PT1812031E - Composições e métodos para modificação de biomoléculas - Google Patents

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Carolyn R Bertozzi
Nicholas J Agard
Jennifer A Prescher
Jeremy Michael Baskin
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Univ California
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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAÇÃO DE BIOMOLECULAS CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se geralmente à modificação covalente de moléculas úteis, por exemplo, na modificação de superfícies (incluindo superfícies celulares) e modificação de moléculas sob condições fisiológicas (por exemplo, num ambiente celular).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Reações químicas seletivas que são ortogonais à funcionalidade diversa dos sistemas biológicos são agora reconhecidas como ferramentas importantes na biologia química. Como recém-chegados ao repertório da química sintética, estas reações bio-ortogonais inspiraram novas estratégias para a síntese de bibliotecas de compostos, manipulação de proteínas, proteómica funcional, e remodelação química das superfícies celulares. A azida assegurou um papel proeminente como um manipulador químico único para bioconjugação. A ligação de Staudinger tem sido utilizada com fosfinas para marcar açúcares azido metabolicamente introduzidos em glicoconjugados celulares. A ligação de Staudinger pode ser realizada em animais vivos sem prejuízo fisiológico; não obstante, a reação de Staudinger não está isenta de suscetibilidades. As fosfinas necessárias são suscetíveis à oxidação pelo ar e a sua otimização para solubilidade em água melhorada e taxa de reação aumentada provou ser sinteticamente desafiante. 0 grupo azida tem um modo alternativo de reatividade bio-ortogonal: a cicloadição [3+2] com alquinas descrita por Huisgen. Na sua forma clássica, esta reação possui aplicabilidade limitada nos sistemas biológicos devido ao requisito de temperaturas (ou pressões) elevadas para taxas de reação razoáveis. Sharpless e os seus colaboradores superaram este obstáculo com o desenvolvimento de uma versão catalisada com cobre (I), designada "química click", que prossegue prontamente em temperaturas fisiológicas e em ambientes biológicos ricamente funcionalizados. Esta descoberta permitiu a modificação seletiva de partículas virais, ácidos nucleicos, e proteínas a partir de lisados de tecidos complexos. Infelizmente, o catalisador de cobre obrigatório é tóxico tanto para células de mamífero como bacterianas, impedindo assim aplicações em que as células devem permanecer viáveis. As cicloadições de Huisgen livres de catalisador de alcinos ativadas por substituintes de remoção de eletrões foram relatadas como ocorrendo em temperaturas ambientes. No entanto, estes compostos passam pela reação de Michael com nucleófilos biológicos.
Existe uma necessidade no campo para mecanismos adicionais para modificar moléculas biológicas através de uma reação biocompativel, particularmente num ambiente biológico. A presente invenção aborda esta necessidade.
Literatura
Huisgen (1963) Angew. Chem. Int. Ed. 2:565-598; Shea e Kim. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4846-4855; Reese e Shaw (1970) Chem. Comm. 1172-1173; Wilbur et al. Bioconj. Chem. 1996, 7, 689-702; Bistrup et al. J. Cell Biol. 1999, 145, 899-910; Saxon et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14893-14902; Hang e Bertozzi. Acc. Chem. Res. 2001,34, 727-736; Link et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 603-609; Lee et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588-9589; Wang et al. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 3192-3193; Kiick et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2002, 99, 19-24; Speers e Cravatt. Chem. Biol., 2004, 11, 535-546; Saxon e Bertozzi Science 2000, 287, 2007-2010; Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1164-1165; Dube e Bertozzi. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 616-625; Vocadlo et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2003, 100, 9116-9121; Prescher et al., Nature 2004, 430, 873-877; Seo et al. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612; Li et al. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3143-3146; Wittig e Krebs. Chem. Ber. 1961, 94, 3260-3275; Meier et al. Chem. Ber. 1980, 113, 2398-2409; Turner et al., J. Am. Chem. Soc. 1972, 95, 790-792.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos de cicloalcino conforme estabelecido na reivindicação 1; e método de utilização de tais compostos na modificação de biomoléculas conforme estabelecido nas reivindicações 15 e 23. A presente invenção apresenta uma reação de cicloadição que pode ser levada a cabo sob condições fisiológicas. Em geral, a invenção envolve reagir uma cicloalquina modificada com uma fração de azida numa biomolécula alvo, gerando uma biomolécula covalentemente modificada. A seletividade da reação e a sua compatibilidade com ambientes aquosos proporcionam a sua aplicação in vivo (por exemplo, na superfície celular ou intracelularmente) e in vitro (por exemplo, síntese de péptidos e outros polímeros, produção de aminoácidos modificados (por exemplo, marcados).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figuras IA e 1B ilustram reações de cicloadição. A Figura IA ilustra uma cicloadição de Huisgen catalisada por Cu(I) ("química click"). A Figura 1B ilustra a cicloadição de azidas e ciclooctinas [3+2] promovida pela tensão. A Figura 2 ilustra a marcação de GlyCAM-Ig modificada com azida com sondas de alcino.
As Figuras 3A-C ilustram a marcação da superfície celular com um composto de ciclooctina. A Figura 4A ilustra esquematicamente a marcação de azidas da superfície celular com sondas de ciclooctina. A Figura 4B ilustra a marcação com sonda de ciclooctina de células Jurkat que contêm azidas da superfície celular. A Figura 5 ilustra a marcação de esplenocitos com ciclooctina-FLAG. A Figura 6 ilustra a marcação in vivo de ratinhos com compostos de ciclooctina-FLAG.
DEFINIÇÕES
Por "parceiro reativo" entende-se uma molécula ou fração molecular que reagem especificamente com outro parceiro reativo. Parceiros reativos exemplares são aqueles da reação da invenção, isto é, um grupo azida de uma molécula alvo modificada com azida e o grupo cicloalcino de uma fração de cicloalcino modificada.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "isolado" destina-se a descrever um composto de interesse que se encontra num ambiente distinto daquele no qual o composto ocorre naturalmente. "Isolado" destina-se a incluir compostos que estão dentro de amostras que são substancialmente enriquecidas para o composto de interesse e/ou nas quais o composto de interesse é parcial ou substancialmente purificado.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "substancialmente purificado" refere-se a um composto que é removido a partir do seu ambiente natural ou do seu ambiente sintético e que é pelo menos 60% isento, pelo menos 75% isento, pelo menos 90% isento, pelo menos 95% isento, pelo menos 98% isento, ou pelo menos 99% isento de outros compostos com os quais está naturalmente associado, ou é pelo menos 60% isento, pelo menos 75% isento, pelo menos 90% isento, pelo menos 95% isento, pelo menos 98% isento, ou pelo menos 99% isento de contaminantes associados com a síntese do composto.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "célula" no contexto das aplicações in vivo da invenção destina-se a englobar células eucarióticas e procarióticas de qualquer género ou espécie, com as células de mamíferos sendo de interesse particular. "Célula" também se destina a englobar células normais e células doentes, por exemplo, células cancerosas. Em muitas formas de realização, as células são células vivas.
Os termos "polipéptido" e "proteína", utilizados indistintamente no presente documento, referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que podem incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos química ou bioquimicamente modificados ou derivados, e polipéptidos tendo estruturas principais modificadas. 0 termo inclui proteínas de fusão, incluindo, proteínas de fusão com uma sequência de aminoácidos heteróloga, fusões com sequências líder heterólogas ou homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminal; proteínas marcadas imunologicamente. 0 termo "condições fisiológicas" destina-se a englobar aquelas condições compatíveis com células vivas, por exemplo, condições predominantemente aquosas de uma temperatura, pH, salinidade, etc. que são compatíveis com células vivas. 0 termo "arilo", conforme utilizado no presente documento, significa radicais aromáticos simples de 5 e 6 membros que podem incluir desde zero a quatro heteroátomos. Arilos representativos incluem fenilo, tienilo, furanilo, piridinilo, (is)oxazoil. 0 termo "alquilo inferior", isolado ou em combinação, significa geralmente um radical de alquilo acíclico contendo desde 1 a cerca de 10, por exemplo, desde 1 até cerca de 8 átomos de carbono, ou desde 1 até cerca de 6 átomos de carbono. Exemplos de tais radicais incluem metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isoamilo, hexilo, octilo. O termo "grupo alifático" significa um grupo de hidrocarboneto linear ou ramificado saturado ou insaturado e engloba grupos alquilo, alquenilo, e alquinilo, por exemplo. O termo "grupo alquilo" significa um grupo de hidrocarboneto linear ou ramificado saturado substituído ou não substituído ou cadeia (por exemplo, Ci a Cs ) incluindo, por exemplo, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, heptilo, iso-propilo, n-octilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexil. Substituintes adequados incluem carboxi, carboxi protegido, amino, amino protegido, halo, hidroxi, hidroxi protegido, nitro, ciano, amino monossubstituido, amino monossubstituido protegido, amino dissubstituido, alcoxi Ci a C7, acilo Ci a C7, aciloxi Ci a C7. 0 termo "alquilo substituído" significa o grupo alquilo definido acima substituído de uma a três vezes por um hidroxi, hidroxi protegido, amino, amino protegido, ciano, halo, trifluorometilo, amino monossubstituido, amino dissubstituido, alcoxi inferior, alquiltio inferior, carboxi, carboxi protegido, ou urn sal de carboxi, amino, e/ou hidroxi. Conforme utilizado em conjunção com os substituintes para os anéis de heteroarilo, os termos "(cicloalquil)alquilo substituído" e "cicloalquilo substituído" são conforme definido abaixo substituídos com os mesmos grupos conforme listados para um grupo de "alquilo substituído". 0 termo "grupo alquenilo" significa um grupo hidrocarboneto insaturado linear ou ramificado com uma ou mais ligações duplas de carbono-carbono, tal como um grupo vinilo. 0 termo "grupo alquinilo" significa um grupo hidrocarboneto insaturado linear ou ramificado com uma ou mais ligações triplas de carbono-carbono. 0 termo "grupo cíclico" significa um grupo hidrocarboneto de anel fechado que é classificado com um grupo acíclico, grupo aromático, ou grupo heterocíclico. 0 termo "grupo alicíclico" significa um grupo hidrocarboneto tendo propriedades que se assemelham àquelas dos grupos alifáticos. 0 termo "grupo aromático" ou "grupo arilo" significa um grupo hidrocarboneto aromático mono ou policíclico, e pode incluir um ou mais heteroátomos, e o qual é adicionalmente definido abaixo. 0 termo "grupo heterocíclico" significa um hidrocarboneto de anel fechado no qual um ou mais dos átomos no anel são um elemento que não um carbono (por exemplo, azoto, oxigénio, enxofre etc.), e são adicionalmente definidos abaixo.
Os termos "halo" e "halogéneo" referem-se aos grupos de flúor, cloro, bromo ou iodo. Pode existir um ou mais halogéneos, que são os mesmos ou diferentes. 0 termo "haloalquilo" refere a um grupo alquilo conforme definido acima que é substituído por um ou mais átomos de halogéneo. Os átomos de halogéneo podem ser os mesmos ou diferentes. 0 termo "dihaloalquilo" refere-se a um grupo alquilo conforme descrito acima que é substituído por dois grupos halo, que podem ser os mesmos ou diferentes. 0 termo "trihaloalquilo" refere-e a um grupo alquilo conforme descrito acima que é substituído por três grupos halo, que podem ser os mesmos ou diferentes. 0 termo "perhaloalquilo" refere-se a um grupo haloalquilo conforme definido acima em que cada átomo de hidrogénio no grupo alquilo foi substituído por um átomo de halogéneo. 0 termo "perfluoroalquilo" refere-se a um grupo haloalquilo conforme definido acima em que cada átomo de hidrogénio no grupo alquilo foi substituído por um grupo de flúor. 0 termo "cicloalquilo" significa um anel saturado, mono bi, ou triciclico que é completamente saturado ou parcialmente não saturado. Exemplos de um tal grupo incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ciclohexilo, cicloheptilo, adamantilo, ciclooctilo, cis ou trans decaina, biciclo[2.2.1]hept-2-eno, ciclohex-l-enilo, ciclopent-l-enilo, 1,4-ciclooctadienilo. 0 termo " (cicloalquil)alquilo" significa o grupo alquilo acima definido substituído para um dos anéis de cicloalquilo acima. Exemplos de tais grupos incluem (ciclohexil)metilo, 3-(ciclopropil)-n-propilo, 5-(ciclopentil)hexilo, 6-(adamantil)hexilo. 0 termo "fenilo substituído" especifica um grupo fenilo substituído com uma ou mais frações, e em alguns casos uma, duas, ou três frações, escolhidas a partir dos grupos que consistem em halogéneo, hidroxi, hidroxi protegido, ciano, nitro, trifluorometilo, alquilo Ci a C7, alcoxi Ci a C7, acilo Ci a C7, aciloxi Ci a C7, carboxi, oxicarboxi, carboxi protegido, carboximetilo, carboximetilo protegido, hidroximetilo, hidroximetilo protegido, amino, amino protegido, amino(monossubstituído), amino(monossubstituído) protegido, amino(dissubstituido), carboxamida, carboxamida protegida, N- (alquil Ci a Ce) carboxamida, N- (alquil Ci a Ce) carboxamida protegida, N,N-di(alquil Ci a Ce)carboxamida, trifluorometilo, N-((alquil Ci a Ce)sulfonil)amino, N-(fenilsulfonil) amino ou fenilo, substituído ou não substituído, de tal forma que, por exemplo, resulta um grupo bifenilo ou naftilo.
Exemplos do termo "fenilo substituído" incluem um grupo mono ou di (halo) fenilo tal como 2, 3 ou 4-clorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 2, 3 ou 4-bromofenilo, 3,4-dibromofenilo, 3- cloro-4-fluorofenilo, 2, 3 ou 4-fluorofenilo; um grupo mono ou di (hidroxi) fenilo tal como um 2, 3, ou 4-hidroxifenilo, 2,4-dihidroxifenilo, os derivados de hidroxi protegidos dos mesmos; um grupo nitrofenilo tal como 2, 3, ou 4-nitrofenilo; um grupo cianofenilo, por exemplo, 2, 3 ou 4-cianofenilo; um grupo mono ou di (alquil) fenilo tal como 2, 3, ou 4-metilfenilo, 2.4- dimetilfenilo, 2, 3 ou 4-(isopropil)fenilo, 2, 3, ou 4- etil fenilo, 2,3 ou 4-(n-propil)fenilo; um grupo mono ou di (alcoxi)fenilo, por exemplo, 2,6-dimetoxifenil, 2, 3 ou 4-(isopropoxi)fenilo, 2, 3 ou 4-(t-butoxi)fenilo, 3- etoxi-4-metoxifenilo; 2, 3 ou 4-trifluorometilfenilo; um grupo mono ou dicarboxifenilo ou (carboxi protegido)fenilo tal como 2, 3 ou 4-carboxifenilo ou 2,4-di(carboxi protegido)fenilo; um mono ou di(hidroximetil)fenilo ou (hidroximetil protegido)fenilo tal como 2, 3 ou 4- (hidroximetil protegido)fenilo ou 3.4- di(hidroximetil)fenilo; um mono ou di(aminometil)fenilo ou (aminometilo protegido) fenilo tal como 2, 3 ou 4-(aminometil)fenilo ou 2,4-(aminometilo protegido)fenilo; ou um mono ou di(N-(metilsulfonilamino))fenilo tal como 2, 3 ou 4-(N-(metilsulfonilamino))fenilo. Igualmente, o termo "fenilo substituído" representa grupos fenilo dissubstituídos em que os substituintes são diferentes, por exemplo, 3-metil-4-hidroxifenilo, 3-cloro-4-hidroxifenilo, 2- metoxi-4-bromofenilo, 4-etil-2-hidroxifenilo, 3- hidroxi-4-nitrofenilo, 2-hidroxi-4-clorofenilo. 0 termo "(fenilo substituído) alquilo" significa um dos grupos fenilo substituídos acima ligados a um dos grupos alquilo acima descritos. Exemplos de incluem tais grupos como 2-fenilo-l-cloroetilo, 2-(4'-metoxifenil)etilo, (2',6'-dihidroxi fenil)n-hexilo, 2- (5'-ciano-3'-metoxifenil)n-pentilo, 3- (2',6'-dimetilfenil)n-propilo, 4-cloro-3-aminobenzilo, 6-(4'-metoxifenil)-3-carboxi(n-hexilo), 5-(4'-aminometilfenil)-3-(aminometil)n-pentilo, 5-fenil-3-oxo-n-pent-l-ilo, (4-hidroxinaft-2-il)metilo.
Conforme notado acima, o termo "aromático" ou "arilo" refere-se a anéis carbocíclicos de seis membros. Também como notado acima, o termo "heteroarilo" significa anéis de cinco membros ou de seis membros opcionalmente substituídos que têm 1 a 4 heteroátomos, tais como átomos de oxigénio, enxofre e/ou azoto, em particular azoto, seja isoladamente ou em conjunto com átomos de anel de enxofre ou oxigénio.
Além disso, os anéis acima de cinco membros ou seis membros opcionalmente substituídos podem ser opcionalmente fusionados com um sistema de anel de 5 membros ou 6 membros aromático. Por exemplo, os anéis podem ser opcionalmente fusionados a um sistema de anel de 5 membros ou 6 membros aromático tal como um sistema de piridina ou triazol, por exemplo, a um anel de benzeno.
Os seguintes sistemas de anel são exemplos dos radicais heterocíclicos (seja substituídos ou não substituídos= indicados pelo termo "heteroarilo": tienilo, furilo, pirrolilo, pirrolidinilo, imidazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, tiatriazolilo, oxatriazolilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, oxazinilo, triazinilo, tiadiazinilo tetrazolo, 1,5-[b]piridazinilo e purinilo, bem como derivados benzo-fusionados, por exemplo, benzoxazolilo, benztiazolilo, benzimidazolilo e indolilo.
