TW201920282A

TW201920282A - 抗egfr和pd-1的雙特異性抗體

Info

Publication number: TW201920282A
Application number: TW107133918A
Authority: TW
Inventors: 卓智王; 競李
Original assignee: 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2019-06-01
Also published as: EP3688034A4; EP3688034A1; WO2019062755A1; US20200354460A1; CN109575139A

Abstract

本發明提供雙特異性抗體，其包含結合於EGFR的第一結合結構域及結合於PD-1的第二結合結構域，其中，該抗體或其抗原結合片段係選自由單鏈抗體(scFv)、雙抗體及上述形式的寡聚物組成之群中的形式。本發明亦提供本發明抗體的胺基酸序列、選殖或表現載體、宿主細胞、以及用於表現或分離抗體的方法。亦提供包含本發明抗體的治療組合物。本發明亦提供用雙特異性抗體治療癌症及其他疾病的方法。

Description

抗EGFR和PD-1的雙特異性抗體

本發明係關於一種雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一結合結構域及結合PD-1的第二結合結構域，其中，該抗體或其抗原結合片段係選自由單鏈抗體(scFv)、雙抗體及上述形式之寡聚物組成之群中的形式。此外，本發明提供一種編碼該抗體之聚核苷酸、包含該聚核苷酸的載體、宿主細胞、生產抗體的方法以及使用雙特異性抗體治療癌症、感染或其他人類疾病的免疫治療方法。

表皮生長因子受體(EGFR)在多種人類癌症中均過度表現。EGFR可由不同配位體激活。在此等配位體中，EGF係EGFR的高親和力配位體。EGF與EGFR胞外區結合誘導受體二聚化。EGFR亦可與ErbB受體之另一成員，如HER2，配對形成異源二聚體。EGFR二聚化刺激其內在激酶活性以及EGFR在幾個位點隨後之磷酸化。該磷酸化誘導下游激活及信號傳遞，且進一步啟動一些信號轉導通路，主要為MAPK、Akt及JNK通路，從而導致DNA合成及細胞增殖。整個EGF/EGFR通路誘導細胞分化、遷移、黏附及增殖。由於EGFR在多種人類腫瘤中過度表現，因此EGFR係靶向治療的重要靶點。

兩個EGFR靴向抗體，西妥昔單抗(Erbitux)及帕尼單抗(Vectibix)，己被美國食品藥物管理局批准用於治療結腸癌及頭頸部癌。此等抗體阻斷配位體與EGFR及下游信號之結合，介導抗腫瘤免疫反應。

程式性死亡蛋白1 (PD-1，CD279)係表現在活化的T細胞及其他免疫細胞上的CD28家族中的一個成員。PD-1的參與抑制此等免疫細胞之功能。PD-1有兩個已知配位體，PD-L1(B7-H1，CD274)及PD-L2(B7-DC，CD273)，兩者皆屬於B7家族。PD-L1表現在各種淋巴及外周組織細胞類型中可誘導，而PD-L2更侷限於髓系細胞包括樹突狀細胞。PD-1通路之主要作用為下調組織及器官中的炎症免疫反應。

研究發現，在腫瘤微環境中，癌細胞能夠藉由上調PD-1/PD-L1通路而產生免疫逃逸(Boussiotis 2016 N Engl J Med)。此機制尤其見於具有EGFR基因激活突變之腫瘤中。PD-1通路上調可為免疫逃逸的典型機制。作為證據，高PD-L1表現在EGFR突變的患者的腫瘤中發現(Azuma 2014 Ann Oncol; Ramalingam 2016 J Thorac Oncol)。

事實上，儘管己在肺癌中發現EGFR過量表現，但抗EGFR抗體尚未被批准用於肺癌治療。抗EGFR治療的初始效果經常受到此靶向治療的抵制而減弱，主要由EGFR突變所致。目前相比單獨靶向EGFR的腫瘤治療，尚未知曉靶向EGFR通路及PD-1/PD-L1通路是否可能提供更有效的治療。因此，本發明之目標為產生抗EGFR及PD-1雙特異性抗體且證明該抗體在癌症治療中提供一些優勢。首先，雙特異性抗體可用於肺癌治療，而抗EGFR抗體尚未被批准用於EGFR過量表現的此適應症。第二，雙特異性抗體可逆轉EGFR治療之耐藥性。同時與抗PD-1治療相比，雙特異性抗體可增加PD-L1及EGFR雙陽性的腫瘤的反應率。

本發明提供分離之抗體，尤其雙特異性抗體。

在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，包含結合於人EGFR之第一結合結構域及結合於人PD-1之第二結合結構域，其中，該抗體或其抗原結合片段包括選自由單鏈抗體(scFv)、雙抗體、及上述形式之寡聚物組成之群中的形式。

在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段係選自由單鏈抗體 (scFv)、雙抗體、及上述形式的寡聚物組成之群中的形式。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該第二結合結構域結合於鼠源PD-1。

在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗EGFR的單鏈抗體。

在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗PD-1的單鏈抗體。

在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗EGFR的單鏈抗體及抗PD-1的單鏈抗體。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段
a) 結合於人EGFR且親和常數K_D 為5.49E-10以下；且
b) 結合於人PD-1且親和常數K_D 為7.68E-09以下。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有以下性質中的至少一種：
a)結合於人EGFR且K_D 在5.45E-10至5.49E-10之間，且
b)結合於人PD-1且Kd在1.98E-09至7.68E-09之間。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包括：
包含第一結合結構域的多肽鏈，該第一結合結構域包含抗EGFR的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)；
包含第二結合結構域的另一多肽鏈，該第二結合結構域包含抗PD-1的重鏈可變區及輕鏈可變區。

在一個實施例中，如前所述之抗體或其抗原結合片段，其中該第一結合結構域包含：
重鏈可變區，該重鏈可變區包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，其中
H-CDR3包含SEQ ID NO: 8所示之序列及其保守性修飾，H-CDR2包含SEQ ID NO: 7所示之序列及其保守性修飾，H-CDR1包含如SEQ ID NO: 6所示之序列及其保守性修飾；且
L-CDR3包含如SEQ ID NO: 11所示之序列及其保守性修飾； L-CDR2包含SEQ ID NO: 10所示之序列及其保守性修飾；L-CDR1包含如SEQ ID NO: 9所示之序列及其保守性修飾。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自SEQ ID NO : 1、2、3、4、5組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列係選自SEQ ID NO:1、2、3、4、5組成之群中的序列。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 1、3組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%的同源性；以及
b)第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO : 2、4、5組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%的同源性。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1、3組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 2、4、5組成之群中的序列。

在各種實施例中，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 2組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 3組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 2組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 4組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 5組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO : 3組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 4組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 3組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 5組成之群中的序列；
該抗體的序列如表1及序列表所示。
表1推導之抗體胺基酸序列

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 19、20、21、22、23組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 19、20、21、22、23組成之群中的序列。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 19、21組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 20、22、23組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 19、21組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 20、22、23組成之群中的序列。

在各種實施例中，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 19組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 20組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 21組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 20組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 19組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 22組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 19組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 23組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 21組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 22組成之群中的序列；
或者，如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 第二結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 21組成之群中的序列；以及
b) 第一結合結構域，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 23組成之群中的序列；
該抗體的序列如表3及序列表所示。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，包含互補決定區(CDR)，該互補決定區具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 6-18組成之群中的序列。

如前所述之抗體或其抗原結合片段，其中第二結合結構域包含：
重鏈可變區，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及
輕鏈可變區，其包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
其中該H-CDR3包含如SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳地，其中抗PD-1的L-CDR3包含如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳地，其中抗PD-1的H-CDR2包含如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳地，其中抗PD-1的L-CDR2包含如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳地，其中抗PD-1的H-CDR1包含如SEQ ID NO:12所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳地，其中抗PD-1的L-CDR1包含如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

在更佳的實施例中，前述抗體或其抗原結合片段，其中第二結合域包含：
包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的重鏈可變區；包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的輕鏈可變區，其中
a) 抗PD-1的H-CDR3包含如SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列及其保守性修飾；
b) 抗PD-1的L-CDR3包含如SEQ ID NO:17所示之胺基酸序列及其保守性修飾；
c) 抗PD-1的H-CDR2包含如SEQ ID N0:13所示之胺基酸序列及其保守性修飾；
d) 抗PD-1的L-CDR2包含如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列及其保守性修飾；
e) 抗PD-1的H-CDR1包含如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列及其保守性修飾；
f) 抗PD-1的L-CDR1包含如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列及其保守性修飾。

較佳的抗體或其抗原結合片段，其中第二結合結構域包含：
a) 包含SEQ ID NO: 12的H-CDR1；
b) 包含SEQ ID NO: 13的H-CDR2；
c) 包含SEQ ID NO: 14的H-CDR3；
d) 包含SEQ ID NO: 15的L-CDR1；
e) 包含SEQ ID NO: 16的L-CDR2；
f) 包含SEQ ID NO: 17的L-CDR3。

