JP2022530496A - Ｐｄ－１およびｌａｇ－３に対する二重特異性抗体 - Google Patents

Ｐｄ－１およびｌａｇ－３に対する二重特異性抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＰＤ－１に特異的に結合する第１標的部分およびＬＡＧ－３に特異的に結合する第２標的部分を含む二重特異性抗体を提供し、ここで第１標的部分は第１ＶＨＨドメインを含み、第２標的部分は第２ＶＨＨドメインを含む。本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列、クローニングまたは発現ベクター、宿主細胞、および該抗体を発現または単離するための方法をさらに提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物もまた提供する。本発明はさらに、該二重特異性抗体を用いて、がんおよびその他の疾患を処置するための方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、ＰＤ－１に特異的に結合する第１標的部分およびＬＡＧ－３に特異的に結合する第２標的部分を含む二重特異性抗体に関し、ここで、該第１標的部分は第１ＶＨＨドメインを含み、および該第２標的部分は第２ＶＨＨドメインを含む。さらに、本発明は、該抗体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、該抗体の生産プロセス、およびがん、感染症またはその他のヒト疾患の処置における、該二重特異性抗体を用いた免疫療法、を提供する。
発明の背景
ここ数年、免疫療法は、いくつかの種類のがんと闘うための非常に有望な新しい分野として進歩してきた。免疫チェックポイントタンパク質の１つであるＰＤ－１は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＢ細胞上で発現する、ＣＤ２８ファミリーの抑制性のメンバーである。ＰＤ－１は、免疫系の下方制御において主要な役割を担う。
ＰＤ－１は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、およびその構造は、免疫グロブリン可変領域様細胞外ドメイン、および免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞内ドメインからなる。
ＰＤ－１は２つの知られたリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有し、これらは細胞表面に発現するＢ７ファミリーのメンバーである。自身の生理学的なリガンドと結合すると、ＰＤ－１は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達の主要なインテグレーターであるＺａｐ７０を脱リン酸化し不活化するＳＨＰ－２、をリクルートする事でＴ細胞の活性化を抑制する。結果として、ＰＤ－１はＴ細胞の増殖、ならびにサイトカイン産生および細胞傷害活性などのＴ細胞の機能を阻害する。
ＰＤ－１を標的とするモノクローナル抗体はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合を遮断し、およびがん細胞に対する免疫応答を増幅する。これらの薬剤は、特定のがんの処置において大きな期待が寄せられている。ＰＤ－１を標的とした複数の認可された治療抗体がいくつかの製薬会社で開発されており、これにはＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｏｐｄｉｖｏ）、Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ（Ｌｉｂｔａｙｏ）を含む。これらの薬剤は、皮膚のメラノーマ、非小細胞肺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、およびホジキンリンパ腫を含む様々な種類のがんの処置において効果的であることを示してきた。これらはまた、他の多くの種類のがんに対する使用についても研究されている。
ＬＡＧ－３としても知られるリンパ球活性化遺伝子３は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。Ｌａｇ－３は、細胞表面分子であり、活性化したＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および形質細胞様樹状細胞で発現するが、休止状態のＴ細胞では発現しない。ＬＡＧ－３は、ＣＤ４と約２０％のアミノ酸配列の相同性があるが、ＭＨＣクラスＩＩとより高い親和性で結合し、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の負の制御をもたらす。
ＬＡＧ－３の遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を増強し、およびＬＡＧ－３欠損マウスは、スーパー抗原であるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂや、ペプチド、またはセンダイウイルス感染によって誘導されるＴ細胞応答の下方制御に欠陥がある。ＬＡＧ－３は、活性化した内因性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞および誘導性ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞の両者で発現され、その発現量は活性化エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞において観察したものよりも高い。Ｔｒｅｇ細胞上のＬＡＧ－３の遮断は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制性機能を廃棄させ、一方非ＴｒｅｇＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ－３の異所性発現は、抑制性機能を付与する。慢性感染症およびがんにおけるＴ細胞上でのＬＡＧ－３の免疫調節機能に基づくと、ＬＡＧ－３特異的モノクローナル抗体の予測された作用機序は、腫瘍特異的エフェクターＴ細胞の負の制御を阻害する事である。さらに、マウスおよびヒトにおけるＰＤ－１経路およびＬＡＧ－３の二重遮断は、どちらかの分子を単独で遮断するよりも抗腫瘍免疫に対してより効果的であることを示した。
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ではＬＡＧ－３およびＰＤ－１の共発現が見られ、およびこの両者の遮断は、増殖およびサイトカイン産生の改善をもたらした。抗ＰＤ－１療法と併用した抗ＬＡＧ－３は、様々な種類の固形腫瘍に対しての臨床試験に入っている。
発明の概要
本発明は、単離された抗体、特に二重特異性抗体を提供する。
１つの態様では、本発明は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する第１標的部分、およびヒトＬＡＧ－３に結合する第２標的部分を含む二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで該第１標的部分は第１ＶＨＨドメインを含み、および該第２標的部分は第２ＶＨＨドメインを含む。
１つの実施形態では、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１標的部分がマウスＰＤ－１に結合し、第２標的部分がマウスＬＡＧ－３に結合する。
