JP2022530584A - 迅速なインキュベーション及び核酸富化による微生物試料の同定及び分析 - Google Patents

迅速なインキュベーション及び核酸富化による微生物試料の同定及び分析 Download PDF

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Abstract

本開示は、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を使用する、試料中の微生物の同定及び分析のための方法、組成物、及びキットに関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年４月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／８４０，３２２号からの、米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本開示は、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を使用した試料中の微生物の同定及び分析のための方法、組成物、及びキットに関する。
患者が微生物感染しているかどうかを決定することは、一般的な臨床的課題である。敗血症は入院患者の最も一般的な死因であり、米国では年間推定２０万人が死亡している。しかしながら、敗血症は、様々な臨床症状を有する不正確な臨床症候群である。診断は通常、臓器機能不全の兆候と組み合わせた感染の疑いに基づく。重度の敗血症又は敗血症ショックへの進行が深刻な結果をもたらすため、早期の敗血症の診断及び抗生物質の投与は重要である。残念ながら、敗血症と他の炎症状態を区別することは、重症の患者において多くの場合困難である。血液中の細菌感染を検出することは、敗血症の診断及び抗菌剤による治療の開始における重要な工程である。しかしながら、血液培養では、重度の敗血症の患者の６０～７０％で陰性であり、研究では、＞８０％が陰性であった。加えて、従来の微生物学的方法は、病原性細菌に対する一次療法に影響を与えるには時間が掛かりすぎる。ＰＣＲ及び質量分析の開発は、血液試料中の細菌を同定する可能性を増加させたが、多くの場合、病原体負荷を増加させるために、血液培養などの時間がかかる分析前処理に依存することが多い。感染の尺度値（proxy）には、循環サイトカイン及びＣ反応性タンパク質などの急性期タンパク質の増加が挙げられるが、これらの濃度はまた、分娩などの生理学的事象、又は火傷などの病理組織損傷中にも増加する。典型的には敗血症については、血液培養検査が、どの種類の細菌又は真菌が血液中に感染を引き起こしたかを同定しようとするために行われる。血液培養は、他の血液試験とは別に収集され、多くの場合、異なる静脈から複数回採取される。血液培養の結果を得るために、数日を要することがある。インビトロ培養条件により、敗血症の人々の３分の１～半分のみが陽性である血液培養を有することになり、これは、細菌が実際にインビトロ条件下で成長及び増殖することを意味する。
現在、細菌の検出は、（１）分析のための細菌を単離するために、並びに（２）分析を困難又は不可能にする可能性のある任意の汚染性バックグラウンド細胞又は他の物質を低減するために、培養を必要とすることが多い。例えば、敗血症の患者では、病原菌を単離するために血液を培養する必要がある。同様に、食品の監視において、汚染微生物を単離するために、試料を培養する必要がる。残念ながら、標準的な培養プロセスは数日間かかる場合がある。敗血症の場合、このラグタイムは、抗生物質の不必要な投与又は誤診断につながり、患者の合併症又は死につながる可能性がある。食品業界では、このラグタイムにより、リコール又はその他の予防措置につながる情報を遅延させる。したがって、活動性感染症の迅速な検出は、問題を低減し、人命を救うことができる方策を可能にすることができる。
ＰＣＲ検出法は、長期培養を必要としないかもしれないが、偏りのない配列決定手法とは対照的に、ＰＣＲは対象となる生物のゲノム配列の先験的知識を必要とする。すなわち、研究者は自分が何を探しているのかを知る必要があり、これはまれな生物又は未発見の生物には当てはまらない可能性がある。更に、ＰＣＲに依存する方法は、試料中の遺伝物質の存在を検出するのみであり、その材料が生存生物又は死滅生物のどちらに由来するかを区別することができない。多くの場合、生存微生物によって引き起こされる活動性感染症の同定は、治療選択肢にとって、また更には食品若しくは環境中の汚染物質の同定にとっても、最も重要な考慮事項である。
本開示は、試料中の生存微生物及び／又は増殖微生物の同定及び分析のための方法であって、（ａ）１つ以上の種類の微生物を有する又は有する疑いのある試料を得ることと、（ｂ）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で試料をインキュベートすることであって、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、（ｃ）新たに合成された微生物核酸を、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと選択的に結合する標識試薬と接触させることにより、新たに合成された微生物核酸を標識することと、（ｄ）標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製することと、（ｅ）単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の配列決定又は同一性の決定に基づいて、試料中の生存微生物及び／又は増殖微生物の同一性を決定することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、試料は、微生物感染症の疑いのある又は微生物感染症である対象から得られる。更に別の実施形態では、対象は、敗血症の疑いがある又は敗血症である。更なる実施形態では、（ａ）で、得られた試料は、非微生物核酸を選択的に除去するために、（ｂ）の前に、脱ホスティング法（dehosting method）を使用して処理される。なお更なる実施形態では、この脱ホスティング法は、非微生物核酸を、（ｉ）得られた試料を、ヒストン（複数可）によって結合された非微生物核酸に若しくはメチル化ＣｐＧ残基を含む非微生物核酸に選択的に結合する結合ドメインと、核酸を切断する活性を有するヌクレアーゼドメインと、を含む組み換えタンパク質と接触させることによって、非微生物ＤＮＡを選択的に切断すること、又は（ｉｉ）ヒストン（複数可）により結合された核酸に選択的に結合するか、若しくは非微生物核酸のメチル化ＣｐＧ残基に選択的に結合する、固体基質に結合している親和性剤（affinity agent）の使用によって、除去すること、を含む。ある特定の実施形態では、試料は、環境試験サイトから得られた環境試料である。別の実施形態では、環境サイトは、微生物汚染について試験される。更に別の実施形態では、試料は、微生物汚染の疑いのある食品から得られた試料である。更なる実施形態では、１つ以上の種類の微生物は、細菌、真菌、ウイルス、藻類、古細菌、及び／又は原虫である。なお更なる実施形態では、細菌は、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バルトネラ・ヘネセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウエイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチア（Rickettsia rickettsia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、及び／又はエルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）、から選択される。別の実施形態では、真菌は、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramose）、アコリオン・ガリナエ（Achorion gallinae）、アクチノマヅラ属種（Actinomadura spp.）、アジェロミセス・デルマチジジス（Ajellomyces dermatididis）、アロイリスマ・ブラジリエンシス（Aleurisma brasiliensis）、アレシェリア・ボイジイ（Allersheria boydii）、アロスロデルマ属種（Arthroderma spp.）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツ（Aspergillus fumigatu）、バシジオボラス属種（Basidiobolus spp）、ブラストミセス属種（Blastomyces spp.）、カドホラ属種（Cadophora spp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、セルコスポラ・アピイ（Cercospora apii）、クリソスポリウム属種（Chrysosporium spp.）、クラドスポリウム属種（Cladosporium spp.）、クラドトリクス・アステロイド（Cladothrix asteroids）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クンニングアメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、デマチウム・ウェルネッケ（Dematium wernecke）、ディスコマイセス・イスラエリイ（Discomyces israelii）、エモンシア属種（Emmonsia spp.）、エモンシエラ・カプスレート（Emmonsiella capsulate）、エンドミセス・ゲオトリクム（Endomyces geotrichum）、エントモルフトラ・コロネート（Entomophthora coronate）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella neoformans）、フォンセセア属種（Fonsecaea spp.）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Geotrichum candidum）、グレノスポラ・カートメンシス（Glenospora khartoumensis）、ギムノアスクス・シプセウス（Gymnoascus gypseus）、ハプロスポランジウム・パルバム（Haplosporangium parvum）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ホルミシウム・デルマチジジス（Hormiscium dermatididis）、ホルモデンドラム属種（Hormodendrum spp.）、ケラチノマイセス属種（Keratinomyces spp）、ランゲロニア・スーダナンス（Langeronia soudanense）、レプトスフェリア－セネガレンシス（Leptosphaeria senegalensis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ロブミセス・ロボイ（Lobmyces loboi）、ロボア・ロボイ（Loboa loboi）、ロボミコーシス（Lobomycosis）、マヅレラ属種（Madurella spp.）、マラセジア・フルフール（Malassezia furfur）、ミクロコッカス・ペレティエリ（Micrococcus pelletieri）、ミクロスポラム属種（Microsporum spp.）、モニリア属種（Monilia spp.）、ムコール属種（Mucor spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナニジア属種（Nannizzia spp.）、ネオテスツジナ・ロサティ（Neotestudina rosatii）、ノカルジア属種（Nocardia spp.）、オイジウム・アルビカンス（Oidium albicans）、オオスポラ・ラクティス（Oospora lactis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペエトリエリジウム・ボイジイ（Petriellidium boydii）、フィアロフォラ属種（Phialophora spp.）、ピエドライア・ホルテ（Piedraia hortae）、ピチロスポルム・フルフール（Pityrosporum furfur）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）（又はニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii））、プルラリア・グウジェロティ（Pullularia gougerotii）、ピレノケータ・ロメロイ（Pyrenochaeta romeroi）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、サブローオ－ダイト（ミクロスポルム属）（Sabouraudites（Microsporum））、サルトーヤ・フミゲート（Sartorya fumigate）、セペドニウム属（Sepedonium）、スポロドリクム属種（Sporotrichum spp.）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、スタキボトリス・チャータラム（Stachybotrys chartarum）、ストレプトマイス属種（Streptomyce spp.）、チニア属種（Tinea spp.）、トルラ属種（Torula spp.）、トリコフィトン属種（Trichophyton spp.）、トリコスポロン属種（Trichosporon spp.）、及び／又はゾフィア・ロサティ（Zopfia rosatii）、から選択される。更に別の実施形態では、ウイルスは、シンプレックスウイルス属（Simplexvirus）、バリセロウイルス属（Varicellovirus）、サイトメガロウイルス属（Cytomegalovirus）、ロゼオロウイルス属（Roseolovirus）、リンホクリプトウイルス属（Lympho-cryptovirus）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）、α－パピローマウイルス属（α-Papillomavirus）、β－パピローマウイルス属（β-Papillomavirus）、Ｘ－パピローマウイルス属（Χ-Papillomavirus）、γ－パピローマウイルス属（γ-Papillomavirus）、ミューパピローマウイルス属（Mupapillomavirus）、ニューパピローマウイルス属（Nupapillomavirus）、アルファポリオーマウイルス属（Alphapolyomavirus）、ベータポリオーマウイルス属（Betapolyomavirus）、γ－ポリオーマウイルス属（γ-Polyomavirus）、デルタポリオーマウイルス属（Deltapolyomavirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、α－トルクウイルス属（α－Torquevirus）、β－トルクウイルス属（β－Torquevirus）、γ－トルクウイルス属（γ－Torquevirus）、サイクロウイルス属（Cyclovirus）、ジェミサーキュラー属（Gemycircular）、ジェミキビウイルス属（Gemykibivirus）、ジェミボンウイルス属（Gemyvongvirus）、エリスロウイルス属（Erythrovirus）、ディペンドウイルス属
（Dependovirus）、ボカウイルス属（Bocavirus）、オルトヘパドナウイルス属（Orthohepadnavirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、デルタレトロウイルス属（Deltaretrovirus）、レンチウイルス属（Lentivirus）、シミスプマウイルス属（Simiispumavirus）、コルチウイルス属（Coltivirus）、ロタウイルス属（Rotavirus）、セアドナウイルス属（Seadornavirus）、α－コロナウイルス属（α-Coronavirus）、β－コロナウイルス属（β－Coronavirus）、トロウイルス属（Torovirus）、ママストロウイルス属（Mamastrovirus）、ノロウイルス属（Norovirus）、サポウイルス属（Sapovirus）、フラビウイルス属（Flavivirus）、ヘパシウイルス属（Hepacivirus）、ベギウイルス属（Pegivirus）、オルトヘペウイルス属（Orthohepevirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ヘパトウイルス属（Hepatovirus）、コブウイルス属（Kobuvirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）、ロサウイルス属（Rosavirus）、サリウイルス属（Salivirus）、アルファウイルス属（Alphavirus）、ルビウイルス属（Rubivirus）、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マーブルグウイルス属（Marburgvirus）、ヘニパウイルス属（Henipavirus）、モルビリウイルス属（Morbilivirus）、レスピロウイルス属（Respirovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、メタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、オルトニューモウイルス属（Orthopneumovirus）、レダンテウイルス属（Ledantevirus）、リッサウイルス属（Lyssavirus）、ベジクロウイルス属（Vesiculovirus）、マンマレナウイルス属（Mammarenavirus）、オルトハンタウイルス属（Orthohantavirus）、オルトナイロウイルス属（Orthonairovirus）、オルトブニヤウイルス属（Orthobunyavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）、α－インフルエンザウイルス属（α-Influenzavirus）、β－インフルエンザウイルス属（β-Influenzavirus）、γ－インフルエンザウイルス属（γ-Influenzavirus）、クアランジャウイルス属（Quaranjavirus）、ソゴトウイルス属（Thogotovirus）、及び／又はデルタウイルス属（Deltavirus）、から選択される。更なる実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体は、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジン、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジン、から選択される。なお更なる実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、及び（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、から選択される。更に別の実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体は、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシアデノシンから選択され、１つ以上のタイプのヌクレオシド又はヌクレオチド類似体は、２’－アジド－２’－デオキシアデノシンから選択され、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、及び５アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジンが選択される。更なる実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジンから選択される。なお更なる実施形態では、試料は、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で５分～１８０分間インキュベートされる。別の実施形態では、試料は、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で、３０分～１２０分間インキュベートされる。更に別の実施形態では、標識試薬は、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、又はヨードデオキシウリジンに高い特異性で結合する。別の実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリー、ひずみ（strained）［３＋２］環化付加反応、又はシュタウディンガーライゲーションを介して、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと結合する。更に別の実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリーを介してアルキニル基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアジド基を含む。更なる実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリーを介してアジド基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアルキニル基を含む。ある特定の実施形態では、標識試薬はビオチン基を含む。更なる実施形態では、ビオチン基を含む標識試薬は、
Figure 2022530584000002
 から選択される。更なる実施形態では、標識試薬は、化学的に切断可能なリンカー又は酵素的に切断可能なリンカーを更に含む。なお更なる実施形態では、切断可能なリンカーは、酸－不安定系（acid-labile-based）リンカー又はジスルフィド系（disulfide-based）リンカーである。ある特定の実施形態では、酸－不安定系リンカーは、ヒドラゾン又はシス－アコニチル基を含む。別の実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、ペプチド系リンカー又はβ－グルクロニド系リンカーを含む。更に別の実施形態では、プルダウン剤（pulldown agent）は、標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製するために使用される。更なる実施形態では、プルダウン試薬は、固体支持体上に固定化された抗体であり、抗体は、標識試薬に高い特異性で結合するか、又は１つ以上の種類のヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する。なお更なる実施形態では、プルダウン試薬は、固体支持体上に固定化されたストレプトアビジン又はアビジンであり、標識試薬はビオチン基を含む。ある特定の実施形態では、固体支持体は、ナノ材料又はマイクロ材料、ビーズ、又はプレートである。別の実施形態では、標識試薬又は標識は、上述の（ｅ）の前に、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸から除去又は切断される。更に別の実施形態では、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の同一性は、異なる微生物からの核酸に対するプローブを含むマイクロアレイを使用することによって決定される。更なる実施形態では、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の同一性が、（ｉ）蛍光色素を含有するプライマーを使用して、第１のＰＣＲベースの方法を用いて、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、プライマーが、保存された微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、（ｉｉ）標識された産物を、２０以上の微生物からの固有の１６ｓ ｒＲＮＡ可変領域配列を含むプローブを含むマイクロアレイに適用することと、（ｉｉｉ）蛍光ハイブリダイゼーション産物のマイクロアレイを撮像すること及びマイクロアレイプローブの配列に基づいて微生物の同一性を決定することに基づいて、生存微生物及び／又は増殖微生物の同一性を決定することと、によって、決定される。別の実施形態では、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の同一性は、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を配列決定することによって決定又は確認される。更に別の実施形態では、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸は、トランスポソームに基づく配列決定法を使用して配列決定される。更なる実施形態では、新たに合成された微生物核酸の配列決定は、（ａ）単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸をビーズ結合型トランスポソームに適用することであって、ビーズ結合型トランスポソームは、微生物核酸の同時断片化及び配列決定プライマーの添加を媒介する、適用することと、（ｂ）微生物核酸断片を、インデックス及びアダプター配列を含むプライマーで増幅して、増幅産物のライブラリを形成することと、（ｃ）増幅産物のライブラリを洗浄及びプールすることと、（ｄ）増幅産物のライブラリを配列決定することと、（ｅ）バイオインフォマティクス分析（bioinformatic analysis）を使用して、増幅産物のライブラリから得られた配列を、既知の微生物配列のデータベースと相関させることに基づいて、生存微生物及び／又は増殖微生物の同一性を決定することと、によるものである。別の実施形態では、新たに合成された微生物核酸がＲＮＡであり、微生物ＲＮＡが、上記の（ｅ）の前に、ｃＤＮＡに逆転写され、生存微生物及び／又は増殖微生物の遺伝子発現が、マイクロアレイを使用して及び／又は配列決定によって、新たに合成された微生物ＲＮＡからの遺伝子産物の発現レベルを分析することに基づいて決定することができる。
