CN114867846A - 多靶向效应细胞和其用途 - Google Patents

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R·比乔戴尔
J·古德里奇
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Abstract

提供了用于获得通过对基因组工程化iPSC进行定向分化获得的功能上增强的衍生效应细胞的方法和组合物。本文所提供的所述衍生细胞具有递送改善的或增强的治疗效果的稳定且功能性基因组编辑。还提供了治疗性组合物和其用途，所述治疗性组合物包括单独的所述功能上增强的衍生效应细胞或在组合疗法中所述功能上增强的衍生效应细胞与抗体或检查点抑制剂。

Description

多靶向效应细胞和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月5日提交的美国临时申请序列号62/944,187和于2019年9月25日提交的美国临时申请序列号62/906,046的优先权，所述美国临时申请的公开内容特此通过引用整体并入本文。
通过引用并入序列表
于2020年9月25日创建的大小为73,729字节的命名为“056932-519001WO_SL_ST25.TXT”的序列表特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开广泛涉及现成的免疫细胞产物领域。更具体地说，本公开与研发能够体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略相关。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。
背景技术
过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留，以促进有利的患者结果。淋巴细胞(例如T细胞和自然杀伤(NK)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然具有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用T细胞和NK细胞或其它淋巴细胞的全部潜能。
发明内容
需要功能改善的效应细胞，其解决以下范围内的问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤通过标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。
本发明的一个目的是提供用以产生由单一细胞衍生的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，所述iPSC系包括其基因组中的一种或几种基因修饰。所述一种或几种基因修饰包含DNA***、缺失和取代，并且所述修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在后续衍生的细胞中保留并且保持功能性。
本申请的iPSC衍生的非多能细胞包含(但不限于)CD34细胞、生血内皮细胞、HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞和B细胞。本申请的iPSC衍生的非多能细胞通过由包括相同基因修饰的iPSC分化而在其基因组中包括一种或几种基因修饰。用于获得基因工程化衍生细胞的工程化克隆iPSC分化策略要求iPSC在定向分化中的发育潜能不会受到iPSC中的工程化模式的不利影响，并且也要求工程化模式如预期一般在衍生细胞中起作用。另外，这一策略克服了工程化原代淋巴细胞(如从外周血获得的T细胞或NK细胞)的现有障碍，因此细胞难以工程化，并且对这类细胞进行工程化通常缺乏再现性和均一性，使得细胞表现出伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞持久性。此外，这种策略避免产生使用起始时为异源的原代细胞源另外获得的异源效应细胞群。
本发明的一些方面提供使用包括(I)、(II)或(III)的方法获得的基因组工程化的iPSC，分别反映了在重编程过程之后、同时和之前基因组工程化的策略：
(I)：按任何次序通过(i)和(ii)中的一个或两个对iPSC进行基因工程化：(i)将一个或多个构建体引入到iPSC中以允许在所选位点进行靶向整合；(ii)(a)使用能够进行所选位点识别的一种或多种核酸内切酶在所选位点处将一个或多个双链断裂引入到iPSC中；以及(b)培养步骤(I)(ii)(a)中的iPSC以允许进行内源性DNA修复，从而在所选位点处产生靶向***/缺失；由此获得能够分化成部分或完全分化细胞的基因组工程化iPSC。
(II)：对重编程非多能细胞进行基因工程化，以获得基因组工程化iPSC，所述基因工程化包括：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选地小分子组合物接触，以启动非多能细胞重编程，所述小分子组合物包括TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；和(ii)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入步骤(II)(i)中的重编程非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在一个或多个所选位点处进行靶向整合；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，然后培养步骤(II)(ii)(b)中的细胞以允许进行内源性DNA修复，从而在所选位点产生靶向***/缺失；因此所获基因组工程化iPSC包括至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程化iPSC能够分化成部分或完全分化细胞。
(III)：对重编程的非多能细胞进行基因工程化以获得基因组工程化iPSC，所述基因工程化包括(i)和(ii)：(i)按任何次序将(a)和(b)中的一者或两者引入非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在一个或多个所选位点处进行靶向整合；(b)使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶在所选位点的一个或多个双链断裂，其中培养步骤(III)(i)(b)中的细胞以允许进行内源性DNA修复，从而在所选位点产生靶向***/缺失；和(ii)使步骤(III)(i)中的细胞与一种或多种重编程因子和任选地小分子组合物接触，以获得基因组工程化iPSC，所述小分子组合物包括TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂，所述iPSC在所选位点包括靶向编辑；进而获得基因组工程化iPSC，其包括至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述基因组工程化iPSC能够分化成部分分化细胞或完全分化细胞。
在上述方法的一个实施例中，在一个或多个所选位点处的至少一种靶向基因组编辑包括一种或多种外源性多核苷酸的***，所述外源性多核苷酸编码安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物或促进基因组工程化iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，用于***的外源性多核苷酸与以下可操作地连接：(1)一种或多种外源性启动子，所述一种或多种外源性启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或者(2)所选位点中包括的一种或多种内源性启动子，所述所选位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1或符合基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，使用上述方法产生的基因组工程化iPSC包括一种或多种不同的外源性多核苷酸，所述一种或多种不同的外源性多核苷酸编码包括胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR或B细胞CD20的蛋白质，其中当基因组工程化iPSC包括两个或更多个***基因时，所述***基因整合在不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在一个实施例中，外源性多核苷酸编码IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或其相应受体的部分或全部肽。在一些实施例中，由外源性多核苷酸编码的IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或其相应受体的部分或全部肽呈融合蛋白形式。
在一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程化iPSC包括位于一种或多种与以下相关的内源性基因处的***/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节或抑制iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，用于破坏的内源性基因包括以下中的至少一者：B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，以及染色体6p21区域中的任何基因。
在又一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的基因组工程化iPSC包括位于AAVS1基因座的编码胱天蛋白酶的外源性多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源性多核苷酸。
在另外一些其它实施例中，方法(I)、(II)和/或(III)进一步包括：使基因组工程化iPSC与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物接触，以维持基因组工程化iPSC的多能性。在一个实施例中，包括至少一个靶向基因组编辑的所获得的基因组工程化iPSC具有功能性、可有效分化并且能够分化成包括同一功能性基因组编辑的非多能细胞。
因此，在一方面，本发明提供了一种细胞或其群体，其中(i)所述细胞是诱导多能细胞(iPSC)，或通过iPSC分化获得的衍生细胞；并且所述细胞包括至少编码BCMA-CAR(嵌合抗原受体)的多核苷酸。在一些实施例中，通过iPSC分化获得的所述衍生细胞是造血细胞，并且所述造血细胞包括比所述衍生细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞的端粒更长的端粒；或者其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：(i)是T细胞特异性的；(ii)是NK细胞特异性的；(iii)与表面BCMA结合；(iv)被***在以下基因座之一处：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1；或者(v)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述***任选地敲除所述基因座中的基因的表达。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，所述细胞进一步包括以下中的一种或多种：(i)CD38敲除；(ii)与其天然对应物细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；(iv)外源性CD16或其变体；(v)具有除了BCMA之外的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；(vi)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；(vii)表1中列出的基因型中的至少一种；(viii)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的缺失或减少的表达：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT；以及(ix)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段和变体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。在一些实施例中，所述BCMA-CAR至少包括：(a)重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(b)轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；或者(c)scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39-44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，所述细胞是衍生NK或衍生T细胞，并且与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞相比，具有以下特性中的至少一个特性：(i)改善的持久性和/或存活率；(ii)对天然免疫细胞的抗性增加；(iii)增加的细胞毒性；(iv)改善的肿瘤渗透性；(v)增强或获取的ADCC；(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及(x)避免互相杀伤的能力。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，所述细胞进一步包括高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)或其变体。在各个实施例中，外源性CD16或其受体包括以下中的至少一项：(a)CD16的胞外结构域中的F176V和S197P；(b)源自CD64的全部或部分胞外结构域；(c)非天然(或非CD16)跨膜结构域；(d)非天然(或非CD16)胞内结构域；(e)非天然(或非CD16)信号传导结构域；(f)非天然刺激性结构域；以及(g)并非源自CD16并且源自相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激性结构域。在一些实施例中，(a)非天然跨膜结构域源自CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体(TCR)多肽；(b)所述非天然刺激性结构域源自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽；(c)所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽；或(d)所述非天然跨膜结构域源自NKG2D，所述非天然刺激性结构域源自2B4，并且所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ。
在上述细胞或其群体中的一些实施例中，所述细胞进一步包括具有除BCMA之外的靶向特异性的CAR，并且其中所述CAR是：(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的；(ii)双特异性抗原结合性CAR；(iii)可切换的CAR；(iv)二聚化CAR；(v)分开的CAR；(vi)多链CAR；(vii)诱导型CAR；(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物共表达；(xi)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与抗体或其功能片段或变体或检查点抑制剂共表达；(xii)对以下中的至少一者具有特异性：CD19、MICA/B、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1；和/或(xiii)对以下中的任何一种具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合性蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶***结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、***干细胞抗原(PSCA)、PRAME***特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和病原体抗原。在一些实施例中，所述细胞至少包括***在TRAC基因座处的CAR和/或由TCR的内源性启动子驱动，和/或所述TCR通过所述CAR***而被敲除。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，其中所述细胞包括包含细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物，所述细胞表面表达的蛋白质复合物：(a)包括以下中的至少一项：IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或其变体；以及其受体或其变体；或者(b)包括以下中的至少一项：(i)通过使用自切割肽进行IL15和IL15Rα的共表达；(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白；(iii)具有截短的IL15Rα的胞内结构域的IL15/IL15Rα融合蛋白；(iv)IL15以及IL15Rα的结合膜的Sushi结构域的融合蛋白；(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白；(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白，其中所述共同受体γC是天然的或经修饰的；以及(vii)IL15Rβ的同源二聚体；其中(i)-(vii)中的任一项都可在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；以及任选地，(c)瞬时表达。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，所述细胞是衍生NK或衍生T细胞，其中所述衍生NK细胞能够募集T细胞和/或将所述T细胞迁移到肿瘤位点，并且其中所述衍生NK或所述衍生T细胞能够在存在一种或多种检查点抑制剂的情况下降低肿瘤免疫抑制。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，其中所述细胞包括在至少一种检查点抑制剂中引入或增加的表达，所述检查点抑制剂可以是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR。在一些实施例中，所述检查点抑制剂包括：(a)以下中的一种或多种：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫纳利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能等效物；或(b)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一种。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，其中所述细胞是通过iPSC分化获得的衍生细胞，所述衍生细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞或衍生B细胞。
在上述细胞或其群体的一些实施例中，所述细胞包括：(i)一个或多个外源性多核苷酸，所述一个或多个外源性多核苷酸整合在一个安全港基因座或所选基因座中；(ii)多于两个外源性多核苷酸，所述多于两个外源性多核苷酸整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选基因座中；或者(iii)编码IL15Δ的多核苷酸，所述IL15Δ包括与SEQ ID NO:17、19或21具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述安全港基因座包括以下中的至少一者：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1；并且其中所述所选基因座是以下之一：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述外源性多核苷酸的所述整合任选地敲除所述基因座中的基因的表达。在一些实施例中，所述TCR基因座是TCRα或TCRβ的恒定区。
另一方面，本发明提供了一种细胞或其群体，其包括BCMA-CAR，以及以下中的一种或多种：(i)CD38敲除；(ii)外源性CD16或其变体；以及(iii)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；其中所述细胞是免疫效应细胞。在一些实施例中，所述BCMA-CAR至少包括：(a)重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(b)轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；或者(c)scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39-44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应细胞相比，所述细胞或其群体包括以下特性中的至少一个特性：(i)改善的持久性和/或存活率；(ii)对天然免疫细胞的抗性增加；(iii)增加的细胞毒性；(iv)改善的肿瘤渗透性；(v)增强或获取的ADCC；(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及(x)避免互相杀伤的能力。在一些实施例中，所述免疫细胞是T谱系或NK谱系细胞。
在又另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括如上文所描述的细胞或其群体。在又另一方面，本发明提供了用于治疗用途的组合物，所述组合物包括如上文所描述的细胞和一种或多种治疗剂。在一些实施例中，一种或多种治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体或其功能变体或片段、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。在其中所述组合物包含检查点抑制剂的实施例中，所述检查点抑制剂包括：(a)一种或多种拮抗剂检查点分子，所述一种或多种拮抗剂检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；(b)以下中的一种或多种：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫纳利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能等效物；或者(c)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种；在所述组合物的各个实施例中，所述治疗剂包括维奈托克(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)、泊马度胺(pomalidomide)中的一种或多种。在所述组合物的各个实施例中，所述治疗剂包括γ分泌酶抑制剂(GSI)。通常，GSI是γ分泌酶的抑制剂，γ分泌酶是一种蛋白酶复合物，涉及某些I型整合膜蛋白(如Notch)的加工。在所述组合物的各个实施例中，所述抗体包括：(a)抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；(b)以下中的一种或多种：雷妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(certuximab)、迪努妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗、达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202、7G3、CSL362、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)和其人源化或经Fc修饰的变体或片段和其功能等效物和生物仿制药；或者(c)达土木单抗。
在又另一方面，本发明提供了上文所描述的任何组合物用于过继性细胞疗法的治疗用途，其中此类用途是通过将所述组合物引入到受试者中进行的，其中所述受试者患有(i)自身免疫性病症；血液***恶性肿瘤；实体瘤；癌症或病毒感染；(ii)炎性自身免疫性疾病、浆细胞癌或B淋巴细胞癌；(iii)与自身反应性浆细胞和/或自身反应性记忆B细胞相关的自身免疫性疾病；(iv)全身性红斑狼疮(SLE)或风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
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macroglobulinemia)、浆细胞白血病或霍奇金氏病(Hodgkin's disease)；或者(v)多发性骨髓瘤。因此，本发明提供了上文所描述的任何组合物在用于治疗以下的药物中的用途：(i)自身免疫性病症；血液***恶性肿瘤；实体瘤；癌症或病毒感染；(ii)炎性自身免疫性疾病、浆细胞癌或B淋巴细胞癌；(iii)与自身反应性浆细胞和/或自身反应性记忆B细胞相关的自身免疫性疾病；(iv)全身性红斑狼疮(SLE)或风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞白血病或霍奇金氏病；或者(v)多发性骨髓瘤。
在又另一方面，本发明提供了一种制造如上文所描述的衍生细胞的方法，其中所述制造方法包括分化iPSC，其中所述iPSC包括编码BCMA-CAR的多核苷酸，以及任选地以下中的一种或多种：(i)CD38敲除；(ii)与其天然对应物细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；(iv)高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)或其变体；(v)具有除了BCMA之外的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；(vi)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；(vii)本文提供的表1中列出的基因型中的至少一种；(viii)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的缺失或减少的表达：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT；以及(ix)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段或变体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
在制造所述衍生细胞的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括对克隆iPSC进行基因组工程化以敲入编码BCMA-CAR的多核苷酸；并且任选地(i)敲除CD38；(ii)敲除B2M和CIITA、敲除CD58和CD54之一或两者或引入以下的表达：HLA-G或不可切割的HLA-G、外源性CD16或其变体、第二CAR和/或包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物。在制造所述衍生细胞的方法的一些实施例中，所述基因组工程化包括靶向编辑。在一些实施例中，所述靶向编辑包括缺失、***或***/缺失，并且其中所述靶向编辑通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型进行。
在又另一方面，本发明提供了一种对克隆iPSC进行的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑包括敲入编码BCMA-CAR的多核苷酸，并且其中经编辑的克隆iPSC包括如本文所提供的表1中列出的基因型中的至少一种基因型。在一些实施例中，所述对克隆iPSC的编辑进一步包括敲除CD38，或者其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：(i)是T细胞特异性的；(ii)是NK细胞特异性的；(iii)与表面BCMA结合；(iv)包括重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(vi)包括轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(vii)包括scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；以及(viii)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述***敲除所述基因座中的基因的表达。在一些实施例中，所述编辑进一步包括在TCR基因座的恒定区处***所述BCMA-CAR或第二CAR，和/或其中所述CAR由TCR的内源性启动子驱动，和/或其中所述TCR通过所述CAR***而被敲除。
在又另一方面，本发明提供了一种改善多发性骨髓瘤治疗的方法，所述方法包括在治疗下向受试者施用包括BCMA-CAR、CD38敲除和高亲和力不可切割的CD16或其变体的效应细胞，其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：(i)是T细胞特异性的；(ii)是NK细胞特异性的；(iii)与细胞表面BCMA结合并稳定所述细胞表面BCMA；(iv)包括重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(vi)包括轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；(vii)包括scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；以及(viii)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述***敲除所述基因座中的基因的表达。在一些实施例中，所述效应细胞包括衍生造血细胞，所述衍生造血细胞包括衍生NK细胞或衍生T细胞，其中所述衍生NK细胞或衍生T细胞进一步包括以下中的一种或多种：(i)B2M和CIITA敲除；(ii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者中的敲除；(iii)第二CAR和/或包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物的所引入表达；和/或(iv)本文提供的表1中列出的基因型中的至少一种。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用抗CD38抗体和/或γ分泌酶抑制剂(GSI)。在一些实施例中，包括BCMA-CAR、CD38敲除、高亲和力不可切割的CD16或其变体的效应细胞已经与GSI接触或正与其在接触。在一些实施例中，所述多发性骨髓瘤是复发性或难治型多发性骨髓瘤。
通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施例。
附图说明
图1是用于iPSC衍生的细胞中的细胞表面表达的细胞因子的若干构建体设计的图示。IL15用作说明性实例，其可以用其它所期望的细胞因子置换。
图2A-D展示了具有一个或多个转基因的靶向CD38的转基因敲入构建体的各种组成(A和B对C和D)，其由外源性启动子或由用于产生CD38-/-转基因+多能干细胞和源自其的效应细胞的CD38内源性启动子驱动(B和D对A和C)。
图3示出了包含在靶向CD38的IL15/IL15ra-2A-hnCD16敲入构建体中的示例性核酸序列，所述构建体具有由用于产生CD38-/-CD16 IL15效应细胞的外源性启动子驱动的转基因，所述效应细胞源自使用所述构建体及其变体工程化的多能干细胞。
图4示出了包含在靶向CD38的IL15/IL15ra-2A-hnCD16敲入构建体中的示例性核酸序列，所述构建体具有由用于产生CD38-/-CD16+IL15+效应细胞的CD38内源性启动子驱动的转基因，所述效应细胞源自使用所述构建体及其变体工程化的多能干细胞。
图5示出了DAP10促进293T细胞中的BCMA-CAR表面表达。
图6示出了无论是否存在DAP10表达，在工程化iPSC中均未检测到BCMA-CAR表面表达。
图7A-C示出了每个指定的iNK细胞系中的BCMA-CAR和IL15Δ的表面表达，并且DAP10不影响从包括相同CAR但没有其可检测表面表达的iPSC中分化的NK细胞中的BCMA-CAR表面表达。
图8是由流式细胞术测定的端粒长度的图示，并且来自iPSC的成熟衍生NK细胞相较于成体外周血NK细胞维持更长的端粒。
图9描绘了如所指示的iNK细胞系上的BCMA-CAR表面表达。
图10示出了在4小时杀伤测定中表达BCMA-CAR的T细胞具有特异性细胞毒性。
图11示出了BCMA特异性CAR和达土木单抗在48小时杀伤测定中协同作用，通过包括BCMA-CAR、IL15Δ、CD38无效和hnCD16的多抗原靶向iNK细胞有效消除多发性骨髓瘤癌细胞。
图12A-12B示出了达土木单抗与BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK细胞的组合消除了多发性骨髓瘤播散小鼠模型中的肿瘤负荷。将5×105MM.1S-荧光素酶(MM.1S-luc)细胞静脉内注射到免疫功能低下的NSG小鼠中。两天后，小鼠要么未经治疗，要么用200μg达土木单抗(Dara)单独治疗或与1×107个所述iNK细胞组合治疗，其中在第一周期间向小鼠三次静脉内注射hIL-15(5μg)以支持NK细胞的持久性。图12A示出了代表性生物发光图像，并且图12B示出了每组n＝10只小鼠的累积数据，证明了BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK细胞的体内功效。
图13示出了iNK细胞通过CAR介导机制和ADCC机制两者有效靶向BCMA+多发性骨髓瘤肿瘤细胞系。FT576对(A)RPMI-8266和(B)U266多发性骨髓瘤肿瘤系的细胞毒性以3:1的效应物:靶标比率，添加和不添加2ug/ml达土木单抗。将样品在37℃下温育4小时，并通过流式细胞术评估靶细胞凋亡。与缺乏CAR表达的iNK细胞相比，BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK细胞在没有达土木单抗的情况下表现出增强的细胞毒性，其中在达土木单抗存在的情况下，两种细胞类型都观察到了另外的ADCC。在每对条中，非CAR对照是左侧条。
图14示出了在存在或不存在达土木单抗的情况下，使用BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK细胞作为效应细胞以1:1E:T比率对MM.1S细胞进行的再刺激细胞毒性测定的示例结果与CAR阴性亲本细胞相比。X轴以12个单位的增量展示。Y轴以0.5个单位的增量展示。
图15示出了响应于CAR和CD16刺激的BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK细胞的细胞因子产生。
图16示出了在存在或不存在外源性细胞因子支持的情况下移植有MM.1S-Luc细胞并用多剂量BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16效应细胞处理的NSG小鼠与接受或不接受相同细胞因子治疗的CAR T细胞相比的示例性BLI图像。
图17示出了γ分泌酶抑制剂增加了BCMA-CAR/IL15Δ/CD38无效/hnCD16效应细胞的体内功效。未经处理的小鼠以虚线的空心方形符号示出，而未移植的对照小鼠以空心符号和虚线示出。
具体实施方式
iPSC(诱导性多能干细胞)的基因组修饰包含多核苷酸***、缺失和取代。基因组工程化iPSC中的外源性基因表达通常遇到问题，例如在初始基因组工程化iPSC长期克隆扩增之后、在细胞分化之后并且在来自源自基因组工程化iPSC的细胞的去分化细胞类型中基因沉默或基因表达减少。另一方面，直接工程化例如T细胞或NK细胞的原代免疫细胞具有挑战性，并且对制备和递送用于过继性细胞疗法的工程化免疫细胞存在障碍。本发明提供了用于将一种或多种外源性基因(包含***基因和其它功能性形式)稳定地整合到iPSC衍生的细胞(包含但不限于HSC(造血干细胞和祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞)中的有效的、可靠的和靶向的方法，所述一种或多种外源性基因提供与移植、运输、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、寿命、自我更新、持久性和/或存活有关的有所改善的治疗性质。
定义
除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有所属领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数并且复数术语应包含单数。
应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，且因此可变化。本文所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书界定。
如本文所用，冠词“一(a/an)”和“所述(the)”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))的所述冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围。
如本文所用，术语“大体上”或“基本上”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“大体上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“大体上不含”和“基本上不含”可互换使用，且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时，是指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包含任何浓度的这类成分或物质，或(2)所述组合物中包含功能上呈惰性、但处于低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“不存在”，其中是指不存在组合物的特定物质或其来源。
在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包含所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施例中，术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”同义地使用。
“由……组成”意指包含并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素是需要或必需的，并且不能存在其它要素。
“基本上由……组成”意指包含短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素为需要或必需的，但其它要素不是任选的且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
贯穿本说明书提及“一个实施例”、“一实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某一实施例”、“另外实施例”或“另一实施例”或其组合意指结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含于本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施例。此外，特定特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适方式组合。
术语“离体(ex vivo)”通常是指在生物体外发生的活动，如在生物体外的人工环境中的活组织中或上进行的实验或测量，优选地具有最小的自然条件改变。在特定实施例中，“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养，并且通常培养几小时或长达约24小时，但包含长达48小时或72小时或更长，这视情况而定。在某些实施例中，可以收集和冷冻这类组织或细胞，并且稍后解冻以便进行离体处理。使用活细胞或组织持续时间长于几天的组织培养实验或程序通常被视为“体外”，但在某些实施例中，这个术语可以与离体互换使用。
