CN113727731B - 靶向pd-1和lag-3的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了双特异性抗体，其包含特异性结合到PD‑1的第一靶向部分和特异性结合到LAG‑3的第二靶向部分，其中所述第一靶向部分包含第一VHH结构域并且所述第二靶向部分包含第二VHH结构域。本发明还提供了本发明的抗体的氨基酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞和用于表达或分离所述抗体的方法。还提供了包含本发明的抗体的治疗性组合物。本发明还提供了使用所述双特异性抗体治疗癌症和其他疾病的方法。

Description

靶向PD-1和LAG-3的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及双特异性抗体，其包含特异性结合到PD-1的第一靶向部分和特异性结合到LAG-3的第二靶向部分，其中所述第一靶向部分包含第一VHH结构域，并且所述第二靶向部分包含第二VHH结构域。此外，本发明提供了编码所述抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞、生产所述抗体的方法和使用所述双特异性抗体治疗癌症、感染或其他人类疾病的免疫疗法。
背景技术
在过去的几年中，免疫疗法已发展成对抗某些癌症类型的非常有前途的新领域。作为免疫检查点蛋白之一的PD-1是在活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞以及B细胞上表达的CD28家族的抑制性成员。PD-1在下调免疫***中发挥主要作用。
PD-1是一种I型跨膜蛋白，其结构由免疫球蛋白可变区样细胞外结构域和含有免疫受体的基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)和免疫受体的基于酪氨酸的开关基序(ITSM)的胞质结构域组成。
PD-1具有两种已知配体，PD-L1和PD-L2，它们是细胞表面表达的B7家族的成员。在与其生理配体连接后，PD-1通过招募SHP-2抑制T-细胞活化，SHP-2会使作为T-细胞受体(TCR)介导的信号传导的主要整合者Zap70去磷酸化并失活。因此，PD-1抑制T细胞增殖和T细胞功能例如细胞因子产生和细胞毒性活性。
靶向PD-1的单克隆抗体可以阻断PD-1/PD-L1结合并提高对癌细胞的免疫应答。这些药物在治疗某些癌症中显示出很大的前景。一些制药公司已开发出多种获批的靶向PD-1的治疗性抗体，包括派姆单抗(Keytruda)、纳武单抗(Opdivo)、西米普利单抗(Libtayo)。已显示这些药物在治疗各种不同类型的癌症包括皮肤黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤中是有效的。也正在研究将它们用于对抗许多其他类型的癌症。
淋巴细胞活化基因3，也被称为LAG-3，是一种I型跨膜蛋白，它是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。LAG-3是在活化T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达但不在静息T细胞上表达的细胞表面分子。LAG-3与CD4有大约20％的氨基酸序列同源性，但以更高的亲和性结合到II类MHC，提供T细胞受体信号传导的负调控。
在体外阻断LAG-3会增强T细胞增殖和细胞因子生产，并且LAG-3缺陷小鼠在由超抗原葡萄球菌肠毒素B、肽或仙台病毒感染诱导的T细胞应答的下调方面具有缺陷。LAG-3在活化的天然Treg(nTreg)和诱导的CD4+FoxP3+Treg(iTreg)细胞两者上表达，在其中表达水平高于在活化的效应CD4+T细胞上观察到的水平。阻断Treg细胞上的LAG-3会削弱Treg细胞抑制功能，而LAG-3在非Treg CD4+T细胞中的异位表达赋予抑制活性。基于慢性感染和癌症中LAG-3对T细胞功能的免疫调节作用，LAG-3特异性单克隆抗体的预测作用机制是抑制肿瘤特异性效应T细胞的负调控。此外，在小鼠和人类中，已显示PD-1途径和LAG-3的双重阻断比单独阻断任一分子对抗肿瘤免疫来说更加有效。
在抗原特异性CD8+T细胞上发现了LAG-3和PD-1的共表达，并且两者的共阻断导致增殖和细胞因子生产的提高。抗LAG-3疗法与抗PD-1疗法的组合已进入各种不同类型的实体肿瘤的临床试验。
发明内容
本发明提供了分离的抗体，特别是双特异性抗体。
一方面，本发明提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合到人类PD-1的第一靶向部分和特异性结合到人类LAG-3的第二靶向部分，其中所述第一靶向部分包含第一VHH结构域，并且所述第二靶向部分包含第二VHH结构域。
在一个实施方式中，在上述抗体或其抗原结合片段中，所述第一靶向部分结合到鼠类PD-1，所述第二靶向部分结合到鼠类LAG-3。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；其中所述H-CDR3包含SEQ ID NO：1中所描述的序列及其保守修饰，所述H-CDR2包含SEQ ID NO：2中所描述的序列及其保守修饰，所述H-CDR1包含SEQ ID NO：3中所描述的序列及其保守修饰。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述第二VHH结构域包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；其中所述H-CDR3包含SEQ ID NO：4中所描述的序列及其保守修饰，所述H-CDR2包含SEQ ID NO：5中所描述的序列及其保守修饰，所述H-CDR1包含SEQ ID NO：6中所描述的序列及其保守修饰。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域包含与SEQ ID NO：7至少70％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述第二VHH结构域包含与SEQ ID NO：8至少70％、80％、85％、90％、95％或99％同源的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域包含SEQ ID NO：7的序列，并且所述第二VHH结构域包含SEQ ID NO：8的序列。