特定の実施形態では、本開示はまた、試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性を決定するための方法であって、（ａ）１つ以上の種類の微生物を有する又は有する疑いのある試料を得ることと、（ｂ）試料を２つの試料、対照試料及び処理試料に分割することと、（ｃ）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で対照試料をインキュベートすることであって、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、（ｃ’）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体及び抗菌剤の存在下で処理試料をインキュベートすることであって、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、（ｄ）新たに合成された微生物核酸を、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと選択的に結合する標識試薬と接触させることによって、新たに合成された微生物核酸を、対照試料及び処理試料の新たに合成された微生物核酸を標識することと、（ｅ）対照試料及び処理試料から、標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製することと、（ｆ）対照試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量又は同一性を決定することと、（ｆ’）処理試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び同一性を決定することと、（ｇ）対照試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性と、処理試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量又は同一性とを比較及び任意の変化を決定することと、を含み、処理試料対対照試料において、新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベルが減少している場合、あるいは処理試料対対照試料において、新たに合成された微生物核酸の量及び／又は同一性が減少している場合、抗菌剤が微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す、方法を提供する。別の実施形態では、抗菌剤は、抗生物質、抗真菌剤、及び抗ウイルスから選択される。更なる実施形態では、抗生物質は、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メゾロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピバンピシリン、ピブメシリナム、チカルシリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフカペン、セフダロキシム（cefdaloxime）、セフジニル、セフジトレン、セフェタメット、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン（ceftiolene）、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフクリジン（cefclidine）、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン、セファクロメジン（cefaclomezine）、セファロラム（cefaloram）、セファパロール（cefaparole）、セフカネル（cefcanel）、セフェドロロール（cefedrolor）、セフェムピドン（cefempidone）、セフェトリゾール（cefetrizole）、セフィビトリル（cefivitril）、セフマチレン、セフメピジウム（cefmepidium）、セフォベシン、セフォキサゾール（cefoxazole）、セフロチル（cefrotil）、セフスミド（cefsumide）、セフラセチム（cefuracetime）、セフチオキシド（ceftioxide）、アズトレオナム、イミペネム、ドリペネム、エルタペネム、メロペネム、アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、フルメキン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミド酸、ピペミド酸、ロソキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、デラフロキサシン（delafloxacin）、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン、バンコマイシン、テイコプラニン、テラバンシン、リネゾリド、サイクロセリン、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル（rifalazil）、バイオマイシン、カプレオマイシン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、及びニトロフラントイン、から選択される。なお更なる実施形態では、抗真菌剤は、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、テルコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール、アバファンギン（abafungin）、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、トルナフテート、フルシトシン、ブテナフィン、グリセオフルビン、シクロピロックス、硫化セレン、タバボロール（tavaborole）、から選択される。別の実施形態では、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ブリブジン、ドコサノール、ファムシクロビル、フォスカーネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、ビダラビン、シタラビン、バラシクロビル、トロマタンジン（tromatandine）、プリテリビル（pritelivir）、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ペラミビル、ザナミビル、アスナプレビル、ボセプレビル、シルプレビル、ダノプレビル、ファルダプレビル、グレカプレビル（glecaprevir）、グラゾプレビル（grazoprevir）、ナルラプレビル（narlaprevir）、パリタプレビル、シメプレビル、ソバプレビル（sovaprevir）、テラプレビル、バニプレビル、ベドロプレビル（vedroprevir）、ボキシラプレビル（voxilaprevir）、ダクラタスビル、エルバスビル、レジパスビル、オダラスビル（odalasvir）、オムビタスビル、ピブレンタスビル（pibrentasvir）、ラビダスビル（ravidasvir）、ルザスビル（ruzasvir）、サマタスビル（samatasvir）、ベルパタスビル（velpatasvir）、ベクラブビル、ダサブビル、デレオブビル（deleobuvir）、フィリブビル（filibuvir）、セトロブビル（setrobuvir）、ソホスブビル、ラダルブビル（radalbuvir）、ウプリフォスビル（uprifosbuvir）、ラミブジン、テルビブジン、クレブジン、アデフォビル、テノフビル・ジソプロキシル（tenofvir disoproxil）、テノホビル・アラフェナミド、エンフビルチド、マラビロク、ビクリビロック、セニクリビロック（cenicriviroc）、ＰＲＯ １４０、イバリズマブ（ibalizumab）、フォステムサビル（fostemsavir）、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、ジドブジン、アムドキソビル、アプリシタビン（apricitabine）、センサブジン（censavudine）、エルブシタビン（elvucitabine）、ラシビル（racivir）、スタンピジン（stampidine）、４’－エチニル－２－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、ザルシタビン、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、リルピビリン、ドラビリン（doravirine）、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル（cabotegravir）、ビクテグラビル（bictegravir）、ＭＫ－２０４８、ベビリマット（bevirimat）、ＢＭＳ－９５５１７６、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、チプラナビル、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル、ビクテグラビル、ＭＫ－２０４８、コビシスタット、リトナビル、インターフェロン－α、ペグインターフェロン－α、メチサゾン、リファンピシン、イミキモド、レシキモド、ポドフィロトキシン、ホミビルセン、シドフォビル、プリコナリル、ファビピラビル、ガリデシビル（galidesivir）、レムデシビル、メリシタビン、ＭＫ－６０８、ＮＩＴＤ００８、モロキシジン、トロマンタジン、及びトリアザビリン（triazavirin）、から選択される。なお更なる実施形態では、試料は、微生物感染症の疑いのある又は微生物感染症である対象から得られる。特定の実施形態では、対象は、敗血症の疑いがある又は敗血症である。別の実施形態では、１つ以上の種類の微生物は、細菌、真菌、及び／又はウイルスである。更に別の実施形態では、細菌は、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バルトネラ・ヘネセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウエイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・レプレ（My
cobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチア（Rickettsia rickettsia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、及び／又はエルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）、から選択される。更なる実施形態では、真菌は、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramose）、アコリオン・ガリナエ（Achorion gallinae）、アクチノマヅラ属種（Actinomadura spp.）、アジェロミセス・デルマチジジス（Ajellomyces dermatididis）、アロイリスマ・ブラジリエンシス（Aleurisma brasiliensis）、アレシェリア・ボイジイ（Allersheria boydii）、アロスロデルマ属種（Arthroderma spp.）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツ（Aspergillus fumigatu）、バシジオボラス属種（Basidiobolus spp）、ブラストミセス属種（Blastomyces spp.）、カドホラ属種（Cadophora spp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、セルコスポラ・アピイ（Cercospora apii）、クリソスポリウム属種（Chrysosporium spp）、クラドスポリウム属種（Cladosporium spp.）、クラドトリクス・アステロイド（Cladothrix asteroids）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クンニングアメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、デマチウム・ウェルネッケ（Dematium wernecke）、ディスコマイセス・イスラエリイ（Discomyces israelii）、エモンシア属種（Emmonsia spp.）、エモンシエラ・カプスレート（Emmonsiella capsulate）、エンドミセス・ゲオトリクム（Endomyces geotrichum）、エントモルフトラ・コロネート（Entomophthora coronate）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella neoformans）、フォンセセア属種（Fonsecaea spp.）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Geotrichum candidum）、グレノスポラ・カートメンシス（Glenospora khartoumensis）、ギムノアスクス・シプセウス（Gymnoascus gypseus）、ハプロスポランジウム・パルバム（Haplosporangium parvum）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ホルミシウム・デルマチジジス（Hormiscium dermatididis）、ホルモデンドラム属種（Hormodendrum spp.）、ケラチノマイセス属種（Keratinomyces spp.）、ランゲロニア・スーダナンス（Langeronia soudanense）、レプトスフェリア－セネガレンシス（Leptosphaeria senegalensis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ロブミセス・ロボイ（Lobmyces loboi）、ロボア・ロボイ（Loboa loboi）、ロボミコーシス（Lobomycosis）、マヅレラ属種（Madurella spp.）、マラセジア・フルフール（Malassezia furfur）、ミクロコッカス・ペレティエリ（Micrococcus pelletieri）、ミクロスポルム属種（Microsporum spp.）、モニリア属種（Monilia spp.）、ムコール属種（Mucor spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナニジア属種（Nannizzia spp.）、ネオテスツジナ・ロサティ（Neotestudina rosatii）、ノカルジア属種（Nocardia spp.）、オイジウム・アルビカンス（Oidium albicans）、オオスポラ・ラクティス（Oospora lactis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペエトリエリジウム・ボイジイ（Petriellidium boydii）、フィアロフォラ属種（Phialophora spp）、ピエドライア・ホルテ（Piedraia hortae）、ピチロスポルム・フルフール（Pityrosporum furfur）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）（又はニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii））、プルラリア・グウジェロティ（Pullularia gougerotii）、ピレノケータ・ロメロイ（Pyrenochaeta romeroi）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、サブローオ－ダイト（ミクロスポルム属）（Sabouraudites（Microsporum））、サルトーヤ・フミゲート（Sartorya fumigate）、セペドニウム属（Sepedonium）、スポロドリクム属種（Sporotrichum spp.）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、スタキボトリス・チャータラム（Stachybotrys chartarum）、ストレプトマイス属種（Streptomyce spp.）、チニア属種（Tinea spp.）、トルラ属種（Torula spp.）、トリコフィトン属種（Trichophyton spp.）、トリコスポロン属種（Trichosporon spp.）、及び／又はゾフィア・ロサティ（Zopfia rosatii）、から選択される。なお更なる実施形態では、ウイルスは、シンプレックスウイルス属（Simplexvirus）、バリセロウイルス属（Varicellovirus）、サイトメガロウイルス属（Cytomegalovirus）、ロゼオロウイルス属（Roseolovirus）、リンホクリプトウイルス属（Lympho-cryptovirus）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）、α－パピローマウイルス属（α-Papillomavirus）、β－パピローマウイルス属（β-Papillomavirus）、Ｘ－パピローマウイルス属（Χ-Papillomavirus）、γ－パピローマウイルス属（γ-Papillomavirus）、ミューパピローマウイルス属（Mupapillomavirus）、ニューパピローマウイルス属（Nupapillomavirus）、アルファポリオーマウイルス属（Alphapolyomavirus）、ベータポリオーマウイルス属（Betapolyomavirus）、γ－ポリオーマウイルス属（γ-Polyomavirus）、デルタポリオーマウイルス属（Deltapolyomavirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、α－トルクウイルス属（α-Torquevirus）、β－トルクウイルス属（β-Torquevirus）、γ－トルクウイルス属（γ-Torquevirus）、サイクロウイルス属（Cyclovirus）、ジェミサーキュラー属（Gemycircular）、ジェミキビウイルス属（Gemykibivirus）、ジェミボンウイルス属（Gemyvongvirus）、エリスロウイルス属（Erythrovirus）、ディペンドウイルス属（Dependovirus）、ボカウイルス属（Bocavirus）、オルトヘパドナウイルス属（Orthohepadnavirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、デルタレトロウイルス属（Deltaretrovirus）、レンチウイルス属（Lentivirus）、シミスプマウイルス属（Simiispumavirus）、コルチウイルス属（Coltivirus）、ロタウイルス属（Rotavirus）、セアドナウイルス属（Seadornavirus）、α－コロナウイルス属（α-Coronavirus）、β－コロナウイルス属（β-Coronavirus）、トロウイルス属（Torovirus）、ママストロウイルス属（Mamastrovirus）、ノロウイルス属（Norovirus）、サポウイルス属（Sapovirus）、フラビウイルス属（Flavivirus）、ヘパシウイルス属（Hepacivirus）、ベギウイルス属（Pegivirus）、オルトヘペウイルス属（Orthohepevirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ヘパトウイルス属（Hepatovirus）、コブウイルス属（Kobuvirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）、ロサウイルス属（Rosavirus）、サリウイルス属（Salivirus）、アルファウイルス属（Alphavirus）、ルビウイルス属（Rubivirus）、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マーブルグウイルス属（Marburgvirus）、ヘニパウイルス属（Henipavirus）、モルビリウイルス属（Morbilivirus）、レスピロウイルス属（Respirovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、メタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、オルトニューモウイルス属（Orthopneumovirus）、レダンテウイルス属（Ledantevirus）、リッサウイルス属（Lyssavirus）、ベジクロウイルス属（Vesiculovirus）、マンマレナウイルス属（Mammarenavirus）、オルトハンタウイルス属（Orthohantavirus）、オルトナイロウイルス属（Orthonairovirus）、オルトブニヤウイルス属（Orthobunyavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）、α－インフルエンザウイルス属（α－Influenzavirus）、β－インフルエンザウイルス属（β－Influenzavirus）、γ－インフルエンザウイルス属（γ－Influenzavirus）、クアランジャウイルス属（Quaranjavirus）、ソゴトウイルス属（Thogotovirus）、及び／又はデルタウイルス属（Deltavirus）、から選択される。ある特定の実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体は、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジン、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジン、から選択される。別の実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル
）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、及び（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、から選択される。更に別の実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシンから選択され、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、及び５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジンから選択される。特定の実施形態では、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジンから選択される。別の実施形態では、対照試料及び処理試料は、両方とも、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で５分～１８０分間同じ時間でインキュベートされる。更に別の実施形態では、対照試料及び処理試料は、両方とも、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で、３０分～１２０分間同じ時間でインキュベートされる。更なる実施形態では、標識試薬は、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する抗体である。なお更なる実施形態では、抗体は、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、又はヨードデオキシウリジンに高い特異性で結合する。ある特定の実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリー、ひずみ［３＋２］環化付加反応、又はシュタウディンガーライゲーションを介して、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと結合する。別の実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリーを介してアルキニル基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアジド基を含む。更に別の実施形態では、標識試薬は、クリックケミストリーを介してアジド基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアルキニル基を含む。更なる実施形態では、標識試薬はビオチン基を含む。特定の実施形態では、ビオチン基を含む標識試薬は、
Figure 2022530584000003
 から選択される。
別の実施形態では、標識試薬は、化学的に切断可能なリンカー又は酵素的に切断可能なリンカーを更に含む。更に別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸－不安定系リンカー又はジスルフィド系リンカーである。更なる実施形態では、酸－不安定系リンカーは、ヒドラゾン又はシス－アコニチル基を含む。なお更なる実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、ペプチド系リンカー又はβ－グルクロニド系リンカーを含む。特定の実施形態では、プルダウン剤は、標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製するために使用される。別の実施形態では、プルダウン試薬は、固体支持体上に固定化された抗体であり、抗体は、標識試薬に高い特異性で結合するか、又は１つ以上の種類のヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する。更に別の実施形態では、プルダウン試薬は、固体支持体上に固定化されたストレプトアビジン又はアビジンであり、標識試薬はビオチン基を含む。別の実施形態では、固体支持体は、ナノ材料又はマイクロ材料、ビーズ、又はプレートである。更に別の実施形態では、標識試薬又は標識は、上記（ｆ）（ｆ’）及び（ｇ）の前に、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸から除去又は切断される。更なる実施形態では、対照試料中及び処理試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性を決定することが、異なる微生物からの核酸に対するプローブを含むマイクロアレイを使用することによって決定される。なお更なる実施形態では、対照試料中及び処理試料中の単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性を決定することが、（ｉ）蛍光色素を含有するプライマーを使用して、第１のＰＣＲベースの方法を用いて、対照試料からの単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、プライマーが、保存された微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、（ｉ’）蛍光色素を含有するプライマーを使用して、第１のＰＣＲベースの方法を用いて、処理試料からの単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、プライマーが、保存された微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、（ｉｉ）対照試料からの標識された産物を、２０以上の微生物からの固有の１６ｓ ｒＲＮＡ可変領域配列を含むプローブを含む第１のマイクロアレイに適用することと、（ｉｉ’）処理試料からの標識された産物を、第２のマイクロアレイに適用することであって、第２のマイクロアレイが、第１のマイクロアレイの複製である、適用することと、（ｉｉｉ）蛍光ハイブリダイゼーション産物の第１のマイクロアレイ及び第２のマイクロアレイを撮像すること、及びマイクロアレイ間の蛍光ハイブリダイゼーション産物の強度、位置、又は非存在に関して任意の変化があるかどうかを決定することに基づいて、試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性を決定することであって、第１のマイクロアレイと第２のマイクロアレイとの間の蛍光ハイブリダイゼーション産物の強度の低下がある場合、又は第１のマイクロアレイと第２のマイクロアレイとの間の蛍光ハイブリダイゼーション産物の位置又は非存在に変化がある場合、抗菌剤が、微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す、決定することと、による。別の実施形態では、試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性が、対照試料から及び処理試料からの単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を配列決定することにより、決定又は確認され、処理試料対対照試料中における新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベルの減少、あるいは、処理試料対対照試料中における新たに合成された微生物核酸の量及び／又は同一性の減少がある場合に、抗菌剤が、微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す。更に別の実施形態では、対照試料及び処理試料からの単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸は、トランスポソームに基づく配列決定法を使用して配列決定される。更なる実施形態では、対照試料及び処理試料からの新たに合成された微生物核酸の配列決定が、（ａ）対照試料及び処理試料からの単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を、ビーズ結合型トランスポソームに適用することであって、ビーズ結合型トランスポソームが、微生物核酸の同時断片化及び配列決定プライマーの添加を媒介する、適用することと、（ｂ）微生物核酸断片を、インデックス及びアダプター配列を含むプライマーで増幅して、増幅産物のライブラリを形成することと、（ｃ）対照試料からの増幅産物のライブラリを洗浄及びプールすることと、（ｃ’）処理試料からの増幅産物のライブラリを洗浄及びプールすることと、（ｄ）対照試料からの増幅産物のライブラリを配列決定することと、（ｄ’）処理試料からの増幅産物のライブラリを配列決定することと、（ｅ）バイオインフォマティクス分析の使用に基づいて、対照試料及び処理試料からの、単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性の任意の変化を決定することと、によるものである。なお更なる実施形態では、新たに合成された微生物核酸はＲＮＡであり、微生物ＲＮＡは、上記（ｆ）、（ｆ’）及び（ｇ）の前に、ｃＤＮＡに逆転写され、微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性が、マイクロアレイを使用することによって、及び／又は配列決定することによって、対照試料及び処理試料からの新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベルの変化を決定することに基づいて、決定することができる。