１つの実施形態では、本発明は、第１ＶＨＨドメインがＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含み；ここで、該Ｈ－ＣＤＲ３が配列番号１に記載の配列およびその保存的改変を含み；該Ｈ－ＣＤＲ２が配列番号２に記載の配列およびその保存的改変を含み；該Ｈ－ＣＤＲ１が配列番号３に記載の配列およびその保存的改変を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、第２ＶＨＨドメインがＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３を含み；ここで該Ｈ－ＣＤＲ３は配列番号４に記載の配列およびその保存的改変を含み；該Ｈ－ＣＤＲ２は配列番号５に記載の配列およびその保存的改変を含み；該Ｈ－ＣＤＲ１は配列番号６に記載の配列およびその保存的改変を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、相同である配列を第１ＶＨＨドメインが含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号８に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、相同である配列を第２ＶＨＨドメインが含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、第１ＶＨＨドメインが配列番号７の配列を含む、および第２ＶＨＨドメインが配列番号８の配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
１つの実施形態では、第１ＶＨＨドメインおよび第２ＶＨＨドメインはペプチド配列によって連結されており、ここで、該ペプチド配列は、（ａ）ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＩｇＧ Ｆｃ フラグメント、および／または（ｂ）リンカー、を含む。
１つの実施形態では、リンカーは配列番号９の配列を含む。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１０の配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ａ）２．９２Ｅ－０９以下のＫＤでヒトＰＤ－１と結合する；およびｂ）３．０１Ｅ－１０以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合する、前述の抗体またはその抗原結合フラグメント。
上記の抗体の配列を、表１および配列表に示した。Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの構成は、ＶＨＨ（抗ＰＤ－１）－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＶＨＨ（抗ＬＡＧ－３）であり、ここで、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、ＩｇＧ４のＦｃフラグメントである。
Figure 2022530496000001
上記の抗体のＣＤＲ配列を表２および配列表に示す。
Figure 2022530496000002
本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。
本発明の抗体は、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。
本発明の抗体は、げっ歯類の抗体であり得る。
さらなる態様では、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子、を提供する。
本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を含む、クローニングまたは発現ベクター、を提供する。
本発明はまた、１以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞を培養し、および抗体を単離する事を含むプロセス、を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明における抗体または該抗体の抗原結合フラグメント、および１以上の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物、を提供する。
本発明は、治療剤に連結された、本発明における上記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫コンジュゲート、を提供する。
ここで、本発明は、上記の免疫コンジュゲートおよび１以上の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物、を提供する。
本発明はまた、本発明における抗体、または上記の抗体の何れか１つの抗原結合フラグメントを対象に投与する事を含む、対象において免疫応答を調節する方法を提供する。
本発明はまた、免疫疾患またはがんの処置または予防するための医薬の製造における、上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
本発明はまた、腫瘍細胞の成長を阻害するために、上記の抗体、または上記の抗原結合フラグメントを治療有効量で対象に投与する事を含む、対象において腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。
ここで、本発明は、該腫瘍細胞が、メラノーマ、腎がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、および直腸がん、からなる群より選択されたがん細胞である、方法を提供する。
本発明の特徴および利点
ＰＤ－１およびＬＡＧ－３経路の両者を対象とする二重特異性抗体は、がん治療においていくつかの利益を提供し得る。ＰＤ－１療法と比べて、二重特異性抗体は、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３の両者がポジティブながんにおける、応答の割合を増加し得る。
図面の簡単な説明
図１は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体がヒトＰＤ－１タンパク質に結合する事を示す。 図２は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体がヒトＬＡＧ－３タンパク質に結合する事を示す。 図３は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体がマウスＰＤ－１タンパク質に結合する事を示す。 図４は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体がマウスＬＡＧ－３タンパク質に結合する事を示す。 図５は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が細胞表面のカニクイザルＰＤ－１に結合する事を示す。 図６は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体がカニクイザルＬＡＧ－３タンパク質に結合する事を示す。 図７は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の、ヒトＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８およびＣＤ４タンパク質への結合を示す。図７Ａは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ヒトＣＴＬＡ－４タンパク質に結合しない事を示す；図７Ｂは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ヒトＣＤ２８タンパク質に結合しない事を示す；図７Ｃは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ヒトＣＤ４タンパク質に結合しない事を示す。 図８は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ヒトＰＤ－１およびＬＡＧ－３タンパク質に同時に結合する事を示す。 