在一个实施方式中，所述第一VHH结构域和第二VHH结构域通过肽序列相连，其中所述肽序列包含
(a)包含铰链区、CH2和CH3的IgG Fc片段，和/或
(b)连接物。
在一个实施方式中，所述连接物包含SEQ ID NO：9的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ IDNO：10的序列。
上述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段
a)以2.92E-09或更低的KD结合到人类PD-1；并且
b)以3.01E-10或更低的KD结合到人类LAG-3。
所述抗体的序列示出在表1和序列表中。W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP的格式是VHH(抗PD-1)-铰链-CH2-CH3-连接物-VHH(抗LAG-3)，其中所述铰链-CH2-CH3是IgG4的Fc片段。
表1抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003318599940000041
所述抗体的CDR序列示出在表2和序列表中。
表2抗体的CDR序列
Figure BDA0003318599940000051
本发明的抗体可以是嵌合抗体。
本发明的抗体可以是人源化抗体或全人类抗体。
本发明的抗体可以是啮齿动物抗体。
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码所述抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了一种克隆或表达载体，其包含编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含一个或多个克隆或表达载体。
另一方面，本发明提供了一种方法，其包括培养本发明的宿主细胞并分离所述抗体。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或所述抗体的抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明提供了一种免疫偶联物，其包含连接到治疗剂的本发明中所述的抗体或其抗原结合片段。
其中，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述免疫偶联物和一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明还提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明中的抗体或任一所述抗体的抗原结合片段。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防免疫障碍或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了一种在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体或所述抗原结合片段，以抑制所述肿瘤细胞的生长。
其中，本发明提供了所述方法，其中所述肿瘤细胞是选自黑素瘤、肾癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌组成的组中的癌症的细胞。
本发明的特点和优点
靶向PD-1和LAG-3途径两者的双特异性抗体可以在癌症疗法中提供几个益处。与抗PD-1疗法相比，所述双特异性抗体可以提高对PD-1和LAG-3双阳性癌症的反应率。
附图说明
图1示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到人类PD-1蛋白。
图2示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到人类LAG-3蛋白。
图3示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到小鼠PD-1蛋白。
图4示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到小鼠LAG-3蛋白。
图5示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到细胞表面食蟹猴PD-1。
图6示出PD-1×LAG-3双特异性抗体结合到食蟹猴LAG-3蛋白。
图7示出PD-1×LAG-3双特异性抗体与人类CTLA-4、CD28和CD4蛋白的结合。图7A示出了PD-1×LAG-3双特异性抗体不结合到人类CTLA-4蛋白；图7B示出了PD-1×LAG-3双特异性抗体不结合到人类CD28蛋白；图7C示出了PD-1×LAG-3双特异性抗体不结合到人类CD4蛋白。
图8示出PD-1×LAG-3双特异性抗体同时结合到人类PD-1和LAG-3蛋白。
图9示出PD-1×LAG-3双特异性抗体阻断PD-1与表达PD-L1的细胞的结合。
图10示出PD-1×LAG-3双特异性抗体阻断LAG-3与Raji细胞上的MHC-II的结合。
图11示出PD-1×LAG-3双特异性抗体增强表达PD-1的Jurkat中的NFAT途径。
图12示出PD-1×LAG-3双特异性抗体增强表达LAG-3的Jurkat中的IL-2途径。
图13示出PD-1×LAG-3双特异性抗体增强表达LAG-3和PD-1的Jurkat中的NFAT途径。
图14示出PD-1×LAG-3双特异性抗体对人类同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的影响。图14A示出PD-1×LAG-3双特异性抗体在MLR测定法中增强IL-2的产生。图14B示出PD-1×LAG-3双特异性抗体在MLR测定法中增强IFN-γ的产生。
图15示出PD-1×LAG-3双特异性抗体增强用SEB刺激的PBMC的IL-2的产生。