术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“增加细胞效能”或“增加发育效能”是指一种增加细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。例如，相较于非重编程状态下的相同细胞，细胞效能增加的细胞具有更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞为与非重编程状态下的相同细胞相比分化状态减少的细胞。
如本文所用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导的细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞，所述细胞在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够从三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一种形成细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或iPSC意指由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞，所述干细胞已经诱导或改变，即重编程为能够分化成所有三种胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的iPSC并非指如其在自然界中被发现的那样的细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，不是分化全能的。
如本文所用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多潜能细胞为所属领域中熟知的，并且多潜能细胞的实例包含成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”指示细胞可以形成既定谱系内的许多类型的细胞，而非其它谱系的细胞。例如，多潜能造血细胞可形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指一种细胞状态，其发育潜能的程度低于分化全能和多能。
可部分地通过评定细胞的多能性特征确定多能性。多能性特性包含但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，所述标记物包含但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/凸素(prominin)、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上所述的特性，但所述初始或基础状态进一步展现；(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活；(ii)在单一细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调节基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源性多能性基因引入体细胞中，表达，并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特征。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源性转基因表达(其中观察到基础状态的特征)，否则这类细胞保持激发状态。
如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特征。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比率高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选地是人类患者、牲畜或其它驯养动物。
“多能性因子”或“重编程因子”是指能够单独或与其它药剂组合增加细胞的发育效能的药剂。多能性因子包含(但不限于)能够增加细胞的发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包含例如转录因子和小分子重编程剂。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下为单数“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培养细胞培养物的营养组合物。
“培养”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)的维持、繁殖(生长)和/或分化。“培养”或“维持”可以利用培养基作为有助于繁殖和/或维持细胞的营养物、激素和/或其它因子来源。
如本文所用，术语“中胚层”是指三种胚层中的一种，其出现于早期胚胎发生期间且产生各种特化细胞类型，包含循环***的血细胞、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和***。
如本文所用，术语“永久性生血内皮细胞”(HE)或“多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞”(iHE)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行：从侧板中胚层到成血管细胞到永久性生血内皮细胞和造血祖细胞。
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指定型为造血谱系，但能够进一步造血分化的细胞，且包含多潜能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多潜能干细胞，其产生所有血细胞类型，包含骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，术语“永久性造血干细胞”是指能够产生成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型两者，包含T细胞、NK细胞和B细胞的CD34+造血细胞。造血细胞还包含原始造血细胞的多种亚群，其产生原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用并且是指白血细胞的主要类型，其在胸腺中完成成熟并且在免疫***中具有多种作用，包含鉴别体内的特异性外来抗原和使其它免疫细胞活化和失活。T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包含(但不限于)CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调控T细胞、γδT细胞(gamma delta T cell/γδT cell)等等。其它类型的辅助T细胞包含例如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞的细胞。其它类型的记忆T细胞包含例如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指基因工程化的T细胞，例如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞也可以由干细胞或祖细胞分化。
“CD4+T细胞”是指在其表面上表达CD4且与细胞介导的免疫反应相关的T细胞的亚群。其特征在于刺激后的分泌概况，其可以包含分泌细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10。“CD4”是最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也发现于包含单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上的55kD的糖蛋白。CD4抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，且表明为MHC(主要组织相容性复合物)II类限制的免疫反应中的相关识别元件。在T淋巴细胞上，其界定了辅助/诱导因子亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面上表达CD8，受限于MHC I类，且充当细胞毒性T细胞的T细胞的亚群。“CD8”分子是在胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制的相互作用中的相关识别元件。
如本文所用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的不存在定义的外周血淋巴细胞的亚群。如本文所用，术语“适应性NK细胞”和“记忆NK细胞”可互换并且是指NK细胞的亚群，其表型为CD3-和CD56+，表达NKG2C和CD57和任选地CD16中的至少一种，但缺少以下中的一种或多种的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施例中，分离的CD56+NK细胞亚群包括CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是较弱或较强的表达。
如本文所用，术语“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指受限于CD1d的T细胞，其表达T细胞受体(TCR)。不同于检测由常规主要组织相容性(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别由CD1d(一种非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。识别两种类型的NKT细胞。恒定或I型NKT细胞表达非常有限的TCR库：典型α链(在人类中为Vα24-Jα18)与有限光谱的β链(在人类中为Vβ11)的结合。第二NKT细胞群体(称为非经典或非恒定II型NKT细胞)显示更不均匀的TCRαβ利用率。I型NKT细胞被视为适合于免疫疗法。适应性或恒定(I型)NKT细胞可以利用以下标记物中的至少一种或多种的表达来鉴别：TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161和CD56。
如本文所用，术语“分离”等是指细胞或细胞群，其已从其原始环境中分离，即，所分离细胞的环境大体上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包含从一些或所有组分去除的细胞，如同其在其自然环境中发现，例如从组织或活检样品分离。所述术语还包含从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，如同所述细胞在非天然存在的环境中发现，例如从细胞培养物或细胞悬浮液分离。因此，分离的细胞部分地或完全地与至少一种组分(包含其它物质、细胞或细胞群)分离，如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。所分离细胞的特定实例包含部分纯的细胞组合物、大体上纯的细胞组合物和非天然存在的培养基中培养的细胞。可以通过将所期望的细胞或其群体与环境中的其它物质或细胞分离，或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群或亚群来获得分离的细胞。
如本文所用，术语“纯化”等是指增加的纯度。例如，纯度可以增加到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特异性序列的固有特性，以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有所定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列和由其产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物***中产生蛋白质，那么所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
“构建体”是指包括要体外或体内传递给宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用，“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体，在所述靶细胞中，所述核酸构建体能够复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包括要递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合的或非整合的。载体的主要类型包含(但不限于)质粒、游离型载体、病毒载体、粘性质粒和人工染色体。病毒载体包含(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体(Sendai virus vector)等。
“整合”意指构建体的一个或多个核苷酸稳定***细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”意指将构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”处***细胞染色体或线粒体DNA中。如本文所用，术语“整合”进一步是指一种过程，其涉及在内源性序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点***构建体的一个或多个外源性序列或核苷酸。在***位点存在缺失的情况下，“整合”可以进一步包括用一个或多个所***核苷酸置换缺失的内源性序列或核苷酸。
如本文所用，术语“外源”旨在意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中，或对于宿主细胞是非原生的。可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(例如质粒)来引入所述分子。因此，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时体内转录成RNA并且在一些情况下转译成多肽的DNA序列。所关注的基因或多核苷酸可以包含(但不限于)原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如，所关注基因可以编码miRNA、shRNA、原生多肽(即，自然界中发现的多肽)或其片段；变异多肽(即，与原生多肽具有小于100％序列一致性的原生多肽突变体)或其片段；经工程化的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标志物、可选标志物等等。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸序列由四个核苷酸碱基构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包含基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还指双链和单链分子。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两种氨基酸，且多肽的氨基酸的最大数目不受限制。如本文所用，所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和低聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包含例如生物活性片段、大体上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包含天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
“可操作地连接”是指单一核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能RNA表达(即，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以在有义或反义定向上可操作地连接到调控序列。
如本文所用，术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优先治疗属性有贡献，并且可保留于源细胞衍生iPSC和/或iPSC衍生的造血谱系细胞中的遗传或表观遗传信息。如本文所用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生iPSC可以进一步分化成特定细胞类型，包含任何造血谱系细胞。视上下文而定，源细胞衍生iPSC和其分化细胞有时统称为“衍生的细胞”或“衍生细胞”。例如，如在整个本申请中所使用，衍生效应细胞或衍生NK细胞或衍生T细胞与获自天然/原生来源(例如，外周血、脐带血或其它供体组织)的其原代对应物相比是由iPSC分化的细胞。如本文所用，赋予优先治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入iPSC来并入iPSC中。在从具体所选供体、疾病或治疗背景中获得的源细胞的所述方面中，有助于优先治疗属性的基因印记可以包含任何背景特异性基因或表观遗传修饰，其显现可保留的表型，即优先治疗属性，所述表型被传递到所选源细胞的衍生细胞，无论潜在分子事件是否得到鉴定。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可以包括能保留于iPSC和衍生造血谱系细胞中的遗传印记，所述遗传印记包含但不限于预排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞；能追踪和所期望的遗传多态性，例如对编码所选供体中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型；和预定的HLA需求，即，所选的HLA匹配供体细胞随着群体增加而展现单倍型。如本文所用，优先治疗属性包含衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优先治疗属性还可以与以下有关：抗原靶向受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；对例如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比增强的细胞的治疗特性。例如，与典型的、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包含但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现：靶向抗原的受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；对如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，术语“接合体”是指一种分子，例如融合多肽，其能够在免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；并且活化所述免疫细胞。接合体的实例包含(但不限于)双特异性T细胞接合体(BiTE)、双特异性杀伤细胞接合体(BiKE)、三特异性杀伤细胞接合体或多特异性杀伤细胞接合体，或与多种免疫细胞类型相容的通用接合体。
如本文所用，术语“表面触发性受体”是指一种能够触发或启动免疫反应(例如细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可以加以工程化，并且可以在效应细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞上表达。在一些实施例中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的天然受体和细胞类型。使用这种方法，可以产生包括通用表面触发性受体的iPSC，并且然后使这类iPSC分化成表达所述通用表面触发性受体的各种效应细胞类型的群体。“通用”意指表面触发性受体可表达于任何效应细胞中并且激活任何效应细胞(不论细胞类型)并且表达通用受体的所有效应细胞可与表面触发性受体可识别的具有相同抗原决定基的衔接子偶联或连接(不论衔接子的肿瘤结合特异性)。在一些实施例中，具有相同肿瘤靶向特异性的接合体用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施例中，具有不同肿瘤靶向特异性的接合体用于与通用表面触发受体偶联。因此，可使一种或多种效应细胞类型接合，以在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包括用于效应细胞激活的共刺激性结构域和对衔接子的表位具有特异性的表位结合区。双特异性衔接子对位于一端上的表面触发受体的表位结合区具有特异性，并且对位于另一端上的肿瘤抗原具有特异性。
如本文所用，术语“安全开关蛋白质”是指一种工程化的蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止副作用。在一些情况下，有条件地控制安全开关蛋白表达，以解决已经将编码安全开关蛋白的基因永久地并入其基因组中的移植的工程细胞的安全问题。这种条件性调控可以是可变的并且可以包含通过小分子介导的转译后活化和组织特异性和/或时间转录调控进行控制。安全开关可以介导对凋亡的诱导、对蛋白合成或DNA复制的抑制、生长阻滞、转录和转录后遗传调节和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白由外源分子例如前药活化，所述外源分子在被活化时触发了治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的实例包含但不限于***基因如胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR和其任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时给予的前药由***基因产物活化并且杀死转导的细胞。
如本文所用，术语“药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，且可以给予以改善、减轻(relieve)、缓解、逆转或减轻(lessen)疾病的严重程度。药学活性蛋白质还具有防治性特性且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理性病状在其显现时的严重程度。药学活性蛋白质包含完整蛋白质或肽或其药学活性片段。其还包含所述蛋白质或肽的药学活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语药学活性蛋白质还指以协作或协同方式起作用以提供治疗效益的多个蛋白质或肽。药学活性蛋白质或肽的实例包含(但不限于)受体、结合蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、活化、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合物来以化学修饰的形式传递分子信号。信号转导路径为所属领域中熟知的，并且包含(但不限于)G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、TG点信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导通路、Wnt信号传导通路、cAMP依赖性通路和IP3/DAG信号传导通路。
如本文所用，术语“靶向模式”是指分子(例如多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或抗原决定基特异性，其包含但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时)；ii)接合体特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性接合体时)；ⅲ)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞；和v)在不存在特异性抗原或表面分子的情况下的其它靶向策略。
如本文所用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如受体或接合体)选择性地结合到靶分子的能力。
如本文所用，术语“过继性细胞疗法”是指一种基于细胞的免疫疗法，如本文所用，其是指自体或同种异体淋巴细胞的输注，所述淋巴细胞经鉴别为经过遗传修饰或未经遗传修饰的T细胞或B细胞，其在所述输注之前已离体扩增。
如本文所用，“治疗上足够的量”在其含义内包含无毒但足够和/或有效量的其所指代的用于提供期望的治疗效果的特定治疗和/或药物组合物。所需的精确量将随各受试者而变化，这取决于例如患者的一般健康状况、患者的年龄和病状的阶段和严重程度等因素。在特定实施例中，治疗上足够的量足以和/或有效减轻、减少和/或改善与所治疗的受试者的疾病或病状相关的至少一种症状。
多能干细胞的分化需要改变培养***，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略利用类胚胎体(EB)的形成作为共同和关键中间物来起始谱系特异性分化。“类胚胎体”是三维团簇，其已显示模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，通常为几小时到几天，简单的EB(例如经诱发以分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性EB，此时，通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成是通过使多能干细胞在三维多层细胞团簇中彼此紧密接近来起始的，这典型地是通过若干种方法中的一种来实现，包含允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞沉降到“U”形底孔板中或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，因为多能培养维持性培养基中维持的聚集体不形成适当EB。因此，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，所述分化培养基向所选谱系提供诱发提示。随着在EB细胞团簇内适度增殖，多能干细胞的基于EB的培养通常会引起分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实促进细胞分化，然而由于三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示，EB产生了处于可变分化状态的异质细胞。另外，EB难以形成和维持。此外，通过EB进行的细胞分化伴随适度的细胞扩增，这也导致分化效率降低。
相比之下，与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生的细胞群。例如，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择培养基以维持增殖和多能性。细胞增殖通常增加聚集体的大小，从而形成更大聚集体，这些聚集体可用常规的机械或酶方式解离成较小聚集体，以维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数量。不同于EB培养，维持培养中的聚集体内所培养的细胞维持多能性的标记物。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
如本文所用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“EB形成”。除本文所公开的其它优势之外，单层分化避免了对用于分化起始的EB形成的需要。由于单层培养不模拟胚胎发育，例如EB形成，因此与EB中的所有三种胚层分化相比，朝向特定谱系的分化被认为是最少的。
如本文所用，“解离”细胞是指已与其它细胞或表面(例如培养板表面)大体上分离或纯化的细胞。例如，可通过机械或酶方法从动物或组织中解离细胞。可替代地，在体外聚集的细胞可以彼此解离，如酶促地或机械地解离成簇、单细胞或单细胞和簇的混合物的悬浮液。在又一替代实施例中，从培养板或其它表面解离粘附细胞。因此，解离可涉及破坏细胞与胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文所用，“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可生长、扩增或分化的环境的一种类型的细胞的术语，因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供刺激、生长因子和营养物。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人类细胞，包含干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一个实例中，外周血衍生细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。当与其它细胞共培养时，饲养细胞可以通常通过辐射或用如丝裂霉素等有丝***剂拮抗剂处理来激活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包含内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说，多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、引导朝向某一谱系的分化，增强增殖能力并且促进向特化细胞类型(例如效应细胞)的成熟。
如本文所用，“无饲养层”(FF)环境是指一种环境，例如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层或基质细胞，和/或其尚未通过培养饲养细胞进行预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞已在培养基内培养一段时间(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有许多介体物质，包含由培养基中培养的饲养细胞分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施例中，无饲养层环境不含饲养层或基质细胞，并且也不通过培养饲养细胞进行预调节。
如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的背景下所用的“功能”是指(1)在基因层面上成功的敲入、敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达，例如所期望的细胞发育阶段的诱导性或暂时表达，这通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”、通过最初进行基因组工程化起始细胞的分化或重编程来实现；或(2)在细胞层面成功的去除、添加或改变细胞功能/特性，这通过以下实现：(i)在所述细胞中通过直接的基因组编辑而获得的基因表达变化；(ii)在所述细胞中通过“传递”、通过从最初进行基因组工程化起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达变化；(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控，所述基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于通过分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或(iv)成熟细胞产物内所呈现的增强的或新获得的细胞功能或属性，所述成熟细胞产物最初通过对祖细胞或去分化细胞来源的iPSC进行基因组编辑或修饰而获得。
“HLA缺陷”，包括HLA-I类缺陷或HLA-II类缺陷，或两者，是指缺少或不再维持包含HLA I类蛋白质异二聚体和/或HLA II类异二聚体的完整MHC复合物的表面表达或所述表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于由其它细胞或合成方法可自然检测到的水平的细胞。
如本文所用，“缺乏HLA的已修饰的iPSC”是指缺乏HLA的iPSC，其另外通过引入基因表达蛋白质而被修饰，所述蛋白质与以下有关但不限于：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，例如非经典HLA I类蛋白质(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD113和PDL1。“经修饰的HLA缺陷型”细胞还包含除iPSC以外的细胞。
“Fc受体”(缩写为FcR)是基于其识别的抗体类型而分类。例如，结合最常见类别的抗体IgG的受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)并且结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别也通过表达其的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包含若干成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)，它们的抗体亲和力因其分子结构不同而不同。
“嵌合Fc受体”(缩写为CFcR)是用于描述其天然跨膜和/或胞内信号传导结构域被非天然跨膜和/或胞内信号传导结构域修饰或置换的工程化Fc受体的术语。在嵌合Fc受体的一些实施例中，除非天然的跨膜和信号传导结构域中的一者或两者之外，可以将一种或多种刺激性结构域引入工程化的Fc受体的胞内部分中以在触发受体后增强细胞活化、扩增和功能。不同于含有与靶抗原的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，嵌合Fc受体结合于Fc片段、或抗体的Fc区、或包含于接合体或结合分子中并且在使靶细胞接近或不接近附近的情况下活化细胞功能的Fc区。例如，可工程化Fcγ受体以将所选跨膜、刺激和/或信号传导结构域包括在对在胞外结构域结合IgG有反应的胞内区域中，从而产生CFcR。在一个实例中，CFcR由工程化CD16、Fcγ受体通过置换其跨膜结构域和/或胞内结构域来产生。为了进一步提高基于CD16的CFcR的结合亲和力，可并入CD64或CD16的高亲和力变体(例如F176V)的胞外结构域。在涉及高亲和力CD16胞外结构域的CFcR的一些实施例中，在位置197处包括丝氨酸的蛋白水解切割位点被消除或置换，使得受体的胞外结构域不可切割，即不经历脱落，从而获得基于CD16的CFcR。
CD16(一种FcγR受体)已鉴别为具有两种同功异构物：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a为由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以活化NK细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“高亲和力不可裂解的CD16(hnCD16)”是指天然或非天然的CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经受胞外结构域脱落，这是在NK细胞激活时调控白细胞上的各种细胞表面分子的细胞表面密度的蛋白水解切割过程。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16多态变体。在接近膜的区域(位置189到212)中改变或消除裂解位点(位置195到198)的CD16变体不经历脱落。切割位点和接近膜的区域详细地描述于WO2015148926中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。CD16 S197P变体是工程化的CD16的不可裂解型式。包括F158V和S197P两者的CD16变体具有高亲和力，并且不可裂解。另一示例性高亲和力和不可裂解的CD16(hnCD16)变体是包括源自CD64胞外域的3个外显子中的一个或多个的胞外域的工程化的CD16。
I.适用于具有增强特性的过继性细胞疗法的细胞和组合物
本文提供一种策略，其***地工程化克隆iPSC的调控回路，并且不影响iPSC的分化效能以及iPSC和其衍生细胞的细胞发育生物学，同时增强衍生细胞的治疗特性。在iPSC水平上通过基因组工程化引入到细胞中的选择性模式组合之后，衍生细胞在功能上得到改善并且适于过继性细胞疗法。在本发明之前，尚不清楚包括一种或多种所提供的基因编辑的改变的iPSC是否仍具有进入细胞发育和/或使功能分化细胞成熟和产生同时保留调节活性的能力。在iPSC的定向细胞分化期间的意外失败归因于包含(但不限于)以下的方面：发育阶段特定基因表达或缺乏基因表达、HLA复合物呈递的需求、所引入表面表达模式的蛋白质脱落和实现细胞中的表型和/或功能变化的分化方案重配置的需要。本申请已展示，如本文所提供的一种或多种所选基因组修饰不会对iPSC分化效能产生负面影响，并且源自工程化iPSC的功能效应细胞具有增强的和/或获得的治疗特性，这可归因于在iPSC分化之后保留在效应细胞中的单独的或组合的基因组修饰。
1.BCMA-CAR
适用于基因工程化iPSC及其衍生效应细胞可以是一种或多种CAR设计。CAR(一种嵌合抗原受体)为融合蛋白，其一般包含包括抗原识别区的胞外域、跨膜结构域和胞内域。在一些实施例中，胞外域可以进一步包含信号肽或前导序列和/或间隔子。在一些实施例中，胞内域可以进一步包括信号传导肽，其活化表达CAR的效应细胞。在一些实施例中，抗原识别结构域可以特异性结合抗原。在一些实施例中，抗原识别结构域可以特异性结合与疾病或病原体相关的抗原。在一些实施例中，疾病相关的抗原是肿瘤抗原，其中肿瘤可以是液体或实体肿瘤。在一些实施例中，CAR适于激活表达所述CAR的T细胞、NK细胞或NKT细胞。在一些实施例中，CAR为对包括NK特异性信号传导组分具有特异性的NK细胞。在一些实施例中，CAR是对包括NKT特异性信号传导组分具有特异性的NKT细胞。在某些实施例中，所述T细胞源自表达CAR的iPSC，并且衍生T细胞可以包括T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞、γδT细胞或其组合。在某些实施例中，所述NK细胞源自表达CAR的iPSC。在某些实施例中，所述NKT细胞源自表达CAR的iPSC。
在某些实施例中，所述抗原识别区包括鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包含Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、抗原结合单链可变片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单结构域抗原结合片段(sdAb、纳米抗体)、重组仅重链抗体(VHH)以及维持完整抗体的结合特异性的其它抗体片段。
在一个实例中，本说明书提供了包括靶向肿瘤抗原BCMA(B细胞成熟抗原)的抗原识别区的CAR。BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族17(TNFRSF17或CD269)中的一种跨膜糖蛋白，并且在所有患者多发性骨髓瘤细胞中以显著更高的水平表达，但在除正常浆细胞外的其它正常组织中不表达。在靶向CAR的BCMA的一些实施例中，抗原识别区是与CD269的胞外结构域特异性结合的scFV。在一个实施例中，scFV包括重链的可变区(VH)，所述重链的可变区由与SEQ ID NO:33、35和37中的任一个具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示；以及轻链的可变区(VL)，所述轻链的可变区由与SEQ ID NO:34、36和38中的任一个具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。在用于CAR构建的BCMA scFV的一个实施例中，scFV包括VH和VL，其由分别与SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；或分别与SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。在BCMA scFV的一个实施例中，scFV由与SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44中的任一个具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。本说明书的另一方面提供了基因工程化iPSC及其衍生细胞，其中所述细胞包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸。在一些实施例中，包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸的iPSC衍生的效应细胞是T细胞。在一些实施例中，包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸的iPSC衍生的效应细胞是NK细胞。在一些其它实施例中，包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸的iPSC衍生的效应细胞是NKT细胞。在一些其它实施例中，包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸的iPSC衍生的效应细胞具有在天然来源的T、NK或NKT细胞或任何其它免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征。在一个实例中，本说明书提供了包括靶向肿瘤抗原BCMA的抗原识别区的CAR。