迅速な細菌培養から新たに合成されたＤＮＡを富化させるためのワークフローの例示的な実施形態を示す。新たに合成されたＤＮＡの富化は、患者試料中の生存細菌の遺伝的同定を可能にする。
迅速な細菌培養から新たに合成されたＲＮＡを富化するためのワークフローの例示的な実施形態を示す。新たに合成されたＲＮＡの富化は、患者試料中の生存細菌による遺伝子発現の評価を可能にする。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「微生物」への言及は、複数のそのような微生物を含み、「ヌクレオシド類似体」への言及は、当業者に既知の１つ以上のヌクレオシド類似体及びその等価物などへの言及を含む。
また、別途記載のない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。同様に、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含める（include）」、「含める（includes）」、及び「含めている（including）」は、互換可能であり、限定することを意図するものではない。
様々な実施形態の説明が用語（term）「含んでいる（comprising）」を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例では、実施形態が、用語（language）「から本質的になる」又は「からなる」を使用して代替的に説明され得ることを更に理解するであろう。
別途定義されない限り、本開示書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。多くの方法及び試薬は、本明細書に記載されるものと類似又は同等であるが、例示的な方法及び材料が本明細書に開示される。
本明細書に記載される全ての刊行物は、本明細書の説明に関連して使用され得る方法論を説明及び開示する目的で、参照により全体が本明細書に組み込まれる。更に、本開示において明示的に定義されている用語と類似又は同一である１つ以上の刊行物に提示される任意の用語に関して、本開示において明示的に提供される用語の定義は、全ての点において支配する。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されるものではなく、したがって変化する可能性があることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
操作実施例以外又は特に明記されていない場合、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数値は、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。本発明を説明するために使用される場合の用語「約」は、パーセンテージに関連して、±１％を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「クリックケミストリー」は、銅（Ｉ）触媒の存在下で実施される場合の、［３＋２］環化付加反応を指す。銅（Ｉ）触媒は、銅（Ｉ）イオン又は銅（Ｉ）キレート部分を含み得る。銅（Ｉ）キレート部分は、「銅（Ｉ）イオンとの錯体（２つ以上の配位結合を含有する）の形成に関与し得る２つ以上の極性基の存在を特徴とする任意の実体」であってもよい（例えば、Ｓａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００７０２０７４７６号（上掲）を参照されたい）。銅（Ｉ）キレート剤の例としては、ネオクプロイン及びバソクプロインジスルホネートが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００７０２０７４７６号及びＳｈａｒｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００３０００５１６６７１号を参照されたい）。［３＋２］環化付加反応は、１，３双極子環化付加としても知られており、１，３－双極子と親双極子（dipolarophile）との間で生じ得る。１，３－双極子の例としては、アジドが挙げられる。親双極子の例としては、アルキンが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「色素」は、光を放出して観察可能な検出可能なシグナルを産生する化合物を指す。
本明細書で使用する場合、用語「二重標識」は、識別可能なシグナルを産生する２つの検出可能な薬剤で核酸が標識される標識化プロセスを指す。このような標識化プロセスから得られる核酸は、二重に標識化されていると言われる。
本明細書で使用する場合、用語「色素標識アルキン」は、色素標識を含むように更に修飾されたアルキンを指す。
本明細書で使用する場合、用語「色素標識アジド」及び「アジド色素分子」は、色素で標識もされた反応性アジド基を有する化合物又は分子を指す。例としては、限定するものではないが、ローダミン－アジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５－アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８－アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８－アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４アジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３－アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７－アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）アジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、フルオレセイン－アジド、クマリン－アジド、ＢＯＤＩＰＹ－アジド、シマリン－アジド、又はテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）－アジド、が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「色素標識シクロアルキン」は、色素標識を含むように更に修飾されたシクロアルキンを指す。用語「シクロアルキン」は、ＤＮＡを標識するために、ひずみ［３＋２］環化付加反応で使用され得る化合物又は分子を指す。この文脈において、シクロアルキンの例としては、シクロオクチン、ジフルオロシクロオクチン、ヘテロシクロアルキン、ジクロロシクロオクチン、ジブロモシクロオクチン、又はジヨードシクロオクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、細胞、組織、又は微生物における関連応答を引き出す物質、化合物、分子、薬剤、又は組成物の量を指す。例えば、ヌクレオシド類似体と接触した微生物の場合、有効量は、微生物のＤＮＡに組み込まれるヌクレオシドの量である。
本明細書で使用する場合、用語「発蛍光団」又は「蛍光発生性」は、生物学的化合物又は対象とする検体への結合時に蛍光の変化を示す組成物を指す。本開示の好ましい発蛍光団としては、水性媒体中で高い量子収率を有する蛍光色素が挙げられる。例示的な発蛍光団としては、中でも、キサンテン、インドール、ボラポリアザインダセン、フラン、及びベンゾフラン、シアニンが挙げられる。本発明の発蛍光団は、発蛍光団の溶解性、スペクトル特性、又は物理的特性を変更するように置換されてもよい。
本明細書で使用する場合、用語「標識」は、本開示の標識試薬の一部が本開示の方法で使用されるとき、その本来の特性（例えば、スペクトル特性、立体構造及び活性）を保持する化学部分又はタンパク質を指す。例示的な「標識」分子は、直接検出可能（発蛍光団）、間接的に検出可能（ハプテン又は酵素）であってもよく、又はヌクレオシドが組み込まれた核酸の検出及び精製に使用することができる（例えば、ビオチン－ストレプトアビジンプルダウンアッセイ）。このような「標識」分子としては、限定するものではないが、クリックケミストリーで設計されたビオチン標識、イミノビオチン、又はデスチオビオチン含有標識、例えば
Figure 2022530584000004
 放射線計数装置で測定することができるラジオレポーター分子；分光光度計で視覚的に観察又は測定され得るピグメント、色素、又は他の色原体；スピン標識分析器で測定することができるスピン標識；蛍光部分であって、出力シグナルが好適な分子付加物の励起によって生成され、色素によって吸収される光による励起によって可視化することができるか、又は例えば、標準的な蛍光光度計又は撮像システムで測定することができる、蛍光部分、が含まれる。「標識」分子は、蛍光体又は蛍光物質などの発光物質、生物発光物質、出力シグナルがシグナル化合物の化学修飾によって生成される化学発光物質、金属含有物質、又は、無色基質からの着色産物の形成などの酵素依存性のシグナルの二次生成が生じる酵素、であってよい。「標識」はまた、コロイド金、微小球、量子ドット、又はナノ結晶若しくは蛍光体などの無機結晶を含むがこれらに限定されない、化学的若しくは生化学的な形態、又は不活性粒子の形態をとってもよい（例えば、Ｂｅｖｅｒｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３，３２６－３４（１９９２）を参照されたい）。「標識」分子はまた、ヌクレオシド類似体を「タグ付け」するために使用される「タグ」又はハプテンであってもよい。次に、「タグ」は、「タグ」に選択的に結合する別の試薬によって結合され得る。例えば、ビオチン、イミノビオチン、又はデスチオビオチンを「タグ」として使用し、次いで、基質（例えば、ビーズ）、標識、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされたアビジン又はストレプトアビジンを使用してビオチン系「タグ」に結合することができる。後者に関して、発色基質（例えば、テトラメチルベンジジン）又は蛍光発生性基質、例えばＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ又はＡｍｐｌｅｘ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用することができる。同様に、タグは、ハプテン又は抗原（例えば、ジゴキシゲニン）、及び酵素的に、蛍光的に標識された抗体、又は放射線活性標識抗体を使用してタグに結合することができる。数多くのレポーター分子は、当業者に既知であり、粒子、蛍光色素、ハプテン、酵素、並びにそれらの発色性、蛍光発生性、及び化学発光基質、並びにＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，１０ｔｈ Ｅｄ．，（２００５）に記載されている他のレポーター分子が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「微生物（microorganism）」又は「病原微生物（microbe）」は、本明細書では互換的に使用され、その単一細胞型又は細胞のコロニー内に存在し得る微視的な生物を指す。本開示の目的のために、本明細書で使用するとき、「微生物」は、細菌、真菌、ウイルス、藻類、古細菌、及び原虫を含む。
本明細書で使用する場合、用語「微生物増殖」は、微生物（複数可）の増殖及び／又は成長を指す。
用語「ヌクレオシド類似体」及び「ヌクレオチド類似体」は、互換的に使用され、本明細書では、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる天然ヌクレオシド又はヌクレオチドと構造的に類似する分子又は化合物を指す。ヌクレオシドの場合、細胞内に入ると、リン酸化されてヌクレオチドになり、次いで、新生の核酸ポリマーに組み込まれる。ヌクレオチドは、それらの電荷に起因して細胞膜を横切ることが困難であり、ヌクレオシドよりも不安定であるため、それらの使用は、典型的には、脂質二重層を横切ってヌクレオチドを輸送するためにトランスフェクションのための追加の工程及び試薬を必要とする。本ヌクレオシド類似体は、天然ヌクレオチドと同様の方法で核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に組み込まれ、正しいポリメラーゼ酵素が、天然ヌクレオチドとして類似体を認識し、合成において支障はない。これらの類似体は、ハロゲン化類似体（ブロモ、クロロ、ヨードなど）及びアジド、アルキン、又はホスフィンなどの生体直交部分を含むものなど、最終的に検出に使用されるいくつかの異なる部分を含む。
本明細書で使用する場合、用語「プルダウン試薬」は、本明細書に開示される１つ以上の標識ヌクレオチド類似体を含む、新生の核酸ポリマーを精製又は単離するために使用される試薬を指す。「プルダウン試薬」は、典型的には、ビーズなどの固体支持体に結合され、本明細書に開示される標識と選択的に結合する。典型的には、標識は、上記のように「タグ」として機能する。例示的な実施形態では、プルダウン試薬は、ビーズ、超常磁性マイクロ粒子又はナノ粒子、プレートなどの固体支持体にコンジュゲートされたストレプトアビジンである。別の実施形態では、プルダウン試薬は、ビーズ、超常磁性マイクロ粒子、又はナノ粒子、プレートなどの固体支持体上に固定化される標識又は「タグ」に特異的な抗体又は他の種類の親和性リガンドである。
本明細書で使用する場合、用語「シュタウディンガーライゲーション」は、古典的なシュタウディンガー反応の改変である、Ｓａｘｏｎ及びＢｅｒｔｏｚｚｉによって開発された化学反応（Ｅ．Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７：２００７－２０１０）を指す。古典的なシュタウディンガー反応は、アジドとホスフィン又はホスファイトとの組み合わせがアザ－イリド中間体を産生し、加水分解するとホスフィンオキシド及びアミンが生じる、化学反応である。シュタウディンガー反応は、アジドをアミンに還元する穏和な方法であり、トリフェニルホスフィンが還元剤として一般的に使用される。シュタウディンガーライゲーションにおいて、求電子トラップ（通常、メチルエステル）がトリアリールホスフィンアリール基（通常、リン原子に対してオルト位）に適切に配置され、アジドと反応して、アザ－イリド中間体を生成し、これは水性媒体中で再構成してアミド基及びホスフィンオキシド官能基を有する化合物を産生する。このシュタウディンガーライゲーションは、２つの出発分子を一緒にライゲーション（結合／共有結合）するためこのように名付けられたが、古典的なシュタウディンガー反応では、加水分解後に２つの産物は共有結合しない。
用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、本明細書において互換的に使用され、試料が得られ得る動物、特にヒトを指す。これは、ヒト及び非ヒト動物を含む。本明細書では、用語「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」は、本明細書において互換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの哺乳動物、及びニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳動物が挙げられる。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとして実験動物又は動物代替物である。「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、並びにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの動物園、スポーツ若しくはペット動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。患者又は対象は、前述の任意のサブセット、例えば、上記の全てを含むが、ヒト、霊長類、又はげっ歯類などの１つ以上の群又は種を除外する。対象は、男性又は女性であり得る。対象は、完全に発達した対象（例えば、成人）、又は発育過程を経ている対象（例えば、小児、乳児、又は胎児）であってもよい。
生存している増殖微生物（例えば、細菌藻類、古細菌、原虫、及び真菌）は、新しいＤＮＡを継続的に合成する。直接対照的に、もはや生存していない微生物は、もはやＤＮＡを合成しなくなる。生きている非増殖性微生物は、新たなＤＮＡを合成してそれらのゲノムを修復及び維持することが可能であるが、新たなＤＮＡ合成の速度は、生存している増殖微生物よりもはるかに低い。本開示は、患者からの血液試料、若しくは環境試料、又は汚染が疑われる食品からの試料などの、試料中の生存している増殖微生物を迅速に同定するために、ＤＮＡ合成における前述の差異を利用する方法論及び技術を提供する。具体的には、本明細書に提示される方法論及び技術は、試料が非生存微生物又は非増殖微生物を更に含むか又は汚染されているかどうかにかかわらず、試料中の生存している増殖微生物の同定を可能にする。より具体的には、本明細書に提示される方法論及び技術は、試料中の１種以上の微生物から得られた新たに合成された微生物ＤＮＡの選択的富化及び配列決定を提供し、試料中に含有される生存している増殖微生物の同定を可能にする。
本開示はまた、混合集団中の特定の生物又は同様の生物群からＤＮＡ及びＲＮＡを選択的に富化するために使用することができる方法及び組成物を提供する。例えば、脱ホスティング（dehosting）適用の場合、感染宿主からのＤＮＡ又はＲＮＡのバックグラウンドから感染生物のＤＮＡ又はＲＮＡを富化することが望まれる。本方法は、標的化生物を同定するために、混合集団から標的化微生物（例えば、細菌）のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを迅速に富化することを可能にする。富化は、標的化生物のみがＤＮＡ及び／又はＲＮＡを合成できるような条件を必要とする。例えば、培地条件、温度及び／又は特定の阻害剤を使用して、試料中の標的化集団又は分集団を選択的に阻害することができる。
一例として、敗血症を患う又は患っている疑いのある対象からの血液を取得し、血液試料中の哺乳動物細胞がＤＮＡ及び／又はＲＮＡ合成を阻害される条件下で、試料中の細菌細胞がＤＮＡ及び／又はＲＮＡを合成し続けることができる条件下で培養することができる。このようにして、細菌ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを選択的に標識する。一実施形態では、哺乳類細胞がＤＮＡ及び／又はＲＮＡ合成を継続しない（又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡ合成が実質的に低減する）ように、同時に、微生物集団は、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を受け続け、例えばＥｄＵの選択的組み込みをもたらすように、血液試料を単離し及び、ＬＢブロス又は他の細菌培地で播種又は培養することができる。別の実施形態では、血液培養の温度を低下させることができ、それにより、哺乳動物細胞の複製及び合成が阻害され、微生物の複製及び合成のみが維持されるか又はより高い温度に戻ると再生される。温度は、数分～数時間の期間にわたって低下させることができる。別の実施形態では、哺乳類ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ機構を選択的に標的とするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ合成の小分子阻害剤を使用することができる。例えば、１つの阻害剤は、テングダケ属（Amanita）キノコから誘導される、アルファ－アマニチンと呼ばれ、弁別力のないキノコ狩りでの毎年約１００人の死亡の原因となるものである。ＲＮＡＰ阻害剤は、単一の分類の生物に特異的であり得る。アルファ－アマニチンは、例えば、高等真核生物に影響を及ぼすが、細菌に影響を及ぼさない。逆に、いくつかの薬物は、細菌ＲＮＡＰに特異的に影響を与える。これらの最もよく知られているのは、リファンピンであり、これは真菌により産生され、現在、リファンピン誘導体リファンピシン（Rif）として抗結核薬として使用されている。Ｒｉｆは、細菌ＲＮＡＰに特異的である。この阻害剤の特異性は、２つの理由で生じる。第一に、阻害剤は、多くの場合、１つの生物によって作製されて、別の生物を死滅させ、産生生物は、自殺しない阻害剤を進化させなければならない。第二に、阻害剤は、通常、酵素の保存されていない部分に結合し、この場合配列変化により、それらが全てのＲＮＡＰで作用するのを防ぐことができる。
本開示はまた、本開示の方法を使用して、新生の微生物核酸合成の同定の前に、試料を脱ホスティングすることを目的とする実施形態も提供する。このような脱ホスティング技術及び組成物は、例えば、微生物及び非微生物核酸の両方を含有する試料中の非微生物核酸の選択的切断に関連し、その結果、試料は微生物核酸が大幅に富化される。脱ホスティング法の例としては、Ｆｅｅｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ７６０９６（２０１３）、Ｓａｃｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４７：１０５０－１０５７（２００９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（１０）：ｅ１０９０６１（２０１４）、Ｌｅｉｃｈｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９８（２）：４７３－８１（２０１４）、Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４（４）：９１９－２７（２０１６）、及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１（１）：ｅ０１４６０６４（２０１６）に記載されるものであり、これらの開示は、本明細書に完全に組み込まれる。更に、脱ホスティングを実行するための市販のキットも利用可能であり、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（商標）キット、Ｍｏｌｚｙｍ ＭｏｌＹｓｉｓ Ｂａｓｉｃ（商標）キット、及びＭＩＣＲＯＢＥＥｎｒｉｃｈ（商標）キットを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脱ホスティング法及び組成物は、ＣｐＧ残基におけるメチル化を含む非微生物核酸に関連する特性、及びヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質との関連を利用する。例えば、特定の実施形態では、脱ホスティング法及び組成物は、非微生物核酸（例えば、ヒスタミン、制限酵素）と選択的に結合する核酸結合タンパク質を利用することができる。更なる実施形態では、脱ホスティング法及び組成物は、非微生物核酸と選択的に結合し、また非微生物核酸を選択的に分解する組み換えタンパク質を含むことができ、すなわち、組み換えタンパク質は、非微生物核酸結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインの両方を含む。特定の実施形態では、核酸結合タンパク質は、ヒストンである。ヒストンは、真核細胞の核、及び特定の古細菌、すなわちサーモプロテウス目及びユーリ古細菌（Euryarchaea）に見られるが、細菌又はウイルスには見られない。更なる実施形態では、ヒストン結合非微生物核酸は、次に、ヒストンタンパク質、すなわちヒストン結合ドメインに選択的に結合する親和性剤を含む基質を使用することによって、試料から除去することができる。ヒストンタンパク質に結合することができる親和性剤の例としては、クロモドメイン、チューダー（Tudor）、悪性脳腫瘍（Malignant Brain Tumor）（ＭＢＴ）、植物ホメオドメイン（ＰＨＤ）、ブロモドメイン、ＳＡＮＴ、ＹＥＡＴＳ、プロリン－トリプトファン－トリプトファン－プロリン（ＰＷＷＰ）、ブロモ隣接ホモロジー（Bromo Adjacent Homology）（ＢＡＨ）、Ａｎｋｒｙｉｎリピート、ＷＤ４０リピート、ＡＴＲＸ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ（ＡＤＤ）、又はｚｎ－ＣＷが挙げられる。別の実施形態では、ヒストン結合ドメインは、ＨＡＴ１、ＣＢＰ／Ｐ３００、ＰＣＡＦ／ＧＣＮ５、ＴＩＰ６０、ＨＢ０１（ＳｃＥＳＡ１、ＳｐＭＳＴ１）、ＳｃＳＡＳ３、ＳｃＳＡＳ２（ＳｐＭＳＴ２）、ＳｃＲＴＴ１０９、ＳｉｒＴ２（ＳｃＳｉｒ２）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１、ＥｕＨＭＴａｓｅ／ＧＬＰ、ＣＬＬ８、ＳｐＣｌｒ４、ＭＬＬ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＡＳＨ１、Ｓｃ／Ｓｐ ＳＥＴ１、ＳＥＴ２（Ｓｃ／Ｓｐ ＳＥＴ２）、ＮＳＤ１、ＳＹＭＤ２、ＤＯＴ１、Ｓｃ／Ｓｐ ＤＯＴ１、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４ ２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＳｐＳｅｔ ９、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＪＨＤＭ１ａ、ＪＨＤＭ１ｂ、ＪＨＤＭ２ａ、ＪＨＤＭ２ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＣＡＲＭ１、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ５、Ｈａｓｐｉｎ、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＣＫＩＩ、Ｍｓｔ１、Ｂｍｉ／Ｒｉｎｇ１Ａ、ＲＮＦ２０／ＲＮＦ４０、又はＳｃＦＰＲ４などのタンパク質からのヒストン又はそれらのヒストン結合断片に特異的に結合するドメインを含むことができる。