图16示出W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP在新鲜的人血清中稳定长达14天。
图17示出在小鼠中PD-1×LAG-3双特异性抗体对肿瘤的影响。图17A示出PD-1×LAG-3双特异性抗体在小鼠中抑制结肠26肿瘤的生长。图17B示出治疗过的小鼠的存活曲线。图17C示出治疗过的小鼠的体重变化。
详细描述
为了可以更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其他定义阐述在整个详细描述中。
术语“程序化死亡蛋白1”、“程序化细胞死亡蛋白1”“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”、“CD279”和“hPD-F”可互换使用，并且包括人类PD-1的变体、同种型、物种同源物、其他物种的PD-1以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。
当在本文中提及时，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(在本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区可以被进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高度可变的区域，并散布有被称为构架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链中的CDR被简写为H-CDR，例如H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，轻链中的CDR被简写为L-CDR，例如L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
当在本公开中使用时，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，不论它是在体外还是体内产生的。所述术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变和嫁接抗体。术语“抗体”还包括抗体片段，例如scFv、dAb、包含第一VHH结构域和第二VHH结构域的双特异性抗体，以及保留了抗原结合功能、即特异性结合PD-1和LAG-3的能力的其他抗体片段。通常，此类片段将包含抗原结合片段。
抗原结合片段通常包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，不是必定包含两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域和CH1结构域构成，但仍保留完整抗体的一些抗原结合功能。
术语“交叉反应性”是指本文中描述的抗原片段与人类、猴和/或鼠类(小鼠或大鼠)中的相同靶分子的结合。因此，“交叉反应性”应该被理解为与在不同物种中表达的同一分子X的物种间反应性，但不与X之外的分子反应。识别例如人类PD-1的单克隆抗体对猴和/或鼠类(小鼠或大鼠)PD-1的跨物种特异性，可以例如通过FACS分析来确定。
当在本文中使用时，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非注明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性措施两者。需要治疗的个体可以包括已经患有特定医学障碍的个体以及最终可能患上所述障碍的个体。
术语“保守修饰”是指核苷酸和氨基酸序列修饰，其不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码或含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替换、添加和缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术例如定点突变和PCR介导的突变引入到所述序列中。保守氨基酸替换包括其中所述氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“LAG-3”、“淋巴细胞活化基因3”、“CD223”可互换使用，并且包括人类LAG-3的变体、同种型、物种同源物、其他物种的LAG-3以及与LAG-3具有至少一个共同表位的类似物。
术语“单结构域抗体”、“重链抗体”、“HCAb”可互换使用，是指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体。重链抗体最初源自于骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。尽管不含轻链，但HCAb具有真正的抗原结合库。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表了通过适应性免疫应答产生的最小已知抗原结合单位。术语“VHH”是指HCAb的重链的可变结构域。
当在本文中使用时，术语“同源物”和“同源的”可互换，并且是指在最适排列时与另一个序列具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
实施例
实施例1：研究材料准备
1.商品化材料
Figure BDA0003318599940000101
Figure BDA0003318599940000111
2.抗原和其他蛋白质的产生
2.1抗原的产生
编码人类PD-1、小鼠PD-1、人类LAG-3、小鼠LAG-3和食蟹猴LAG-3ECD(细胞外结构域)的核酸由生工生物(Sangon Biotech)合成。PD-1或LAG-3基因片段从合成的核酸扩增并***到表达载体pcDNA3.3(ThermoFisher)中。所述***的PD-1或LAG-3基因片段通过DNA测序进一步确认。带有各种不同标签包括人类Fc、小鼠Fc的人类LAG-3ECD的融合蛋白，通过将人类PD-1或LAG-3基因转染到293F细胞(ThermoFisher)中来获得。将所述细胞在FreeStyle293表达培养基中，在37℃、5％CO2下培养。在培养5天后，将从瞬时转染的细胞的培养收获的上清液用于蛋白质纯化。所述融合蛋白通过蛋白A和/或SEC柱纯化。不带标签的LAG-3ECD蛋白通过用因子Xa蛋白酶切割带有切割位点的ECD-hFc融合蛋白来产生。将纯化的蛋白用于筛选和表征。