SEQ ID NO:33
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
(BCMA scFV重链-1(VH))
SEQ ID NO:34
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK
(BCMA scFV轻链-1(VL))
SEQ ID NO:35
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(BCMA scFV重链-2(VH))
SEQ ID NO:36
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK
(BCMA scFV轻链-2(VL))
SEQ ID NO:37
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(BCMA scFV重链-3(VH))
SEQ ID NO:38
DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK
(BCMA scFV轻链-3(VL))
SEQ ID NO:39
MDFQVQIFSFLLISASVIMSREVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSSGSTSG SGKPGSGEGSTKGEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK
(BCMA scFV-1；VH-连接子-VL；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:40
MDFQVQIFSFLLISASVIMSREIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
(BCMA scFV-2；VL-连接子-VH；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:41
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSSGSTSGS GKPGSGEGSTKGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK
(BCMA scFV-3；VH-连接子-VL；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:42
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGE GSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(BCMA scFV-4；VL-连接子-VH；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:43
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSSGSTSGS GKPGSGEGSTKGDIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK
(BCMA scFV-5；VH-连接子-VL；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:44
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRDIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGE GSTKGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS
(BCMA scFV-6；VL-连接子-VH；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
在本说明书的另一方面，包括至少编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸的基因工程化的iPSC和其衍生细胞进一步包括靶向除BCMA之外的抗原的另外的CAR。在一些实施例中，另外的CAR靶向肿瘤抗原MICA和MICB(MICA/B)。在靶向CAR的MICA/B的一些实施例中，抗原识别区是与MICA和MICB的保守α3结构域特异性结合的scFV。在一个实施例中，scFV包括重链的可变区，所述重链的可变区由与SEQ ID NO:45具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示；以及轻链的可变区，所述轻链的可变区由与SEQ ID NO:46具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。在MICA/B scFV的一个实施例中，scFV由与SEQ ID NO:47具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。在MICA/B scFV的另一个实施例中，scFV由与SEQ ID NO:48具有至少约99％、约98％、约96％、约95％、约90％、约85％或至少约80％同一性的氨基酸序列表示。
SEQ ID NO:45
QIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSS
(118AA.MICA/B scFV重链(HC))
SEQ ID NO:46
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIK
(107AA.MICA/B scFV轻链(LC))
SEQ ID NO:47
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRQIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIK
(MICA/B scFV；HC-连接子-LC；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
SEQ ID NO:48
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSS
(MICA/B scFV；LC-连接子-HC；信号肽/前导-其它信号肽也是可能的；连接子–其它连接子也是可能的)
如本说明书中所示，如所提供的MICA/B-CAR靶向MICA/B肿瘤抗原抑制在许多人类和鼠类肿瘤细胞系中观察到的表面MICA/B脱落，从而导致MICA/B细胞表面密度增加、可溶性脱落的MICA/B减少以及NK细胞介导的肿瘤杀伤增强。所提供的MICA/B-CAR能够靶向和稳定肿瘤细胞表面MICA/B，不会干扰与肿瘤MICA和MICB的结合的NKG2D。
可以被包含在基因工程化iPSC和衍生效应细胞中的除MICA/B之外的另外的CAR靶向的抗原的非限制性实例包含ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合性蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶***结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、***干细胞抗原(PSCA)、PRAME***特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和所属领域中已知的各种病原体抗原。病原体的非限制性实例包含能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。在包括BCMA-CAR的iPSC和来自其的衍生效应细胞的一个实施例中，所述细胞进一步包括MICA/B-CAR。在包括BCMA-CAR的iPSC及来自其的衍生效应细胞的另一个实施例中，所述细胞进一步包括CD19-CAR。在包括BCMA-CAR的iPSC及来自其的衍生效应细胞的又另一个实施例中，所述细胞进一步包括HER2 CAR。在包括BCMA-CAR的iPSC及来自其的衍生效应细胞的仍另一个实施例中，所述细胞进一步包括MSLN CAR。在包括BCMA-CAR的iPSC及来自其的衍生效应细胞的另外的实施例中，所述细胞还包括PSMA CAR。在包括BCMA-CAR的iPSC及来自其的衍生效应细胞的仍另一个实施例中，所述细胞还包括VEGF-R2 CAR。
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包括CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体多肽的原生或修饰的跨膜区的全长或至少一部分。在一个实施例中，BCMA-CAR和/或另外的CAR(靶向除了BCMA之外的抗原)包括源自CD28的跨膜结构域。在一个实施例中，BCMA-CAR和/或另外的CAR包括源自NKG2D的跨膜结构域。
在一些实施例中，内域(或胞内结构域)的信号传导结构域包括CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D的多肽的全长或至少一部分。在一个实施例中，本文所公开的CAR的信号传导肽包括与CD3ζ的至少一种基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述内域进一步包括至少一个共刺激信号传导区。所述共刺激信号传导区可以包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA4或NKG2D或其任何组合的多肽的全长或至少一部分。
在一个实施例中，本申请中提供的BCMA-CAR包括包含CD3ζ的天然或经修饰的ITAM1的信号传导结构域，所述CD3ζ由与SEQ ID NO:13具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。在另一个实施例中，包括源自CD28和CD3ζ的天然或修饰的ITAM1的共刺激性结构域的CAR也包括源自CD28的铰链结构域和反式膜结构域，其中scFv可通过铰链连接到反式膜结构域，并且CAR包括与SEQ ID NO:14至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％一致性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(153a.a.CD28 co-stim+CD3ζITAM)
SEQ ID NO:14
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR
(219a.a.CD28铰链+CD28 TM+CD28共刺激+CD3ζITAM)
在另一个实施例中，本申请中提供的BCMA-CAR包括源自NKG2D的跨膜结构域、源自2B4的共刺激性结构域和包括天然或经修饰的CD3ζ的信号传导结构域，所述CD3ζ由与SEQID NO:15具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列表示。包括源自NKG2D的跨膜结构域、源自2B4的共刺激性结构域和包括天然或修饰的CD3ζ的信号传导结构域的所述CAR可进一步包括CD8铰链，其中这类结构的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:16至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％一致性。
SEQ ID NO:15
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(263个氨基酸NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
SEQ ID NO:16
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIF CCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(308个氨基酸CD8铰链+NKG2D TM+2B4+CD3ζ)
非限制性CAR策略进一步包含：异二聚体，其通过使一对胞内结构域二聚化而有条件地活化CAR(参见例如，美国专利第9587020号)；分离CAR，其中同源重组抗原结合、铰链和胞内域以产生CAR(参见例如，美国公开案第20170183407号)；多链CAR，其允许分别连接到抗原结合结构域和信号传导结构域的两个跨膜结构域之间的非共价连接(参见例如，美国公开案第20140134142号)；CAR，其具有双特异性抗原结合性结构域(参见例如，美国专利第9447194号)，或具有识别相同或不同抗原或抗原决定基的一对抗原结合性结构域(参见例如，美国专利第8409577号)，或串联CAR(参见例如，Hegde等人,《临床研究杂志(J ClinInvest.)》2016；126(8):3036-3052)；诱导型CAR(参见例如，美国公开案第20160046700号、第20160058857号、第20170166877号)；可切换CAR(参见例如，美国公开案编号：20140219975)；和所属领域中已知的任何其它设计。
适于BCMA CAR和/或另外的CAR(靶向除了BCMA之外的抗原)***的基因组基因座包含满足如本文所提供的基因组安全港的标准的基因座和期望由于整合而敲低或敲除所选基因座中的基因的基因座。在一些实施例中，适于BCMACAR***的基因组基因座包含但不限于AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白(Tapasin)、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。
在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在TCR恒定区中的CAR，引起TCR敲除，并且任选地将CAR表达置于内源性TCR启动子的控制下。在包括TCR无效和BCMA CAR的iPSC衍生的细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞是T细胞。在另一个实施例中，包括CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在NKG2A基因座或NKG2D基因座中的CAR，引起NKG2A或NKG2D敲除，并且任选地将CAR表达置于内源性NKG2A或NKG2D启动子的控制下。在包括NKG2A或NKG2D无效和BCMA CAR的iPSC衍生的细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞是NK细胞。在又另一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CD38编码区中的CAR，引起CD38敲除，并且任选地将CAR表达置于内源性CD38启动子的控制下。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CD58编码区中的CAR，引起CD58敲除。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CD54编码区中的CAR，引起CD54敲除。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CIS(细胞因子诱导的含SH2的蛋白质)编码区中的CAR，引起CIS敲除。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CBL-B(E3泛素-蛋白连接酶CBL-B)编码区中的CAR，引起CBL-B敲除。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在SOCS2(E3泛素-蛋白连接酶CBL-B)编码区中的CAR，引起SOCS2敲除。在一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在CD56(NCAM1)编码区中的CAR。在另一个实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在PD1、CTLA4、LAG3和TIM3中的任一个的编码区中的CAR，引起***位点处的基因敲除。在另外的实施例中，包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞具有***在TIGIT的编码区中的CAR，引起TIGIT敲除。
因此，本文提供的包含从分化的基因组工程化iPSC中获得的衍生细胞，其中iPSC和衍生细胞两者至少包括BCMA-CAR。还提供了iPSC以及包括BCMA-CAR和一种或多种另外的修饰模式的衍生细胞，所述一种或多种另外的修饰模式包含但不限于对除了BCMA之外的靶标具有特异性的第二CAR；CD38敲除；hnCD16；外源性细胞因子信号传导组分；具有HLA-G、CD58和CD54中的至少一个的过表达的HLA-I和/或HLA-II缺陷；TCR无效；表面呈递CD3；抗原特异性TCR；NKG2C；DAP10/12；NKG2C-IL15-CD33(“2C1533”)，如本说明书中进一步详述的。
2.CD38敲除
细胞表面分子CD38在多种血液恶性病中高度上调，所述血液恶性病衍生自淋巴和骨髓谱系两者，包含多发性骨髓瘤和CD20阴性B细胞恶性肿瘤，其使用以使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为有吸引力的标靶。抗体介导的癌细胞耗竭通常可归因于免疫效应机制，例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)的直接细胞凋亡诱导和活化的组合。除ADCC以外，与治疗抗体协同作用的免疫效应机制还可以包含吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
除在恶性细胞上高度表达外，CD38也在浆细胞上以及NK细胞和活化的T细胞和B细胞上表达。在造血期间，CD38在CD34+干细胞和淋巴、红细胞和骨髓的谱系定向祖细胞上表达，并且在成熟的最后阶段持续到浆细胞阶段。作为II型跨膜糖蛋白，CD38既作为受体，又作为参与核苷酸代谢物产生的多功能酶执行细胞功能。作为一种酶，CD38催化从NAD+到ADP-核糖的反应的合成和水解，从而产生二级信使CADPR和NAADP，它们刺激钙从内质网和溶酶体中释放，这对钙依赖的细胞粘附过程至关重要。作为受体，CD38识别CD31并且调控活化NK细胞中的细胞因子释放和细胞毒性。据报道，CD38与脂筏中的细胞表面蛋白结合以调节细胞质Ca2+通量，并介导淋巴和骨髓细胞中的信号转导。
在恶性肿瘤治疗中，全身性地使用CD38抗原结合受体转导的T细胞已显示裂解CD34+造血祖细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的CD38+级分，导致因为接受者免疫效应细胞功能受损而使得治疗反应不完全并且功效降低或消除。另外，在用达土木单抗、CD38特异性抗体治疗的多发性骨髓瘤患者中，尽管其它免疫细胞类型(例如T细胞和B细胞)不管其CD38表达如何都不受影响，但观测到骨髓和外周血两者中NK细胞减少(Casneuf等人,《血液研究进展(Blood Advances.)》2017；1(23):2105-2114)。在不受理论限制的情况下，包括如所提供的BCMA-CAR的CD38无效效应细胞可以克服CD38介导的互相杀伤并且避免特异性抗体和/或CD38抗原结合结构域诱导的效应细胞耗尽或减少。另外，由于CD38在活化的淋巴细胞如T细胞或B细胞上被上调，如达土木单抗等CD38特异性抗体可以用于消除活化的淋巴细胞或抑制这些淋巴细胞在适应性同种异体效应细胞的接受者中的活化，条件是CD38无效，使得可以减少和/或预防宿主淋巴细胞对这些效应细胞的同种异体排斥，并且可以增加这些效应细胞的存活和持久性，尽管存在用于淋巴耗尽的CD38抗体。如此，本申请还提供了通过使用CD38特异性抗体、所分泌的CD38特异性衔接子或CD38 CAR(嵌合抗原受体)对接受者T细胞和B细胞的激活和/或消除激活的接受者T细胞和B细胞来增强效应细胞持久性和/或存活同时降低或防止同种异体排斥的策略。具体地，如所提供的策略包含产生iPSC系和制造具有BCMA-CAR和CD38敲除的iPSC克隆细胞库，并通过对工程化的iPSC系的定向分化获得BCMA-CAR表达和CD38无效(BCMA-CAR CD38-/-)衍生效应细胞。在本申请之前，考虑到CD38在如上所述的细胞发育生物学和细胞功能中发挥许多关键作用，尚不清楚在涉及BCMA-CAR和/或CD38敲除的iPSC中的编辑是否会扰乱任何方面，所述方面包含iPSC分化、衍生细胞表型和效应细胞功能。
在如本文所提供的一个实施例中，iPSC系中的CD38敲除是双等位基因基因敲除。如本文所公开，所提供的CD38无效iPSC系能够定向分化以产生功能性衍生造血效应细胞。在一些实施例中，衍生造血效应细胞包含但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，衍生造血效应细胞具有天然来源的T、NK或NKT细胞或任何其它免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征。在一些实施例中，当CD38抗体用于诱导ADCC或CD38 CAR用于靶向杀伤细胞时，CD38-/-iPSC和/或其衍生效应细胞不会被所述CD38抗体或CD38 CAR消除，从而增加iPSC和其效应细胞在此类治疗剂存在的情况下和/或暴露于此类治疗剂之后的持久性和/或存活率。在一些实施例中，效应细胞在存在此类治疗剂的情况下和/或在暴露于此类治疗剂之后具有增加的体内持久性和/或存活。在一些实施例中，CD38无效效应细胞是源自iPSC的NK细胞。在一些实施例中，CD38无效效应细胞是源自iPSC的T细胞。在一些实施例中，CD38无效iPSC和衍生细胞包括一种或多种如本文所描述的另外的基因组编辑，包含但不限于外源性CD16或其变体的表达、CAR表达、细胞因子/细胞因子受体表达、HLAI和/或HLAII敲除，以及所提供的另外的模式。
在另一个实施例中，在CD38中的所选位置处***包含如本文所提供的BCMA-CAR的一个或多个转基因的同时敲除CD38可以通过例如靶向CD38的敲入/敲除(CD38-KI/KO)构建体实现(图2A-D)。在所述构建体的一些实施例中，构建体包括一对CD38靶向同源臂，用于CD38基因座内的位置选择性***。在一些实施例中，预选的靶向位点位于CD38的外显子内。本文所提供的CD38-KI/KO构建体允许转基因在CD38内源性启动子下或在包含在构建体中的外源性启动子下表达。当两个或更多个转基因将被***在CD38基因座中的所选位置处时，连接子序列(例如，2A连接子或IRES)被置于任何两个转基因之间。2A连接子编码源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的自切割肽(分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”)，使得从单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包含绝缘体以降低转基因和/或外源启动子沉默的风险。包含在CD38-KI/KO构建体中的外源性启动子可以是CAG或其它组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子，包含但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。图3和图4证明了构建体的示例性序列，所述构建体被设计成***hnCD16和IL15RF(在这个特定实例中为截短的IL15RF)两者在CD38基因座处的所选位置中，由CAG启动子驱动(图3)或由CD38内源性启动子驱动(图4)，同时敲除CD38表达。如附图中所提供的并且如本领域的普通技术人员所理解的，包含在图3和图4中所示的构建体中的组分中的一些组分不是必需的，使得所述组分是任选的，并且一些所包含组分的核酸序列可以变化并且可以与如附图中所提供的每种组分或整个构建体的示例性核酸序列具有小于约95％、90％、85％、80％、75％、70％但是大于50％的序列同一性。在一个实施例中，将BCMA-CAR***在CD38基因座以同时敲除iPSC中的CD38。因此，本发明进一步提供了包括BCMA-CAR和CD38敲除的iPSC及其衍生细胞。
3.外源引入的CD16或其变体
CD16已鉴别为两种同功异构物：Fc受体FcγRIIIa(CD16a；NM_000569.6)和FcγRIIIb(CD16b；NM_000570.4)。CD16a为由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以活化NK细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CD16b仅由人类嗜中性粒细胞表达。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“高亲和力不可裂解的CD16”是指各种CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外域脱落，这是一种蛋白水解裂解过程，其在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V(在一些公开案中也被称为F158V)是具有高亲和力的例示性CD16多态变体；然而S197P变体是基因工程化CD16的不可切割型式的实例。包括F176V和S197P两者的工程化CD16变体具有高亲和力，并且不可切割，其更详细地描述于WO2015/148926中，并且其完整公开内容以引入的方式并入本文中。另外，CD16的胞外结构域基本上被至少一部分CD64胞外结构域置换的嵌合CD16受体也可实现能够进行ADCC的CD16受体的所期望的高亲和力和不可切割特点。在一些实施例中，嵌合CD16的置换胞外域包括以下中的一种或多种：CD64的EC1、EC2和EC3外显子(UniPRotKB_P12314或其同功异构物或多态变体)。
因此，高亲和力不可裂解的CD16受体(hnCD16)在一些实施例中包含F176V和S197P两者；并且在一些实施例中包括F176V，其中消除了裂解区域。在一些其它实施例中，hnCD16包括在与各自包括至少一部分CD64胞外域的示例性序列SEQ ID NO.7、8和9中的任一个比较时，具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其间的任何百分比的一致性的序列。SEQ ID NO.7、8和9分别由示例性SEQ ID NO.10-12编码。如本文和整个本申请中所用，考虑需要引入以对两个序列进行最佳比对的间隙数目和每个空隙的长度，两个序列之间的一致性百分比是序列共用的一致位置数目的函数(即，一致性％＝一致位置数/位置总数×100)。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的确定可以使用所属领域中公认的数学算法实现。
SEQ ID NO.7:
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340a.a.基于CD64结构域的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO.8
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336a.a.基于CD64外显子的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO.9
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335a.a.基于CD64外显子的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO.10
Figure BDA0003637988930000411
SEQ ID NO.11
Figure BDA0003637988930000412
Figure BDA0003637988930000421
SEQ ID NO.12
Figure BDA0003637988930000422
因此，本文提供克隆iPSC，其经过基因工程化以在如本文所涵盖和描述的其它编辑中包括外源性CD16或其变体，其中基因工程化iPSC能够分化成包括引入到iPSC中的相同外源性CD16的效应细胞。在一些实施例中，外源性CD16是高亲和力不可切割CD16受体(hnCD16)。在iPSC或其衍生细胞中表达的外源性hnCD16在不仅与ADCC抗体或其片段结合而且与识别所述hnCD16的CD16或CD64胞外结合结构域的双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子结合中具有高亲和力。双特异性、三特异性或多特异性接合体或结合子在以下本申请中进一步描述(参见I.7部分)。因此，本申请提供衍生效应细胞或其细胞群，其通过与在衍生效应细胞上表达的hnCD16的胞外结构域的高亲和力结合，以对于治疗如以下V部分中进一步详述的病况、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选ADCC抗体，其中所述hnCD16包括CD64或具有F176V和S197P的CD16的胞外结合性结构域。
在一些其它实施例中，进一步修饰或置换外源性CD16的天然CD16跨膜结构域和/或胞内结构域，使得产生嵌合Fc受体(CFcR)以包括非天然跨膜结构域、非天然刺激性结构域和/或非天然信号传导结构域。本文所使用的术语“非天然”意指除提供胞外结构域的受体外，跨膜结构域、刺激结构域或信号传导结构域源自不同受体。在本文的说明中，基于CD16或其变体的CFcR不具有源自CD16的跨膜结构域、刺激结构域或信号传导结构域。在一些实施例中，基于CD16的CFcR包括源自以下的非天然跨膜结构域：CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体多肽。在一些实施例中，基于CD16的CFcR包括源自以下的非天然刺激性/抑制性结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA4或NKG2D多肽。在一些实施例中，基于CD16的CFcR包括源自以下的非天然信号传导结构域：CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。在外源性CD16的一个实施例中，所提供的嵌合受体包括源自IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C和NKG2D多肽中的一种的跨膜结构域和信号传导结构域两者。基于CD16的嵌合Fc受体的一个特定实施例包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激性结构域和CD3ζ的信号传导结构域；其中基于CD16的嵌合Fc受体的胞外结构域源自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的胞外结构域包括F176V和S197P。基于CD16的嵌合Fc受体的另一个实施例包含CD3ζ的跨膜结构域和信号传导结构域；其中基于CD16的嵌合Fc受体的胞外结构域源自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的胞外结构域包括F176V和S197P。
如上所述的基于CD16的嵌合Fc受体的各种实施例能够以高亲和力结合到抗体或其片段的Fc区；或者结合到双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子的Fc区。结合后，嵌合受体的刺激结构域和/或信号传导结构域实现效应细胞的活化和细胞因子分泌，并且杀死由抗体或具有肿瘤抗原结合组分以及Fc区的所述双特异性、三特异性或多特异性接合体或结合子靶向的肿瘤细胞。在不受理论限制的情况下，通过非天然跨膜结构域、刺激性结构域和/或信号传导结构域，或通过与基于CD16的嵌合Fc受体的胞外结构域结合的衔接子，CFcR可以有助于效应细胞的杀伤能力，同时增加效应细胞的增殖和/或扩增潜能。抗体和接合体可使表达抗原的肿瘤细胞和表达CFcR的效应细胞紧密接近，这也有助于增强肿瘤细胞的杀伤。双特异性、三特异性、多特异性接合体或结合子的示例性肿瘤抗原包含(但不限于)B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。适于在攻击肿瘤细胞时接合表达基于CD16的CFcR的效应细胞的一些非限制性例示性双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子包含CD16(或CD64)-CD30、CD16(或CD64)-BCMA、CD16(或CD64)-IL15-EPCAM和CD16(或CD64)-IL15-CD33。
不同于NK细胞激活之后从细胞表面切割的原代NK细胞表达的内源性CD16，衍生NK中CD16的各种不可切割型式避免CD16脱落，并且维持恒定表达。在衍生NK谱系细胞中，不可切割的CD16增加TNFα和CD107a的表达，表明细胞功能得到改善。不可裂解的CD16还增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及双特异性、三特异性或多特异性接合体的接合。ADCC是通过将CD16结合到抗体涂布的靶细胞的NK细胞介导的裂解的机制。在向需要细胞疗法的受试者施用细胞之前，衍生NK细胞中引入的hnCD16的另外高亲和力特性也允许通过hnCD16将ADCC抗体体外负载到NK细胞。如所提供，hnCD16可以在一些实施例中包括F176V和S197P，或可以包括源自如由SEQ ID NO:7、8或9所例示的CD64的全部或部分胞外域，或可以进一步包括非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所公开，本申请还提供衍生效应细胞或其细胞群，其以对于治疗如以下文进一步详述的病况、疾病或感染效应子用途足够的量预负载有一种或多种预选ADCC抗体。在一些实施例中，包括hnCD16的衍生效应细胞进一步包括如本文所提供的BCMA-CAR。在一些实施例中，包括BCMA-CAR、hnCD16的衍生效应细胞进一步包括CD38敲除。在一些实施例中，包括BCMA-CAR、hnCD16和CD38敲除的衍生效应细胞预加载有CD38抗体。
在一些实施例中，预加载的CD38抗体是达土木单抗。
不同于原代NK细胞，来自原代来源(即，天然/原生来源，例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟T细胞不表达CD16。出人意料的，包括所表达的外源性CD16的iPSC不损害T细胞发育生物学，并且能够分化成功能衍生T谱系细胞，其不仅表达外源性CD16，而且能够通过所获得ADCC机制执行功能。衍生T谱系细胞中这一所获ADCC可另外用作双靶向和/或挽救伴随CAR-T细胞疗法常出现的抗原逃逸的方法，其中肿瘤随着靶向CAR-T的抗原表达或突变抗原表达减少或损失以避免被CAR(嵌合抗原受体)识别而复发。当所述衍生T谱系细胞通过外源CD16表达包括获得的ADCC时，并且当抗体靶向与CAR靶向的抗原不同的肿瘤抗原时，抗体可用于挽救CAR-T抗原逃逸并且减少或防止CAR-T治疗中常见的靶向肿瘤的复发或再现。减少和/或防止抗原逃逸同时实现双靶向的这种策略同样适用于表达一种或多种CAR的NK谱系细胞或任何人造效应细胞。下文进一步叙述可用于这种抗原逃逸减少和防止策略的各种CAR。
因此，本发明提供一种包括外源性CD16的衍生T谱系细胞。在一个实施例中，在本文中获得的衍生T谱系细胞包括BCMA-CAR和外源性CD16。在另外的所提供的实施例中，除了hnCD16和BCMA-CAR的表达之外，在本文中获得的衍生T谱系细胞还包括CD38敲除。在一些实施例中，衍生T谱系细胞中包含的hnCD16包括F176V和S197P。在一些其它实施例中，衍生T谱系细胞中包含的hnCD16包括源自如由SEQ ID NO:7、8或9所例示的CD64的全部或部分胞外结构域，或可进一步包括非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所解释，这类衍生T谱系细胞具有获得性机制以用由ADCC介导的单克隆抗体靶向肿瘤，从而增强抗体的治疗效果。如所公开，本申请还提供衍生T谱系细胞或其细胞群，其以对于治疗如以下文进一步详述的病况、疾病或感染效应子用途足够的量预负载有一种或多种预选ADCC抗体。在一些其它实施例中，表达hnCD16和BCMA CAR的衍生T谱系细胞也是CD38无效，使得细胞可以避免在存在靶向肿瘤抗原CD38的治疗剂的情况下时被消除。在一个实施例中，所述靶向肿瘤抗原CD38的治疗剂是CD38抗体。在另一个实施例中，所述靶向肿瘤抗原CD38的治疗剂是包括CD38结合区的CAR，例如抗CD38scFV。
4.外源引入的细胞因子和/或细胞因子信号传导
通过避免全身性高剂量给予临床相关的细胞因子，由于这类实践的剂量限制性毒性的风险降低，同时建立细胞因子介导的细胞自主性。为了实现淋巴细胞自主性而不需要另外施用可溶性细胞因子，将编码包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21中的一种或多种的部分或全部肽、其受体中的一种或多种受体的部分或全部肽以及其任何组合的蛋白质复合物的多核苷酸引入到细胞以启用细胞因子信号传导，从而维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能，并且降低细胞因子毒性的风险。在一些实施例中，在细胞表面上表达用于细胞因子信号传导的所引入细胞因子和/或其相应的天然或修饰受体。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。
图1呈现了使用IL15作为说明性实例的若干种构建体设计。图1中的设计中的任何设计的跨膜(TM)结构域对于IL15受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
设计1：IL15和IL15Rα通过使用自切割肽共表达，模拟IL15的反式呈递而不消除IL15的顺式呈递。
设计2：IL15Rα通过接头在C端与IL15融合，模拟反式呈递而不消除IL15的顺式呈递并且确保IL15膜结合。
设计3：具有截短的胞内结构域的IL15Rα通过连接子在C端与IL15融合，模拟IL15的反式呈递，维持IL15膜结合，并且另外消除顺式呈递和/或由正常IL15R通过其胞内结构域介导的任何其它潜在信号转导通路。IL15Rα的胞内结构域已被认为对于在IL15响应细胞中表达的受体和对于扩增和起作用的响应细胞至关重要。这种截短构建体包括与SEQ IDNO:17至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:18表示的示例性核酸序列编码。在截短IL15/IL15Rα的一个实施例中，构建体不包括SEQ IDNO:17的最后4个氨基酸“KSRQ”，并且包括与SEQ ID NO:21至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379a.a.；信号肽和连接肽加下划线)
SEQ ID NO:18
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCTGGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGCCCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATGCCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGCACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCTCCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTGCTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA(1140个氨基酸)
SEQ ID NO:21
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYL
(375a.a.；信号肽和连接肽加下划线)