Substituintes para os anéis de heteroarilo acima opcionalmente substituídos são desde um a três halo, trihalometilo, amino, amino protegido, sais de amino, amino monossubstituído, amino dissubstituído, carboxi, carboxi protegido, sais de carboxilato, hidroxi, hidroxi protegido, sais de um grupo hidroxi, alcoxi inferior, alquiltio inferior, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, (cicloalquil)alquilo, cicloalquil(alquilo) substituído, fenilo, fenilo substituído, fenilalquilo, e (fenilo substituído)alquilo. Os substituintes para o grupo heteroarilo são conforme até aqui definidos, ou no caso de trihalometilo, podem ser trifluorometilo, triclorometilo, tribromometilo, ou triiodometilo. Conforme utilizado em conjunção com os substituintes acima para os anéis de heteroarilo, "alcoxi inferior" significa um grupo alcoxi Ci a C4, de forma semelhante, "alquiltio inferior" significa um grupo alquiltio Ci a C4, 0 termo "amino(monossubstituído)" refere-se a um grupo amino com um substituinte escolhido a partir do grupo que consiste em fenilo, fenilo substituído, alquilo, alquilo substituído, acilo Ci a C4, alquenilo C2-C7, alquenilo substituído C2 a C7, alquinilo C2 a C7, alquilarilo C7 a Ci6, alquilarilo substituído C7 a Ci6 e grupo heteroarilo. 0 amino (monossubstituído) pode adicionalmente ter um grupo protetor amino conforme englobado pelo termo "amino(monossubstituído) protegido". 0 termo "amino(dissubstituído) " refere-se a grupos amino com dois substituinte escolhido a partir do grupo que consiste em fenilo, fenilo substituído, alquilo, alquilo substituído, acilo Ci a C7, alquenilo C2-C7, alquinilo C2 a C7, alquilarilo C7 a Ci6, alquilarilo substituído C7 a Ci6 e heteroarilo. Os dois substituintes podem ser os mesmos ou diferentes. 0 termo "heteroaril(alquilo) " indica um grupo alquilo conforme definido acima, substutuído em qualquer posição por um grupo heteroarilo, conforme definido acima. "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento circunstância, caracteristica, ou elemento descrito subsequentemente pode, mas não tem de, ocorrer, e que a descrição inclui casos onde o evento ou circunstância ocorre e casos em que não. Por exemplo, "grupo heterociclo opcionalmente mono ou dissubstituido com grupo alquilo" significa que o alquilo pode, mas não tem de, estar presente, e a descrição inclui situações onde o grupo heterociclo é mono ou dissubst ituido com um grupo alquilo e situações onde o grupo heterociclo não é substituído com um grupo alquilo.
Compostos que têm a mesma forma molecular mas diferem na natureza ou sequência de união dos seus átomos ou da disposição dos seus átomos no espaço são designados "isómeros". Isómeros que diferem na disposição dos seus átomos no espaço são chamados "estereoisómeros". Estereoisómeros que não são imagens especulares entre si são chamados "diastereómeros" e aqueles que são imagens especulares não sobreponíveis um do outro são chamados "enantiómeros". Quando um composto tem um centro assimétrico, por exemplo, está ligado a quatro grupos diferentes, um par de enantiómeros é possível. Um enantiómero pode ser caracterizado por uma configuração absoluta do seu centro assimétrico e é descrito por regras de sequenciação R e S de Cahn e Prelog, ou pela forma na qual a molécula gira no plano de luz polarizada e designada como dextrorotatória ou levorotatória (ou seja, como isómeros (+) ou (-) respetivamente). Um composto quiral pode existir como um enatiómero individual ou uma mistura do mesmo. Uma mistura contendo proporções iguais dos enantiómeros é designada uma "mistura racémica".
Os compostos da presente invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos; tais compostos podem, portanto, ser produzidos como estereoisómeros (R) ou (S) individuais ou como misturas dos mesmos. A menos que seja indicado de outro modo, a descrição ou designação de um composto particular na memória descritiva e reivindicações destina-se a incluir ambos enantiómeros individuais e misturas, racémicas ou outras, do mesmo. Os métodos para a determinação da estereoquímica e separação de esteroisómeros é bem conhecida na técnica (veja-se, por exemplo, a discussão no Capitulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4a edição J. March, John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1992).
Onde um intervalo de valores é proporcionado, entende-se que cada valor interveniente, até à décima da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente indique o contrário, entre o limite superior e inferior desse limite e qualquer outro valor indicado ou interveniente nesse intervalo indicado, está englobado na presente invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos mais pequenos podem, independentemente, ser incluídos nos limites mais pequenos, e estão também englobados na presente invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, intervalos que excluam um ou ambos daqueles limites incluídos estão também incluídos na invenção. A não ser que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um perito na especialidade à qual esta invenção pertence.
Deve ser indicado que, conforme utilizado no presente documento, e nas reivindicações anexas, as formas singulares "uma/um" e "o/a" incluem os respetivos plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um cicloalcino modificado" inclui uma pluralidade de tais cicloalcinos modificados e a referência à "molécula alvo" inclui referência a uma ou mais moléculas alvo e equivalentes das mesmas conhecidas pelos peritos na especialidade, e assim por diante. É adicionalmente indicado que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta afirmação
destina-se a servir como base antecedente para utilização de tal terminologia exclusiva como "unicamente", "apenas" e semelhante em conexão com a recitação dos elementos das reivindicações, ou utilização de uma limitação "negativa". DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta uma reação de cicloadição [3+2] promovida pela tensão gue pode ser levada a cabo sob condições fisiológicas. Em geral, a invenção envolve reagir um cicloalcino modificado com uma fração de azida numa biomolécula, gerando uma biomolécula covalentemente modificada. A seletividade da reação e a sua compatibilidade com ambientes aquosos proporcionam a sua aplicação in vivo (por exemplo, na superfície celular ou intracelularmente) e in vitro (por exemplo, síntese de péptidos e outros polímeros, produção de aminoácidos modificados (por exemplo, marcados). A reação é compatível com a modificação de células vivas. A invenção proporciona métodos e composições para específica e eficientemente modificar sinteticamente componentes celulares num ambiente aguoso, proporcionando assim a modificação de tais componentes celulares sobre, ou em células vivas. A invenção utiliza parceitos reativos gue são completamente abióticos e guimicamente ortogonais em relação a componentes celulares nativos, proporcionando assim uma seletividade extrema da reação. Além disso, a reação pode ser levada a cabo sob condições fisiológicas, por exemplo, um pH de cerca de 7 dentro de um ambiente aguoso, e cerca de 37 °C. A invenção está baseada, em parte, na descoberta de um meio para levar a cabo uma reação de Huisgen modificada gue pode ser levada a cabo num ambiente fisiológico, aguoso. Uma vez que a reação da invenção é altamente seletiva e funciona em solventes aquosos, a reação pode ser utilizada numa variedade de aplicações ambas in vitro e in vivo. A reação é conseguida através da utilização de uma primeira molécula que compreende uma fração de cicloalcino em tensão, e uma segunda molécula que compreende uma fração de azida. A fração de azida na segunda molécula reage, na ausência de um catalisador, com a fração de cicloalcino em tensão na primeira molécula, formando um produto conjugado final que compreende um anel de azida/cicloalcino fusionado. A primeira molécula que compreende a fração de cicloalcino em tensão podem compreender adicionalmente uma fração que permite reações subsequentes e/ou que proporciona a marcação detetável do produto da reação final. A reação prossegue sem a necessidade de um catalisador. Em vez disso, a energia de ativação para a reação é proporcionada por um grupo azida e o grupo cicloalcino em tensão. A invenção tira partido da enorme deformação do ângulo de ligação do grupo acetileno na fração de cicloalcino, que proporciona a tensão do anel. Por exemplo, a deformação do ângulo de ligação do grupo acetileno de ciclooctina para 163° é responsável por quase 18 kcal/mol da tensão do anel. Esta destabilização do estado fundamental em relação ao estado de transição da reação proporciona uma taxa de aceleração dramática comparada com alcinos sem tensão.
COMPOSTOS DE CICLOALCINO MODIFICADOS A presente invenção proporciona compostos de cicloalcino modificados; e composições que compreendem os compostos. 0 composto da invenção é estabelecido na reivindicação 1.
Rié selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro. Nalgumas formas de realização, Ri é um grupo alifático substituído ou não substituído, por exemplo, um alquilo substituído ou não substituído; um alquenilo substituído ou não substituído; ou um alquinilo substituído ou não substituído. Nalgumas formas de realização, Ri é um fenilo substituído ou não substituído.
Nalgumas formas de realização, Y é um grupo reativo selecionado a partir de um carboxilo, uma gamina, um éster, um tioéster, um haleto de sulfonilo, um álcool, um tiol, um éster de succinimidilo, um isotiocianato, uma iodoacetamida, uma maleimida, e uma hidrazina.
Nalgumas formas de realização, Y é uma molécula de interesse, selecionada a partir de um marcado detetável; uma toxina (incluindo citotoxinas); um ligante; a partir de um péptido; um fármaco; um membro de um par de ligação específico; uma etiqueta de epitopo. Onde Y é uma molécula de interesse que não um ligante, a molécula de interesse está ligada diretamente a Ri, ou está ligada através de um ligante. 0 composto da invenção compreende um cicloalcino em tensão, por exemplo, o cicloalcino aumenta a taxa de reação desde cerca de 2 vezes até cerca de 1000 vezes, por exemplo, o cicloalcino aumenta a taxa de reação em pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, em comparação com a taxa de reação entre uma azida e um alcino linear tendo o mesmo número de átomos de carbono que o cicloalcino. O cicloalcino é um anel de 8 membros. A tensão sobre o cicloalcino pode ser aumentada através de uma série de formas, por exemplo, através da utilização de heteroátomos; o grau de insaturação, ou tensão torsional; utilização de grupos de remoção de eletrões, etc. Em algumas formas de realização de interesse particular, o cicloalcino é uma ciclooctina. Em algumas formas de realização, o cicloalcino em tensão é um composto no qual um ou mais dos átomos de carbono no anel de cicloalcino, além dos dois átmos de carbono unidos por uma ligação tripla, são substituídos com um ou mais grupos de remoção de eletrões, por exemplo, um halo (bromo, cloro, flúor, iodo), um grupo nitro, um grupo ciano, ou um grupo sulfona. Onde o grupo de remoção de eletrões é um grupo nitro, um grupo ciano, ou um grupo sulfona, o grupo de remoção de eletrões não está diretamente ligado ao anel de cicloalcino.
Nalgumas formas de realização, um cicloalcino modificado em causa é de Fórmula I: onde:
Y é H; uma fração que compreende um grupo reativo que facilita a ligação covalente de uma molécula de interesse conforme definido acima; ou uma molécula de interesse conforme de definido acima; e
Ri é selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro. Ri pode estar em qualquer posição no grupo ciclooctina que não seja nos dois átomos de carbono unidos pela ligação tripla.
Nalgumas formas de realização, um cicloalcino modificado em causa é de Fórmula III: onde:
Y é H; uma fração que compreende um grupo reativo que facilita a ligação covalente de uma molécula de interesse conforme definido acima; ou uma molécula de interesse conforme de definido acima; e
Ri é selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro. Ri pode estar em qualquer posição no grupo ciclooctina que não seja nos dois átomos de carbono ligados pela ligação tripla.
Nalgumas formas de realização, um cicloalcino modificado em causa é de Fórmula IV: onde:
Y é H; uma fração que compreende um grupo reativo que facilita a ligação covalente de uma molécula de interesse conforme definido acima; ou uma molécula de interesse conforme de definido acima; e
Ri é selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro. Ri pode estar em qualquer posição no grupo ciclooctina que não seja nos dois átomos de carbono ligados pela ligação tripla.
Exemplos exemplares de um composto de ciclooctina halogenada em causa incluem: e
Moléculas de interesse
Nalgumas formas de realização, Y é uma molécula de interesse selecionada a partir de um marcador detetável; uma toxina (incluindo citotoxinas); um ligante; um péptido; um fármaco; um membro de um par de ligação especifico; uma etiqueta de epitopo. Onde Y é uma molécula de interesse que não um ligante, a molécula de interesse está ligada diretamente a Ri, ou está ligada através de um ligante.
Quando Y é uma molécula de interesse, o cicloalcino modificado compreende uma molécula desejada para distribuição e conjugação com o substrato alvo azido (molécula alvo contendo azida), substrato alvo o qual pode ser exibido na superfície celular, pode residir dentro da membrana celular, ou pode ser intracelular. Moléculas que podem ser desejáveis para a distribuição incluem marcadores detetáveis (por exemplo, marcadores de spin, corantes do tipo de transferência de energia ressonante de fluorescência (FRET), por exemplo, para estudar a estrutura de biomoléculas in vivo), fármacos de pequenas moléculas, moléculas citotóxicas (por exemplo, fármacos), ligantes para ligação a um recetor alvo (por exemplo, para facilitar a ligação virai, ligação a uma proteína alvo presente num lipossoma, etc.), etiquetas para auxiliar na purificação através, por exemplo, de cromatografia de afinidade (por exemplo, ligação a um epitopo FLAG) , e moléculas para facilitar a ligação seletiva do polipéptido a uma superfície. Exemplos específicos são proporcionados abaixo. Marcadores detetáveis
As composições e métodos da invenção podem ser utilizados para distribuir um marcador detetável a uma molécula alvo tendo uma azida. Assim, nalgumas formas de realização, um cicloalcino modificado em causa compreende um marcador detetável, ligado covalentemente ao cicloalcino modificado seja diretamente ou através de um ligante.
Marcadores detetáveis exemplares incluem moléculas fluorescentes (por exemplo, moléculas autofluorescentes, moléculas que emitem fluorescência após o contacto com um reagente, etc.), marcadores radioativos (por exemplo, 111In, 1251, 1311, 212 B, 90Y, 186Rh) ; biotina (por exemplo, para ser detetada através da reação de biotina e avidina); etiquetas fluorescentes; reagentes de produção de imagem (por exemplo, aqueles descritos no documento de patente U.S. N.° 4.741.900 e documento de Patente U.S. N° . 5.326.856) . Os marcadores detetáveis também incluem péptidos ou polipéptidos que podem ser detetados através da ligação de anticorpos, por exemplo, através da ligação de um anticorpo marcado de forma detetável ou através da deteção de anticorpo ligado através de um ensaio do tipo sandwich. Também são adequados para utilização pontos quânticos (por exemplo, nanocristais semicondutores marcados de forma detetável, tais como pontos quânticos marcados com fluorescência, pontos quânticos conjugados com anticorpo). Veja-se, por exemplo, Dubertret et al. 2002 Science 298:759-1762; Chan et al. (1998) Science 2 81:2016-2018; documento de Patente U.S. N° 6.855.551; Bruchez et al. (1998) Science 281:2013-2016
Moléculas fluorescentes adequadas (fluoróforos) incluem fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, ésteres de succinimidilo ou carboxifluoresceina, ésteres de succinimidilo ou fluoresceina, 5-isómero de diclorotriazina de fluoresceina, carboxi-fluoresceina-alanina-carboxamida encerrada, Oregon Green 488, Oregon Green 514; Lucifer Yellow, Laranja acridina, rodamina, tetrametilrodamina, Texas Red, iodeto de propidio, JC-1 (5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazoil carbocianina, iodeto), tetrabromorodamina 123, rodamina 6G, TMRM (éster de metilo de tetrametilrodamina), TMRE (éster de etilo de tetrametilrodamina), tetrametilrosamina, rodamina B e 4-dimetilaminotetrametilrosamina, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde com desvio azul, proteína fluorescente verde com desvio ciano, proteína fluorescente verde com desvio vermelho, proteína fluorescente verde com desvio amarelo, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'dissulfónico; acridina e derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-l-sulfónico (EDANS); dissulfonato de amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5; N—(4—anilino—1—naftil)maleimida; antranilamida; ácido 4,4-difluoro-5-(2-tienil)-4-bora-3a, 4a diaza-5-indaceno-3-propiónico BODIPY; cascade blue;
Brilliant Yellow; cumarina e derivados: cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120),7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151); corantes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5', 5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Bromopyrogallol
Red) ; 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilenotriaamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2-, 2' -dissulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatostilbeno-2-,2'-dissulfónico; cloreto de (dimetilamino)naftaleno-l-sulfonilo (DNS, dansilcloreto); 4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina e derivados: eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina e derivados: eritrosina B, eritrosina, isotiocianato; etidio; fluoresceina e derivados: 5- carboxifluoresceina (FAM),5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceina (DTAF), 2' ,1' dimetoxi-4' S'-dicloro-G-carboxifluoresceina (JOE) , fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, QFITC, (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de Verde
Malaquite; 4-metilumbeli-feroneorto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados: pireno, pireno butirato, succinimidil 1-pireno; pontos quânticos de butirato; Reactive Red 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B- A) rodamina e derivados: 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6- carboxirodamina (R6G), lissamina rodamina B cloreto de sulfonilo rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonilo de sulforodamina 101 (Texas Red); N,N,Ν',Ν'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido 5-(2'-aminoetil) aminonaftaleno-l-sulfónico (EDANS), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), ácido rosólico; Orange 560 CAL Fluor; derivados de quelato de térbio;
Cy 3; Cy 5; Cy 5,5; Cy 7; IRD 700; IRD 800; La Jolla Blue; ftalo cianina; e naftalo cianina, coumarinas e corantes relacionados, corantes de xanteno tais como rodóis, resorufinas, bimanos, acridinas, isoindóis, corantes de dansilo, hidrazidas aminoftálicas tais como luminol, e derivados de isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas, dicianohidroquinonas, e európio fluorescente e complexos de térbio; e semelhantes. Fluoróforos de interesse são adicionalmente descritos nos documentos WO 01/42505 e WO 01/86001.
Proteínas fluorescentes e proteínas cromogénicas adequadas incluem uma proteína fluorescente verde (GFP), incluindo uma GFP derivada a partir de Aequoria victoria ou um derivado da mesma, por exemplo, um derivado "humanizado" tal como GFP melhorada, que está disponível comercialmente, por exemplo, a partir de Clontech, Inc.; uma GFP de outra espécie tal como Renilla reniformis, Renilla mulleri, ou Ptilosarcusguernyi, conforme descrito em, por exemplo, WO 99/49019 e Peelle et ai. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519; GFP recombinante "humanizada" (hrGFP) (Stratagene); qualquer de uma variedade de proteínas coloridas e fluorescentes de espécies de antozoários, conforme descrito em, por exemplo, Matz et ai. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973.
Etiquetas de epítopo adequadas incluem hemaglutinina (HA; por exemplo, CYPYDVPDYA; SEQ ID NO:1), FLAG (por exemplo, DYKDDDDK; SEQ ID NO:2), FLAG-C (por exemplo, DYKDDDDKC; SEQ ID NO:3, c-myc (por exemplo, CEQKLISEEDL; SEQ ID NO:4), uma etiqueta de afinidade de iões metálicos tal como uma etiqueta de polihistidina (por exemplo, Hise) .
