも発現される。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋幹細胞、ならびにリンパ系、赤血球、および骨髄の系統にコミットした前駆細胞で、形質細胞段階まで続く成熟の最終段階中に発現される。ＣＤ３８は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質として、ヌクレオチド代謝物の産生に関与する受容体および多機能酵素の両方として細胞機能を実行する。酵素として、ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースへの反応の合成および加水分解を触媒し、それにより細胞接着のプロセス（このプロセスはカルシウム依存である）に重要な小胞体およびリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰを産生する。受容体として、ＣＤ３８は、ＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞におけるサイトカイン放出および細胞傷害性を調節する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ２＋束を調節し、リンパ系および骨髄系細胞におけるシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体を形質導入したＴ細胞を全身使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエント免疫エフェクター細胞機能障害のため、治療応答が不完全になり、効能が低下または排除されることが示されている。加えて、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄および末梢血の両方でＮＫ細胞の低減が観察されたが、Ｔ細胞およびＢ細胞などの他の免疫細胞型は、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に制限されることなく、提供されるＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ＣＤ３８を介したフラトリサイドを克服し、特定の抗体および／またはＣＤ３８抗原結合ドメインによって誘導されるエフェクター細胞の枯渇または減少を回避できる。加えて、ＣＤ３８はＴ細胞またはＢ細胞などの活性化リンパ球で上方調節されるため、ダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用して、ＣＤ３８ヌルである提供される適応性同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおいて活性化リンパ球を排除するか、またはこれらのリンパ球の活性化を抑制することができ、その結果、これらのエフェクター細胞に対する宿主リンパ球によるアロ拒絶を減少および／または防止することができ、リンパ球枯渇に使用されるＣＤ３８抗体の存在にもかかわらず、これらのエフェクター細胞の生存および持続性を増加させることができる。このように、本出願はまた、エフェクター細胞の持続性および／または生存率を増強しつつ、レシピエントＴ細胞およびＢ細胞の活性化に対する、および／または活性化したレシピエントＴ細胞およびＢ細胞を排除する、ＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャーまたはＣＤ３８ ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用することによる同種拒絶反応の低減または防止をする戦略を提供する。具体的には、提供される戦略には、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＣＤ３８ノックアウトを有するｉＰＳＣ株を生成することおよびｉＰＳＣのクローン細胞バンクを製造すること、ならびにＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現およびＣＤ３８ヌル（ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ＣＤ３８－／－）の派生エフェクター細胞を、操作されたｉＰＳＣ株の分化誘導によって得ることが含まれる。本出願の前は、ＣＤ３８が上述のように細胞発生生物学と細胞機能で多くの重要な役割を果たすことを考えると、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび／またはＣＤ３８ノックアウトを含む、ｉＰＳＣにおける編集が、ｉＰＳＣ分化、派生細胞表現型、およびエフェクター細胞機能を含む側面が混乱するかどうかは不明であった。
本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８ヌルｉＰＳＣ株は、機能的派生造血エフェクター細胞を産生するように分化誘導することができる。いくつかの実施形態では、派生造血エフェクター細胞には、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、派生造血エフェクター細胞は、天然源からのＴ、ＮＫ、もしくはＮＫＴ細胞、または任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能的または構造的特徴を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８抗体を使用してＡＤＣＣを誘導するか、またはＣＤ３８ ＣＡＲを標的化細胞殺滅に使用する場合、ＣＤ３８－／－ｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は該ＣＤ３８抗体またはＣＤ３８ ＣＡＲによって排除されず、これにより、そのような治療薬の存在下および／または曝露後のｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療薬の存在下で、および／または曝露後の、インビボでの持続性および／または生存率が増加している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルｉＰＳＣおよび派生細胞は、外因性ＣＤ１６もしくはそのバリアントの発現、ＣＡＲ発現、サイトカイン／サイトカイン受容体発現、ＨＬＡ Ｉおよび／またはＨＬＡＩＩノックアウト、ならびに提供される追加のモダリティを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つ以上の追加のゲノム編集を含む。
別の実施形態では、ＣＤ３８の選択された位置に本明細書で提供されるＢＣＭＡ－ＣＡＲを含む１つ以上の導入遺伝子を挿入すると同時にＣＤ３８をノックアウトすることは、例えば、ＣＤ３８を標的化するノックイン／ノックアウト（ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ）構築物（図２Ａ～Ｄ）によって達成することができる。該構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、ＣＤ３８遺伝子座内の位置選択的挿入のための一対のＣＤ３８標的化相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、事前に選択された標的化部位は、ＣＤ３８のエキソン内にある。本明細書で提供されるＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物は、導入遺伝子（複数可）が、ＣＤ３８内因性プロモーター下または構築物に含まれる外因性プロモーター下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２ＡリンカーまたはＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶに由来する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子および／または外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物に含まれる外因性プロモーターは、ＣＡＧ、またはＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターであり得る。図３および図４は、ＣＡＧプロモーター（図３）によって、またはＣＤ３８内因性プロモーター（図４）によって駆動されるｈｎＣＤ１６とＩＬ１５ＲＦ（この特定の実施例では、切断されたＩＬ１５ＲＦ）のＣＤ３８遺伝子座の選択した位置に挿入しつつＣＤ３８発現をノックアウトするように設計された構築物の例示的な配列を示す。図で提示され、当業者によって理解されるように、図３および図４に示される構築物に含まれる構成要素のいくつかは、それらが任意選択であるように必須ではなく、含まれるいくつかの成分のための核酸配列は変動する可能性があり、図に提示される各々の構成要素の例示的な核酸配列または構築物全体に対して、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％未満であるが、５０％を超える配列同一性を有し得る。一実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをＣＤ３８遺伝子座に挿入して、ｉＰＳＣでＣＤ３８を同時にノックアウトした。したがって、本発明はさらに、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣおよびそれからの派生細胞を提供する。
３．外因的に導入されたＣＤ１６またはそのバリアント
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）の２つのアイソフォームとして特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を容易にする。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現される。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、または「高親和性の切断不可能なＣＤ１６」は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを受ける。Ｆ１７６Ｖ（一部の出版物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、遺伝子操作された例示的な切断不可能なバージョンのＣＤ１６である。Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能であり、これは、ＷＯ２０１５／１４８９２６により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＣＤ１６の外部ドメインが本質的にＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体はまた、ＡＤＣＣを実施することが可能なＣＤ１６受容体の所望の高親和性および切断不可能な特色を達成することができる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４またはそのアイソフォームもしくは多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、およびＥＣ３エキソンのうちの１つ以上を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）は、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、それぞれ、ＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部を含む、例示的な配列の配列番号７、８、および９のいずれかと比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。配列番号７、８、および９は、配列番号１０～１２を例示することによってそれぞれコードされる。本明細書および本出願全体を通して使用される場合、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
配列番号７：
Figure 2022548943000013
（３４０ ａ．ａ．ＣＤ６４ドメインベースの構築；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
配列番号８
Figure 2022548943000014
（３３６ ａ．ａ．ＣＤ６４エキソンベースの構築；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
配列番号９
Figure 2022548943000015
（３３５ ａ．ａ．ＣＤ６４エキソンベースの構築；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
配列番号１０
ｃｔｔｇｇａｇａｃａ ａｃａｔｇｔｇｇｔｔ ｃｔｔｇａｃａａｃｔ ｃｔｇｃｔｃｃｔｔｔ ｇｇｇｔｔｃｃａｇｔ ｔｇａｔｇｇｇｃａａ
ｇｔｇｇａｃａｃｃａ ｃａａａｇｇｃａｇｔ ｇａｔｃａｃｔｔｔｇ ｃａｇｃｃｔｃｃａｔ ｇｇｇｔｃａｇｃｇｔ ｇｔｔｃｃａａｇａｇ ｇａａａｃｃｇｔａａ ｃｃｔｔｇｃａｔｔｇ ｔｇａｇｇｔｇｃｔｃ ｃａｔｃｔｇｃｃｔｇ ｇｇａｇｃａｇｃｔｃ ｔａｃａｃａｇｔｇｇ ｔｔｔｃｔｃａａｔｇ ｇｃａｃａｇｃｃａｃ ｔｃａｇａｃｃｔｃｇ ａｃｃｃｃｃａｇｃｔ ａｃａｇａａｔｃａｃ ｃｔｃｔｇｃｃａｇｔ ｇｔｃａａｔｇａｃａ ｇｔｇｇｔｇａａｔａ ｃａｇｇｔｇｃｃａｇ ａｇａｇｇｔｃｔｃｔ ｃａｇｇｇｃｇａａｇ ｔｇａｃｃｃｃａｔａ ｃａｇｃｔｇｇａａａ ｔｃｃａｃａｇａｇｇ ｃｔｇｇｃｔａｃｔａ ｃｔｇｃａｇｇｔｃｔ ｃｃａｇｃａｇａｇｔ ｃｔｔｃａｃｇｇａａ ｇｇａｇａａｃｃｔｃ ｔｇｇｃｃｔｔｇａｇ ｇｔｇｔｃａｔｇｃｇ ｔｇｇａａｇｇａｔａ ａｇｃｔｇｇｔｇｔａ ｃａａｔｇｔｇｃｔｔ ｔａｃｔａｔｃｇａａ ａｔｇｇｃａａａｇｃ ｃｔｔｔａａｇｔｔｔ ｔｔｃｃａｃｔｇｇａ ａｔｔｃｔａａｃｃｔ ｃａｃｃａｔｔｃｔｇ ａａａａｃｃａａｃａ ｔａａｇｔｃａｃａａ ｔｇｇｃａｃｃｔａｃ ｃａｔｔｇｃｔｃａｇ ｇｃａｔｇｇｇａａａ ｇｃａｔｃｇｃｔａｃ ａｃａｔｃａｇｃａｇ ｇａａｔａｔｃｔｇｔ ｃａｃｔｇｔｇａａａ ｇａｇｃｔａｔｔｔｃ ｃａｇｃｔｃｃａｇｔ ｇｃｔｇａａｔｇｃａ ｔｃｔｇｔｇａｃａｔ ｃｃｃｃａｃｔｃｃｔ ｇｇａｇｇｇｇａａｔ ｃｔｇｇｔｃａｃｃｃ ｔｇａｇｃｔｇｔｇａ ａａｃａａａｇｔｔｇ ｃｔｃｔｔｇｃａｇａ ｇｇｃｃｔｇｇｔｔｔ ｇｃａｇｃｔｔｔａｃ ｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔ ａｃａｔｇｇｇｃａｇ ｃａａｇａｃｃｃｔｇ ｃｇａｇｇｃａｇｇａ ａｃａｃａｔｃｃｔｃ ｔｇａａｔａｃｃａａ ａｔａｃｔａａｃｔｇ ｃｔａｇａａｇａｇａ ａｇａｃｔｃｔｇｇｇ ｔｔａｔａｃｔｇｇｔ ｇｃｇａｇｇｃｔｇｃ ｃａｃａｇａｇｇａｔ ｇｇａａａｔｇｔｃｃ ｔｔａａｇｃｇｃａｇ ｃｃｃｔｇａｇｔｔｇ ｇａｇｃｔｔｃａａｇ ｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔ ｃｃａｇｔｔａｃｃａ ａｃｔｃｃｔｇｔｃｔ ｇｇｔｔｔｃａｔｔａ ｃｃａａｇｔｃｔｃｔ ｔｔｃｔｇｃｔｔｇｇ ｔｇａｔｇｇｔａｃｔ ｃｃｔｔｔｔｔｇｃａ ｇｔｇｇａｃａｃａｇ ｇａｃｔａｔａｔｔｔ ｃｔｃｔｇｔｇａａｇ ａｃａａａｃａｔｔｃ ｇａａｇｃｔｃａａｃ ａａｇａｇａｃｔｇｇ ａａｇｇａｃｃａｔａ ａａｔｔｔａａａｔｇ ｇａｇａａａｇｇａｃ ｃｃｔｃａａｇａｃａ ａａ
配列番号１１
ｃｔｔｇｇａｇａｃａ ａｃａｔｇｔｇｇｔｔ ｃｔｔｇａｃａａｃｔ ｃｔｇｃｔｃｃｔｔｔ ｇｇｇｔｔｃｃａｇｔ ｔｇａｔｇｇｇｃａａ
ｇｔｇｇａｃａｃｃａ ｃａａａｇｇｃａｇｔ ｇａｔｃａｃｔｔｔｇ ｃａｇｃｃｔｃｃａｔ ｇｇｇｔｃａｇｃｇｔ ｇｔｔｃｃａａｇａｇ
ｇａａａｃｃｇｔａａ ｃｃｔｔｇｃａｔｔｇ ｔｇａｇｇｔｇｃｔｃ ｃａｔｃｔｇｃｃｔｇ ｇｇａｇｃａｇｃｔｃ ｔａｃａｃａｇｔｇｇ
ｔｔｔｃｔｃａａｔｇ ｇｃａｃａｇｃｃａｃ ｔｃａｇａｃｃｔｃｇ ａｃｃｃｃｃａｇｃｔ ａｃａｇａａｔｃａｃ ｃｔｃｔｇｃｃａｇｔ
ｇｔｃａａｔｇａｃａ ｇｔｇｇｔｇａａｔａ ｃａｇｇｔｇｃｃａｇ ａｇａｇｇｔｃｔｃｔ ｃａｇｇｇｃｇａａｇ ｔｇａｃｃｃｃａｔａ
ｃａｇｃｔｇｇａａａ ｔｃｃａｃａｇａｇｇ ｃｔｇｇｃｔａｃｔａ ｃｔｇｃａｇｇｔｃｔ ｃｃａｇｃａｇａｇｔ ｃｔｔｃａｃｇｇａａ
ｇｇａｇａａｃｃｔｃ ｔｇｇｃｃｔｔｇａｇ ｇｔｇｔｃａｔｇｃｇ ｔｇｇａａｇｇａｔａ ａｇｃｔｇｇｔｇｔａ ｃａａｔｇｔｇｃｔｔ
ｔａｃｔａｔｃｇａａ ａｔｇｇｃａａａｇｃ ｃｔｔｔａａｇｔｔｔ ｔｔｃｃａｃｔｇｇａ ａｔｔｃｔａａｃｃｔ ｃａｃｃａｔｔｃｔｇ
ａａａａｃｃａａｃａ ｔａａｇｔｃａｃａａ ｔｇｇｃａｃｃｔａｃ ｃａｔｔｇｃｔｃａｇ ｇｃａｔｇｇｇａａａ ｇｃａｔｃｇｃｔａｃ
ａｃａｔｃａｇｃａｇ ｇａａｔａｔｃｔｇｔ ｃａｃｔｇｔｇａａａ ｇａｇｃｔａｔｔｔｃ ｃａｇｃｔｃｃａｇｔ ｇｃｔｇａａｔｇｃａ
ｔｃｔｇｔｇａｃａｔ ｃｃｃｃａｃｔｃｃｔ ｇｇａｇｇｇｇａａｔ ｃｔｇｇｔｃａｃｃｃ ｔｇａｇｃｔｇｔｇａ ａａｃａａａｇｔｔｇ
ｃｔｃｔｔｇｃａｇａ ｇｇｃｃｔｇｇｔｔｔ ｇｃａｇｃｔｔｔａｃ ｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔ ａｃａｔｇｇｇｃａｇ ｃａａｇａｃｃｃｔｇ
ｃｇａｇｇｃａｇｇａ ａｃａｃａｔｃｃｔｃ ｔｇａａｔａｃｃａａ ａｔａｃｔａａｃｔｇ ｃｔａｇａａｇａｇａ ａｇａｃｔｃｔｇｇｇ
ｔｔａｔａｃｔｇｇｔ ｇｃｇａｇｇｃｔｇｃ ｃａｃａｇａｇｇａｔ ｇｇａａａｔｇｔｃｃ ｔｔａａｇｃｇｃａｇ ｃｃｃｔｇａｇｔｔｇ
ｇａｇｃｔｔｃａａｇ ｔｇｃｔｔｇｇｔｔｔ ｇｔｔｃｔｔｔｃｃａ ｃｃｔｇｇｇｔａｃｃ ａａｇｔｃｔｃｔｔｔ ｃｔｇｃｔｔｇｇｔｇ
ａｔｇｇｔａｃｔｃｃ ｔｔｔｔｔｇｃａｇｔ ｇｇａｃａｃａｇｇａ ｃｔａｔａｔｔｔｃｔ ｃｔｇｔｇａａｇａｃ ａａａｃａｔｔｃｇａ
ａｇｃｔｃａａｃａａ ｇａｇａｃｔｇｇａａ ｇｇａｃｃａｔａａａ ｔｔｔａａａｔｇｇａ ｇａａａｇｇａｃｃｃ ｔｃａａｇａｃａａａ
配列番号１２
ａｔｇｔｇｇｔｔｃｔ ｔｇａｃａａｃｔｃｔ ｇｃｔｃｃｔｔｔｇｇ ｇｔｔｃｃａｇｔｔｇ ａｔｇｇｇｃａａｇｔ ｇｇａｃａｃｃａｃａ
ａａｇｇｃａｇｔｇａ ｔｃａｃｔｔｔｇｃａ ｇｃｃｔｃｃａｔｇｇ ｇｔｃａｇｃｇｔｇｔ ｔｃｃａａｇａｇｇａ ａａｃｃｇｔａａｃｃ
ｔｔｇｃａｃｔｇｔｇ ａｇｇｔｇｃｔｃｃａ ｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇ ａｇｃａｇｃｔｃｔａ ｃａｃａｇｔｇｇｔｔ ｔｃｔｃａａｔｇｇｃ
ａｃａｇｃｃａｃｔｃ ａｇａｃｃｔｃｇａｃ ｃｃｃｃａｇｃｔａｃ ａｇａａｔｃａｃｃｔ ｃｔｇｃｃａｇｔｇｔ ｃａａｔｇａｃａｇｔ
ｇｇｔｇａａｔａｃａ ｇｇｔｇｃｃａｇａｇ ａｇｇｔｃｔｃｔｃａ ｇｇｇｃｇａａｇｔｇ ａｃｃｃｃａｔａｃａ ｇｃｔｇｇａａａｔｃ
ｃａｃａｇａｇｇｃｔ ｇｇｃｔａｃｔａｃｔ ｇｃａｇｇｔｃｔｃｃ ａｇｃａｇａｇｔｃｔ ｔｃａｃｇｇａａｇｇ ａｇａａｃｃｔｃｔｇ
ｇｃｃｔｔｇａｇｇｔ ｇｔｃａｔｇｃｇｔｇ ｇａａｇｇａｔａａｇ ｃｔｇｇｔｇｔａｃａ ａｔｇｔｇｃｔｔｔａ ｃｔａｔｃｇａａａｔ
ｇｇｃａａａｇｃｃｔ ｔｔａａｇｔｔｔｔｔ ｃｃａｃｔｇｇａａｃ ｔｃｔａａｃｃｔｃａ ｃｃａｔｔｃｔｇａａ ａａｃｃａａｃａｔａ
ａｇｔｃａｃａａｔｇ ｇｃａｃｃｔａｃｃａ ｔｔｇｃｔｃａｇｇｃ ａｔｇｇｇａａａｇｃ ａｔｃｇｃｔａｃａｃ ａｔｃａｇｃａｇｇａ
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ｃｃｔｇｇｔｔｔｇｃ ａｇｃｔｔｔａｃｔｔ ｃｔｃｃｔｔｃｔａｃ ａｔｇｇｇｃａｇｃａ ａｇａｃｃｃｔｇｃｇ ａｇｇｃａｇｇａａｃ
ａｃａｔｃｃｔｃｔｇ ａａｔａｃｃａａａｔ ａｃｔａａｃｔｇｃｔ ａｇａａｇａｇａａｇ ａｃｔｃｔｇｇｇｔｔ ａｔａｃｔｇｇｔｇｃ
ｇａｇｇｃｔｇｃｃａ ｃａｇａｇｇａｔｇｇ ａａａｔｇｔｃｃｔｔ ａａｇｃｇｃａｇｃｃ ｃｔｇａｇｔｔｇｇａ ｇｃｔｔｃａａｇｔｇ
ｃｔｔｇｇｃｔｔｃｔ ｔｔｃｃａｃｃｔｇｇ ｇｔａｃｃａａｇｔｃ ｔｃｔｔｔｃｔｇｃｔ ｔｇｇｔｇａｔｇｇｔ ａｃｔｃｃｔｔｔｔｔ
ｇｃａｇｔｇｇａｃａ ｃａｇｇａｃｔａｔａ ｔｔｔｃｔｃｔｇｔｇ ａａｇａｃａａａｃａ ｔｔｃｇａａｇｃｔｃ ａａｃａａｇａｇａｃ
ｔｇｇａａｇｇａｃｃ ａｔａａａｔｔｔａａ ａｔｇｇａｇａａａｇ ｇａｃｃｃｔｃａａｇ ａｃａａａ
したがって、本明細書で企図および記載される他の編集の中でも、外因性ＣＤ１６またはそのバリアントを含むように遺伝子操作されたクローンｉＰＳＣが本明細書で提供され、遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入された同じ外因性ＣＤ１６を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。ｉＰＳＣまたはその派生細胞で発現する外因性ｈｎＣＤ１６は、ＡＤＣＣ抗体またはその断片だけでなく、該ｈｎＣＤ１６のＣＤ１６またはＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーへの結合にも高い親和性を示す。二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーについては、本出願で以下にさらに記載される（セクションＩ．７を参照されたい）。このように、本出願は、以下のセクションＶでさらに詳述する状態、疾患、または感染症の治療における治療用途に十分な量で、派生エフェクター細胞上で発現するｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインとの高親和性結合を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞またはその細胞集団を提供し、該ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の、またはＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６の天然のＣＤ１６膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインは、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）が非天然の膜貫通ドメイン、非天然の刺激ドメイン、および／または非天然のシグナル伝達ドメインを含むように産生されるように、さらに修飾または置き換えられる。本明細書で使用される場合、「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。ここの図では、ＣＤ１６またはそのバリアントに基づくＣＦｃＲは、ＣＤ１６に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然の刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメインを含む。外因性ＣＤ１６の一実施形態では、提供されるキメラ受容体は、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、両方ともＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つに由来する。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の１つの特定の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。
上述のＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、高親和性で抗体もしくはその断片のＦｃ領域に、または二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーのＦｃ領域に結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化およびサイトカイン分泌、ならびに抗体、または腫瘍抗原結合構成要素ならびにＦｃ領域を有する該二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーによって標的化される腫瘍細胞の殺滅を可能にする。理論に制限されることなく、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の非天然の膜貫通、刺激および／またはシグナル伝達ドメインを通じて、または外部ドメインへのエンゲージャーの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺滅能力に寄与し、エフェクター細胞の増殖および／または増殖の可能性を増加させる。抗体およびエンゲージャーは、抗原を発現する腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を近接させることができ、これも腫瘍細胞の殺滅の増強に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーの例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、およびＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーには、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、およびＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。
ＮＫ細胞の活性化後に細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６とは異なり、派生ＮＫにおけるＣＤ１６の様々な切断不可能なバージョンは、ＣＤ１６のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。派生ＮＫ系統細胞では、切断不可能なＣＤ１６は、細胞機能の改善を示すＴＮＦαおよびＣＤ１０７ａの発現を増加させる。切断不可能なＣＤ１６は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および二重特異性、三重特異性、または多重特異性エンゲージャーの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介溶解機構である。由来ＮＫ細胞における導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性の特徴により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＮＫ細胞へのＡＤＣＣ抗体のインビトロのローディングも可能となる。提供されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含み得るか、または配列番号７、８、もしくは９によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメインを含み得るか、または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。開示されるように、本出願はまた、以下でさらに詳述されるように、状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体を予めロードされた派生エフェクター細胞またはその細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は本明細書で提供されるＢＣＭＡ－ＣＡＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は、ＣＤ３８ノックアウトをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６、およびＣＤ３８ノックアウトを含む由来エフェクター細胞は、ＣＤ３８抗体を予めロードされている。いくつかの実施形態では、予めロードされたＣＤ３８抗体はダラツムマブである。