追加の実施形態では、本開示は、メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡに選択的に結合する核酸結合タンパク質又は核酸結合ドメインを提供する。ＣＧジヌクレオチドモチーフ（「ＣｐＧ部位」又は「ＣＧ部位」）は、ＤＮＡの領域に見出され、ここで、シトシンヌクレオチドの後に、その５’から３’方向に沿って塩基の直鎖配列においてグアニンヌクレオチドが続く。ＣｐＧアイランド（又はＣＧアイランド）は、ＣｐＧ部位の頻度の高い領域である。ＣｐＧは、５’－Ｃ－リン酸－Ｇ－３’の省略形であり、すなわち１つのリン酸によって分離されたシトシン及びグアニンである。ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンをメチル化して５－メチルシトシンを形成することができる。シトシンメチル化は、多くのＣｐＧ部位でヒトゲノム全体にわたって生じる。ＣＧ部位でのシトシンメチル化はまた、他の真核生物のゲノム全体にわたって生じる。哺乳動物では、例えば、７０％～８０％のＣｐＧシトシンがメチル化され得る。細菌及びウイルスなどの対象となる病原微生物において、このＣｐＧメチル化は、生じないか、ヒトゲノム中のＣｐＧメチル化よりも著しく低い。したがって、脱ホスティングは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡを選択的に切断することによって達成することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣｐＧアイランド又はＣｐＧ部位に結合する核酸結合タンパク質又は結合ドメインを含む、脱ホスティング法を提供する。別の実施形態では、結合ドメインは、メチル化ＣｐＧアイランドに結合するタンパク質又はその断片を含む。更に別の実施形態では、核酸結合タンパク質結合ドメインは、メチル－ＣｐＧ－結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む。ＭＢＤの例は、アルファ１ヘリックス及びＣ末端のヘアピンループによって形成された別の層によって裏打ちされる、ねじれたベータシートの層を含むアルファ／ベータサンドイッチ構造に折りたたまれる約７０残基のポリペプチドである。これらの層は両方とも両親媒性であり、アルファ１ヘリックス及びベータシートが平行に配置され、疎水性の面は互いに密に詰まっている。ベータシートは、２つの短い外側ストランド（ベータ１及びベータ４）によって挟まれた２つの長い内側ストランド（ベータ２及びベータ３）から構成される。更なる実施形態では、核酸結合タンパク質又は結合ドメインは、ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、及びＭＢＤ４、又はそれらの断片からなる群から選択されるタンパク質を含む。なお更なる実施形態では、核酸結合タンパク質又は結合ドメインは、ＭＢＤ２を含む。ある特定の実施形態では、核酸結合タンパク質又は結合ドメインは、ＭＢＤ２の断片を含む。別の実施形態では、核酸結合タンパク質又は結合ドメインは、ＭＢＤ５、ＭＢＤ６、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＴＩＰ５／ＢＡＺ２Ａ、又はＢＡＺ２Ｂ、又はこれらの断片を含む。更に別の実施形態では、核酸結合タンパク質又は結合ドメインは、ＣｐＧメチル化若しくは脱メチル化タンパク質、又はそれらの断片を含む。更なる実施形態では、ＣｐＧ結合非微生物核酸は、次に、ＣｐＧアイランド又はＣｐＧ部位に結合する核酸結合タンパク質又は結合ドメインに選択的に結合する親和性剤を含む基質を使用することによって、試料から除去することができる。親和性剤の例としては、ＣｐＧアイランド又はＣｐＧ部位に結合する核酸結合タンパク質又は結合ドメインに選択的に結合する抗体又は抗体断片が挙げられる。抗体又は抗体断片を含む親和性剤は、基質に結合されてもよく、あるいはそれ自体が基質に結合された二次抗体によって結合されてもよく、それによって、試料から非微生物核酸を分離及び除去する手段を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼドメインを含む組み換えタンパク質を使用する、脱ホスティング法を提供し、それによりヌクレアーゼは、非微生物核酸を断片に切断する。後者の場合、組み換えタンパク質はまた、核酸結合タンパク質（例えば、ヒスタミン、メチル－ＣｐＧ－結合タンパク質）に対する活性を有する核酸タンパク質結合ドメインを含んでもよい。ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼとしては、非特異的ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、非特異的エンドヌクレアーゼ、非特異的エキソヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、及び制限エンドヌクレアーゼを含むことができるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼドメインがそれ自体の固有の標的を有さない任意のヌクレアーゼに由来する。更に別の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、他のタンパク質と融合したときに活性を有する。非特異的ヌクレアーゼの例としては、ＦｏｋＩ及びＩ－ＴｅｖＩ．が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ又はその断片である。更なる実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｉ－ＴｅｖＩ又はその断片である。なお更なる実施形態では、ＦｏｋＩ又はＩ－ＴｅｖＩ又はそれらの断片は、変異していない及び／又は野生型である。ヌクレアーゼの更なる例としては、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ Ｉ）、ＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｂａｌ ３１エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩ（ｅｎｄｏ Ｉ）、小球菌ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩ（ｅｎｄｏ ＶＩ、ｅｘｏ ＩＩＩ）、ニューロスポラ（Neurospora）エンドヌクレアーゼ、Ｓ１－ヌクレアーゼ、Ｐ１－ヌクレアーゼ、マングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼＩ、ウスチラゴ（Ustilago）ヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ Ｉ）、ＡＰエンドヌクレアーゼ、及びＥｎｄｏ Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。
対象となる微生物は、限定するものではないが、患者（例えば、血液、尿、及び脊髄液）、食品試料（例えば、小麦粉、牛肉、及びレタス）、又は環境試料（例えば、地下水、及び病院の構築スワブ）を含むが、これらに限定されない、様々な試料で同定することができる。本明細書に開示される方法、組成物、及びキットの主な利点は、試料中の生存している、及び／又は増殖している微生物（複数可）を同定する前に微生物を広範に培養する必要なしに同定ができることである。したがって、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）（梅毒）及び環境細菌のような、通常の培養培地又は組織培養物上でインビトロで培養することができない微生物を、本開示の方法、組成物及びキットを使用して容易に同定することができる。
更に、本明細書では、患者、食品、環境、又は他の試料中の生存微生物を同定し、分析するために、新たに合成された核酸を標識し、精製し、配列決定する方法を開示する。本開示の方法は、試験化合物（例えば、抗生物質）を、試料中で同定された生存微生物に対するそれらの効果についてスクリーニングするために更に使用することができる。本明細書に開示される方法は、微生物に「供給」され、新たに合成された又は新生の核酸に組み込まれるヌクレオシド類似体を利用する。微生物に関しては、細菌、真菌、ウイルス、藻類、古細菌、及び原虫を含む任意の種類の微生物を、本明細書に開示される方法によって検出することができる。
細菌は核を欠いており、細胞小器官を含まない原核生物である。細菌ファミリー内には、細胞壁が厚いグラム陽性菌と、内膜と外膜との間に挟まれた薄い層を有するグラム陰性菌の２つのクラスが存在する。細菌は非常に多様であり、数の点では、地球上の最も成功した生物である。細菌は、人体内で無害に生存することができる唯一の微生物であり、しばしば消化などの身体機能を補助する。ウイルス以外では、細菌は、敗血症などのヒトにおける疾患に関して最も問題を引き起こす。本明細書に開示される方法、組成物及びキットを使用して同定及び分析することができる細菌の例としては、限定するものではないが、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バルトネラ・ヘネセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウエイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチア（Rickettsia rickettsia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、及び／又はエルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）、が挙げられる。
真菌は真核生物であり、これは、それらが明確な核及び細胞小器官を有することを意味する。細胞は、細菌などの原核生物よりも大きい。真菌コロニーは、例えばパンのカビなど、一定レベルの成長を達成すると、ヒトの目に見えるようになる。真菌は、（１）糸状（線維状）の成長及び多細胞構造を表示するカビ、（２）典型的には非糸状であり、単細胞であり得る酵母、及び（３）胞子の産生のための子実体を保有するキノコの３つの主なグループに分けることができる。真菌は、免疫不全のために問題となる場合があり、植物にとって有意な病原体であり得る。本明細書に開示される方法、組成物及びキットを使用して同定及び分析することができる真菌の例としては、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramose）、アコリオン・ガリナエ（Achorion gallinae）、アクチノマヅラ属種（Actinomadura spp.）、アジェロミセス・デルマチジジス（Ajellomyces dermatididis）、アロイリスマ・ブラジリエンシス（Aleurisma brasiliensis）、アレシェリア・ボイジイ（Allersheria boydii）、アロスロデルマ属種（Arthroderma spp.）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツ（Aspergillus fumigatu）、バシジオボラス属種（Basidiobolus spp.）、ブラストミセス属種（Blastomyces spp.）、カドホラ属種（Cadophora spp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、セルコスポラ・アピイ（Cercospora apii）、クリソスポリウム属種（Chrysosporium spp.）、クラドスポリウム属種（Cladosporium spp.）、クラドトリクス・アステロイド（Cladothrix asteroids）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クンニングアメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、デマチウム・ウェルネッケ（Dematium wernecke）、ディスコマイセス・イスラエリイ（Discomyces israelii）、エモンシア属種（Emmonsia spp.）、エモンシエラ・カプスレート（Emmonsiella capsulate）、エンドミセス・ゲオトリクム（Endomyces geotrichum）、エントモルフトラ・コロネート（Entomophthora coronate）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella neoformans）、フォンセセア属種（Fonsecaea spp.）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Geotrichum candidum）、グレノスポラ・カートメンシス（Glenospora khartoumensis）、ギムノアスクス・シプセウス（Gymnoascus gypseus）、ハプロスポランジウム・パルバム（Haplosporangium parvum）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ホルミシウム・デルマチジジス（Hormiscium dermatididis）、ホルモデンドラム属種（Hormodendrum spp.）、ケラチノマイセス属種（Keratinomyces spp）、ランゲロニア・スーダナンス（Langeronia soudanense）、レプトスフェリア－セネガレンシス（Leptosphaeria senegalensis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ロブミセス・ロボイ（Lobmyces loboi）、ロボア・ロボイ（Loboa loboi）、ロボミコーシス（Lobomycosis）、マヅレラ属種（Madurella spp.）、マラセジア・フルフール（Malassezia furfur）、ミクロコッカス・ペレティエリ（Micrococcus pelletieri）、ミクロスポルム属種（Microsporum spp.）、モニリア属種（Monilia spp.）、ムコール属種（Mucor spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナニジア属種（Nannizzia spp.）、ネオテスツジナ・ロサティ（Neotestudina rosatii）、ノカルジア属種（Nocardia spp.）、オイジウム・アルビカンス（Oidium albicans）、オオスポラ・ラクティス（Oospora lactis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペエトリエリジウム・ボイジイ（Petriellidium boydii）、フィアロフォラ属種（Phialophora spp.）、ピエドライア・ホルテ（Piedraia hortae）、ピチロスポルム・フルフール（Pityrosporum furfur）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）（又はニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii））、プルラリア・グウジェロティ（Pullularia gougerotii）、ピレノケータ・ロメロイ（Pyrenochaeta romeroi）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、サブローオ－ダイト（ミクロスポルム属）（Sabouraudites（Microsporum））、サルトーヤ・フミゲート（Sartorya fumigate）、セペドニウム属（Sepedonium）、スポロドリクム属種（Sporotrichum spp.）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、スタキボトリス・チャータラム（Stachybotrys chartarum）、ストレプトマイス属種（Streptomyce spp.）、チニア属種（Tinea spp.）、トルラ属種（Torula spp.）、トリコフィトン属種（Trichophyton spp）、トリコスポロン属種（Trichosporon spp.）、及びゾフィア・ロサティ（Zopfia rosatii）、が挙げられる。
ウイルスは、通常、非生体の極めて複雑な分子とみなされ、典型的には遺伝子物質のＲＮＡ又はＤＮＡコアを取り囲むタンパク質コートを含有するが、半透膜を含有せず、生存細胞のみで成長及び増殖することができ、及びヒト、動物、及び植物において様々な重要な疾患を引き起こす、超顕微鏡的感染因子の大きなグループを表す。本明細書に開示される方法、組成物及びキットを使用して同定及び分析することができるウイルスの例としては、シンプレックスウイルス属（Simplexvirus）、バリセロウイルス属（Varicellovirus）、サイトメガロウイルス属（Cytomegalovirus）、ロゼオロウイルス属（Roseolovirus）、リンホクリプトウイルス属（Lympho-cryptovirus）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）、α－パピローマウイルス属（α-Papillomavirus）、β－パピローマウイルス属（β－Papillomavirus）、Ｘ－パピローマウイルス属（Χ-Papillomavirus）、γ－パピローマウイルス属（γ-Papillomavirus）、ミューパピローマウイルス属（Mupapillomavirus）、ニューパピローマウイルス属（Nupapillomavirus）、アルファポリオーマウイルス属（Alphapolyomavirus）、ベータポリオーマウイルス属（Betapolyomavirus）、γ－ポリオーマウイルス属（γ-Polyomavirus）、デルタポリオーマウイルス属（Deltapolyomavirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、α－トルクウイルス属（α-Torquevirus）、β－トルクウイルス属（β-Torquevirus）、γ－トルクウイルス属（γ-Torquevirus）、サイクロウイルス属（Cyclovirus）、ジェミサーキュラー属（Gemycircular）、ジェミキビウイルス属（Gemykibivirus）、ジェミボンウイルス属（Gemyvongvirus）、エリスロウイルス属（Erythrovirus）、ディペンドウイルス属（Dependovirus）、ボカウイルス属（Bocavirus）、オルトヘパドナウイルス属（Orthohepadnavirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、デルタレトロウイルス属（Deltaretrovirus）、レンチウイルス属（Lentivirus）、シミスプマウイルス属（Simiispumavirus）、コルチウイルス属（Coltivirus）、ロタウイルス属（Rotavirus）、セアドナウイルス属（Seadornavirus）、α－コロナウイルス属（α-Coronavirus）、β－コロナウイルス属（β-Coronavirus）、トロウイルス属（Torovirus）、ママストロウイルス属（Mamastrovirus）、ノロウイルス属（Norovirus）、サポウイルス属（Sapovirus）、フラビウイルス属（Flavivirus）、ヘパシウイルス属（Hepacivirus）、ベギウイルス属（Pegivirus）、オルトヘペウイルス属（Orthohepevirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ヘパトウイルス属（Hepatovirus）、コブウイルス属（Kobuvirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）、ロサウイルス属（Rosavirus）、サリウイルス属（Salivirus）、アルファウイルス属（Alphavirus）、ルビウイルス属（Rubivirus）、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マーブルグウイルス属（Marburgvirus）、ヘニパウイルス属（Henipavirus）、モルビリウイルス属（Morbilivirus）、レスピロウイルス属（Respirovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、メタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、オルトニューモウイルス属（Orthopneumovirus）、レダンテウイルス属（Ledantevirus）、リッサウイルス属（Lyssavirus）、ベジクロウイルス属（Vesiculovirus）、マンマレナウイルス属（Mammarenavirus）、オルトハンタウイルス属（Orthohantavirus）、オルトナイロウイルス属（Orthonairovirus）、オルトブニヤウイルス属（Orthobunyavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）、α－インフルエンザウイルス属（α-Influenzavirus）、β－インフルエンザウイルス属（β-Influenzavirus）、γ－インフルエンザウイルス属（γ-Influenzavirus）、クアランジャウイルス属（Quaranjavirus）、ソゴトウイルス属（Thogotovirus）、及び／又はデルタウイルス属（Deltavirus）、が挙げられる。
藻類は、生物のグループを定義することはより困難であり、一部の定義によって原核生物及び真核生物の両方を含有する。他の微生物とは異なり、藻類は典型的には光合成生物（photosynthesizer）であり、典型的には海洋環境で見られる。有害アオコ（ＨＡＢ）は、天然毒素の産生、他の生物への機械的損傷、又は他の手段による他の生物への悪影響を与えるアオコ（algal bloom）である。ＨＡＢは、多くの場合、大規模な海洋死亡事象に関連し、様々な種類の貝中毒に関連している。ＨＡＢは、アレキサンドリウム（Alexandrium）及びカレニア（Karenia）属の渦鞭毛藻類又はプセウドニッチア属（Pseudo-nitzschia）の珪藻類などの有毒な又は他の有害な植物プランクトンを含む。このようなアオコは、多くの場合、赤色又は茶色の色相を呈し、通称赤潮として知られている。本開示の方法、組成物、及びキットは、例えば環境試料などの試料からのこのような藻類の同定を可能にする。
古細菌は、細菌と同様の形態を有する原核生物である。古細菌は、遺伝的特徴、生化学的特徴、及び構造的特徴に関して、真核及び細菌とは異なる。例えば、古細菌は、固有のフラジェリン及びエーテル結合脂質を有し、それらの細胞壁にムレインがない。古細菌は、疾患を引き起こす可能性を反映し得る既知の病原体といくつかの特性を共有する。このような特性としては、宿主への豊富なアクセス（すなわち、機会）、並びに長期コロニー形成及び宿主内の内因性フローラとの共存の能力が含まれる。ヒト結腸、膣、及び口腔微生物叢における嫌気性古細菌の検出は、ヒト宿主にコロニー形成するそれらの能力を示している。本開示の方法、組成物、及びキットは、試料、例えば、環境試料、対象から得られた試料などからのそのような古細菌の同定を可能にする。
原虫は、他の微生物又は有機組織及び破片などの有機物を摂食する、自由生活性か又は寄生性いずれかの単細胞型真核生物を指す。原虫は、伝統的に定義されているように、サイズが１マイクロメートル～数ミリメートル程度、又はそれ以上の範囲にある。全ての原虫は、従属栄養性であり、それらの全体を摂取するか、又はそれらの有機残留物及び廃棄物を消費するかのいずれかによって、他の生物から栄養素を引き出す。いくつかの原虫は、食作用によって食物を摂取し、仮足（アメーバのように）で有機粒子を飲み込むか、又は細胞口と呼ばれる特殊な口様開口部を通して食物を摂取する。他のものは、浸透栄養によって食物を摂取し、溶解した栄養素を細胞膜を通して吸収する。数多くの原虫病原体は、ヒトの寄生虫であり、マラリア（マラリア原虫（Plasmodium）による）、アメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症、クリプトポリジウム症、トリコモニア症、チャガス病、リューシュマニア症、アフリカトリパノソーマ症（睡眠病）、アメーバ赤痢、アカントアメーバ角膜炎、及び原発性アメーバ性髄膜炎（ネグレリア症（naegleriasis）などの疾患を引き起こす。本開示の方法、組成物、及びキットは、試料、例えば、環境試料、対象から得られた試料などからのそのような原虫の同定を可能にする。
本開示の方法は、試料からの前述の微生物、特に生存微生物及び／又は増殖微生物の同定及び分析を提供する。上記のように、試料は、対象から、環境から、食品からなどの様々な供給源に由来し得る。対象からの任意の数の種類の試料を本開示の組成物、方法、及びキットと共に使用することができ、これらは限定するものではないが、血液、尿、唾液、中耳吸引物、胆汁、膣分泌物、膿、胸水、滑液、及び腹腔膿瘍が含まれる。したがって、本開示の方法、組成物、及びキットは、対象から得られる試料の種類及び位置によって特に制限されない。更に、本明細書に開示される方法、キット、及び組成物は、本明細書に開示される方法、キット、及び組成物が、標準的な方法論よりもはるかに迅速な方法で、問題の微生物を正確に同定することができるという点で、患者に敗血症を引き起こしている、又は患者に***症を引き起こしている微生物を同定する際の標準的な方法論に対する改善を提供する。したがって、同定された微生物（複数可）に対する適切な抗菌剤（複数可）を、はるかに早く投与することができ、それにより、より迅速な方法で微生物感染と戦い及び除去することができ、微生物感染に関連する副作用、例えば、敗血症性ショック、悪寒、発熱、身体痛、知能の変化、疲労感、倦怠感、呼吸障害、異常な心臓感染、炎症、悪心、及び嘔吐、不安など、を防止又は軽減することができる。更に、本明細書に開示される方法、キット及び組成物はまた、抗菌剤が微生物の阻害又は殺傷に有効であるかどうかを決定することができる。したがって、微生物が特定の抗菌剤に対して耐性がある場合、本明細書に開示される方法、キット、及び組成物は、そのような決定を迅速に行うことができ、その結果、別の抗菌剤を試すことができる。
本開示の方法、組成物、及びキットは、新生の微生物核酸合成を同定するためのヌクレオシド及びヌクレオチド類似体の両方を利用することができる。以下により詳細に記載されるように、本開示の方法、組成物、及びキットは、複数種類のヌクレオシド及びヌクレオチド類似体を利用することができ、その使用は、ベースライン核酸合成を確立し、抗菌剤の添加などの核酸合成の速度の変化を決定するために有利であり得る。ヌクレオシド類似体は生細胞により容易に取り込まれ、そこでリン酸化されてヌクレオチドになり、次に成長する核酸ポリマーに組み込まれるため、ヌクレオシドは、典型的には、細胞培養に添加されるか、又は動物に投与される実験において使用される。対照的に、ヌクレオチドは、細胞への組み込みの前又は後のいずれかで、より不安定であり、酵素切断をより受けやすく、一般にヌクレオシドよりも安定性が低い。加えて、リン酸基からの追加の電荷により、ヌクレオチドは、生細胞に容易に輸送されず、一般に、細胞膜を横切って十分な濃度のヌクレオチドを得るためにトランスフェクション工程を必要とする。これは、結果を正確に解釈するために細胞摂動を最小限に保たれるべきであるインビボ又はエクスビボ／インビボ実験のいずれにも理想的ではない。これらの理由から、以下の開示は、一般に、細胞又は動物に添加される類似体としてヌクレオシドを指すが、これは決して限定することを意図するものではなく、ヌクレオチドも同様に重要である。
ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体は、４つのＤＮＡ塩基（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはチミン（Ｔ））のいずれか又は４つのＲＮＡ塩基（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはウラシル（Ｕ））のいずれかの類似体であり得、それらの三リン酸及びホスホルアミダイトの形態を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体は、微生物中に存在するポリメラーゼによって、新たに合成された核酸に組み込まれる。ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体は、リン酸骨格、ペントース糖、及び／又はリボース又はデオキシリボースが、典型的には合成化学技術によって変更されているという点で天然に存在するヌクレオシドとは異なり、例えば、ヌクレオチド又はヌクレオシドは、検出可能な標識（例えば、色素、発蛍光団）、生体直交機能部分（例えば、クリックケミストリーのような特定の化学反応に関与する部分）、生体分子（例えば、酵素、抗体、ビオチン）など、を含むように変更することができ、これらのうちのいずれか１つを本開示の方法、組成物、及びキットで使用して、新生の作製された微生物核酸ポリマーを同定することができる。一実施形態では、ヌクレオシド類似体は、ブロモ、クロロ、及びヨード部分を含むがこれらに限定されないハロゲン化類似体である。ハロゲン化類似体の例としては、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。ハロゲン化類似体に関して、抗体は、ブロモ－２－デオキシウリジン及びヨードデオキシウリジンなどの、これらの類似体に高い親和性で結合するために特別に開発されている（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照されたい）。別の実施形態では、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体は、アジド、アルキニル又はホスフィニル部分を含むがこれらに限定されない、生物直交機能部分を含む。生物直交機能部分を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の例としては、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’フルオロ－５－エチニルウリジン、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、及び５アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ヌクレオシド類似体は、クリックケミストリー、ひずみ［３＋２］環化付加反応、又は標識試薬の官能基を有するシュタウディンガーライゲーションのいずれかを受けることができる生体直交機能部分を含む。いくつかの実施形態では、反応性生体直交部分は、ヌクレオシドの塩基によって担持される。反応性生体直交部分を担持する塩基は、プリン（例えば、アデニン又はグアニン）又はピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、又はチミン）であり得る。ある特定の実施形態では、塩基はウラシルであり、いくつかのこのような実施形態では、ウラシルは、５位に反応性生体直交部分を担持する。ある特定の実施形態では、塩基はアデニンであり、いくつかのこのような実施形態では、アデニンは、反応性生体直交部分を担持する。ある特定の実施形態では、生体直交部分は、塩基に間接的に付着しているが、他の実施形態では、生体直交部分は、塩基に直接共有結合している。ある特定の実施形態では、反応性生体直交部分は、ヌクレオシドの糖（リボース及びデオキシリボース）によって担持される。ある特定の実施形態では、生体直交部分は、糖に間接的に付着しているが、他の実施形態では、生体直交部分は、糖に直接かつ共有結合している。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドのリン酸部分に付着された反応性生体直交部分。反応性生体直交部分を担持する糖は、プリン（例えば、アデニン又はグアニン）又はピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、又はチミン）に共有結合することができる。ある特定の実施形態では、塩基はウラシルであるが、他の実施形態では、塩基はアデニンである。