Agentes de produção de imagem adequados incluem agentes de contraste positivo e agentes de contraste negativo. Agentes de contraste positivo incluem gadolínio ácido tetraazaciclododecanotetraacético (Gd-DOTA); gadolínio-ácido dietilenotriaminopentacético (Gd-DTPA); Gadolínio-1,4,7-tris(carbonilmetil)-10-(2'-hidroxipropil)- 1,4,7,1O-tetraazociclododecano (Gd- HP-D03A); manganês (11)-difosfato de piridoxal (Mn-DPDP); Gd-dietilenotriaminopentacetato-bis(metilamida) (Gd-DTPA-BMA). Agentes de contraste negativo incluem um agente de produção de imagem de óxido de ferro superparamagnético (SPIO); e um perfluorocarbono, quando adequado, os perfluorocarbonos incluem fluroheptanos, fluorocicloheptanos, fluorometilcicloheptanos, fluorohexanos, fluorociclohexanos, fluoroheptanos, fluorocicloheptanos, fluorometilciclopentanos, fluorodimetilciclopentanos, fluorometilciclobutanos, fluorodimetilciclobutanos, fluorotrimetilciclobutanos, fluorobutanos, fluorociclobutanos, fluoropropanos, fluoroéteres, fluoropoliéteres, fluorotrietilaminas, perfluorohexanos, perfluoropentanos, perfluorobutanos, perfluoropropanos, hexafluoreto de enxofre.
Parceiros de ligação específicos
Noutra forma de realização, um cicloalcino modificado em causa compreende um membro de um par de parceiros de ligação. Um membro de um par de parceiros de ligação é referido no presente documento como um "parceiro de ligação específico".
Parceiros de ligação específicos adequados incluem um membro de um par de recetor/ligando; um membro de um par de anticorpo/antigénio; um membro de um par de lectina/hidrato de carbono; um membro de um par de enzima/substrato; biotina/avidina; biotina/estreptavidina; digoxina/antidigoxina. Parceiros de ligação específicos adequados incluem um ligando recetor; um recetor para um ligando; uma porção de recetor de ligação a ligando; um anticorpo; um fragmento de ligação a antigénio de um anticorpo; um antigénio; um hapteno; uma lectina; um hidrato de carbono de ligação a lectina; um substrato enzimático; um inibidor irreversível de uma enzima (por exemplo, um inibidor irreversível que se liga a um local de ligação de substrato de uma enzima, por exemplo, um substrato "suicida").
Membros de ligando adequados de pares de recetor/ligando incluem neurotransmissores tais como compostos opioides, acetilcolina; proteínas virais que se ligam a um recetor da superfície celular, por exemplo, gpl20 do vírus da imunodeficiência humana; hormonas.
Fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio adequados incluem os fragmentos F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, e Fd, anticorpos de cadeia simples, e proteínas de fusão que compreendem uma porção de ligação a antigénio de um anticorpo e uma proteína não anticorpo (por exemplo, um fragmento de ligação a antigénio de um anticorpo fusionado com uma região constante de uma imunoglobulina).
Haptenos adequados incluem (4-hidroxi-3-nitrofenil) acetil; ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou um dos seus complexos metálicos; paranitrofenilo; biotina; isotiocianato de fluoresceína. Fármacos Fármacos adequados que podem ser ligados a uma fração de cicloalcino modificada incluem compostos citotóxicos (por exemplo, compostos quimioterapêuticos contra o cancro); compostos antivirais; modificadores de resposta biológica (por exemplo, hormonas, quimiocinas, citocinas, interleucinas, etc.); agentes que afetam os microtúbulos; moduladores hormonais; compostos esteroides.
Compostos quimioterapêuticos contra o cancro incluem compostos não peptídicos (ou seja, não proteicos) que reduzem a proliferação de células cancerosas; compostos peptídicos que reduzem a proliferação de células cancerosas; agentes antimetabolito; agentes citotóxicos; e agentes citostáticos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, nitrosureias, antimetabolitos, antibióticos antitumorais, alcaloides vegetais (vinca) , e hormonas esteroides.
Agentes adequados que atuam para reduzir a proliferação celular incluem agentes alquilantes, tais como mostardas de azoto, nitrosureias, derivados de etilamina, sulfonatos de alquilo, e triazenos, incluindo, mas não limitados a, mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan™), melfalan (L-sarcolisina), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil- CCNU), estreptozocina, clorozotocina, mostarda de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucilo, pipobroman, trietilenamina, trietilenotiofosforamina, bussulfan, dacarbazina, e temozolomida.
Agentes antimetabolito adequados incluem análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, e inibidores de adenosina deaminase, incluindo citarabina (CYTOSAR-U), citosina arabinósido, fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR), tioguanina, 6-mercaptopurina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato, 10-propargil-5,8-dideazafolato (PDDF, CB3717), ácido 5, 8-dideazatetrahidrofólico (DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, e gencitabina.
Produtos naturais antiproliferativos adequados e os seus derivados, (por exemplo, alcaloides da vinca, antibióticos antitumorais, enzimas, linfocinas, e epipodofilotoxinas), incluem Ara-C, paclitaxel (Taxol®) , docetaxel (Taxotere®) , desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginase, azatioprina; brequinar; alcaloides, por exemplo vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por exemplo etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por exemplo antraciclina, cloreto de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina) , idarrubicina, doxorrubicina, epirrubicina e derivados de morfolino, etc.; bisciclopéptidos de fenoxizona, por exemplo dactinomicina; glicopéptidos básicos, por exemplo bleomicina; glicósidos de antraquinona, por exemplo plicamicina (mitramicina); antracenedionas, por exemplo mitoxantrona; indoledionas de azirinopirrolo, por exemplo, mitomicina; imunossupressores macrociclicos, por exemplo, ciclosporina, FK-506 (tacrólimo, prograf), rapamicina.
Outros agentes citotóxicos antiproliferativos adequados são navelbeno, CPT-11, anastrozol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, isofosfamida, e droloxafina.
Agentes que afetam os microtúbulos adequados que possuem atividade antiproliferativa incluem alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados da colchicina (por exemplo, NSC 33410), dolstatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®), derivados de Taxol®, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina (NSC 361792), tritil cisteina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, epotilonas naturais e sintéticas incluindo, epotilona A, epotilona B, discodermolida, estramustina, nocodazol.
Moduladores hormonais e esteroides adequados (incluindo análogos sintéticos) incluem adrenocorticoesteroides, por exemplo, prednisona, dexametasona, etc.; estrogénios e pregestinas, por exemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxifeno; etc.; e supressores adrenocortiçais, por exemplo, aminoglutetimida, 17a-etinilestradiol; dietilstilbestrol, testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostalonona, testolactona, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprólido, Flutamida (Drogenil), Toremifeno (Fareston), e Zoladex®. Os estrogénios estimulam a proliferação e diferenciação, portanto, compostos que se ligam ao recetor de estrogénio são utilizados para bloquear esta atividade. Os corticoesteroides podem inibir a proliferação de células T.
Outros agentes quimioterapêuticos adequados incluem complexos metálicos, por exemplo cisplatina (cis-DDP), carboplatina; ureias, por exemplo hidroxiureia; e hidrazinas, por exemplo, N-metilhidrazina; epidofilotoxina; um inibidor da topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur; etc.. Outros agentes antiproliferativos de interesse incluem imunossupressores, por exemplo ácido micofenólico, talidoinida, desoxispergualina, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirano (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil )propoxi)quinazolina).
Os taxanos também são úteis para a ligação a uma fração de cicloalcino. "Taxanos" incluem paclitaxel, bem como qualquer derivado de taxano ativo ou profármaco. "Paclitaxel" (que deve ser entendido no presente documento como incluindo análogos, formulações, e derivados tais como, por exemplo, docetaxel, TAXOL™, TAXOTERE™ (uma formulação de docetaxel), análogos de paclitaxel de 10-desacetilo e análogos de paclitaxel de 3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonilo) podem ser prontamente preparados utilizando técnicas conhecidas para aqueles peritos na especialidade (veja-se também o documento WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; os documento de Patente U.S. N.°s 5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; e EP 590.267), ou obtidos a partir de uma variedade de origens comerciais, incluindo por exemplo, Sigma Chemical Co. , St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia; ou T-1912 de Taxus yannanensis). O paclitaxel deve ser entendido como referindo-se não apenas à forma comum comercialmente disponível de paclitaxel, mas também análogos e derivados (por exemplo, Taxotere™ docetaxel, conforme indicado acima) e conjugados de paclitaxel (por exemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano, ou paclitaxel-xilose).
Também está incluída dentro do termo "taxano" uma variedade de derivados conhecidos, incluindo derivados hidrofílicos, e derivados hidrofóbicos. Derivados de taxano incluem derivados de galactose e manose descritos no Pedido de Patente Internacional N.° WO 99/18113; piperazino e outros derivados descritos no documento WO 99/14209; derivados de taxano descritos no documento WO 99/09021, WO 98/22451, e documento de Patente U.S. 5.869.680; derivados de 6-tio descritos no documento WO 98/28288; derivados de sulfenamida descritos no documento de Patente U.S. 5.821.263; e derivado de taxol descrito no documento de Patente U.S. 5.415.869. Ele inclui adicionalmente profármacos de paclitaxel incluindo aqueles descritos nos documentos WO 98/58927; WO 98/13059; e documento de Patente U.S. N.° 5.824.701.
Modificadores da resposta biológica que são adequados para a ligação a uma fração de cicloalcino incluem (1) inibidores da atividade da tirosina cinase (RTK); (2) inibidores da atividade de serina/treonina cinase; (3) agonistas de antigénios associados a tumores, tais como anticorpos que se ligam especificamente a um antigénio tumoral; (4) agonistas dos recetores da apoptose; (5) interleucina-2; (6) IFN-a; (7) IFN-γ (8) fatores de estimulação de colónias; e (9) inibidores da angiogénese. Ligantes
Ligantes adequados incluem um ácido carboxilico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, um nitro, e um ligante peptídico.
Ligantes peptídicos exemplares para utilização na ligação de uma molécula de interesse com um cicloalcino modificado irão, em algumas formas de realização, ter uma combinação de resíduos de glicina, alanina, prolina e metionina, onde os ligantes peptídicos adequados incluem, mas não estão limitados a AAAGGM (SEQ ID NO:5); AAAGGMPPAAAGGM (SEQ ID NO:6); AAAGGM (SEQ ID NO:7); e PPAAAGGMM (SEQ ID NO:8). Qualquer ligante flexível, geralmente tendo um comprimento desde cerca de 6 aminoácidos e cerca de 40 aminoácidos é adequado para utilização. Os ligantes podem ter virtualmente qualquer sequência que resulta num péptido geralmente flexível, incluindo sequências ricas em alanina-prolina.
Composições A presente invenção proporciona adicionalmente composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem um composto de cicloalcino modificado em causa. Uma composição em causa geralmente compreende um composto de cicloalcino modificado em causa; e pelo menos um composto adicional. Compostos adicionais adequados incluem, mas não são limitados a: um sal, tal como um sal de magnésio, um sal de sódio, etc., por exemplo, NaCl, MgCl, KC1, MgS04, etc.; um agente de tamponamento, por exemplo, um tampão Tris, N-(2-Hidroxietil)piperazin-N'-(ácido 2-butanossulfónico) (HEPBS), ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (MES), sal de sódio de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (MOPS), ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanossulfónico (TAPS), etc.; um agente solubilizante; um detergente, por exemplo, um detergente não iónico como Tween-20, etc.; um inibidor de protease.
Nalgumas formas de realização, uma composição em causa compreende um composto de cicloalcino modificado em causa; e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma ampla variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e não necessitam de ser discutidos em detalhe no presente documento. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis foram amplamente descritos numa variedade de publicações, incluindo, por exemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20a edição, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7a ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3a ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, portadores ou diluentes, estão prontamente disponíveis ao público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ajuste do pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizantes, agentes humectantes, estão prontamente disponíveis ao público.
MÉTODOS DE MODIFICAÇÃO DE UMA BIOMOLÉCULA ALVO A presente invenção proporciona métodos in vitro para a modificação quimiosseletiva de uma molécula alvo compreendendo uma azida. Os métodos geralmente envolvem reagir uma azida numa molécula alvo contendo azida com um cicloalcino modificado. 0 cicloalcino modificado tem uma estrutura conforme descrita acima. Assim, em muitas formas de realização, um método em causa para a modificação sintética de um componente celular geralmente envolve: a) introduzir uma fração de azida num componente celular, gerando assim um componente celular modificado com azida; e contactar a célula que compreende o componente celular modificado com azida com um parceiro reativo que compreende um cicloalcino modificado, o contacto sendo sob condições fisiológicas. A etapa de contacto resulta na reação entre o grupo azida do componente celular modificado com azida e o cicloalcino do parceiro reativo, modificando, assim, sintética e covalentemente o componente celular. Nalgumas formas de realização, o método é levado a cabo em células vivas in vitro. Noutras formas de realização, o método é levado a cabo em células vivas ex vivo.
Numa forma de realização, a ligação quimiosseletiva é designada para utilização em condições fisiológicas completamente aquosas e envolve a produção de um produto final estável que compreende um anel de azida/cicloalcino fusionado. Em geral, esta forma de realização envolve a reação do primeiro reagente que compreende uma fração de cicloalcino em tensão com um segundo reagente que compreende uma azida, de modo que uma ligação covalente é formada entre o primeiro e o segundo reagente através da reação da fração de cicloalcino em tensão com o grupo azida.
Primeiro reagente
Um primeiro reagente compreende uma fração de cicloalcino em tensão, conforme descrito no presente documento, que proporciona a energia para a reação entre o primeiro e segundo reagentes. 0 primeiro reagente é um composto de cicloalcino modificado conforme estabelecido na reivindicação 15. Y é uma molécula de interesse conforme descrito abaixo;
Rié selecionado a partir de um ácido carboxilico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro. Nalgumas formas de realização, o primeiro reagente é um composto de cicloalcino modificado de qualquer das Fórmulas I-IV, conforme descrito anteriormente. A molécula de interesse pode ser submetida a reação diretamente com o grupo reativo ou através de um ligante. As moléculas de interesse são um marcador detetável, um fármaco, um péptido, um membro de um par de ligação específico. Tais moléculas de interesse são descritas em maior detalhe acima.
Nalgumas formas de realização, o cicloalcino modificado é de Fórmula I:
onde Y e Ri são como definidos acima.
Noutras formas de realização, o cicloalcino modificado é de qualquer das Fórmulas II-IV, acima.
Segundo reagente 0 segundo reagente é um composto que compreende uma azida de modo que uma ligação covalente é formada entre o primeiro e o segundo reagente através da reação da fração de cicloalcino com o grupo azida. Em geral, o segundo reagente é da fórmula: R2-N3 onde R2 é uma molécula alvo, por exemplo, uma biomolécula ou outra molécula alvo.
Moléculas alvo
Moléculas que compreendem uma azida e adequadas para utilização na presente invenção, bem como métodos para produção de moléculas compreendendo azida adequados para utilização na presente invenção, são bem conhecidos na técnica. Moléculas alvo de interesse particular como o segundo reagente incluem aminoácidos e resíduos de aminoácidos, polipéptidos (incluindo péptidos e proteínas) , açúcares ou resíduos de açúcar, que contêm ou são modificados para conter pelo menos uma azida.
As moléculas alvo podem ocorrer naturalmente, ou podem ser produzidas sintática ou recombinantemente, e podem ser isoladas, substancialmente purificadas, ou presentes dentro de um meio nativo da molécula não modificada sobre a qual a molécula alvo contendo azida se baseia (por exemplo, na superfície de uma célula ou dentro de uma célula, incluindo dentro de um animal hospedeiro, por exemplo, um animal mamífero, tal como um hospedeiro murino (por exemplo, rato, ratinho), hámster, canino, felino, bovino, suíno). Nalgumas formas de realização, a molécula alvo está presente in vitro numa reação livre de células. Noutras formas de realização, a molécula alvo está presente numa célula e/ou exibida na superfície de uma célula. Em muitas formas de realização de interesse, a molécula alvo encontra-se numa célula viva; na superfície de uma célula viva; num organismo vivo, por exemplo, num organismo multicelular vivo. Células vivas adequadas incluem células que são parte de um organismo multicelular vivo; células isoladas a partir de um organismo multicelular; linhas celulares imortalizadas.
Quando a molécula alvo é um polipéptido, o polipéptido pode estar composto de D-aminoácidos, L-aminoácidos, ou ambos, e pode ser adicionalmente modificado, seja naturalmente, sinteticamente, ou recombinantemente, para incluir outras frações. Por exemplo, o polipéptido alvo pode ser uma lipoproteína, uma glicoproteína, ou outra proteína assim modificada.
Em geral, a molécula alvo útil como o segundo reagente compreende pelo menos uma azida para reação com o cicloalcino modificado de acordo com a invenção, mas podem compreender 2 ou mais, 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais azidas. O número de azidas que podem estar presentes numa molécula alvo irá variar de acordo com a aplicação pretendida do produto final da reação, a naturaza da própria molécula alvo, e outras considerações que serão prontamente aparentes para os peritos na especialidade na prática da invenção são divulgadas no presente documento.
Conforme descrito no presente documento, o composto da invenção é útil na modificação de uma molécula alvo in vivo. Nesta forma de realização, o substrato alvo é modificado para compreender um grupo azida no ponto no qual a ligação ao reagente de cicloalcino modificado é desejada. Por exemplo, quando o substrato alvo é um polipéptido, o polipéptido é modificado para conter uma azida N-terminal. Quando o substrato alvo é uma glicoproteína, um resíduo de açúcar da glicoproteína pode ser modificado para conter uma azida. Uma molécula alvo que é não modificada com uma azida, mas que deve ser modificada com uma azida, é referida no presente documento como um "substrato alvo". Uma molécula alvo que é modificada com uma azida é referida no presente documento como "uma molécula alvo modificada com azida" ou "uma molécula alvo contendo azida".