図９は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＰＤ－Ｌ１発現細胞に対するＰＤ－１の結合を遮断する事を示す。 図１０は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、Ｒａｊｉ細胞上のＭＨＣ－ＩＩに対するＬＡＧ－３の結合を遮断する事を示す。 図１１は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴ経路を増強する事を示す。 図１２は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＬＡＧ－３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ－２経路を増強する事を示す。 図１３は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＬＡＧ－３およびＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴ経路を増強する事を示す。 図１４は、ヒト同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＰＤ－１×ＬＡＧ－３ 二重特異性抗体の効果を示す。図１４Ａは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ－２の産生を増強する事を示す。図１４Ｂは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＭＬＲアッセイにおいてＩＦＮ－γの産生を増強する事を示す。 図１５は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ＳＥＢで刺激したＰＢＭＣのＩＬ－２産生を増強する事を示す。 図１６は、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰが、新鮮なヒト血清中で１４日まで安定であった事を示す。 図１７は、マウスにおける、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の腫瘍への効果を示す。図１７Ａは、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、マウスにおけるｃｏｌｏｎ２６腫瘍の成長を阻害する事を示す。図１７Ｂは、処置したマウスの生存曲線を示す。図１７Ｃは、処置したマウスの体重の変化を示す。
詳細な説明
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載される。
「プログラム死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ）１」、「プログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ）１」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ－１」、「ＣＤ２７９」および「ｈＰＤ－Ｆ」という用語は、互換的に用いられ、およびヒトＰＤ－１のバリアント、アイソフォーム、種のホモログ、他の種のＰＤ－１、およびＰＤ－１と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログ、を含む。
本明細書で言及される「抗体」という用語は、全長の抗体、および任意のその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部位」）、またはその一本鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に結合した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、を含むタンパク質またはその抗原結合部位を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化でき、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域中に散在している。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて以下の順番で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖のＣＤＲはＨ－ＣＤＲと略記され、例えばＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３があり、および軽鎖のＣＤＲはＬ－ＣＤＲと略記され、例えばＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３がある。
本開示で用いられる、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは、そのフラグメントもしくはその誘導体を指し、およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで産生されたかどうかに関わらず、抗原結合部位を含む任意のペプチドを包含する。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノスペシフィック抗体、ポリスペシフィック抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、および移植抗体を含むが、これに限定されない。「抗体」という用語はまた、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、第１ＶＨＨドメインおよび第２ＶＨＨドメインを含む二重特異性抗体、および抗原結合機能すなわちＰＤ－１およびＬＡＧ－３特異的に結合する能力を保持したその他の抗体フラグメント、などの抗体フラグメントを含む。典型的には、このようなフラグメントには抗原結合フラグメントを含み得る。
抗原結合フラグメントは、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしもその両方を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインのみからなるが、しかし完全抗体のいくつかの抗原結合機能を保持している。
「交差反応性」という用語は、本明細書で記載する抗原フラグメントが、ヒト、サル、および／または、マウス（マウスまたはラット）における同一の標的分子に結合する事を指す。よって、「交差反応性」とは、異なる種において発現する同一の分子Ｘに対する種間反応性であって、Ｘ以外の分子に対する反応性ではない、と理解される。例えば、ヒトＰＤ－１、サルおよび／またはマウス（マウスまたはラット）ＰＤ－１を認識するモノクローナル抗体の種間特異性は、例えばＦＡＣＳ解析によって決定され得る。
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒトの動物を含む。「非ヒトの動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば非ヒトの霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、などの哺乳類および非哺乳類を含む。特記する場合を除き、「患者」または「対象」という用語は互換的に用いられる。
「処置」および「療法」という用語は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両者を指す。処置を必要とするものには、すでに特定の医学的障害を有する個体、および最終的にその障害を獲得するであろう固体も含み得る。