如上所述产生了带有小鼠Fc标签的人类PD-L1 ECD、人类CTLA-4ECD和CD28 ECD。
2.2基准抗体的产生
抗人类LAG-3或PD-1基准抗体(W339-BMK1和W305-BMK1)的基因序列分别在专利申请US20110150892A1(W339-BMK1被称为“25F7”)和WO2006121168(W305-BMK1被称为“5C4”)中公开的信息的基础上合成。
抗人类PD-1×LAG-3基准抗体W365-BMK1、W365-BMK2和W365-BMK3的序列分别在专利申请WO2015200119A8(W365-BMK1被称为“SEQ25&SEQ27”)、WO2017087589A2(W365-BMK2被称为“SEQ110”)和WO2015200119A8(W365-BMK3被称为“SEQ 5和4”)中公开的信息的基础上合成。将所述合成的基因序列并入到质粒pcDNA3.3中。将用所述质粒转染的细胞培养5天，并收集上清液，用于使用蛋白A柱的蛋白质纯化。得到的基准抗体通过SDS-PAGE和SEC进行分析，然后储存在-80℃。
W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-Fc-V2(3056，抗PD-1抗体)和W3396-P2R2(L)-1E1-z4-R2-2-Fc(3396，抗LAG-3抗体)在Wuxi Biologics的TAD部门发现。
3.细胞系的产生
产生了食蟹猴PD-1转染细胞系。简单来说，使用Lipofectamine转染试剂盒，按照制造商的方案将293F细胞分别用含有全长人类、食蟹猴PD-1的pcDNA3.3表达载体转染。在转染后48-72小时，将所述转染的细胞在含有用于选择的杀稻瘟素的培养基中培养，并测试靶蛋白的表达。
使用Nucleofactor(Lonza)，将Jurkat细胞系用含有人类全长PD-1/NFAT报告基因或LAG-3/IL-2报告基因的质粒转染。在转染后72小时，将所述转染的细胞在含有用于选择的潮霉素的培养基中培养，并测试靶蛋白的表达。在两个月后，获得表达人类PD-1或LAG-3以及稳定整合的NFAT或IL-2萤光素酶报告基因的Jurkat细胞。
实施例2：双特异性抗体的产生
1.构建表达载体
用于产生结合PD-1的第一VHH的方法描述在PCT申请号PCT/CN2019/078515中，用于产生结合LAG-3的第二VHH的方法描述在PCT申请号PCT/CN2019/078315中。
编码抗PD-1VHH和抗LAG-3VHH的DNA序列由金唯智GENEWIZ(Suzhou,China)合成。然后将抗PD-1VHH和抗LAG-3VHH分别亚克隆在pYF表达载体中铰链区和IgG4 Fc区的N-端和C-端。
2.小规模转染、表达和纯化
将双特异性抗体的质粒转染到Expi293细胞中。将细胞培养5天，并收集上清液用于使用蛋白A柱(GE Healthcare)的蛋白质纯化。将得到的抗体通过SDS-PAGE和HPLC-SEC进行分析，然后储存在-80℃。
抗体的纯度使用Agilent 1260Infinity HPLC通过SEC-HPLC来确定。使用50mM磷酸钠、0.15M NaCl、pH 7.0缓冲液将抗体溶液进样到TSKgel SuperSW3000柱上。运行时间为20min。在柱上的峰保留时间在280nm处监测。数据使用ChemStation软件(V2.99.2.0)进行分析。
3.结果
先导候选物的序列
抗体先导物的序列列于表2中，并且CDR列于表1中。
实施例4：体外表征
1.PD-1×LAG-3双特异性抗体与人类PD-1或LAG-3蛋白的结合
将96孔酶标板用PD-1×LAG-3抗体在4℃包被过夜。在阻断并清洗后，向板添加各种不同浓度的带有小鼠Fc标签的PD-1蛋白或LAG-3蛋白，并在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体温育1小时。在清洗后，添加TMB底物，并通过2MHCl终止颜色反应。使用微孔板读板器读取450nm处的吸光值。
如图1和表3中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP与PD-1蛋白的结合的EC50与基准抗体相当。
表3.PD-1×LAG-3双特异性抗体与人类PD-1蛋白结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.07
W305-BMK1 0.09
W365-BMK1 0.15
W365-BMK2 0.18
W365-BMK3 0.09
如图2和表4中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP与LAG-3蛋白结合的EC50与基准抗体相当。
表4.PD-1×LAG-3双特异性抗体与人类LAG-3蛋白结合的EC50
Figure BDA0003318599940000141
2.PD-1×LAG-3双特异性抗体与小鼠PD-1或LAG-3的结合
将96孔酶标板用PD-1×LAG-3抗体在4℃包被过夜。在阻断并清洗后，向板添加各种不同浓度的带有His标签的小鼠PD-1或LAG-3蛋白，并在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与HRP标记的山羊抗His IgG抗体温育1小时。在清洗后，添加TMB底物，并通过2M HCl终止颜色反应。使用微孔板读板器读取450nm处的吸光值。
如图3和表5中所示，只有W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP而不是BMK可以与小鼠PD-1蛋白结合。
表5.PD-1×LAG-3双特异性抗体与小鼠PD-1蛋白结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.26
W305-BMK1 不结合
W365-BMK3 不结合