Modificação com azida de uma molécula alvo O substrato alvo pode ser gerado in vitro e depois introduzido na célula utilizando qualquer de uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, microinjeção, distribuição mediada por lipossomas ou lipofectina, eletroporação, etc.), métodos os quais irão variar de acordo com a natureza do substrato a ser alvejado para modificação e pode ser pronta e apropriadamente selecionado pelo perito na especialidade. 0 substrato alvo final também pode ser gerado in vivo explorando a maquinaria biossintética natural da célula hospedeira. Por exemplo, a célula pode ser proporcionada com um derivado de azida biocompativel de um substrato para síntese da molécula alvo desejada, substrato o qual é processado pela célula para proporcionar um derivado de azida do substrato alvo final. Por exemplo, quando o substrato alvo é uma glicoproteína de superfície celular, a célula pode ser proporcionada com um derivado de azida de um resíduo de açúcar encontrado dentro da glicoproteína, que é subsequentemente processada pela célula através de processos biossintéticos naturais para produzir uma glicoproteína modificada tendo pelo menos uma fração de açúcar modificada compreendendo um grupo azida acessível. 0 substrato alvo também pode ser produzido in vivo utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, aminoácidos não naturais tendo azidas podem ser incorporados em polipéptidos recombinantes expressos em£, coli (veja-se, por exemplo, Kiick et ai. (2000) Tetrahedron 56:9487) . Tais polipéptidos produzidos de forma recombinante podem ser submetidos a reação seletivamente com um reagente de cicloalcino modificado de acordo com a invenção.
Num exemplo, um grupo azida é incorporado na molécula alvo proporcionando uma célula (por exemplo, uma célula eucariótica que glicosila biopolímeros tais como proteínas) com um bloco de construção sintético para o substrato alvo de biopolimero desejado. Por exemplo, a célula pode ser proporcionada com uma molécula de açúcar que compreende um grupo azida para proporcionar a incorporação do grupo azida numa glicoproteína. Nalgumas formas de realização, a glicoproteína é expressa na superfície celular. Alternativamente, o grupo azida pode ser incorporado num aminoácido, que é subsequentemente incorporado num péptido ou polipéptido sintetizado pela célula. Vários métodos estão disponíveis para a incorporação de blocos de construção não naturais em biopolímeros; não existe a necessidade de restrição a oligossacarídeos de superfície celular como moléculas alvo. Veja-se, por exemplo, vanHest et al. (1998) FEBS Lett. 428:68; e Nowak, et al. (1995) Science 268:439.
Numa forma de realização, a molécula alvo é uma molécula que contém hidratos de carbono (por exemplo, uma glicoproteína; um polissacarídeo; etc.), e um grupo azida é introduzido na molécula alvo utilizando um substrato sintético. Nalgumas formas de realização, o substrato sintético é um derivado de azida de um açúcar utilizado na produção de uma molécula glicosilada. Nalgumas formas de realização, o substrato sintético é um derivado de azida de um açúcar utilizado na produção de uma molécula de superfície celular, por exemplo, na via biossintética de glicoproteína. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser proporcionada com derivado de azida de ácido siálico sintético, que é incorporado na via para a síntese de ácido siálico, eventualmente resultando na incorporação do resíduo de açúcar sintético em glicoproteínas. Nalgumas formas de realização, a glicoproteína é expressa na superfície celular.
Num exemplo, o substrato sintético é um derivado de azido de manosamina da fórmula aeral:
onde n é desde 1 a 6, geralmente desde 1 a 4, mais normalmente 1 a 2, e Ri, R2, R3, e R4 são independentemente hidrogénio ou acetilo. Nalgumas formas de realização, o substrato é W-azidoacetilmanosamina (η = 1) ou um derivado acetilado do mesmo, ou N-azidopropanoilmanosamina (n=2) ou uma forma acetilada da mesma.
Noutra forma de realização, o substrato sintético é um derivado de açúcar azido de uma fórmula geral de, por exemplo:
qualquer uma das quais pode ser incorporada na via de biossintese do ácido siálico, e onde n é desde 1 a 6, geralmente desde 1 a 4, mais normalmente 1 a 2, e R2, R3, e R4 são independentemente hidrogénio ou acetilo.
Noutra forma de realização, o substrato sintético é um derivado de açúcar azido de uma fórmula geral de, por exemplo:
onde Ri, R2, R3, e R4 são independentemente hidrogénio ou acetilo, e onde o substrato sintético é incorporado nas vias biossintéticas que envolvem fucose.
Noutra forma de realização, o substrato sintético é um derivado de açúcar azido de uma fórmula geral de, por exemplo:
onde n é desde 1 a 6, geralmente desde 1 a 4, mais normalmente 1 a 2, e Ri, R2, R3, e R4 são independentemente hidrogénio ou acetilo, e o qual é incorporado nas vias biossintéticas que envolvem galactose.
Modificação da superfície celular
Nalgumas formas de realização, o composto da invenção para utilização em terapêutica ou diagnóstico é utilizado para modificar a superfície de uma célula. Assim, descreve-se no presente documento um método para modificar a superfície celular in vitro ou in vivo. 0 método envolve geralmente reagir um grupo azida numa molécula alvo que compreende um grupo azida com um cicloalcino modificado para proporcionar a ligação quimiosseletiva na superfície celular. Em muitas formas de realização, o método compreende modificar uma molécula alvo numa superfície celular com um grupo azida; e reagir o grupo azida na molécula alvo com um cicloalcino modificado. Por exemplo, conforme descrito anteriormente, um açúcar azido é proporcionado a uma célula viva, açúcar azido o qual é incorporado numa glicoproteína que é exibida na superfície celular.
Modificação de uma molécula alvo modificada com azida com marcadores detetáveis; fármacos, e outras moléculas
Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona a ligação de uma molécula de interesse, por exemplo, uma molécula funcional, a uma molécula alvo modificada com azida. Os métodos geralmente envolvem reagir uma molécula alvo modificada com azida com um cicloalcino modificado em causa, onde o cicloalcino modificado compreende uma molécula de interesse, conforme descrito anteriormente.
Conforme descrito anteriormente, as moléculas de interesse incluem um marcador detetável; uma toxina (incluindo citotoxinas); um ligante; um péptido; um fármaco; um membro de um par de ligação especifico; uma etiqueta de epítopo. Ligação de moléculas alvo a um suporte 0 cicloalcino modificado pode também compreender um ou mais ligantes de hidrocarboneto (por exemplo, um grupo alquilo ou derivado do mesmo tal como um éster de alquilo) conjugado com uma fração que proporciona a ligação ao substrato sólido (por exemplo, para facilitar ensaios), ou a uma fração que proporciona uma separação fácil (por exemplo, um hapteno reconhecido por um anticorpo ligado a uma esfera magnética) . Numa forma de realização, os métodos da invenção são utilizados para proporcionar a ligação de uma proteína (ou outra molécula que contém ou pode ser modificada para conter uma azida) a um chip numa orientação definida. Por exemplo, um polipéptido tendo uma azida num local selecionado (por exemplo, no terminal-N ou perto dele) pode ser gerado, e os métodos e composições da invenção utilizados para distribuir uma etiqueta ou outra fração à azida do polipéptido. A etiqueta ou outra fração pode depois ser utilizada como o local de ligação para fixação do polipéptido a um suporte (por exemplo, suporte sólido ou semissólido, particularmente um suporte sólido para utilização como um microchip em ensaios de alto rendimento).
Ligação de moléculas para distribuição a um local alvo 0 cicloalcino modificado irá, em algumas formas de realização, compreender um fármaco de molécula pequena, toxina, ou outra molécula para distribuição a uma célula. 0 fármaco de molécula pequena, toxina, ou outra molécula irá, em algumas formas de realização, proporcionar uma atividade farmacológica. 0 fármaco de molécula pequena, toxina; ou outra molécula irá, em algumas formas de realização, servir como um alvo para distribuição de outras moléculas. Fármacos de moléculas pequenas podem ser pequenos compostos orgânicos ou inorgânicos tendo uma massa molecular de mais do que 50 e menos do que cerca de 2.500 daltons . Fármacos de moléculas pequenas podem compreender grupos funcionais necessários para interação estrutural com proteínas, particularmente ligação de hidrogénio, e pode incluir pelo menos um grupo amina, carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, e pode conter pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os fármacos podem compreender estruturas de carbono cíclico ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Fármacos de moléculas pequenas também são encontrados entre biomoléculas incluindo péptidos, sacarídeos, ácidos gordos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações dos mesmos.
Noutra forma de realização, um cicloalcino modificado em causa compreende um de um par de parceiros de ligação (por exemplo, um ligando; uma porção de ligação a ligando de um recetor; um anticorpo; um fragmento de ligação a antigénio de um anticorpo; um antigénio; umhapteno; uma lectina; um hidrato de carbono de ligação a lectina; etc.). Por exemplo, o cicloalcino modificado pode compreender um polipéptido que serve como um recetor virai e, após ligação com uma proteína de envelope virai ou proteína de cápside virai, facilita a ligação do vírus à superfície celular na qual o cicloalcino modificado é exibido. Alternativamente, o cicloalcino modificado compreende um antigénio que está especificamente ligado por um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal), para facilitar a deteção e/ou separação de células hospedeiras que exibem o antigénio na superfície celular. Noutro exemplo, o cicloalcino modificado compreende uma porção de ligação a ligando de um recetor, ou uma porção de ligação a recetor de um ligando.
UTILIDADE
Compostos de cicloalcino modificados em causa, e métodos de modificação em causa, são úteis numa variedade de aplicações, incluindo aplicações de investigação e aplicações de diagnóstico.
Aplicações de investigação
Nalgumas formas de realização, compostos de cicloalcino modificados em causa, e métodos de modificação em causa, são úteis em aplicações de investigação. Aplicações de interesse incluem aplicações de investigação, por exemplo, exploração de características físicas e funcionais de um recetor; proteómica; metabolómica. As aplicações de investigação também incluem a descoberta de fármacos ou outras aplicações de rastreio. A proteómica tem o objetivo de detetar, identificar e quantificar proteínas para obter informações biologicamente relevantes. A metabolómica é a deteção, identificação, e quantificação de metabolitos e outras moléculas pequenas tais como lípidos e hidratos de carbono. Fiehn (2001) Comparative and Functional Genomics 2:155-168; e documento de Patente U.S. N. 0 6.873.914.
As aplicações de descoberta de fármacos incluem identificar agentes que inibem a viabilidade e/ou crescimento de células cancerosas. Assim, nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona métodos de identificação de um agente que inibe a viabilidade e/ou crescimento de células cancerosas. Os métodos envolvem, geralmente, a modificação de um componente da célula para compreender um primeiro parceiro reativo que compreende uma azida; o contacto da célula, na presença de um agente de teste; com um segundo parceito reativo que compreende um cicloalcino modificado, o contacto sendo sob condições fisiológicas; onde contacto resulta na reação entre o grupo azida do primeiro parceiro reativo e o cicloalcino do segundo parceiro reativo, modificando, assim, sintética e covalentemente o componente celular; e a determinação do efeito, se existir algum, do agente de teste no que diz respeito ao nível de modificação da célula com o segundo parceiro reativo.
Quando a célula cancerosa é uma que produz uma quantidade mais elevada de um hidrato de carbono do que uma célula normal (não cancerosa) do mesmo tipo celular, o método proporciona a identificação de um agente que reduz o crescrimento e/ou viabilidade da célula cancerosa.
Aplicações de diagnóstico e terapêuticas
Aplicações de interesse também incluem aplicações de diagnóstico, por exemplo, para deteção de cancro, onde um cicloalcino modificado em causa compreendendo um marcador detetável é utilizado para marcar uma molécula alvo modificada com azida, por exemplo, uma molécula alvo marcada com azida presente numa célula cancerosa. Aplicações de interesse também incluem aplicações terapêuticas, onde um fármaco ou outro agente terapêutico é distribuído a uma molécula alvo modificada com azida, utilizando um cicloalcino modificado em causa que compreende um fármaco ou outro agente terapêutico ligado de forma covalente.
Nalgumas formas de realização, a presente invenção é utilizada para produção de imagens in vivo, por exemplo, para determinar o estado metabólico ou outro de uma célula num organismo, por exemplo, um indivíduo. Como um exemplo, um método em causa pode ser aplicado à produção de imagens in vivo de células cancerosas num indivíduo (por exemplo, um mamífero, incluindo roedores, lagomorfos, felinos, caninos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, primatas não humanos, e seres humanos).
Uma aplicação exemplar de uma cicloadição de azida-alcino em causa é na deteção da alteração metabólica em células que ocorre à medida que alteram o seu fenótipo. Como um exemplo, os padrões de glicosilação alterados são uma marca do fenótipo do tumor, que consiste em ambas as sob e sobrexpressão de glicanos de ocorrência natural bem como a apresentação de glicanos normalmente restringidos à expressão durante o desenvolvimento embrionário. Exemplos de antigénios comuns associados com as células transformadas são sialil Lewis a, sialil Lewis x, sialil T, sialil Tn, e acid polissiálico (PSA) . Jorgensen et al. (1995) Cancer Res. 55, 1817-1819; Sell (1990) Hum. Pathology 21, 1003-1019; Taki et al. (1988) J. Biochem. 103, 998-1003; Gabius (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1267-1276; Feizi (1991) Trends Biochem. Sci. 16, 84-86; Taylor-Papadimitriou e Epenetos (1994) Trends Biotech. 12, 227-233; Hakomori e Zhang (1997) Chem. Biol. 4, 97-104; Dohi et al. (1994) Cancer 73, 1552. Estes antigénios partilham uma importante caracteristica - cada um deles contém ácido siálico terminal. PSA é um homopolimero de resíduos de ácido siálico até cerca de 50 unidades de comprimento. Níveis elevados de ácido siálico estão altamente correlacionados com o fenótipo transformado em muitos cancros, incluindo gástrico (Dohi et al. , (1994) Cancer 73, 1552; e Yamashita et al. (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87, 441-446), cólon (Yamashita et al. (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87, 441-446; Hanski et al. (1995) Cancer Res. 55, 928-933; Hanski et al. (1993) Cancer Res. 53, 4082-4088; Yang et al. (1994) Glycobiology 4, 873-884; Saitoh et al. (1992) J. Mol. Chem. 267, 5700-5711), pancreático (Sawada et al. (1994) Int. J. Cancer 57, 901-907), fígado (Sawada et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1425-1431), pulmão (Weibel et al. (1988) Cancer Res. 48, 4318-4323), próstata (Jorgensen et al. (1995) Cancer Res. 55, 1817-1819) , rim (Roth et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85, 2999-3000), e cancros da mama (Cho et al. (1994) Cancer Res. 54, 6302-6305) , bem como vários tipos de leucemia (Joshi et al. (1987) Cancer Res. 47, 3551-3557; Altevogt et al. (1983) Cancer Res. 43, 5138-5144; Okada et ai. (1994) Cancer 73, 1811-1816) . Uma forte correlação entre o nível de ácido siálico da superfície celular e potencial metastático também foi observada em vários tipos de tumores diferentes (Kakeji et al. (1995) Brit. J. Cancer 71, 191-195; Takano et al. (1994) Glycobiology 4, 665-674). A exibição coletiva de múltiplos antigénios sialilados numa única célula cancerosa pode ser responsável pelo facto de que muitos tipos de tumores diferentes partilham o fenótipo de elevado ácido siálico sem necessariamente expressar um complemento idêntico de antigénios (Roth et al. (1988) supra). Consequentemente, estratégias de diagnóstico ou terapêuticas que têm como alvo células na base dos níveis de ácido siálico possuem ampla aplicabilidade em muitos cancros.
A introdução e incorporação de açúcares azido não naturais (ManNAz, GalNAz) em animais vivos proporciona a deteção de alterações no estado metabólico. Através da ligação da etiqueta de epitopo adequada, a ciclooctina modificada marca estas células num organismo vivo, e consequentemente deteta alterações no estado metabólico. A deteção precoce de células tumorigénicas e subsequente intervenção reduz a gravidade e aumenta as taxas de sobrevivência para pacientes com cancro. EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são apresentados de modo a proporcionar aos peritos na especialidade com uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar a presente invenção. Foram feitos esforços para assegurar precisão com respeito aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais deveriam ser tomados em conta. A menos que seja indicado de outro modo, partes são partes em peso, massa molecular é massa molecular de massa média, temperatura está em graus Celsius, e a pressão é a atmosférica ou próxima. Abreviaturas padrão podem ser utilizadas, por exemplo, pb, par(es) de bases; kb, quilobase (s); pl, picolitro (s); s ou seg, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótido (s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal (mente); s.c., subcutânea (subcutaneamente).
Exemplo 1; Modificação de biomoléculas utilizando uma ciclooctina modificada MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os reagentes químicos foram comprados a partir de Aldrich e utilizados sem purificação adicional. Todos os solventes foram destilados sob uma atmosfera de N2. CH2CI2, tolueno, e piridina foram secos sobre Catb. Cromatografia de camada fina foi levada a cabo em placas de gel de sílica Analtech Uniplate®. Cromatografia flash foi realizada utilizando gel de malha de sílica de 230-400 Á Merck 60. Todos os espectros de RMN de 3Η e 13C foram adquiridos num Bruker AVB-400® ou DRX-500® conforme indicado. Os desvios químicos de 3Η são relatados como δ em referência ao solvente e as constantes de acoplamento (J) são relatadas em Hz. Os compostos 1 e 4 foram relatados anteriormente . Skattebol e Solomon (1973) Organic Syntheses 5/Coll. Volumes:306-310; e Wilbur et al. (1996) Bioconj. Chem. 7:689-702.