「保存的改変」という用語は、すなわち、ヌクレオチド配列にコードされる抗体またはアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に、著しい影響を与えないまたは変更しない、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の改変の事である。このような保存的な配列の改変には、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、追加、および欠失を含む。改変は、部位指向性の変異導入、およびＰＣＲ介在性変異導入など当技術分野で公知の標準的な技術によって配列に導入され得る。保存的なアミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換されているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。
「ＬＡＧ－３」、「リンパ球活性化遺伝子３」、「ＣＤ２２３」という用語は、互換的に用いられ、およびヒトＬＡＧ－３のバリアント、アイソフォーム、種のホモログ、他の種のＬＡＧ－３、およびＬＡＧ－３と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログ、を含む。
「単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、「ＨＣＡｂ」という用語は、互換的に用いられ、２つのＶＨドメインを含むが、軽鎖を含まない抗体を指す。重鎖個体は、元々ラクダ科（ラクダ、ドロメダリー、ラマ）に由来する。軽鎖を持たないが、ＨＣＡｂは本物の抗原結合レパートリーを有する。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生成される、知られた最小の抗原結合単位を表す。「ＶＨＨ」という用語は、ＨＣＡｂの重鎖可変ドメインを指す。
本明細書で使用される場合、「ホモログ」および「相同」という用語は互換性があり、および最適にアライメントされた際に、別の配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
実施例
実施例１：研究材料の調製
１、市販材料
Figure 2022530496000003
２．抗原またはその他のタンパク質の生成
２．１ 抗原の産生
ヒトＰＤ－１、マウスＰＤ－１、ヒトＬＡＧ－３、マウスＬＡＧ－３およびカニクイザルＬＡＧ－３ ＥＣＤ（細胞外ドメイン）をコードする核酸は、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。合成された核酸から、ＰＤ－１またはＬＡＧ－３遺伝子フラグメントを増幅し、および発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に挿入した。挿入されたＰＤ－１およびＬＡＧ－３遺伝子フラグメントをさらにＤＮＡシーケンシングによって確認した。ヒトＰＤ－１またはＬＡＧ－３遺伝子を、２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にトランスフェクションする事によって、ヒトＬＡＧ－３ ＥＣＤと、ヒトＦｃ、マウスＦｃを含む様々なタグとを含む融合タンパク質を取得した。この細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養５日後、一過性トランスフェクションした細胞培養物から回収した上清を、タンパク質精製に用いた。プロテインＡおよび／またはＳＥＣカラムを用いて融合タンパク質を精製した。第Ｘａ因子プロテアーゼを用い、切断部位にてＥＣＤ－ｈＦｃ融合タンパク質を切断することによって、タグのないＬＡＧ－３ＥＣＤタンパク質を生成した。精製したタンパク質は、スクリーニングおよび評価に用いた。
マウスＦｃタグをつけたヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤ、ヒトＣＤＬＡ－４ ＥＣＤおよびＣＤ２８ ＥＣＤを上記のようにして生成した。
２．２ベンチマーク抗体の産生
抗ヒトＰＤ－１またはＬＡＧ－３ベンチマーク抗体（Ｗ３３９－ＢＭＫ１およびＷ３０５－ＢＭＫ１）の遺伝子配列を、それぞれ特許出願ＵＳ２０１１０１５０８９２Ａ１（Ｗ３３９－ＢＭＫ１は「２５Ｆ７」と表記）およびＷＯ２００６１２１１６８（Ｗ３０５－ＢＭＫ１は「５Ｃ４」と表記）、において開示された情報に基づいて合成した。
抗ヒトＰＤ－１×ＬＡＧ－３ベンチマーク抗体、Ｗ３６５－ＢＭＫ１、Ｗ３６５－ＢＭＫ２およびＷ３６５－ＢＭＫ３の配列を、それぞれ特許出願ＷＯ２０１５２００１１９Ａ８（Ｗ３６５－ＢＭＫ１は「配列２５＆配列２７」を指す）、ＷＯ２０１７０８７５８９Ａ２（Ｗ３６５－ＢＭＫ２は「配列１１０」を指す）およびＷＯ２０１５２００１１９Ａ８（Ｗ３６５－ＢＭＫ３は「配列５および４」を指す）、において開示された情報に基づいて合成した。合成した遺伝子配列を、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３に組み込んだ。このプラスミドでトランスフェクションした細胞を、５日間培養し、そしてプロテインＡカラムを用いたタンパク質精製のために上清を回収した。得られたベンチマーク抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣで解析し、－８０℃で保存した。
Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－Ｆｃ－Ｖ２（３０５６、抗ＰＤ－１）およびＷ３３９６－Ｐ２Ｒ２（Ｌ）－１Ｅ１－ｚ４－Ｒ２－２－Ｆｃ （３３９６、抗ＬＡＧ－３）は、Ｗｕｘｉ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓのＴＡＤ部門において見出された。
３．細胞株の生成
カニクイザルＰＤ－１トランスフェクタント細胞株を生成した。簡単に説明すると、２９３Ｆ細胞に、全長のヒト、カニクイザルＰＤ－１を含むｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターを、製造元のプロトコルに従いリポフェクタミントランスフェクションキットを用いて、それぞれトランスフェクションした。トランスフェクションから４８－７２時間後、トランスフェクションした細胞を、選択のためのブラストサイジンを含む培地中で培養し、および標的の発現を試験した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、ヒト全長ＰＤ－１／ＮＦＡＴレポーターまたはＬＡＧ－３／ＩＬ－２レポーターを含むプラスミドを、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後、トランスフェクションした細胞を、選択のためのハイグロマイシンを含む培地中で培養し、および標的の発現を試験した。２か月後、安定的に組み込んだＮＦＡＴまたはＩＬ－２ルシフェラーゼレポーター遺伝子と共に、ヒトＰＤ－１またはＬＡＧ－３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を得た。
実施例２：二重特異性抗体の生成
１．発現ベクターのコンストラクト
ＰＤ－１に結合する第１ＶＨＨを生産するための方法は、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７８５１５号に記載されており、およびＬＡＧ－３に結合する第２ＶＨＨを生産するための方法は、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７８３１５号に記載されている。
抗ＰＤ－１ ＶＨＨおよび抗ＬＡＧ－３ ＶＨＨをコードするＤＮＡ配列はＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）によって合成された。そして、抗ＰＤ－１ ＶＨＨおよび抗ＬＡＧ－３ ＶＨＨを、ｐＹＦ発現ベクター中のヒンジ領域およびＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＮ末端およびＣ末端のそれぞれにサブクローニングした。