如图4和表6中所示，只有W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP而不是BMK可以与小鼠LAG-3蛋白结合。
表6.PD-1×LAG-3双特异性抗体与小鼠PD-1蛋白结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.87
W305-BMK1 不结合
W365-BMK3 不结合
3.PD-1×LAG-3双特异性抗体与食蟹猴PD-1或LAG-3的结合
对于食蟹猴PD-1来说，将表达食蟹猴PD-1的293F细胞分别与各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体温育。使用PE标记的山羊抗人类IgG抗体检测PD-1×LAG-3抗体在所述细胞上的结合。细胞的MFI通过流式细胞术来测量并通过FlowJo(7.6.1版)分析。
对于食蟹猴LAG-3来说，将96孔酶标板用PD-1×LAG-3抗体在4℃包被过夜。在阻断并清洗后，向板添加各种不同浓度的带有His标签的食蟹猴LAG-3，并在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与HRP标记的山羊抗His抗体温育1小时。在清洗后，添加TMB底物，并通过2M HCl终止颜色反应。使用微孔板读板器读取450nm处的吸光值。
如图5和表7中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP与LAG-3蛋白结合的EC50与BMK相当。
表7.PD-1×LAG-3双特异性抗体与细胞表面食蟹猴PD-1结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.36
W305-BMK1 0.28
W365-BMK3 0.33
如图6和表8中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP与LAG-3蛋白结合的EC50与W365-BMK3相当并好于W339-BMK1。
表8.PD-1×LAG-3双特异性抗体与食蟹猴LAG-3蛋白结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 1.21
W339-BMK1 4.27
W365-BMK3 0.87
4.与人类CD4、CTLA-4和CD28的交叉反应性
通过ELISA测量与人类CD4、CTLA-4或CD28的交叉反应性。将96孔酶标板用1μg/mL的人类CD4、CTLA-4或CD28在4℃包被过夜。在阻断并清洗后，向板添加各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体，并在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与相应的第二抗体温育60min。在清洗后，添加TMB底物，并通过2M HCl终止颜色反应。
图7A、7B和7C中的结果表明PD-1×LAG-3双特异性抗体不与人类CTLA-4、CD28或CD4蛋白结合。
5.通过SPR进行的靶向人类、小鼠、食蟹猴PD-1和LAG-3的亲和性测试
使用Biacore 8K，通过SPR测定法确定了双特异性抗体对抗原的结合亲和性。将PD-1x LAG-3抗体捕获在固定有抗人类IgG Fc抗体的传感芯片(GE)上。将不同浓度的带有His标签的人类PD-1蛋白(MW：40KD)和食蟹猴PD-1(MW：40KD)以30μL/分钟的流速进样到传感芯片上，结合期为120，然后是800s的解离。将不同浓度的带有His标签的小鼠LAG-3蛋白(MW：45KD)以30μL/分钟的流速进样到传感芯片上，结合期为120s，然后是3600s的解离。将不同浓度的带有His标签的小鼠PD-1蛋白(MW：45KD)以30μL/分钟的流速进样到传感芯片上，结合期为60s，然后是90s的解离。在每个结合循环后，将芯片用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生。
对于靶向人类LAG-3的亲和性来说，将PD-1×LAG-3抗体固定化在CM5传感芯片上。使用单循环动力学方法，将不同浓度的不带标签的人类LAG-3以30μL/分钟的流速进样到传感芯片上，结合期为180s，然后是3600s的解离。将芯片用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生。
从测试传感图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图。使用Langmiur分析将实验数据通过1:1模型进行拟合。
表9.PD-1×LAG-3双特异性抗体靶向人类、小鼠和食蟹猴PD-1的亲和力常数
Figure BDA0003318599940000171
表10.PD-1×LAG-3双特异性抗体靶向人类和食蟹猴LAG-3的亲和力常数
Figure BDA0003318599940000172
6.PD-1×LAG-3双特异性抗体与人类PD-1和LAG-3蛋白的双重结合
将96孔酶标板用1μg/mL的带有小鼠Fc标签的人类PD-1在4℃包被过夜。在阻断并清洗后，向板添加各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体，并在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与带有His标签的LAG-3蛋白温育。在清洗后，向板添加HRP标记的抗His抗体，并在室温温育1小时。在清洗后，添加TMB底物，并通过2M HCl终止颜色反应。使用微孔板读板器读取450nm处的吸光值。
如图8和表11中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP与LAG-3蛋白结合的EC50与W365-BMK3相当，并好于W365-BMK1和BMK2。
表11.PD-1×LAG-3双特异性抗体结合人类PD-1和LAG-3蛋白的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.03
W365-BMK1 2.41
W365-BMK2 0.2
W365-BMK3 0.03
7.PD-L1蛋白与表达PD-1的细胞的结合的阻断