Meios RPMI 1640 e solução salina tamponada com fosfato foram comprados de Invitrogen Life Technologies. Soro bovino fetal (FCS) foi a partir de Hyclone. Avidina conjugada com FITC e albumina sérica bovina (BSA) foram compradas de Sigma, e anticorpo de ratinho anti-biotina conjugado com peroxidase (HRP-a-biotina) e anticorpo de burro anti-Ig humana conjugado com peroxidase (HRP-a-Ig) foram comprados de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. Géis de poliacrilamida a 4-15% de TrisHCl pré-fabricados, nitrocelulose, e Tween 20 (detergente não iónico) foram comprados de BioRad. Tampão de extração de Western blot Restore™ e substrato quimioluminescente potenciado foram obtidos de Pierce. Para experiências de marcação de células, um contador celular Coulter Z2 foi utilizado para determinar as densidades celulares. Os dados de citometria de fluxo foram adquiridos no citómetro de fluxo FACSCalibur de BD Biosciences equipado com um laser de árgon de 488-nm, e células vivas foram analisadas conforme determinado através da granularidade e tamanho. Para todas as experiências de citometria de fluxo, os pontos de dados foram recolhidos em triplicado. Síntese de Compostos:
Composto 2. AgClC>4 (1,16 g, 5,61 mmol) foi adicionado a uma solução de composto 1 (500 mg, 1,87 mmol) e 4-hidroximetilbenzoato de metilo (4,66 g, 28,1 mmol) dissolvido em tolueno (8 ml) num frasco envolvido em folha de alumínio e seco em chama. A reação foi agitada durante 2 h, diluída com pentano (20 ml), e filtrada para remover sais de prata insolúveis. A solução foi concentrada e purificada através de cromatografia em gel de sílica (4-8% de EtOAc: éter de petróleo; Rf (8% de EtOAc: éter de petróleo) = 0,32) para dar 2 como um óleo incolor (660 mg, 1,86 mmol, 99%) . RMN 1H (500 MHz, CDCls) δ 8,02 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,47 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 6,21-(dd, 1 H, J= 4,0, 11,5 Hz), 4,72 (d, 1 H, J= 12,5 Hz), 4,39 (d, 1 H, J = 12,5 Hz), 3,95-3,91 (m, 4 H), 2,81 (dq apar., 1 H, J = 5,5, 12,0), 2,32 (m, 1 H) , 2,05-1, 88 (m, 4 H) , 1,75 (m, 1 H), 1,49 (dq apar., 1 H, J = 5,0, 8,0), 1,35 (m, 1 H) , 0,79 (m, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CDC13) δ 166, 93, 143,20, 132,60, 132,09, 129,66, 129,34, 127,65, 84,22, 69,61, 52,04, 39,48, 36,46, 33, 31, 28,09, 26,29; IV (cm-1) 2931, 2856, 1724, 1614, 1434, 1279, 1109; FAB HRMS calc. para Ci7H2303Br [M+H] + 353,0752, encontrada 353,0744.
Composto 3. Uma suspensão de NaOMe (119 mg, 2,2 0 mmol) em DMSO anidro (8 ml) foi adicionada ao composto 2 (650 mg, 1,84 mmol) dissolvido em DMSO anidro (16 ml). A reação foi agitada 20 min e NaOMe adicional (110 mg, 1,10 mmol em 1,5 ml de DMSO) foi adicionado. A reação foi agitada até que o material de partida foi completamente consumido conforme determinado por TLC (20 min). A reação foi acidificada com HC1 a 1 M (100 ml) e extraída duas vezes com EtOAc (40 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (40 ml) e concentradas. A película resultante foi dissolvida em 20% tbO/dioxano (15 ml), LiOH (220 mg, 9,0 mmol) foi adicionado, e a reação foi agitada durante 24 h. A reação foi acidificada com HC1 a 1 M (100 ml) e extraída duas vezes com EtOAc (40 ml). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgS04, filtrados, e purificados através de cromatografia em gel de sílica (EtOAc: éter de petróleo: AcOH a 10:90:1 - EtOAc: éter de petróleo: AcOH a 25:75:1; Rf (25:75:1) = 0,38) para dar 3 (350 mg, 1,36 mmol, 74%) como um sólido branco. RMN ΤΗ (500 MHz, CDCI3) δ 8,09 (d, 1 H, J = 8,50 Hz), 7,47 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,77 (d, 1 H, J = 12,5 Hz) , 4,49 (d, 1 H, J = 13 Hz) , 4,26 (m, 1 H) , 2,32-2,26 (m, 1 H) , 2,22-2,13 (m, 2 H) , 2,08-2,03 (m, 1 H) , 1,97-1,92 (m, 1 H) , 1, 89-1,83 (m, 2 H) , 1,73-1, 62 (m, 2 H) 1,52-1, 44 (m, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CDCI3) δ 171,52, 144,50, 130,27, 128,29, 127,46, 100,69, 92,40, 72,11, 70,39, 42,31, 34,26, 29,68, 26,31, 20,70; IV (cm-1) 2924, 2852, 2672, 2561, 1685, 1429, 1323, 1294, 1086; FAB HRMS calc, para CieHisOsLi [M+Li] + 265,1416, encontrado 265,1422.
Composto 5. Trifluoroacetato de pentafluorofenilo (Pfp-TFA) (40 ml, 0,23 mmol) foi adicionado ao composto 3 em pirida anidra (1 ml) . A reação foi agitada durante 4 h, diluída com CH2CI2 (30 ml) , e extraída com HC1 a 1 M (3x20 ml) e solução saturada de NaHCCb (2 x 20 ml) . A camada orgânica foi seca sobre MgSCb, filtrada, e concentrada. O éster em bruto foi dissovido em CH2CI2 (2 ml) . Trietilamina (67 μΐ, 0,46 mmol) e composto 4 (104 mg, 0,23 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada durante 1 h. A solução foi concentrada e o produto bruto purificado através de cromatografia de gel de sílica (EtOAc:MeOH:H2O a 80:15:5, Rf = 0,40) para dar 5 (68 mg, 0,099 mmol, 51%) como um óleo transparente. RMN 3H (400 MHz, CD3CN) δ 7,80 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,42 (m, 3 Η), 6,62 (s 1, 1 Η), 5,51 (s, 1 Η), 5,19 (s, 1 Η), 4,66 (d, 1 H, J = 12,0 Hz), 4,45-4,40 (m, 2 H), 4,29-4,26 (m, 2 H), 3,62-3,56 (m, 8 H), 3, 52-3,49 (m, 2 H), 3,47-3,42 (m, 4 H), 3,22-3,13 (m, 3 H) , 2,91-2,87 (m, 2 H) , 2,66 (d, 1 H, J = 12,8 Hz), 2,32-2,19 (m, 6 H) , 1,8 9-1,79 (m, 4H), 1,75-1,34 (m, 10 H); RMN 13C (125 MHz, CD3CN) δ 172,64, 166,56, 162,93, 141,82, 134,15, 127,47, 127,05, 100,31, 92,63, 71,94, 70,12, 69,94, 69,83, 69,16, 68,75, 61,37, 59,80, 55,36, 42,14, 40,18, 37,53, 36,56, 35,45, 34,12, 29,56, 29, 32, 29,26, 28,02, 27, 98, 26, 18, 25,46, 20,13; FAB HRMS calc, para C36H55N4O7S [M+H]+ 687,3791, encontrado 687,3798.
Composto 6. O composto 4 (46 mg, 0,10 mmol), ácido pentinoico (15 mg, 0,15 mmol) e HATU (59 mg, 0,15 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (1 ml). Trietilamina (22 μΐ, 0,15 mmol) foi adicionada à solução e a reação foi agitada durante 14 h. Purificação através de cromatografia de gel de sílica (15:2:1 EtOAc:MeOH:H20 para 9:2:1 EtOAc:MeOH:H20 Rf (9:2:1) = 0,30) deu 6 (25 mg, 0,047 mmol, 46%) como um óleo amarelo. RMN 3H (400 MHz, CD3CN) δ 6,77 (s 1, 2 H) , 5,74 (s, 1 H), 5,38 (s, 1 H) , 4,44 (t apar., 1 H, J= 7,6 Hz), 4,27 (m, 1 H) , 3,61-3,54 (m, 8 H) , 3,51 (t, 4 H, J= 6,4 Hz), 3,25-3,16 (m, 5 H) , 2,91 (dd, 1 H, J= 4,8, 12,4 Hz), 2,68 (d, 1 H, J= 12,8 Hz), 2,47 (m, 2 H) , 2,35-2,30 (m, 6 H) , 2,22 (t, 1 H, J= 2,8 Hz), 2,17 (t, 2 H, J= 7,2 Hz), 1,75-1,53 (m, 8 H) , 1,44-1,37 (m, 2 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3CN) δ 172,79, 170,74, 163,21, 83,53, 70, 10, 69,82, 69,10, 68,71, 68,60, 61,46, 59,87, 55,41, 40,18, 36,49, 35,47, 34,69, 29,32, 29,29, 28,07, 28,01, 25,48, 14,32; FAB LRMS calc, para C2sH43N406S [M+H]+ 527,4, encontrado 527,4. Análise de Western blot de uma GlyCAM-Ig marcada com azida
Para a análise de Western blot de GlyCAM-Ig marcada e não marcada com azida, amostras foram incubadas com 5 (250 μΜ de concentração final em PBS, pH 7,4 contendo DMF a 0,7%), 6 (250 μΜ de concentração final em PBS, pH 7,4 contendo DMF a 0,7%) ou deixadas sem tratar durante 12 h. Para verificar que 6 poderia reagir com GlyCAM-Ig marcada com azida através de cicloadição [3+2] mediada com cobre, empregou-se uma versão modificada do método relatado por Speers e Cravatt. Speers e Cravatt (2004) Chem. Biol. 11:535-46. De forma breve, amostras de GlyCAM-Ig (em PBS, pH 7,4 contendo DMF a 0,7%) foram incubadas com 6 a 250 μΜ, TCEP a 2,5 mM, ligando tris-triazolilo a 250 μΜ (a partir de uma solução-mãe a 1,7 mM em 1:4 DMSO: terc-butanol) , e CuSCt a 2,5 mM. As amostras foram submetidas a vórtex e deixadas a reagir à ta durante 12 h. Antes da eletroforese, as amostras foram incubadas com um volume igual de 2-azidoetanol a 100 mM em 2 X tampão de carga SDS-PAGE durante 8 h à ta (para extinguir 5 ou 6 sem reagir) . As amostras extintas foram fervidas durante 3 min e carregadas em géis de poliacrilamida pré-fabricados. Depois da eletroforese, as amostras foram eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose, A membrana foi bloqueada utilizando BSA a 5% em PBS (ph 7,4, contendo Tween 20 a 0,05% (tampão de bloqueio A) durante 1 h à ta, depois incubada com uma solução de tampão de bloqueio A contendo HRP-a-biotina (diluição de 1:250.000, 1 h à ta). A membrana foi lavada, e a deteção de anti-biotina-HRP ligada à membrana foi conseguida através de quimiluminescência. Após a deteção, a membrana foi lavada com PBS (pH 7,4) contendo Tween a 0,05% (PBS-T) e colocada num tampão de extração (15 min à TA) para remover anti-biotina Ig ligada. A membrana foi minuciosamente lavada com PBS-T e sondada para o sinal anti-biotina residual através de quimiluminescência. A membrana foi lavada e bloqueada de novo com leite em pó seco desnatado a 5% (tampão de bloqueio B) durante 1 h à ta. A membrana foi depois incubada com HRP-a-Ig (1:5000 em tampão de bloqueio B) durante 1 h à ta. A membrana foi lavada novamente com PBS-T, e a deteção de anti-Ig humana ligada à membrana foi conseguida como para anti-biotina conjugada com peroxidase. As amostras de controlo foram tratadas de uma forma idêntica, exceto que reagentes específicos foram substituídos por tampão quando apropriado.
Condições de cultura celular Células Jurkat (linfoma de células T humano) foram mantidas numa atmosfera saturada de água com CO2 a 5% e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com FCS a 10%, penicilina (100 unidades/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml). As densidades celulares foram mantidas entre lxlO5 e 1,6 x 106 células/ml para todas as experiências.
Marcação e deteção de azida de superfície celular Células Jurkat foram semeadas numa densidade de 1,5-2,0 x 105 células/ml e incubadas durante 3 d em meio não tratado ou meio contendo várias cocentrações de Ac4ManNAz. Após o crescimento na presença de Ac4ManNAz, as células foram distribuídas numa placa de cultura de tecidos de fundo em V de 96 poços. As células foram sedimentadas (3500 rpm, 3 min) e lavadas duas vezes com 200 μΐ de tampão de marcação (PBS, pH 7,4 contendo FCS a 1%). As células foram depois incubadas com 5 ou uma sonda de fosfina biotinilada (Vocadlo et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100:9116-21) em tampão de marcação contendo DMF a 2,8% ou tampão de marcação mais DMF a 2,8% apenas. Após a incubação, as células foram sedimentadas, lavadas duas vezes com tampão de marcação e ressuspensas no mesmo tampão contendo FITC-avidina (diluição de 1:500 da solução-mãe Sigma). Após uma incubação de 10 min em gelo (no escuro), as células foram lavadas com 200 μΐ de tampão de marcação frio e o procedimento de coloração com FITC-avidina foi repetido. As células foram lavadas duas vezes com tampão de marcação frio, depois diluídas até um volume de 400 μΐ para análise de citometria de fluxo.
RESULTADOS
Ciclooctina biotinilada 5 foi sintetizada conforme mostrado no Esquema 1.
A construção do núcleo de ciclooctina substituída foi alcançada essencialmente conforme descrito por Reese e Shaw. Reese e Shaw (1970) Chem. Comm. 1172-1173. De forma breve, o composto 1 (Skattebol e Solomon, supra) foi tratado com perclorato de prata para efetuar a abertura do anel eletrocíclico para o catião trans-alílico, que foi capturado com hidroximetilbenzoato de metilo para dar bromo-trans-cicloocteno 2. A eliminação mediada por bases do brometo de vinilo seguida por saponificação deu o intermediário versátil 3, ao qual uma sonda biológica pode ser ligada. Finalmente, o composto 3 foi acoplado ao análogo de biotina 4 (Wilbur et al. , (1996) Bioconj. Chem. 7:689-702) carregando um ligante de PEG, proporcionando o alvo 5. A ciclooctina 3 foi estável a ácido moderado (HC1 a 0,5 N durante 30 min), base (NaOMe a 0,8 M durante 30 min), e exposição prolongada a nucleófilos biológicos tais como tóis (2-mercaptoetanol a 120 mM durante 12 horas).
Reações modelo foram realizadas com o composto 3 e 2-azidoetanol, benzilazida ou α-azidoacetamida de JV-butilo. Em todos os casos, os únicos produtos observados foram os dois triazóis regioisoméricos formados em quantidades aproximadamente iguais. A reação foi depois aplicada para marcação covalente de biomoléculas. A glicoproteína recombinante GlyCAM- Ig (Bistrup et al. (1999) J. Cell Biol. 145:899-910) foi expressa em células CHO na presença de N-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz), levando à incorporação metabólica do ácido N-azidoacetil siálico (SiaNAz) correspondente nos seus glicanos. Amostras de controlo de GlyCAM-Ig foram expressas na ausência de açúcar azido. As amostras de GlyCAM-Ig purificadas foram incubadas com 5 a 250 μΜ durante a noite, a ciclooctina não reagida foi extinta com excesso de 2-azietanol, e as amostras foram analisadas através de sondagem com Western blot com HRP-a-biotina (Fig. 2) . Uma biotinilação robusta foi observada para GlyCAM-Ig modificada com SiaNAz. Azidas que carecem de GlyCAM-Ig nativas não apresentaram marcação de fundo, enfatizando a excelente seletividade da cicloadição promovida pela tensão.
Como um ponto de comparação, reações semelhantes foram realizadas com alcino 6 terminal modificado com biotina (Esquema 1) . Na ausência de reagentes para a catálise do cobre, não foi observada marcação de glicoproteínas (Fig. 2) . Conforme esperado, com base em relatos anteriores (Sharpless e Finn (2003) J. Am. Chem. Soc. 125:3192-3193; e Speers e Cravatt ((2004) Chem. Biol. 11:535-546), a adição de CuSCg, TCEP e um ligando de triazol resultou na marcação fácil da glicoproteína modificada por azida. A transferência foi extraída e sondada novamente com anticorpo anti-IgG marcado com HRP (HRP-a-IgG) para confirmar a carga proteica igual. De forma interessante, a imunorreatividade anti-IgG consistentemente diminuída foi observada para GlyCAM-Ig modificada por azida marcada com 6 na presença de cobre. É possível que a combinação de produtos de triazol e cobre danifique o epítopo reconhecido por HRP-a-IgG.
Finalmente, a utilidade da reação promovida pela tensão para marcação de células vivas foi investigada. Células Jurkat foram incubadas com Ac4ManNAz a 25 μΜ durante 3 d de modo a introduzir resíduos de SiaNAz nas suas glicoproteinas da superfície celular. Saxon e Bertozzi (2000) Science 287:2007-2010; e Saxon et al. 92002) J. Am. Chem. Soc. 124:14893-14902. As células foram reagidas com várias concentrações de 5 durante 1,5 h à ta, depois coradas com FITC-avidina e analisadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Fig. 3A, as células exibindo azidas apresentaram um aumento dependente da dose na fluorescência após o tratamento com a sonda de ciclooctina. Não foi observada marcação detetável de células sem azidas. A reação da superfície celular também foi dependente da duração da incubação com 5 (Fig. 3B) e da densidade de azidas da superfície celular. Não foram observados quaisquer efeitos negativos na viabilidade celular.
Figura 2. A marcação de GlyCAM-Ig modificada por azida com sondas de alcino. GlyCAM-Ig purificada foi tratada com tampão (-) , 5 a 250 μΜ, ou 6 a 250 μΜ isoladamente ou na presença (cat) de CuS04, TCEP, e um ligando de triazol, durante a noite à ta. As misturas de reação foram extintas com 2-azidoetanol e analisadas através de sondagem por Western blot com HRP-a-biotina (painel superior). A transferência foi depois extraída e sondada novamente com HRP-a-IgG (painel inferior).
Figuras 3A e 3B A marcação da superfície celular com o composto 5. Células Jurkatt foram incubadas na presença (+Az) ou ausência (-Az) de Ac4ManNAz a 25 μΜ durante 3 d. Figura 3A. As células foram reagidas com várias concentrações de 5 durante 1 h à ta e tratadas com FITC-avidina; a intensidade de fluorescência média (MFI) foi determinada por citometria de fluxo. Figura 3B. As células foram incubadas com 5 a 250 μΜ por várias durações à ta e analisadas como em A. C. As células foram incubadas com sonda de 100 μΜ durante 1 h à ta e analisadas como em A. As barras de erro representam o desvio padrão a partir de três réplicas. AU = unidades de fluorescência arbitrária. O exemplo acima demonstra que a cicloadição [3+2] de derivados de azida e ciclooctina (ciclooctinas modificadas) de acordo com um método em causa ocorre prontamente sob condições fisiológicas na ausência de reagentes auxiliares; e que a modificação química seletiva de células vivas utilizando um método em causa ocorre sem qualquer toxicidade aparente.