初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源）からの成熟Ｔ細胞は、ＣＤ１６を発現しない。発現された外因性ＣＤ１６を含むｉＰＳＣがＴ細胞の発生生物学を損なわず、外因性のＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得ＡＤＣＣ機構を介して機能を実行することができる機能的派生Ｔ系統細胞に分化することができることは予想外であった。派生Ｔ系統細胞におけるこの獲得ＡＤＣＣは、二重標的化のためのアプローチとして、および／またはＣＡＲ－Ｔ標的化された抗原の発現低下もしくは喪失、またはＣＡＲ（キメラ抗原受容体）による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再発する、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法でしばしば発生する抗原エスケープを救済するためのアプローチとしてさらに使用できる。該派生Ｔ系統細胞が外因性ＣＤ１６発現を介した獲得ＡＤＣＣを含む場合、および抗体がＣＡＲによって標的化されるものとは異なる腫瘍抗原を標的化する場合、抗体を使用して、ＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的化された腫瘍の再発生または再発を低減または防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減および／または防止するそのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ系統細胞または任意の人工エフェクター細胞にも同様に適用される。この抗原エスケープの低減および防止戦略で使用することができる様々なＣＡＲは、以下でさらに詳しく説明される。
したがって、本発明は、外因性ＣＤ１６を含む派生Ｔ系統細胞を提供する。一実施形態では、本明細書で得られる派生Ｔ系統細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび外因性ＣＤ１６を含む。さらに提供される実施形態では、本明細書で得された派生Ｔ系統細胞は、ｈｎＣＤ１６およびＢＣＭＡ－ＣＡＲの発現に加えて、ＣＤ３８ノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。いくつかの他の実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、配列番号７、８、または９によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメインを含むか、または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。説明されるように、そのような派生Ｔ系統細胞は、抗体の治療効果を増強するためにＡＤＣＣによって瞑想されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的化する獲得機構を有する。開示されるように、本出願はまた、以下でさらに詳述されるように、状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体で予めロードされた派生Ｔ系統細胞またはその細胞集団を提供する。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６およびＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する派生Ｔ系統細胞はまた、ＣＤ３８ヌルであり、その結果、細胞は、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する治療薬の存在下にあるときに排除されることを回避できる。一実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する該治療薬はＣＤ３８抗体である。別の実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する該治療薬は、ＣＤ３８結合領域、例えば抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶを含むＣＡＲである。
４．外因的に導入されたサイトカインおよび／またはサイトカインシグナル伝達
臨床的に関連するサイトカインの全身的な高用量投与を回避することにより、そのような実践による用量制限毒性のリスクが低減される一方で、サイトカインを介した細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球の自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１のうちの１つ以上の部分長または完全長のペプチド、それらの受容体のうちの１つ以上の部分長または完全長のペプチド、およびそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されて、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それにより、サイトカイン毒性のリスクを低減しながら、細胞の成長、増殖、拡大、および／またはエフェクター機能を維持または改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカインおよび／またはそのそれぞれの天然または修飾された受容体が、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。
図１は、例示的な例としてＩＬ１５を使用するいくつかの構築物設計を提示する。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に天然であり得るか、または任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで修飾されるか、またはそれに置き換えられてもよい。
設計１：ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、自己切断ペプチドを使用することによって共発現され、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくＩＬ１５のトランス提示を模倣する。
設計２：ＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合し、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を確実にする。
設計３：切断型細胞内ドメインを有するＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５膜結合を維持し、さらにシス提示および／またはその細胞内ドメインを介して正常なＩＬ１５Ｒによって媒介される任意の他の可能なシグナル伝達経路を排除する。ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインは、受容体がＩＬ１５応答細胞で発現し、応答細胞が拡大し、機能するために重要であると考えられている。そのような切断型構築物は、配列番号１７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号１８によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの一実施形態では、構築物は、配列番号１７の最後４つのアミノ酸「ＫＳＲＱ」を含まず、配列番号２１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。
配列番号１７
Figure 2022548943000016
（３７９ ａ．ａ．；シグナルおよびリンカーペプチドには下線が引かれている）
配列番号１８
ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＧＴＡＴＣ
ＣＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡ
ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＣＴ
ＡＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣ
ＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＧＧＴＣ
ＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＧＴＣＡ
ＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＴＴＣ
ＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡ
ＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＴ
ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＧＴＡＧＡＡＣＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣ
ＣＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣ
ＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＣ
ＡＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＴ
ＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣ
ＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧ
ＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴ
ＣＣＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧ
ＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡ
（１１４０ ｎ．ａ．）
配列番号２１
Figure 2022548943000017
（３７５ ａ．ａ．；シグナルおよびリンカーペプチドには下線が引かれている）
当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび／またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能的ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。
設計４：設計３の構築物は、エフェクター細胞の生存および拡大の促進に機能することが示され、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、そのような設計でＩＬ１５シグナル伝達複合体を備えたエフェクター細胞の自律的特色に悪影響を与えることなく省略できることを示したため、設計４は、設計３の別の実用的な代替案を提供する構築物であり、Ｓｕｓｈｉドメインが、一方の端でＩＬ１５と、もう一方の端で膜貫通ドメインと融合しており（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）、任意選択で、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーを有することを除いて、本質的にＩＬ１５Ｒα全体が除去される。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、任意の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計４などの構築物では、ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含むＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達は排除される。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む構成要素は、配列番号１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２０によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。
配列番号１９
Figure 2022548943000018
（２４２ ａ．ａ．；シグナルおよびリンカーペプチドには下線が引かれている）
配列番号２０
ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＧＧＴＡＴＣ
ＣＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡ
ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＣＴ
ＡＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣ
ＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＧＧＴＣ
ＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＧＴＣＡ
ＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＴＴＣ
ＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡ
ＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＴ
ＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＧＴＡＧＡＡＣＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣ
ＣＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣ
ＧＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＧＣ
ＡＴＣＡＧＡ
（７２６ ｎ．ａ．）
当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび／またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能的ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。
設計５：天然のまたは修飾されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５の膜結合およびトランス表現を維持する。
設計６：天然のまたは修飾された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達および膜結合トランス提示のためのリンカーを介して、Ｃ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖またはＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマまたはＩＬ２ＲＧとしても知られる。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、およびＩＬ２１受容体を含むがこれらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。
設計７：ＩＬ１５の非存在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を産生するのに有用である。
いくつかの実施形態では、サイトカインＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１、ならびに／またはそれらの受容体のうちの１つ以上は、図１の設計のうちの１つ以上を使用してｉＰＳＣに、およびｉＰＳＣ分化時のその派生細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２またはＩＬ１５細胞表面の発現およびシグナル伝達は、設計１～７のいずれか１つに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ７表面発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体（ＩＬ４受容体など）のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、それぞれのサイトカイン受容体に天然であり得るか、または任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで修飾されるか、またはそれに置き換えられてもよい。
ＣＡＲと外因性サイトカインおよび／またはサイトカイン受容体シグナル伝達との両方を含むｉＰＳＣおよびそれからの派生細胞において、ＣＡＲおよびＩＬは、別個の構築物で発現されても、ＣＡＲおよびＩＬの両方を含むバイシストロン性構築物において共発現されてもよく、ＩＬは、任意のサイトカイン、サイトカイン受容体、それらのバリアント、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかのさらなる実施形態では、図１の構築物設計のいずれかによって表される形態のＩＬ１５は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲとして図示される自己切断２Ａコード配列を介して、ＣＡＲ発現構築物の５’または３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬ１５およびＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。一実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計３のＩＬ１５を含む。別の実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計３のＩＬ１５を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計７のＩＬ１５を含む。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲが発現すると、自己切断２Ａペプチドにより、発現されたＣＡＲおよびＩＬ１５が解離し、解離したＩＬ１５が細胞表面に提示される。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲバイシストロン設計により、タイミングおよび量の両方で、および例えば、単一ＯＲＦの表現のための誘導性プロモーターを組み込むために選択され得る同じ制御機構の下で、協調されたＣＡＲおよびＩＬ１５の発現が可能になる。自己切断ペプチドは、***ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、およびブタテシオウイルス－１（ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）、Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などの***ウイルス、ならびにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）および脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルスのメンバーにおいて見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ、「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」とも呼ばれる。
ＩＬ１５について本明細書に開示されるバイシストロン性構造ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲの実施形態はまた、本明細書で提供される任意の他のサイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１の発現にも適用可能である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２細胞表面発現およびシグナル伝達は、設計１～７のいずれかに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体および／またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用して、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。
５．ＨＬＡ－Ｉ－およびＨＬＡ－ＩＩ－欠損
同種異系拒絶反応の問題を回避するために、同種異系レシピエントの組織適合性について、複数のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質を一致させる必要がある。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩタンパク質の両方の発現が排除または実質的に低下したｉＰＳＣ細胞株およびそれから分化したその派生細胞が本明細書で提供される。ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座の任意の領域（染色体６ｐ２１）の機能的欠失、またはベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、およびタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失または発現レベルの低下によって達成され得る。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、すべてのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または減少によって達成できる。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベーターであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を介して機能する。ＣＩＩＴＡヌル細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。例えば、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ発現の両方を欠くためのＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損の両方を有するｉＰＳＣ株およびその派生細胞が本明細書で提供され、得られた派生エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）一致の必要性を排除することによって同種異系細胞療法を可能にし、宿主（同種異系）Ｔ細胞による認識および殺滅を回避する。
しかしながら、一部の細胞型では、クラスＩの発現の欠如は、ＮＫ細胞による溶解をもたらす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを任意選択でノックインして、操作されたｉＰＳＣに由来するＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識および殺滅を回避することができる。一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインをさらに含む。代替的に、いくつかの実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５８ノックアウトおよびＣＤ５４ノックアウトの一方または両方をさらに含む。ＣＤ５８（またはＬＦＡ－３）およびＣＤ５４（またはＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む細胞の遊走を容易にする接着タンパク質である。本発明以前は、ｉＰＳＣにおけるＣＤ５８および／またはＣＤ５４の破壊が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む機能的免疫エフェクター細胞へと誘導されるｉＰＳＣ分化における多能性細胞および発生生物学に影響を与えるかどうか、およびどのように影響するかは不明であった。また、ＣＤ５８および／またはＣＤ５４ノックアウトがＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞の同種異系ＮＫ細胞殺滅に対する感受性を効果的および／または十分に低下させることができるかどうかも以前は不明であった。ここでは、ＣＤ５８ノックアウトはＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞の活性化を低減する効率が高い一方で、ＣＤ５８およびＣＤ５４の両方をダブルノックアウトすると、ＮＫ細胞の活性化の低減が最も増強されることが示された。いくつかの観察では、ＣＤ５８およびＣＤ５４ダブルノックアウトは、「自己喪失」効果を克服する上で、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりもさらに効果的である。
上記に提供されるように、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５８ヌルである。いくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５４ヌルである。さらにいくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５４ヌルおよびＣＤ５４ヌルである。さらに、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞のいくつかの実施形態では、該細胞は、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞のいくつかの実施形態では、該細胞は、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５８ヌルである。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞のいくつかの実施形態では、該細胞は、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５４ヌルである。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞のさらにいくつかの他の実施形態では、該細胞は、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、両方ともＣＤ５８ヌルおよびＣＤ５４ヌルである。
６．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ系統および派生細胞
上記に照らして、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはそれらの集団、および該ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生機能的エフェクター細胞を提供し、それぞれの細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはそれらの集団、および該ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞を提供し、それぞれの細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを少なくとも含む。いくつかの実施形態では、機能的派生細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態では、機能的派生細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および調節細胞などのエフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、天然源のＴ、ＮＫ、もしくはＮＫＴ細胞、または任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能的または構造的特徴を有するエフェクター細胞を含む。