較佳的抗體或其抗原結合片段，其中第二結合結構域包含：
a) 包含SEQ ID NO: 12的H-CDR1；
b) 包含SEQ ID NO: 13的H-CDR2；
c) 包含SEQ ID NO: 18的H-CDR3；
d) 包含SEQ ID NO: 15的L-CDR1；
e) 包含SEQ ID NO: 16的L-CDR2；
f) 包含SEQ ID NO: 17的L-CDR3。

該抗體的CDR序列如表2及序列表所示。
表2抗體的CDR序列

在更佳的實施例中，抗體或其抗原結合片段，其中第一結合結構域包含：
a) 包含SEQ ID NO: 6的H-CDR1；
b) 包含SEQ ID NO: 7的H-CDR2；
c) 包含SEQ ID NO: 8的H-CDR3；
d) 包含SEQ ID NO: 9的L-CDR1；
e) 包含SEQ ID NO: 10的L-CDR2；
f) 包含SEQ ID NO: 11的L-CDR3。

本發明中的抗體可為嵌合抗體。

本發明中的抗體可為人源化抗體或全人抗體。

本發明中的抗體可為嚙齒類動物的抗體。

在另一態樣中，本發明提供一種核酸分子，該核酸分子編碼如前所述之抗體或其抗原結合片段。

本發明提供一種選殖或表現載體，該選殖或表現載體包含如前所述的核酸分子。

本發明提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含超過一個如前所述之選殖或表現載體。

在另一態樣中，本發明提供一種用於生產如前所述之抗體的方法，包括培養如前所述之宿主細胞，且分離該抗體。

在又一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，包含如前所述之抗體或其抗原結合片段，以及超過一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

本發明提供一種免疫偶聯物，包含連接至治療劑的如前所述之抗體或其抗原結合片段。

其中，本發明提供一種醫藥組合物，包含如前所述之免疫偶聯物及超過一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

本發明亦提供一種調節受試者之免疫反應的方法，包括向受試者施用如前所述之抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供如前所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於治療或預防免疫病症或癌症的藥物中的應用。

本發明亦提供一種抑制受試者的腫瘤細胞生長的方法，包括向受試者施用治療有效量的如前所述之抗體或其抗原結合片段，以抑制腫瘤細胞生長。

其中，該腫瘤細胞係選自由黑素瘤、腎癌、***癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌組成之群中的癌症的細胞。

發明的有益效果
抗EGFR及PD-1通路的雙特異性抗體可提供癌症治療的幾大好處。首先，雙特異性抗體可用於肺癌治療，而抗EGFR抗體尚未被批准用於此適應症，雖然EGFR的過度表現己在肺癌中的發現。第二，雙特異性抗體可逆轉EGFR治療的耐藥性。同時與抗PD-1治療相比，雙特異性抗體可增加PD-L1及EGFR雙陽性腫瘤的反應率。

相關申請的交叉引用
本申請主張2017年9月29日提交之PCT專利申請序列號PCT/CN2017/104584的權益及優先權，其全部內容以引用整體併入本文。

下面藉由具體實施方式及實驗資料對本發明作進一步的說明。儘管為了清楚的目的，在下文中使用專用術語，但此等術語不意謂著定義或限制本發明的範圍。

術語「程式性死亡蛋白1」、「程式性死亡受體1」、「程式性細胞死亡受體1」、「蛋白PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」、「CD279」及「hPD-F」可互換使用，且包括人PD-1的變體、亞型、物種同源物或其他物種的PD-1及具有PD-1的至少一個共同表位的類似物。

如本文中所使用，術語「抗體」包括完整抗體及任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」係指包含至少兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)且藉由二硫鍵相互連接之蛋白質，或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH及VL區可進一步細分成：稱為互補決定區(CDR)之高變區，以及穿插分佈的稱為構架區(FR)的更保守區域。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，自胺基末端至羧基末端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區包含與抗原相互作用之結合結構域。重鏈中的CDR縮寫為H-CDR，例如H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，輕鏈中的CDR縮寫為L-CDR，例如L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。

如本文中所使用，術語「抗體」係指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，且包括包含抗原結合位點之任何多肽，而不論其是否在活體外或活體內產生。該術語包括但不限於，多選殖、單選殖、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、以及嫁接的抗體。術語「抗體」亦包括抗體片段，例如scFv、dAb及其他保留抗原結合功能(即，與PD-1及EGFR特異性結合的能力)的抗體片段。通常情況下，此片段應包括抗原結合片段。

抗原結合片段通常包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，然而，其並非必須包括兩者。例如，所謂的Fd抗體片段僅由VH及CH1結構域組成，但仍保留完整抗體的一些抗原結合功能。

本文中所描述之術語「交叉反應性」係指對人類、猴、及/或鼠源(小鼠或大鼠)中相同靶分子之抗原片段的結合。因此，「交叉反應性」應理解為與在不同物種中表現的相同分子X的種屬間反應，而並非除X以外的分子。識別例如人PD-1與猴、及/或鼠(小鼠或大鼠)PD-1的單選殖抗體的交叉反應特異性可藉由例如FACS分析確定。

如本文所用，術語「受試者」包括任何人或非人動物。術語「非人動物」包括全部脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，如非人靈長類動物、羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。除非特別指出，術語「患者」或「受試者」可互換使用。

術語「治療」及「治療方法」係指治療性治療及預防性/預防措施。彼等需要治療者包括已有特定醫學病症的個體，以及彼等可能最終得到該病症的個體。

術語「保守性修飾」，即，不顯著影響或改變由核苷酸序列編碼的或包含胺基酸序列的抗體結合特性的核苷酸及胺基酸序列修飾。此類保守性序列修飾包括核苷酸及胺基酸的取代、添加及缺失。可藉由本此項技術己知之標準技術，如定點突變及PCR介導之突變將修飾引入序列。保守性胺基酸取代包括此取代，其中胺基酸殘基被具有相似側鏈之胺基酸殘基所取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術進行定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)，不帶電荷的極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)，非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、***酸、蛋胺酸)，β分支的側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

實施例：
實施例 1 實驗材料準備
1.抗原及基準抗體的產生
1.1產生可溶性抗原
編碼人EGFR (Uniport No.: P00533)、人PD-1 (Uniport No.: Q15116)、鼠PD-1 (Uniport No.: Q02242)、人PD-L1 (Uniport No.: Q9NZQ7)、鼠PD-L1 (Uniport No.: Q9EP73)的胞外結構域的序列的DNA是在生工生物工程(上海)股份有限公司合成的，接著次選殖至在C端具有不同標籤(例如6Xhis、人Fc或小鼠Fc)修飾的pcDNA3.3表現載體中。

用純化的表現載體pcDNA3.3轉染Expi293細胞(Invitrogen-A14527)。培養細胞5天，收集清液層，且使用Ni-NTA管柱(GE Healthcare, 175248)或蛋白A管柱(GE Healthcare, 175438)或蛋白G管柱(GE Healthcare, 170618)進行蛋白質純化。所獲得之人EGFR、人PD-1、小鼠PD-1、人PD-L1、小鼠PD-L1藉由SDS-PAGE及SEC進行質量控制，接著儲存於-80℃。

1.2生成基準(BMK)抗體
在生工生物工程(上海)股份有限公司合成編碼抗EGFR抗體西妥昔單抗的可變區的DNA序列(WBP336-BMK1)，接著次選殖至具有人IgGl或人IgG4恆定區的修飾的pcDNA3.3表現載體(S228P)。在用人PD-1及小鼠PD-1免疫大鼠後，內部產生抗PD-1抗體W3052-R2-2E5-uIgG4k，且轉化為IgG4 (S228P)形式。

將含有VH及VL基因的質粒共轉染入Expi293細胞。接著將細胞培養5天，收集清液層，使用蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare, 170618)進行蛋白質純化。使用SDS-PAGE及SEC評估獲得的抗體，接著儲存在-80℃。

2.細胞池/細胞系的產生
2 . 1 產生靶標表現細胞系
使用Lipofectamine 2000將含有編碼全長人PD-1或小鼠PD-1的基因的表現載體轉染至CHO-S或293F細胞中。將細胞在含有適當選擇標記的培養基中培養。藉由有限稀釋法獲得人PD-1高表現之穩定細胞系(WBP305.CHO-S.hProl.C6)及小鼠PD-1高表現的穩定細胞系(WBP305.293F.mProl.B4)。