Exemplo 2: Síntese de compostos de ciclooctina adicionais e a sua utilização na marcação de células vivas
Este exemplo apresenta a síntese dos compostos 3a e 3b (mostrados abaixo), a avaliação dos seus parâmetros cinéticos em reações com azidas orgânicas pequenas, e a sua utilização na marcação bio-ortogonal de células vivas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os reagentes químicos foram de grau analítico, obtidos a partir de fornecedores comerciais, e utilizados sem purificação adicional a menos que indicado. Com a exceção de reações realizadas em meios aquosos, todos os recipientes de reação foram secos em chama antes da utilização. As reações foram realizadas numa atmosfera de N2, Com a exceção de reações realizadas em meios aquosos, e reagentes líquidos foram adicionados com uma seringa a menos que indicado o contrário. Tetrahidrofurano (THF) foi destilado sob N2 a partir de Na/benzofeno imeadiatamente antes da utilização, e CH2CI2 foi destilado a partir de Catb imediatamente antes da utilização. A cromatografia foi levada a cabo com gel de malha de sílica 230-400 Merck 60 de acordo como procedimento descrito por Still. J. Org. Chem. (1978) 43:2923-2925. As reações e frações cromatográficas foram analisadas com placas G de gel de sílica de 250 micra Analtech, e visualizadas através de coloração com molibdato de amónio ou através de absorvância de luz UV a 245 nm. Quando um Rf é relatado para um composto, o solvente que foi utilizado foi o solvente da cromatografia a menos que indicado o contrário. Extratos orgânicos foram secos sobre MgS04 e os solventes foram removidos com um evaporador rotativo a pressão reduzida (20 torr), a menos que indicado o contrário. Os espectros de IV foram de finas películas em placas de NaCl. A menos que indicado o contrário, os espectros de RMN de 3H, 13C, e 19F foram obtidos com espectrómetros Bruker a 300 MHz e 400 MHz. Os desvios químicos são relatados em 8 ppm com referência ao pico de solvente para 3H and 13C e em relação a CFCI3 para 19F. As constantes de acoplamento (J) são relatadas em Hz. Espectros de massa de bombardeamento com átomos rápidos (FAB) de baixa e alta resolução e de impacto de eletrões (EI) foram obtidos na UC Berkeley Mass Spectrometry Facility, e as análises elementares foram obtidas na UC Berkeley Micro-Mass Facility. Os pontos de fusão foram determinados utilizando um aparelho de pontos de fusão Mel-Temp 3.0 e não estão corrigidos.
Procedimentos Sintéticos
(Ciclooct-l-eniloxi)-trimetilsilano (6). A uma solução de cilcooctanona (40,0 g, 316 mmol) em 200 ml de DMF anidro foram adicionados trietilamina (TEA, 93,0 ml, 666 mmol) e clorometilsilano (84,0 ml, 666 mmol). A reação foi aquecida até refluxo. Após 15 h, a reação foi extinta com 20 ml de H2O e a DMF foi removida num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com hexanos (300 ml), lavado com H2O (3 x 100 ml) e salmoura (1 x 50 ml), e seco sobre MgSCt. A distilação sob pressão reduzida (20 torr) deu 58,1 g (93%) do produto desejado como um óleo incolor, pe 108 °C (20 torr) (lit. 106 °C a 25 torr) . Nakamura, et al. J. Am. Chem. Soc. (1976) 98, 2346-2348. IV: 2926, 2851, 1661 cm-1. RMN 3H (CDCI3, 300 MHz) : δ 0,20 (s, 9H), 1,39-1,58 (m, 8H), 2,02 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 4,75 (t, 1H, J = 9,0 Hz) . Lit: RMN 3H (CDC13, 60 0 MHz) : δ 0,16 (s, 9H) , 1,46 (m, 4H) , 1,49 (m, 2H) , 1,55 (m, 2H) , 1,97 (m, 2H) , 2,14 (m, 2H), 4,70 (t, 1H, J= 8,0 Hz) (Frimer et al. J. Org. Chem. (2000) 65, 1807-1817.) RMN 13C (CDC13, 75 MHz): δ 0,4, 25,5,
26,3, 26,4, 27, 8, 30, 9, 31,0, 105, 41, 152, 99. (Lit: RMN 13C (CDCI3, 150 MHz): 8 0,45, 25,52, 26,36, 26,40, 27,83, 30, 98, 31,05, 105,45, 153,05) Frimer et al. (2000) supra) FAB-HRMS: Cale. para CnH230Si+ [M+H] + : 199,1518, encontrado 199, 1520.
2-Fluorociclooctanona (5b) . A uma solução de silil enol éter 6 (57,8 g, 291 mmol) em DMF (350 ml) foi adicionada a uma solução de Selectfluor (124 g, 349 mmol) em DMF (150 ml) ao longo de 1 h à ta. A solução foi deixada a agitar durante 12 h. A reação foi extinta com 30 ml de H2O, e a DMF foi removida num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com hexanos (500 ml) , lavado com H2O (3 x 200 ml) e salmoura (1 x 50 ml) , e seco sobre MgSCh. Após a cromatografia de coluna (pentano/éter a 30:1 para 15:1), um sólido branco foi isolado (38,4 g, 91%, Rf= 0,30 em 9:1 pentano/éter) , pf = 48, 1-49, 8 °C (217 mg, 3429, 2932, 2859, 1721, 1709 cm-1. (Lit: 1710 cirr1) (Rozen e Menahem. J. Fluorine Chem. (1980), 16, 19-31). RMN 3H (CDC13, 400 MHz): δ 1,25 (m, 1H), 1,38-1,55 (m, 4H), 1,61 (m, 1H), 1,73 (m, 1H), 2.05 (m, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 4,86 (ddd, 1H, J = 49,6, 6,4, 2,8 Hz). (Lit: RMN 3H (CDC13, 250 MHz): δ 1,36-2,7 (m, 12H) , 4,9 (dm, 1H, J = 49,5 Hz) (Chambers e Hutchinson J. Fluorine Chem. (1998) 89, 229-232) RMN 13C (CDC13, 100 MHz) : 8 20,3 (d, J= 4,0 MHz), 24,4 (d, J= 6,0 Hz), 24,5, 26, 9, 32,2 (d, J= 11,0 Hz), 39,3, 94,7 (d, J= 185,0 Hz), 213,4 (d, J = 21,0 Hz) . (Lit: RMN 13C (CDC13, 50 MHz) : δ 20,5 (d, J = 3,6 Hz), 24,6 (d, J= 3,7 Hz), 24,7, 32,7 (d, J = 21,0 Hz), 39,6, 91.5 (d, J = 184,7 Hz), 213,9 (d, J = 20,9 Hz) (Chambers e
Hutchinson (1998) supra) RMN 19F (CDC13, 376 MHz) : δ -190,7 (m) . (Lit: RMN 19F (CDC13, 235 MHz) : δ - 191,6 (m) (Chambers e
Hutchinson (1998) supra)
Éster de metilo de ácido 4-(l-Fluoro-2-oxo-ciclooctilmetil)benzoico (4b). A uma solução de LDA (34 ml, 61 mmol, uma solução a 1,8 M em heptano/THF/etilbenzeno) em THF (50 ml) a -78 °C foi adicionada uma solução de 2-flurociclooctanona (5b) (7,38 g, 51,2 mmol) em THF (50 ml) ao longo de duas horas utilizando uma bomba de seringa. Após 1 h, uma solução de 4-bromometil- benzoato de metilo (17,6 g, 76,8 mmol) em THF (50 ml) foi adicionada e a reação foi deixada a aquecer até à ta. Após 1 h, a mistura de reação foi extinta com H2O (50 ml) e o THF foi removido num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com EtOAc (200 ml) , lavado com H2O (3 x 100 ml) e salmoura (1 x 50 ml) , e seco sobre MgSCb. Após cromatografia de coluna (hexanos/EtOAc a 50:1 para 15:1), um sólido branco foi isolado (6,45 g, 43%, Rf= 0,35 em hexanos/EtOAc a 9:1), pf 53,5-55,2 °C. IV: 2931, 2858, 1721 cm-1. RMN !H (CDCI3, 400 MHz): 5 1,08 (m, 1H), 1,35-1,65 (m, 7H), 1,86 (m, 2H), 2,04 (d apar., 2H, J- 9,0 Hz), 2,90 (dd, 1H, J = 20,1, 14,1 Hz), 3,14 (dd, 1H, J= 28,2, 14,1 Hz), 3,78 (s, 3H), 7,15 (d, 2H, J= 7,8 Hz), 7,83 (d, 2H, J= 8,4 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) : 5 21,1, 24,7, 25,3, 27, 6, 38,7 (d, J = 22,0 Hz), 40, 0, 43, 4 (d, J = 21,0 Hz), 51,9, 102,3 (d, J= 189,0 Hz), 128,7, 129,3, 130,5, 140,3, 166, 8, 216, 0 (d, J=Hz). RMN 19F (CDCI3, 376 MHz): 5 -166,0 (m) . FAB-HRMS: Cale. para C17H22O3E1 [M+H] + : 293, 1553, encontrado: 293, 1560.
Éster de metilo de ácido 4-(l-fluoro-2-trifluorometanossulfoniloxi-ciclooct-2-enilm etil)-benzoico (7b) . A uma solução de cetona 4b (4,62 g, 15,8 mmol) em THF (50 ml) a -78 °C foi adicionada hexametildisilazida de potássio (KHMDS, 35,0 ml, 17,5 mmol, solução a 0,50 M em tolueno) . Após 1 h, uma solução de N-fenilbistrifluorometanossulfonimida (Tf2NPh, 6,18 g, 17,3 mmol) em THF (25 mL) foi adicionada e a reação foi deixada a aquecer até à ta. Após 30 min, a mistura de reação foi concentrada num evaporador rotativo e o produto foi purificado por cromatografia de coluna (hexanos/EtOAc a 20:1 para 12:1) para dar o produto desejado (4,09 g, 73%, Rf = 0,30 em hexanos/EtOAc a 9:1) como um óleo incolor. IV: 3424, 2952, 1723, 1646 cm-1. RMN ^ (CDC13, 400 MHz) : δ 1,38-1, 67 (m, 4H) , 1,74-1,97 (m, 4H), 1,97-2,18 (m, 2H), 3,16 (d apar., 1H, J = 3.2 Hz), 3,20 (s, 1H) , 3,91 (s, 3H) , 5,86 (t, 1H, J= 9,6 Hz), 7.2 6 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,9 6 (d, 2H, J= 8,4 Hz) . RMN 13C (CDCI3,
100 MHz): 5 22,0, 22,1, 23,1, 25,2, 35,1 (d, J = 22,0 Hz) , 44,3 (d, J = 26,0 Hz), 52,0, 95,7 (d, J = 177,0 Hz), 118,4 (q, J =317,0 Hz), 123,8, 129,1, 129,4, 130,5, 139,7 (d, J=8,0Hz), 148.2 (d, J = 21,0 Hz), 166,8. RMN 19F (CDCI3, 376 MHz) : δ -73,7 (d apar., 3H, J = 3,8 Hz), -144,3 (d apar., 1H, J= 3,8 Hz). FAB-HRMS: Cale. para Cis^iOsFfS1 [M+H] + : 425, 1046, encontrado: 425,1046.
Éster de metilo de ácido 4-(l-Fluoro-ciclooct-2-inilmetil)benzoico (8b). A uma solução de triflato de vinilo 7b (14,3 g, 33,5 mmol) em THF (100 ml) a 0 °C foi adicionada LDA (23,5 ml, 35,2 mmol, 1,8 M em heptano/THF/benzeno de etilo) gota-a-gota, utilizando uma bomba de seringa, ao longo de 3 h. LDA foi adicionada até que o material de partida foi consumido. A reação foi extinte com 20 ml de H2O e a THF foi removida num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com EtOAc (300 ml) , lavado com H2O (3 x 100 ml) e salmoura (1 x 50 ml), e seco sobre MgSCg. Após cromatografia em gel de sílica (hexanos/EtOAc a 50:1 para 25:1), um óleo incolor foi isolado (5,41 g, 59%, Rf = 0,40 em hexanos/EtOAc a 9:1). IV: 3421,2930, 2854, 2223, 1721, 1613 cm-1. RMN !H (CDCI3, 300 MHz): 8 1,35 (m, 1H), 1,66-1,76 (m, 2H) , 1,76-2,07 (m, 4H), 2,07-2,33 (m, 3H), 3,03 (d apar., 1H, J = 2,1 Hz), 3,10 (s, 1H) , 3,90 (s, 3H) , 7,37 (d, 2H, J= 8,1 Hz), 7,98 (d, 2H, J = 8,1 Hz). RMN 13C (CDC13, 75 MHz): 8 20,5, 26,0 (d, J= 1,5 Hz), 29,4, 34,0, 44,7 (d, J= 26,0 Hz), 48,8 (d, J = 25,0 Hz), 51,9, 90,5 (d, J = Hz), 95,2 (d, J = 175,0 Hz), 104,5 (d, J= 11,0 Hz), 128, 6, 129,3, 130,3, 141,2, 167, 0. RMN 19F (CDCI3, 376 MHz): δ -139,0 (m) . FAB-HRMS: Calc, para
Ci7H2oC>2F+ [M+H] + : 275, 1447, encontrado: 275, 1442.
Ácido 4-(l-Fluoro-ciclooct-2-inilmetil)benzoico (3b). A uma solução de ciclooctina 8b (1,8 g, 6,6 mmol) em dioxano (30 ml) e H2O (7,5 ml) foi adicionado LiOH finamente esmagado (3,1 g, 130 mmol). A suspensão foi aquecida até 50 °C e agitada durante 3 h. O dioxano foi removido num evaporador rotativo e a mistura de reação foi diluída com CH2CI2 (100 ml) . A camada orgânica foi lavada com HC1 a 1 N (2 x 100 ml), H2O (3 x 100 ml) , e salmoura (1 x 25 ml) , e seco sobre MgSCb, dando um sólido branco (1,7 g, 98%, Rf = 0,30 em hexano/EtOAc/AcOH a 27:3:1), pf 132,0-132,5 °C (dec). IV: 3442, 2926, 2851,2674, 2557, 2224, 1686, 1611 cm-1. RMN 3H (DMSO-d6, 400 MHz) : δ 1,39 (quinteto apar., 1H, J = 7,6 Hz), 1,64 (m, 2H) , 1,76 (m, 2H) , 2,10 (m,
5H), 3,07 (s, 1H), 3,11 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,38 (d, 2H, J
= 8,0 Hz), 7,87 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 12,9 (1 s, 1H). RMN 13C (DMSO-de, 100 MHz) : 8 19, 8, 25,7, 29, 0, 33,7, 43,7 (d, J= 25,0 Hz), 47,6 (d, J = 25,0 Hz), 90,7 (d, J = 32,0 Hz), 95,4 (d, J= 173,0 Hz), 104,5 (d, J= 10,0 Hz), 129,0, 129,2, 130,4, 141,2, RMN 19F (CD3CN, 376 MHz): δ -139,4 (m) . FAB-HRMS: Calc, para Ci6His02F+ [M+H] + : 261,1291, encontrado: 261, 1291. Anal, calc, para C16H17O2F: C, 79,31; H, 7,49. Encontrado: C, 79, 07; H, 7,26.
Trifluoroacetato de
3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-pirrol-l-il)-propilamónio (13). A uma solução de maleimida (3,12 g, 32,2 mmol) e ΡΡϊρ (8,29 g, 31,6 mmol) em THF (150 ml) foi adicionada N- (t-butoxicarbonil)propanolamina (5,00 ml, 29,3 mmol) e depois azodicarboxilato de diisopropilo (6,80 ml) , 35,1 mmol) . A solução foi agitada à ta durante 48 h, concentrada num evaporador rotativo, e purificada por cromatografia de coluna (hexanos/EtOAc a 4:1 para 2:1 ) para dar 10,3 g de uma mistura do produto protegido por JV-Boc e hidrazinadicarboxilato de diisopropilo. A mistura foi dissolvida numa solução de CH2CI2 (60 ml) e H2O (5 ml), e depois ácido trifluoroacético (TFA, 35 ml) foi adicionado. A reação foi agitada durante 5 h à ta e depois diluída com CH2CI2 (50 ml) e H2O (50 ml) . A camada aquosa foi lavada com CH2CI2 (3 x 50 ml) e depois concentrada para dar o produto desejado como um óleo amarelo (7,51 g, 96%). IV: 3435, 2959, 2917, 2849, 1707, 1683 cm-1. RMN 9H (DMSO-de, 400 MHz) : δ 1,76 (q apar., 2H, J = 7,2 Hz), 2,78 (m, 2H), 3,45 (t, 2H, J= 6,8 Hz), 7,02 (s, 2H) , 7,79 (s 1, 3H) . RMN 13C (DMSO-de, 10 0 MHz) : δ 26,7, 34,6, 37,0, 116,0 (q, 289,0 Hz), 134,7, 158,9 (q, J= 36,0 Hz), 171,3. RMN 19F (DMSO-de, 376 MHz): δ -72,9 (s) . FAB-HRMS: Calc. para C7HnN202+ [M+H] +: 155, 0821, encontrado: 155,0824.
N- [3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-pirrol-l-yl)-propil]-4-(1-fluorociclooct-2-inilmetil)benzamida (12b). TEA (0,508 ml, 3, 65 mmol) foi adicionada a uma solução de ciclooctina 3b (0,200 g, 0,768 mmol), amina 13 (0,235 g, 0,875 mmol), hexafluorofosfato de 0-(7-Azabenzotriazol-l-il)-N, N, N', N-tetrametilurónio (HATU, 0,305 g, 0,802 mmol), e 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 0,123 g, 0,802 mmol) em CH2CI2 (3 ml) à ta. A reação foi agitada durante 15 min à ta, extinta com H2O (10 ml), e diluída com CH2CI2 (50 ml). A camada orgânica foi lavada com HC1 a 1 N (3 x 50 ml), NaHCCç saturado (3 x 50 ml) , e salmoura (2 x 25 ml) e seco sobre MgSCg. Cromatografia do produto bruto (hexanos/EtOAc a 2:1 para 1:1) deu o produto desejado como um sólido branco (0,198 g, 65%, Rf = 0,30 em hexanos/EtOAc a 1:1), pf 122,0-124,0 °C (dec) . IV: 3413, 2931,2854, 2222, 1705, 1640 cm-1. RMN ΤΗ (CDC13, 400 MHz) : 8 1,39 (m, 1H) , 1,74 (m, 2H) , 1,81-2,06 (m, 6H) , 2,14-2,32 (m, 3H), 3,05 (d, 1H, J= 2,8 Hz), 3,09 (s, 1H), 3,40 (q, 2H, J = 6,4 Hz), 3,67 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,75 (s, 2H) , 6,93 (m,
1H), 7,41 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,81 (d, 2H, J= 8,0 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) : 8 20,5, 26, 0, 28, 1, 29,4, 34,0, 34,8, 36,2, 44,6 (d, J= 25,0 Hz), 47,8 (d, J= 24,0 Hz), 90,7 (d, J= 32,0 Hz), 95,3 (d, J= 174,0 Hz), 104,5 (d, J= 10,0 Hz), 126,7, 130,5, 132, 9, 134,2, 139, 6, 167, 1, 171, 1. RMN 19F (CDCI3, 376 MHz): δ -139,0 (m) . FAB-HRMS: Cale. para C2iH26N203F+ [M+H] + : 397,1927, encontrado: 397,1920.