反応性生体直交部分は、ニトリルオキシド、アジド、ジアゾメタン、ニトロン、又はニトリルイミンなどの１，３－双極子であり得る。ある特定の実施形態では、１，３－双極子はアジドである。あるいは、反応性生体直交官能性部分は、アルケン（例えば、ビニル、プロピレンなど）又はアルキン（例えば、エチニル、プロピニルなど）などの親双極子であり得る。ある特定の実施形態では、親双極子は、例えばエチニル基などのアルキンである。
上記のこれらの生体直交官能性部分は、高度に選択的な反応によって修飾され得る固有の化学官能性を有する非天然の非摂動生物化学部分である。具体的には、これらの組み込まれたヌクレオシドは、細胞環境の存在下でヌクレオシドと共有結合を選択的に形成する化学的手段を含む標識試薬を使用して標識される。
微生物増殖を含む複雑な細胞プロセスを分析するには、生体分子が本来の生息環境内で機能するように生体分子を追跡する能力を必要とする。近年、生体分子をタグ付けするための更なる方法として、生体直交機能部分が使用されてきた。生物直交機能部分の使用は、生物学的に直交する機能部分としてアジド部分を使用する代謝産物及び翻訳後修飾の検出について記載されている。標的生体分子に導入されると、代謝的に又は化学修飾により、アジドは、３つの高度に選択的な反応：スタウディンガーライゲーション、Ｃｕ（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン環化付加、又はひずみ促進［３＋２］環化付加のうちの１つを使用してプローブによるタグ付けができる（例えば、Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００４ Ｎｏｖ ２４；１、２６（４６）：１ ５０４６－７を参照されたい）。
生物直交機能部分は、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の組み込みによって核酸を標識するために使用することができる。したがって、シュタウディンガーライゲーション、アジドとアルキンのＣｕ（Ｉ）触媒による［３＋２］環化付加（「クリックケミストリー」）又はＢａｒｒｙ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及びＣａｒｏｌｙｎ Ｂｅｒｔｏｚｚｉにより独立して記載された「銅なしの」クリックケミストリーなどの生体直交標識を使用して核酸を標識することができる。（例えば、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００２ Ｍａｒ １５；４１（６）：１ ０５３－７、Ｍｅｌｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，３０５７；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００４ Ｎｏｖ ２４；１ ２６（４６）：１ ５０４６－７；米国特許第７，１２２，７０３号、米国特許出願公開第２００３０００５１６６７１号を参照されたい）。クリックケミストリー及びシュタウディンガーライゲーションは、ヌクレオチドの取り込みを直接検出することで細胞増殖を測定するように適合されている。Ｓａｌｉｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２００７０２０７４７６号及び同第２００７００９９２２２号（２００６年１０月２７日出願）を参照されたい。
核酸を標識するためのクリックケミストリー技術は、第１のヌクレオシド類似体が新たに合成された微生物核酸に組み込まれるように、反応性不飽和基を含有する第１のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体で細胞を処理することを含む。次いで、細胞は、標識に結合された第２の反応性不飽和基を含む標識試薬と接触され、それにより、［３＋２］環化付加が、第１反応性不飽和基と第２反応性不飽和基との間で起こる。
微生物核酸を標識するための［３＋２］環化付加反応の以下の説明は、例としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
クリックケミストリーを使用して微生物ＤＮＡを標識する一例として、試料は、ＥｄＵが新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるように、定義された期間にわたって、有効量のアルキル修飾ヌクレオシド類似体、例えば５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）で処理される。ＥｄＵで標識された後、標識された微生物ＤＮＡを、銅（Ｉ）触媒の存在下で、アジド－ジスルフィド－ビオチンリンカーと反応させる。［３＋２］環化付加反応を介して、アジドと組み込まれたヌクレオシド類似体との間に共有結合が形成され、次いで、得られた錯体は、ストレプトアビジンコンジュゲート基質（例えば、ビーズ）を使用して捕捉され得る。基質を洗浄した後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を添加することにより、微生物ＤＮＡを基質から遊離させる。次に、微生物ＤＮＡの配列を、標準的な方法（例えば、ＰＣＲライブラリ増幅を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ）を使用して決定することができる。
クリックケミストリーを使用して微生物ＤＮＡを標識する第２の例では、試料は、ＡｚｄＵが新たに合成された微生物ＤＮＡに組み込まれるように、定義された期間にわたって、有効量のアジド修飾ヌクレオシド類似体、例えば、５－アジド－２’－デオキシウラシル（ＡｚｄＵ）で処理される。ＡｚｄＵで標識された後、標識された微生物ＤＮＡを、銅（Ｉ）触媒の存在下で、色素標識アルキンと反応させる。アジドとアルキン部分との間の［３＋２］環化付加反応の結果として、共有結合が形成される。次いで、色素標識は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、イメージング、マルチウェルプレートアッセイ、又はハイコンテントスクリーニングが挙げられるがこれらに限定されない標準的な方法を用いて測定することができる。
クリックケミストリーを使用してＲＮＡを標識する例では、試料は、ＥＵが新たに合成された微生物ＲＮＡ中に組み込まれるように、定義された期間にわたって、有効量のアルキル修飾ヌクレオシド類似体、例えば５－エチニル－ウリジン（ＥＵ）の存在下で、インキュベートされる。ＥＵで標識された後、病原微生物を溶解させ、銅（Ｉ）触媒の存在下でアジド－ジスルフィド－ビオチンリンカーと反応させる。［３＋２］環化付加反応を介して、アジドと組み込まれたヌクレオシド類似体との間に共有結合が形成され、次いで、得られた錯体は、ストレプトアビジンコンジュゲート基質（例えば、ビーズ）を使用して捕捉され得る。基質を洗浄した後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を添加することにより、ＲＮＡを基質から遊離される。ＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される。ｃＤＮＡからシークエンシングライブラリを調製することができる。
銅（Ｉ）触媒を使用せずに、ひずみ［３＋２］環化付加反応を利用するクリックケミストリーの代替案の１つは、Ｂｅｒｔｏｚｚｉらによって、説明されている「銅なしの」クリックケミストリー反応である。Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，米国特許出願第２００６０１１０７８２号。
例えば、病原微生物は、アジド修飾ヌクレオシド類似体が新たに合成された微生物ＤＮＡに組み込まれるように、定義された期間にわたって、有効量のアジド修飾ヌクレオシド類似体、例えば、ＡｚｄＵで、病原微生物を最初に処理することができる。ＡｚｄＵを添加した後、アジドとシクロアルキン部分との間でひずみ［３＋２］環化付加反応が生じるように、細胞を、反応性シクロアルキン部分を有する有効量の化合物又は分子で処理する。シクロアルキンは、色素標識を更に含むように修飾されてもよく、これには、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、イメージング、マルチウェルプレートアッセイ、又はハイコンテントスクリーニング、プルダウン試薬と共に使用され得るビオチン標識、ＨＲＰ酵素、など、が挙げられるがこれらに限定されない標準的な方法を使用して測定することができる。ＤＮＡを標識するために、ひずみ［３＋２］環化付加反応に使用され得るシクロアルキンとしては、シクロオクチン、ジフルオロシクロオクチン、ヘテロシクロアルキン、ジクロロシクロオクチン、ジブロモシクロオクチン、又はジヨードシクロオクチンが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知の他の化学を、微生物ＤＮＡの標識に適用することができる。例えば、シュタウディンガーライゲーションとしても知られるＢｅｒｔｏｚｚｉらによって記載されているアジド－ホスフィン化学を使用して、新たに合成された微生物ＤＮＡへのアジド修飾ヌクレオシド類似体、例えばＡｚｄＵの取り込みを検出することができる。Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ，米国特許出願第２００７００３７９６４号を参照されたい。病原微生物は、最初に、有効量のアジド修飾ヌクレオシド類似体、例えばＡｚｄＵと、定義された期間にわたって接触させる。次に病原微生物を操作されたホスフィン部分と反応させる。操作されたホスフィン部分の一例は、２－ジフェニルホスファニル－安息香酸メチルエステルである。アジド－ホスフィン化学が微生物ＤＮＡを標識するために使用される場合、操作されたホスフィン部分は、色素分子、ビオチン部分、酵素などを更に含む。アジドとホスフィン部分との間の反応が行われると、ビオチン分子をプルダウンアッセイなどで使用することができる。
ベースラインの微生物の増殖及びその後の微生物増殖の変化の両方を測定するために、本開示は、第１の使用されたヌクレオシド又はヌクレオチド類似体とは別個に標識された第２ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の使用を更に提供する。微生物による微生物増殖又は遺伝子発現に対する抗菌剤（例えば、抗生物質）の有効性を測定するために、第３及び／又は第４のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を使用することができることが更に想定される。ベースライン合成速度は、核酸を第１のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体で標識することによって記録することができる。第２のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を導入する前に、第１のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を除去する必要はない。更に、第２のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を導入する前に第１のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を最初に除去することにより、微生物増殖速度の正確な決定を困難にする可能性がある。加えて、洗浄なしの工程により、プロセスはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）と適合する。
本明細書に開示される組成物、方法、及びキットの主要な利点の１つは、標準的なプロトコルとは異なり、試料中の微生物（複数可）の同定が長い培養工程を必要としないことである。ＤＮＡが生存し、増殖する生物において常に産生されるので、本開示の組成物、方法、及びキットは、微生物を増殖させるために培養工程を使用する必要なしに微生物を同定することができる。その代わりに、本開示の組成物、方法、及びキットは、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が新生の作製された微生物核酸に組み込まれるように、試料が、最小限の時間にわたって、１つ以上のタイプのヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下でインキュベートされるインキュベーション工程を利用する。したがって、一度得られた試料は、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で、約５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、８５分間、９０分間、９５分間、１００分間、１０５分間、１１０分間、１１５分間、１２０分間、１２５分間、１３０分間、１４５分間、１５０分間、１５５分間、１６０分間、１６５分間、１７０分間、１７５分間、１８０分間、１９０分間、２００分間、２２０分間、３３０分間、２４０分間、２６０分間、２８０分間、３００分間、３５０分間、４００分間、５００分間、６００分間、又は前述の時点のうちのいずれか２つを含むか若しくはそれらの間にあり、その派閥の増分を含む任意の範囲で、インキュベートすることができる。
本開示は、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を含有する新生の作製された微生物核酸を、１種類以上の標識試薬で標識することを更に提供する。本明細書に開示される標識試薬は、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に特異的に結合する。例えば、標識試薬は、標識にコンジュゲートされてもよく、又は標識に共有結合している二次抗体によって結合され得る一次抗体であってよく、一次抗体は組み込まれたヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合する。このような一次抗体の例としては、抗ＢｒｄＵ抗体、抗ｌｄＵ抗体、及び抗ＣｌｄＵ抗体を挙げることができ、これらの全ては様々なベンダーから市販されている。しかしながら、組み込まれたヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に選択的に結合することができる他の抗体（上述のように）もまた想定される。二次抗体に関して、二次抗体は、ビーズ又はプレートなどの基質に結合することができる。したがって、二次抗体は、新たに合成された微生物核酸の単離又は精製を可能にするプルダウン試薬として機能し得る。あるいは、標識試薬は、相補的な生体直交官能基（例えば、アルキニル基）を有するヌクレオシド又はヌクレオチド類似体と化学反応起こすことができるように設計され、及び色素部分、発蛍光団部分、親和性リガンド（例えば、ＧＳＴ、ビオチン、ヒスチジンなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの標識を含む、官能基（例えば、アジド）を含む化合物であってもよい。ビオチン標識を含む標識試薬の例としては、以下が挙げられる：
Figure 2022530584000005
既に上述したように、標識の役割は、標識後に、核酸ポリマー、例えば、新たに合成された微生物ＤＮＡの可視化又は検出を可能にすることである。典型的には、標識（又は検出可能な薬剤又は部分）は、プルダウン試薬によって選択的に結合され得るように選択されるか、あるいは、測定することができ、その強度が、例えば、分析される試料中の標識された核酸ポリマーの量に関連する（例えば、比例する）シグナルを生成することができるように選択される。したがって、新たに合成された微生物核酸を検出し、同定し、定量するために複数の標識を使用することが想定され、例えば、第１の標識はプルダウン試薬によって結合されて新たに合成された微生物核酸の単離を提供でき、そして第２、第３、又はそれ以上の標識を使用して、測定され、その強度が分析される試料中の標識された核酸ポリマーの量に関連するシグナルを生成することができる。このような複数の標識の使用は、増殖速度又は新たな核酸合成を決定するために、又は抗生物質などの投与された薬剤の効果を試験するために特に有利である。更に、標識試薬は、化学的に切断可能なリンカー又は酵素的に切断可能なリンカーを更に含むことができ、必要に応じて標識を除去することができる。任意の数の化学的に切断可能なリンカーを使用することができるが、一般に、酸－不安定系（acid-labile-based）リンカー、塩基－不安定系（base-labile-based）リンカー、ジアゾ系リンカー又はジスルフィド系リンカーなどの穏和な反応条件下で切断することができるリンカーである必要がある。酸－不安定系リンカーの例としては、ヒドラゾン、エナミン、エノールエーテル、イミン又はシス－アコニチル基を含むリンカーが挙げられる。塩基不安定系リンカーの例としては、カルバメート系リンカー及びエステル系リンカーが挙げられる。あるいは、切断可能なリンカーは、酵素的に切断可能なリンカーであってもよい。酵素的に切断可能なリンカーの例としては、ペプチド系リンカー又はβ－グルクロニド系リンカーが挙げられる。
本明細書に記載の試料中の微生物の同定及び分析のための方法は、標識された微生物核酸の単離又は精製を更に提供する。特定の実施形態では、標識された微生物核酸は、プルダウン試薬を使用して精製又は単離され得る。そのような場合、新たに合成された微生物核酸は、本明細書に記載されるように組み込まれたヌクレオシド類似体に結合するか若しくはそれと結合し、固定化されたプルダウン試薬によって選択的に結合され得る標識を含む、標識試薬で標識される。標識試薬は、抗体又は別の種類の親和性に基づくリガンド（例えば、ＧＳＴ、ビオチン、ヒスチジンなど）であり得る。プルダウン試薬は、標識試薬に特異的な二次抗体であってもよく、又は標識試薬に対して高い及び選択的親和性を有する別の種類の薬剤若しくは化合物であってもよい。例えば、標識試薬は、クリックケミストリーを介してヌクレオシド類似体と結合するビオチン系分子であってよく、それ自体は、アビジン又はストレプトアビジンを含むプルダウン試薬によって選択的に結合することができる。したがって、ビオチン系標識試薬とストレプトアビジン系プルダウン剤との間の相互作用は、「無標識されていない」微生物核酸及び他の微生物成分からの「標識された」微生物核酸の単離又は精製を可能にする。典型的には、プルダウン試薬は、プレート、ビーズ、ナノ材料、又はマイクロ材料（例えば、磁気ナノ粒子）などの固体支持体上に固定される。
本開示はまた、本開示の組成物、方法、及びキットが、微生物生存能力、成長及び増殖に対する薬剤の有効性を検出することができることを提供する。例えば、抗菌剤を試料に直接添加することができ、微生物の生存率、成長及び／又は増殖に対する結果として得られる効果は、本開示の方法を使用して、新たに合成された核酸の検出又はその欠如に基づいて決定することができる。より制御された結果を得るために、試料を２つの試料、「対照」試料及び「処理」試料に分割することができ、それによって抗菌剤が「処理」試料に添加され、ビヒクル対照が「対照試料」に添加され、２つの試料間の新たに合成された微生物核酸の産生における任意の違いを決定し、「処理」試料が、「対照」試料と比較して、新たに合成された微生物核酸が少ないか全く有さない場合、抗菌剤の有効性が示される。あるいは、抗菌剤の効果は、抗菌剤の投与前に第１の試料を採取し、抗菌剤の投与後の１つ以上の時点で第２、第３、又はそれ以上の試料を採取することに基づいて試験されるシステムにおいて、決定することができる。例えば、血液試料は、抗生物質の投与前及び投与後の敗血症ヒト患者から得ることができ、それにより、新たに合成された核酸の減少した割合又は非存在は、敗血症を引き起こす細菌の生存性、成長及び／又は増殖に対する抗生物質の有効性を示す。本開示の組成物、方法、及びキットと共に使用することができる抗菌剤の例としては、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び抗寄生虫が挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質は、細菌に対して活性な抗菌物質の一種であり、細菌感染と戦うための最も重要な種類の抗菌剤である。抗生物質の薬剤は、そのような感染症の治療及び予防に広く使用されている。これらは、細菌の成長を死滅させるか又は阻害するかのいずれかであり得る。本明細書に開示される組成物、方法、及びキットと共に使用することができる抗生物質の例としては、限定するものではないが、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メゾロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピバンピシリン、ピブメシリナム、チカルシリンなどのペニシリン系、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメット、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフクリジン、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン、セファクロメジン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェムピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム、セフォベシン、セフォキサゾール、セフロチル、セフスミド、セフラセチム、セフチオキシドなどのセファロスポリン系、アズトレオナムなどのモノバクタム系、イミペネム、ダリペム、エルタペネム、及びメロペネムなどのカルバペネム系、アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、及びテリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質、クリンダマイシン及びリンコマイシンなどのリンコサミド系、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ペロモマイシン、ストレプトマイシン、及びトブラマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質、フルメキン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミジン酸、ピペミド酸、ソクサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、デラフロキサシン、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、及びトロバフロキサシンなどのキノロン系抗生物質、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾールなどのスルホンアミド系、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、及びチゲサイクリンなどのテトラサイクリン系抗生物質、バンコマイシン及びテイコプラニンなどのグリコペプチド系抗生物質、テラバンシンなどのリポグリコペプチド系抗生物質、リネゾリド及びサイクロセリンなどのオキサゾリジン系抗生物質、リファンピン、リファブチン、リファペンチンン、及びリファラジルなどのリファマイシン系、バイオマイシン及びカプレオマイシンなどのツベラクチノマイシン系、バシトラシン、ポリミキシンＢ、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、及びニトロフラントインなどの他の抗生物質。抗真菌剤は、真菌に対して活性な抗菌物質の一種であり、真菌感染戦うためのするための最も重要な種類の抗真菌剤である。抗真菌薬は、そのような感染症の治療及び予防に広く使用されている。これらは、真菌の成長を死滅させるか又は阻害するかのいずれかであり得る。本明細書に開示される組成物、方法、及びキットと共に使用することができる抗真菌剤の例としては、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、及びテルビナフィンなどのアリルアミン系抗真菌剤、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、及びテルコナゾールなどのイミダゾール系抗真菌剤、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、及びボリコナゾールなどのトリアゾール系抗真菌剤、及びアバファンギン（abafungin）などのチアゾール系抗真菌剤、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、及びトリコマイシンなどのポリエン系抗真菌剤、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギンなどのエキノカンディン、トルナフテートなどのチオカルバメート抗真菌剤、フルシトシンなどの代謝拮抗抗真菌剤、ブテナフィンなどのベンジルアミン、グリセオフルビン、シクロピロックス、硫化セレン、及びタバボロール（tavaborole）などの他の抗真菌剤。抗ウイルスは、ウイルスの侵入、複製、広がり、及び／又は成熟を防止する薬剤である。本明細書に開示される組成物、方法、及びキットと共に使用することができる抗ウイルス剤の例としては、限定するものではないが、アシクロビル、ブリブジン、ドコサノール、ファムシクロビル、フォスカーネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、ビダラビン、シタラビン、バラシクロビル、トロマタンジン（tromatandine）及びプリテリビルなどの抗ヘルペス剤、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ペラミビル、及びザナミビルなどの抗インフルエンザ剤、アスナプレビル、ボセプレビル、シルプレビル、ダノプレビル、ファルダプレビル、グレカプレビル、グラゾプレビル、ナルラプレビル、パリタプレビル、シメプレビル、ソバプレビル、テラプレビル、バニプレビル、ベドロプレビル、及びボキシラプレビルなどの、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤、ダクラタスビル、エルバスビル、レジパスビル、オダラスビル、オムビタスビル、ピブレンタスビル、ラビダスビル、ルザスビル、サマタスビル、及びベルパタスビルなどのＮＳ５Ａ阻害剤、ベクラブビル、ダサブビル、デレオブビル、フィリブビル、セトロブビル、ソホスブビル、ラダルブビル、及びウプリフォスビルなどのＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ラミブジン、テルビブジン、クレブジン、アデフォビル、テノフビル・ジソプロキシル（tenofvir disoproxil）、及びテノホビル・アラフェナミドなどの抗Ｂ型肝炎剤、エンフビルチド、マラビロク、ビクリビロック、セニクリビロック、ＰＲＯ １４０、イバリズマブ、及びフォステムサビルなどの侵入／融合阻害剤、例えば、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、ジドブジン、アムドキソビル、アプリシタビン、センサブジン、エルブシタビン、ラシビル、スタンピジン、４’－エチニル－２－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、ザルシタビン、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、リルピビリン、及びドラビリンなどの逆転写酵素阻害剤、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル、ビクテグラビル、及びＭＫ－２０４８などのイネグラーゼ（inegrase）阻害剤、ベビリマット及びＢＭＳ－９５５１７６などの成熟阻害剤、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、及びチプラナビルなどのプロテアーゼ阻害剤、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル、ビクテグラビル、及びＭＫ－２０４８などのインテグラーゼ阻害剤、テノホビル・ジソプロキシル、テノホビル・アラフェナミド（ＴＡＦ）などのヌクレオチド類似体／ＮｔＲＴＩ、コビシスタット及びリトナビルなどの薬物動態増進剤、並びにインターフェロンα及びペグインターフェロン－αなどのインターフェロン、メチサゾン、リファンピシン、イミキモド、レシキモド、ポドフィロトキシン、ホミビルセン、シドフォビル、プリコナリル、ファビピラビル、ガリデシビル、レムデシビル、メリシタビン、ＭＫ－６０８、ＮＩＴＤ００８、モロキシジン、トロマンタジン、及びトリアザビリンなどの他の抗ウイルス剤。