將人EGFR、人EGFRvIII及食蟹猴(macaca fascicularis) EGFR的基因分別***表現載體pcDNA 3.3中。接著將質粒分別轉染至CHO-K1細胞中，如下所述。簡言之，在轉染前一天，將5×10⁵ 個CHO-K1細胞接種至6孔組織培養板的一個孔中，且在5% CO₂ 及37℃下溫育。向細胞中加入3 mL新鮮非選擇性培養基(F12-K，10%FBS)。在1.5 mL管中製備轉染試劑，其中將4 μg DNA與10 μg Lipofectamine 2000混合，使其在Opti-MEM培養基中的最終體積為200 μL。用移液管將管中的溶液逐滴加入細胞中。轉染6-8小時後，用PBS洗滌細胞，且加入3 mL新鮮的非選擇性培養基。轉染24-48小時後用胰蛋白酶收穫表現細胞，且接種於選擇性培養基(F12-K，10%FBS, 10 μg/mL殺稻瘟菌素)中的T75燒瓶中。經兩三次選擇，細胞用藻紅蛋白(PE)及抗PE微珠(Miltenyi-013-048-801)標記的抗EGFR抗體富集。藉由有限稀釋法分離穩定的單細胞純系，且使用抗EGFR抗體進行FACS篩選。

2 . 2 獲取且培養靶向表現的腫瘤細胞系
A431購自ATCC (ATCC號：CRL-1555)，且在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中培養。細胞在37℃、5% CO₂ 培養箱中進行常規傳代培養。對於長期儲存，將細胞在補充有5% (v/v) DMSO的完全生長培養基中冷凍且儲存在液氮氣相中。

實施例 2 ： 雙特異性抗體的產生
1 .構建表現載體
雙特異性抗體的構建：將編碼具有C末端人κ輕鏈的抗EGFR抗體的scFv (VH-(G4S)₃ -VL)的DNA序列選殖至修飾之pcDNA3.3表現載體中，將編碼具有C末端人IgG4 (S228P)重鏈恆定區的抗PD-1抗體4k的scFv (VH-(G4S)₃ -VL)的DNA序列選殖至修飾之pcDNA3.3表現載體中。

2. 優化雙特異性抗體(連接或定向等)
在原始構建的基礎上，吾人優化雙特異性抗體。將編碼具有C-端人類κ輕鏈的抗EGFR抗體的scFv (VL-(G4S)₃ -VH) DNA序列選殖至修飾之pcDNA3.3表現載體中；將編碼具有C端人IgG4 (S228P)重鏈恆定區的抗PD-1抗體的scFv (VL-(G4S)₃ -VH)的DNA序列選殖至修飾的pcDNA3.3表現載體中。

在抗EGFR抗體西妥昔單抗的可變區上鑑定兩個潛在的糖基化位點：一個位於輕鏈的FR2上，另一個位於重鏈的FR3上。為了除去位於抗EGFR抗體西妥昔單抗的可變區上的此等潛在的N-糖基化位點，基於此等位置上的種系序列進行幾個突變。LFR2上的RTNGS突變為RTDQS或KPDQS。HFS3上的QSNDT突變為QSEDT或RAEDT。產生之抗體的實例在表1中列出。

3. 小規模轉染、表現及純化
根據製造商的說明書，使用ExpiCHO表現系統套組(Thermo Fisher-A29133)將重鏈及輕鏈表現質粒共轉染至ExpiCHO細胞中。轉染10天後，收集清液層，且使用蛋白A柱(GE Healthcare-17543802)及體積排阻層析(SEC) (GEHealthcare-17104301)進行蛋白質純化。藉由Nano Drop測定抗體濃度。藉由SDS-PAGE及HPLC-SEC評估蛋白質的純度。表現及純化後獲得兩個雙特異性抗體，即W336-T1U2.G10-4.uIgG4.SP (dk)及 W336-TlU3.G10-4.uIgG4.SP (dk)。

4. 產生雙特異性抗體用於活體內研究(包括內毒素對照及偵測)
使用ExpiCHO系統套組(ThermoFisher-A29133)將WBP336B(W 336-TlU2.G10-4.uIgG4.SP(dk))或WBP336C (W336-TlU3.G10-4.uIgG4. SP(dk))表現質粒對共轉染至ExpiCHO細胞中。轉染後10天，收集上清液，且在控制內毒素的條件下使用蛋白A柱(GE Healthcare-17543802)及體積排阻層析(GE Healthcare-17104301)進行蛋白質純化。藉由使用內毒素偵測套組(GenScript-L00350)偵測內毒素含量，兩種雙特異性抗體的內毒素含量均小於10 EU/mgo藉由SDS-PAGE及HPLC-SEC評估蛋白質的純度。

5. 結果
5.1 候選序列
候選抗體序列在表3中列出，CDR在表4中列出。

表3.推導的雙特異性抗體胺基酸序列

表4. WBP336B及WBP336C的CDR序列

實施例 3 ：靶向 EGFR 及 PD-1 的可能機制
針對EGFR及PD-1的雙特異性抗體能夠改善抗腫瘤作用，吾人提出了三種可能的機制(圖2)。首先，該抗體能夠阻斷EGFR途徑，抑制腫瘤的增殖、遷移等。其次，該抗體能夠阻斷PD-1通路，恢復或改善T細胞的抗腫瘤功能。最後，該抗體能夠橋接腫瘤細胞及T細胞，容易改善抗腫瘤作用。此亦有助於在腫瘤微環境中蓄積抗PD-1抗體。

實施例 4 : 體外表徵
1. 蛋白質分析
兩個候選抗體由ExpiCHO細胞表現，接著使用蛋白A層析及體積排阻層析進行純化。如表5及圖3所示，兩種抗體具有合理的表現水準及高純度。
表5.雙特異性抗體的純化

2a. EGFR- 或 PD-1-結合 (ELISA及FACS)
為了鑑定兩種候選抗體之特徵，吾人用ELISA (圖4A)及FACS (圖4B)方法偵測其與PD-1之結合。在ELISA實驗中，將0.5 μg/mL人體PD-1蛋白WBP305-hProl.ECD.mFc在4℃下預包被於非組織培養處理的平底96孔板中。2% BSA封閉後，將100 μL濃度為25 nM至0.0001 nM的進行連續3倍稀釋抗體吸移至每個孔中，且在室溫下培育1小時。除去未結合之物質後，將HRP標記的山羊抗人IgG加入到孔中且培育1小時。藉由分配100 μL的TMB受質顯色，接著用100 μL 2N HCl終止。使用微孔板分光光度計在450 nm處讀取吸光度。

對於FACS結合，將工程改造的人PD-1表現細胞WBP305.CHO-S.hProl.C6以1 × 10⁵ 個細胞/孔接種在U底96孔板中。向細胞中加入83.3 nM至0.001 nM的連續3倍稀釋抗體。將板在4℃下培育1小時。洗滌後，將PE標記的山羊抗人抗體加入各孔中，且將板在4℃下培育1小時。藉由流式細胞儀偵測抗體與細胞之結合，且藉由FlowJo分析平均螢光強度(MFI)。

吾人亦藉由流式細胞法測定雙特異性抗體與EGFR表現細胞的結合。簡言之，將1 × 10⁵ 個A431 (EGFR+)細胞或食蟹猴EGFR過表現的穩定細胞系(WBP562-CHOKl.cProl.H6)在4℃下與EGFR×PD-1雙特異性或hIgG4同型對照抗體的系列稀釋液培育60分鐘。用補充有1%牛血清白蛋白(洗滌緩衝液)的冷PBS洗滌兩次後，在4℃下用螢光標記的抗人IgG抗體培育細胞30分鐘，偵測細胞表面結合的抗體。細胞在相同的緩衝液中洗滌兩次，使用FACS Canto II細胞儀(BD Biosciences)量測染色細胞的平均螢光(MFI)。使用不含抗體或僅含第二抗體的孔建立背景螢光。使用四參數非線性回歸分析，使用GraphPad Prism軟體獲得細胞結合的EC₅₀ 值。

在ELISA方法中，與其親本抗體(EC₅₀ = 0.031 nM)或WBP305-BMK1 (EC₅₀ = 0.024 nM)相比，WBP336B (EC₅₀ = 0.032 nM)及WBP336C (EC₅₀ = 0.024 nM)與PD-1結合的能力相當。FACS方法用於測試結合細胞表面PD-1與此等抗體的結合。WBP336B及WBP336C 以分別為1.29 nM及1.05 nM的EC₅ ₀ 結合於PD-1陽性細胞，略高於其親本抗體(0.78 nM)及BMK1 (0.87 nM)的EC₅₀ 。