ＣＤ３８－／－（本明細書では「ＣＤ３８ヌル」またはＣＤ３８ノックアウトとも称される）ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはその集団、およびＣＤ３８－／－ｉＰＳＣの分化から得られるＣＤ３８ノックアウトを含む誘導された機能的派生細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－／－ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはそれらの集団、および誘導された機能的派生細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３８遺伝子座にある。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＣＤ３８ノックアウトを含む機能的派生細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＣＤ３８ノックアウトを含む機能的派生細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージである。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および調節細胞などのエフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、機能的派生造血細胞は、天然源からのＴ、ＮＫ、もしくはＮＫＴ細胞、または任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、強化された機能的または構造的特徴を有するエフェクター細胞である。
さらに、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、および高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣが本明細書でさらに提供され、ｉＰＳＣは、指示された分化により機能的造血細胞を産生することができる。ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびｈｎＣＤ１６の両方を含む細胞は、ＣＡＲ結合およびＣＤ１６を介したＡＤＣＣによる二重標的化に好適であり、腫瘍標的化の精度を高め、腫瘍の殺滅を促進し、腫瘍抗原エスケープの影響を最小限に抑える。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞はまた、ＣＤ３８ヌルであり、その結果、ＣＤ３８抗体を使用してｈｎＣＤ１６媒介増強ＡＤＣＣを誘導する場合、ＣＤ３８ノックアウト、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ、およびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除、すなわち、ＣＤ３８発現エフェクター細胞の減少または枯渇を引き起こすことなく、それによってｉＰＳＣとそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させ、ＣＤ３８発現（腫瘍）細胞を標的化することができる。ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌルを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞、および外因性ＣＤ１６は、ＣＤ３８抗体またはＣＤ３８ ＣＡＲの存在下で低減した細胞枯渇を経験し、腫瘍殺滅のための複数の機序を提供する。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、およびＢＣＭＡ以外の標的特異性を有する第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣが本明細書で提供され、ｉＰＳＣは、２つの異なる腫瘍抗原を標的化する２つのＣＡＲを有する機能的派生エフェクター細胞を生成するために分化誘導することができる。一実施形態では、ｉＰＳＣに含まれる第２のＣＡＲおよびＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むその誘導体エフェクター細胞は、腫瘍細胞表面タンパク質ＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１を標的化する。一実施形態では、ｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は、ＣＤ３８を標的化する第２のＣＡＲを有し、該細胞もまた、ＣＤ３８ヌルである。そのため、ＣＤ３８－ＣＡＲは、ＣＤ３８を介したフラトリサイドにより、ｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞を排除することができない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞に含まれるＣＡＲは、ＣＤ３８を標的化しない。
さらに、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ならびに、細胞の生存率、持続性、および／または増殖に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にする少なくとも１つの外因性サイトカインおよび／またはサイトカイン受容体（ＩＬ）もしくはそのバリアントを含むタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを含み、ｉＰＳＣ株は分化誘導して、生存率、持続性、増殖、およびエフェクター細胞機能が改善された機能的派生造血細胞を産生することができる。外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のいずれか１つまたは２つまたはそれ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための、サイトカインの導入された部分的または完全なペプチドおよび／またはそのそれぞれの受容体は、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＰＳＣまたはその派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ７シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＰＳＣまたはその派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１０シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＰＳＣまたはその派生細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１５シグナル伝達を可能にする。該ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１の構築物３によるものである。該ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１の構築物４によるものである。上述の実施形態の該ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、インビトロまたはインビボで追加的に供給される可溶性サイトカインに接触することなく、細胞増殖、増殖、増殖、および／またはエフェクター機能を自律的に維持または改善することができる。ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞のいくつかの実施形態では、該細胞はＣＤ３８ヌルであり、ＣＤ３８抗体とともに使用して、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それにより相乗的にｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存率を増加させることができる。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、Ｂ２Ｍノックアウト、およびＣＩＩＴＡノックアウト、ならびに任意選択でＨＬＡ－Ｇ過剰発現、ＣＤ５８ノックアウト、およびＣＤ５４ノックアウトのうちの１つを含むｉＰＳＣも提供され、ｉＰＳＣは誘導分化によって、機能的派生造血細胞を産生することができる。該ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩの両方が欠損している。さらなる実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞もまたＣＤ３８ヌルであり、エフェクター細胞の排除を引き起こさずにＡＤＣＣを誘導するためにＣＤ３８抗体とともに使用することができ、それによりｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存が増加する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、増加したインビボでの持続性および／または生存率を有する。
上述の観点から、本明細書で提供されるものには、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、外因性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含むｉＰＳＣが含まれ、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが任意選択で導入され、ｉＰＳＣは、分化誘導によって、機能的派生造血細胞を産生することができる。ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、外因性ＣＤ１６、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、および外因性サイトカイン／受容体タンパク質複合体のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含む機能的ｉＰＳＣ派生造血細胞も本出願に含まれ、ここでは、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、派生造血細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、派生造血細胞は、天然源のＮＫ、Ｔ、もしくはＮＫＴ細胞、または任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能的または構造的特徴を有するエフェクター細胞である。
本明細書で提供される別の態様は、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの切断型融合タンパク質を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞を含み、融合タンパク質は細胞内ドメインを含まない。図１に「ＩＬ１５Ｒα（ΔＩＣＤ）融合」および「ＩＬ５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ」として示されるように、これらの実施形態は、本出願全体を通してさらに集合的にＩＬ１５Δと略され、表１に示される「ＩＬ」の実施形態のうちの１つである。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１７、１９、または２１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞のいくつかの実施形態では、該細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、外因性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ以上をさらに含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４のノックアウトのうちの１つが任意選択で導入され、ｉＰＳＣは、分化誘導によって、機能的派生造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、派生造血細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むがこれらに限定されない。いくつかの他の実施形態では、派生造血細胞は、天然源のＮＫ、Ｔ、もしくはＮＫＴ細胞、または任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能的または構造的特徴を有するエフェクター細胞である。
したがって、本出願は、表１の以下の遺伝子型のいずれか１つを含む、ｉＰＳＣおよびその機能的派生造血細胞を提供する。本出願の表１に提供される「ＣＡＲ（第２）」は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲとは異なる標的特異性を有するＣＡＲを表し、非限定な例としては、ＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的化するＣＡＲが挙げられる。表１に提供されるように、「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のうちの１つを表す。さらに、「ＩＬ」はまた、ＩＬ１５Δの実施形態も包含し、これは、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの切断型融合タンパク質として上に詳述されているが、細胞内ドメインを含まない。さらに、ｉＰＳＣおよびその機能的派生造血細胞がＣＡＲ（ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、または第２のＣＡＲ）とＩＬとの両方を含む遺伝子型を有する場合、該細胞の一実施形態では、ＣＡＲおよびＩＬは２Ａ配列を含むバイシストロ性発現カセットに含まれる。比較として、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲおよびＩＬは、ｉＰＳＣおよびその機能的派生造血細胞に含まれる別個の発現カセットにある。特定の一実施形態では、ＣＡＲとＩＬとの両方を発現するｉＰＳＣおよびその機能的派生エフェクター細胞に含まれるのは、図１の構築物３または４におけるＩＬ１５であり、ＩＬ１５構築物は、ＣＡＲとともに、またはそれと別個に発現カセットに含まれる。
Figure 2022548943000019
Figure 2022548943000020
Figure 2022548943000021
Figure 2022548943000022
７．追加の修飾
いくつかの実施形態では、表１の遺伝子型のいずれか１つを含むｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低下をさらに含み得るか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含み得る。
二重特異性または多重特異性エンゲージャーは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、少なくとも１つのｓｃＦｖがエフェクター細胞表面分子に結合し、少なくとも別の１つが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。二重特異性もしくは多重特異性エンゲージャー認識、またはカップリングに使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子または表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、および本明細書に開示されるキメラＦｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、セクションＩ．２に記載される、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖおよび任意選択でＳ１９７Ｐを含む）またはＣＤ６４細胞外ドメイン、ならびに天然または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖおよび任意選択でＳ１９７Ｐを含む。二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識の例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ１９である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０またはＣＤ６４－ＣＤ３０である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡまたはＣＤ６４－ＢＣＭＡである。また別の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ３－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体はさらに、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカーとしての修飾されたＩＬ１５（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、または三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる）を含む。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭまたはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３またはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）である。
いくつかの実施形態では、二重特異性または多重特異性のエンゲージャーのための表面トリガー受容体は、時には細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、すなわち、表１に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣをさらに操作し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含む任意の他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化誘導を行い、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
８．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的化する抗体または抗体断片を含む追加の治療薬を、組み合わせ療法でこれらのエフェクター細胞とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬として、組み合わせ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、およびそれらのヒト化またはＦｃ修飾されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列記される遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列記される遺伝子型を含むＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表１に列記される遺伝子型を含むＴ細胞を含む。
液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞を含む。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせの他のいくつかの実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞とを含む。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌルを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞と、ＣＤ３８抗体とを含む。一実施形態では、組み合わせは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、およびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞と、ＣＤ３８抗体であるダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２のうちの１つとを含む。一実施形態では、組み合わせは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、およびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞と、ダラツムマブとを含む。いくつかのさらなる実施形態では、ダラツムマブとの組み合わせに含まれるｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５、ならびにＣＤ３８またはＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的化するＣＡＲを含み、ここで、ＩＬ１５はＣＡＲと共発現または別々に発現され、ＩＬ１５は、図１の構築物１～７に提示される形態のうちのいずれか１つである。いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ１５は、ＣＡＲと同時または別個に発現される場合、構築物３、４、または７の形態である。
９．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方調節することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。腫瘍がある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要機構として利用していることが今では明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させ、それによって阻害チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１またはＣＴＬＡ４を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発生は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、ＣＩとの併用療法で提供されるようにゲノム操作された機能的派生細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、派生細胞はＮＫ細胞である。併用療法の別の実施形態では、派生細胞はＴ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を呈することに加えて、本明細書で提供される派生ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でＴ細胞の活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、該ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤の併用療法のための由来ＮＫ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、および外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８もしくはＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生ＮＫ細胞は、表１に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生ＮＫ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。
別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の併用療法のための由来Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、および外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含み、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８もしくはＣＤ５４のノックアウトのうちの１つが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生Ｔ細胞は、表１に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生Ｔ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。
上述の該派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ならびに任意選択で、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、および外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、ここで、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４のノックアウトのうちの少なくとも１つが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、上述の該ｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーとの結合のための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。