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和连接子序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或连接子的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或连接子序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或连接子序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由连接子连接的功能肽的活性。
设计4：因为设计3构建体展示在促进效应细胞存活和扩增中具有功能，证明IL15Rα的细胞质域可省略而不会对这类设计中配备有IL15信号传导复合物的效应细胞的自主构件产生负面影响，设计4是提供设计3的另一起作用的替代方案的构建体，除Sushi结构域以外，基本上完整IL15Rα从所述设计3中去除，在一端与IL15融合，并且在另一端与跨膜结构域融合(mb-Sushi)，任选地利用Sushi结构域与反式膜域之间的接头。融合的IL15/mb-Sushi通过任何膜结合蛋白的跨膜结构域在细胞表面上表达。在例如设计4的构建体的情况下，在只保留所期望的IL15的反式呈递时，消除通过IL15Rα的不必要的信号传导，包含顺式呈递。在一些实施例中，包括与Sushi结构域融合的IL15的组分包括与SEQ ID NO:19至少75％、80％、85％、90％、95％或99％一致的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:20表示的示例性核酸序列编码。
SEQ ID NO:19
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(242a.a.；信号肽和连接肽加下划线)
SEQ ID NO:20
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGA
(726个氨基酸)
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和连接子序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或连接子的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或连接子序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或连接子序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由连接子连接的功能肽的活性。
设计5：原生或修饰的IL15Rβ通过接头在C端与IL15融合，实现组成性信号传导并且维持IL15膜结合和反式重呈递。
设计6：原生或修饰的共同受体γC通过接头在C端与IL15融合以用于细胞因子的组成性信号传导和结合膜的反式呈递。共同受体γC也被称为共同γ链或CD132，也称为IL2受体亚基γ或IL2RG。γC是许多白介素受体的受体复合体所共有的细胞因子受体亚基，所述白介素受体包含但不限于IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21受体。
设计7：在缺乏IL15的情况下形成同源二聚体的工程化IL15Rβ适用于产生细胞因子的组成性信号传导。
在一些实施例中，可以使用图1中的设计中的一个或多个设计将细胞因子IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21和/或其受体中的一种或多种引入到iPSC中，并且在iPSC分化后引入到其衍生细胞中。在一些实施例中，IL2或IL15细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些实施例中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体。在一些实施例中，IL7表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体，例如IL4受体。图1中的设计中的任何设计的跨膜(TM)结构域对于相应细胞因子受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
在包括CAR和外源细胞因子两者和/或细胞因子受体信号传导的iPSC和其衍生细胞中，CAR和IL可以在单独构建体中表达，或可以在包括CAR和IL两者的双顺反子构建体中共表达，并且IL可以是任何细胞因子、细胞因子受体、其变体或其组合。在一些另外的实施例中，呈图1中的构建体设计中的任何构建体设计表示的形式的IL15可以通过如例如CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR所示的自我切割2A编码序列与CAR表达构建体的5'端或3'端连接。因此，IL15和CAR处于单一开放阅读框(ORF)中。在一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计3中的IL15。在另一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计3中的IL15。在又另一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计7中的IL15。当表达CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR时，自我裂解2A肽允许所表达的CAR和IL15解离，并且然后可在细胞表面呈递解离的IL15。CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR双顺反子设计在时间和数量上以及在可选择以并入例如诱导性启动子以表达单一ORF的相同控制机制下允许配位的CAR和IL15表达。自切割肽发现于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae virus family)的成员中，包含口疮病毒属(aphthovirus)，例如***病毒(foot-and-mouth disease virus；FMDV)、马鼻炎A病毒(equine rhinitis A virus；ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus；TaV)和猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1；PTV-I)(Donnelly,ML,等人,《普通病毒学期刊(J.Gen.Virol)》,82,1027-101(2001)；Ryan,MD,等人,《普通病毒学期刊》,72,2727-2732(2001))；和心病毒属(cardiovirus)，例如泰勒病毒(Theilovirus)(例如，泰勒鼠类脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的2A肽有时也分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。
用于IL15的如本文所公开的双顺反子结构CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR实施例还可用于表达本文所提供的任何其它细胞因子，例如IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18和IL21。在一些实施例中，IL2细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些其它实施例中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体和/或细胞因子特异性受体。
5.HLA-I和HLA-II缺乏
必须在同种异体受体中匹配多种HLA I类和II类蛋白质以获得组织相容性，从而避免同种异体排斥反应问题。本文提供一种iPSC细胞系和由其分化的衍生细胞，其中消除或大体上减少HLA I类和HLA II类蛋白质的表达。HLA I类缺陷可以通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或使HLA I类相关基因(包含不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因和TAP相关蛋白)缺失或表达水平降低来实现。例如，B2M基因编码所有HLA I类异二聚体的细胞表面表达所必需的共同亚单位。B2M无效细胞是HLA-I缺陷的。HLA II类缺陷可以通过使HLA-II相关基因(包含不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)发生功能缺失或降低来实现。CIITA是通过II类蛋白质表达所需的转录因子RFX5的活化起作用的转录共激活子。CIITA无效细胞是HLA-II缺陷的。本文提供一种具有HLA-I和HLA-II缺乏两者，例如缺少B2M和CIITA表达两者的iPSC系及其衍生细胞，其中所获得的衍生效应细胞通过消除对MHC(主要组织相容性复合物)匹配的需要实现同种异体细胞疗法，并且避免宿主(同种异体)T细胞的识别和杀伤。
然而，对于一些细胞类型，缺乏I类表达导致被NK细胞溶解。为克服这种“自我缺失”反应，HLA-G可任选地基因敲入以避免NK细胞识别和杀死源自工程化的iPSC的HLA-I缺陷型效应细胞。在一个实施例中，所提供的HLA-I缺陷型iPSC及其衍生细胞进一步包括HLA-G敲入。可替代地，在一个实施例中，所提供的HLA-I缺陷型iPSC及其衍生细胞进一步包括CD58敲除和CD54敲除中的一者或两者。CD58(或LFA-3)和CD54(或ICAM-1)为起始信号依赖性细胞相互作用并且有助于细胞(包含免疫细胞)迁移的粘附蛋白。在本发明之前，未知的是iPSC中的CD58和/或CD54破坏是否以及如何影响定向iPSC分化为功能性免疫效应细胞(包含T细胞和NK细胞)中的多能细胞和发育生物学。之前还未知的是，CD58和/或CD54敲除是否可以有效和/或充分降低HLA-I缺陷型iPSC衍生的效应细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性。这里表明CD58敲除在减少同种异体NK细胞活化方面具有比CD54敲除更高的效率；而CD58和CD54两者的双敲除对NK细胞活化的减少作用最强。在一些观测中，相比于HLA-I缺陷型细胞在克服“自我缺失”作用中的HLA-G过表达，CD58和CD54双基因敲除甚至更有效。
如上文所提供，在一些实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞具有编码HLA-G的外源性多核苷酸。在一些实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞为CD58剔除型。在一些其它实施例中HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞为CD54剔除型。在又一些其它实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC及其衍生细胞是CD54无效和CD54无效。另外，在包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是HLA-I和HLA-II缺陷的并且具有编码HLA-G的外源性多核苷酸。在包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是HLA-I和HLA-II缺陷的并且是CD58无效的。在包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞的一些实施例中，所述细胞是HLA-I和HLA-II缺陷的并且是CD54无效的。在包括BCMA-CAR的iPSC及其衍生细胞的又一些其它实施例中，所述细胞是HLA-I和HLA-II缺陷的，并且两者都是CD58无效和CD54无效的。
6.本文提供的基因工程化iPSC系和衍生细胞
鉴于上述内容，本申请提供了iPSC、iPS细胞系细胞或其群体，以及从分化所述iPSC获得的衍生功能效应细胞，其中每个细胞包括BCMA-CAR。在一些实施例中，本申请提供了iPSC、iPS细胞系细胞或其群体，以及从分化所述iPSC获得的衍生效应细胞，其中每个细胞包括编码BCMA-CAR的至少外源性多核苷酸。在一些实施例中，功能性衍生细胞是造血细胞。在一些实施例中，功能性衍生细胞是包含但不限于：具有永久性造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，功能衍生造血细胞包括效应细胞，例如T细胞、NK细胞和调控细胞。在一些实施例中，功能衍生造血细胞包括效应细胞，所述效应细胞具有天然来源的T、NK或NKT细胞或任何其它免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征。
本文中还提供了CD38-/-(本文中也称为“CD38无效”或CD38敲除)iPSC、iPS细胞系细胞或其群体，以及包括从CD38-/-iPSC的分化获得的CD38敲除的衍生功能性衍生细胞。在一些实施例中，CD38-/-iPSC、iPS细胞系细胞或其群体以及衍生的功能性衍生细胞进一步包括编码BCMA-CAR的外源性多核苷酸。在一些实施例中，编码BCMA-CAR的多核苷酸位于CD38基因座处。在一些实施例，包括BCMA-CAR和CD38敲除的功能性衍生细胞是造血细胞。在一些实施例中，包括BCMA-CAR和CD38敲除的功能性衍生细胞是具有永久性造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、髓样细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，功能衍生造血细胞包括效应细胞，例如T细胞、NK细胞和调控细胞。在一些实施例中，功能衍生造血细胞包括效应细胞，所述效应细胞具有天然来源的T、NK或NKT细胞或任何其它免疫细胞中不存在或不典型的增强功能或结构特征。
本文进一步提供了包括编码BCMA-CAR的多核苷酸和编码高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)的多核苷酸的iPSC，其中所述iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。包括BCMA-CAR和hnCD16两者的细胞适于通过CAR结合和CD16介导的ADCC的双重靶向，由此增加肿瘤靶向精度、增强肿瘤杀伤并且使肿瘤抗原逃逸的影响最小化。进一步，在一些实施例中，包括BCMA-CAR和hnCD16的iPSC和/或其衍生效应细胞也是CD38无效的，使得当使用CD38抗体来诱导hnCD16介导的增强型ADCC时，包括CD38敲除、BCMA-CAR和hnCD16的iPSC和/或其衍生效应细胞可以靶向表达CD38的(肿瘤)细胞而不引起效应细胞消除，即减少或耗尽表达CD38的效应细胞，从而增加iPSC和其效应细胞的持久性和/或存活率。包括BCMA-CAR、CD38无效和外源性CD16的iPSC衍生的效应细胞在存在CD38抗体或CD38 CAR的情况下细胞消耗减少；已经获得或增强ADCC，从而提供用于肿瘤杀伤的多种机制。
本文提供了包括编码BCMA-CAR的多核苷酸和编码具有不同于BCMA的靶特异性的第二嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸的iPSC，其中所述iPSC能够定向分化以产生具有两个靶向两种不同肿瘤抗原的CAR的功能性衍生效应细胞。在一个实施例中，包含在包括BCMA-CAR的iPSC和其衍生效应细胞中的第二CAR靶向肿瘤细胞表面蛋白CD19、MICA/B、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1。在一个实施例中，iPSC和/或其衍生效应细胞具有靶向CD38的第二CAR，并且所述细胞也是CD38无效的。因此，由于CD38介导的互相杀伤，CD38-CAR不会导致iPSC和/或其衍生效应细胞的消除。在一些实施例中，包含在包括CD38敲除的iPSC和其衍生效应细胞中的CAR不靶向CD38。
另外提供了一种iPSC，其包括编码BCMA-CAR的多核苷酸和编码蛋白质复合物的多核苷酸，所述蛋白质复合物包括至少一种外源性细胞因子和/或细胞因子受体(IL)或其变体，以使细胞因子信号传导有助于细胞存活、持久性和/或扩增，其中所述iPSC系能够定向分化以产生具有改善的存活、持久性、扩增和效应细胞功能的功能性衍生造血细胞。外源引入的细胞因子信号传导包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的任何一种或两种或更多种的信号传导。在一些实施例中，用于细胞因子信号传导的细胞因子和/或其相应受体的所引入部分或全部肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施例中，细胞表面细胞因子/细胞因子受体的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、小环或包含mRNA的RNA。在一些实施例中，包含在BCMA-CAR iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体使得IL7信号传导能够进行。在一些实施例中，包含在BCMA-CAR iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体使得IL10信号传导能够进行。在一些实施例中，包含在BCMA-CAR iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体使得IL15信号传导能够进行。在所述BCMA-CAR IL iPSC的一些实施例中，IL15表达通过图1的构建体3进行。在所述BCMA-CAR IL iPSC的一些实施例中，IL15表达通过图1的构建体4进行。上述实施例的所述BCMA-CAR IL iPSC及其衍生细胞能够自主地维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应子功能，而不在体外或体内接触另外提供的可溶性细胞因子。在BCMA-CAR IL iPSC和其衍生效应细胞的一些实施例中，所述细胞是CD38无效的并且可以与CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不引起效应细胞的消除，从而协同增加iPSC和其效应细胞的持久性和/或存活率。
还提供了一种iPSC，其包括BCMA-CAR、B2M敲除和CIITA敲除，以及任选地HLA-G过表达、CD58敲除和CD54敲除中的一种，其中所述iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。所述BCMA-CAR B2M-/-CIITA-/-iPSC和其衍生效应细胞既是HLA-I缺陷的又是HLA-II缺陷的。在另外的实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型BCMA-CAR iPSC和其衍生效应细胞也是CD38无效的，并且可以与CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不会导致效应细胞消除，从而增加iPSC和其效应细胞的持久性和/或存活率。在一些实施例中，效应细胞在体内具有增加的持久性和/或存活。
鉴于上述内容，本文提供的包含包括BCMA-CAR以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种的iPSC：CD38敲除、hnCD16、第二CAR、外源性细胞因子/受体和B2M/CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G或CD58和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸，并且其中所述iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。本申请还包含功能性iPSC衍生的造血细胞，其包括BCMA-CAR，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、外源性CD16、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞因子/受体蛋白质复合物；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G或CD58和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸。在一些实施例中，衍生造血细胞包含但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些其它实施例中，衍生造血细胞是具有在NK、T或NKT或天然来源的任何其它免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征的效应细胞。
本文提供的另一方面包含包括IL15和IL15Rα的截短融合蛋白的iPSC或iPSC衍生的细胞，其中融合蛋白不包括胞内结构域。在图1中显示为“IL15Rα(ΔICD)融合”和“IL5/mb-Sushi”，这些实施例贯穿本申请进一步统一缩写为IL15Δ并且是表1中展示的“IL”的实施例之一。在“IL”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括与SEQ ID NO:17、19或21具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在包括缺乏胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白(IL15Δ)的iPSC或iPSC衍生的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包括BCMA-CAR以及任选地以下中的一种或多种：CD38敲除、hnCD16、第二CAR、外源性细胞因子/受体和B2M/CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G或CD58和CD54敲除中的一种的多核苷酸，并且其中所述iPSC能够定向分化以产生功能性衍生造血细胞。在一些实施例中，衍生造血细胞包含但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些其它实施例中，衍生造血细胞是具有在NK、T或NKT或天然来源的任何其它免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征的效应细胞。
因此，本申请提供了iPSC和其功能衍生造血细胞，所述iPSC和其功能衍生造血细胞包括表1中的以下基因型中的任一种。如在本申请的表1中提供的“CAR(2nd)”表示具有不同于BCMA-CAR的靶向特异性的CAR，并且非限制性实例包含靶向以下中的至少一者的CAR：CD19、MICA/B、CD20、CD22、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1。如表1中提供的“IL”代表以下之一：IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21，这取决于选择哪种特异性细胞因子/受体表达。另外，“IL”还涵盖IL15Δ实施例，所述实施例在上文详述为IL15和IL15Rα的截短的融合蛋白，但没有胞内结构域。另外，当iPSC及其功能性衍生造血细胞具有包括CAR(BCMA-CAR或第二CAR)和IL两者的基因型时，在所述细胞的一个实施例中，CAR和IL包含在包括2A序列的双顺反子表达盒中。相比而言，在一些其它实施例中，CAR和IL在包含于iPSC和其功能性衍生造血细胞中的单独表达盒中。在一个特定实施例中，包含在表达CAR和IL两者的iPSC以及其功能性衍生效应细胞中的是图1的构建体3或4中的IL15，其中所述IL15构建体包含在与CAR一起或与CAR分开的表达盒中。
表1：所提供的细胞的适用的示例性基因型：
表1
Figure BDA0003637988930000551
Figure BDA0003637988930000561
Figure BDA0003637988930000571
Figure BDA0003637988930000581
Figure BDA0003637988930000591
Figure BDA0003637988930000601
7.另外的修饰
在一些实施例中，包括表1中的基因型中的任一种的iPSC和其衍生效应细胞可以另外地包括TAP1、TAP2、Tap相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段或变体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
双特异性衔接子或多特异性衔接子是由不同抗体的两个或更多个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白，其中至少一个scFv与效应细胞表面分子结合，并且至少另一个通过肿瘤特异性表面分子与肿瘤细胞结合。可以用于双特异性或多特异性衔接子识别或偶联的示例性效应细胞表面分子或表面触发受体包含但不限于CD3、CD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C和如本文所公开的嵌合Fc受体。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于接合体识别的CD16是hnCD16，其包括如I.2部分中所描述的CD16(含有F176V和任选地S197P)或CD64胞外结构域以及天然或非天然的跨膜结构域、刺激结构域和/或信号传导结构域。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于接合体识别的CD16是基于CD16的嵌合Fc受体(CFcR)。在一些实施例中，基于CD16的CFcR包括NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激性结构域和CD3ζ的信号传导结构域；其中hnCD16的胞外结构域源自CD64或CD16的胞外结构域的全长或部分序列；并且其中CD16的胞外结构域包括F176V和任选地S197P。用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包含但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘蛋白、ROR1。在一个实施例中，双特异性抗体是CD3-CD19。在另一个实施例中，双特异性抗体是CD16-CD30或CD64-CD30。在另一个实施例中，双特异性抗体为CD16-BCMA或CD64-BCMA。在仍另一个实施例中，双特异性抗体是CD3-CD33。在又另一个实施例中，双特异性抗体进一步包括位于效应细胞与肿瘤细胞抗原结合结构域之间的连接子，例如，作为效应NK细胞的连接子(在一些出版物中被称为TriKE或三特异性杀伤衔接子)以促进效应细胞扩增的经修饰的IL15。在一个实施例中，TriKE为CD16-IL15-EPCAM或CD64-IL15-EPCAM。在另一个实施例中，TriKE为CD16-IL15-CD33或CD64-IL15-CD33。在又另一个实施例中，TriKE是NKG2C-IL15-CD33(“2C1533”)。
在一些实施例中，用于双特异性或多特异性衔接子的表面触发受体对于效应细胞可以是内源性的，有时视细胞类型而定。在一些其它实施例中，可以使用本文所提供的方法和组合物将一种或多种外源性表面触发受体引入到效应细胞中，即通过对包括表1中列出的基因型的iPSC进行另外的工程化，然后指导iPSC的分化成T细胞、NK细胞或包括与源iPSC相同的基因型和表面触发受体作为源iPSC的任何其它效应细胞。
8.用于免疫疗法的抗体
在一些实施例中，除如本文所提供的基因组工程化效应细胞之外，包括靶向与病况、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段的另外治疗剂可在组合疗法中与这些效应细胞一起使用。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的iPSC衍生的效应细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的iPSC衍生的效应细胞的另外的治疗剂进行组合治疗的抗体包含但不限于CD20抗体(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、HER2抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、CD52抗体(阿仑单抗)、EGFR抗体(西妥昔单抗)、GD2抗体(迪努妥昔单抗)、PDL1抗体(阿维鲁单抗)、CD38抗体(达土木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、CD123抗体(7G3、CSL362)、SLAMF7抗体(埃罗妥珠单抗)、MICA/B抗体(7C6、6F11、1C2)及其人源化或经Fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。在一些实施例中，iPSC衍生的效应细胞包括造血谱系细胞，其包括表1中所列的基因型。在一些实施例中，iPSC衍生的效应细胞包括NK细胞，其包括表1中所列的基因型。在一些实施例中，iPSC衍生的效应细胞包括T细胞，所述T细胞包括表1中列出的基因型。
在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括至少BCMA-CAR的iPSC衍生的NK或T细胞。在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些其它实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括至少BCMA-CAR和hnCD16的iPSC衍生的NK或T细胞。在用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括包含以下的iPSC衍生的NK或T细胞：至少BCMA-CAR、CD38无效和CD38抗体。在一个实施例中，所述组合包括包含以下的iPSC衍生的NK细胞：BCMA-CAR、CD38无效和hnCD16；以及CD38抗体之一、达土木单抗、伊沙妥昔单抗和MOR202。在一个实施例中，所述组合包括包含以下的iPSC衍生的NK细胞：BCMA-CAR、CD38无效和hnCD16以及达土木单抗。在一些另外的实施例中，包含在与达土木单抗的组合中的iPSC衍生的NK细胞包括BCMA-CAR CD38无效、hnCD16、IL15和靶向CD38的CAR或以下之一：CD19、MICA/B、CD20、CD22、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1之一；其中IL15与CAR共表达或分开表达；并且IL15呈图1的构建体1到7中呈现的形式中的任一种形式。在一些特定实施例中，当IL15与CAR共表达或分开表达时，其呈构建体3、4或7的形式。
9.检查点抑制剂
检查点是细胞分子，通常是细胞表面分子，在不被抑制时能够抑制或下调免疫反应。现在清楚的是，肿瘤选择某些免疫检查点路径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。检查点抑制剂(CI)是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子的活性，从而阻断抑制性检查点，恢复免疫***功能的拮抗剂。检查点抑制剂靶向PD1/PDL1或CTLA4的发展转变了肿瘤学前景，这些试剂提供多种适应症的长期缓解。然而，许多肿瘤亚型对检查点阻断疗法具有抗性，并且复发仍然是一个大问题。本申请的一个方面提供了一种通过包含如在与CI的组合疗法中提供的基因组工程化功能性衍生细胞来克服CI抗性的治疗方法。在组合疗法的一个实施例中，衍生细胞是NK细胞。在组合疗法的另一个实施例中，衍生细胞是T细胞。除了展现直接的抗肿瘤能力外，本文所提供的衍生NK细胞已显示出抵抗PDL1-PD1介导的抑制作用，并且具有增强T细胞迁移、将T细胞募集到肿瘤微环境并且增强肿瘤位点处的T细胞活化的能力。因此，由功能上有效的基因组工程化衍生NK细胞促进的T细胞的肿瘤浸润表明，所述NK细胞能够与T细胞靶向的免疫疗法(包含检查点抑制剂)协同作用，以缓解局部免疫抑制并且减少肿瘤负荷。
在一个实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生NK细胞包括BCMA-CAR，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当B2M被敲除时，任选地包含编码HLA-G或CD58或CD54敲除中的至少一种的多核苷酸。在一些实施例中，衍生NK细胞包括表1中列出的基因型中的任一种基因型。在一些实施例中，上述衍生NK细胞另外包括：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体功能或其片段或变体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
在另一个实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生T细胞包括BCMA-CAR，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当B2M被敲除时，任选地包含编码HLA-G或CD58或CD54敲除之一的多核苷酸。在一些实施例中，衍生T细胞包括表1中所列的任一种基因型。在一些实施例中，上述衍生T细胞另外包括：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、检查点抑制剂、抗体或功能片段或其变体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
上文所述的衍生NK或T细胞是从分化iPSC克隆系获得的，所述iPSC克隆系包括BCMA-CAR，以及任选地以下中的一种、两种、三种或全部四种：CD38敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子表达；其中当B2M被敲除时，任选地引入编码HLA-G或CD58和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸。在一些实施例中，上文所述iPSC克隆系进一步包括：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段或变体、衔接子和用于与双特异性衔接子、多特异性衔接子或通用衔接子偶联的表面触发受体。
用于与如本文所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的合适的检查点抑制剂包含但不限于PD1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG3(Lag3、CD223)、CTLA4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如，2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
在一些实施例中，抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包含Fab、Fab′、F(ab)′2、F(ab)′3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合片段(sdAb，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，所述一种或两种或三种或更多种检查点抑制剂包括以下中的至少一种：阿特珠单抗(PDL1 mAb)、阿维鲁单抗(PDL1 mAb)、度伐单抗(PDL1 mAb)、曲美木单抗(tremelimumab)(CTLA4 mAb)、伊匹单抗(CTLA4 mAb)、IPH4102(KIR抗体)、IPH43(MICA抗体)、IPH33(TLR3抗体)、利瑞木单抗(KIR抗体)、莫纳利珠单抗(NKG2A抗体)、纳武单抗(PD1 mAb)、派姆单抗(PD1 mAb)和其任何衍生物、功能等效物或生物仿制药。
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是基于微RNA的，因为发现许多miRNA作为控制免疫检查点的表达的调控因子(Dragomir等人,《癌症生物医学(CancerBiol Med.)》2018,15(2):103-115)。在一些实施例中，检查点拮抗性miRNA包含但不限于miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513和miR-29c。
与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的一些实施例包括至少一种检查点抑制剂以靶向至少一种检查点分子；其中衍生细胞具有表1中所列的基因型。与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的一些其它实施例包括两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在包括至少一种检查点抑制剂和具有表1中所列的基因型的衍生细胞的组合疗法的一些实施例中，所述检查点抑制剂是抗体、或人源化或Fc修饰的变体或片段、或其功能等效物或生物类似物，并且所述检查点抑制剂通过表达编码所述抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列由衍生细胞产生。在一些实施例中，编码抑制检查点的抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达，所述双顺反子构建体包括CAR和编码抗体或其片段的序列两者。在一些另外的实施例中，编码抗体或其片段的序列可通过自我裂解2A编码序列连接到CAR表达构建体的5'端或3'端，示出为例如CAR-2A-CI或CI-2A-CAR。因此，检查点抑制剂和CAR的编码序列在单一开放阅读框(ORF)中。当通过能够浸润肿瘤微环境(TME)的衍生效应细胞将检查点抑制剂以有效负载递送、表达和分泌时，其在接合TME后抵消抑制性检查点分子，从而允许利用例如CAR或活化受体的活化模式活化效应细胞。在一些实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂抑制以下检查点分子中的至少一种：PD1、PDL-1、TIM3、TIGIT、LAG3、CTLA4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。在一些实施例中，在具有表1中所列的基因型的衍生细胞中与CAR共表达的检查点抑制剂选自包括以下的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物仿制药。在一些实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物仿制药。在一些其它实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物仿制药。在一些其它实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物仿制药。
在包括本文所提供的衍生细胞和至少一种抑制检查点分子的抗体的组合疗法的一些其它实施例中，所述抗体不由衍生细胞或在衍生细胞中产生，并且在施用具有表1中所列的基因型的衍生细胞之前、同时或之后另外施用。在一些实施例中，在与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法中给予一种、两种、三种或更多种检查点抑制剂是同时或依序的。在包括具有表1中所列的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一个实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物仿制药中的一种或多种。在包括具有表1中所列的基因型的衍生效应细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。在包括具有表1中所列的基因型的衍生效应细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物仿制药。在包括具有表1中所列的基因型的衍生效应细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂是帕博利珠单抗或其人源化或Fc修饰的变体、片段和其功能等效物或生物类似物。
II.在iPSC中选定基因座处进行靶向基因组编辑的方法