使用相似的測定法來測試與EGFR的抗體結合(圖5A及5B)。將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)在4℃下用含有0.5 μg/mL抗原(EGFR-ECD, W562-hProl.ECD.his (sino))的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液包被隔夜。在用含有2% (w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封閉1小時後，使用含有2%牛血清白蛋白的PBS對不同EGFFXPD-1雙特異性抗體進行不同稀釋度的系列稀釋，在室溫下在板上培育2小時。培育後，將板每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌三次。加入100 ng/mL山羊抗人IgG Fc-HRP (Bethyl, #A80-304P)且在室溫下培育1小時。每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌6次後，加入四甲基聯苯胺(TMB)受質(Sigma-860336-5G)進行偵測。經大約8分鐘後，每孔加入100 μL的2M HCl，反應終止。使用多孔板讀數器(SpectraMax® M5e)在450 nm處量測孔的吸光度。

在ELISA中，WBP336B及WBP336C結合於人EGFR的EC₅₀ 分別為0.035 nM及0.029 nM，與西妥昔單抗結合於EGFR的EC₅₀ = 0.023 nM相近。在細胞表面EGFR的結合中，WBP336B/C及西妥昔單抗之間的差異略大。使用A431細胞作為靶細胞，WBP336B及WBP336C與A431結合的EC₅₀ 分別為2.6 nM及1.4 nM，而西妥昔單抗結合於EGFR的EC₅₀ =0.5 nM。

2b. EGFR- 及 PD-1- 雙重結合 (ELISA 及 FACS)
為了測試雙特異性抗體是否可以同時結合PD-1及EGFR，開發了如下ELISA測定。在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中，在4℃下，用0.5 μg/mL抗原-1 (EGFR-ECD, W562-hProl.ECD.his (sino))包被96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)隔夜。用溶解2% (w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封閉1小時後，將含有2%牛血清白蛋白的PBS對不同的EGFR×PD-1雙特異性抗體進行不同稀釋度的系列稀釋，在室溫下在板上培育1小時。培育後，平板每孔用300 μL含有0.5% (v/v) 吐溫20的PBS洗滌三次。將0.1 μg/mL抗原-2 (PD-1-ECD, WBP305-hProl.ECD.hFc.Biotin)加入板中且培育1小時。洗滌板三次後，加入Streptavidin-HRP (Invitrogen, # SNN1004) (1:25000稀釋)，且在室溫下培育1小時。每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌6次後，加入四甲基聯苯胺(TMB)受質(Sigma-860336-5G)進行偵測。大約10分鐘後，藉由加入每孔100 μL的2M HCl終止反應。使用多孔板讀數器(SpectraMax®M5e)在450 nm處量測孔的吸光度。

如圖6a所示，兩個抗體能夠結合兩個靶標，EC₅₀ 分別為0.035 nM及0.028 nM。

藉由流式細胞術偵測EGFR×PD-1雙特異性抗體橋接兩個靶細胞的能力。用50 nM鈣黃綠素-AM (Invitrogen-C3099)或20 nM FarRed (Invitrogen-C34572)分別在37℃下標記1×10⁶ /mL EGFR⁺ A431細胞或PD-1⁺ CHOK-S細胞30分鐘，且用1%胎牛血清洗滌兩次。每種類型的細胞重新懸浮，接著以1:1的比例混合至1×10⁶ /mL的終濃度。將抗體加入至細胞中，接著緩慢混合且培育1小時。橋接百分比藉由同時標記的鈣黃綠素AM及FarRed的百分比計算。

如圖6b、c及d所示，與兩種單特異性抗體的聯合或同型對照抗體相比，雙特異性抗體可以使Far-Red及CAlcein-AM染色細胞群體顯著增加，證明雙特異性抗體確實將兩種細胞橋接在一起。

3.交叉物種結合(ELISA/FACS)
由於親本抗PD-1抗體能夠結合食蟹猴及鼠源靶點，因此研究兩種雙特異性抗體的交叉物種結合。在FACS測定中，偵測抗體與小鼠PD-1結合。簡言之，將工程化的表現小鼠PD-1的細胞WBP305.293F.mProl.B4以1×10⁵ 個細胞/孔接種在U底96孔板中。向細胞中加入133.3 nM至0.06 nM的3倍滴定抗體。4℃下培育1小時。洗滌後，將PE標記的山羊抗人抗體加入各孔中，且在4℃下培育1小時。通過流式細胞儀偵測抗體與細胞的結合，且藉由FlowJo分析平均螢光強度(MFI)。

ELISA方法用於偵測抗體與食蟹猴PD-1結合的能力。簡言之，將96孔板用0.5 μg/mL內部製造的食蟹猴PD-1蛋白WBP305-cPro1.ECD.his在4℃包被隔夜。2% BSA封閉後，將100 μL從25 nM至0.0001 nM的3倍滴定的抗體吸移到每個孔中，且在室溫下培育1小時。除去未結合的物質後，將HRP標記的山羊抗人IgG加入到孔中且培育1小時。藉由分配100 μL的TMB受質顯色，接著用100 μL 2N HCl終止。使用微孔板分光光度計在450 nm處讀取吸光度。

如圖7所示，與其親本抗體(EC₅₀ = 0.295 nM)相比，WBP336C (EC₅₀ =0.275 nM)相似地結合於食蟹猴PD-1，而WBP336B具有降低的結合活性(EC 50= 0.874 nM)。相比之下，WBP305-BMK1具有EC₅₀ = 0.132 nM的結合活性。

FACS用於測定雙特異性抗體與鼠PD-1的結合。如圖8所示，WBP336B及WBP336C分別具有EC₅₀ 為7.11 nM及4.47 nM的鼠PD-1結合能力，類似於其親本抗體的5.01 nM。相比之下，WBP305-BMK1完全不與鼠PD-1結合。

據報導，西妥昔單抗與食蟹猴EGFR結合，但不結合鼠源EGFR。因此，吾人僅測試結合食蟹猴EGFR的雙特異性抗體。如圖9所示，WBP336B及WBP336C結合EGFR，EC₅₀ 為0.75 nM及0.59 nM，而西妥昔單抗結合EGFR的EC₅₀ 為0.29 nM。

4. 雙特異性抗體的親和力
表面電漿共振(SPR)技術用於測定抗體對EGFR或PD-1的ECD的結合速率(on-rate constant) (ka)及解離速率(kd)，且由此確定親和常數(KD)。

Biacore T200系列S感測器晶片CM5，胺偶合套組及10×HBS-EP緩衝液購自GE Healthcare。山羊抗人IgG Fc抗體購自Jackson ImmunoResearch Lab (目錄號109-005-098)。在固定步驟中，藉由在注射前即刻混合400 mM EDC及100 mM NHS來製備活化緩衝液。CM5感測器晶片藉由活化緩衝液活化420秒。接著將10 μg NaAc (pH4.5)中的30 μg/mL山羊抗人IgGFcγ抗體以5 μL/min的流速注射至Fcl-Fc4通道中200秒。該晶片由1M乙醇胺-HCl (GE)去活化。接著將抗體捕獲在晶片上。簡言之，將操作緩衝液(HBS-EP+)中的4 μg/mL抗體以10 μL/分鐘的流速分別注射至Fc3通道30秒。將EGFR或PD-1的分析物ECD及空白操作緩衝液的八種不同濃度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125及0.15625 nM)以30 μL/分鐘的流速順序注射至Fc1-Fc4通道，相關階段為120秒，接著為2400秒的解離階段。在每個解離階段之後，以10 μL/分鐘的速度注入再生緩衝液(10 mM甘胺酸，pH 1.5) 30秒。

如表6所示，WBP336B及WBP336C均以高親和力結合於PD-1及EGFR。其與hPD-l結合的K_D 分別為8 nM及2 nM，高於其親本抗體的0.65 nM。高K_D 主要由快kd的貢獻，而ka無顯著變化。與其親本抗體西妥昔單抗相比，其與EGFR之結合無變化。
表6

5. 基於競爭的功能測定 ( 例如配位體競爭測定 )
吾人使用不同的測定法研究雙特異性抗體之功能。

首先，此等抗體能夠在基於ELISA之競爭實驗中阻斷PD-1與PD-L1的結合，如圖10a所示。WBP336B及WBP336C的IC₅₀ 分別為0.454 nM及0.352 nM，與其親本抗體305B (IC₅₀ = 0.524 nM)相近。雙特異性抗體的增加的效力可能由於其比習知IgG更大的尺寸，藉由空間阻礙提高阻斷作用。

亦基於FACS的競爭測定用於評估細胞表面PD-1上的雙特異性抗體。簡言之，1×10⁵ 個A431 (EGFR+)細胞在4℃下與系列稀釋的EGFR×PD-1雙特異性或hIgG4同型對照抗體以及0.1 μg/mL生物素標記的EGF (Life Technology, #E3477, W562-hLl-生物素)進行培育60分鐘。用補充有1%牛血清白蛋白的冷PBS (洗滌緩衝液)洗滌兩次後，藉由在4℃下將細胞與鏈黴親和素PE (Affymetrix, # 12-4317-87)培育30分鐘來偵測細胞表面結合的抗體。細胞在相同的緩衝液中洗滌兩次，使用FACS Canto II細胞儀(BD Biosciences)量測染色細胞的平均螢光(MFI)。使用不含抗體或僅含第二抗體的孔建立背景螢光。使用四參數非線性回歸分析，使用GraphPad Prism軟體獲得細胞結合的IC₅₀ 值。