Éster de metilo de ácido 4-(2-0xo-ciclooctilmetil)benzoico (4a). A uma solução em agitação de ciclooctanona (1,76 g, 14,0 mmol) em THF (30 ml) a -78 °C foi adicionada LDA (8,54 ml, 15,4 mmol, 1,8 M em heptano/THF/etilbenzeno) . Após 1 h, uma solução de 4-bromometilbenzoato de metilo (3,53 g, 15,4 mmol) em THF (10 ml) foi adicionada e a mistura de reação foi deixada a aquecer até à ta. Após 30 min, a reação foi extinta com H2O (10 ml) e a THF foi removida num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com EtOAc (100 ml), lavado com H2O (3 x 100 ml) e salmoura (1 x 50 ml), e seco sobre MgSCf. Cromatografia do produto bruto (hexanos/EtOAc a 50:1 para 9:1) deu o produto desejado como um óleo incolor (3,08 g, 80%, Rf = 0,30, hexanos/EtOAc a 9:1). IV: 3426,2929, 2856, 1721, 1700, 1657, 1611 cm-1. RMN ^ (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,10-1,28 (m, 1H) , 1,28-1,42 (m, 1H) , 1,42-1, 80 (m, 6H) , 1, 80-1, 90 (m, 1H) , 1,90-2,08 (m, 1H), 2,08-2,18 (m, 1H), 2,22-2,35 (m, 1H), 2,64 (dd, 1H, J= 12,6, 6,0 Hz), 3,01 (m, 2H) , 3,89 (s, 3H) , 7,20 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,93 (d, 2H, J = 8,4 Hz). RMN 13C (CDCI3, 75MHz): 824,5, 24,6, 25,1, 27,7, 32,9, 38,1, 43,2, 51,5, 52,0, 128,1, 129,7, 145,6, 167,0, 218,9. FAB-HRMS: Cale. para C17H23O31 [M+H] + : 275, 1647, encontrado: 275, 1648.
Éster de metilo de ácido 4-(2-Trifluorometanossulfoniloxi-ciclooct-2-enilmetil)-ben zoico (7a). A uma solução de cetona 4a (2,17 g, 7,91 mmol) em THF (50 ml) a -78 °C foi adicionada KHMDS (17,4 ml, 8,70 mmol, solução a 0,50 M em tolueno) . Após 1 h, a solução de Tf2NPh (3, 11 g, 8,70 mmol) em THF (25 ml) foi adicionada e a reação foi deixada a aquecer até à ta. Após 30 min, a mistura de reação foi concentrada num evaporador rotativo e o produto foi purificado diretamente por cromatografia de coluna (hexanos/EtOAc a 20:1 para 12:1 ) para dar o produto desejado (2,19 g, 68%, Rf = 0,35 em hexanos/EtOAc a 9:1) como um óleo incolor. O produto foi isolado como uma mistura a 9:1 de regioisómeros. IV: 2932, 2856, 1723, 1410 cm-1. RMN 3Η (CDCÍ3, 400 MHz): δ 1,25-1,38 (m, 1H) , 1,38-1,52 (m, 1H) , 1,52-1,71 (m, 4H), 1,71-1,85 (m, 2H), 1,98-2,11 (m, 1H), 2,15-2,25 (m, 1 H) , 2,73 (dd, 1H, J= 14,0, 6,8 Hz), 2,99 (dd, 1 H, J= 13,6, 8,0 Hz), 3,13 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 5,76 (t, 1H, J= 8,8 Hz), 7,27 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,98 (d, 2H, J= 8,0 Hz) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz) : δ 25, 9, 26,5, 29,8, 33,3, 37,4, 39, 8, 52,0, 118,5 (q, J= 318,0 Hz), 121,3, 128,4, 128,8, 129,8, 144,8, 151,0, 167,0. RMN 19F (CDCI3, 376 MHz): δ -73,8 (s). FAB-HRMS: Cale. para Ci8H220sF3S+ [M+H] + : 407,1140, encontrado: 407,1133.
Éster de metilo de ácido 4-ciclooct-2-inilmetilbenzoico (8a) . A uma solução do triflato d0 νϊπϊΐο 7a (2,14 g , 5,28 mm o 1) em THF (30 ml) a 0 °C foi adicionada LDA (3,52 ml, 5,28 mmol, 1,8 M em heptano/THF/benzeno de etilo) gota-a-gota por bomba de seringa, ao longo de 3 h. LDA foi adicionada até que o material de partida foi consumido. A reação foi extinta com H2O (10 ml) e a THF foi removida num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com EtOAc (100 ml) , lavado com H2O (3 x 100 ml) e salmoura (1 x 50 ml), e seco sobre MgSCb. Após cromatografia em gel de sílica (hexanos/tolueno/EtOAc a 3:1:0 para 30:10:2), um óleo incolor foi isolado (0,310 g, 23%, Rf= 0,20 em hexanos/tolueno/EtOAc a 30:10:1) . IV: 2930,2857, 1720 cm-1. RMN !H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,42 (m, 2H) , 1,62 (m, 1H) , 1,71-1,88 (m, 3H) , 1, 88-1, 98 (m, 1H) , 2,00-2,10 (m, 1H) , 2,11-2,23 (m, 2H), 2,63-2,80 (m, 3H), 3,90 (s, 3H), 7,29 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,97 (d, 2H, J= 8,4 Hz). RMN 13C (CDCI3, 100 MHz): 5 20,8, 28,4, 30,0, 34, 8, 36,5, 40,3, 41,7, 51, 9, 94, 9, 96,1, 128,1, 128,9, 129,6, 145,7, 167,1. FAB- HRMS: Cale. para C17H21O21. [M+H] + : 257,1542, encontrado: 257,1536.
Ácido 4-ciclooct-2-inilmetilbenzoico (3a) . A uma solução de ciclooctina 8a (283 mg, 1,11 mmol) em dioxano (12 ml) e H2O (3 ml) foi adicionado LiOH finamente esmagado (530 mg, 22,1 mmol). A suspensão foi aquecida até 50 °C e agitada durante 3 h. O dioxano foi removido num evaporador rotativo. O resíduo foi diluído com EtOAc (50 ml), lavado com HC1 a 1 N (3x50 ml) , H2O (3 x 50 ml) , e salmoura (2 x 50 ml) , e seco sobre MgS04 para dar um sólido branco (254 mg, 95%, Rf = 0,25 em hexano/EtOAc/AcOH a 27:3:1), pf 112,0-113,9 °C (dec). IV: 3071, 2922, 2846, 1680 cm-1. RMN ^ (CD3CN, 400 MHz) : 5 1,35-1,48 (m, 2H) , 1,56-1, 66 (m, 1H) , 1, 66-1, 95 (m, 4H) , 2,01-2,17 (m, 3H), 2,70 (d, 1H, J= 5,2 Hz), 2,71 (d, 1H, J= 1,2 Hz), 2,76 (m, 1H), 7,33 (d, 2H, J= 8,4 Hz), 7,91 (d, 2H, J= 8,4 Hz), 9,40 (1 s, 1H) . RMN 13C (CD3CN, 100 MHz): 8 21,2, 29,2, 30,8, 35,6, 37,3, 40,8, 42,5, 95,7, 97,1, 128,9, 130,1, 130,5, 147,4, 167.8. EI-HRMS: Calc, para Ci6Hi802 M+: 242,1307, encontrado: 242,1307. Calc. Anal, para Ci6Hi802 : C, 79,31; H, 7,49.
Encontrado: C, 79,07; H, 7,26.
4-ciclooct-2-inilmetil)-N- [3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropir rol-l-il)propil]benzamida (12a). TEA (0,184 ml, 0,396 mmol) foi adicionada a uma solução de ciclooctina 3a (64 mg, 0,26 mmol) , amina 13 (10 6 mg, 0,3 96 mmol) , e HATU (111 mg, 0,2 91 mmol) em CH2C12 (2 ml) à ta. A reação foi agitada durante 15 min à ta, extinta com H20 (10 ml), e diluída com CH2C12 (50 ml) . A camada orgânica foi lavada com HC1 a 1 N (3 x 50 ml), NaHC03 saturado (3 x 50 ml) , e salmoura (2 x 25 ml) , e seca sobre MgSCt. Cromatografia do produto bruto (hexanos/EtOAc a 2:1 para 1:1) deu o produto desejado como um óleo incolor (69 mg, 69%, Rf = 0,30 em hexanos/EtOAc a 1:1) . IV: 3411,3099, 2925, 2849, 1704, 163 9 cm-1. RMN 3H (CDC13, 400 MHz): 5 1,42 (m, 2H) , 1,61 (m, 1H), 1,70-1, 97 (m, 6H) , 2,00-2,09 (m, 1H) , 2,09-2,22 (m, 2H) , 2, 62-2,78 (m, 3H) , 3,38 (q, 2H, J = 6,4 Hz), 3,65 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,74 (s, 2H) , 6,93 (m, 1H) , 7,29 (d, 2H, J= 8,0
Hz), 7,78 (d, 2H, J = 8, 0 Hz) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz): 5 20,8, 28,2, 28,4, 29, 9, 34,7, 34,8, 36, 1, 36,5, 41, 6; 94, 9, 96,2, 126.9, 129,0, 132,2, 134,2, 144,0, 167,1, 171,2. FAB-HRMS: Cale. para C23H27N203+ [M+H] + : 379,2022, encontrado: 379,2014.
Compostos 11b e 11c. Ciclooctina 3b (0,20 g, 0,77 mmol) e 2-azidoetanol (N.J. Agard, resultados não publicados, 461 μΐ, 3,84 mmol) foram dissolvidos em CH3CN (7,2 ml) e solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (IX, pH 7,4, 5,9 ml) . A reação foi agitada à ta durante 12 h e concentrada num evaporador rotativo. Cromatografia do produto bruto (CH2CÍ2/MeOH/AcOH a 95:4:1 para 90:9:1) deu uma mistura a 20:1 de 11b: 11a (99 mg, 37%, Rf = 0,30 em CH2Cl2/MeOH/AcOH a 90:9:1) e 11c (144 mg, 54%, Rf = 0,15 em CH2CÍ2/MeOH/AcOH a 90:9:1) como óleos incolores.
Composto 11b: pf 175, 0-178, 0 °C. IV: 3442, 2103, 1644 cm-1. RMN JH (CD3OD, 400MHz): 51,39 (m, 3H), 1,55 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 2,15 (m, 2H), 2,30 (m, 1H), 2,82 (ddd, 1H, J= 14,8, 4,4, 4,4 Hz), 3,38 (t apar., 1H, J= 12,4 Hz), 3,48 (t apar., 1H, J= 14,4 Hz), 4,02 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,46 (dt, 1H, J = 14,0, 5,2 Hz), 4,62 (ddd, 1H, J = 14,0, 8,0, 5,6 Hz), 7,05 (d, 2H, J= 8,4 Hz), 7,86 (d, 2H, J= 8,4 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz) : 5 22, 9, 25,4, 27,4, 28,4, 38,3 (d, J = 22.0 Hz), 48,1 (d, J= 26,0 Hz), 53,9 (d, J= 7,0 Hz), 62,1, 97.0 (d, J= 174,0 Hz), 130,7, 131,2, 135,2 (d, J= 23,0 Hz), 141,6 (d, J= 8,0 Hz), 145,7 (d, J= 5,0 Hz), 169,8. RMN 19F (CD3OD, 376 MHz): 5 -145,7 (m). FAB-HRMS: Cale. para C18H23FN3O3+[M+H] +: 348,1723, encontrado: 348,1722.
Composto 11c: pf 183, 0-184, 6 °C. IV: 3423, 2068, 1643 cm-1. RMN !H (CD3OD, 400 MHz): 8 1,31 (m, 1H), 1,40-1,68 (m, 4H), 1,74 (m, 1H) , 1,92 (m, 2H) , 2,39 (m, 1H) , 2,95 (m, 1H) , 3,32 (q apar., 2H, J= 12,8 Hz), 3,88 (t, 2H, J= 5,6 Hz), 4,34 (m, 2H) , 7,05 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,82 (d, 2H, J= 8,0 Hz). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz): 8 21,7, 23, 8, 25, 9, 28,1, 38, 9, 51,1, 51,2, 55, 0, 62,2, 130,3, 130,9, 132,0, 135,7, 144,2, 149,9, 170,8. FAB-HRMS: Calc, para CisH24N304+ [M+H] + : 346, 1767, encontrado: 346,1764.
Avaliação cinética de sondas de ciclooctina
Soluções-mãe de ciclooctinas 3a e 3b (50 mM), azida de benzilo (500 mM) e 2-azidoetanol (500 mM) foram feitos em CD3CN ou uma mistura a 55:45 de CD3CN e solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco deuterada (pH 7,4, feita, com D2O) . Foi necessário aquecimento suave e/ou sonicação num banho de H2O para dissolver completamente 3a e 3b. Um tubo de RMN foi carregado com 450 μΐ de 3a ou 3b, e 50 μΐ de azida de benzilo ou 2-azidoetanol, e a reação foi monitorizada ao longo do tempo utilizando espectroscopia de RMN 1H.
No caso das reações de 3a e 3b com azida de benzilo, os dados cinéticos foram derivados através da monitorização da alteração na integração de ressonâncias correspondendo aos protões de benzilo na azida de benzilo (δ - 4,2 ppm) em comparação com as ressonâncias correspondentes dos produtos de triazol δ ~5,0 a 5,5 ppm). No caso das reações de 3a e 3b com 2- azidoetanol, os dados cinéticos foram derivados a partir da integração das ressonâncias correspondentes para o par mais a jusante de protões aromáticos (δ ~7,9 ppm) no material de partida de ciclooctina em comparação com as ressonâncias correspondentes nos produtos de triazol (δ ~7,7 a 7,8 ppm).
As constantes de taxa de segunda ordem para a reação foram determinadas através da representação gráfica de 1/[azida de benzilo] em função do tempo, no caso das reações de 3a e 3b com azida de benzilo e através da representação gráfica de 1/[3a] em função do tempo ou de l/[3b] em função do tempo no caso das reações de 3a e 3b com 2-azidoetanol, e subsequente análise através de regressão linear. As constantes de taxa de segunda ordem correspondem a um meio do declive determinado (Quadro 1) . As barras de erro representam desvios padrão a partir de três experiências replicadas.
aConstantes de taxa de segunda ordem para a cicloadição [3+2] foram determinadas a 22 °C utilizando RMN (veja-se a secção experimental para uma descrição completa da configuração experimental). bAgard, N. J., Prescher, J.A., Bertozzi, C.R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047. cLin, F. L., Hoyt, H.M., van Halbeek, H., Bergman, R.G., Bertozzi, C.R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2686-95. Marcação da superfície celular de células Jurkat com 12b-FLAG. Células Jurkat (linfoma de células T humano) foram mantidas numa atmosfera saturada de água com CO2 a 5% e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com FCS a 10%, penicilina (100 unidades/ml), e estreptomicina (0,1 mg/ml). As densidades celulares foram mantidas entre 1 x 105 e 1,6 x 106 células/ml. As células foram incubadas durante 3 d em meio não tratado ou meio contendo Ac4ManNAz a 25 μΜ. Após o crescimento na presença de Ac4ManNAz, as células foram distribuídas numa placa de cultura de tecidos de fundo em V de 96 poços. As células foram sedimentadas (3500 rpm, 3 min) e lavadas duas vezes com 200 μΐ de tampão de marcação (PBS, pH 7,4 contendo FCS a 1%). As células foram depois incubadas com 12b-FLAG ou 1-FLAG em tampão de marcação durante 1 h à ta. Após a incubação, as células foram sedimentadas, lavadas duas vezes com tampão de marcação, e suspensas novamente no mesmo tampão contendo α-FLAG conjugado com FITC (diluição de 1:3000 da solução-mãe de Sigma) . Após uma incubação de 30 min em gelo (no escuro), as células foram lavadas duas vezes com 200 μΐ de tampão de marcação frio e depois diluídas até um volume de 400 μΐ para análise de citometria de fluxo.
RESULTADOS
Para testar a especificidade da reação de cicloadição num contexto biológico, 3a e 3b foram adicionalmente derivatizados com FLAG-C (SEQ ID NO:3), um pequeno epítopo peptídico para o qual um anticorpo marcado de forma fluorescente está comercialmente disponível (Esquema 6) . Os derivados de maleimida 12a e 12b foram preparados pelo acoplamento mediado por HATU de 3a e 3b com aminomaleimida 13. Péptidos FLAG terminados em cisteína foram ligados às maleimidas 12a e 12b utilizando condições padrão e as sondas resultantes (12a-FLAG e 12b-FLAG) foram purificadas por HPLC para utilização em experiências de marcação de células.
Esquema 6
Esquema 6: (a) Hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-l-il)-N, N, N', N'-tetrametilurónio (HATU), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), TEA CH2C12, 69% (12a), 65% (12b); (b) H2N-DYKDDDDKC-C02H (SEQ ID NO:3), DMF/H20.
Azidas foram instaladas nas superfícies de células
Jurkatt através de marcação metabólica de resíduos de ácido siálico10. De forma breve, células alimentadas com N-azidoacetilmanosamina (Ac4ManNAz), um análogo de JV-acetilmanosamina (ManNAc), convertem o açúcar azido no ácido siálico azido (SiaNAz) correspondente dentro de glicoproteínas da superfície celular. A reação das azidas da superfície celular com fosfina ou sondas de ciclooctina contendo o epítopo FLAG foi monitorizada através de citometria de fluxo utilizando visualização com um anticorpo a-FLAG conjugado com FITC.