本明細書で提供される、派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、および３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、または３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、アベルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（ＫＩＲ抗体）、ＩＰＨ４３（ＭＩＣＡ抗体）、ＩＰＨ３３（ＴＬＲ３抗体）、リリムマブ（ＫＩＲ抗体）、モナリズマブ（ＮＫＧ２Ａ抗体）、ニボルマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、ペンブロリズマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、およびそれらの誘導体、機能的同等物、またはバイオシミラーのうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニストｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、およびｍｉＲ－２９ｃが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞との併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的化する少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、派生細胞は表１に列記される遺伝子型を有する。提供される派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的化されるように、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイント阻害剤および表１に列記された遺伝子型を有する派生細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態では、該チェックポイント阻害剤は、抗体、またはヒト化もしくはＦｃ修飾バリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーであり、該チェックポイント阻害剤は、該抗体、またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、派生細胞により産生される。いくつかの実施形態では、チェックポイントを阻害する抗体またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列は、別個の構築物、またはＣＡＲおよび抗体もしくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物のいずれかにおいて、ＣＡＲと共発現される。いくつかのさらなる実施形態では、抗体またはその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩまたはＣＩ－２Ａ－ＣＡＲとして図示される自己切断２Ａコード配列を介して、ＣＡＲ発現構築物の５’または３’末端のいずれかに連結され得る。そのため、チェックポイント阻害剤およびＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。チェックポイント阻害剤が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することが可能な派生エフェクター細胞によってペイロードとして送達、発現、分泌される場合、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を相殺し、ＣＡＲまたは活性化受容体などのモダリティを活性化することによってエフェクター細胞の活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子：ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表１に列記される遺伝子型を有する派生細胞においてＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはＦｃ修飾されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。
本明細書で提供される派生細胞およびチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、該抗体は、派生細胞によって、または派生細胞内で産生されず、表１に列記されている遺伝子型を持つ派生細胞の投与の前、それと同時、またはその後にさらに投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法における１つ、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時または連続的である。表１に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む併用治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはＦｃ修飾されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーのうちの１つ以上である。表１に列記される遺伝子型を有する由来エフェクター細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表１に列記される遺伝子型を有する由来エフェクター細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、あるいはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表１に列記される遺伝子型を有する由来エフェクター細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、あるいはそのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。
ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座での標的化されたゲノム編集の方法
本明細書で交換可能に使用されるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、またはゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子編集は、標的化された細胞のゲノムにおいてＤＮＡが挿入される、欠失される、および／または置き換えられる遺伝子操作の一種である。標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）（「標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）」または「標的化された遺伝子編集」と交換可能）により、ゲノム内の予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換が可能となる。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失されると、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子が、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化された編集を使用して、内因性遺伝子の発現を正確に妨害することもできる。「標的化された組み込み」という用語は、本明細書で同様に使用され、挿入部位での内因性配列の欠失の有無にかかわらず、１つ以上の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。比較すると、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受け、それらの発現は信頼性がなく、予測できない。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、細胞の挙動を改変するか、または細胞の形質転換を支持する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）などの予め選択された遺伝子座に外因性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、および信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。代替的に、外因性ＤＮＡは、遺伝子座でのノックダウンおよびノックアウトを含む遺伝子発現の破壊が意図されている、予め選択された遺伝子座に挿入され得る。
標的化された編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、またはヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって達成され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化された編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。
代替的に、特定のレアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を介して、より高い頻度で標的化された編集を達成することができる。そのようなヌクレアーゼに依存する標的化された編集は、ＤＳＢに応答して起こる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構を利用する。外因性遺伝子材料を含むドナーベクターがないと、ＮＨＥＪは、多くの場合、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（イン／デル）をもたらす。比較すると、一対の相同性アームに隣接する外因性遺伝子材料を含むドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝子材料は、相同組換えによる相同性指向修復（ＨＤＲ）中にゲノムに導入され、「標的化された組み込み」をもたらし得る。場合によっては、標的化された組み込み部位が選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図されているため、標的化された組み込みが遺伝子発現を妨害し、１回の編集ステップでノックインおよびノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）を同時にもたらすことができる。
目的の遺伝子座（ＧＯＩ）の選択された位置に１つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることは、例としてＣＤ３８遺伝子座を使用する図２Ａ～Ｄに例示される構築物設計によって達成され得る。同時ノックインおよびノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）に好適な他遺伝子座としては、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれのＣＤ３８標的化相同性アームにより、本明細書で提供される構築物により、導入遺伝子（複数可）は、構築物に含まれるＣＤ３８内因性プロモーターまたは外因性プロモーターの下で発現することができる（図２のＡ対Ｂ、およびＣ対Ｄを比較されたい）。ＣＤ３８遺伝子座内の選択的挿入／ノックアウト位置は、構築物に含まれる隣接する左および右の相同性アーム（ＬＨＡ／ＣＤ３８およびＲＨＡ／ＣＤ３８）の配列と適合する。ＬＨＡ／ＣＤ３８およびＲＨＡ／ＣＤ３８は、ＣＤ３８遺伝子座内の事前に選択された標的化部位に応じて、様々な長さおよび配列を有し得る。いくつかの実施形態では、事前に選択された標的化部位は、ＣＤ３８のエキソン内にある。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２ＡリンカーまたはＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶに由来する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子および／または外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。外因性プロモーターは、ＣＡＧ、またはＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターであり得る。
特定のおよび標的化されたＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の回文配列リピート）系が含まれるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）系も、標的化された組み込みのための有望なツールである。
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインであり、その構造は亜鉛イオンの配位により安定する。ジンクフィンガーの例には、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、およびＣ４ジンクフィンガーが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計／組成が主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計の情報と結合データを格納するデータベースの情報を処理するための置換規則およびコンピューター化されたアルゴリズムの適用から生じる、自然界では存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、また、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、自然界では見られないドメインであり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号および米国特許第７，９７２，８５４号により詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体から分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、ＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、それらのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、リピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択リピート位置で多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されている。当該技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへの融合ポリペプチドである。
主題の方法で使用が見出される標的化されたヌクレアーゼの別の例は、標的化されたＳｐｏ１１ヌクレアーゼであり、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。例えば、米国特許出願第６１／５５５，８５７号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明に好適な標的化されたヌクレアーゼの追加の例には、個々にまたは組み合わせて使用されるかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、およびＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。
標的化されたヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼおよび組換えヌクレアーゼ；ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼなどが含まれる。
例としてＣａｓ９を使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な構成要素：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。共発現されると、２つの構成要素は複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭ近くのシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を誘導して選択された配列を標的化することができる。これらの２つの構成要素は、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳類細胞に送達され得る。
ＤＩＣＥを介した挿入では、一対のリコンビナーゼ、例えば、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位に厳密に制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位でゲノムに導入する必要がある。例えば、米国出願公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームをさらに含み、標的化された組み込み方法は、細胞に構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットを導入することと、所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９を介した挿入を可能にすることとを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含む。
標的化された組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞または生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるか、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質または非コードＲＮＡの所望のレベルを得るのに十分な導入遺伝子の発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換させやすくしてはならず、また細胞機能を改変してはならない。組み込み部位が可能性のあるセーフハーバー遺伝子座となるために、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断される調節要素もしくは遺伝子の破壊がない；遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域であるか、または反対方向に転写された２つの遺伝子間の収束位置である；ベクターにコードされた転写活性化因子と隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子およびマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離にわたる相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つ；かつユビキタスな転写活性を示す広範な空間的および時間的発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンに反映されるように、明らかにユビキタスな転写活性を有する。この後者の特徴は、分化中にクロマチンリモデリングが、典型的にはいくつかの遺伝子座のサイレンシングおよび他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす幹細胞において特に重要である。外因性挿入に好適な領域内で、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素および保存された配列を欠き、相同アーム増幅のためのプライマーを容易に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、または具体的には標的化された組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、およびマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログもまた、本明細書に開示される組成物および標的化された組み込み方法を使用する挿入に好適な部位であり得る。さらに、コラーゲンおよびＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化された組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択された各部位の検証は、特に特定の組み込み事象のための幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列および配置、ならびに構築物の設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたイン／デルの場合、編集部位は、その発現および／または機能が妨害されることを意図している内因性遺伝子に含まれることが多い。一実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節および調整に関連している。いくつかの他の実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の調節および調整、または幹細胞および／もしくは前駆細胞、ならびにその由来細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および／または生存を抑制するタンパク質に関連する。
したがって、本発明の一態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１などの連続的または一時的な遺伝子発現に安全であり、十分に調節されていることが既知のまたは証明されている予め選択された遺伝子座、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座における標的化された組み込み方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的化された組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが所望される遺伝子座のうちの１つにあり、そのような遺伝子座としては、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームおよび１つ以上の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットおよび所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９を介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を、細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。
さらに、本明細書で提供されるように、セーフハーバーにおける標的化された組み込みのための上記の方法は、目的の任意のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、ならびに幹細胞および／または前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、１つ以上のマーカー遺伝子をさらに含む。一実施形態では、本発明の構築物における外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死に好適な自殺遺伝子系には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくは７）およびＡＰ１９０３；チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）および５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０でのＴリンパ球の遺伝子修飾により、ｍＡｂリツキシマブの投与によりそれらを排除することができる。さらに、セツキシマブによって認識される修飾されたＥＧＦＲ含有エピトープは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、修飾されたＥＧＦＲ、およびＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化された組み込み方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化された組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは、誘導性または構成的であってもよく、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的であってもよい。本発明の方法に好適な構築的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、およびユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。
本明細書の方法によって組み込まれる外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位で、宿主ゲノムの内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座での１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＨ１１遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのコラーゲン遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＨＴＲＰ遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置への正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化された組み込み方法のための構築物に含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、部分間の物理的分離を広げ、酵素機構へのアクセスを最大にするために、同じプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列のリンカーペプチドは、部分（外因性ポリヌクレオチド、および／またはそれからコードされるタンパク質またはペプチド）間の物理的分離を、関連する機能に応じてより柔軟にまたはより堅固にするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、別個の部分を生じさせるために、プロテアーゼによって切断可能であるか、または化学的に切断可能であり得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、およびトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって自然に産生されるか、または外因的に導入されるものである。代替的に、リンカーにおける切断部位は、選択された化学物質、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または低ｐＨへの曝露時に切断が可能な部位であり得る。任意選択のリンカー配列は、切断部位を提供する以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接する部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間の立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であり得る。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾を提供し得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体構造に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主に構成され得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０または９０パーセント以上は、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシングドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。適切なリンカー配列は、経験的に容易に特定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズおよび配列もまた、従来のコンピューターモデリング技法によって決定することができる。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化された組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体が知られている細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡｌ－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達および／または発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作のために使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、または置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、はるかに高い割合で相同性指向遺伝子標的化を媒介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６またはＡＡＶ２ベクターは、ｉＰＳＣのゲノムの標的部位に挿入、欠失または置換を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表１に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを得て維持する方法