如圖10b所示，雙特異性抗體在阻斷PD-1與PDL1結合上具有與其親本抗體305B以及WBP305-BMK1相似的作用。WBP336B、WBP336C、305B及WBP305-BMK1的IC₅₀ 分別為1.12 nM、0.79 nM、0.68 nM及0.90 nM。雙特異性抗體及其親本抗體亦可阻斷鼠PD-1/PDL1的相互作用，如圖10c所示。WBP336B、WBP336C、305B的IC₅₀ 分別為31.77 nM、18.73 nM及16.78 nM。抗體阻斷鼠PD-1比阻斷人PD-1的效力低，可能由於其對小鼠PD-1的親和力低於對人PD-1的親和力。

雙特異性抗體亦可阻斷EGF/EGFR相互作用。如圖11所示，WBP336B、WBP336C及WBP336-BMK1分別阻斷EGF與EGFR的結合，IC₅₀ 分別為1.62 nM、1.44 nM及1.01 nM，表明雙特異性抗體保持其針對EGFR的效力。

6.基於細胞的功能測定
幾種基於細胞的測定用以評估雙特異性抗體的功能。同種異體混合淋巴細胞反應(MLR)用於測定評估抗PD-1的功能。簡言之，將純化的CD4+ T細胞與未成熟或成熟的同種異體DC (iDC或mDC)共同培養。使用完整的RPMI-1640培養基在96孔圓底板中建立MLR。將CD4+ T細胞、各種濃度的抗體及突觸狀細胞加入板中。將板在37℃、5% CO₂ 下培育。分別在第3天及第5天測定IL-2及IFN-γ的產生。細胞在第5天收穫以藉由³ H-TDR量測CD4+ T細胞的增殖。

如圖12a及12b所示，WBP336B及WBP336C以與抗PD-1抗體相似的劑量依賴性方式改善IL2及INFγ釋放。

吾人亦測試抗體在A431細胞中阻斷EGFR磷酸化的能力。簡言之，將A431細胞進行胰蛋白酶消化，且稀釋至5×10⁵ 個細胞/mL。接著將100 μL細胞懸浮液加入96孔透明的平底微孔板(Corning-3599)的每個孔中，得到5×10⁴ 個細胞/孔的最終密度。使A431細胞附著約18小時，接著將培養基更換為不含胎牛血清的饑餓培養基。將所有板在37℃下培育隔夜，接著用適當濃度的EGFR×PD-1雙特異性抗體、EGFR單選殖抗體或具有200 ng/mLEGF (Sino Biological-10605-HNAE)的hIgG對照抗體在37℃下培養2小時。緩慢吸出所有培養基，用冰冷的DPBS (GE-Healthcare-SH30028)洗滌細胞。藉由加入110 μL/孔的補充有10 μg/mL抑肽酶(ThermoProd78432)及亮肽素半硫酸鹽(Santa Cruz Biotechnology-SC-295358)的冰冷裂解緩衝液(R&D System-DYC002)將細胞裂解，且在冰上培育15分鐘。將所有裂解物儲存在-80℃。

使用ELISA測定法偵測磷酸化的EGFR。在室溫下將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)用8 μg/mL人EGFR捕獲抗體(R&D Systems-DYC1095B)包被隔夜。將板用洗滌緩衝液洗滌三次，且在室溫下用溶解1% (w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封閉1小時。接著收集細胞裂解物，且在4℃下以2000 g旋轉5分鐘以除去細胞碎片。將100 μL清液層加入每個孔中，且將板在室溫下培育2小時。培育後，每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌三次。抗磷酸酪胺酸-HRP (R&D Systems-DYC1095B)用來偵測磷酸化的EGFR。每孔用洗滌緩衝液洗滌三次。每孔加入100 μL的受質混合物(R&D Systems-DY999)進行偵測。大約10分鐘後，每孔藉由加入250 μL的 2M HCl來終止反應。使用多孔板讀數器(SpectraMax®M5e)在450 nm量測孔的吸光度。使用四參數非線性回歸分析，使用GraphPad Prism軟體獲得EGFR磷酸化抑制的IC₅₀ 值。

如圖13所示，抗體亦可以劑量依賴的方式抑制A431細胞中EGFR的磷酸化。然而，雙特異性抗體在抑制EGFR磷酸化中顯示比其親本抗體西妥昔單抗低的有效性，包括較低的最大抑制率及較高IC₅₀ (WBP336B，WBP336C及西妥昔單抗分別為21.8 nM、21.9 nM及8.1 nM)。雙特異性抗體的此性質可降低西妥昔單抗的皮膚毒性(Liporini C 2013, J Pharmacol Pharmacother)。

7.對EGFR+細胞及PD-1+細胞的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)及補體介導的細胞毒作用(CDC)測定
測試雙特異性抗體WBP336B及WBP336C對於EGFR+ A431及HCC827細胞介導ADCC作用。亦在EGFR+細胞上測試抗體依賴性細胞介導的細胞毒性及補體依賴性細胞毒性。藉由Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, # 17-1440-03)密度離心，自肝素化靜脈血中新鮮分離人外周血單核細胞(PBMC)，接著在完全培養基中培養隔夜(RPMI1640，補充有10% FBS，100 U/mL青黴素，100 μg/mL鏈黴素)。簡言之，在ADCC測定當天，將EGFR表現的靶細胞A431及HCC827 ( 2×10⁴ /孔)與效應細胞(PBMC/靶細胞比例為20:1)及系列稀釋的抗體或hIgG同型對照在37℃下完全培養4小時。培育後，將板離心，將清液層轉移至透明底部的96孔板(Coming，#3599)，且向每個孔中加入反應混合物(Roche，#116447930，細胞毒性反應套組)且培育15分鐘。加入終止溶液後，用M5e讀板，測定樣品在492 nm及600 nm處的吸光度。

使用以下等式計算細胞毒性百分比：
%細胞毒性=(樣品-效應細胞對照-靶細胞對照)/(靶細胞裂解-靶細胞對照)×100%
對於CDC測定，將EGFR表現的靶細胞A431及HCC827 (2×10⁴ 細胞/孔)用100 μL人正常血清(最終1:50稀釋)(Quidel，#A113)及系列稀釋的抗體或hIgG同型對照在37℃完全培養2小時。培育後，將板離心，將清液層轉移至透明底部的96孔板(Coming，#3599)，且向每個孔中加入反應混合物(Roche，#116447930，細胞毒性反應試劑盒)且培育15分鐘。加入終止溶液後，用M5e讀板，測定樣品在492 nm及600 nm處的吸光度。

使用以下等式計算細胞毒性百分比：
%細胞毒性=(樣品-靶細胞對照)/(靶細胞裂解-靶細胞對照)×100%
使用GraphPad Prism軟體測定細胞殺傷的IC₅₀ 值，其中使用四參數非線性回歸分析計算值。

如圖14所示，IgG4同型中的雙特異性抗體對兩種腫瘤細胞系不誘導ADCC作用。雙特異性抗體的此性質可減少或避免西妥昔單抗的皮膚毒性(Liporini C 2013，J Pharmacol Pharmacother)。兩種腫瘤細胞系亦用於測試兩種抗體的CDC效應。如圖15所示，雙特異性抗體以及西妥昔單抗未觀察到CDC的作用。

同樣，吾人亦測試PD-1陽性細胞上的ADCC及CDC。為了測試ADCC效應，將活化的人CD4+ T細胞或工程改造的人PD-1表現細胞WBP305.CHO-S.hProl.C6及各種濃度的PD-1抗體在96孔板中預培養30分鐘，接著以20:1的效應物/靶標比例加入新鮮分離的PBMC。將板在5% CO₂ 培養箱中在37℃下保持4小時。藉由基於LDH的細胞毒性檢測套組測定靶細胞裂解。使用微孔板分光光度計在492 nm下讀取吸光度。

對於PD-1陽性細胞的CDC，將活化的人CD4+ T細胞或工程化的人PD-1表現細胞WBP305.CHO-S.hProl.C6及各種濃度的PD-1抗體在96孔板中混合。以1:50的稀釋比加入人補體。將板在5% CO₂ 培養箱中在37℃下保持2小時。靶細胞裂解由CellTiter-Glo試劑測定。