本明細書に開示される組成物、方法、及びキットはまた、多くの異なる微生物からの核酸に対するプローブを含むマイクロアレイを使用することによって、新たに合成された微生物核酸を同定することによって、試料中の微生物の同定を提供する。典型的には、マイクロアレイは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００の又は前述の値のうちのいずれか２つを含むか、又はそれらの間にある任意の範囲（その派閥の増分を含む）の、異なる微生物からの核酸に対するプローブを有する。プローブは、典型的には、１つ以上の標的生物ゲノム（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ）のセグメントに相補的な配列を有するように設計される。オリゴ（oligo）は、機械的堆積によってアレイ上にスポッティングされるか、改変されたインクジェットプリンタヘッドで噴霧されるか、又は一連の光触媒反応によってインサイチュで合成されてもよい。プローブは、それぞれ同じオリゴの多くのコピーを含有する「特徴（feature）」の矩形グリッド内のアレイ上に配置される。アレイ上の特徴の密度は、典型的なスポッティングされたアレイのスライド当たり２０，０００スポットから、インサイチュで合成されたオリゴを使用するＮｉｍｂｌｅＧｅｎ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘなどのプラットフォームの数百万まで、プラットフォーム間で異なる。アレイは、ガスケットでサブアレイに細分化されてもよく、複数の試料を１つのスライド上で試験することができる。アレイにわたってランダムに散乱した複製特徴部を使用して、引っ掻き（scratch）及び空間的効果の補正を可能にすることができる。いくつかのアレイでは、バックグラウンドノイズ補正の閾値レベルを提供するために、ランダムシークエンスを有する陰性対照プローブが含まれる。任意の数の病原体検出マイクロアレイが当該技術分野において記載されており、ＶｉｒｏＣｈｉｐ（Ｗａｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２００３；１：Ｅ２）、病原体マイクロアレイのリシークエンシング（Ｌｅｓｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２００９；４：ｅ６５６９）、ユニバーサル検出マイクロアレイ（Ｂｅｌｏｓｌｕｄｔｓｅｖ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００４；３７：６５４－８，６６）、ＧｒｅｅｎｅＣｈｉｐ（Ｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；４５：２３５９－６４）、及びＬａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ微生物検出アレイ（Ｇａｒｄｎｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１０；１１：６６８）が含まれる。例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ微生物検出アレイは、約６，０００のウイルス及び１５，０００の細菌並びに真菌及び原虫のプローブを有する。新たに合成された微生物ＤＮＡをマイクロアレイに適用した後、その特定の配列を検出する任意のプローブが蛍光を発し、スキャナによって読み取られる。次いで、スキャナからの生データをアルゴリズムを用いて分析する。バイオインフォマティクスは、病原微生物のシグネチャである多数の核酸配列又はプローブを同定する際に使用される。
本明細書に開示される組成物、方法、及びキットはまた、本開示のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を組み込んだ新たに合成された微生物核酸を配列決定することによって、試料中の微生物の同定を提供する。任意の数のシークエンシング方法を使用して、新たに合成された微生物ＤＮＡ又はｃＤＮＡに逆転写された微生物ＲＮＡを配列決定でき、これらはサンガージデオキシ連鎖停止反応シークエンシング法（Ｓａｎｇｅｒ ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄに基づくシークエンシング技術、インビトロ転位、４５４ ＦＬＸ（商標）又は４５４ ＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を含む次世代配列プラットフォーム、ＳＯＬＥＸＡ（商標）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＳＯＬＩＤ（商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）機器）、並びにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの企業によって開発されている他のプラットフォームが含まれる。配列情報を生成する化学は、異なる次世代シークエンシングプラットフォームに関して変化するが、それらの全ては、シークエンシング反応が同時に実行される非常に多数のシークエンシングテンプレートから配列データを生成するという共通の特徴を共有している。一般に、これらのシークエンシング反応の全てからのデータをスキャナを使用して収集し、次いでコンピュータ及び強力なバイオインフォマティクスプログラムを使用して組み立て、分析する。シークエンシング反応は、「超並列」又は「多重」様式で実施、読み取り、組み立て、及び分析される。これらの機器の超並列性により、これらの強力な機器からのシークエンシングデータの最大限可能な量を得るために、必要なシークエンシングテンプレートの種類、及びそれらの生成方法についての考え方を変える必要があった。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＤＮＡクローンのゲノムライブラリを必要とするのではなく、試料中の標的ＤＮＡから生成されたＤＮＡ断片の集合又は集団を含むＤＮＡ断片ライブラリを生成するためのインビトロシステムに関して考えることが重要であり、集合又は集団中の全てのＤＮＡ断片の組み合わせが、ＤＮＡ断片が生成された標的ＤＮＡの配列を定性的かつ／又は定量的に表す配列を示す。実際に、場合によっては、複数のゲノムＤＮＡ断片ライブラリからなるＤＮＡ断片ライブラリを生成する観点から考える必要があり、これらのライブラリのそれぞれは、配列決定された各断片の供給源の同定を可能にするために、異なるアドレスタグ又はバーコードで標識される。
一般に、これらの次世代シークエンシング方法は、ゲノムＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡ（ＲＮＡから調製）をより小さいｓｓＤＮＡ断片に断片化すること、及びｓｓＤＮＡ断片の少なくとも１つの鎖に、又は好ましくは両方の鎖にタグを付加することを必要とする。いくつかの方法では、タグはＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ配列決定のためのプライミング部位を提供する。いくつかの方法では、タグはまた、ビーズなどの表面上に断片を捕捉するための部位を提供する（例えば、これらの方法のいくつかのためのエマルションＰＣＲ増幅の前に、例えば、米国特許第７，３２３，３０５号に記載の方法を使用する）。ほとんどの場合、次世代シークエンシングのためのテンプレートとして使用されるＤＮＡ断片ライブラリは、５’－及び３’－タグ付きＤＮＡ断片又は「ｄｉ－タグ付きＤＮＡ断片」を含む。一般に、次世代シークエンシングのためのＤＮＡ断片ライブラリを生成するための現在の方法は、超音波装置、ネブライザー、又はヌクレアーゼを使用して、配列決定したい標的ＤＮＡ（例えば、ＲＮＡの逆転写後のゲノムＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡを含む標的ＤＮＡ）を断片化し、アダプター又はタグからなるオリゴヌクレオチドを断片の５’末端及び３’末端に（例えば、ライゲーションにより）結合することを含む。次世代シークエンシング法のいくつかは、シークエンシングプロセスにおいて環状ｓｓＤＮＡ基質を使用する。例えば、Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第２００９００１１９４３号、同第２００９０００５２５２号、同第２００８０３１８７９６号、同第２００８０２３４１３６号、同第２００８０２１３７７１号、同第２００７００９９２０８号、及び同第２００７００７２２０８号は、超並列ＤＮＡシークエンシングのための環状ｓｓＤＮＡテンプレートの生成を開示している。Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ及びＳｔｅｅｍｅｒｓの米国特許出願第２００８０２４２５６０号は、以下を含む方法を開示している：デジタルＤＮＡボールを作製すること（例えば、米国特許出願第２００８０２４２５６０号の図８を参照）、及び／又は、多重置換増幅又は全ゲノム増幅（例えば、その中の図１７）による、若しくは増幅された核酸アレイ（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＢｅａｄＡｒｒａｙｓ（商標）；ＩＬＬＵＭＩＮＡ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を生成するためのハイパーブランチＲＣＡ（例えば、その中の図１８）による、増幅を含む、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡの遺伝子座位特異的切断及び増幅。
特定の実施形態では、本開示は、試料中の微生物を同定するための、トランスポソームに基づく配列決定法の使用を提供する。このようなトランスポソームに基づく配列決定法は、米国特許出願公開第２０１４／０１６２８９７号、同第２０１５／０３６８６３８号、同第２０１８／０２４５０６９号、同第２０１８／００２３１１９号、国際公開第２０１２２１０３５４５号、同第２０１５０１６０８９５号、同第２０１６１３０７０４号、同第２０１９０２８０４７号、米国特許第９５７４２２６号、欧州特許第３１６１１５２号に記載されており、これらの開示は、本開示に完全に組み込まれる。ＤＮＡなどの標的核酸を、次世代シークエンシングの準備が整ったアダプター修飾テンプレートに変換するために必要とされる工程の数は、トランスポザーゼを介在とした断片化及びタグ付けの使用によって最小限に抑えることができる。本明細書で「タグ付（tagmentation）」と称されるこのプロセスは、多くの場合、一本鎖アダプター配列と二本鎖トランスポゾン末端配列領域を含むトランスポゾン対と複合体を形成したトランスポゾン酵素を含むトランスポソーム複合体による標的核酸の修飾、並びに特定の目的のために設計された任意の追加配列、を含む。タグ付により、標的核酸の断片化と二本鎖核酸断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションが同時にもたらされる。トランスポソーム錯体が支持体結合している場合、得られた断片は、タグ付反応後に、固体支持体に結合される（５’結合型トランスポソーム複合体の場合に直接、又は３’結合型トランスポソーム複合体の場合にハイブリダイゼーションを介して）。具体的には、本明細書に記載されるトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を使用することにより、ゲノム、サブゲノム、トランスクリプトーム、又はメタゲノム分析又は微生物ＲＮＡ発現の分析のために、標的微生物ＤＮＡ（微生物ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡを含む）から、ｄｉ－タグ付き直鎖ｓｓＤＮＡ断片又はタグ付き環状ｓｓＤＮＡ断片（及びその増幅産物）のライブラリを生成することができる（例えば、マイクロアレイ分析のために標識された標的を作製するために使用するため、例えば、コピー数の変動を分析するため、一塩基多型の検出及び分析のため、及び土壌又は水源などの環境試料からの遺伝子の検索するため）。
特定の実施形態では、本明細書に記載のトランスポソームに基づく配列決定法は、インビトロ転位反応を使用して、新たに合成された微生物ＤＮＡを同時に、断片に切断し、各断片の５’末端にタグを結合する。インビトロ転位反応は、別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物、又はトランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物との間に形成された安定した複合体を含む単一のトランスポソーム組成物、のいずれかを使用して、反応を組み立てることによって実施することができる。したがって、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物の使用を記載する任意のトランスポソームに基づく配列決定方法はまた、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物から作製されたトランスポソーム組成物を使用することができ、また、トランスポソーム組成物の使用について記載する任意のトランスポソームに基づく配列決定法はまた、トランスポソーム組成物が構成される別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を使用することもできることが理解されるであろう。
本明細書に記載のトランスポソームに基づく配列決定方法を使用して、新たに合成された微生物ＤＮＡからタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを生成することができ、このトランスポソームに基づく配列決定法は、新たに合成された微生物ＤＮＡを、少なくとも１つのトランスポザーゼ及びトランスポザーゼが転位複合体を形成するトランスポゾン末端組成物とのインビトロ転位反応においてインキュベートすることであって、トランスポゾン末端組成物は、（ｉ）転移トランスポゾン末端配列を示す転移鎖、及び任意で、転移トランスポゾン末端配列の５’－の追加配列、及び（ｉｉ）転移トランスポゾン末端配列に相補的な配列を示す非転移鎖を含み、ここで、新たに合成された微生物ＤＮＡへの複数の挿入が起こり得、そのそれぞれは、標的ＤＮＡのヌクレオチドの５’末端への転移された鎖を含む又はそれからなる第１のタグの結合をもたらす、条件下及び十分な時間で、インキュベートすることと、それにより、標的ＤＮＡを断片化し、アニーリングされた５’タグ付きＤＮＡ断片の集団を生成することであって、各断片は、５’末端に第１のタグがあり、次に、５’タグ付きＤＮＡ断片の３’末端を第１タグ又は第２タグに結合し、それによってタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを生成する（例えば、タグ付き環状ｓｓＤＮＡ断片又は５’－及び３’－タグ付きＤＮＡ断片（又は「ｄｉタグ付きＤＮＡ断片」））ことと、を含む。更なる実施形態では、上記のトランスポソームに基づく配列決定法は、別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を使用するが、他の実施形態では、トランスポソームに基づく配列決定法は、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物との間に形成された複合体を含むトランスポソーム組成物を使用して実施される。
本開示は、トランスポソーム複合体が固体支持体に結合しているトランスポソームに基づく配列決定法を使用することによる、微生物の同定を更に提供する。配列決定のためにビーズ結合型トランスポソームを使用した市販品の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供されるＮｅｘｔｅｒａ（商標）ＤＮＡ Ｆｌｅｘシステムである。Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＤＮＡ Ｆｌｅｘシステムは、本明細書に記載の方法を使用して微生物の同定に使用することができる。核酸断片ライブラリは、２つのトランスポゾン末端配列（１つがタグ配列に連結されている）、及びトランスポザーゼがトランスポソーム複合体を形成する、トランスポソームに基づく方法を使用して調製することができる。トランスポソーム複合体は、溶液中の標的核酸を断片化及びタグ付けして、シークエンサーの準備が整ったライブラリを生成するために使用される。トランスポソーム複合体は、２つの末端配列のうちの１つの５’末端に付加されたビオチンを介して、固体表面上に固定化されてもよい。固定化されたトランスポソームの使用は、実践の及び全体的なライブラリ調製時間、コスト、及び試薬の要件を削減し、試料入力要件を低減させ、並びにライブラリ調製の開始点として未精製又は分解された試料の使用を可能にすることによって、液相アプローチよりも有意な利点を提供する。均一な断片サイズ及びライブラリ収率をもたらすため、固体表面上のトランスポソームの固定化のための例示的な転位手順及びシステムは、国際公開第２０１４／１０８８１０号及び同第２０１６／１８９３３１号に詳細に記載されており、これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第２０１６／１８９３３１号及び米国特許出願公開第２０１４／０９３９１６（Ａ１）号に記載されている特定のビーズベースのタグ付方法では、トランスポソームは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を使用して磁気ビーズに結合される。
一般に、トランスポソームは、共有結合又は非共有結合パートナー、例えば、親和性要素及び親和性結合パートナーを使用して、スライド又はビーズなどの基質に固定化される。例えば、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体に結合したビオチン化リンカーを介してストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上に固定化される。新たに合成された微生物核酸は、固定化されたトランスポソーム複合体によって捕捉され、核酸は断片化され及びタグ付けされる（「タグ付」）。タグ付けされた断片を増幅させ、所望のアンプリコンを（例えば、ハイブリダイゼーションプローブを介して）捕捉し、タグ付けされた断片を配列決定する。
ライブラリ調製のための固体支持結合型トランスポソーム複合体を使用することにより、ライブラリ調製プロセスに進む試料入力の正規化、及び豊富化又は配列決定工程前のライブラリ出力の正規化の必要性を低減する。これらの複合体を使用することにより、様々な試料入力濃度が使用される場合であっても、液相法と比較してより一貫したインサートサイズを有するライブラリを生成する。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）などの１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン配列の末端に付加されたリンカーを介して固定化されてもよく、例えば、トランスポザーゼ酵素を固体支持体にカップリングし得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びトランスポゾンポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）の両方は、固体支持体に固定される。分子（例えば、核酸、酵素）の固体支持体への固定化に言及する場合、用語「固定化された」、「固着された」、及び「付着された」は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によって指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。本開示のある特定の実施形態では、共有結合が好ましい場合があるが、一般的に、必要とされるのは、例えば核酸増幅及び／又は配列決定を必要とする用途において支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸、酵素）が、支持体に固定化されたままであるか又は付着したままであるということである。いくつかの例では、ビーズベースのタグ付では、トランスポソームは、リガンド対、例えば、親和性要素及び親和性結合パートナーを介してビーズ表面に結合されてもよい。
トランスポゾンベースの技術は、例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＸＴ及びフレックスＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローに例示されるように、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、新たに合成された微生物核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付け（「ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」）するトランスポソーム複合体で処理され、それにより、断片の末端に固有のアダプター配列でタグ付けされた断片化された核酸分子の集団を作成する。
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダム部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載される核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素、例えば、インテグラーゼ）、及び酵素に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに結合されたアダプター配列が含まれる。二本鎖トランスポゾン末端配列のうちの一本鎖は、標的核酸の一本鎖に転移され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は、転移されない（すなわち、転移されないトランスポゾン配列）。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列（例えば、プライマー配列）を含み得る。
したがって、更なる実施形態では、試料中の微生物の同定及び分析は、タグ付き核酸断片のライブラリを生成する工程であって：本明細書に記載のトランスポソーム複合体をその上に固定化した固体支持体を提供する工程と、標的核酸を複数の標的断片に断片化し、かつ標的断片の５’末端に第１のトランスポゾンの３’末端を結合して、複数の５’タグ付き標的断片を提供するのに十分な条件下で、単離された又は精製された微生物核酸と固体支持体を接触させる工程と、を更に含む。更なる実施形態では、本方法は、５’タグ付き標的断片を増幅することを更に含む。なお更なる実施形態では、本方法は、５’タグ付き標的断片又はその増幅産物のうちの１つ以上を配列決定することを更に含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の方法により生成された新たに合成された微生物核酸の５’タグ付き断片のライブラリを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのヌクレオシド類似体及び標識試薬を含むキットを提供する。キットは、一般的に、典型的には微生物核酸合成における変化を検出又は測定するために、ヌクレオシド類似体及び標識試薬を１つ以上の方法で使用するための説明書も含む。
例示的な実施形態では、キットは、生体直交機能部分を含有するヌクレオシド又はヌクレオチド類似体と、生物直交機能部分とのクリックケミストリーを受けることができる第１の標識試薬と、を含む。追加のキット構成要素としては、プルダウン試薬、緩衝剤、他の検出試薬及び標準物質が含まれる。
以下の実施例は、本開示を例示することを意図しているが、本開示を限定するものではない。これらは、使用され得るものの典型的であるが、当業者に既知の他の手順を使用してもよい。
敗血症患者からの試料中の細菌を検出及び同定するための例示的な方法。本開示の方法論及び技術は、敗血症患者における細菌の検出を可能にする。図１に示すように、血液試料は、ヌクレオシド標識試薬５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）を含有する培地で培養される。短期間の培養（数分から数時間まで）後、ＤＮＡ合成中の生存細胞は、ＥｄＵをそれらのゲノムに組み込む。ここで、抗生物質耐性を調べる場合は、目的の抗生物質を培養培地に含めることができる。急速培養後、細胞を溶解させ、任意選択的にＤＮＡを溶解物から精製することができる。次いで、新たに合成されたＥｄＵを含有ＤＮＡは、アジド－ジスルフィド－ビオチンリンカーとのクリック反応を介してビオチンで標識される。ビオチンで標識化した後、新たに合成されたＤＮＡをストレプトアビジンコンジュゲートビーズによって捕捉する。ビーズを洗浄した後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加することにより、ＤＮＡをビーズから遊離させる。ＤＮＡを産生する細菌を同定するために、標準法（例えば、ＰＣＲライブラリ増幅を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ）を使用してシークエンシングライブラリを調製し、配列決定する。配列のバイオインフォマティクス分析により、敗血症の原因となる細菌の正体を明らかにする。
生存微生物を含有する試料中の微生物遺伝子発現を迅速に分析するための例示的な方法。本開示の方法論及び技術を使用して、生存微生物を含有する試料中の微生物遺伝子発現を迅速に分析することができる（図２）。ＥｄＵを用いて培養する代わりに、試料を５－エチニル－ウリジン（ＥＵ）を用いて培養し、次に、新たに合成した微生物ＲＮＡに組み込む。ビオチン標識化及びＲＮＡのストレプトアビジンに基づく精製後、ＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写される。ｃＤＮＡからシークエンシングライブラリを調製する。次に、配列決定及びバイオインフォマティクス分析により、試料中の生存病原微生物の遺伝子発現を明らかにする。この遺伝子発現分析を使用して、疾患の表現型を引き起こしている遺伝子を同定する、又は微生物が抗生物質に応答しているかどうかを決定することができる。遺伝子発現に関する情報に加えて、ＲＮＡ配列分析を使用して菌株を同定することもできる。ＲＮＡは、生存している、非増殖病原微生物において合成されるため、ＲＮＡ分析は、培養では複製されないが生存している汚染病原微生物又は感染性病原微生物を同定することが可能であり得る。
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (79)

  1. 試料中の生存微生物及び／又は増殖微生物の同定及び分析のための方法であって、
    （ａ）１つ以上の種類の微生物を有する又は有する疑いのある試料を得ることと、
    （ｂ）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で前記試料をインキュベートすることであって、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、
    （ｃ）前記新たに合成された微生物核酸を、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと選択的に結合する標識試薬と接触させることにより、新たに合成された微生物核酸を標識することと、
    （ｄ）前記標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製することと、
    （ｅ）前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の配列決定又は同一性の決定に基づいて、前記試料中の前記生存微生物及び／又は増殖微生物の同一性を決定することと、を含む、方法。
  2. 前記試料が、微生物感染症の疑いのある又は微生物感染症である対象から得られる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が、敗血症の疑いがある又は敗血症である、請求項２に記載の方法。
  4. （ａ）で、前記得られた試料は、非微生物核酸を選択的に除去するために、（ｂ）の前に脱ホスティング法を使用して処理される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記脱ホスティング法が、
    非微生物核酸を、