如本文中可互换使用的基因组编辑(Genome editing/genomic editing)是一种类型的基因工程化，其中在靶细胞的基因组中***、缺失和/或置换DNA。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中的预选位点实现***、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源序列在***位点缺失时，可以因序列缺失而基因敲除或基因敲减包括受影响序列的内源基因。因此，靶向编辑还可以用于精确地破坏内源基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”，其是指一种涉及在使内源序列在***位点缺失或不缺失的情况下***一个或多个外源序列的过程。相比之下，随机整合的基因经历位置效应和沉默，使其表达不可靠且不可预测。例如，着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因沉默。相反，新整合的基因可影响周围的内源基因和染色质，从而潜在地改变细胞行为或有利于细胞转化。因此，将外源DNA***预选基因座(例如安全港基因座或基因组安全港(GSH))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制非常重要。可替代地，可以将外源性DNA***在预选的基因座中，其中预期破坏基因座处的基因表达，包含敲低和敲除。
可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现靶向编辑。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中，同源重组是通过宿主细胞的酶机制，由侧接所***的外源性多核苷酸的同源序列引导。
可替代地，可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶，特异性引入双链断裂(DSB)来以更高的频率实现靶向编辑。这类核酸酶依赖性靶向编辑是利用DNA修复机制，包含非同源末端连接(NHEJ)，其响应于DSB而发生。在不具有含有外源遗传物质的供体载体的情况下，NHEJ通常引起少量的内源核苷酸的随机***或缺失(***/缺失)。相比之下，当存在含有位于一对同源臂两侧的外源性遗传物质的供体载体时，可以在同源指导修复(HDR)期间通过同源重组将外源性遗传物质引入基因组中，从而导致“靶向整合”。在一些情况下，靶向整合位点旨在位于所选基因的编码区内，并且因此靶向整合可能破坏基因表达，从而导致在一个单一编辑步骤中同时敲入和敲除(KI/KO)。
在所关注基因座(GOI)的所选位置处***一个或多个转基因以同时敲除基因可以通过在图2A-D中例示的构建体设计来实现，所述构建体设计使用CD38基因座用于说明。适于同时敲入和敲除(KI/KO)的其它基因座包含但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。由于用于位置选择性***的相应CD38靶向同源臂，本文提供的构建体允许转基因在CD38内源性启动子下或在包含在构建体中的外源性启动子下表达(比较图2A与B以及C与D)。CD38基因座内的选择性***/敲除位置与包含在构建体中的侧翼左同源臂和右同源臂(LHA/CD38和RHA/CD38)的序列相容。根据CD38基因座内的预选的靶向位点，LHA/CD38和RHA/CD38可以具有可变的长度和序列。在一些实施例中，预选的靶向位点位于CD38的外显子内。当两个或更多个转基因将被***在CD38基因座中的所选位置处时，连接子序列(例如，2A连接子或IRES)被置于任何两个转基因之间。2A连接子编码源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的自切割肽(分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”)，使得从单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包含绝缘体以降低转基因和/或外源启动子沉默的风险。外源启动子可以是CAG，或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性和/或细胞类型特异性的启动子，包含但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。
能够引入特定和靶向DSB的可用核酸内切酶包含(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的CRISPR(簇聚的规则间隔的短回文重复序列)***。另外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)***也是一种用于靶向整合的有前景的工具。
ZFN是靶向核酸酶，其包括与锌指DNA结合结构域融合的核酸酶。“锌指DNA结合结构域”或“ZFBD”意指通过一个或多个锌指，以序列特异性方式结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内具有约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定。锌指实例包含但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计”的锌指结构域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理准则，例如应用取代规则和计算机化算法来处理储存现有ZFP设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利第6,140,081号；第6,453,242号；和第6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。“所选”锌指域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。ZFN更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。ZFN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。
TALEN为靶向核酸酶，其包括与TAL效应物DNA结合结构域融合的核酸酶。“转录活化因子样效应物DNA结合结构域”、“TAL效应物DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”意指负责TAL效应蛋白与DNA结合的TAL效应蛋白的多肽结构域。TAL效应蛋白由黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，经由其DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列，并且经由其转录活化结构域在这些序列处激活基因转录。TAL效应物DNA结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复序列的效应子可变数量，其包括所选重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(RVD)。TALEN更详细地描述于美国专利申请第2011/0145940号，所述申请以引用的方式并入本文中。TALEN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与TAL效应物DNA结合结构域的融合多肽。
用于本发明方法中的靶向核酸酶的另一实例为靶向Spo11核酸酶，其为一种包括Spo11多肽的多肽，所述多肽具有与DNA结合结构域，例如对所关注DNA序列具有特异性的锌指DNA结合结构域、TAL效应物DNA结合结构域等融合的核酸酶活性。参见例如美国申请第61/555,857号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
适用于本发明的靶向核酸酶的其它实例包含但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1,不论单独地或组合地使用。
靶向核酸酶的其它非限制性实例包含天然存在的核酸酶和重组核酸酶；来自包含以下的家族的CRISPR相关核酸酶：cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr；限制性核酸内切酶；大范围核酸酶；归巢核酸内切酶等。
使用Cas9作为实例，CRISPR/Cas9需要两种主要组分：(1)Cas9核酸内切酶和(2)crRNA-tracrRNA复合体。当共表达时，所述两种组分形成募集到标靶DNA序列的复合物，所述序列包括PAM和靠近PAM的接种区域。crRNA和tracrRNA可以组合形成嵌合向导RNA(gRNA)以引导Cas9靶向所选序列。这两种组分然后可以经由转染或转导递送到哺乳动物细胞。
DICE介导的***是利用一对重组酶(例如phiC31和Bxb1)来提供外源DNA的单向整合，其严格局限于每种酶自身的小attB和attP识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将其引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国申请公开案第2015/0140665号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
本发明的一个方面提供一种构建体，其包括一种或多种用于靶向基因组整合的外源性多核苷酸。在一个实施例中，所述构建体进一步包括对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂，并且靶向整合的方法包括向细胞中引入所述构建体以允许细胞宿主酶机制实现定点同源重组。在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中引入包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包括对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒以实现ZFN介导的***。在又一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中引入包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包括对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒以实现TALEN介导的***。在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中引入包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体，向细胞中引入Cas9表达盒和包括对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA以实现Cas9介导的***。在仍另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的所期望的整合位点、向细胞中引入包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体，和引入DICE重组酶的表达盒以实现DICE介导的靶向整合。
有望用于靶向整合的位点包含但不限于安全港基因座或基因组安全港(GSH)，其是人类基因组的基因内或基因外区域，在理论上，其能够容纳新整合的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生不利影响。适用的安全港必须允许转基因表达足以产生由载体编码的蛋白质或非编码RNA的所期望水平。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化，也不得改变细胞功能。如果整合位点是潜在的安全港基因座，那么理想的是需要满足包含但不限于以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录激活子与相邻基因(特别是癌症相关和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；并且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达谱所反映，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特征在干细胞中尤其重要，其中在分化期间，染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适于外源***的区域内，选用于***的确切基因座应所述不含重复元件和保守序列并且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包含但不限于腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(CC基元)受体5(CCR5)基因座和小鼠ROSA26基因座的人类直系同源物。另外地，小鼠H11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行***的合适位点。进一步，也可以使用胶原蛋白和HTRP基因座作为靶向整合的安全港。然而，每个所选位点的验证已显示为必需的，特别是在特异性整合事件的干细胞中，并且通常需要优化***策略，包含启动子选择、外源基因序列和排列，以及构建体设计。
对于靶向***/缺失，编辑位点通常包含于旨在破坏其表达和/或功能的内源基因中。在一个实施例中，包括靶向***/缺失的内源性基因与免疫应答调控和调节相关。在一些其它实施例中，包括靶向***/缺失的内源基因与以下相关：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。
如此，本发明的一个方面提供了在所选基因座中的靶向整合的方法，所述所选基因座包含基因组安全港或已知或证明是安全的并且针对连续或时间基因表达调控良好的预选的基因座，如AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1，或满足基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，靶向整合位于期望作为整合的结果的基因敲低或敲除的基因座之一，其中此类基因座包含但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。
在一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的一对同源臂和一个或多个同源序列的构建体引入到细胞中，以使得能够通过细胞宿主酶机制进行位点特异性同源重组，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒引入到细胞中，以使得能够进行ZFN介导的***，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在又另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒引入到细胞中，以使得能够进行TALEN介导的***，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中、将Cas9表达盒以及包括对期望整合位点具有特异性的引导序列的gRNA引入到细胞中，以使得能够进行Cas9介导的***，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在仍另一个实施例中，细胞中的靶向整合的方法包括向细胞中的期望整合位点引入包括一对DICE重组酶的一个或多个att位点，向细胞引入包括一个或多个外源性多核苷酸的构建体，以及引入DICE重组酶的表达盒，以实现DICE介导的靶向整合，其中期望的整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
进一步，如本文所提供，用于在安全港中进行靶向整合的上述方法用于***所关注的任何多核苷酸，例如编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物，和促进干细胞和/或祖细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些其它实施例中，包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体进一步包括一个或多个标志物基因。在一个实施例中，本发明的构建体中的外源性多核苷酸是编码安全开关蛋白质的***基因。适用于诱导细胞死亡的***基因***包含但不限于胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和苷昔洛韦(ganciclovir，GCV)；胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。另外地，一些***基因***对细胞类型具有特异性，例如使用B细胞分子CD20对T淋巴细胞进行基因修饰允许其在给予mAb利妥昔单抗后消除。进一步，当基因工程化的细胞暴露于西妥昔单抗时，含有由西妥昔单抗识别的抗原决定基的经修饰EGFR可以用于耗尽所述细胞。因此，本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的***基因的方法，所述安全开关蛋白质选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰EGFR和B细胞CD20。
在一些实施例中，通过本文中的方法整合的一种或多种外源性多核苷酸是由包含于用于靶向整合的构建体中的可操作连接的外源启动子驱动。所述启动子可以是诱导性的或构建性的，且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的构建性启动子包含(但不限于)巨细胞病毒(CMV)、延伸因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子。在一个实施例中，外源启动子是CAG。
通过本文中的方法整合的外源性多核苷酸可以由宿主基因组中的内源性启动子在整合位点处驱动。在一个实施例中，本发明的方法是用于使一种或多种外源性多核苷酸靶向整合于细胞基因组中的AAVS1基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性AAVS1启动子驱动。在另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的ROSA26基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性ROSA26启动子驱动。在仍另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的H11基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性H11启动子驱动。在另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性胶原蛋白启动子驱动。在仍另一个实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的HTRP基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性HTRP启动子驱动。理论上，只有正确***所期望位置才能实现由内源性启动子驱动的外源基因的基因表达。
在一些实施例中，用于靶向整合方法的包含于构建体中的一种或多种外源性多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施例中，构建体包括一个或多个位于由相同启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的连接子序列，以使得各部分之间的物理间距更大并且使酶机制的可行性最大化。连接子序列的连接肽可以由为了使各部分(外源性多核苷酸，和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成，视相关功能而定，其较柔软或较硬。连接子序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生单独的部分。连接子中的酶裂解位点的实例包含蛋白水解酶，例如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶的裂解位点。在一些实施例中，所述蛋白酶为由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源引入。可替代地，连接子中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质(例如溴化氰、羟胺或低pH)后能够裂解的位点。任选的连接子序列可以服务于除提供裂解位点以外的目的。连接子序列应允许所述部分相对于另一相邻部分的有效定位，以便所述部分正确地发挥作用。连接子还可以是长度足以防止部分之间的任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外，连接子序列可以实现转译后修饰，包含(但不限于)例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等。在一些实施例中，连接子序列是柔软的，以便使生物活性肽不能保持单一非所要的构形。连接子可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施例中，约80％或90％或更多的连接子序列包括甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施例中，G4S连接肽将融合蛋白的末端处理结构域和核酸内切酶结构域分开。在其它实施例中，2A连接子序列允许单次转译产生两种单独的蛋白质。可以容易地凭经验鉴别合适的连接子序列。另外地，连接子序列的合适大小和序列也可以通过常规计算机建模技术确定。在一个实施例中，连接子序列编码自切割肽。在一个实施例中，自我裂解肽为2A。在一些其它实施例中，连接子序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施例中，任何两个连续连接子序列是不同的。
将包括用于靶向整合的外源性多核苷酸的构建体引入细胞中的方法可以使用本身已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施例中，构建体包括病毒载体的骨架，所述病毒载体例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体。在一些实施例中，质粒载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞和/或使外源性多核苷酸在靶细胞(例如pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等等中表达。在一些其它实施例中，游离型载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施例中，重组腺相关病毒(rAAV)可以用于基因工程化以通过同源重组来引入***、缺失或取代。不同于慢病毒，rAAV不会整合到宿主基因组中。另外，相较于常规靶向质粒的转染，游离型rAAV载体以高得多的速率介导同源定向的基因靶向。在一些实施例中，AAV6或AAV2载体用于在iPSC的基因组中的标靶位点处引入***、缺失或取代。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表1中所列的至少一种基因型。
III.获取和维持基因组工程化iPSC的方法
本发明提供一种获得和维持基因组工程化的iPSC的方法，所述方法包括在一个或多个所期望的位点处的一个或多个靶向编辑，其中所述靶向编辑在扩增的基因组工程化的iPSC或iPSC衍生的非多能细胞中在相应的所选编辑位点处保持完整和功能。所述靶向编辑将***、缺失和/或取代引入基因组iPSC和其衍生细胞中，即，在所选位点引入靶向整合和/或***/缺失。与直接工程化患者源的外周血起源原代效应细胞相比，通过编辑和分化如本文所提供的iPSC获得基因组工程化衍生细胞的许多益处包含但不限于：工程化效应细胞的来源不受限制；无需重复操纵效应细胞，尤其在涉及多种工程化模式时；所获得的效应细胞因具有伸长端粒和经历较少耗尽而再生；效应细胞群关于编辑位点、拷贝数和缺乏等位基因变异、随机突变和表达杂色是同质的，这主要是由于如本文所提供的工程化iPSC中能够进行的克隆选择。
在特定实施例中，包括在一个或多个所选位点处的一个或多个靶向编辑的基因组工程化的iPSC作为单一细胞在表2中所示的作为命运维持培养基(Fate MaintenanceMedium；FMM)的细胞培养基中维持、传代和扩增持续延长的时段，其中所述iPSC在所选位点处保留靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表2中所示的最优范围内的量存在于培养基中。FMM中所培养的iPSC已表明继续维持其未分化和基础或初始轮廓；基因组稳定性，而不需要培养物清洗或选择；并且通过体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)；和体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如美国申请第61/947,979号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
表2：用于iPSC重编程和维持的例示性培养基
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在一些实施例中，包含一个或多个靶向整合和/或***/缺失的基因组工程化iPSC是在包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂并且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增，其中所述iPSC在所选位点保留完整和功能靶向编辑。
本发明的另一方面提供一种产生基因组工程化的iPSC的方法，其通过iPSC的靶向编辑；或通过首先利用靶向编辑产生基因组工程化的非多能细胞，并且然后将所选/分离的基因组工程化的非多能细胞重编程，以获得包括与非多能细胞相同的靶向编辑的iPSC。本发明的另一方面提供基因组工程化的非多能细胞，其通过将靶向整合和/或靶向***/缺失引入细胞中而同时经历重编程，其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下，并且其中重编程的条件包括使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程化和重编程的方法的各个实施例中，可以在起始重编程之前或基本上同时，通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选地小分子接触而将靶向整合和/或靶向***/缺失引入非多能细胞中。
在一些实施例中，为了对非多能细胞同时进行基因组工程化和重编程，还可以在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而启动多日重编程工艺之后，将靶向整合和/或***/缺失引入非多能细胞中，并且其中携带构建体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源性多能基因(包含但不限于SSEA4、Tra181和CD30)的稳定表达之前引入。
在一些实施例中，通过使非多能细胞与至少一种重编程因子和任选地TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FRM；表2)接触来起始重编程。在一些实施例中，通过上述任何方法进行的基因组工程化的iPSC进一步使用包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FMM；表2)的混合物来维持和扩增。
在产生基因组工程化的iPSC的方法的一些实施例中，所述方法包括：通过将一种或多种靶向整合和/或***/缺失引入iPSC中来基因组工程化iPSC，以获得具有至少一种表1中所列的基因型的基因组工程化的iPSC。可替代地，产生基因组工程化的iPSC的方法包括：(a)将一个或多个靶向编辑引入到非多能细胞中，以获得包括位于所选位点的靶向整合和/或***/缺失的基因组工程化的非多能细胞，和(b)使基因组工程化的非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选地小分子组合物接触，以获得包括位于所选位点的靶向整合和/或***/缺失的基因组工程化的iPSC，所述小分子组合物包括TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。可替代地，产生基因组工程化iPSC的方法包括：(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子以及任选地小分子组合物接触，以启动非多能细胞的重编程，所述小分子组合物包括TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；(b)将一种或多种靶向整合和/或***/缺失引入到用于基因组工程化的重编程非多能细胞中；以及(c)获得包括位于所选位点处的靶向整合和/或***/缺失的克隆基因组工程化iPSC。
重编程因子选自由以下组成的组：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1和其任何组合，如PCT/US2015/018801和PCT/US16/57136中所公开，其公开内容以引入的方式并入本文中。一种或多种重编程因子可以呈多肽形式。重编程因子也可以呈多核苷酸形式，并且因此通过载体(例如，逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、质粒和小环)引入非多能细胞中。在特定实施例中，通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各个其它实施例中，通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，所述一种或多种多核苷酸是通过质粒与所考虑的各种重编程因子的化学计量的组合来引入的。参见例如美国申请第62/571,105号，其公开内容以引入的方式并入本文中。
在一些实施例中，非多能细胞是利用包括不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的多个构建体，通过用于在相同或不同的所选位点进行靶向整合的多种载体转移。这些外源性多核苷酸可以包括***基因或编码靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶标候选物的基因或编码蛋白质的基因，所述蛋白质促进iPSC或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活。在一些实施例中，外源性多核苷酸编码RNA，包含但不限于siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。这些外源性多核苷酸可以由一个或多个启动子驱动，所述启动子选自由以下组成的组：组成性启动子、诱导性启动子、时间特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子。因此，当在例如在诱导剂的存在下或在特定分化细胞类型中激活启动子的条件下时，多核苷酸是可表达的。在一些实施例中，多核苷酸在iPSC和/或在由iPSC分化的细胞中表达。在一个实施例中，一个或多个***基因是由组成性启动子驱动，例如胱天蛋白酶-9由CAG驱动。可以同时或连续将包括不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的这些构建体转移到非多能细胞中。经历多个构建体的靶向整合的非多能细胞可以同时接触一种或多种重编程因子以与基因工程化同时起始重编程，从而获得在同一细胞池中包括多个靶向整合的基因组工程化的iPSC。因此，这种稳固方法实现同时重编程和工程化策略，以衍生具有整合到一个或多个所选的标靶位点的多种模式的克隆的基因组工程化的hiPSC。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表1中所列的至少一种基因型。
IV.通过分化基因组工程化iPSC获得基因工程化效应细胞的方法
本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成体内分化基因组工程化iPSC的方法，其中通过基因组工程化iPSC体内得到的分化细胞保留完整和功能性靶向编辑，其包含在所期望的位点处的靶向整合和/或***/缺失。在一些实施例中，基因组工程化iPSC经由畸胎瘤体内得到的分化细胞包括在一个或多个所期望的位点整合的一个或多个诱导性***基因，所述位点包含AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施例中，基因组工程化iPSC经由畸胎瘤体内得到的分化细胞包括编码靶向模式或编码促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，基因组工程化iPSC经由畸胎瘤体内得到的分化细胞包括一个或多个诱导性***基因，在与免疫反应调控和介导相关的内源性基因中进一步包括一个或多个***/缺失。在一些实施例中，***/缺失包含于一个或多个内源检查点基因中。在一些实施例中，***/缺失包含于一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施例中，***/缺失包含于一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，***/缺失包含于与主要组织相容性复合物相关的一个或多个内源基因中。在一些实施例中，***/缺失包含在一种或多种内源性基因中，所述一种或多种内源性基因包含但不限于B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关基因、TCR基因。在一个实施例中，在所选位点处包括一种或多种外源性多核苷酸的基因组工程化的iPSC在B2M(β-2微球蛋白)编码基因中进一步包括靶向编辑。
在特定实施例中，包括如本文所提供的一种或多种基因修饰的基因组工程化iPSC用于体外得到造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型，其中衍生非多能细胞保留功能性基因修饰，包含在所选位点处的靶向编辑。在一个实施例中，基因组工程化iPSC衍生的细胞包含但不限于具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久性HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多潜能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、骨髓细胞、嗜中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞，其中源自基因组工程化iPSC的这些细胞保留功能性基因修饰，包含在所期望的位点处的靶向编辑。
用于获得iPSC衍生的造血细胞谱系的适用分化方法和组合物包含例如国际申请第PCT/US2016/044122号中描绘的那些分化方法和组合物，所述申请的公开内容以引入的方式并入本文中。如所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需EB形成的情况下通过源自多能干细胞(包含hiPSC)的永久性生血内皮细胞(HE)。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是从多能干细胞到专门化为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞、和到直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，通过分化干细胞而产生的细胞的范围是从多潜能干细胞或祖细胞到末端分化细胞，以及到所有中间造血细胞谱系。
用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包括使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选地bFGF接触。如所提供，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而不会由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选地ROCK抑制剂和/或WNT通路活化剂接触，将具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞，其在分化期间还得到扩增。
本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用至关重要；并且费力且效率低。
所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化，从而使得衍生造血干细胞和分化后代，例如T细胞、B细胞、NKT细胞和NK细胞。单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增组合，实现了在不同治疗应用中递送治疗相关数量的多能干细胞衍生造血细胞。进一步，使用本文所提供的方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞，其实现了全范围的试管内分化、体外调节和体内长期造血自我更新、重构和移植。如所提供，iPSC衍生的造血谱系细胞包含(但不限于)永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
用于引导多能干细胞分化成永久性造血谱系细胞的方法，其中所述方法包括：(i)使多能干细胞与包括BMP活化剂和任选地存在的bFGF的组合物接触，以启动多能干细胞分化成和扩增中胚层细胞；(ii)使所述中胚层细胞与包括BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，以启动中胚层细胞分化成和扩增具有永久性HE潜能的中胚层细胞，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(iii)使具有永久性HE潜能的所述中胚层细胞与组合物接触，以启动具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生的中胚层细胞分化成和扩增永久性生血内皮细胞，所述组合物包括ROCK抑制剂、一个或多个生长因子和细胞因子和任选地存在的Wnt通路活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使多能干细胞与包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多能干细胞，其中所述组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施例中，多能干细胞为iPSC、或初始iPSC或包括一种或多种遗传印记的iPSC；并且iPSC中所包含的一种或多种遗传印记保留于由其分化的造血细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的方法的一些实施例中，多能干细胞分化成造血谱系细胞缺乏产生类胚胎体，并且呈单层培养形式。
在上述方法的一些实施例中，所获得的多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施例中，所获得的永久性生血内皮细胞为CD34+CD43-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为CD34+CD43-CD93-。在一些实施例中，永久性生血内皮细胞为CD34+CD93-。
在上述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括(i)使多能干细胞衍生的永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动所述永久性生血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞，所述组合物包括ROCK抑制剂、一种或多种生长因子和细胞因子和任选地BMP活化剂，所述细胞因子选自由以下组成的组：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7；以及任选地(ii)使所述前T细胞祖细胞与组合物接触以启动所述前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞，所述组合物包括一种或多种生长因子和选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞为CD34+CD45+CD7+。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞为CD45+CD7+。