活化的人CD4⁺ 細胞及工程化的PD-1⁺ 細胞均用作靶細胞。如圖16及17所示，兩種雙特異性抗體對PD-1+細胞無誘導顯著的ADCC或CDC作用。

8.與PD-1及EGFR的旁系同源物的結合
為了測試兩種雙特異性抗體的特異性，測試其與PD-1及EGFR的旁系同源物結合。在4℃下，將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)在含有0.5-1 μg/mL CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、HER2-ECD或HER3-ECD的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中用包被隔夜。在用含有2% (w/v)牛血清白蛋白(Pierce)的PBS封閉1小時後，使用含有2%牛血清白蛋白的PBS系列稀釋EGFR×PD-1雙特異性抗體或陽性對照抗體，且在室溫下在板上培育2小時。培育後，將平板每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌三次。加入濃度為100 ng/mL的山羊抗人IgG Fc-HRP (Bethyl，#A80-304P)，且在室溫下培育1小時。每孔用300 μL含有0.5% (v/v)吐溫20的PBS洗滌6次後，加入四甲基聯苯胺(TMB)受質(Sigma-860336-5G)進行偵測。大約8分鐘後，每孔加入100 μL的2M HCl，終止反應。使用多孔板讀數器 (SpectraMax®M5e)在450 nm量測孔的吸光度。用內部製備的1.0 μg/mL 的人CD28 ECD.mFc (20368)、人CTLA4 ECD.his、人ICOS ECD.mFc (20374)及人PD-1預包被非組織培養處理的平底96孔板，4℃隔夜。2% BSA封閉後，將100 μL自20 nM開始進行10倍連續稀釋的抗體吸移至每個孔中，且在室溫下培育1小時。除去未結合的抗體後，將HRP標記的山羊抗人IgG加入到孔中且培育1小時。藉由分配100 μL的TMB受質顯色，接著用100 μL 2N HCl終止。使用微孔板分光光度計在450 nm處讀取吸光度。

如圖18所示，兩種抗體不結合CD28、CTLA-4或ICOS、PD-1的旁系同源物。抗體亦不結合Her2或Her3、EGFR的旁系同源物(圖19)。

9. 非特異性結合 (ELISA/FACS)
測試抗體與無關蛋白(ELISA)或不同細胞系(FACS)的結合。FACS及ELISA偵測均用於偵測抗體是否結合其他靶標。在ELISA測定中，測試了測試抗體、同型對照抗體與不同蛋白質(包括因子VIII、FGFR-ECD、PD-1、CTLA-4.ECD、HER3.ECD、OX40.ECD、4-1BB.ECD、CD22.ECD、CD3e.ECD、Agl.E及XAg.ECD)的結合。Agl.E及XAg是未揭示的蛋白質。在4℃下，將幾個96孔板(Nunc-Immuno Plate，Thermo Scientific)用個別抗原(2 μg/mL)包被隔夜。用含有2% BSA的PBS封閉1小時後，用300 μL的PBST洗滌3次。將測試抗體以及同型對照抗體在含有2% BSA的PBS中稀釋至10 μg/mL，接著加入板中且在室溫下培育2小時。用300 μL的PBST洗滌3次後，將HRP偶合之山羊抗人IgG抗體(2% BSA中1:5000稀釋)加入板中，室溫培育1小時。最後，將板用300 μL的PBST洗滌6次。藉由分配100 μL的TMB受質12分鐘顯色，接著用100 μL的2M HCl終止。使用微板分光光度計量測450 nm的吸光度。

在FACS測定中，不同的細胞系(Ramos、Raji、MDA-MB-453、BT474、Jurkat、Hut78、A431、A204、CaLu-6、A375、HepG2、BxPC-3、HT29、FaDu、293F、CHO-K1)被調整為每孔1×10⁵ 個細胞。將測試抗體及同型對照抗體在含有1% BSA的PBS中稀釋至10 μg/mL，且與細胞在4℃培育1小時。細胞用180 μL的含有1% BSA的PBS洗滌兩次。將PE偶合的山羊抗人IgG Fc片段(Jackson，目錄號109-115-098)在含有1% BSA的PBS中稀釋至5 μg/mL的終濃度，接著加入以再懸浮細胞，且在4℃避光培育30分鐘。用180 μL含有1% BSA的PBS進行另外的洗滌步驟，接著在4℃下以1500 rpm離心4分鐘。最後，將細胞重新懸浮於100 μL含有1% BSA的PBS中，且藉由流式細胞術(BD Canto II)量測螢光值，且藉由FlowJo進行分析。

如表7所示，如預期的那樣，在所測試的蛋白質中，WBP336B及WBP336C僅與PD-1結合。其不與其他蛋白質結合，包括PD-1的接近的家族成員CTLA-4。

在FACS測定中，測試WBP336B及WBP336C在不同細胞系上的結合。如表8所示，兩種抗體結合於具有高水準EGFR表現的細胞系A431、CaLu-6、BxPC-3、HT29及FaDu。其亦弱結合至具有中等EGFR表現的細胞系BT474、A375、HepG2及293F。其不結合Ramos、Raji、MDA-MB-453、Jurkat、Hut78及CHO-K1。

總體而言，非特異性結合試驗表明WBP336B及WBP336C特異性結合EGFR及PD-1。

表7.在ELISA中雙特異性抗體結合於不同蛋白
表8.在FACS中雙特異性抗體結合於不同蛋白(MFI值)

10 . 熱穩定性
差式掃描螢光法(DSF)用於量測雙特異性抗體的熱穩定性。使用7500 Fast Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)進行DSF測定。簡言之，將19 μL的雙特異性抗體溶液與1 μL 62.5倍SYPRO橙色溶液(TheromFisher-S6650)混合且加入至96孔板中。以2℃/分鐘的速度將板自26℃加熱至95℃，且收集所得的螢光資料。藉由其操作軟體自動分析資料，且藉由釆用所得螢光資料的相對於溫度的負導數的最大值來計算T_h 。T_on 可粗略地確定為負導數圖自轉變前的基線開始減少的溫度。

如表9及圖20所示，兩種抗體在57℃具有相似的Thl。

表9.雙特異性抗體的DSF資料

11. 血清穩定性
將雙特異性抗體與人血清培育長達14天，且不時測試其與PD-1及EGFR的結合。將新鮮收集的人血液在不含抗凝血劑的聚苯乙烯管中在室溫下靜置培育30分鐘。在4000 rpm離心血液10分鐘後收集血清。重複離心及收集步驟直至血清澄清。將抗體在37℃下與血清緩慢混合14天，且在指定的時間點抽取等分測試樣品：0天、1天、4天、7天及14天，將等分測試樣品在液氮中快速冷凍，且在-80℃儲存直至使用。樣品用於藉由FACS評估其對EGFR+ A431及工程化的PD-1+ CHO細胞的結合能力。如圖21及22所示，其與PD-1及EGFR的結合隨時間無顯著變化，表明雙特異性抗體在人血清中穩定至少14天。

12. 壓力測試
使用Micro Float-A-Lyzer®透析裝置(8-10 kD，光譜/孔)將WBP336B (W336-TlU2.G10-4.uIgG4.SP (dK))、WBP336C(W336-TlU3.G10-4.uIgG.4SP (dK))、抗EGFR抗體(WBP336-hBMKl.IgG1)及抗-PD-1抗體交換至20 mM Tris，150 mM NaCl，pH8.5緩衝液中，且使用超濾過濾器(Amicon超離心過濾器，30K截留分子量(MWCO)，0.5 mL，Merck Millipore Crop)進一步濃縮至1 mg/mL。使用Uv-Vis分光光度計(NanoDrop 2000 Spectrophotometer，Thermo Scientific Inc.)進行抗體的定量。將抗體在37℃下培育，且在培育5天後取出，以藉由表面電漿共振(SPR)分析靶結合。藉由SPR (ProteOn XPR36，Bio-Rad Laboratories，Inc)量測抗體與兩種抗原(PD1.ECD.his及EGFR.ECD.his)之間的相互作用。將每種抗體捕獲至固定在GLM生物感測器晶片(Bio-Rad Laboratories，Inc)上的抗人Fc IgG (Jackson，目錄號：109-005-098)表面上。測定在25℃下用1×PBST作為操作及稀釋緩衝液進行。對於120秒的締合相，以100 μL/分鐘的流速注射1:5 系列稀釋的W305-hProl.ECD.His 溶液(20、10、5、2.5及1.25 nM)及操作緩衝液，隨後進行400秒的解離。藉由18 s注射10 mM甘胺酸(pH1.5)達到晶片表面的再生。再生後，對於120秒的締合相，以100 μL/分鐘的流速注射1:5系列稀釋的W562-hPro1.ECD.his溶液(20、10、5、2.5及1.25 nM)及操作緩衝液，接著進行1200秒的解離。藉由18 s注射10 mM甘胺酸(pH1.5)達到晶片表面的再生。

由於在WBP336B及WBP336C上存在潛在的PTM位點(表3)，所以測試此等抗體對高pH及高溫條件的抗性。將此等抗體在pH 8.0及37℃下培育5天，且使用SPR測定其與PD-1及EGFR的結合。