２．小規模でのトランスフェクション、発現および精製
二重特異性抗体のプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞を５日間培養し、およびプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたタンパク質精製のために上清を回収した。得られた抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＳＥＣによって解析し、－８０℃で保存した。
抗体の精製度を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを用いたＳＥＣ－ＨＰＬＣによって決定した。抗体溶液を、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０ 緩衝液を用いてＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムに注入した。測定時間は２０分であった。カラムのピーク保持時間を２８０ｎｍでモニターした。データはＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ２．９９．２．０）を用いて解析した。
３．結果
リード候補の配列
リード抗体の配列を表２に示し、およびそのＣＤＲを表１に示した。
実施例４：Ｉｎ ｖｉｔｒｏの評価
１．ヒトＰＤ－１またはＬＡＧ－３に対するＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の結合
プレートをＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のマウスＦｃタグ付きＰＤ－１タンパク質またはＬＡＧ－３タンパク質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けてＨＰＲ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加して１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、および発色反応を２Ｍ ＨＣＬで停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図１および表３に示すように、ＰＤ－１タンパク質への結合におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０はベンチマークと同程度である。
Figure 2022530496000004
図２および表４に示すように、ＬＡＧ－３にタンパク質への結合におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０はベンチマークと同程度である。
Figure 2022530496000005
２．マウスＰＤ－１またはＬＡＧ－３に対する、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の結合
プレートをＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のＨｉｓタグ付きマウスＰＤ－１タンパク質またはＬＡＧ－３タンパク質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けてＨＰＲ標識ヤギ抗Ｈｉｓ ＩｇＧ抗体を添加して１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、および発色反応を２Ｍ ＨＣＬで停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図３および表５に示すように、ＢＭＫではなく、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのみが、マウスＰＤ－１タンパク質に結合し得る。
Figure 2022530496000006
図４および表６に示すように、ＢＭＫではなく、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのみが、マウスＬＡＧ－３タンパク質に結合し得る。
Figure 2022530496000007
３．カニクイザルＰＤ－１またはＬＡＧ－３に対するＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の結合。
カニクイザルのＰＤ－１について、カニクイザルＰＤ－１を発現する２９３Ｆ細胞を様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体と共にそれぞれインキュベートした。ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の細胞への結合を検出するために用いた。細胞のＭＦＩを、フローサイトメトリーを用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ（ヴァージョン７．６．１）で解析した。
カニクイザルのＬＡＧ－３について、プレートをＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のＨｉｓタグ付きカニクイザルＬＡＧ－３タンパク質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けてＨＰＲ標識ヤギ抗Ｈｉｓ ＩｇＧ抗体を添加して１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、および発色反応を２Ｍ ＨＣＬで停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図５および表７に示すように、ＬＡＧ－３タンパク質への結合におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０はＢＭＫと同程度である。
Figure 2022530496000008
図６および表８に示すように、ＬＡＧ－３タンパク質への結合におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０は、Ｗ３６５－ＢＭＫ３と同程度かつ、Ｗ３３９－ＢＭＫ１よりも優れている。
Figure 2022530496000009
４．ヒトＣＤ４、ＣＴＬＡ－４、およびＣＤ２８に対する交差反応性
ＥＬＩＳＡ法を用いて、ヒトＣＤ４、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に対する交差反応性を測定した。プレートを、１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ４、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けて対応する二次抗体を添加し６０分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、発色反応を２Ｍ ＨＣｌで停止させた。
図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃの結果は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体が、ヒトＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８またはＣＤ４タンパク質に結合しなかった事を示唆する。
５．ＳＰＲによる、ヒト、マウス、カニクイザルＰＤ－１およびＬＡＧ－３に対する親和性試験