    （ａ）前記得られた試料を、ヒストン（複数可）によって結合された非微生物核酸に若しくはメチル化ＣｐＧ残基を含む非微生物核酸に選択的に結合する結合ドメインと、核酸を切断する活性を有するヌクレアーゼドメインと、を含む組み換えタンパク質と接触させることによって、非微生物ＤＮＡを選択的に切断すること、又は
    （ｂ）ヒストン（複数可）により結合された核酸に選択的に結合するか、若しくは非微生物核酸のメチル化ＣｐＧ残基に選択的に結合する、固体基質に結合している親和性剤の使用によって、除去することを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記試料が、環境試験サイトから得られた環境試料である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記環境サイトが、微生物汚染について試験される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記試料が、微生物汚染の疑いのある食品から得られた試料である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記１つ以上の種類の微生物が、細菌、真菌、ウイルス、藻類、古細菌、及び／又は原虫である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記細菌が、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バルトネラ・ヘネセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンサ゛エ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウエイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチア（Rickettsia rickettsia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、及び／又はエルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）、から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記真菌が、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramose）、アコリオン・ガリナエ（Achorion gallinae）、アクチノマヅラ属種（Actinomadura spp.）、アジェロミセス・デルマチジジス（Ajellomyces dermatididis）、アロイリスマ・ブラジリエンシス（Aleurisma brasiliensis）、アレシェリア・ボイジイ（Allersheria boydii）、アロスロデルマ属種（Arthroderma spp.）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツ（Aspergillus fumigatu）、バシジオボラス属種（Basidiobolus spp）、ブラストミセス属種（Blastomyces spp）、カドホラ属種（Cadophora spp）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、セルコスポラ・アピイ（Cercospora apii）、クリソスポリウム属種（Chrysosporium spp）、クラドスポリウム属種（Cladosporium spp）、クラドトリクス・アステロイド（Cladothrix asteroids）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クンニングアメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、デマチウム・ウェルネッケ（Dematium wernecke）、ディスコマイセス・イスラエリイ（Discomyces israelii）、エモンシア属種（Emmonsia spp）、エモンシエラ・カプスレート（Emmonsiella capsulate）、エンドミセス・ゲオトリクム（Endomyces geotrichum）、エントモルフトラ・コロネート（Entomophthora coronate）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella neoformans）、フォンセセア属種（Fonsecaea spp.）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Geotrichum candidum）、グレノスポラ・カートメンシス（Glenospora khartoumensis）、ギムノアスクス・シプセウス（Gymnoascus gypseus）、ハプロスポランジウム・パルバム（Haplosporangium parvum）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ホルミシウム・デルマチジジス（Hormiscium dermatididis）、ホルモデンドラム属種（Hormodendrum spp.）、ケラチノマイセス属種（Keratinomyces spp）、ランゲロニア・スーダナンス（Langeronia soudanense）、レプトスフェリア－セネガレンシス（Leptosphaeria senegalensis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ロブミセス・ロボイ（Lobmyces loboi）、ロボア・ロボイ（Loboa loboi）、ロボミコーシス（Lobomycosis）、マヅレラ属種（Madurella spp.）、マラセジア・フルフール（Malassezia furfur）、ミクロコッカス・ペレティエリ（Micrococcus pelletieri）、ミクロスポルム属種（Microsporum spp）、モニリア属種（Monilia spp.）、ムコール属種（Mucor spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナニジア属種（Nannizzia spp.）、ネオテスツジナ・ロサティ（Neotestudina rosatii）、ノカルジア属種（Nocardia spp.）、オイジウム・アルビカンス（Oidium albicans）、オオスポラ・ラクティス（Oospora lactis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペエトリエリジウム・ボイジイ（Petriellidium boydii）、フィアロフォラ属種（Phialophora spp.）、ピエドライア・ホルテ（Piedraia hortae）、ピチロスポルム・フルフール（Pityrosporum furfur）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）（又はニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii））、プルラリア・グウジェロティ（Pullularia gougerotii）、ピレノケータ・ロメロイ（Pyrenochaeta romeroi）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、サブローオ－ダイト（ミクロスポルム属）（Sabouraudites（Microsporum））、サルトーヤ・フミゲート（Sartorya fumigate）、セペドニウム属（Sepedonium）、スポロドリクム属種（Sporotrichum spp.）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、スタキボトリス・チャータラム（Stachybotrys chartarum）、ストレプトマイス属種（Streptomyce spp.）、チニア属種（Tinea spp.）、トルラ属種（Torula spp）、トリコフィトン属種（Trichophyton spp）、トリコスポロン属種（Trichosporon spp）、及び／又はゾフィア・ロサティ（Zopfia rosatii）、から選択される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ウイルスが、シンプレックスウイルス属（Simplexvirus）、バリセロウイルス属（Varicellovirus）、サイトメガロウイルス属（Cytomegalovirus）、ロゼオロウイルス属（Roseolovirus）、リンホクリプトウイルス属（Lympho-cryptovirus）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）、α－パピローマウイルス属（α-Papillomavirus）、β－パピローマウイルス属（β-Papillomavirus）、Ｘ－パピローマウイルス属（Χ-Papillomavirus）、γ－パピローマウイルス属（γ-Papillomavirus）、ミューパピローマウイルス属（Mupapillomavirus）、ニューパピローマウイルス属（Nupapillomavirus）、アルファポリオーマウイルス属（Alphapolyomavirus）、ベータポリオーマウイルス属（Betapolyomavirus）、γ－ポリオーマウイルス属（γ-Polyomavirus）、デルタポリオーマウイルス属（Deltapolyomavirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、α－トルクウイルス属（α-Torquevirus）、β－トルクウイルス属（β-Torquevirus）、γ－トルクウイルス属（γ-Torquevirus）、サイクロウイルス属（Cyclovirus）、ジェミサーキュラー属（Gemycircular）、ジェミキビウイルス属（Gemykibivirus）、ジェミボンウイルス属（Gemyvongvirus）、エリスロウイルス属（Erythrovirus）、ディペンドウイルス属（Dependovirus）、ボカウイルス属（Bocavirus）、オルトヘパドナウイルス属（Orthohepadnavirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、デルタレトロウイルス属（Deltaretrovirus）、レンチウイルス属（Lentivirus）、シミスプマウイルス属（Simiispumavirus）、コルチウイルス属（Coltivirus）、ロタウイルス属（Rotavirus）、セアドナウイルス属（Seadornavirus）、α－コロナウイルス属（α-Coronavirus）、β－コロナウイルス属（β-Coronavirus）、トロウイルス属（Torovirus）、ママストロウイルス属（Mamastrovirus）、ノロウイルス属（Norovirus）、サポウイルス属（Sapovirus）、フラビウイルス属（Flavivirus）、ヘパシウイルス属（Hepacivirus）、ベギウイルス属（Pegivirus）、オルトヘペウイルス属（Orthohepevirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ヘパトウイルス属（Hepatovirus）、コブウイルス属（Kobuvirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）、ロサウイルス属（Rosavirus）、サリウイルス属（Salivirus）、アルファウイルス属（Alphavirus）、ルビウイルス属（Rubivirus）、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マーブルグウイルス属（Marburgvirus）、ヘニパウイルス属（Henipavirus）、モルビリウイルス属（Morbilivirus）、レスピロウイルス属（Respirovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、メタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、オルトニューモウイルス属（Orthopneumovirus）、レダンテウイルス属（Ledantevirus）、リッサウイルス属（Lyssavirus）、ベジクロウイルス属（Vesiculovirus）、マンマレナウイルス属（Mammarenavirus）、オルトハンタウイルス属（Orthohantavirus）、オルトナイロウイルス属（Orthonairovirus）、オルトブニヤウイルス属（Orthobunyavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）、α－インフルエンザウイルス属（α-Influenzavirus）、β－インフルエンザウイルス属（β-Influenzavirus）、γ－インフルエンザウイルス属（γ-Influenzavirus）、クアランジャウイルス属（Quaranjavirus）、ソゴトウイルス属（Thogotovirus）、及び／又はデルタウイルス属（Deltavirus）、から選択される、請求項９に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジン、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジン、から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、及び（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシンから選択され、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、及び５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジンから選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジンから選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記試料が、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で５分～１８０分間インキュベートされる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記試料が、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で３０分～１２０分間インキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記標識試薬が、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する抗体である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記抗体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、又はヨードデオキシウリジンに高い特異性で結合する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標識試薬が、クリックケミストリー、ひずみ［３＋２］環化付加反応、又はシュタウディンガーライゲーションを介して、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと結合する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記標識試薬が、クリックケミストリーを介してアルキニル基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアジド基を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記標識試薬が、クリックケミストリーを介してアジド基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアルキニル基を含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記標識試薬がビオチン基を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ビオチン基を含む標識試薬が、
    Figure 2022530584000006
     から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記標識試薬が、化学的に切断可能なリンカー又は酵素的に切断可能なリンカーを更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記切断可能なリンカーが、酸－不安定系リンカー又はジスルフィド系リンカーである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記酸－不安定系リンカーが、ヒドラゾン又はシス－アコニチル基を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記酵素的に切断可能なリンカーが、ペプチド系リンカー又はβ－グルクロニド系リンカーを含む、請求項２６に記載の方法。
  30. プルダウン剤が、前記標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製するために使用される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記プルダウン試薬が、固体支持体上に固定化された抗体であり、前記抗体が、標識試薬に高い特異性で結合するか、又は前記１つ以上の種類のヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記プルダウン試薬が、固体支持体上に固定化されたストレプトアビジン又はアビジンであり、前記標識試薬がビオチン基を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記固体支持体が、ナノ材料又はマイクロ材料、ビーズ、又はプレートである、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
  34. 前記標識試薬又は標識が、請求項１に記載の（ｅ）の前に、前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸から除去又は切断される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記同一性が、異なる微生物からの核酸に対するプローブを含むマイクロアレイを使用することによって決定される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記同一性が、
    （ｉ）蛍光色素を含有するプライマーを使用して、第１のＰＣＲベースの方法を用いて、前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、前記プライマーが、保存された微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、
    （ｉｉ）前記標識された産物を、２０以上の微生物からの固有の１６ｓ ｒＲＮＡ可変領域配列を含むプローブを含むマイクロアレイに適用することと、
    （ｉｉｉ）蛍光ハイブリダイゼーション産物の前記マイクロアレイを撮像すること及び前記マイクロアレイプローブの配列に基づいて前記微生物の前記同一性を決定することに基づいて、前記生存微生物及び／又は増殖微生物の前記同一性を決定することと、によって決定される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記同一性が、前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を配列決定することによって決定又は確認される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸が、トランスポソームに基づく配列決定法を使用して配列決定される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記新たに合成された微生物核酸の配列決定が、
    （ａ）前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸をビーズ結合型トランスポソームに適用することであって、前記ビーズ結合型トランスポソームが、微生物核酸の同時断片化及び配列決定プライマーの添加を媒介する、適用することと、
    （ｂ）前記微生物核酸断片を、インデックス及びアダプター配列を含むプライマーで増幅して、増幅産物のライブラリを形成することと、
    （ｃ）増幅産物の前記ライブラリを洗浄及びプールすることと、
    （ｄ）増幅産物の前記ライブラリを配列決定することと、
    （ｅ）バイオインフォマティクス分析を使用して、増幅産物の前記ライブラリから得られた配列を、既知の微生物配列のデータベースと相関させることに基づいて、前記生存微生物及び／又は増殖微生物の前記同一性を決定することと、によるものである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記新たに合成された微生物核酸が、ＲＮＡであり、前記微生物ＲＮＡが、請求項１に記載の（ｅ）の前に、ｃＤＮＡに逆転写され、前記生存微生物及び／又は増殖微生物の遺伝子発現が、マイクロアレイを使用して及び／又は配列決定によって、新たに合成された微生物ＲＮＡからの遺伝子産物の前記発現レベルを分析することに基づいて決定することができる、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性を決定するための方法であって、
    （ａ）１つ以上の種類の微生物を有する又は有する疑いのある試料を得ることと、
    （ｂ）前記試料を２つの試料、対照試料及び処理試料に分割することと、
    （ｃ）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で前記対照試料をインキュベートすることであって、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、
    （ｃ’）１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体及び抗菌剤の存在下で前記処理試料をインキュベートすることであって、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、新たに合成された微生物核酸に組み込まれる、インキュベートすることと、
    （ｄ）前記新たに合成された微生物核酸を、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと選択的に結合する標識試薬と接触させることによって、前記対照試料及び前記処理試料の新たに合成された微生物核酸を標識することと、
    （ｅ）前記対照試料及び前記処理試料から、前記標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製することと、
    （ｆ）前記対照試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量又は同一性を決定することと、
    （ｆ’）前記処理試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量及び同一性を決定することと、
    （ｇ）前記対照試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性と、前記処理試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量又は同一性と、を比較及び任意の変化を決定することと、を含み、
    前記処理試料対前記対照試料において、前記新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベルが減少している場合、あるいは前記処理試料対前記対照試料において、前記新たに合成された微生物核酸の前記量及び／又は同一性が減少している場合、前記抗菌剤が前記微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す、方法。
  42. 前記抗菌剤が、抗生物質、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記抗生物質が、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メゾロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピバンピシリン、ピブメシリナム、チカルシリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフカペン、セフダロキシム（cefdaloxime）、セフジニル、セフジトレン、セフェタメット、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン（ceftiolene）、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフクリジン（cefclidine）、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン、セファクロメジン（cefaclomezine）、セファロラム（cefaloram）、セファパロール（cefaparole）、セフカネル（cefcanel）、セフェドロロール（cefedrolor）、セフェムピドン（cefempidone）、セフェトリゾール（cefetrizole）、セフィビトリル（cefivitril）、セフマチレン、セフメピジウム（cefmepidium）、セフォベシン、セフォキサゾール（cefoxazole）、セフロチル（cefrotil）、セフスミド（cefsumide）、セフラセチム（cefuracetime）、セフチオキシド（ceftioxide）、アズトレオナム、イミペネム、ドリペネム、エルタペネム、メロペネム、アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、フルメキン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミド酸、ピペミド酸、ロソキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、デラフロキサシン（delafloxacin）、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン、バンコマイシン、テイコプラニン、テラバンシン、リネゾリド、サイクロセリン、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル（rifalazil）、バイオマイシン、カプレオマイシン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、及びニトロフラントイン、から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記抗真菌剤が、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、テルコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール、アバファンギン（abafungin）、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、トルナフテート、フルシトシン、ブテナフィン、グリセオフルビン、シクロピロックス、硫化セレン、タバボロール（tavaborole）、から選択される、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記抗ウイルス剤が、アシクロビル、ブリブジン、ドコサノール、ファムシクロビル、フォスカーネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、ビダラビン、シタラビン、バラシクロビル、トロマタンジン（tromatandine）、プリテリビル（pritelivir）、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ペラミビル、ザナミビル、アスナプレビル、ボセプレビル、シルプレビル、ダノプレビル、ファルダプレビル、グレカプレビル（glecaprevir）、グラゾプレビル（grazoprevir）、ナルラプレビル（narlaprevir）、パリタプレビル、シメプレビル、ソバプレビル（sovaprevir）、テラプレビル、バニプレビル、ベドロプレビル（vedroprevir）、ボキシラプレビル（voxilaprevir）、ダクラタスビル、エルバスビル、レジパスビル、オダラスビル（odalasvir）、オムビタスビル、ピブレンタスビル（pibrentasvir）、ラビダスビル（ravidasvir）、ルザスビル（ruzasvir）、サマタスビル（samatasvir）、ベルパタスビル（velpatasvir）、ベクラブビル、ダサブビル、デレオブビル（deleobuvir）、フィリブビル（filibuvir）、セトロブビル（setrobuvir）、ソホスブビル、ラダルブビル（radalbuvir）、ウプリフォスビル（uprifosbuvir）、ラミブジン、テルビブジン、クレブジン、アデフォビル、テノフビル・ジソプロキシル（tenofvir