如表10及11所示，其在高pH及高溫條件下對PD-1或EGFR的結合無變化，表明無顯著的PTM或PTM未改變其與靶標的結合活性。
表10. PD-1的抗體結合
表11.EGFR的抗體結合

13.顆粒酶B測定
活體外顆粒酶B測定試驗中，表現EGFR的A431靶細胞(5×10³ 細胞/孔，50 μL)與PBMC或CD8 + T細胞(1×10⁵ 細胞/孔，50 μL，被25 ng/mL PMA及50 ng/mL離子黴素Ionomycin激活)混合在一起培養7天，且在100 μL完全培養基中用抗體或hIgG同種型對照在37℃下培養24小時。培育後，將板離心且將清液層轉移至透明底96孔板(Coming，#3799)。將細胞重懸於含有10 μg/mL抑肽酶及10 μg/mL亮肽素的100 μL的裂解緩衝液(R&D, Cat： DYC002)中，且置於冰上20分鐘。在偵測顆粒酶B之前，將樣品以約10000 g離心5分鐘且收集細胞裂解物。將來自8000 pg/mL至15.36 pg/mL的雙倍滴定標準品，稀釋的清液層及稀釋的細胞裂解物以100 μL/孔加入ELISA板中。在37℃溫育1.5小時後，每孔加入100 μL生物素化的抗人粒酶B抗體，且在37℃溫育1小時。將板洗滌3次且製備100 μL抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物工作溶液至每個孔中。在37℃溫育30分鐘後進行另外5次洗滌步驟。在停止TMB顯色後30分鐘內使用酶標儀量測450 nm處的吸光度。

雙特異性抗體WBP336B/WBP336C增加顆粒酶B分泌的結果顯示在圖23中。與抗EGFR抗體、抗PD-1抗體及同種型對照相比，雙特異性抗體WBP336B或WBP336C可促進顆粒酶B的分泌。

實施例5 :體內表徵
1. A431 異種移植小鼠模型的療 效
在補充有15%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素的1640培養基中，將A431腫瘤細胞(ATCC，Manassas，VA，cat #CRL-1555)在5% CO₂ 空氣環境下37℃活體外培養為單層培養物。腫瘤細胞每週常規傳代培養兩次。收穫以指數生長期生長的細胞且計數後進行腫瘤接種。

從健康供體的全血中收集PBMC，且使用分離血液層的親水性多糖1.077 Ficoll (GE Healthcare公司，GE Healthcare)提取。梯度離心將血液分離成血漿的頂層，隨後是PBMC層，以及多形核細胞及紅細胞的底部部分。接種之前，將新鮮分離的PBMC與用絲裂黴素(mytomycin)處理的A431共培養72小時，接著與E:T比為1:3的未處理的A431混合。

將每隻小鼠在右側腹部皮下接種含有A431腫瘤細胞(5×10⁶ )的0.2 mL PBS，該A431腫瘤細胞使用或不使用PBMC (1.67×10⁶ )共培養3-4天，以促進腫瘤發生。當腫瘤接種後第3天平均腫瘤大小達到約60 mm³ 時開始治療。根據實驗設計表中所示之預定方案，確定每組的小鼠數目及施用測試品的小鼠數目。

關於動物處理、護理及研究相關的所有程序均按照實驗動物護理評估與認證協會(AAALAC)的指導及按照藥明康德(WuXi AppTec)機構動物保護使用委員會(IACUC)批准的指導原則進行。在日常監測時，每天根據協議中該檢查動物對腫瘤生長及治療對正常行為(如移動性、食物及水消耗(僅藉由查看)、體重增益/損失(體重每週量測兩次)、眼睛/頭髮纏結(matting))的任何影響以及任何其他異常效果。基於每個子集中的動物數目，記錄死亡及觀察到的臨床症狀。

主要終點是觀察腫瘤生長是否可延遲或小鼠是否可治癒。使用卡尺在兩個維度中每週量測兩次腫瘤大小，且體積以mm³ 表示，使用下式：V = 0.5 a×b² ，其中a及b分別是腫瘤的長及短直徑。T/C值(百分比)表示抗腫瘤效果。

對於每組使用下式計算TGI: TGI (%) = [1- (Ti-T0) / (Vi-V0)]×100，其中Ti是治療組在給定日的平均腫瘤體積，T0是治療開始當天治療組的平均腫瘤體積，Vi是與Ti相同天的載體對照組的平均腫瘤體積，V0是治療開始當天的載體組的平均腫瘤體積。

統計分析
在每個時間點為每組的腫瘤體積提供總結統計，包括平均值及標準誤差(SEM)。對最終劑量後(藥物開始後第28天)最佳治療時間點獲得的資料進行組間腫瘤體積差異的統計分析及藥物相互作用分析。

進行單因素方差分析，以比較各組之間的腫瘤體積，接著進行Dunnett t檢驗的post-hoc多重比較(均與IgG組比較)。所有資料使用SPSS 17.0進行分析。認為p＜0.05具有統計學顯著意義。

表12.腫瘤生長抑制
注：
a. 平均值± SEM.
b. 腫瘤生長抑制藉由將治療組的組平均腫瘤體積除以對照組的組平均腫瘤體積來計算(T/C及TGI)。對於認為具有抗腫瘤活性的測試樣品，T/C必須在50%以下。
c. 基於腫瘤大小計算p值。

每週兩次向不同組的小鼠注射WBP336B或對照抗體。每週量測腫瘤三次，結果顯示在圖24中。基於第28天的腫瘤體積量測計算攜帶A431異種移植物的MiXeno人源化小鼠中的腫瘤生長抑制。與同種型對照(hIgG4)組相比，抗PD-1抗體組略微抑制腫瘤生長(p = 0.163)。相反，如表12中所分析的，抗EGFR (西妥昔單抗)組及WBP336B組完全誘導腫瘤消退(p=0.000)。結果表明WBP336B的抗EGFR活性完全抑制腫瘤生長。

2. MC38同系小鼠模型的療效
為了在體內測試雙特異性抗體的抗PD-1活性，由於雙特異性抗體與鼠PD-1的交叉反應性，吾人使用同系小鼠模型。

在37℃、5% CO₂ 空氣的環境中，MC38細胞作為單層培養物培養在補充有10%胎牛血清、2 mM L-穀胺醯胺、100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素的DMEM培養基中。藉由胰蛋白酶-EDTA處理將腫瘤細胞每週常規地傳代培養兩次。收穫生長在指數生長期的細胞且計數後進行腫瘤接種。

將每隻小鼠右側腋下(外側)皮下接種0.1 mL含有MC38腫瘤細胞 (3×10⁵ )的PBS用於腫瘤發生。當平均腫瘤體積達到79 mm³ 時，對動物隨機分組，接著開始療效研究。

關於動物處理、護理及研究相關的所有程序均按照實驗動物護理評估與認證協會(AAALAC)的指導及按照藥明康德(WuXi AppTec)機構動物保護使用委員會(IACUC)批准的指導原則進行。在日常監測時，每天根據協議中該檢查動物對腫瘤生長及治療對正常行為(如移動性、食物及水消耗(僅通過查看)、體重增益/損失(體重每週量測兩次)、眼睛/頭髮纏結(matting))的任何影響，以及任何其他異常效果。基於每個子集中的動物數目，記錄死亡及觀察到的臨床症狀。

主要終點是觀察腫瘤生長是否可延遲或小鼠是否可治癒。使用卡尺在兩個維度中每週量測兩次腫瘤大小，且體積以mm³ 表示，使用下式：V = 0.5a ×b ² ，其中a及b分別是腫瘤的長及短直徑。腫瘤大小用於計算T/C (%)值。T/C值(百分比)表示抗腫瘤效果，T及C分別是治療組及對照組在給定日的平均體積。

對於每組使用下式計算TGI：TGI (%) = [ 1 - (Ti-T0) / (Vi-V0) ] × 100，其中Ti是治療組在給定日的平均腫瘤體積，T0是治療開始當天治療組的平均腫瘤體積，Vi是與Ti相同天的載體對照組的平均腫瘤體積，V0 是治療開始當天的載體組的平均腫瘤體積。

在每個時間點為每組的腫瘤體積提供總結統計，包括平均值及標準誤差(SEM)。對最終劑量後(藥物開始後第14天)最佳治療時間點獲得的資料進行組間腫瘤體積差異的統計分析及藥物相互作用分析。

進行單因素方差分析以比較各組之間的腫瘤體積，且當獲得顯著的F-統計學(治療方差與誤差方差的比率)時，藉由Games-Howell檢驗進行組間比較。對於兩組之間的比較，使用Mann-Whitney檢驗。所有資料均採用SPSS 17.0及prism 5進行分析，p ＜0.05被認為具有統計學顯著意義。