在用于指导多能干细胞分化成造血谱系细胞中的上述方法的又一些实施例中，所述方法进一步包括：(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触，以启动所述永久性生血内皮细胞分化成前NK细胞祖细胞，所述组合物包括ROCK抑制剂；选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15；以及任选地(ii)使多能干细胞衍生前NK细胞祖细胞与包括选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子的组合物接触：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15，以启动所述前NK祖细胞分化成NK细胞祖细胞或NK细胞，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施例中，多能干细胞衍生NK祖细胞为CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施例中，多能干细胞衍生NK细胞为CD3-CD45+CD56+，并且任选地进一步由NKp46+、CD57+和CD16+定义。
因此，使用上述分化方法可以获得一种或多种iPSC衍生的造血细胞群体：(i)CD34+HE细胞(iCD34)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(ii)永久性生血内皮细胞(iHE)，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iii)永久性HSC，使用一种或多种选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的培养基；(iv)多潜能祖细胞(iMPP)，使用iMPP-A；(v)T细胞祖细胞(ipro-T)，使用一种或多种选自iTC-A2和iTC-B2的培养基；(vi)T细胞(iTC)，使用iTC-B2；(vii)NK细胞祖细胞(ipro-NK)，使用一种或多种选自iNK-A2和iNK-B2的培养基；和/或(viii)NK细胞(iNK)，和iNK-B2。在一些实施例中，培养基：
a.iCD34-C包括ROCK抑制剂、一种或多种选自由以下组成的组的生长因子和细胞因子：bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF和EPO，和任选地Wnt通路活化剂；并且不含TGFβ受体/ALK抑制剂；
b.iMPP-A包括BMP活化剂、ROCK抑制剂以及一种或多种选自由以下组成的组的生长因子和细胞因子：TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L和IL11；
c.iTC-A2包括ROCK抑制剂；一种或多种选自由以下组成的组的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、TPO和IL7；和任选地BMP活化剂；
d.iTC-B2包括一种或多种选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的生长因子和细胞因子；
e.iNK-A2包括ROCK抑制剂以及选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15；并且
f.iNK-B2包括一种或多种选自由以下组成的组的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7和IL15。
在一些实施例中，由上述方法获得的基因组工程化iPSC衍生的细胞包括在一个或多个期望整合位点处整合的一个或多个诱导型***基因，所述一个或多个期望整合位点包括：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在一些其它实施例中，基因组工程化的iPSC衍生的细胞包括编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物或促进干细胞和/或祖细胞的运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，包括一个或多个***基因的基因组工程化的iPSC衍生的细胞进一步包括一个或多个内源基因中所包含的一种或多种***/缺失，所述内源基因与免疫反应调控和介导相关，包含(但不限于)检查点基因、内源T细胞受体基因和MHC I类抑制基因。在一个实施例中，包括一个或多个***基因的基因组工程化的iPSC衍生的细胞进一步包括B2M基因中的***/缺失，其中基因敲除B2M。
另外地，用于获得第一命运的基因组工程化的造血细胞到第二命运的基因组工程化的造血细胞的适用去分化方法和组合物包含例如国际公开案第WO2011/159726号中所描绘的那些方法和组合物，所述申请的公开内容以引入的方式并入本文中。其中提供的方法和组合物允许部分地将初始非多能细胞重编程为非多能中间细胞，这是通过在重编程期间限制内源Nanog基因的表达；并且使所述非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成所期望的细胞类型的条件来进行。在一些实施例中，使用本文中的方法和组合物获得的基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表1中所列的至少一种基因型。
V.具有从基因工程化iPSC分化的外源性功能模式的衍生免疫细胞的治疗用途
在一些实施例中，本发明提供一种组合物，其包括功能增强的衍生免疫细胞的分离群体或亚群，所述免疫细胞使用如所公开的方法和组合物由基因组工程化的iPSC分化。在一些实施例中，iPSC包括一种或多种靶向基因编辑，其能在iPSC衍生的免疫细胞中保留，其中基因工程化iPSC和其衍生细胞适于基于细胞的过继性疗法。在一个实施例中，基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC衍生的CD34细胞。在一个实施例中，基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC衍生的HSC细胞。在一个实施例中，基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC衍生的proT细胞或T细胞。在一个实施例中，基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC衍生的proNK细胞或NK细胞。在一个实施例中，基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC衍生的免疫调控细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施例中，iPSC衍生的基因工程化免疫细胞进一步离体调节以改善治疗潜能。在一个实施例中，已源自iPSC的基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比例增加的初始T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在一个实施例中，已源自iPSC的基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比例增加的I型NKT细胞。在另一个实施例中，已源自iPSC的基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比例增加的适应性NK细胞。在一些实施例中，源自iPSC的基因工程化的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或骨髓衍生抑制细胞的分离群体或亚群是同种异体的。在一些其它实施例中，源自iPSC的基因工程化CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞或MDSC的分离群体或亚群是自体的。
在一些实施例中，用于分化的iPSC包括经选择以在效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记，其限制条件为不破坏分化期间的细胞发育生物学，并且其限制条件为遗传印记在源自所述iPSC的分化的造血细胞中保留并且起作用。
在一些实施例中，多能干细胞中的遗传印记包括(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞的基因组中进行基因组***、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式；或(ii)对供者、疾病或治疗反应具有特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性，且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中iPSC保留来源治疗属性，iPSC衍生的造血谱系细胞中也包含所述来源治疗属性。
在一些实施例中，基因修饰模式包括以下中的一种或多种：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或者促进iPSC或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在一些实施例中，经基因修饰的iPSC及其衍生效应细胞包括表1中列出的基因型。在一些其它实施例中，包括表1中列出的基因型的经基因修饰的iPSC和其衍生效应细胞进一步包括另外的经基因修饰的模式，所述另外的经基因修饰的模式包括(1)以下的缺失或减少的表达的一种或多种：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因；以及(2)以下的引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段或变体，或用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
在仍一些其它实施例中，造血谱系细胞包括与以下中的至少两种的组合有关的来源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)一种或多种靶向抗原的受体表达；(ii)经修饰的HLA；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)旁观者免疫细胞的募集和免疫调节；(iv)随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；和(v)归巢、存留、细胞毒性或抗原逃逸拯救改善。
在一些实施例中，iPSC衍生的造血细胞包括表1中所列的基因型，并且所述细胞表达至少一种细胞因子和/或其受体，包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18或IL21或其任何被修饰的蛋白质，并且至少表达CAR。在一些实施例中，细胞因子和CAR的工程化表达具有NK细胞特异性。在一些其它实施例中，细胞因子和CAR的工程化表达具有T细胞特异性。在一个实施例中，CAR包括BCMA结合结构域。在一些实施例中，iPSC衍生的造血效应细胞具有抗原特异性。在一些实施例中，抗原特异性衍生效应细胞靶向液体肿瘤。在一些实施例中，抗原特异性衍生效应细胞靶向实体肿瘤。在一些实施例中，抗原特异性iPSC衍生的造血效应细胞能够挽救肿瘤抗原逃逸。
多种疾病可以通过向适合于过继性细胞疗法的受试者引入本发明的免疫细胞而得到改善。在一些实施例中，如所提供的iPSC衍生的造血细胞用于同种异体过继性细胞疗法。另外，在一些实施例中，本发明提供上述治疗性组合物通过将所述组合物引入适于过继细胞疗法的受试者来实现的治疗用途，其中所述受试者患有：自身免疫病症；血液***恶性肿瘤；实体瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。恶性血液病的实例包含(但不限于)急性和慢性白血病(急性骨髓白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma；NHL)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症。实体癌症的实例包含(但不限于)脑癌、***癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、子***、直肠癌、喉癌和食道癌。多种自身免疫病症的实例包含(但不限于)斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、休格连氏综合症(
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syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener's))。病毒感染的实例包含但不限于HIV-(人类免疫缺陷病毒)、HSV-(单纯疱疹病毒)、KSHV(卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)相关疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus))、EBV(埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus))、CMV(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关病症。
使用本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗可以在症状后进行，或用于复发预防。术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中一般用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良作用，所述作用就完全或部分预防疾病来说，可以是防治性的，和/或就部分或完全治愈来说，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者疾病的任何干预，并且包含：防止可能易患所述疾病、但尚未被诊断患有其的受试者出现所述疾病；抑制所述疾病，即，阻滞其发展；或缓解所述疾病，即，引起所述疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后给予治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所要临床症状。在特定实施例中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以含有、缓解和/或改善的疾病、病状和/或损伤。某些实施例预期需要细胞疗法的受试者包含(但不限于)骨髓或干细胞移植的候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有过度增殖病症或癌症(例如过度增殖病症或造血***癌症)或处于患有其的风险下的受试者、患有肿瘤(例如实体肿瘤)或处于罹患所述肿瘤的风险下的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受试者。
在评估对包括本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗的反应性时，应答可以由包括以下中的至少一种的标准来测量：临床效益率、直到死亡的存活期、病理性完全反应、病理性反应的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无再现存活、无转移存活、无疾病存活、循环肿瘤细胞减少、循环标志物反应和实体瘤的反应评估准则(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors；RECIST)。
可以在其它治疗之前、期间和/或之后在受试者中施用包括如所公开的衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此，组合疗法的方法可以涉及在使用另外治疗剂之前、期间和/或之后给予或制备iPSC衍生的免疫细胞。如上文所提供，一种或多种另外的治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体或其功能变体或片段、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。施用iPSC衍生的免疫细胞与施用另外的治疗剂可以在时间上间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地，施用可以与其它生物活性剂或模式组合，所述生物活性剂或模式例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法，例如手术。
在组合细胞疗法的一些实施例中，治疗组合包括本文所提供的iPSC衍生的造血谱系细胞和另外治疗剂，所述另外治疗剂是抗体或抗体片段。在一些实施例中，另外的治疗剂包括多种抗体，靶向一种或多种抗原。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体可以是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的iPSC衍生的造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的iPSC衍生的造血谱系细胞的另外的治疗剂进行组合治疗的抗体包含但不限于CD20抗体(例如，利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、HER2抗体(例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、CD52抗体(例如，阿仑单抗)、EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)、GD2抗体(例如，迪努妥昔单抗)、PDL1抗体(例如，阿维鲁单抗)、CD38抗体(例如，达土木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、CD123抗体(例如，7G3、CSL362)、SLAMF7抗体(埃罗妥珠单抗)、MICA/B抗体(7C6、6F11、1C2)及其人源化或经Fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。
在一些实施例中，另外的治疗剂包括一种或多种检查点抑制剂。检查点是指细胞分子，通常是细胞表面分子，在不被抑制时能够抑制或下调免疫反应。检查点抑制剂是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子活性的拮抗剂。适用于与如本文所提供的衍生效应细胞(包含NK细胞或T细胞)的组合疗法的检查点抑制剂包含但不限于PD1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG3(Lag3、CD223)、CTLA4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
包括所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些实施例进一步包括至少一种靶向检查点分子的抑制剂。与所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些其它实施例包括两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在一些实施例中，如本文所提供，用于组合疗法的衍生效应细胞在功能上增强。在一些实施例中，两种、三种或更多种检查点抑制剂可以在组合疗法中在施用衍生效应细胞同时、之前或之后施用。在一些实施例中，两种或更多种检查点抑制剂是同时或一次一个地(依序)施用。
在一些实施例中，抑制以上检查点分子中的任一种的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包含Fab、Fab′、F(ab)′2、F(ab)′3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、单域抗原结合片段(sdAb，纳米抗体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，一种、或两种、或三种或更多种检查点抑制剂包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其衍生物或功能等效物中的至少一种。
包括衍生效应细胞和一种或多种检查抑制剂的组合疗法适用于治疗液体和实体癌症，包含(但不限于)皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、蕈样真菌病(Mycosisfungoide)、佩吉特样网状细胞增生症(Pagetoid reticulosis)、塞氏综合症(Sezarysyndrome)、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹(Pityriasislichenoides chronica)、急性苔癣痘疹样糠疹(Pityriasis lichenoides etvarioliformis acuta)、CD30+皮肤T细胞淋巴瘤、继发性皮肤CD30+大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病CD30皮肤大T细胞淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(Lennert lymphoma)、皮下T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)、母细胞性NK细胞淋巴瘤(blastic NK-cell lymphoma)、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、头颈部肿瘤、鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤(rhabdomyocarcoma)、路易斯肺癌(Lewis lung carcinoma；LLC)、非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、急性骨髓白血病(AML)、乳腺癌、胃癌、***小细胞神经内分泌癌瘤(SCNC)、肝癌、神经胶母细胞瘤、肝癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺***状癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌瘤、骨癌、癌转移和鼻咽癌。
在一些实施例中，除如本文所提供的衍生效应细胞以外，用于治疗用途的组合包括一种或多种另外的治疗剂，其包括化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀死赘生性细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环，或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上用于防止或减少赘生性细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗瘤形成或细胞毒性药物或药剂，并且为所属领域中熟知的。
在一些实施例中，化学治疗剂包括蒽环霉素(anthracycline)、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白介素。示例性化学治疗剂包含(但不限于)烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺(heamethylmelamine)、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposide orthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽(bisanthrene)、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽D(gramicidineD))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。另外的药剂包含氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二***calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(cladribine)、氯呋拉滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基***、依西美坦(exemestane)、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、替伊莫单抗、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥(meclorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalin)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的那些药剂，包含将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的那些药剂。这类药剂可由多个标准医师和肿瘤学家的参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)》,第九版,McGraw-Hill,N.Y.,1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用，两者都会不时更新。
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供，IMiD可与iPSC衍生的治疗性免疫细胞一起使用以供癌症治疗。
除治疗性组合物中包含的iPSC衍生的造血谱系细胞的分离的群体外，适于向患者施用的组合物可以进一步包含一种或多种医药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如，药物学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其它药物学上可接受的组分。药学上可接受的载剂和/或稀释剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用治疗组合物的特定方法决定。因此，本发明的治疗组合物存在多种合适的配方(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第17版,1985，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施例中，治疗组合物包括利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的T细胞。在一个实施例中，治疗组合物包括利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的NK细胞。在一个实施例中，治疗组合物包括利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的CD34+HE细胞。在一个实施例中，治疗组合物包括利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的HSC。在一个实施例中，治疗组合物包括利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的MDSC。可以通过静脉内、腹膜内、经肠或气管施用方法分开施用或与其它合适的化合物组合施用包括如本文所公开的iPSC衍生的造血谱系细胞的群体的治疗组合物，以实现所期望的治疗目标。
这些药学上可接受的载剂和/或稀释剂可以足以使治疗组合物的pH维持在约3与约10之间的量存在。因此，基于总组合物的重量比(weight to weight)，缓冲剂可以高达约5％。治疗组合物中还可以包含电解质，例如(但不限于)氯化钠和氯化钾。在一个方面中，治疗组合物的pH在约4到约10的范围内。可替代地，治疗组合物的pH在约5到约9、约6到约9或约6.5到约8的范围内。在另一个实施例中，治疗组合物包含pH在所述pH范围中的一种的缓冲液。在另一个实施例中，治疗组合物的pH为约7。可替代地，治疗组合物的pH在约6.8到约7.4的范围内。在仍另一个实施例中，治疗组合物的pH为约7.4。
本发明还部分地提供药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适合于向人受试者施用。一般来说，支持根据本发明的实施例的iPSC衍生的免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适用作药学细胞培养基。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各个实施例中，无血清培养基是无动物成分(animal-free)的，并且可以任选地为无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分源自非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的天然动物蛋白，且营养物是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，无蛋白质培养基定义为大体上不含蛋白质。所属领域的普通技术人员将了解，上述培养基实例为说明性的并且决不限制适用于本发明的培养基调配物，并且存在所属领域的技术人员已知且可使用的许多合适培养基。
分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞可以具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施例中，分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞具有约95％到约100％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施例中，本发明提供具有纯化的T细胞或NK细胞的治疗组合物，例如具有约95％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的分离群体的组合物，以治疗需要细胞疗法的受试者。在一些其它实施例中，分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞可以具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的具有在T、NK或NKT细胞或任何其它天然来源的免疫细胞中不存在或不典型的功能或结构特征的效应细胞。
在一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗性蛋白质或肽和源自包括表1中列出的基因型的基因组工程化iPSC的效应细胞群体，其中衍生效应细胞包括BCMA-CAR。在另一个实施例中，组合细胞疗法包括CD38特异性治疗蛋白或肽和源自包括在表1中列出的基因型的基因组工程化iPSC的效应细胞群体，其中衍生效应细胞包括BCMA-CAR和CD38无效。在一些实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗、艾沙妥昔单抗或MOR202和源自包括表1中列出的基因型的基因组工程化iPSC效应细胞群体，其中衍生NK或T细胞包括BCMA-CAR、CD38无效和外源性CD16。在又一些其它实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗和源自包括表1中列出的基因型的基因组工程化iPSC的效应细胞群体，其中衍生效应细胞包括BCMA-CAR、CD38无效、hnCD16以及靶向以下中的至少一者的第二CAR：CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1。在仍一些另外的实施例中，组合细胞疗法包括达雷妥尤单抗、伊妥昔单抗或MOR202，以及源自基因组工程化iPSC的效应细胞群体，所述iPSC包括表1中列出的基因型，其中所述衍生效应细胞包括BCMA-CAR、CD38无效、外源性CD16、CAR和一种或多种包括全长或部分长度的细胞因子、细胞因子受体或其组合的蛋白质复合物。在又另一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗性蛋白质或肽和源自包括表1中列出的基因型的基因组工程化iPSC的NK谱系细胞群体，其中衍生NK细胞包括BCMA-CAR、CD38无效、hnCD16、CAR、一种或多种外源性细胞因子和具有HLA-G过表达或具有CD58敲除和CD54敲除中的至少一种的B2M-/-CIITA-/-。
如所属领域的普通技术人员将理解，基于本文中的方法和组合物的源自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞两者均可用于如上文所描述的细胞疗法中。对于自体移植，衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施例中，衍生造血谱系细胞与受试者不是HLA匹配的，其中衍生造血谱系细胞是HLA-I和HLA-II无效的效应细胞。
在一些实施例中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数量是每剂量至少0.1×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少5×106个细胞、至少1×107个细胞、至少5×107个细胞、至少1×108个细胞、至少5×108个细胞、至少1×109个细胞或至少5×109个细胞。在一些实施例中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数量是每剂量约0.1×105个细胞到约1×106个细胞；每剂量约0.5×106个细胞到约1×107个细胞；每剂量约0.5×107个细胞到约1×108个细胞；每剂量约0.5×108个细胞到约1×109个细胞；每剂量约1×109个细胞到约5×109个细胞；每剂量约0.5×109个细胞到约8×109个细胞；每剂量约3×109个细胞到约3×1010个细胞或其间任何范围。一般来说，1×108个细胞/剂量转化为对于60kg的患者1.67×106个细胞/kg。
在一个实施例中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数量是部分或单一脐带血中的免疫细胞数量，或是至少0.1×105个细胞/千克体重、至少0.5×105个细胞/千克体重、至少1×105个细胞/千克体重、至少5×105个细胞/千克体重、至少10×105个细胞/千克体重、至少0.75×106个细胞/千克体重、至少1.25×106个细胞/千克体重、至少1.5×106个细胞/千克体重、至少1.75×106个细胞/千克体重、至少2×106个细胞/千克体重、至少2.5×106个细胞/千克体重、至少3×106个细胞/千克体重、至少4×106个细胞/千克体重、至少5×106个细胞/千克体重、至少10×106个细胞/千克体重、至少15×106个细胞/千克体重、至少20×106个细胞/千克体重、至少25×106个细胞/千克体重、至少30×106个细胞/千克体重、1×108个细胞/千克体重、5×108个细胞/千克体重或1×109个细胞/千克体重。
在一个实施例中，向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量为至少2×106个细胞/kg、至少3×106个细胞/kg、至少4×106个细胞/kg、至少5×106个细胞/kg、至少6×106个细胞/kg、至少7×106个细胞/kg、至少8×106个细胞/kg、至少9×106个细胞/kg或至少10×106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的效应细胞是约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg或约10×106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的效应细胞为约2×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg或6×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg，包含所有中间的细胞剂量。
在一些实施例中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施例中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗(也被称为多周期或分次治疗)。在一些实施例中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或其间的任何天数一次剂量。
包括本发明的衍生造血谱系细胞群体的组合物可以是无菌的，并且可以适合于和准备好向人患者施用(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下施用)。准备好施用的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或施用于受试者之前不需要任何进一步处理或操纵。在其它实施例中，本发明提供在与一种或多种药剂一起施用之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。对于经基因工程化以表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞，可以使用如例如美国专利6,352,694中所描述的方法活化和扩增细胞。
在某些实施例中，可以利用不同方案向衍生造血谱系细胞提供初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的试剂可以处于溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，所述试剂可与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。可替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂处于溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供初级活化信号的试剂处于溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施例中，试剂可以呈可溶形式，并且然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或其它结合剂，其将结合于例如美国专利申请公开案第20040101519号和第20060034810号中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞预期在本发明的实施例中用于活化和扩增T淋巴细胞。
视所治疗的受试者的病状而定，将必然会出现剂量、频率和方案的一些变化。负责施用的人员将在任何情况下确定个别受试者的适当剂量、频率和方案。
实例
以下实例是以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实例1——材料和方法
为了在与不同安全港基因座整合策略组合的各种启动子的控制下有效选择和测试******，使用本申请人的一种专有hiPSC平台，其能够实现单细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞测量术分选，以允许衍生具有单一或多种基因调节的克隆hiPSC。
hiPSC在小分子培养物中的维持：hiPSC按常规方式，在培养物融合度达到75％-90％后，即作为单一细胞传代。对于单一细胞解离，hiPSC用PBS(Mediatech)洗涤一次且在37℃用阿库酶(Accutase)(密理博(Millipore))处理3到5分钟，随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与常规培养基等体积混合，在225×g下离心4分钟，再悬浮于FMM中且接种于经基质胶涂布的表面上。传代数典型为1:6-1:8，在37℃下转移预先涂布有基质胶的组织培养板持续2-4小时且每2-3天用FMM饲养。将细胞培养物在设定为37℃和5％CO2的含湿气培育箱中维持。