Conforme mostrado na Figura 4b, o 12b-FLAG marca as células Jurkat de uma forma dependente de azida, semelhante a uma sonda de fosfina marcada com FLAG previamente estudada capaz de passar pela ligação de Staudinger (1-FLAG). Agard et al. (2004). J. Am. Chem. Soc. 126, 15046-15047. O composto 12b-FLAG marca as células de uma forma dependente da dose. Não foi observada toxicidade em qualquer uma destas experiências.
Figuras 4A e 4B Marcação de azidas da superfície celular com sondas de ciclooctina. (a) Células Jurkat foram incubadas com açúcares azido durante 3 d e depois marcadas com várias concentrações de 1-FLAG ou 12b-FLAG. A deteção do péptido FLAG foi alcançada utilizando um anticorpo α-FLAG conjugado com FITC, seguida por análise através de citometria de fluxo, (b) Azul escuro: Células incubadas com Ac4ManNAz a 25 μΜ durante 3 d. Azul claro: Células incubadas na ausência de Ac4ManNAz. As barras de erro indicam o desvio padrão de três ensaios. aIntensidade de fluorescência média.
Exemplo 3: Síntese de um composto de ciclooctina sem arilo e sua utilização na marcação de células vivas
Este exemplo descreve a síntese de uma octina "sem arilo" (ALO; mostrado abaixo) e a utilização de uma ALO conjugada para marcar células vivas in vivo. A octina sem arilo foi sintetizada; depois um grupo arilo foi introduzido. A funcionalidade da maleimida permite uma conjugação específica com o tiol de um péptido contendo cisteína. Abaixo estão descritas as sínteses da octina, das maleimidas ligadas a octina, da sua conjugação com um péptido FLAG, e a utilização subsequente destes conjugados nas superfícies celulares e em ratinhos vivos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Síntese de ALO
Composto 14. AgCICh (2,40 g, 11,6 mmol) foi adicionada a uma solução de dibromobiciclo 1 (1,00 g, 3,72 mmol) e glicolato de metilo (6,0 ml, 78,2 mmol) dissolvido em tolueno (4 ml) num frasco envolvido em folha de alumínio e seco em chama. A reação foi agitada durante 2 h, diluída com pentano (20 ml) , e filtrada para remover sais de prata insolúveis. A solução foi concentrada e purificada através de cromatografia em gel de sílica (5-10% de EtOAc: éter de petróleo; Rf (EtOAc a 10%: éter de petróleo) = 0,32) para dar 2 como um óleo incolor (330 mg, 1,19 mmol, 22%). RMN ΤΗ (300 MHz, CD3C1) δ 6,20 (dd, 1H, J = 3,9, 11,7) 4,23 (d, 1H, J= 16,5), 4,11 (m, 1H) 3,96 (d, 1H, J= 16,5), 3,73 (s, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,25 (m, 1H), 0,8-2,1 (m, 8H) . EI LRMS calculado CnHisCbBr [M+H]+ 278,2 encontrado 278,1.
Composto 15. Uma suspensão de NaOMe (128 mg, 2,38 mmol) em DMSO anidro (2 ml) foi adicionada ao composto 2 (330 mg, 1,19 mmol) dissolvido em DMSO anidro (3 ml). A reação foi agitada 20 min e NaOMe adicional (250 mg, 4,8 mmol em 1,5 ml de DMSO) foi adicionado. A reação foi agitada até que o material de partida foi completamente consumido conforme determinado por TLC (20 min). Água (1 ml) foi adicionada à reação e esta foi agitada durante a noite. A reação foi acidificada com HC1 a 1 M (75 ml) e extraída duas vezes com EtOAc (50 ml). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgS04, filtrados, e o solvente foi removido in vacuo. (A reação pode ser purificada neste ponto para dar o ácido livre, mas é, mais frequentemente, tomada na sua forma em bruto para dar o éster de pentafluorofenilo ativado). A mistura de reação foi dissolvida em 5 ml de CH2CI2, e a esta solução foi adicionado Et3N (332 μΐ, 2,38 mmol) seguido por pentafluorofeniltrifluoroacetato (409 μΐ, 2,38 mmol). A reação foi agitada 3 h à ta, o solvente foi removido in vacuo, e o produto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (1,5-3% EtOAc:éteres de petróleo; Rf (3% EtOAc) = 0,30) para dar 3 como um óleo transparente (274 mg, 0,78 mmol, 66%) . RMN !H (400 MHz, CD3C1) 5 4,42 (m, 1H), 4,25 (d, 1H, J = 15,2) , 4,13 (d, 1 H, J= 15,2), 1,5-2,3 (m, 10 H) EI LRMS calc. para C16H14O3F5 [M+H]+ 349,3, encontrada 349, 0. Síntese de octinas de maleimida
Os compostos 16 e 17 foram sintetizados conforme se segue. TEA (1,5 eq) foi adicionada a uma solução de ciclooctina-PFP (1 eq.), e amina 13 (1,5 eq.), em CH2CI2 a ta. A reação foi agitada durante 2 h à ta, extinta com H2O, e diluída com CH2CI2. A camada orgânica foi lavada com HC1 a 1 N (x 3) NaHC03 saturado (x 3) , e salmoura (x 2), e seca sobre MgS04. Cromatografia do produto bruto (hexanos/EtOAc) deu o produto desejado como um óleo incolor.
Síntese de conjugados de oct-FLAG
Octina-maleimida (1 eq) foi adicionada a uma solução de FLAG-C (DYKDDDDKC; SEQ ID NO:3) preparada através de síntese de péptido de fase sólida padrão) (1,2 eq) em DMFtíbO a 1:1 e agitada durante a noite. A mistura de reação em bruto foi concentrada e purificada através de HPLC de fase reversa (sistema de HPLC Varian Dynamax com deteção de 254-nm, numa coluna preparativa Microsorb C-18 a uma taxa de fluxo de 20 ml/min). Todos os ciclos de HPLC utilizaram o seguinte gradiente: acetonitrilo de 5-25% em água ao longo de 10 min, seguido por acetonitrilo de 35-50% em água ao longo de 30 min. Ratinhos
Ratinhos B6D2F1 foram obtidos a partir do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Todos os animais foram alojados e monitorizados na Northwest Animal Facility (Berkeley, CA), e todas as experiências foram realizadas de acordo com orientações estabelecidas pelo Animal Care and Use Committee na Universidade da Califórnia, Berkeley (protocolo número R234-0504B).
Protocolo geral para a administração de composto
Foram administradas aos ratinhos doses diárias de Ac4ManNAz (0-300 mg/kg em -200 μΐ de DMSO a 70%, a partir de uma solução-mãe de 50 mg/ml) por via intraperitoneal (i.p.) durante 7 dias. Vinte e quatro horas após a injeção final de Ac4ManNAz, os ratinhos foram injetados por via i.p. com oct-FLAG (0-40 mmol em -200 μΐ de H2O) , Fos-FLAG (20 pmol em -200 μΐ de H2O) , ou veiculo apenas (H2O) . Após 3 h, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e sacrificados, e os seus esplenocitos foram isolados utilizando um protocolo padrão. Marcação de azidas da superfície celular de esplenocitos ex vivo
Esplenocitos a partir de um baço foram suspensos em meio RPMI 1640 e distribuídos entre poços de uma placa de cultura de tecidos com fundo em V de 96 poços (3 poços por tratamento, -5 x 105 células/poço). As células foram sedimentadas (3500 rpm, 3 min), enxaguadas três vezes com tampão de marcação (FBS a 1% em PBS, pH 7,4), e incubadas com tampão de marcação oct-FLAG a 0-500 μΜ, Fos-FLAG em tampão de marcação, ou tampão de marcação isoladamente. Após incubação à ta durante 1 h, as células foram enxaguadas três vezes com tampão de marcação, tratadas com FITC-a-FLAG (diluição a 1:900) ou isotipo controlo IgGi de ratinho conjugado com FITC (diluição de 1:200) em tampão de marcação durante 30 min em gelo, enxaguadas, e analisadas por citometria de fluxo.
RESULTADOS
Marcação de esplenocitos de conjugados de FLAG:
Esplenocitos cultivados na presença de Ac4ManNAz foram marcados conforme descrito nos procedimentos. Os resultados são mostrados na Figura 5. Fosfina-FLAG ("Fos-FLAG" serve como um controlo positivo de ligação, e as três octinas sintetizadas todas apresentam bio-ortogonalidade conforme demonstrado pela marcação aumentada na presença de células que carregam azida. O grau de marcação é consistente com os dados cinéticos in vitro entre as octinas. As octinas mais hidrofóbicas (F-oct(MOFO) e Oct (a primeira ciclooctina relatada) apresentam algum fundo .
Marcação in vivo de ratinhos: Ratinhos foram injetados com os açúcares marcados com azida conforme descrito nos procedimentos. Eles foram subsequentemente injetados com fosfina-FLAG ou ALO-FLAG, sacrificados e as suas células foram analisadas em relação à presença de FLAG através de citometria de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 6. ALO-FLAG, mas não F-oct-FLAG ou Oct-FLAG, demonstram a capacidade para realizar esta cicloadição promovida pela tensão num animal vivo.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> BERTOZZI, CAROLYN R. AGARD, NICHOLAS J. PRESCHER, JENNIFER A.
BASKIN, JEREMY MICHAEL
<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS <130> BERK-039WO <150> 60/624.202 <151> 01-11-2004 <160>8 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Epitopo sintético <4 0 0> 1
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 15 10
<210>2 <211>8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Epitopo sintético <400> 2
Asjp Tyr i,y« Asp Asp Asp Asp Lys I S
<210>3 <211>9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Epitopo sintético <400> 3
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Cys 1 5
<210>4 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Epitopo sintético <4 0 0>4
Cys Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu 15 10
<210>5 <211>6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante sintético <400> 5
Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5
<210>6 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante sintético <400> 6
Ala Ala Ala Gly Gly Met Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 10
<210>7 <211>6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante sintético <4Ο0> 7
Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 .
<210>8 <211>9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante sintético <400> 8
Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met Met 1 5
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 4741900 A [0051] • US 5326856 A [0051] • US 6855551 B [0051] • WO 0142505 A [0052] • WO 0186001 A [0052] • WO 9949019 A [0053] • WO 9407882 A [0070] • WO 9407881 A [0070] • WO 9407880 A [0070] • WO 9407876 A [0070] • WO 9323555 A [0070] • WO 9310076 A [0070] • US 5294637 A [0070] • US 5283253 A [0070] • US 5279949 A [0070] • US 5274137 A [0070] • US 5202448 A [0070] • US 5200534 A [0070] • US 5229529 A [0070] • EP 590267 A [0070] • WO 9918113 A [0072] • WO 9914209 A [0072] • WO 9909021 A [0072] • WO 9822451 A [0072] • US 5869680 A [0072] • WO 9828288 A [0072] • US 5821263 A [0072] • US 5415869 A [0072] • WO 9858927 A [0072] • WO 9813059 A [0072] • US 5824701 A [0072] • US 6873914 B [0109] • US 60624202 B [0177]
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Lisboa, 18 de Agosto de 2015

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula: em que:
    cada de X e X' é independentemente: (a) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (b) —W—(CH2)n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (c) - (CH2) n-W- (CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (d) — (CH2) η-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é H; um grupo reativo selecionado a partir de carboxilo, uma amina, um éster, um tioéster, um haleto de sulfonilo, um álcool, um tiol, um éster de succinimidilo, um isotiocianato, uma iodoacetamida, uma maleimida, e uma hidrazina; ou um marcador detetável, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epítopo, ou um membro e um par de ligação específico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro; ou cada de X e X' é independentemente: (a) H; (b) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (c) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (d) - (CH2) n-W-(CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (e) — (CH2) η-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é um carboxilo, uma amina, um tioéster, um haleto de sulfonilo, um álcool, um tiol, um éster de succinimidilo, um isotiocianato, uma iodoacetamida, uma maleimida, ou uma hidrazina; ou um marcador fluorescente, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epítopo, ou um membro e um par de ligação específico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  2. 2. 0 composto da reivindicação 1, em que: cada de X e X' é independentemente: (a) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (b) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (c) - (CH2) n-W- (CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (d) — (CH2) n—Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é H; um grupo reativo selecionado a partir de carboxilo, uma amina, um éster, um tioéster, um haleto de sulfonilo, um álcool, um tiol, um éster de succinimidilo, um isotiocianato, uma iodoacetamida, uma maleimida, e uma hidrazina; ou um marcador detetável, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epitopo, ou um membro e um par de ligação especifico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxilico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  3. 3. 0 composto da reivindicação 1, em que: cada de X e X' é independentemente: (a) H; (b) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (c) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (d) - (CH2) n-W-(CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (e) - (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é um carboxilo, uma amina, um tioéster, um haleto de sulfonilo, um álcool, um tiol, um éster de succinimidilo, um isotiocianato, uma iodoacetamida, uma maleimida, ou uma hidrazina; ou um marcador fluorescente, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epitopo, ou um membro e um par de ligação especifico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxilico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  4. 4. 0 composto da reivindicação 3, em que X é dois átomos de flúor e X' é H.
  5. 5. 0 composto da reivindicação 3, em que X e X' são ambos H.
  6. 6. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que X e X' são ambos flúor.
  7. 7. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que Y é um fluoróforo.
  8. 8. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que Y é um membro de um par de ligação especifico.
  9. 9. 0 composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que Y é biotina.
  10. 10. O composto da reivindicação 9, em que o composto tem a estrutura:
  11. 11. O composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que Y é uma etiqueta de epitopo.
  12. 12. Um composto para utilização num método de diagnóstico ou um método de terapêutica, em que o composto é um cicloalcano modificado de fórmula
    em que: cada de X e X' é independentemente: (a) H; (b) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (c) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é O, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (d) - (CH2) n-W- (CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é O, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é O, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (e) - (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é um marcador detetável, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epítopo, ou um membro e um par de ligação especifico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxilico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  13. 13. 0 composto para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o método compreende as etapas de reagir uma azida de uma molécula alvo com o cicloalcino modificado, e a dita reação produz um conjugado entre a azida da molécula alvo e o cicloalcino modificado.
  14. 14. 0 composto para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o método é para modificar sinteticamente um componente celular, o método que compreende: introduzir uma fração de azida num componente celular, gerando assim um componente celular modificado com azida; e contactar a célula que compreende um componente celular modificado com azida com um parceiro reativo que compreende o cicloalcino modificado, o dito contacto sendo sob condições fisiológicas; e o dito contacto com o dito parceiro reativo resulta na reação entre o grupo azida do componente celular modificado com azida e o cicloalcino do parceiro reativo, modificando, assim, sintética e covalentemente o componente celular.
  15. 15. Um método in vitro para a ligação quimiosseletiva de uma molécula alvo compreendendo uma azida, o método que compreende: reagir uma azida de uma molécula alvo com um cicloalcino modificado, e a dita reação produz um conjugado entre a azida da molécula alvo e o cicloalcino modificado, em que o cicloalcino modificado é de fórmula
    em que: cada de X e X' é independentemente: (a) H; (b) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (c) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (d) - (CH2) n-W- (CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (e) - (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é um marcador detetável, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epítopo, ou um membro e um par de ligação específico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  16. 16. 0 método de qualquer uma das reivindicações 13-15, em que a dita reação é realizada em condições aquosas.
  17. 17. 0 método de qualquer uma das reivindicações 13-15, em que a dita reação é realizada sob condições fisiológicas.
  18. 18 . 0 composto para utilização de acordo com as reivindicações 12 ou 13 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a molécula alvo é um açúcar.
  19. 19. 0 composto para utilização de acordo com as reivindicações 12 ou 13 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que o açúcar é um substrato da biossíntese de ácido siálico.
  20. 20 . O composto para utilização de acordo com as reivindicações 12 ou 13 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que o açúcar é manosamina ou manosamina acetilada.
  21. 21. O composto para utilização de acordo com as reivindicações 12 ou 13 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a molécula alvo é um aminoácido.
  22. 22 . O composto para utilização de acordo com as reivindicações 12 ou 13 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a molécula alvo que compreende a azida é expressa numa superfície celular.
  23. 23. Um método in vitro para modificar sinteticamente um componente celular, o método que compreende: introduzir uma fração de azida num componente celular, gerando assim um componente celular modificado com azida; e contactar a célula que compreende um componente celular modificado com azida com um parceiro reativo que compreende um cicloalcino modificado, o dito contacto sendo sob condições fisiológicas; e o dito contacto com o dito parceiro reativo resulta na reação entre o grupo azida do componente celular modificado com azida e o cicloalcino do parceiro reativo, modificando, assim, sintética e covalentemente o componente celular, em que o cicloalcino modificado é de fórmula
    em que: cada de X e X' é independentemente: (a) H; (b) um ou dois átomos de halogéneo (por exemplo, bromo cloro, flúor, iodo); (c) -W- (CH2) n-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; em que W, se presente, é 0, N, ou S; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; (d) - (CH2) n-W- (CH2) m-Z, em que nem são cada independentemente 1 ou 2; em que W é 0, N, S, ou sulfonilo; com a condição de que se W é 0, N, ou S, então Z é nitro, ciano, ou halogéneo; e com a condição de que se W é sulfonilo, então Z é H; ou (e) — (CH2) η-Z, em que n é um número inteiro desde 1-4; e em que Z é nitro, ciano, ácido sulfónico, ou um halogéneo; Y é um marcador detetável, um fármaco, uma toxina, um péptido, um polipéptido, uma etiqueta de epítopo, ou um membro e um par de ligação específico; e Rié selecionado a partir de um ácido carboxílico, um éster de alquilo, um éster de arilo, um éster de arilo substituído, um aldeído, uma amida, uma arilamida, um haleto de alquilo, um tioéster, um éster de sulfonilo, uma cetona de alquilo, uma cetona de arilo, uma cetona de arilo substituída, um halossulfonilo, um nitrilo, e um nitro.
  24. 24. 0 composto para utilização de acordo com a reivindicação 14 ou o método da reivindicação 23, em que o componente celular é um polipéptido.
  25. 25. 0 composto para utilização de acordo com a reivindicação 14 ou o método da reivindicação 23, em que Ri é um éster de alquilo.
  26. 26. 0 composto para utilização de acordo com a reivindicação 14 ou o método da reivindicação 23, em que o éster de alquilo é um éster de metilo.
  27. 27. 0 composto para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14 ou os métodos de qualquer uma das reivindicações 15 a 24, em que o composto é conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11. Lisboa, 18 de Agosto de 2015
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