二重特異性抗体の抗原への結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋを用いたＳＰＲアッセイによって決定した。ＰＤ－１ｘＬＡＧ－３抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ 抗体が固定化されたＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）上に捕捉された。異なる濃度のＨｉｓタグ付きヒトＰＤ－１タンパク質（ＭＷ：４０ＫＤ）およびカニクイザルＰＤ－１（ＭＷ：４０ＫＤ）を、３０μＬ／分の流速でセンサーチップ上に注入し、１２０秒間の会合フェーズ、続けて８００秒間の解離フェーズを行った。異なる濃度のＨｉｓタグ付きマウスＬＡＧ－３タンパク質（ＭＷ：４５ＫＤ）を３０μＬ／分の流速でセンサーチップ上に注入し、１２０秒間の会合フェーズ、続けて３６００秒間の解離フェーズを行った。異なる濃度のＨｉｓタグ付きマウスＰＤ－１タンパク質（ＭＷ：４５ＫＤ）を３０μＬ／分の流速でセンサーチップ上に注入し、６０秒間の会合フェーズ、続けて９０秒間の解離フェーズを行った。各結合サイクルの後、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）でチップを再生した。
ヒトＬＡＧ－３に対する親和性のために、ＰＤ－１ｘＬＡＧ－３抗体を、ＣＭ５センサーチップ上に固定した。シングルサイクルカイネティクス法を用いて、様々な濃度のタグ無しヒトＬＡＧ－３を、３０μＬの流速でセンサーチップ上に注入し、１８０秒間の会合フェーズ、続けて３６００秒間の解離フェーズを行った。チップは１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）で再生した。
ブランク表面および緩衝液チャネルのセンサーグラムを、試験センサーグラムから減算した。実験データを、ラングミュア解析を用いて１：１モデルでフィッティングした。
Figure 2022530496000010
Figure 2022530496000011
６．ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体のヒトＰＤ－１およびＬＡＧ－３タンパク質への二重の結合
プレートを１μｇ／ｍＬのマウスＦｃタグ付きヒトＰＤ－１で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体をプレートに添加し、洗浄後室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けてＨｉｓタグ付きＬＡＧ－３タンパク質を添加して１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ抗ＨＩＳ抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、および発色反応を２Ｍ ＨＣＬで停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図８および表１１に示すように、ＬＡＧ－３タンパク質への結合におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０は、Ｗ３６５－ＢＭＫ３と同程度であり、およびＷ３６５－ＢＭＫ１およびＢＭＫ２よりも優れている。
Figure 2022530496000012
７． ＰＤ－１発現細胞に結合するＰＤ－Ｌ１タンパク質の遮断
抗体を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで段階希釈し、およびｍＦｃタグ付きＰＤ－Ｌ１タンパク質と４℃で混合した。この混合液を、ＰＤ－１発現ＣＨＯ－Ｓ細胞を播いた９６ウェルプレートに移した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ抗体を用いてＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１発現細胞への結合を検出した。このＭＦＩをフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
図９および表１２に示すように、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１発現細胞への結合の遮断におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０は、ＢＭＫと同程度である。
Figure 2022530496000013
８．Ｒａｊｉ細胞上で発現するＭＨＣ－ＩＩに結合するＬＡＧ－３タンパク質の遮断
抗体を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで段階希釈し、およびマウスＦｃタグ付きＬＡＧ－３タンパク質と一緒に４℃でインキュベートした。この混合液を、その表面上でＭＨＣ－ＩＩを発現するＲａｊｉ細胞を播いた９６ウェルプレートに移した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ抗体を用いて、ＬＡＧ－３タンパク質のＲａｊｉ細胞への結合を検出した。このＭＦＩをフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
図１０および表１３に示すように、ＭＨＣ－ＩＩ発現Ｒａｊｉ細胞へのＬＡＧ－３の結合の遮断におけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０は、Ｗ３３９－ＢＭＫ１、Ｗ３６５－ＢＭＫ３と同程度であり、かつＷ３６５－ＢＭＫ１およびＷ３６５－ＢＭＫ２よりも優れていた。
Figure 2022530496000014
９．ＮＦＡＴレポーター遺伝子を持つＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ヒトＰＤ－１と共に、安定的に組み込んだＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞、およびヒトＰＤ－Ｌ１を発現する人工ＡＰＣ（抗原提示細胞）細胞を９６ウェルプレートに播種した。これらの細胞に試験抗体を添加した。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート後、再構成されたルシフェラーゼ基質、Ｏｎｅ－Ｇｌｏを添加し、ルシフェラーゼの蛍光強度をマイクロプレート分光光度計で測定した。
図１１に示されるように、レポーター遺伝子アッセイにおいて、抗体はＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ経路を増強した。さらに、表１４に示すように、このアッセイにおけるＷ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰのＥＣ５０は、Ｗ３６５－ＢＭＫ１よりも優れており、およびその他のベンチマーク抗体と同程度であった。
Figure 2022530496000015
１０．ＩＬ－２レポーター遺伝子を持つＬＡＧ－３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ヒトＬＡＧ－３と共に、安定的に組み込んだＩＬ－２ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞、およびＲａｊｉ細胞を、ＳＥＥ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｅ）の存在下で、（９６ウェルプレートに播種した。これらの細胞に試験抗体を添加した。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、再構成したルシフェラーゼ基質、Ｏｎｅ－Ｇｌｏを添加し、ルシフェラーゼの蛍光強度をマイクロプレート分光光度計で測定した。
図１２および表１５に示されるように、レポーター遺伝子アッセイにおいて、抗体はＪｕｒｋａｔ細胞のＩＬ－２経路を増強した。
Figure 2022530496000016