結果如圖25所示。WBP336B及WBP336C均顯著抑制腫瘤生長(p ＜0.05)，WBP336B誘導腫瘤消退。由於抗人EGFR抗體不與小鼠EGFR結合，所以抗人EGFR抗體在該模型中未顯示出任何抗腫瘤作用，此表明雙特異性抗體的抗腫瘤作用主要由抗PD-1部位所提供。

3. A431/hPBMC 小鼠模型中的抗體生物分佈
3.1 細胞培養
將A431腫瘤細胞(ATCC，貨號#CRL-1555)作為單層培養物在活體外維持在1640培養基中，其中補充有15%熱滅活的胎牛血清，100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素，溫度為37℃。空氣中5% CO₂ 的氛圍。每週兩次對腫瘤細胞進行常規傳代培養。收穫在指數生長期生長的細胞且計數腫瘤接種。

3.2外周血單核細胞 ( PBMC) 提取
自健康供體捐贈的全血中收集PBMC，且使用分離血液層的親水性多糖1.077 Ficoll (GE Healthcare公司，GE Healthcare)提取。梯度離心將血液分離成頂層血漿，接著是一層PBMC及多形核細胞及紅細胞的底部部分。

3.3 MiXeno皮下移植物模型的腫瘤及 PBMC接種
在第0天，每隻小鼠在右側皮下接種A431腫瘤細胞(5×10⁶ )。當平均腫瘤大小達到約50 mm³ 時，PBMC (3×10⁶ )在0.2 mL PBS中靜脈注射注入每隻小鼠。當平均腫瘤大小達到約600 mm³ 時開始治療。根據預定方案將每組及測試物品的小鼠數目給予小鼠，如下面的實驗設計表所示。

3.4實驗設計表
表13.實驗設計

3.5 觀察
所有與動物處理，護理及研究中的治療相關的程序均按照Wuxi AppTec動物護理及使用委員會(IACUC)批准的指南進行，且遵循實驗動物管理評估及認證協會的指導(AAALAC)。在常規監測時，每天檢查動物腫瘤生長及治療對正常行為的影響，例如活動性、食物及水消耗(僅藉由觀察)、體重增加/減少(體重每週量測兩次)、眼/毛髮墊及協議中規定的任何其他異常效果。根據每個子集內的動物數目記錄死亡及觀察到的臨床症狀。

3.6 樣品在不同時間點收集及準備
在抗體注射後，在48小時、72小時、及6天的時間點收集血液及組織樣品。收集腫瘤及肝臟樣品以藉由IHC測試抗體。在收集組織樣本之前，使用PBS灌注移除組織中的血液。將大約60-90 mg腫瘤及肝臟樣品包埋在OCT中用於IHC染色。

3.7 結果
如表14所示，同型對照、抗PD-1抗體在肝臟及腫瘤組織中具有相似的IHC評分。而抗EGFR抗體及雙特異性抗體WBP336B/C在腫瘤中的IHC評分高於肝組織。結果表明，雙特異性抗體優先分佈於腫瘤組織中。
表14

圖1示出測試的雙特異性抗體的示意圖。

圖2示出雙特異性抗體靶向EGFR及PD-1的可能機製圖。

圖3示出純化之WBP336B (a)及WBP336C (b)的體積排阻層析圖。

圖4示出ELISA (a)及FACS (b)中雙特異性抗體與人PD-1的結合。

圖5示出ELISA (a)及FACS (b)中雙特異性抗體與人EGFR的結合。

圖6示出ELISA (a)及FACS (b、c、d)中雙特異性抗體與人EGFR及PD-1的雙重結合。

圖7示出ELISA中雙特異性抗體與食蟹猴(cynomolgus) PD-1的結合。

圖8示出FACS中雙特異性抗體與小鼠PD-1的結合。

圖9示出FACS中雙特異性抗體與食蟹猴EGFR的結合。

圖10示出ELISA (a)及FACS (b，c)中，雙特異性抗體阻斷人或小鼠PD-1與PDL1的結合。

圖11示出FACS中雙特異性抗體能夠阻斷人EGF與EGFR的結合。

圖12a及b示出人MLR試驗中的IL2及IFNγ釋放。

圖13示出在A431中雙特異性抗體抑制EGFR磷酸化。

圖14示出雙特異性抗體對EGFR+腫瘤細胞的ADCC作用。

圖15示出雙特異性抗體以及西妥昔單抗的CDC效應。

圖16 a及b示出雙特異性抗體對PD-1陽性細胞的ADCC效應。

圖17 a及b示出雙特異性抗體對PD-1陽性細胞的CDC效應。

圖18 a至d示出兩種雙特異性抗體與CD28、CTLA-4或ICOS的結合能力。

圖19示出兩種雙特異性抗體對Her2或Her3的結合能力。

圖20示出兩種雙特異性抗體的熔融曲線。

圖21示出雙特異性抗體的PD-1結合在血清中14天後無損失。

圖22示出雙特異性抗體的EGFR結合在血清中14天後輕微損失。

圖23示出由雙特異抗體WBP336B、WBP336C、及對照抗體刺激細胞的顆粒酶B (Granzyme B)的分泌。

圖24示出WBP336B在動物模型中抑制A431腫瘤的生長。

圖25示出雙特異性抗體在MC38同基因小鼠模型中的抑制腫瘤生長的作用。

Claims

一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，包含結合於人EGFR的第一結合結構域及結合於人PD-1的第二結合結構域，其中，該抗體或其抗原結合片段包括選自由單鏈抗體(scFv)、雙抗體(diabody)及上述形式的寡聚物組成之群中的形式。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中，該第二結合結構域結合於鼠源PD-1。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗EGFR的單鏈抗體。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗PD-1的單鏈抗體。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含抗EGFR的單鏈抗體及抗PD-1的單鏈抗體。
如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段 a) 結合於人EGFR且K_D 為5.49E-10以下；且 b) 結合於人PD-1且K_D 為7.68E-09以下。
如請求項6之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有以下性質中的至少一種： a) 結合於人EGFR且K_D 在5.45E-10至5.49E-10之間，且 b) 結合於人PD-1且K_D 在1.98E-09至7.68E-09之間。
如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包括兩種多肽鏈：包含第一結合結構域的多肽鏈，該第一結合結構域包含抗EGFR的重鏈可變區及輕鏈可變區；包含第二結合結構域的另一多肽鏈，該第二結合結構域包含抗PD-1的重鏈可變區及輕鏈可變區。
如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該第一結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，其中該H-CDR3包含SEQ ID NO: 8所示之序列及其保守性修飾，所述H-CDR2包含SEQ ID NO: 7所示之序列及其保守性修飾，該H-CDR1包含如SEQ ID NO: 6所示之序列及其保守性修飾；且該L-CDR3包含如SEQ ID NO: 11所示之序列及其保守性修飾；該L-CDR2包含SEQ ID NO: 10所示之序列及其保守性修飾；該L-CDR1包含如SEQ ID NO: 9所示之序列及其保守性修飾。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5組成之群中的序列。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其包含： a) 該第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 1、3組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性；以及 b) 該第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 2、4、5組成之群中的序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%的同源性。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其包含： a) 該第二結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 1、3組成之群中的序列；以及 b) 該第一結合結構域的可變區，其具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 2、4、5組成之群中的序列。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其包含互補決定區(CDR)，該互補決定區具有的胺基酸序列係選自SEQ ID NO: 6-18 組成之群中的序列。
如請求項8或9之抗體或其抗原結合片段，其中該第二結合結構域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；其中該H-CDR3包含如SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項15之抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-1的所述L-CDR3包含如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項15或16之抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-1的該H-CDR2包含如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項15至17中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-1的該L-CDR2包含如SEQ ID NO:16所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項15至18中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-1的該H-CDR1包含如SEQ ID NO:12所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項15至19中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-1的該L-CDR1包含如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列及其保守性修飾。
如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、或嚙齒類動物的抗體。
一種核酸分子，其編碼如請求項1至21中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種選殖或表現載體，其包含如請求項22之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含超過一個如請求項23之選殖或表達載體。
一種用於生產如請求項1至20中任一項之抗體的方法，包括培養如請求項24之宿主細胞，且分離該抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，以及超過一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種免疫偶聯物，其包含連接至治療劑的如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組合物，其包含如請求項27之免疫偶聯物及超過一種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種調節受試者的免疫反應的方法，包括向該受試者施用如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段。
如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段在製備用於治療或預防免疫病症或癌症的藥物中的應用。
一種抑制受試者的腫瘤細胞生長的方法，包括向該受試者施用治療有效量的如請求項1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段，以抑制腫瘤細胞生長。
如請求項31之方法，其中該腫瘤細胞係選自由黑素瘤、腎癌、***癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌組成之群中的癌症的細胞。