将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释，并与带有mFc标签的PD-L1蛋白在4℃混合。将所述混合物转移到接种有表达PD-1的CHO-S细胞的96孔板中。使用山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体检测PD-L1蛋白与表达PD-1的细胞的结合。MFI通过流式细胞术进行评估并通过FlowJo软件进行分析。
如图9和表12中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP阻断PD-1与表达PD-L1的细胞的结合的EC50与BMK相当。
表12.PD-1×LAG-3双特异性抗体阻断PD-1与PD-L1的结合的EC50
Figure BDA0003318599940000181
Figure BDA0003318599940000191
8.LAG-3蛋白与Raji细胞上表达的MHC-II的结合的阻断
将抗体在1％BSA-PBS中连续稀释，并与带有小鼠Fc标签的LAG-3蛋白在4℃混合。将所述混合物转移到接种有在表面上表达MHC-II的Raji细胞的96孔板中。使用山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗体检测LAG-3蛋白与Raji细胞的结合。MFI通过流式细胞术进行评估并通过FlowJo软件进行分析。
如图10和表13中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP阻断LAG-3与表达MHC-II的Raji细胞的结合的EC50与W339-BMK1、W365-BMK3相当，并好于W365-BMK1和W365-BMK2。
表13.PD-1×LAG-3双特异性抗体阻断LAG-3与MHC-II的结合的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 1.39
W339-BMK1 1.68
W365-BMK1 30.0
W365-BMK2 4.90
W365-BMK3 1.88
9.PD-1×LAG-3双特异性抗体对带有NFAT报告基因的表达PD-1的Jurkat的影响
将表达人类PD-1并稳定整合有NFAT萤光素酶报告基因的Jurkat细胞和表达人类PD-L1的人工APC(抗原呈递细胞)细胞接种在96孔板中。向所述细胞添加测试抗体。将板在37℃、5％CO2下温育6小时。在温育后，添加重构的萤光素酶底物One-Glo，并通过微孔板分光光度计测量萤光素酶强度。
正如在图11中证实的，在报告基因测定中抗体增强Jurkat的NFAT途径。此外，如表14中所示，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP在这个测定中的EC50好于W365-BMK1，并与其他基准抗体相当。
表14.表达PD-1的Jurkat中NFAT途径增强的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.12
W305-BMK1 0.18
W365-BMK1 1.94
W365-BMK2 0.31
W365-BMK3 0.23
10.PD-1×LAG-3双特异性抗体对具有IL-2报告基因的表达LAG-3的Jurkat的影响
将表达人类LAG-3并稳定整合有IL-2萤光素酶报告基因的Jurkat细胞和Raji细胞在存在SEE(葡萄球菌肠毒素E)的情况下接种在96孔板中。向所述细胞添加测试抗体。将板在37℃、5％CO2下温育过夜。在温育后，添加重构的萤光素酶底物One-Glo，并通过微孔板分光光度计测量萤光素酶强度。
正如在图12和表15中证实的，在报告基因测定中抗体增强Jurkat的IL-2通路。
表15.在表达LAG-3的Jurkat中IL-2通路增强的EC50
抗体 EC50(nM)
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP 0.84
W339-BMK1 0.65
W365-BMK1 14.9
W365-BMK2 29.9
W365-BMK3 0.14
11.PD-1×LAG-3双特异性抗体对具有NFAT报告基因的表达PD-1和LAG-3的Jurkat 的影响
将表达人类全长LAG-3的质粒瞬时转染到表达人类PD-1并稳定整合有NFAT萤光素酶报告基因的Jurkat细胞中。48小时后，将所述细胞与表达PD-L1的Raji细胞一起在存在SEE(葡萄球菌肠毒素E)的情况下接种在96孔板中。向所述细胞添加测试抗体。将板在37℃、5％CO2下温育过夜。在温育后，添加重构的萤光素酶底物One-Glo，并通过微孔板分光光度计测量萤光素酶强度。
正如在图13中证实的，在报告基因测定中抗体增强表达PD-1和LAG-3的Jurkat的NFAT通路。倍数比W305-BMK1与W339-BMK1的组合以及其他基准抗体更高。
12.PD-1×LAG-3双特异性抗体对人类同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的影响
使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体血液中新鲜分离人类外周血单核细胞(PBMC)。使用人类单核细胞富集试剂盒，按照制造商的说明书分离单核细胞。将细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7天，以产生树突状细胞(DC)。使用人类CD4+T细胞富集试剂盒，按照制造商的方案分离人类CD4+T细胞。将纯化的CD4+T细胞与同种异体的不成熟DC(iDC)在96孔板中，在各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体存在下共同培养。将板在37℃、5％CO2下温育。分别在第3天和第5天收获上清液，用于IL-2和IFN-γ测试。人类IL-2和IFN-γ释放使用匹配的抗体对，通过ELISA来测量。分别使用重组人类IL-2和IFN-γ作为标准品。将板分别用特异性靶向人类IL-2或IFN-γ的捕获抗体预包被。在阻断后，吸取50μL标准品或样品到每个孔中，并在环境温度下温育。在除去未结合的样品后，向孔添加特异性靶向相应细胞因子的生物素偶联的检测抗体并温育1小时。然后向孔添加HRP-链亲合素，在环境温度下温育30分钟。通过加入50μL TMB底物进行显色，然后用50μL 2N HCl终止反应。使用微孔板分光光度计读取450nm处的吸光值。