１１．ＮＦＡＴレポーター遺伝子を持つ、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ヒトＰＤ－１と共に、安定的に組み込んだＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞に、全長ヒトＬＡＧ－３プラスミドを一過性にトランスフェクションした。４８時間後、この細胞を、ＰＤ－Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞と共に、ＳＥＥ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｅ）の存在下で、９６ウェルプレートに播種した。これらの細胞に試験抗体を添加した。プレートを、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、再構成したルシフェラーゼ基質、Ｏｎｅ－Ｇｌｏを添加し、ルシフェラーゼの蛍光強度をマイクロプレート分光光度計で測定した。
図１３に示されるように、レポーター遺伝子アッセイにおいて、抗体はＰＤ－１およびＬＡＧ－３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴ経路を増強した。その倍率は、その他のベンチマークだけでなくＷ３０５－ＢＭＫ１およびＷ３３９－ＢＭＫ１の組み合わせよりも高い。
１２．ヒト同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ濃度勾配遠心分離法を用いて、健康なドナーから新たに単離した。製造元の説明書に従い、ヒト単球濃縮キットを用いて単球を単離した。細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を含む培地中で５から７日間培養し、樹状細胞（ＤＣ）を生成した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコルに従い、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを用いて単離した。精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を同種未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と共に、様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の存在下で、９６ウェルプレートで共培養した。プレートを５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ試験のために、それぞれ３日目と５日目に上清を回収した。ヒトＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出を、適合する抗体ペアを用いたＥＬＩＳＡによって測定した。組み換えヒトＩＬ－２およびＩＦＮ－γをそれぞれ標準として用いた。ヒトＩＬ－２またはＩＦＮ－γに特異的な捕捉抗体でプレートを事前にコートした。ブロッキング後、５０μＬの標準またはサンプルを、ピペットを用いて各ウェルに入れ、周囲温度で２時間インキュベートした。結合していない基質を除去した後、対応するサイトカインに特異的な、ビオチンとコンジュゲートした検出抗体をウェルに添加し、そして１時間インキュベートした。その後、ＨＲＰ－ストレプトアビジンをウェルに添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。５０μＬのＴＭＢ基質を分注し、発色させ、および５０μＬの２Ｎ ＨＣｌで停止させた。マイクロプレート分光光度計を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは混合リンパ球反応においてＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌を増強した。
１３．ヒトＰＢＭＣの活性化におけるＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の効果
ＰＢＭＣおよび様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体を、ＳＥＢの存在下で、９６ウェルプレートで共培養した。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で３日間インキュベートし、そしてＩＬ－２試験のために上清を回収した。セクション１２に記載するように、ヒトＩＬ－２の放出をＥＬＩＳＡによって測定した。
図１５に示されるように、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４は、ＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣにおけるＩＬ－２分泌を増強した。
１４．示差走査型蛍光光度計（ＤＳＦ）による熱安定性試験
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ商標７ Ｆｌｅｘ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、抗体のＴＭ値を調べた。１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレートに移した。プレートを２６℃から９５℃まで、０．９℃／分の速度で加熱し、および得られた蛍光データを回収した。異なる温度に対する蛍光変化の負の導関数を計算し、最大値を融解温度Ｔｍとして定義した。タンパク質が複数の非折り畳み構造に遷移する場合、最初の２つのＴｍを報告し、これをＴｍ１およびＴｍ２とした。データの回収およびＴｍの計算は、オペレーションソフトウェアによって自動的に実行された。
Figure 2022530496000017
１５．血清の安定性
リード抗体を、新しく単離されたヒト血清（血清含量＞９５％）中で、３７℃でインキュベートした。示した時点において、血清処置した分注サンプルをインキュベーターから取り出し、液体Ｎ２で瞬間的に凍結させ、その後試験の準備ができるまで－８０℃で保存した、このサンプルを安定性試験の直前に素早く解凍した。
プレートを１μｇ／ｍＬのマウスＦｃタグ付きヒトＰＤ－１で、４℃で一晩コートした。ブロッキングおよび洗浄した後、様々な濃度のＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体をプレートに添加し、洗浄後、室温で１時間インキュベートした。そして、このプレートを洗浄し、続けてＨｉｓタグ付きＬＡＧ－３タンパク質を添加して１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識マウス抗ＨＩＳ抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、および発色反応を２Ｍ ＨＣＬで停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
図１６は、Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、新鮮なヒト血清中で１４日まで安定であった事を示す。
実施例５：Ｉｎ ｖｉｖｏの評価
１．ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体のＩｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＣｏｌｏｎ２６腫瘍モデルを用いて、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の成長を阻害する能力を評価した。０日目に５×１０５個のマウス大腸がんＣｏｌｏｎ２６細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスに皮下移植し、および腫瘍が６０－７０ｍｍ３に達した時点でマウスをグループ分けした（ｎ＝８）。