本発明は、１つ以上の所望の部位で１つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得および維持する方法を提供し、標的化された編集は、拡大されたゲノム操作されたｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷および機能的であり続ける。標的化された編集は、ｉＰＳＣおよびそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、および／または置換、すなわち、選択した部位での標標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを導入する。患者由来の末梢血由来の一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、ここで提供されるようにｉＰＳＣを編集および分化させることによりゲノム操作された派生細胞を得ることの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない：設計されたエフェクター細胞の無制限のソース；特に複数の設計されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない；取得されたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っている；主に本明細書で提供される操作されたｉＰＳＣでのクローン選択が可能であることに起因して、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、および対立遺伝子変異、無作為変異、発現多様性がないという点で均一である。
特定の実施形態では、１つ以上の選択された部位での１つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（ＦＭＭ）として表２に示される細胞培養培地において、単一細胞として長期間維持、継代、および拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化された編集および機能修飾を保持する。培地の組成は、表２に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭで培養されたｉＰＳＣは、未分化で、基底またはナイーブなプロファイル、培養物を洗浄または選択する必要なくゲノム安定性を維持し続けることが示されており、３つすべての体細胞系統、胚様体または単層（胚様体の形成なし）を介したインビトロ分化、および奇形腫形成によるインビボ分化を容易に生じさせる。例えば、米国特許出願第６１／９４７，９７９号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022548943000023
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、または本質的に含まない培地中で維持、継代、拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化された編集を保持する。
本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化された編集を通じて、または最初に標的化された編集によりゲノム操作された非多能性細胞を生成し、次に選択／単離されたゲノム操作された非多能性細胞を再プログラミングして、非多能性細胞と同じ標的化された編集を含むｉＰＳＣを得ることを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、標的化された組み込みおよび／または標的化されたイン／デルを細胞に導入することによって同時に再プログラミングを受けているゲノム操作された非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞は再プログラミングに十分な条件下にあり、再プログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作および再プログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および任意選択で小分子と接触させることにより再プログラミングを開始する前に、または本質的に同時に、標的化された組み込みおよび／または標的化されたイン／デルを非多能性細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作および再プログラミングするために、標的化された組み込みおよび／またはイン／デルはまた、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることによって再プログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入されてもよく、再プログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１、およびＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つの再プログラミング因子、ならびに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表２）と接触させることによって開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表２）を使用してさらに維持および拡大される。
ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを導入することによりｉＰＳＣをゲノム操作し、表１に列記される少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化された編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作された非多能性細胞を得ることと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を、１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、および任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）１つ以上の標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを、ゲノム操作のためのリプログラミング非多能性細胞に導入することと、（ｃ）選択された部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含む、クローンゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。
再プログラミング因子は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１８８０１およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７１３６に開示される（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。１つ以上の再プログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。再プログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得るため、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つの再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、様々な再プログラミング因子の化学量論考慮に入れたプラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、米国特許出願第６２／５７１，１０５号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同じまたは異なる選択された部位での標的化された組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、または標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、または特定の分化した細胞型において発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣから分化した細胞において発現される。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧによって駆動されるカパーゼ－９によって駆動される。異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含むこれらの構築物は、同時にまたは連続してのいずれかで非多能性細胞に移入することができる。複数の構築物の標的化された組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上の再プログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時に再プログラミングを開始でき、それにより、同じ細胞のプールにおいて複数の標的化された組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることができる。このように、この堅牢な方法により、同時再プログラミングおよび操作戦略が、１つ以上の選択された標的部位に組み込まれた複数のモダリティを有するクローンゲノム操作されたｈｉＰＳＣを導くことを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表１に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を得る方法
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのインビボでの分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、所望の部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含む無傷で機能的な標的化された編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または幹細胞および／または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、免疫応答の調節および媒介に関連する内因性遺伝子の１つ以上のイン／デルをさらに含む。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、主要組織適合遺伝子複合体に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ベータ－２－ミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化された編集をさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子修飾を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを使用して、インビトロで造血細胞系統または任意の他の特定の細胞型を導き、由来非多能性細胞は、選択された部位で標的化された編集を含む機能的遺伝子修飾を保持する。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞には、二次造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、二次ＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化された編集を含む機能的遺伝子修飾を保持する。
ｉＰＳＣ由来の造血細胞系統を得るための適用される分化方法および組成物には、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４１２２号に示されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されるように、造血細胞系統を生成するための方法および組成物は、無血清、フィーダーフリー、および／または間質を含まない条件下で、またスケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｈｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する二次造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞にコミットされた前駆細胞、ならびに多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多分化能幹細胞または前駆細胞から、最終分化細胞、および介在するすべての造血細胞系統にまで及ぶ。
単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化および拡大する方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、および任意選択でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく得られ、拡大される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＷＮＴ経路活性化因子と接触させて、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、二次造血性内皮（ＨＥ）の可能性を有する拡大された中胚葉細胞を得る。その後のｂＦＧＦ、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤および／またはＷＮＴ経路活性化因子との接触により、二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞は、二次ＨＥ細胞に分化し、これも分化中に拡大される。
造血系統の細胞を得るために本明細書で提供される方法は、ＥＢ形成が中程度から最小の細胞拡大をもたらし、均質な拡大を必要とする多くの用途に重要である単層培養、および集団内の細胞の均質な分化を可能にせず、困難で、効率が低いため、ＥＢを介した多能性幹細胞分化よりも優れている。
提供される単層分化プラットフォームは、造血幹細胞およびＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞などの分化した子孫の派生をもたらす、二次造血内皮への分化を容易にする。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な拡大を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を使用する単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ調節、ならびにインビボ長期造血自己再生、再構成、および生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されるように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、二次造血内皮、造血多分化能前駆細胞、造血幹細胞および前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ならびに好中球が含まれるが、これらに限定されない。
多能性幹細胞の二次造血系統の細胞への分化を指向する方法であって、方法は、（ｉ）多能性幹細胞をＢＭＰ活性化因子および任意選択でｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、（ｉｉ）中胚葉細胞をＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含む組成物（組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、中胚葉細胞から二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、（ｉｉｉ）二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤；ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物（組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、二次造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞から二次造血内皮の分化および拡大を開始することと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物（組成物はＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、多能性幹細胞を播種および拡大することをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、またはナイーブｉＰＳＣ、または１つ以上の遺伝子インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝子インプリントは、それから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向する方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成を欠き、単層培養形態である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られた二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン；ならびに任意選択でＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＴ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆細胞のＴ細胞前駆細胞またはＴ細胞への分化を開始することとをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。本方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。
多能性幹細胞を造血系統の細胞に分化誘導するための上記の方法のさらにいくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択で、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む組成物（培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない）と接触させて、プレＮＫ細胞前駆細胞のＮＫ細胞前駆細胞またはＮＫ細胞への分化を開始することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、任意選択で、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋、およびＣＤ１６＋によってさらに定義される。
したがって、上記の分化方法を使用して、以下のｉＰＳＣ由来の造血細胞のうちの１つ以上の集団を得ることができる：（ｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＣＤ３４＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用した二次造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用した二次ＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用した多分化能前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２およびｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＴ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用したＴ細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＮＫ細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、およびＥＰＯからなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない；
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択で、ＢＭＰ活性化因子を含む；
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；ならびに
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む１つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または幹細胞および／もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、およびＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答の調節および媒介に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる１つ以上のイン／デルをさらに含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にイン／デルをさらに含み、Ｂ２Ｍはノックアウトされている。
加えて、第１の運命のゲノム操作された造血細胞から第２の運命のゲノム操作された造血細胞を得るための適用される脱分化方法および組成物は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１／１５９７２６号に示されるものを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。その中で提供される方法および組成物は、再プログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的に再プログラミングし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供することを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム修飾されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表１に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。
Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化された外因性機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療用途
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法および組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来免疫細胞に保持可能な１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＴまたはＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＮＫまたはＮＫ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫調節細胞または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボでさらに調節される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞の数または比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数または比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、適応ＮＫ細胞の数または比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団または亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＭＤＳＣの単離された集団または亜集団は、自家性である。
いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含むが、但し、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、該ｉＰＳＣに由来する分化した造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝子インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣに再プログラミングする間もしくはその後に多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失、もしくは置換により得られる１つ以上の遺伝子修飾されたモダリティ、または（ｉｉ）ドナー特異的、疾患特異的、もしくは治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞が供給源特異的免疫細胞から再プログラミングされ、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれる供給源の治療属性を保持する。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾モダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節および調整、ならびに／または生存率を促進するタンパク質の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾されたｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、表１に列記された遺伝子型を含む。他のいくつかの実施形態では、表１に列記された遺伝子型を含む遺伝子修飾ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ以上の欠失または発現低下、ならびに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその機能的断片もしくはバリアント、あるいは二重特異性もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーとのカップリングのための表面トリガー受容体の導入されたまたは増加した発現を含む追加の遺伝子修飾モダリティをさらに含む。
またいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも２つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む：（ｉ）１つ以上の抗原標的化受容体の発現、（ｉｉ）修飾されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞の動員および免疫調節、（ｉｖ）腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、および（ｖ）改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、または抗原エスケープ救済。
いくつかの実施形態では、表１に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣ派生造血細胞、および該細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、またはＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカインおよび／もしくはその受容体、またはその任意の修飾されたタンパク質を発現し、少なくともＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの他の実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液性腫瘍を標的化する。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的化する。いくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。
養子細胞療法に好適な対象に本発明の免疫細胞を導入することにより、様々な疾患を回復させることができる。いくつかの実施形態では、提供されるｉＰＳＣ派生造血細胞は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによって、上記の治療組成物の治療用途を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性および慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、***、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、および食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス関連障害）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を使用する治療は、症状に応じて、または再発生防止のために実施され得る。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される場合「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、または疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療薬または組成物は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定させるまたは低減する進行中の疾患の治療もまた、特に関心がある。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法によって少なくとも１つの関連する症状を抑制し、回復させ、かつ／または改善することができる疾患、状態、および／または傷害を有する。ある特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害またはがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害もしくはがんを有するかまたはそのリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するかまたはそれを発達させるリスクがある対象、ウイルス感染またはウイルス感染に関連する疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価する場合、応答は、臨床的有益率、死亡までの生存、病理学的完全応答、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、およびＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準のうちの少なくとも１つを含む基準によって測定され得る。
開示される由来造血系統細胞を含む治療組成物は、他の治療の前、治療中、および／または治療後に対象に投与され得る。したがって、組み合わせ療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、および／または使用後に、ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与または調製を伴い得る。上記に提供されるように、１つ以上の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体もしくはその機能的バリアントもしくは断片、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から、時間、日、さらには週単位の時間で分離することができる。加えて、または代替的に、投与は、限定されないが、抗腫瘍剤、外科手術などの非薬物療法などの他の生物学的に活性な薬剤またはモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞と、抗体または抗体断片である追加の治療薬とを含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ以上の抗原を標的化する複数の抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞に対する追加の治療薬として、組み合わせ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（例えば、セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（例えば、ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（例えば、アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、およびそれらのヒト化またはＦｃ修飾されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方調節することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供される、ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、および３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも１つの阻害剤をさらに含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的化されるように、２つ、３つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生エフェクター細胞は、本明細書に提供されるように機能的に増強される。いくつかの実施形態では、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与とともに、投与前、または投与後に併用療法で投与され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、または一度に１つ（連続的に）投与される。
いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、または２つ、または３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。
派生エフェクター細胞と、１つ以上のチェック阻害剤とを含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉腫、パジェット細網症、セザリー症候群、肉芽腫性弛緩性皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍、扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん（ＬＬＣ）、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん（ＳＣＮＣ）、肝臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、および鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない液性および固形がんの治療に適用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される派生エフェクター細胞以外に、治療用途の組み合わせは、化学療法剤または放射性部分を含む１つ以上の追加の治療薬を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺滅するか、急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、または幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の成長を防止または低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性または細胞傷害性の薬物または薬剤と呼ばれることもあり、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、およびインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロランブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、アニメタボライト（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、およびテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビサントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、およびグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、およびアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、およびゾレドロネートが含まれる。他の適切な薬剤は、化学療法剤または放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトでの使用が承認されている薬剤である。そのような薬剤は、いくつかの標準的な医師および腫瘍学者の参考文献のいずれか（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）を通じて参照でき、両方とも随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、およびポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためのｉＰＳＣ由来の治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療組成物に含まれるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に好適な組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／もしくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される培地、例えば、細胞培養培地）、または他の薬学的に許容される構成要素をさらに含み得る。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに治療組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５を参照、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＴ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＨＳＣを含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を含む治療組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、または気管投与法によって別個に、または他の適切な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を及ぼすことができる。
これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療組成物のｐＨを約３～約１０の間に維持するのに十分な量で存在することができる。したがって、緩衝剤は、全組成物の重量対重量ベースで約５％ほどであり得る。限定されないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどでの電解質もまた、治療組成物に含まれ得る。一態様では、治療組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、または約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療組成物は、該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、治療組成物は、約７．４のｐＨを有する。
本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物および／または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、成長、および／または健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および／またはフィーダーフリー培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物質を含まず、任意選択でタンパク質を含まなくてもよい。任意選択で、培地は、生物学的製剤に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物質を含まない培地とは、構成要素が動物以外の供給源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地で天然の動物性タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、タンパク質を含まない培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例が例示的であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して制限するものではなく、当業者に既知の利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、または間葉系間質細胞を有し得る。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞を有する治療組成物を提供する。いくつかの他の実施形態では、単離された多能性幹細胞由来の造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の、Ｔ、ＮＫ、もしくはＮＫＴ細胞、または天然源の任意の他の免疫細胞には存在しないかまたは典型的ではない、機能または構造的特徴を有するエフェクター細胞を有し得る。
一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、治療用タンパク質またはペプチド、および表１に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団を含み、ここで、由来エフェクター細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含む。別の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ＣＤ３８特異的治療用タンパク質またはペプチド、および表１に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団を含み、ここで、由来エフェクター細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＣＤ３８ヌルを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表１に列記された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞またはＴ細胞はＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、および外因性ＣＤ１６を含む。さらに他のいくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、および表１に列記された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団を含み、ここで、由来エフェクター細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、およびＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的化する第２のＣＡＲを含む。さらにいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表１に列記された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団を含み、由来エフェクター細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、外因性ＣＤ１６、およびＣＡＲと、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの組み合わせの完全長または部分長を含む１つ以上のタンパク質複合体とを含む。さらに別の一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、治療用タンパク質またはペプチド、および表１に記載された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ系統細胞の集団を含み、由来ＮＫ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、ＣＡＲ、１つ以上の外因性サイトカイン、およびＨＬＡ－Ｇ過剰発現またはＣＤ５８ノックアウトとＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つを含むＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－を含む。
当業者が理解するように、本明細書の方法および組成に基づいてｉＰＳＣに由来する自家および同種異系の造血系統細胞の両方を、上述の細胞治療に使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全または部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、由来造血系統細胞は、ＨＬＡ ＩおよびＨＬＡ ＩＩヌルを有するエフェクター細胞である。
いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも５ｘ１０６細胞、少なくとも１ｘ１０７細胞、少なくとも５ｘ１０７細胞、少なくとも１ｘ１０８細胞、少なくとも５ｘ１０８細胞、少なくとも１ｘ１０９細胞、または少なくとも５ｘ１０９細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり約０．１ｘ１０５細胞～約１ｘ１０６細胞、用量当たり約０．５ｘ１０６細胞～約１ｘ１０７細胞、用量当たり約０．５ｘ１０７細胞～約１ｘ１０８細胞、用量当たり約０．５ｘ１０８細胞～約１ｘ１０９細胞、用量当たり約１ｘ１０９細胞～約５ｘ１０９細胞、用量当たり約０．５ｘ１０９細胞～約８ｘ１０９細胞、用量当たり約３ｘ１０９細胞～約３ｘ１０１０細胞、またはその間の任意の範囲である。概して、６０ｋｇの患者の場合、１×１０８細胞／用量は、１．６７×１０６細胞／ｋｇに変換される。
一実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的または単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも０．１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０６細胞／ｋｇ体重、１×１０８細胞／ｋｇ体重、５×１０８細胞／ｋｇ体重、または１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
一実施形態では、ある用量の由来造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在するすべての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供されるエフェクター細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、または約１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在するすべての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供されるエフェクター細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、または６×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇであり、介在するすべての細胞用量を含む。
いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、複数回投与治療（多サイクルまたは分割治療とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、もしくは５０日ごと、またはその間の任意の日数に１回の投与である。
本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、投与の準備ができている（すなわち、さらに処理することなく投与することができる）。投与の準備ができている細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植または投与の前に、任意のさらなる処理または操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤を投与する前に拡大および／または調節される、由来造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞の場合、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載される方法を使用して、細胞を活性化および拡大することができる。
ある特定の実施形態では、由来造血系統細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合され得る。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面（つまり、「シス」形成で）、または別個の表面に（つまり、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、もう一方の薬剤を溶液中に存在させることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され得、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合される。ある特定の実施形態では、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、または本発明の実施形態においてＴリンパ球を活性化および拡大する際に使用することが企図されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号および同第２００６／００３４８１０号などに開示される薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋され得る。
投与量、頻度、およびプロトコルのある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量、頻度、およびプロトコルを決定する。
以下の実施例は、例示ために提供され、限定のためではない。
実施例１－材料および方法
様々なプロモーターの制御下で、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて自殺系を効果的に選択し、試験するために、単一細胞の継代および高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリー選別を可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一または複数の遺伝子調節によるクローンｈｉＰＳＣの誘導を可能にする。
小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：培養のコンフルエンシーが７５％～９０％に達したら、ｈｉＰＳＣを単一細胞として慣習的に継代した。単一細胞の解離では、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７°Ｃで３～５分間処理した後、ピペッティングして単一細胞の解離を確実にした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面にプレーティングした。継代は、典型的には、１：６～１：８で、３７°Ｃで２～４時間、マトリゲルで前もってコーティングした組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃および５％ＣＯ２に設定した加湿インキュベーターに維持した。
ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化された編集のためのＣＲＩＳＰＲ：例としてＲＯＳＡ２６標的化された挿入を使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、ＡＡＶＳ１標的化された挿入のために、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）、および５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、ＲＯＳＡ２６標的化された挿入のために、５ｕｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）および５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。トランスフェクションは、パラメーター１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用して、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。トランスフェクション後の２日目または３日目に、プラスミドに人工プロモータードライバーＧＦＰおよび／またはＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間は０．１ｕｇ／ｍｌの濃度で、７日後は０．２ｕｇ／ｍｌの濃度で培地に加えて、標的化された細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞を１０日目にマトリゲルでコーティングされた新しいウェルに継代した。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ＋ ｉＰＳ細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。