正如在图14A和14B中显示的，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP在混合淋巴细胞反应中增强IL-2和IFN-γ分泌。
13.PD-1×LAG-3双特异性抗体对人类PBMC活化的影响
将PBMC和各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体在96孔板中，在SEB存在下共培养。将板在37℃、5％CO2下温育3天，并收获上清液用于IL-2测试。人类IL-2释放如章节12中所述通过ELISA来测量。
正如在图15中显示的，在用SEB刺激的PBMC中W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP增强IL-2分泌。
14.通过查示扫描荧光测定法(DSF)进行的热稳定性测试
使用QuantStudioTM 7Flex实时PCR***(Applied Biosystems)调查抗体的Tm。将19μL抗体溶液与1μL 62.5×SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合并转移到96孔板。将板以0.9℃/min的速率从26℃加热到95℃，并收集得到的荧光数据。计算在不同温度下荧光变化的负导数，并将最大值定义为融化温度Tm。如果蛋白质具有多个解折叠转变，则报告前两个Tm，分别命名为Tm1和Tm2。数据采集和Tm计算由操作软件自动进行。
表16.W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP在不同缓冲液中的Tm
Figure BDA0003318599940000221
15.血清稳定性
将所述先导抗体在新鲜分离的人血清(血清含量>95％)中，在37℃下温育。在指定的时间点从温箱中取出血清处理样品的等分试样，在液氮中速冻，然后储存在80℃下直至准备用于测试。在即将进行稳定性测试之前将样品快速融化。
将板用1μg/mL的带有小鼠Fc标签的人类PD-1在4℃包被过夜。在阻断和清洗后，向板添加各种不同浓度的PD-1×LAG-3抗体，并在清洗后在室温温育1小时。然后将板清洗，随后与带有His标签的LAG-3蛋白温育1小时。在清洗后，向板添加HRP标记的小鼠抗His抗体，并在室温温育1小时。在清洗后，添加TMB底物，并通过2M HCl终止颜色反应。使用微孔板读板器读取450nm处的吸光值。
在图16中显示了W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP在新鲜人血清中稳定长达14天。
实施例5：体内表征
1.PD-1×LAG-3抗体的体内抗肿瘤活性
使用Balb/c小鼠(Shanghai Lingchang Biotech)和结肠癌细胞系Colon26肿瘤模型来评估PD-1×LAG-3抗体抑制体内肿瘤细胞生长的能力。在第0天将Balb/C小鼠用5×105个小鼠Colon26细胞皮下植入，并在肿瘤达到60-70mm3时将小鼠分组(n＝8)。
在第0天、第3天、第7天、第10天和第14天，将小鼠用单独的PD-1mAb(3056)(10mg/kg)、单独的LAG-3mAb(3396)(10mg/kg)、PD-1×LAG-3抗体W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP(13.9mg/kg)或3056mAb(10mg/kg)与3396mAb(10mg/kg)的组合腹膜内治疗。提供人类IgG4同种型对照抗体(10mg/kg)作为阴性对照。
在注射后3周内测量肿瘤体积和动物体重。肿瘤体积使用下述公式，以mm3为单位表示：V＝0.5ab2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。
治疗过的小鼠的肿瘤体积和存活曲线在图17A和17B中。结果显示，使用W3396和PD-1×LAG-3抗体W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP的治疗在Colon26肿瘤生长的抑制中有效，而使用单独的抗体W3056的治疗几乎没有效果。与单独的亲代PD-1抗体(W3056)或单独的亲代LAG-3抗体(W3396)相比，W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP引起更大的肿瘤生长抑制。W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP的功效与PD-1和LAG-3抗体的组合相当。同时，在图17C中，每个组的体重增长指示了良好的安全性，没有明显毒性。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 靶向PD-1和LAG-3的双特异性抗体
<130> AJ3297PCT2001CN
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1抗体的HCDR3
<400> 1
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1抗体的HCDR2
<400> 2
Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1抗体的HCDR1
<400> 3
Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val Asn Met Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3抗体的HCDR3
<400> 4
Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3抗体的HCDR2
<400> 5
Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3抗体的HCDR1