０日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に、ＰＤ－１ ｍＡｂ（３０５６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＡＧ－３ ｍＡｂ（３３９６）単独（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰ（１３．９ｍｇ／ｋｇ）、または３０５６ ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）および３３９６ ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ、をマウスに腹腔内投与した。ネガティブコントロールとして、ヒトＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
注入後３週間にわたって、腫瘍容積および動物の体重を測定した。腫瘍容積は、公式：Ｖ＝０．５ａｂ２、を用いてｍｍ３で示し、ここで、ａおよびｂはそれぞれ、腫瘍の長径および短径である。
処置したマウスの腫瘍容積および生存曲線を図１７Ａおよび１７Ｂに示した。その結果、Ｗ３３９６およびＰＤ－１×ＬＡＧ－３ 抗体Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰはＣｏｌｏｎ２６腫瘍成長阻害に効果的であり、一方Ｗ３０５６抗体単独での処置はあまり効果的でないことが示された。Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰは、親のＰＤ－１抗体（Ｗ３０５６）または親のＬＡＧ－３抗体（Ｗ３３９６）単独と比べてより大きな腫瘍成長の阻害をもたらした。Ｗ３６５９－Ｕ１４Ｔ４．Ｇ１－１．ｕＩｇＧ４．ＳＰの有効性はＰＤ－１およびＬＡＧ－３抗体の組み合わせと同程度であった。一方、図１７Ｃでは、各グループの体重増加から、明らかな毒性がない、良好な安全性が示唆された。

Claims (21)

  1. ＰＤ－１に特異的に結合する第１標的部分およびＬＡＧ－３に特異的に結合する第２標的部分を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで、第１標的部分が第１ＶＨＨドメインを含み、および第２標的部分が第２ＶＨＨドメインを含み；
    ここで、第１ＶＨＨドメインはＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含む；Ｈ－ＣＤＲ３は、配列番号１に記載の配列およびその保存的改変を含む；Ｈ－ＣＤＲ２は、配列番号２に記載の配列およびその保存的改変を含む；Ｈ－ＣＤＲ１は、配列番号３に記載の配列およびその保存的改変を含む；
    第２ＶＨＨドメインはＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３を含む；Ｈ－ＣＤＲ３は、配列番号４に記載の配列およびその保存的改変を含む；Ｈ－ＣＤＲ２は、配列番号５に記載の配列およびその保存的改変を含む；Ｈ－ＣＤＲ１は、配列番号６に記載の配列およびその保存的改変を含む、
    二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 該第１ＶＨＨドメインが、配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同である配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 該第２ＶＨＨドメインが、配列番号８に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同である配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 該第１ＶＨＨドメインが、配列番号７の配列を含む、および該第２ＶＨＨドメインが、配列番号８の配列を含む、請求項１－３の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 該第１ＶＨＨドメインおよび該第２ＶＨＨドメインがペプチド配列によって連結している、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 該ペプチド配列が、（ａ）ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＩｇＧ Ｆｃフラグメント、および／または（ｂ）リンカー、を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 該リンカーが配列番号９の配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 配列番号１０の配列を含む、請求項１－７の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 該抗体または抗原結合フラグメントが、
    ａ）２．９２Ｅ－０９以下のＫＤでヒトＰＤ－１と結合する；および
    ｂ）３．０１Ｅ－１０以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３と結合する、
    請求項１－８の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  10. 該抗体がヒト化抗体である、請求項１－９の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
  12. 請求項１１の核酸分子を含む、クローニングまたは発現ベクター。
  13. １以上の請求項１２のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１３の宿主細胞を培養する事および該抗体を単離する事を含む、請求項１－９の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するためのプロセス。
  15. 請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および１以上の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤、および担体を含む、医薬組成物。
  16. 治療剤と連結した、請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫コンジュゲート。
  17. 請求項１６の免疫コンジュゲートおよび１以上の医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤および担体を含む、医薬組成物。
  18. 対象における免疫応答を調節する方法であって、請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与する事を含む、方法。
  19. 免疫疾患またはがんの、処置または予防のための医薬の製造における、請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
  20. 対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、治療有効量の請求項１－１０の何れか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与し、腫瘍細胞の成長を阻害する事を含む、方法。
  21. 該腫瘍細胞が、メラノーマ、腎がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、および直腸がん、からなる群より選択されたがん細胞である、請求項２０に記載の方法。
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