disoproxil）、テノホビル・アラフェナミド、エンフビルチド、マラビロク、ビクリビロック、セニクリビロック（cenicriviroc）、ＰＲＯ １４０、イバリズマブ（ibalizumab）、フォステムサビル（fostemsavir）、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、ジドブジン、アムドキソビル、アプリシタビン（apricitabine）、センサブジン（censavudine）、エルブシタビン（elvucitabine）、ラシビル（racivir）、スタンピジン（stampidine）、４’－エチニル－２－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、ザルシタビン、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、リルピビリン、ドラビリン（doravirine）、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル（cabotegravir）、ビクテグラビル（bictegravir）、ＭＫ－２０４８、ベビリマット（bevirimat）、ＢＭＳ－９５５１７６、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、チプラナビル、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ＢＩ ２２４４３６、カボテグラビル、ビクテグラビル、ＭＫ－２０４８、コビシスタット、リトナビル、インターフェロン－α、ペグインターフェロン－α、メチサゾン、リファンピシン、イミキモド、レシキモド、ポドフィロトキシン、ホミビルセン、シドフォビル、プリコナリル、ファビピラビル、ガリデシビル（galidesivir）、レムデシビル、メリシタビン、ＭＫ－６０８、ＮＩＴＤ００８、モロキシジン、トロマンタジン、及びトリアザビリン（triazavirin）、から選択される、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記試料が、微生物感染症の疑いのある又は微生物感染症である対象から得られる、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記対象が、敗血症の疑いがある又は敗血症である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記１つ以上の種類の微生物が、細菌、真菌、及び／又はウイルスである、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記細菌が、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バルトネラ・ヘネセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana）、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウエイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチア（Rickettsia rickettsia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）、エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、及び／又はエルシニア・シュードツベルクロシス（Yersinia pseudotuberculosis）、から選択される、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記真菌が、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramose）、アコリオン・ガリナエ（Achorion gallinae）、アクチノマヅラ属種（Actinomadura spp.）、アジェロミセス・デルマチジジス（Ajellomyces dermatididis）、アロイリスマ・ブラジリエンシス（Aleurisma brasiliensis）、アレシェリア・ボイジイ（Allersheria boydii）、アロスロデルマ属種（Arthroderma spp.）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツ（Aspergillus fumigatu）、バシジオボラス属種（Basidiobolus spp）、ブラストミセス属種（Blastomyces spp）、カドホラ属種（Cadophora spp）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、セルコスポラ・アピイ（Cercospora apii）、クリソスポリウム属種（Chrysosporium spp）、クラドスポリウム属種（Cladosporium spp）、クラドトリクス・アステロイド（Cladothrix asteroids）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコッカス・ラウレンチイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クンニングアメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、デマチウム・ウェルネッケ（Dematium wernecke）、ディスコマイセス・イスラエリイ（Discomyces israelii）、エモンシア属種（Emmonsia spp）、エモンシエラ・カプスレート（Emmonsiella capsulate）、エンドミセス・ゲオトリクム（Endomyces geotrichum）、エントモルフトラ・コロネート（Entomophthora coronate）、エピデルモフィトン・フロッコーズム（Epidermophyton floccosum）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella neoformans）、フォンセセア属種（Fonsecaea spp.）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Geotrichum candidum）、グレノスポラ・カートメンシス（Glenospora khartoumensis）、ギムノアスクス・シプセウス（Gymnoascus gypseus）、ハプロスポランジウム・パルバム（Haplosporangium parvum）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ホルミシウム・デルマチジジス（Hormiscium dermatididis）、ホルモデンドラム属種（Hormodendrum spp.）、ケラチノマイセス属種（Keratinomyces spp）、ランゲロニア・スーダナンス（Langeronia soudanense）、レプトスフェリア－セネガレンシス（Leptosphaeria senegalensis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ロブミセス・ロボイ（Lobmyces loboi）、ロボア・ロボイ（Loboa loboi）、ロボミコーシス（Lobomycosis）、マヅレラ属種（Madurella spp.）、マラセジア・フルフール（Malassezia furfur）、ミクロコッカス・ペレティエリ（Micrococcus pelletieri）、ミクロスポルム属種（Microsporum spp）、モニリア属種（Monilia spp.）、ムコール属種（Mucor spp.）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナニジア属種（Nannizzia spp.）、ネオテスツジナ・ロサティ（Neotestudina rosatii）、ノカルジア属種（Nocardia spp.）、オイジウム・アルビカンス（Oidium albicans）、オオスポラ・ラクティス（Oospora lactis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペエトリエリジウム・ボイジイ（Petriellidium boydii）、フィアロフォラ属種（Phialophora spp.）、ピエドライア・ホルテ（Piedraia hortae）、ピチロスポルム・フルフール（Pityrosporum furfur）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）（又はニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii））、プルラリア・グウジェロティ（Pullularia gougerotii）、ピレノケータ・ロメロイ（Pyrenochaeta romeroi）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、サブローオ－ダイト（ミクロスポルム属）（Sabouraudites（Microsporum））、サルトーヤ・フミゲート（Sartorya fumigate）、セペドニウム属（Sepedonium）、スポロドリクム属種（Sporotrichum spp.）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、スタキボトリス・チャータラム（Stachybotrys chartarum）、ストレプトマイス属種（Streptomyce spp.）、チニア属種（Tinea spp.）、トルラ属種（Torula spp）、トリコフィトン属種（Trichophyton spp.）、トリコスポロン属種（Trichosporon spp.）、及び／又はゾフィア・ロサティ（Zopfia rosatii）、から選択される、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記ウイルスが、シンプレックスウイルス属（Simplexvirus）、バリセロウイルス属（Varicellovirus）、サイトメガロウイルス属（Cytomegalovirus）、ロゼオロウイルス属（Roseolovirus）、リンホクリプトウイルス属（Lympho-cryptovirus）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）、マストアデノウイルス属（Mastadenovirus）、α－パピローマウイルス属（α-Papillomavirus）、β－パピローマウイルス属（β－Papillomavirus）、Ｘ－パピローマウイルス属（Χ-Papillomavirus）、γ－パピローマウイルス属（γ-Papillomavirus）、ミューパピローマウイルス属（Mupapillomavirus）、ニューパピローマウイルス属（Nupapillomavirus）、アルファポリオーマウイルス属（Alphapolyomavirus）、ベータポリオーマウイルス属（Betapolyomavirus）、γ－ポリオーマウイルス属（γ-Polyomavirus）、デルタポリオーマウイルス属（Deltapolyomavirus）、モルシポックスウイルス属（Molluscipoxvirus）、オルソポックスウイルス属（Orthopoxvirus）、パラポックスウイルス属（Parapoxvirus）、α－トルクウイルス属（α-Torquevirus）、β－トルクウイルス属（β-Torquevirus）、γ－トルクウイルス属（γ-Torquevirus）、サイクロウイルス属（Cyclovirus）、ジェミサーキュラー属（Gemycircular）、ジェミキビウイルス属（Gemykibivirus）、ジェミボンウイルス属（Gemyvongvirus）、エリスロウイルス属（Erythrovirus）、ディペンドウイルス属（Dependovirus）、ボカウイルス属（Bocavirus）、オルトヘパドナウイルス属（Orthohepadnavirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、デルタレトロウイルス属（Deltaretrovirus）、レンチウイルス属（Lentivirus）、シミスプマウイルス属（Simiispumavirus）、コルチウイルス属（Coltivirus）、ロタウイルス属（Rotavirus）、セアドナウイルス属（Seadornavirus）、α－コロナウイルス属（α-Coronavirus）、β－コロナウイルス属（β-Coronavirus）、トロウイルス属（Torovirus）、ママストロウイルス属（Mamastrovirus）、ノロウイルス属（Norovirus）、サポウイルス属（Sapovirus）、フラビウイルス属（Flavivirus）、ヘパシウイルス属（Hepacivirus）、ベギウイルス属（Pegivirus）、オルトヘペウイルス属（Orthohepevirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）、エンテロウイルス属（Enterovirus）、ヘパトウイルス属（Hepatovirus）、コブウイルス属（Kobuvirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）、ロサウイルス属（Rosavirus）、サリウイルス属（Salivirus）、アルファウイルス属（Alphavirus）、ルビウイルス属（Rubivirus）、エボラウイルス属（Ebolavirus）、マーブルグウイルス属（Marburgvirus）、ヘニパウイルス属（Henipavirus）、モルビリウイルス属（Morbilivirus）、レスピロウイルス属（Respirovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、メタニューモウイルス属（Metapneumovirus）、オルトニューモウイルス属（Orthopneumovirus）、レダンテウイルス属（Ledantevirus）、リッサウイルス属（Lyssavirus）、ベジクロウイルス属（Vesiculovirus）、マンマレナウイルス属（Mammarenavirus）、オルトハンタウイルス属（Orthohantavirus）、オルトナイロウイルス属（Orthonairovirus）、オルトブニヤウイルス属（Orthobunyavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）、α－インフルエンザウイルス属（α-Influenzavirus）、β－インフルエンザウイルス属（β-Influenzavirus）、γ－インフルエンザウイルス属（γ-Influenzavirus）、クアランジャウイルス属（Quaranjavirus）、ソゴトウイルス属（Thogotovirus）、及び／又はデルタウイルス属（Deltavirus）、から選択される、請求項４７に記載の方法。
  52. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジン、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジン、から選択される、請求項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２－エチニル－アデノシン、Ｎ６－プロパルギル－アデノシン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－アデノシン、５－エチニル－シチジン、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－シチジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－グアノシン、５－エチニル－ウリジン、５－エチニル－２’－デオキシウリジン、２’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、３’－（Ｏ－プロパルギル）－ウリジン、（２’Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、２’（Ｓ）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、及び（２’Ｓ）－２’－フルオロ－５－エチニルウリジン、から選択される、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、８－アジド－アデノシン、Ｎ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシンから選択され、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、５－アジドメチル－ウリジン、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン、５－（３－アジドプロピル）－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－ウリジン、５－アジド－ＰＥＧ４－シチジン、及び５－アジド－ＰＥＧ４－２’－デオキシシチジンから選択される、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨード－２’デオキシウリジン、及び５－ヨードウリジンから選択される、請求項４１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記対照試料及び前記処理試料が、両方とも、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で５分間～１８０分間同じ時間でインキュベートされる、請求項４１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記対照試料及び前記処理試料が、両方とも、１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の存在下で３０分～１２０分間同じ時間でインキュベートされる、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記標識試薬が、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する抗体である、請求項４１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記抗体が、５－ブロモ－２’デオキシウリジン、又はヨードデオキシウリジンに高い特異性で結合する、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記標識試薬が、クリックケミストリー、ひずみ［３＋２］環化付加反応、又はシュタウディンガーライゲーションを介して、前記１つ以上の種類のヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に若しくはそれらと結合する、請求項４１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記標識試薬が、クリックケミストリーを介してアルキニル基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアジド基を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記標識試薬が、クリックケミストリーを介してアジド基を含むヌクレオシド又はヌクレオチド類似体に結合するアルキニル基を含む、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記標識試薬がビオチン基を含む、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ビオチン基を含む標識試薬が、
    Figure 2022530584000007
     から選択される、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記標識試薬が、化学的に切断可能なリンカー又は酵素的に切断可能なリンカーを更に含む、請求項４１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記切断可能なリンカーが、酸－不安定系リンカー又はジスルフィド系リンカーである、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記酸－不安定系リンカーが、ヒドラゾン又はシス－アコニチル基を含む、請求項６４に記載の方法。
  68. 前記酵素的に切断可能なリンカーが、ペプチド系リンカー又はβ－グルクロニド系リンカーを含む、請求項６３に記載の方法。
  69. プルダウン剤が、前記標識された新たに合成された微生物核酸を単離又は精製するために使用される、請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記プルダウン試薬が、固体支持体上に固定化された抗体であり、前記抗体が、標識試薬に高い特異性で結合するか、又は前記１つ以上の種類のヌクレオシド若しくはヌクレオチド類似体に高い特異性で結合する、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記プルダウン試薬が、固体支持体上に固定化されたストレプトアビジン又はアビジンであり、前記標識試薬がビオチン基を含む、請求項６７に記載の方法。
  72. 前記固体支持体が、ナノ材料又はマイクロ材料、ビーズ、又はプレートである、請求項６８又は請求項６９に記載の方法。
  73. 前記標識試薬又は標識が、請求項４２に記載の（ｆ）、（ｆ’）及び（ｇ）の前に、前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸から除去又は切断される、請求項４１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記対照試料中及び前記処理試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性を決定することが、異なる微生物からの核酸に対するプローブを含むマイクロアレイを使用することによって決定される、請求項４１～７１のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記対照試料中及び前記処理試料中の前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性を決定することが、
    （ｉ）蛍光色素を含有するプライマーを使用して、第１のＰＣＲベースの方法を用いて、前記対照試料からの前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、前記プライマーが、保存された微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、
    （ｉ’）前記蛍光色素を含有するプライマーを使用して、前記第１のＰＣＲベースの方法を用いて、前記処理試料からの前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を増幅して標識された産物を形成することであって、前記プライマーが、保存された微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域に特異的な配列を含む、形成することと、
    （ｉｉ）前記対照試料からの前記標識された産物を、２０以上の微生物からの固有の１６ｓ ｒＲＮＡ可変領域配列を含むプローブを含む第１のマイクロアレイに適用することと、
    （ｉｉ’）前記処理試料からの前記標識された産物を、第２のマイクロアレイに適用することであって、前記第２のマイクロアレイが、前記第１のマイクロアレイの複製である、適用することと、
    （ｉｉｉ）蛍光ハイブリダイゼーション産物の前記第１のマイクロアレイ及び前記第２のマイクロアレイを撮像すること、及び前記マイクロアレイ間の前記蛍光ハイブリダイゼーション産物の強度、位置、又は非存在に関して任意の変化があるかどうかを決定することに基づいて、試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の有効性を決定することであって、
    前記第１のマイクロアレイと第２のマイクロアレイとの間の前記蛍光ハイブリダイゼーション産物の強度の低下がある場合、又は第１のマイクロアレイと第２のマイクロアレイとの間の蛍光ハイブリダイゼーション産物の位置若しくは非存在に変化がある場合、前記抗菌剤が、前記微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す、決定することと、による、請求項７２に記載の方法。
  76. 試料中の微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の前記有効性が、前記対照試料から及び前記処理試料からの前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を配列決定することにより、決定又は確認され、
    前記処理試料対前記対照試料中における前記新たに合成された微生物核酸の遺伝子発現レベルの減少、あるいは、前記処理試料対前記対照試料中における前記新たに合成された微生物核酸の量及び／又は同一性の減少がある場合に、前記抗菌剤が、前記微生物（複数可）の成長及び増殖を調節するのに有効であることを示す、請求項４１～７３のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記対照試料及び処理試料からの前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸が、トランスポソームに基づく配列決定法を使用して配列決定される、請求項７４に記載の方法。
  78. 前記対照試料及び処理試料からの前記新たに合成された微生物核酸の配列決定が、
    （ａ）前記対照試料及び処理試料からの前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸を、ビーズ結合型トランスポソームに適用することであって、前記ビーズ結合型トランスポソームが、微生物核酸の同時断片化及び配列決定プライマーの添加を媒介する、適用することと、
    （ｂ）前記微生物核酸断片を、インデックス及びアダプター配列を含むプライマーで増幅して、増幅産物のライブラリを形成することと、
    （ｃ）前記対照試料からの増幅産物の前記ライブラリを洗浄及びプールすることと、
    （ｃ’）前記処理試料からの増幅産物の前記ライブラリを洗浄及びプールすることと、
    （ｄ）前記対照試料からの増幅産物の前記ライブラリを配列決定することと、
    （ｄ’）前記処理試料からの増幅産物の前記ライブラリを配列決定することと、
    （ｅ）バイオインフォマティクス分析の使用に基づいて、前記対照試料及び処理試料からの、前記単離された又は精製された新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベル及び／又は量及び／又は同一性の任意の変化を決定することと、によるものである、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記新たに合成された微生物核酸がＲＮＡであり、前記微生物ＲＮＡが、請求項４１に記載の（ｆ）、（ｆ’）及び（ｇ）の前に、ｃＤＮＡに逆転写され、微生物（複数可）の成長及び増殖を調節する抗菌剤の前記有効性が、マイクロアレイを使用することによって、及び／又は配列決定によって、前記対照試料及び処理試料からの新たに合成された微生物核酸の前記遺伝子発現レベルの変化を決定することに基づいて決定することができる、請求項４１～７６のいずれか一項に記載の方法。
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