<400> 6
Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-1结合结构域的VHH
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3结合结构域的VHH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 10
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长序列
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
210 215 220
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln
405 410 415
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile His Trp Thr Ser
420 425 430
Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser
435 440 445
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
450 455 460
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr
465 470 475 480
His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
485 490 495
Ser Ser

Claims (20)

1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合到PD-1的第一靶向部分和特异性结合到LAG-3的第二靶向部分，
其中所述第一靶向部分包含第一VHH结构域，并且所述第二靶向部分包含第二VHH结构域；
所述第一VHH结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；其中所述H-CDR3如SEQ ID NO：1所示，所述H-CDR2如SEQ ID NO：2所示，所述H-CDR1如SEQ ID NO：3所示；
所述第二VHH结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；其中所述H-CDR3如SEQ ID NO：4所示，所述H-CDR2如SEQ ID NO：5所示，所述H-CDR1如SEQ ID NO：6所示。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域如SEQ ID NO：7所示。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二VHH结构域如SEQ ID NO：8所示。
4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域如SEQ ID NO：7所示，并且所述第二VHH结构域如SEQ ID NO：8所示。
5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VHH结构域和第二VHH结构域通过肽序列相连。
6.权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肽序列包含：
(a)包含铰链区、CH2和CH3的IgGFc片段，和/或
(b)连接物。
7.权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述连接物如SEQ ID NO：9所示。
8.权利要求1-7中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体如SEQ ID NO：10所示。
9.权利要求1-8中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段
a)以2.92×10-9或更低的KD结合到人类PD-1；并且
b)以3.01×10-10或更低的KD结合到人类LAG-3。
10.权利要求1-9中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体。
11.一种核酸分子，其编码权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.一种克隆或表达载体，其包含权利要求11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞，其包含一个或多个权利要求12所述的克隆或表达载体。
14.一种生产权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求13所述的宿主细胞并分离所述抗体。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载体。
16.一种免疫偶联物，其包含连接到治疗剂的权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种药物组合物，其包含权利要求16所述的免疫偶联物和一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载体。
18.权利要求1-10中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防免疫障碍或癌症的药物中的用途。
19.权利要求18所述的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、肾癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、子宫癌、卵巢癌和直肠癌组成的组。
20.权利要求18所述的用途，其中所述癌症选自皮肤或眼内恶性黑素瘤。
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