用ZFN、CRISPR进行人类iPSC工程化以靶向编辑相关模式：使用ROSA26靶向***作为实例，对于ZFN介导的基因组编辑，2百万个iPSC用2.5ug ZFN-L(FTV893)、2.5ug ZFN-R(FTV894)和5ug供体构建体的混合物转染以进行AAVS1靶向***。对于CRISPR介导的基因组编辑，用5ug ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)和5ug供体构建体的混合物转染2百万个iPSC，以进行ROSA26靶向***。使用Neon转染***(生命技术公司(Life Technologies))，使用参数1500V、10毫秒、3个脉冲进行转染。在转染后第2天或第3天，如果质粒含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒，那么使用流式细胞测量术测量转染效率。在转染后第4天，将嘌呤霉素以开始7天0.1ug/ml和随后7天0.2ug/ml的浓度添加到培养基中以选择靶向细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天将细胞传代到新鲜基质胶涂布的孔上。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞测量术分析存活细胞的GFP+iPS细胞百分比。
基因组编辑的iPSC的批量分选和克隆分选：嘌呤霉素选择20天之后，对使用ZFN或CRISPR-Cas9进行基因组靶向编辑的iPSC进行GFP+SSEA4+TRA181+iPSC的批量分选和克隆分选。将单一细胞解离的靶向iPSC池再悬浮于冷却的染色缓冲液中，所述缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution)(MediaTech)、4％胎牛血清(Invitrogen)、1×青霉素/链霉素(Mediatech)和10mM Hepes(Mediatech)；新鲜制备以达到最优效能。将所结合的一级抗体，包含SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BDBiosciences)添加到细胞溶液中，并且在冰上培育15分钟。所有抗体均以每百万细胞7μL/100μL染色缓冲液使用。将所述溶液在染色缓冲液中洗涤一次，在225g下离心4分钟并且再悬浮于含有10μM噻唑维(Thiazovivn)的染色缓冲液中且在冰上维持以用于流式细胞测量术分选。在FACS Aria II(BD Biosciences)上进行流式细胞测量术分选。对于批量分选，将GFP+SSEA4+TRA181+细胞门控且分选到填充有7ml FMM的15ml标准管中。对于克隆分选，使用100μM喷嘴，以每孔3个事件的浓度，将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预填充有200μL FMM，所述FMM补充有5μg/mL纤维结合蛋白和1×青霉素/链霉素(Mediatech)且预先用5×基质胶涂布过夜。5×基质胶预涂布包含将一个基质胶等分试样添加到5mL DMEM/F12中，然后在4℃下培育过夜以允许适当再悬浮并且最终以每孔50μL添加到96孔板中，随后在37℃下培育过夜。在将培养基添加到各孔之前立即抽吸5×基质胶。在完成分选后，在培育之前，将96孔板在225g下离心1-2分钟。将各板保持不受干扰七天。在第七天，从每个孔中去除150μL培养基并且用100μL FMM置换。在分选后第10天，向孔中再馈送另外100μLFMM。早在第2天就检测出群落形成且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中，各孔用PBS洗涤且在37℃下用30μL阿库酶解离大约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了已在培养物中闲置较长时间的群落的紧密性。在发现细胞解离之后，将200μL FMM添加到每个孔中且移液若干次以使群落破碎。将解离的菌落转移到预先涂布有5×基质胶的96孔板的另一孔，并且然后在培育之前在225g下离心2分钟。在扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代常规地用阿库酶处理3-5分钟且在达到75-90％融合度后按1:4-1:8扩增到FMM中的预先涂布有1×基质胶的较大孔中。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达量。选择具有接近100％GFP+和TRA1-81+的克隆系用于另外的PCR筛选和分析。在Guava EasyCyte 8HT(密理博)上进行流式细胞测量术分析并且使用Flowjo(FlowJo有限责任公司)进行分析。
实例2——包括BCMA-CAR的iPSC和从其中分化的效应细胞
为了确认BCMA-CAR构建体表现出表面表达，在含有或不含表达DAP10-Thy1.1的质粒的情况下，将含有CAR-2A-IL15/IL15Rα(截短的)(IL15Δ)的质粒转染到293T细胞中。采集细胞并在第3天检查表面表达。用针对Thy1.1和IL15Ra的抗体以及生物素化的BCMA蛋白，然后用链霉亲和素-FITC对细胞进行染色。通过流式细胞术评估BCMA-CAR、IL15Δ和Thy1.1的细胞表面表达。如图5所示，外源性DAP10似乎促进了293T细胞中的BCMA-CAR和IL15Δ两者的表面表达。
为了检查BCMA-CAR构建体是否也在iPS细胞中表现出表面表达，将CAR-2A-IL15Δ的慢病毒载体在有或没有DAP10-Thy1.1的情况下转导到包括CD38敲除和hnCD16的工程化iPS细胞。对包括CD38敲除和hnCD16的iPS细胞进行连续或同时工程化以获得CD38敲除和高亲和力不可切割的CD16表达。在每个工程化步骤之后，在下一个工程化步骤之前对iPSC进行分选以获得期望的表型，例如，通过敲除B2M基因来丢失HLA-I，通过敲除CIITA来丢失HLA-II，并且这里是所引入的BCMA-CAR和IL15Δ。然后可以在体外或针对衍生细胞产生来维持工程化的iPSC。
在第3天通过流式细胞术检查转导CD38-/-hnCD16 iPSC之后Thy1.1、IL15Δ和BCMA-CAR蛋白的表面表达。在iPS细胞中，外源性DAP10似乎对于促进构建的BCMA-CAR的表面表达不是必需的，而IL15Δ仅在存在外源性DAP10的情况下可检测到(图6)。为了确定iNK细胞中的BCMA-CAR表达模式，将IL15Δ阳性iPS细胞从含有或不含有DAP10的经转导的iPS细胞中分选出来，然后使用本文提供的方法和组合物将其分化成iNK细胞。如先前所描述的，对从包括BCMA-CAR和IL15Δ的iPSC或从除BCMA-CAR和IL15Δ之外还包括DAP10的iPSC中分化的iNK细胞进行表面染色，用于转基因表达评估。BCMA-CAR和IL15Δ的表达独立于DAP10的引入和表达，如图7A-C所示。
端粒缩短随着细胞老化而出现，并且与干细胞功能障碍和细胞衰老相关。尽管产生的衍生细胞(包含T细胞和NK细胞)已经证明了，iPSC中的这些基因工程化的模式在造血分化期间得以维持，而不会干扰细胞在体外定向发育成期望的细胞命运，但这里已经表明与成人外周血对应物细胞相比，成熟衍生细胞维持更长的端粒。例如，在针对G0/1细胞的DNA指数进行校正的情况下使用1301个T细胞白血病系作为对照(100％)，通过流式细胞术来测定iPSC、成体外周血NK细胞和iPSC衍生的NK谱系细胞的端粒长度。如图8中所示，当与成体外周血NK细胞(p＝.105，ANOVA)相比时，iPSC衍生的NK细胞维持显著更长的端粒长度，这表示iPSC衍生的NK细胞中更大的增殖率、存活率和持久性潜能。对iPSC衍生的T细胞的类似观察也是本领域中已知的。
实例3–表达BCMA-CAR的衍生效应细胞的功能特征
为了检测BCMA-CAR定向抗原特异性活性，进行了靶向表达BCMA的Nalm6细胞(Nalm-BCMA)和亲本Nalm6细胞(Nalm-P；没有BCMA表达)的细胞毒性测定。Nalm6-BCMA和Nalm6-P靶细胞分别用细胞增殖染料eFlour-450和eFlour670进行标记。滴定具有或不具有BCMA-CAR的IL15Δ/CD38无效/hnCD16 iNK效应细胞，并以范围为介于30:1与0.03:1之间的效应物:靶标比率(E:T)添加到靶细胞中。没有效应物的靶细胞用作自发细胞死亡的对照。样品在37℃下温育4小时，其中最后30分钟培养时添加
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胱天蛋白酶-3/7绿色检测试剂(1x400稀释度)。如图9所示，与亲本Nalm6相比，表达BCMA-CAR的iNK细胞表现出优异的抗原特异性并诱导显著杀死表达BCMA的Nalm6系。
为了分析T细胞中的BCMA-CAR功能，用携带BCMA-CAR的慢病毒转导了珠刺激的T细胞。在转导后第6天，测试T细胞靶向表达BCMA的肿瘤靶标的能力。如上文所描述的，制备Nalm6-BCMA和亲本-Nalm6系并与经转导的T细胞一起温育。如图10所示，与未经转导的T细胞相比，BCMA-CAR转导的T细胞在Nalm6-BCMA肿瘤组中表现出明显的抗原分辨率并诱导更多的细胞细胞毒性。
为了测试BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞的ADCC介导的双重靶向能力，MM.1R骨髓瘤细胞在使用BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞和CD19-CAR/hnCD16/IL15Δ/iNK细胞作为效应子的再刺激细胞毒性测定中用作靶标。在有或没有达土木单抗的情况下，靶标和效应细胞以3:1的效应物与靶标的比率温育48小时。48小时之后，收集所有效应细胞并转移到含有新MM.1R靶标的新孔中。在另外的48小时再刺激期之后，确定剩余的MM.1R靶细胞的数量。如图11所示，达土木单抗通过hnCD16介导的ADCC与BCMA-CAR协同有效消除多发性骨髓瘤癌细胞，使BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15Δ效应细胞通过靶向癌细胞的多种抗原来增强抗肿瘤活性。
使用表达人BCMA的小鼠黑色素瘤细胞作为肿瘤细胞靶标或使用表达内源性BCMA的人细胞系评估BCMA-CAR的体内功能。对于体内评估，除了包括BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15Δ的iPSC衍生的NK细胞外，小鼠或人T细胞与BCMA-CAR以及其它编辑物：IL15Δ、CD38无效、hnCD16一起转导并用作效应物。
在小鼠黑色素瘤模型中评估了BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16的功效。将小鼠黑色素瘤细胞系B16F10用人BCMA(B16F10-BCMA)进行转导，并且将这些细胞静脉内(IV)或皮下(SC)移植到免疫活性C57BL/6或免疫功能不全的NSG小鼠中。静脉内注射B16F10-BCMA肿瘤细胞在C57BL/6中产生肺转移并且在NSG小鼠中产生肺和肝转移，并且皮下移植在两种小鼠品系中产生单一实体瘤。在C57BL/6小鼠中，在B16F10-BCMA细胞的IV移植后对肺肿瘤结节(转移)进行计数。肿瘤移植后进行BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16-T或NK细胞的过继转移以评估这些细胞减少在这些动物中发展的肿瘤结节数量的能力。肿瘤结节是通过总体形态学和组织切片的显微镜检查来进行进一步评估。在皮下B16-F10-BCMA模型中，肿瘤进展通过肿瘤大小的卡尺测量来监测。与用模拟经转导的T或NK细胞治疗的小鼠相比，肺部肿瘤结节数量和/或大小减少反映了使用BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16-T或NK细胞用B16F10-BCMA细胞静脉内移植的C57BL/6小鼠治疗的有效性。类似地，在B16-F10-MICA肿瘤生长的SC模型中，延缓肿瘤进展、延长存活、诱导肿瘤消退或上述的组合也表明BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16T或NK细胞治疗的有效性。
在NSG小鼠中，对肺和肝肿瘤结节进行计数，并且将用模拟经转导的T细胞处理的小鼠与BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 T细胞进行比较，以便了解其减少每个器官中的结节数量的能力。评估小鼠和人BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 T细胞两者在NSG小鼠中控制肿瘤生长的能力。IV移植有来自人或小鼠来源的BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 T细胞的NSG小鼠的肺和肝中的肿瘤结节的数量和大小的减少表明了治疗的有效性，并且与小鼠的延长的存活相关。
预期在用BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 iNK细胞处理携带B16-F10-BCMA肿瘤的NSG小鼠中也有类似结果。图12A-B示出了使用代表性生物发光图像(图12A)或每个测试组n＝10只小鼠的累积数据(图12B)的BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 iNK细胞与达土木单抗组合在播散性异种移植物MM.1S多发性骨髓瘤模型中的体内功效，证明了与单独使用细胞治疗或达土木单抗治疗相比，肿瘤完全清除，其中至少30天没有复发迹象。
还评估了BCMA-CAR针对各种人肿瘤细胞系的功能。将表达BCMA的人细胞系(包含CI-H929、RPMI-8226、U266和KMS11)移植到免疫功能低下的NSG小鼠中。在使用源自如本文所提供的工程化的人iPSC的BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 T细胞或BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16 iNK细胞治疗携带任何这些肿瘤类型的NSG小鼠时，评估延迟的肿瘤进展、诱导的肿瘤消退和延长的存活。图13示出了BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16iNK细胞通过CAR介导的机制和ADCC介导的机制有效靶向BCMA+多发性骨髓瘤肿瘤细胞系。
BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞的进一步细胞毒性表征使用连续再刺激测定进行。在存在或不存在达土木单抗的情况下，使用BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK作为效应细胞，以1:1的E:T比率对MM.1S细胞进行了所述测定。效应物的BCMA-CAR阴性亲本细胞(CD38无效/hnCD16/IL15Δ)用作对照。细胞共培养持续48小时(R1)，然后收集所有非贴壁细胞并转移到新铺板的MM.1S靶细胞中进行另一轮刺激(R2)。此过程再重复一次(R3)，总共进行3轮刺激。如图14所示，BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞对肿瘤细胞表现出优异的双重靶向杀伤能力。BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15Δ效应细胞在MM.1S细胞的三个连续挑战中也表现出一致且有效的细胞毒性。这种细胞毒性在存在和不存在达土木单抗的情况下都很明显，并且与CAR阴性亲本对照相比，细胞毒性显著改善。值得注意的是，BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15Δ效应细胞在单药治疗和与达土木单抗组合治疗的两个研究组中的每一轮刺激中都表现出改善的细胞毒性，这表明抗原介导的扩增和避免衰竭。
在细胞因子产生测定中，BCMA-CAR iNK细胞用作效应细胞并在存在达土木单抗的情况下用指定的肿瘤细胞系刺激4小时。收集上清液并使用中尺度诊断公司(MesoScaleDiagnostics，MSD)电化学发光平台评估TNFα和IFNγ的水平。如图15所示，取决于肿瘤细胞，CAR靶向或ADCC介导的靶向可以促进细胞因子产生的增加，从而反映了双靶向策略在BCMA-CAR/CD16效应细胞中利用CAR和ADCC增强细胞毒性的优势。
进一步，观察到BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK效应细胞在不存在外源性细胞因子支持的情况下维持体内功效(参见图16)。NSG小鼠移植有MM.1S-Luc细胞，并且在第2天、第9天和第16天用BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK效应物处理，或在第2天用BCMA-CAR T细胞处理。使用了两批iNK效应细胞，并且所有三个治疗组都被分开，并且要么没有另外的细胞因子支持，要么每周注射两次IL-15和IL-2。在存在或不存在体内外源性细胞因子支持的情况下，每个细胞组的BLI图像在图16中示出。用iNK效应细胞处理MM.1S移植的小鼠导致所有三批测试的肿瘤消退和肿瘤生长延迟，其中在细胞因子与无细胞因子支持之间没有观察到显著差异。相比之下，虽然原代CAR-T细胞在存在外源性IL-2和IL-15支持的情况下有效，但当不施用细胞因子时，这些细胞的效力显著降低。因此，BCMA-CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK效应细胞在体内展示了其自主性和持久性特性，无需细胞因子支持，同时维持抗肿瘤能力。
MM.1S细胞在第0天以2.5E5的剂量移植到小鼠中。在第3天、第10天和第17天以5E6的剂量用3个剂量的CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞治疗小鼠。如图17所示，用γ分泌酶抑制剂(GSI)给药的指定小鼠组以1mg/kg口服给予GSI，每周三次，持续三周。达土木单抗在第3天以单剂量100ug在指定组中递送。未经处理的小鼠以黑色实线示出，而未经移植的对照小鼠以虚线的空心圆圈示出。如所示出的，CAR/CD38无效/hnCD16/IL15ΔiNK细胞的体内功效在与CD38抗体或γ分泌酶抑制剂的组合中增加。此外，在CD38抗体和GSI的组合中，效应iNK细胞不仅有效地杀死了体内的肿瘤细胞，而且通过较长时间的移植后成功地控制了体内肿瘤细胞的复发。不受理论限制，ADCC介导的杀伤、增加肿瘤细胞上的BCMA密度、效应细胞自主性和避免互相杀伤可以是用于协同增强另外地包括CD38KO、IL15Δ和CD16的BCMA-CAR iNK效应细胞的体内功效的机制之一。
所属领域的技术人员将容易地了解，本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施例，并且不旨在为对本发明的范围的限制。所属领域的技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对本文所公开的本公开进行各种取代和修改。
本说明书中提及的所有专利和公开案均指示本公开涉及的所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开案均以引用的方式并入本文中，其程度如同每一个别公开案专门地且单独地指示为以引用的方式并入。
本文说明性描述的本公开可以在不存在本文未专门公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，任一个术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”可以用其它两个术语中的任一个置换。已采用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用，且使用这类术语和表述时，不希望排除所示和所描述的特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在所要求的本公开的范围内可以存在各种修改。因此，应理解，虽然已通过优选实施例和任选的特征具体地公开了本公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的概念进行修饰和变化，且这类修饰和变化被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。
序列表
<110> 菲特治疗公司
<120> 多靶向效应细胞和其用途
<130> 056932-519001WO
<160> 48
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD58外显子1敲除（CD58-gNA-1）的靶向序列
<400> 1
gaccacgctg aggaccccca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD58外显子1敲除（CD58-gNA-2）的靶向序列
<400> 2
tggttgctgg gagcgacgcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD58外显子1敲除（CD58-gNA-3）的靶向序列
<400> 3
catggttgct gggagcgacg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD54外显子1敲除（CD54-gNA-1）的靶向序列
<400> 4
cccgagcagg accaggagtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD54外显子1敲除（CD54-gNA-2）的靶向序列
<400> 5
cgcactcctg gtcctgctcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> CD54外显子1敲除（CD54-gNA-3）的靶向序列
<400> 6
ctgggaacag agccccgagc 20
<210> 7
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 340 a.a.基于CD64结构域的构建
<400> 7
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu
290 295 300
Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg
305 310 315 320
Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp
325 330 335
Pro Gln Asp Lys
340
<210> 8
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 336 a.a.基于CD64外显子的构建
<400> 8
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Phe Phe Pro Pro Gly
275 280 285
Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp
290 295 300
Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg
305 310 315 320
Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 9
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 335 a.a.基于CD64外显子的构建
<400> 9
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 10
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码340 a.a.基于CD64结构域的构建的例示序列
<400> 10
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct 900
ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag 960
acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac 1020
cctcaagaca aa 1032
<210> 11
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码336 a.a.基于CD64外显子的构建的例示序列
<400> 11
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg 900
atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga 960
agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa 1020
<210> 12
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码335 a.a.基于CD64外显子的构建的例示序列
<400> 12
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt 900
gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac 960
tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa 1005
<210> 13
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 153 a.a. CD28共刺激 + CD3-ζ-ITAM
<400> 13
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
50 55 60
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
65 70 75 80
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
85 90 95
Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe
100 105 110
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
115 120 125
Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala
130 135 140
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 219 a.a. CD28铰链 + CD28 TM + CD28共刺激 + CD3-ζ-ITAM
<400> 14
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
100 105 110
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
115 120 125
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
130 135 140
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
145 150 155 160
Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
165 170 175
Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
180 185 190
His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe
195 200 205
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215
<210> 15
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 263 a.a. NKG2D TM + 2B4 + CD3-ζ
<400> 15
Ser Asn Leu Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg
1 5 10 15
Ile Gly Met Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp
20 25 30
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
35 40 45
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
50 55 60
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
85 90 95
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
100 105 110
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
115 120 125
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
130 135 140
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
145 150 155 160
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
165 170 175
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
180 185 190
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
195 200 205
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
210 215 220
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
245 250 255
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
260
<210> 16
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 308 a.a. CD8铰链 + NKG2D TM + 2B4 + CD3-ζ
<400> 16
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ser Asn Leu
35 40 45
Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg Ile Gly Met
50 55 60
Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp Arg Arg Lys
65 70 75 80
Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile
85 90 95
Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu
100 105 110
Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser
115 120 125
Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser
130 135 140
Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser
145 150 155 160
Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro
165 170 175
Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe
180 185 190
Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
195 200 205
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
210 215 220
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
225 230 235 240
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
260 265 270
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
275 280 285
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
290 295 300
Leu Pro Pro Arg
305
<210> 17
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 模拟IL15的反式呈递的构建体（设计3）
<400> 17
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln
370 375
<210> 18
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码模拟IL15的反式呈递的构建体（设计3）的示例性核酸序列
<400> 18
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780
ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840
cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900
cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960
accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020
ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080
ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 融合的IL15/mb-Sushi构建体（设计4）
<400> 19
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg
<210> 20
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码融合的IL15/mb-Sushi构建体（设计4）的示例性核酸序列
<400> 20
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcaga 726
<210> 21
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 由SEQ ID NO. 17进一步修饰的蛋白质构建体
<400> 21
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
370 375
<210> 22
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LHA/CD38
<400> 22
cagagggcat tgtgtgcaca cacgtataga agcaggcagc ccaccctcat gctttccagg 60
aagcaaatgt ggctcaggtg taaagtgccc ggttgatgaa gggagttagc ggagggagta 120
taaggatgta ctgtctgccc ccttaggaca cctgcagagg attaaggtgg ctgtttctcc 180
ctggaggtgg agtgggtggg tcactgcaca ggagcctata gttgttggtc ttttaaactc 240
ttattggtgt aaccagccac ggaactctga ggcaaggggt tgggggtggg aagggaaaca 300
gagaaaaggc aagtgaaaca gaaggggagg tgcagtttca gaacccagcc agcctctctc 360
ttgctgccta gcctcctgcc ggcctcatct tcgcccagcc aaccccgcct ggagccctat 420
ggccaactgc gagttcagcc cggtgtccgg ggacaaaccc tgctgccggc tctctaggag 480
agcccaactc tgtcttggcg tcagtatcct ggtcctgatc ctcgtcgtgg tgctcgcggt 540
ggtcgtcccg aggtggcgcc agcagtggag cggtccgggc accaccaagc gctttcccga 600
g 601
<210> 23
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> insol
<400> 23
tcagcctaaa gctttttccc cgtatccccc caggtgtctg caggctcaaa gagcagcgag 60
aagcgttcag aggaaagcga tcccgtgcca ccttccccgt gcccgggctg tccccgcacg 120
ctgccggctc ggggatgcgg ggggagcgcc ggaccggagc ggagccccgg gcggctcgct 180
gctgccccct agcgggggag ggacgtaatt acatccctgg gggctttggg ggggggctgt 240
ccccgtgagc tc 252
<210> 24
<211> 1734
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAG
<400> 24
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 720
cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 780
tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 840
tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 900
gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 960
gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 1020
cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 1080
tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 1140
gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 1200
gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 1260
ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 1320
cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 1380
ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg 1440
caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 1500
ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg 1560
tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg 1620
tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 1680
gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 1734
<210> 25
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL15RF(tr)
<400> 25
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780
ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840
cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900
cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960
accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020
ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080
ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacag 1137
<210> 26
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2A
<400> 26
ggatccggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 27
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hnCD16
<400> 27
atgtggcagc tgctgctgcc tacagctctc ctgctgctgg tgtccgccgg catgagaacc 60
gaggatctgc ctaaggccgt ggtgttcctg gaaccccagt ggtacagagt gctggaaaag 120
gacagcgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tacagccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcatcga cgccgccacc 240
gtggacgaca gcggcgagta tagatgccag accaacctga gcaccctgag cgaccccgtg 300
cagctggaag tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggccc ccagatgggt gttcaaagaa 360
gaggacccca tccacctgag atgccactct tggaagaaca ccgccctgca caaagtgacc 420
tacctgcaga acggcaaggg cagaaagtac ttccaccaca acagcgactt ctacatcccc 480
aaggccaccc tgaaggactc cggctcctac ttctgcagag gcctcgtggg cagcaagaac 540
gtgtccagcg agacagtgaa catcaccatc acccagggcc tggccgtgcc taccatcagc 600
agctttttcc cacccggcta ccaggtgtcc ttctgcctcg tgatggtgct gctgttcgcc 660
gtggacaccg gcctgtactt cagcgtgaaa acaaacatca gaagcagcac ccgggactgg 720
aaggaccaca agttcaagtg gcggaaggac ccccaggaca agtga 765
<210> 28
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TKpA
<400> 28
gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg 60
caataaaaag acagaataaa acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt 120
cggtcccagg gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc 180
cgcgtttctt ccttttcccc accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca 240
gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata gc 272
<210> 29
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RHA/CD38
<400> 29
gatgcgtcaa gtacactgaa attcatcctg agatgaggtg ggttggcgac taaggcgcac 60
cggtgggcac tgcggggaca gcagggcccc gcgcgcaggg aagccgcccg gatcgcccgg 120
aaccgggcat cttccgtggc gggtcagccg agagcccgcc gggtggtgct gagtagggag 180
tcccgggctc ggggctccgc gggccgcttt caggagcagc tggccttggc accgagcgtg 240
cccgcgggag gcgggggggg gcgctgctcg gtggctctgc tgcgtagccg gtgaacactt 300
ggcaccgatg cccgccttct gggcaaggtg ccctgagccc agcccctcgc cgggctgcag 360
cccaccctcg gcgcgctcag cccgcttcac cgcttcaggg acggaataga actcgcagat 420
gcagggtgtc gctgacattt tcaacttttt ctgcggtttc cgcccgctgt ctctgacccg 480
aaagtgcccc cggacggtta cagaggacac ttaagtggtt tgcaaagcct gtggtagggg 540
aggagggtgt agaagggcca aaccacggaa cttagtttta ttcatttata taaagcagca 600
<210> 30
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LHA/CD38
<400> 30
agagggcatt gtgtgcacac acgtatagaa gcaggcagcc caccctcatg ctttccagga 60
agcaaatgtg gctcaggtgt aaagtgcccg gttgatgaag ggagttagcg gagggagtat 120
aaggatgtac tgtctgcccc cttaggacac ctgcagagga ttaaggtggc tgtttctccc 180
tggaggtgga gtgggtgggt cactgcacag gagcctatag ttgttggtct tttaaactct 240
tattggtgta accagccacg gaactctgag gcaaggggtt gggggtggga agggaaacag 300
agaaaaggca agtgaaacag aaggggaggt gcagtttcag aacccagcca gcctctctct 360
tgctgcctag cctcctgccg gcctcatctt cgcccagcca accccgcctg gagccctatg 420
gccaactgcg agttcagccc ggtgtccggg gacaaaccct gctgccggct ctctaggaga 480
gcccaactct gtcttggcgt cagtatcctg gtcctgatcc tcgtcgtggt gctcgcggtg 540
gtcgtcccga ggtggcgcca gcagtggagc ggtccgggca ccaccaagcg ctttcccgag 600
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T2A
<400> 31
ggcagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
<210> 32
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RHA/CD38
<400> 32
cgatgcgtca agtacactga aattcatcct gagatgaggt gggttggcga ctaaggcgca 60
ccggtgggca ctgcggggac agcagggccc cgcgcgcagg gaagccgccc ggatcgcccg 120
gaaccgggca tcttccgtgg cgggtcagcc gagagcccgc cgggtggtgc tgagtaggga 180
gtcccgggct cggggctccg cgggccgctt tcaggagcag ctggccttgg caccgagcgt 240
gcccgcggga ggcggggggg ggcgctgctc ggtggctctg ctgcgtagcc ggtgaacact 300
tggcaccgat gcccgccttc tgggcaaggt gccctgagcc cagcccctcg ccgggctgca 360
gcccaccctc ggcgcgctca gcccgcttca ccgcttcagg gacggaatag aactcgcaga 420
tgcagggtgt cgctgacatt ttcaactttt tctgcggttt ccgcccgctg tctctgaccc 480
gaaagtgccc ccggacggtt acagaggaca cttaagtggt ttgcaaagcc tgtggtaggg 540
gaggagggtg tagaagggcc aaaccacgga acttagtttt attcatttat ataaagcagc 600
a 601
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV重链-1（VH）
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV轻链-1（VL）
<400> 34
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV重链-2（VH）
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV轻链-2（VL）
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV重链-3（VH）
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA scFV轻链-3（VL）
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Val Trp Val Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
145 150 155 160
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Glu Ser Asn Val
180 185 190
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr
195 200 205
Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
225 230 235 240
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
260 265
<210> 40
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Val Glu Ser Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
165 170 175
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Pro Ser Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys
195 200 205
Asp Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
210 215 220
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gly Asp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 41
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile
145 150 155 160
Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro
165 170 175
Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
180 185 190
Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
225 230 235 240
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile
245 250 255
Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
260 265 270
<210> 42
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn
195 200 205
Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
210 215 220
Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr
245 250 255
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 43
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile
145 150 155 160
Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro
165 170 175
Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly
180 185 190
Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
225 230 235 240
Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His
245 250 255
Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
260 265 270
<210> 44
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn
195 200 205
Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
210 215 220
Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr
245 250 255
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Ser Ile Leu His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Met Phe Thr Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys
50 55 60
Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
165 170 175
Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Ile Leu
195 200 205
His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Thr Leu Glu Ile Lys
260
<210> 48
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Ile Leu His Leu Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Ser Lys Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr
145 150 155 160
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Thr Asn Tyr Ala
165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly
180 185 190
Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
195 200 205
Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu
210 215 220
Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val
225 230 235 240
Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser
260

Claims (40)

1.一种细胞或其群体，其中：
(i)所述细胞是诱导多能细胞(iPSC)或通过iPSC分化获得的衍生细胞；并且
(ii)所述细胞包括至少编码BCMA-CAR(嵌合抗原受体)的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中通过iPSC分化获得的所述衍生细胞是造血细胞，并且包括比所述衍生细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞的端粒更长的端粒；或者其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：
(i)是T细胞特异性的；
(ii)是NK细胞特异性的；
(iii)与表面BCMA结合；
(iv)被***在以下基因座之一处：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1；或者
(v)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述***任选地敲除所述基因座中的基因的表达。
3.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中所述细胞进一步包括以下中的一种或多种：
(i)CD38敲除；
(ii)与其天然对应物细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；
(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(iv)外源性CD16或其变体；
(v)具有除了BCMA之外的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；
(vi)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；
(vii)表1中列出的基因型中的至少一种基因型；
(viii)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的缺失或减少的表达：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT；以及
(ix)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段和变体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
4.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中所述BCMA-CAR至少包括：
(a)重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(b)轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；或者
(c)scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39-44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。
5.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中所述细胞是衍生NK或衍生T细胞，并且与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞相比，具有包括以下的以下特性中的至少一个特性：
(i)改善的持久性和/或存活率；
(ii)增加的对天然免疫细胞的抗性；
(iii)增加的细胞毒性；
(iv)改善的肿瘤渗透性；
(v)增强的或获得的ADCC；
(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；
(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；
(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；
(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及
(x)避免互相杀伤(fratricide)的能力。
6.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述外源性CD16或其变体包括高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)。
7.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述外源性CD16或其受体包括以下中的至少一项：
(a)CD16的胞外结构域中的F176V和S197P；
(b)来源于CD64的完全或部分胞外结构域；
(c)非天然(或非CD16)跨膜结构域；
(d)非天然(或非CD16)胞内结构域；
(e)非天然(或非CD16)信号传导结构域；
(f)非天然刺激性结构域；以及
(g)并非来源于CD16并且来源于相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激性结构域。
8.根据权利要求7所述的细胞或其群体，其中
(a)所述非天然跨膜结构域源自CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体(TCR)多肽；
(b)所述非天然刺激性结构域源自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽；
(c)所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽；或者
(d)所述非天然跨膜结构域源自NKG2D，所述非天然刺激性结构域源自2B4，并且
所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ。
9.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述细胞进一步包括具有除BCMA之外的靶向特异性的CAR，并且其中所述CAR是：
(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的；
(ii)双特异性抗原结合性CAR；
(iii)可切换的CAR；
(iv)二聚化CAR；
(v)分开的CAR；
(vi)多链CAR；
(vii)诱导型CAR；
(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物共表达；
(xi)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与抗体或其功能片段或变体或检查点抑制剂共表达；
(xii)对以下中的至少一者具有特异性：CD19、MICA/B、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1；和/或
(xiii)对以下中的任何一种具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合性蛋白(FBP)、胎儿型乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶***结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PRAME、***干细胞抗原(PSCA)、PRAME***特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和病原体抗原。
10.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述细胞至少包括***在TRAC基因座处的CAR和/或由TCR的内源性启动子驱动，和/或所述TCR通过所述CAR***而被敲除。
11.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述细胞表面表达的蛋白质复合物：
(a)包括以下中的至少一项：IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21或其变体；以及其受体或其变体；或者
(b)包括以下中的至少一项：
(i)通过使用自切割肽进行IL15和IL15Rα的共表达；
(ii)IL15和IL15Rα的融合蛋白；
(iii)具有截短的IL15Rα的胞内结构域的IL15/IL15Rα融合蛋白；
(iv)IL15以及IL15Rα的结合膜的Sushi结构域的融合蛋白；
(v)IL15和IL15Rβ的融合蛋白；
(vi)IL15和共同受体γC的融合蛋白，其中所述共同受体γC是天然的或经修饰的；以及
(vii)IL15Rβ的同源二聚体；
其中(i)到(vii)中的任一项可在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；
并且任选地
(c)瞬时表达。
12.根据权利要求3所述的细胞或其群体，其中所述细胞是衍生NK或衍生T细胞，其中所述衍生NK细胞能够募集T细胞和/或将所述T细胞迁移到肿瘤位点，并且其中所述衍生NK或所述衍生T细胞能够在存在一种或多种检查点抑制剂的情况下降低肿瘤免疫抑制。
13.根据权利要求3或12所述的细胞或其群体，其中所述检查点抑制剂是一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR。
14.根据权利要求13所述的细胞或其群体，其中所述检查点抑制剂包括：
(a)以下中的一种或多种：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫纳利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能等效物；或者
(b)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种。
15.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中所述衍生细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞或衍生B细胞。
16.根据权利要求1所述的细胞或其群体，其中所述细胞包括：
(i)一个或多个外源性多核苷酸，所述一个或多个外源性多核苷酸整合在一个安全港基因座或所选基因座中；或者
(ii)多于两个外源性多核苷酸，所述多于两个外源性多核苷酸整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选基因座中；或者
(iii)编码IL15Δ的多核苷酸，所述IL15Δ包括与SEQ ID NO:17、19或21具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的细胞或其群体，其中所述安全港基因座包括以下中的至少一者：AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1；并且其中所述所选基因座是以下之一：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述外源性多核苷酸的所述整合任选地敲除所述基因座中的基因的表达。
18.根据权利要求17所述的细胞或其群体，其中所述TCR基因座是TCRα或TCRβ的恒定区。
19.一种细胞或其群体，其包括BCMA-CAR以及以下中的一种或多种：(i)CD38敲除；(ii)外源性CD16或其变体；以及(iii)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；其中所述细胞是免疫效应细胞。
20.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述BCMA-CAR至少包括：
(a)重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(b)轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；或者
(c)scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39-44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示。
21.根据权利要求19所述的细胞或其群体，与所述细胞的从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的天然对应物细胞相比，其包括以下特性中的至少一个特性：
(i)改善的持久性和/或存活率；
(ii)增加的对天然免疫细胞的抗性；
(iii)增加的细胞毒性；
(iv)改善的肿瘤渗透性；
(v)增强的或获得的ADCC；
(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；
(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；
(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；
(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及
(x)避免互相杀伤的能力。
22.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述免疫效应细胞是T谱系或NK谱系细胞。
23.一种组合物，其包括根据权利要求1到22中任一项所述的细胞或其群体。
24.一种用于治疗用途的组合物，所述组合物包括根据权利要求1到22中任一项所述的细胞以及一种或多种治疗剂。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述一种或多种治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体或其功能变体或片段、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中：
(1)所述检查点抑制剂包括：
(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，所述检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；
(b)以下中的一种或多种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗和其衍生物或功能等效物；或者
(c)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种；或者
(2)所述治疗剂包括维奈托克(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)、泊马度胺(pomalidomide)中的一种或多种；或者
(3)所述治疗剂包括γ分泌酶抑制剂(GSI)。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述抗体包括：
(a)抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；
(b)以下中的一种或多种：利妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(certuximab)、迪努妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗、达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202、7G3、CSL362、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)以及其人源化或经Fc修饰的变体或片段和其功能性等效物和生物仿制药；或者
(c)达土木单抗。
28.一种根据权利要求24到27中任一项所述的组合物通过将所述组合物引入到适于过继性细胞疗法的受试者来实现的治疗用途，其中所述受试者患有：(i)自身免疫性病症；血液***恶性肿瘤；实体瘤；癌症或病毒感染；(ii)炎性自身免疫性疾病、浆细胞癌或B淋巴细胞癌；(iii)与自身反应性浆细胞和/或自身反应性记忆B细胞相关的自身免疫性疾病；(iv)全身性红斑狼疮(SLE)或风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure FDA0003637988920000081
macroglobulinemia)、浆细胞白血病或霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)；或者(v)多发性骨髓瘤。
29.一种制造权利要求1到18中任一项的所述衍生细胞的方法，所述方法包括分化iPSC，其中所述iPSC包括编码BCMA-CAR的多核苷酸以及任选地以下中的一种或多种：
(i)CD38敲除；
(ii)与其天然对应物细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；
(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(iv)高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)或其变体；
(v)具有除了BCMA之外的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；
(vi)包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物；
(vii)表1中列出的基因型中的至少一种基因型；
(viii)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的缺失或减少的表达：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT；以及
(ix)与其天然对应物细胞相比，以下中的至少一者中的所引入或增加的表达：HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、检查点抑制剂、抗体或其功能片段或变体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体。
30.根据权利要求29所述的制造所述衍生细胞的方法，所述方法进一步包括对克隆iPSC进行基因组工程化以敲入编码BCMA-CAR的多核苷酸；并且任选地：
(i)敲除CD38；或者
(ii)敲除B2M和CIITA、或敲除CD58和CD54中的一者或两者或引入HLA-G或不可切割的HLA-G、外源性CD16或其变体、第二CAR和/或包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物的表达。
31.根据权利要求30所述的制造所述衍生细胞的方法，其中所述基因组工程化包括靶向编辑。
32.根据权利要求31所述的制造所述衍生细胞的方法，其中所述靶向编辑包括缺失、***或***/缺失，并且其中所述靶向编辑是通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型进行的。
33.一种对克隆iPSC进行的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑包括敲入编码BCMA-CAR的多核苷酸，并且其中经编辑的克隆iPSC包括表1中列出的基因型中的至少一种基因型。
34.根据权利要求33所述的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑进一步包括敲除CD38，或者其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：
(i)是T细胞特异性的；
(ii)是NK细胞特异性的；
(iii)与表面BCMA结合；
(iv)包括重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(vi)包括轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(vii)包括scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；以及
(viii)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述***敲除所述基因座中的基因的表达。
35.根据权利要求33所述的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑进一步包括在TCR基因座的恒定区处***所述BCMA-CAR或第二CAR，和/或其中所述CAR由TCR的内源性启动子驱动，和/或其中所述TCR通过所述CAR***而被敲除。
36.一种改善多发性骨髓瘤治疗的方法，所述方法包括在治疗下向受试者施用包括BCMA-CAR、CD38敲除和高亲和力不可切割的CD16或其变体的效应细胞，其中所述BCMA-CAR具有以下特性中的至少一个特性：
(i)是T细胞特异性的；
(ii)是NK细胞特异性的；
(iii)与细胞表面BCMA结合并稳定所述细胞表面BCMA；
(iv)包括重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:33、35或37中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(vi)包括轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:34、36或38中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；
(vii)包括scFV，所述scFV由与SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44中的任一个具有至少约99％、98％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列表示；以及
(viii)被***在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述***敲除所述基因座中的基因的表达。
37.据权利要求36所述的方法，其中所述效应细胞包括衍生造血细胞，所述衍生造血细胞包括衍生NK细胞或衍生T细胞，并且其中所述衍生NK细胞或衍生T细胞进一步包括以下中的一种或多种：
(i)B2M和CIITA敲除；
(ii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一者或两者的敲除；
(iii)第二CAR和/或包括细胞因子、细胞因子受体或其任何组合的部分长度或全长的细胞表面表达的蛋白质复合物的所引入表达；和/或
(iii)表1中列出的基因型中的至少一种基因型。
38.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括施用抗CD38抗体和/或GSI。
39.根据权利要求36所述的方法，其中包括BCMA-CAR、CD38敲除和高亲和力不可切割的CD16或其变体的效应细胞已经与GSI接触或正在与其接触。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤是复发性或难治型多发性骨髓瘤。
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