ゲノム編集されたｉＰＳＣのバルク選別およびクローン選別：ＺＦＮまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化された編集を伴うｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後に、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣのバルク選別およびクローン選別した。単一細胞で解離した標的化されたｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新しく作製した、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎仔児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む、コンジュゲートされた一次抗体を細胞溶液に加え、氷上で１５分間インキュベートした。すべての抗体を、１００万個の細胞当たり１００μＬの染色緩衝液中７μＬで使用した。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭのチアゾビブンを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー選別のために氷上で維持した。フローサイトメトリー選別は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。バルク選別では、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞をゲーティングし、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌの標準チューブに選別した。クローン選別では、選別された細胞を、ウェル当たり３イベントの濃度で、１００μＭのノズルを使用して９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンおよび１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充した２００μＬのＦＭＭを予めロードし、５ｘマトリゲルで前もって一晩コーティングした。５ｘマトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に加え、次いで、適切な再懸濁を可能にするために４°Ｃで一晩インキュベートし、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに加えた後、３７°Ｃで一晩インキュベートすることが含まれる。５ｘマトリゲルを、各ウェルに培地を加える直前に吸引する。選別が完了したら、インキュベーションの前に、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離した。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。選別後１０日目に、ウェルに追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーは選別後７～１０日で拡大した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで、３７℃で約１０分間解離させた。アキュターゼ処理の延長の必要性は、長期間培養でアイドリング状態にあったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離していることが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、５ｘマトリゲルで前もってコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、次いでインキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１：１の継代は、拡大する前に初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処理、およびＦＭＭ中の１ｘマトリゲルで前もってコーティングされたより大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシーでの１：４～１：８の拡大で慣習的に行った。各クローン細胞株を、ＧＦＰ蛍光レベルおよびＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析した。１００％に近いＧＦＰ＋およびＴＲＡ１－８１＋のクローン株を、さらなるＰＣＲスクリーニングおよび分析のために選択した。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で行い、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析した。
実施例２－ｉＰＳＣ、およびＢＣＭＡ－ＣＡＲを含むそれから分化したエフェクター細胞
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ構築物が表面発現を呈することを確認するために、ＤＡＰ１０－Ｔｈｙ１．１を発現するプラスミドを伴うおよび伴わないＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα（切断型）（ＩＬ１５Δ）を含むプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を回収し、３日目に表面発現を調べた。細胞をＴｈｙ１．１およびＩＬ１５Ｒａに対する抗体で染色し、ビオチン化ＢＣＭＡタンパク質、続いてストレプトアビジン－ＦＩＴＣで染色した。ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＩＬ１５Δ、およびＴｈｙ１．１の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより評価した。図５に示すように、外因性ＤＡＰ１０は、２９３Ｔ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲとＩＬ１５Δとの両方の表面発現を促進するようであった。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ構築物がｉＰＳ細胞でも表面発現を呈するかどうかを調べるために、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５Δのレンチウイルスベクターを、ＤＡＰ１０－Ｔｈｙ１．１を伴ってまたは伴わずに、ＣＤ３８ノックアウトおよびｈｎＣＤ１６を含む操作されたｉＰＳ細胞に形質導入した。ＣＤ３８ノックアウトおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳ細胞を、ＣＤ３８ノックアウトと高親和性の切断不可能なＣＤ１６発現を得るように連続してまたは同時に操作した。各操作ステップの後、次の操作ステップの前に、ｉＰＳＣを所望の表現型について、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトすることによるＨＬＡ－Ｉの喪失、ＣＩＩＴＡをノックアウトすることによるＨＬＡ－ＩＩの喪失、ここでは導入されたＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＩＬ１５Δについて、選別した。次いで、操作されたｉＰＳＣを、インビトロで、または派生細胞生成のために維持してもよい。
ＣＤ３８－／－ｈｎＣＤ１６ ｉＰＳＣを形質導入した後のＴｈｙ１．１、ＩＬ１５Δ、およびＢＣＭＡ－ＣＡＲタンパク質の表面発現を、３日目にフローサイトメトリーにより調べた。ｉＰＳ細胞では、構築したままのＢＣＭＡ－ＣＡＲの表面発現を促進するために外因性ＤＡＰ１０は必要ではないようであるが、ＩＬ１５Δは外因性ＤＡＰ１０の存在下でのみ検出可能である（図６）。ｉＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現パターンを決定するために、ＩＬ１５Δ陽性ｉＰＳ細胞を、ＤＡＰ１０を伴うまたは伴わない形質導入されたｉＰＳ細胞から選別し、これを次に、本明細書で提供される方法および組成物を使用してｉＮＫ細胞に分化させた。ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＩＬ１５Δを含むｉＰＳＣから、またはＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＩＬ１５Δに加えてＤＡＰ１０を含むｉＰＳＣから分化させたｉＮＫ細胞を、前述のように導入遺伝子発現評価のために表面染色した。図７Ａ～Ｃに示すように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびＩＬ１５Δの発現は、ＤＡＰ１０の導入および発現とは無関係である。
テロメアの短縮は細胞の老化とともに起こり、幹細胞の機能不全および細胞老化に関連している。Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む生成された派生細胞は、ｉＰＳＣ中のこれらの遺伝子操作されたモダリティが、造血分化中、細胞の所望の細胞運命へのインビトロでの指向された発達を乱すことなく維持されることを示したが、成熟した派生細胞は、成体末梢血の対応する細胞と比較して、より長いテロメアを維持することがここで示された。例えば、テロメア長は、１３０１ Ｔ細胞白血病株を対照（１００％）として使用し、Ｇ０／１細胞のＤＮＡインデックスを補正して、フローサイトメトリーにより、ｉＰＳＣ、成体末梢血ＮＫ系統細胞、およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞ついて決定した。図８に示すように、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、成体末梢血ＮＫ細胞と比較して有意に長いテロメア長を維持し（ｐ＝．１０５、ＡＮＯＶＡ）、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞における増殖、生存、および持続の可能性が高いことを示す。ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞と同様の観察結果も当分野で知られている。
実施例３－ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現する派生エフェクター細胞の機能プロファイリング
ＢＣＭＡ－ＣＡＲに指向された抗原特異的活性を検出するために、ＢＣＭＡ発現Ｎａｌｍ６細胞（Ｎａｌｍ－ＢＣＭＡ）および親Ｎａｌｍ６細胞（Ｎａｌｍ－Ｐ、ＢＣＭＡ発現なし）を標的化する細胞傷害性アッセイを実施した。Ｎａｌｍ６－ＢＣＭＡおよびＮａｌｍ６－Ｐ標的細胞を、細胞増殖色素ｅＦｌｏｕｒ－４５０およびｅＦｌｏｕｒ６７０でそれぞれ標識した。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを伴うまたは伴わないＩＬ１５Δ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫエフェクター細胞を滴定し、３０：１から０．０３：１の範囲のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）で標的細胞に加えた。エフェクターを伴わない標的細胞を、自発的な細胞死の対照として使用した。試料を４時間３７℃でインキュベートし、培養の最後の３０分間にＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（１×４００希釈）を加えた。図９に示すように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現するｉＮＫ細胞は、優れた抗原特異性を示し、親のＮａｌｍ６と比較してＢＣＭＡを発現するＮａｌｍ６系統の有意な殺滅を誘導する。
Ｔ細胞のＢＣＭＡ－ＣＡＲ機能を分析するために、ビーズで刺激したＴ細胞を、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを担持するレンチウイルスで形質導入した。形質導入後６日目に、Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ発現腫瘍標的を標的化するそれらの能力について試験した。Ｎａｌｍ６－ＢＣＭＡ系統および親Ｎａｌｍ６系統を調製し、上記のように形質導入したＴ細胞とともにインキュベートした。図１０に示されるように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、明確な抗原分解を示し、非形質導入Ｔ細胞と比較して、Ｎａｌｍ６－ＢＣＭＡ腫瘍群においてより大きな細胞傷害性を誘導する。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞のＡＤＣＣ媒介性二重標的化能力を試験するために、ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞を、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞を使用する再刺激細胞傷害性アッセイの標的として、ＣＤ１９－ＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ／ｉＮＫ細胞をエフェクターとして使用した。標的細胞およびエフェクター細胞を、３：１のエフェクターと標的との割合で、４８時間、ダラツムマブとともにまたはダラツムマブなしでインキュベートした。４８時間後、すべてのエフェクター細胞を収集し、新しいＭＭ．１Ｒ標的を含む新しいウェルに移した。さらに４８時間の再刺激期間の後、残っているＭＭ．１Ｒ標的細胞の数を決定した。図１１に示すように、多発性骨髄腫がん細胞を効果的に排除するために、ダラツムマブはｈｎＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを介してＢＣＭＡ－ＣＡＲと相乗作用して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δエフェクター細胞が、がん細胞の複数の抗原を標的化することにより抗腫瘍活性を増強できるようにする。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲのインビボ機能を、腫瘍細胞標的としてヒトＢＣＭＡを発現するマウス黒色腫細胞を使用して、または内因性ＢＣＭＡを発現するヒト細胞株を使用して評価した。インビボ評価のために、マウスまたはヒトＴ細胞を、他の編集物ＩＬ１５Δ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６とともにＢＣＭＡ－ＣＡＲで形質導入し、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δを含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞に加えてエフェクターとして使用した。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６の効能をマウス黒色腫モデルで評価した。マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０をヒトＢＣＭＡ（Ｂ１６Ｆ１０－ＢＣＭＡ）で形質導入し、これらの細胞を免疫担当のＣ５７ＢＬ／６または免疫無防備状態のＮＳＧマウスに静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）移植した。Ｂ１６Ｆ１０－ＢＣＭＡ腫瘍細胞の静脈内注射により、Ｃ５７ＢＬ／６で肺転移が生じ、ＮＳＧマウスで肺および肝臓の転移が生じ、皮下移植により、両方のマウス系統で単一の固形腫瘍が生じた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、Ｂ１６Ｆ１０－ＢＣＭＡ細胞のＩＶ移植後に肺腫瘍結節（転移）を計数した。腫瘍移植後にＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６－ＴまたはＮＫ細胞の養子移入を行って、これらの細胞がこれらの動物で発生する腫瘍結節の数を減少させる能力を評価した。腫瘍結節を、組織切片の肉眼形態および顕微鏡検査によってさらに評価した。皮下Ｂ１６－Ｆ１０－ＢＣＭＡモデルにおいて、腫瘍の進行を腫瘍サイズのキャリパー測定によってモニターした。模擬形質導入ＴまたはＮＫ細胞によるマウス治療と比較した肺の腫瘍結節の数および／またはサイズの減少は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６－ＴまたはＮＫ細胞を使用してＢ１６Ｆ１０－ＢＣＭＡ細胞をＩＶ移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの治療の有効性を反映した。同様に、Ｂ１６－Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍増殖のＳＣモデルにおいても、腫瘍進行の遅延、生存期間の延長、腫瘍退縮の誘導、または上記の組み合わせによって、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ＴまたはＮＫ細胞治療の有効性が示された。
ＮＳＧマウスでは、肺腫瘍結節と肝臓腫瘍結節との両方を計数し、模擬形質導入Ｔ細胞で治療したマウスを、各臓器の結節数を減らす能力についてＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ Ｔ細胞と比較した。マウスおよびヒト両方のＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ Ｔ細胞を、ＮＳＧマウスの腫瘍増殖を制御する能力について評価した。ヒトまたはマウスのいずれかの供給源からのＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ Ｔ細胞をＩＶ移植したＮＳＧマウスの肺および肝臓における腫瘍結節の数およびサイズの減少は、治療の有効性を示し、マウスの生存期間の延長と関連付けられる。
同様の結果が、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞を用いたＢ１６－Ｆ１０－ＢＣＭＡ腫瘍担持ＮＳＧマウスの治療でも予測される。図１２Ａ～Ｂは、代表的な生物発光画像（図１２Ａ）または試験群当たりｎ＝１０マウスの累積データ（図１２Ｂ）を使用した、播種性異種移植片ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫モデルにおけるダラツムマブと組み合わせたＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞のインビボ効能を示し、細胞またはダラツムマブ単独での治療と比較して、少なくとも３０日間は再発の兆候がなく完全な腫瘍クリアランスを実証する。
様々なヒト腫瘍細胞株に対するＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能も評価した。ＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、およびＫＭＳ１１を含むＢＣＭＡを発現するヒト細胞株を、免疫無防備状態のＮＳＧマウスに移植した。本明細書で提供される操作されたヒトｉＰＳＣに由来するＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ Ｔ細胞またはＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞のいずれかを使用して、これらの腫瘍タイプのうちのいずれかを担持するＮＳＧマウスの治療において、腫瘍進行の遅延、腫瘍退縮の誘導、および生存期間の延長を評価した。図１３は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６ ｉＮＫ細胞が、ＣＡＲ媒介性およびＡＤＣＣ媒介性機序を介してＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫腫瘍細胞株を効果的に標的化することを示す。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞のさらなる細胞傷害性の特性評価を、連続再刺激アッセイを使用して実施した。アッセイを、ダラツムマブの存在下または非存在下で、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌルｌ／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫをエフェクター細胞として１：１のＥ：Ｔ比で使用して、ＭＭ．１Ｓ細胞に対して行った。エフェクターのＢＣＭＡ－ＣＡＲ陰性親細胞（ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ）を対照として使用した。細胞を４８時間共培養し（Ｒ１）、次にすべての非接着細胞を収集し、新たにプレーティングしたＭＭ．１Ｓ標的細胞に移してさらなる刺激ラウンドを行った（Ｒ２）。この手順をもう一度繰り返し（Ｒ３）、合計３ラウンドの刺激を行った。図１４に示されるように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対して優れた二重標的殺滅能力を示した。ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δエフェクター細胞も、ＭＭ．１Ｓ細胞を用いた３回の連続チャレンジで一貫した効果的な細胞傷害性を呈した。この細胞傷害性は、ダラツムマブの存在下と非存在下との両方で明らかであり、ＣＡＲ陰性の親対照と比較して著しく改善された細胞傷害性を示した。特に、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δエフェクター細胞は、単剤療法試験アームとダラツムマブとの組み合わせ試験アームとの両方において、各刺激ラウンドにわたって細胞傷害性の改善を示し、これは、抗原媒介性の拡大および枯渇の回避を示唆する。
サイトカイン産生アッセイでは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用し、ダラツムマブの存在下で４時間、示される腫瘍細胞株で刺激した。上清を収集し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）電気化学発光プラットフォームを使用して、ＴＮＦαおよびＩＦＮγのレベルを評価した。図１５に示すように、サイトカイン産生の増加は、腫瘍細胞に応じて、ＣＡＲ標的化またはＡＤＣＣ媒介性標的化のいずれかによって促進され得、これは、細胞傷害性の増強のためにＣＡＲとＡＤＣＣとの両方を利用するＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ１６エフェクター細胞における二重標的化酸略の優位性を反映する。
さらに、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫエフェクター細胞は、外因性サイトカインの支援がない中でインビボ効能を維持することが観察された（図１６を参照）。ＮＳＧマウスにＭＭ．１Ｓ－Ｌｕｃ細胞を移植し、２日目、９日目、１６日目にＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫエフェクターで処理するか、または２日目にＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した。ｉＮＫエフェクター細胞の２つのバッチを使用し、３つすべての治療群を分割し、追加のサイトカイン支援なしで放置するか、またはＩＬ－１５およびＩＬ－２の週２回の注射で補充した。インビボ外因性サイトカイン支援の存在下または非存在下での各細胞群についてのＢＬＩ画像を図１６に示す。ＭＭ．１Ｓを移植したマウスをｉＮＫエフェクター細胞で処理すると、試験した３つすべてのバッチで腫瘍の退縮および腫瘍の成長の遅延が生じ、サイトカイン支援とサイトカイン支援なしとの間に有意差は観察されなかった。対照的に、初代ＣＡＲ－Ｔ細胞は外因性ＩＬ－２およびＩＬ－１５支援の存在下で有効であったが、サイトカインを投与しなかった場合、これらの細胞の効力は有意に低かった。このように、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫエフェクター細胞は、抗腫瘍能力を維持しながら、サイトカイン支援を必要とせずに、インビボで自律性および耐久性特性を示した。
ＭＭ．１Ｓ細胞を０日目に２．５Ｅ５の用量でマウスに移植した。マウスを、３用量のＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞により、３日目、１０日目、および１７日目に、５Ｅ６の用量で処理した。図１７に示すように、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を投薬した示されるマウス群に、１ｍｇ／ｋｇのＧＳＩを、週に３回で３週間、経口投与した。ダラツムマブを、３日目に１００ｕｇの単回投与として、示される群に投与した。未反応のマウスを黒い実線で示し、移植しなかった対照マウスを破線で白丸の中に示す。示すように、ＣＡＲ／ＣＤ３８ヌル／ｈｎＣＤ１６／ＩＬ１５Δ ｉＮＫ細胞のインビボ効能は、ＣＤ３８抗体またはガンマセクレターゼ阻害剤のいずれかとの組み合わせで増加する。さらに、ＣＤ３８抗体とＧＳＩとの両方の組み合わせで、エフェクターｉＮＫ細胞は、インビボで腫瘍細胞を効果的に殺滅するだけでなく、移植後の長期にわたるインビボでの腫瘍細胞再発の制御に成功した。理論に制限されることなく、ＡＤＣＣ媒介性の殺滅、腫瘍細胞上のＢＣＭＡ密度の増加、エフェクター細胞の自律性、およびフラトリサイドの回避は、ＣＤ３８ＫＯ、ＩＬ１５Δ、およびＣＤ１６を追加で含むＢＣＭＡ－ＣＡＲ ｉＮＫエフェクター細胞のインビボでの効能を相乗的に向上させる機序の１つであり得る。
当業者であれば、本明細書に記載の方法、組成物、および産物が例示的な実施形態を代表するものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本開示に対して様々な置換および修正を行うことができることは当業者には容易に明らかとなる。
本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本開示が属する分野の当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、制限がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む」、「本質的にからなる」、および「からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特色またはその一部の同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正および変形は、当業者によって想到され得、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。

Claims (40)

  1. 細胞またはその集団であって、
    （ｉ）前記細胞が、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、またはｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞であり、
    （ｉｉ）前記細胞が、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞またはその集団。
  2. 前記ｉＰＳＣ分化から得られた派生細胞が、造血細胞であり、末梢血、臍帯血、もしくは任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較してより長いテロメアを含むか、または前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲが、以下の特徴：
    （ｉ）Ｔ細胞特異的であること、
    （ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、
    （ｉｉｉ）表面ＢＣＭＡに結合すること、
    （ｉｖ）遺伝子座ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、もしくはＲＵＮＸ１のうちの１つにおいて挿入されていること、または
    （ｖ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、もしくはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、前記挿入が、任意選択で、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトすること、のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  3. 前記細胞が、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択でＣＩＩＴＡヌルまたは低、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方におけるノックアウト、
    （ｉｖ）外因性ＣＤ１６またはそのバリアント、
    （ｖ）ＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｖｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体、
    （ｖｉｉ）表１に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｖｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失または低減された発現、ならびに
    （ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片およびバリアント、エンゲージャー、ならびに二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  4. 前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲが、少なくとも
    （ａ）配列番号３３、３５、もしくは３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域、
    （ｂ）配列番号３４、３６、もしくは３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域、または
    （ｃ）配列番号３９～４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶ、を含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  5. 前記細胞が、派生ＮＫまたは派生Ｔ細胞であり、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較して、以下の、
    （ｉ）持続性および／もしくは生存の改善、
    （ｉｉ）天然免疫細胞に対する耐性の増加、
    （ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、
    （ｉｖ）腫瘍浸潤の改善、
    （ｖ）ＡＤＣＣの増強もしくは獲得、
    （ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／または活性化もしくは動員する能力の増強、
    （ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる能力の増強、
    （ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する能力の改善、
    （ｉｘ）腫瘍抗原を安定させる能力、ならびに
    （ｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    を含む特徴のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  6. 前記外因性ＣＤ１６またはそのバリアントが、高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）を含む、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  7. 前記外因性ＣＤ１６またはそのバリアントが、
    （ａ）ＣＤ１６の外部ドメインのドメイン中のＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、
    （ｂ）ＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメイン、
    （ｃ）非天然（または非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｄ）非天然（または非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｅ）非天然（または非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｆ）非天然の刺激ドメイン、ならびに
    （ｇ）ＣＤ１６に由来せず、同じまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  8. （ａ）前記非天然の膜貫通ドメインが、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来するか、
    （ｂ）前記非天然の刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来するか、
    （ｃ）前記非天然のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来するか、または
    （ｄ）前記非天然の膜貫通ドメインがＮＫＧ２Ｄに由来し、前記非天然の刺激ドメインが２Ｂ４に由来し、前記非天然のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する、請求項７に記載の細胞またはその集団。
  9. 前記細胞がＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するＣＡＲをさらに含み、前記ＣＡＲが、
    （ｉ）Ｔ細胞特異的またはＮＫ細胞特異的である、
    （ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲである、
    （ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲである、
    （ｉｖ）二量体化されたＣＡＲである、
    （ｖ）分割ＣＡＲである、
    （ｖｉ）多鎖ＣＡＲである、
    （ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲである、
    （ｖｉｉｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、
    （ｘｉ）抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、またはチェックポイント阻害剤と、任意選択で別個の構築物またはバイシストロン性構築物において共発現される、
    （ｘｉｉ）ＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つに特異的である、かつ／あるいは
    （ｘｉｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的である、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  10. 前記細胞が、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されている少なくともＣＡＲを含む、かつ／またはＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動されている、かつ／またはＴＣＲがＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  11. 前記細胞表面発現タンパク質複合体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、またはそれらのバリアント、およびそれらの受容体またはそれらのバリアント、のうちの少なくとも１つを含むか、
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）切断されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか、または修飾されている、融合タンパク質、ならびに
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    （（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、別個の構築物またはバイシストロン性構築物においてＣＡＲと共発現され得る）、
    かつ任意選択で、
    （ｃ）一過性発現される、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  12. 前記細胞が、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞であり、前記派生ＮＫ細胞が、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員および／または遊走させることができ、前記派生ＮＫ細胞または前記派生Ｔ細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる、請求項３に記載の細胞またはその集団。
  13. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または阻害性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項３または１２に記載の細胞またはその集団。
  14. 前記チェックポイント阻害剤が、
    （ａ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの１つ以上、または
    （ｂ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の細胞またはその集団。
  15. 前記派生細胞が、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、または派生Ｂ細胞を含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  16. 前記細胞が、
    （ｉ）１つのセーフハーバー遺伝子座もしくは選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または
    （ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座もしくは２つ以上の選択された遺伝子座に組み込まれた２つを超える外因性ポリヌクレオチド、または
    （ｉｉｉ）配列番号１７、１９、もしくは２１に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５△をコードするポリヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の細胞またはその集団。
  17. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、前記選択された遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みが、任意選択で、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトする、請求項１６に記載の細胞またはその集団。
  18. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータの定常領域である、請求項１７に記載の細胞またはその集団。
  19. ＢＣＭＡ－ＣＡＲと、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）外因性ＣＤ１６またはそのバリアント、および（ｉｉｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体のうちの１つ以上と、を含む、細胞またはその集団であって、前記細胞が免疫エフェクター細胞である、細胞またはその集団。
  20. 前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲが、少なくとも
    （ａ）配列番号３３、３５、もしくは３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域、
    （ｂ）配列番号３４、３６、もしくは３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域、または
    （ｃ）配列番号３９～４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶ、を含む、請求項１９に記載の細胞またはその集団。
  21. 末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその天然の対応する細胞と比較して、以下の特徴、
    （ｉ）持続性および／もしくは生存の改善、
    （ｉｉ）天然免疫細胞に対する耐性の増加、
    （ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、
    （ｉｖ）腫瘍浸潤の改善、
    （ｖ）ＡＤＣＣの増強もしくは獲得、
    （ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、および／または活性化もしくは動員する能力の増強、
    （ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低下させる能力の増強、
    （ｖｉｉｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する能力の改善、
    （ｉｘ）腫瘍抗原を安定させる能力、ならびに
    （ｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の細胞またはその集団。
  22. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ系統またはＮＫ系統細胞である、請求項１９に記載の細胞またはその集団。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞またはその集団を含む、組成物。
  24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞と、１つ以上の治療薬と、を含む、治療用途のための組成物。
  25. 前記１つ以上の治療薬が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体またはその機能的バリアントもしくは断片、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. （１）前記チェックポイント阻害剤が、
    （ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、もしくは阻害性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、
    （ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの１つ以上、または
    （ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含むか、あるいは
    （２）前記治療薬が、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドマイドのうちの１つ以上を含むか、または
    （３）前記治療薬が、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）を含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記抗体が、
    （ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、および／もしくは抗ＣＤ３８抗体、
    （ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、およびそれらのヒト化もしくはＦｃ修飾されたバリアントもしくは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの１つ以上、または
    （ｃ）ダラツムマブを含む、請求項２５に記載の組成物。
  28. 養子細胞療法に好適な対象に前記組成物を導入することによる、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の組成物の治療用途であって、前記対象が、（ｉ）自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、もしくはウイルス感染、（ｉｉ）炎症性自己免疫疾患、形質細胞のがん、もしくはＢリンパ球のがん、（ｉｉｉ）自己反応性形質細胞および／もしくは自己反応性メモリーＢ細胞に関連する自己免疫疾患、（ｉｖ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、またはリウマチ性関節炎、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、もしくはホジキン病、あるいは（ｖ）多発性骨髄腫、を有する、治療用途。
  29. ｉＰＳＣを分化させることを含み、前記ｉＰＳＣが、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、任意選択で、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択でＣＩＩＴＡヌルまたは低、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方におけるノックアウト、
    （ｉｖ）高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、
    （ｖ）ＢＣＭＡ以外の標的特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｖｉ）サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせの部分長または完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体、
    （ｖｉｉ）表１に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
    （ｖｉｉｉ）天然の対応する細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失または低減された発現、ならびに
    （ｉｘ）天然の対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、チェックポイント阻害剤、抗体またはその機能的断片もしくはバリアント、エンゲージャー、ならびに二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現、のうちの１つ以上と、を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の派生細胞を製造する方法。
  30. クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインし、任意選択で、
    （ｉ）ＣＤ３８をノックアウトするか、あるいは
    （ｉｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡをノックアウトするか、ＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方をノックアウトするか、またはＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇ、外因性ＣＤ１６もしくはそのバリアント、第２のＣＡＲ、および／もしくはサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体の発現を導入することをさらに含む、請求項２９に記載の派生細胞を製造する方法。
  31. 前記ゲノム操作することが、標的化された編集を含む、請求項３０に記載の派生細胞を製造する方法。
  32. 前記標的化された編集が、欠失、挿入、またはイン／デルを含み、前記標的化された編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって実行される、請求項３１に記載の派生細胞を製造する方法。
  33. クローンｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ媒介編集であって、前記編集が、ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのノックインを含み、前記編集されたクローンｉＰＳＣが、表１に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つを含む、クローンｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ媒介編集。
  34. 前記編集が、ＣＤ３８をノックアウトすることをさらに含むか、または前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲが、以下の特徴
    （ｉ）Ｔ細胞特異的であること、
    （ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、
    （ｉｉｉ）表面ＢＣＭＡに結合すること、
    （ｉｖ）配列番号３３、３５、または３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域を含むこと、
    （ｖｉ）配列番号３４、３６、または３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域を含むこと、
    （ｖｉｉ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含むこと、および
    （ｖｉｉｉ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、もしくはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、前記挿入が、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトすること、のうちの少なくとも１つを有する、請求項３３に記載のＣＲＩＳＰＲ媒介編集。
  35. 前記編集がＴＣＲ遺伝子座の定常領域での前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲもしくは第２のＣＡＲの挿入をさらに含み、かつ／または前記ＣＡＲがＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動され、かつ／または前記ＴＣＲが前記ＣＡＲの挿入によってノックアウトされる、請求項３３に記載のＣＲＩＳＰＲ媒介編集。
  36. 多発性骨髄腫の治療を改善する方法であって、前記治療を受けている対象に、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト、および高親和性の切断不可能なＣＤ１６またはそのバリアントを含むエフェクター細胞を投与することを含み、前記ＢＣＭＡ－ＣＡＲが、以下の特徴
    （ｉ）Ｔ細胞特異的であること、
    （ｉｉ）ＮＫ細胞特異的であること、
    （ｉｉｉ）細胞表面ＢＣＭＡに結合し、それを安定させること、
    （ｉｖ）配列番号３３、３５、または３７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域を含むこと、
    （ｖｉ）配列番号３４、３６、または３８のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域を含むこと、
    （ｖｉｉ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含むこと、および
    （ｖｉｉｉ）遺伝子座Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、もしくはＴＩＧＩＴのうちの１つにおいて挿入され、前記挿入が、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトすること、のうちの少なくとも１つを有する、方法。
  37. 前記エフェクター細胞が、派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞を含む派生造血細胞を含み、前記派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞が、
    （ｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡノックアウト、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの発現の導入、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方のノックアウト、
    （ｉｉｉ）第２のＣＡＲ、および／またはサイトカイン、サイトカイン受容体、もしくはそれらの任意の組み合わせの部分長もしくは完全長を含む細胞表面発現タンパク質複合体の発現の導入、ならびに／あるいは
    （ｉｉｉ）表１に列記される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 抗ＣＤ３８抗体および／またはＧＳＩを投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  39. ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト、および高親和性の切断不可能なＣＤ１６またはそのバリアントを含むエフェクター細胞が、ＧＳＩと接触したか、または接触している、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記多発性骨髄腫が、再発性または難治性型の多発性骨髄腫である、請求項３６に記載の方法。
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