JP2022529703A - 腫瘍治療薬及びその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において、特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書において使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学の関連用語及び実験室の操作ステップは、いずれも対応する分野で広く使用されている用語及び一般的なステップである。また、本発明をよりよく理解するために、以下、関連する用語の定義及び解釈を提供する。
一態様において、本開示は、アミノ酸配列の配列番号2-4、12-14、22-24、32-34、42-44、52-54、62-64、72-74、82-84、92-94、102-104、112-114、122-124、132-134、142-144、152-154、157-159、162-164、167-169、172-174、177-179、182-184、187-189、192-194、197-199、202-204、207-209、212-214、217-219、222-224、227-229、232-234又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖CDR、及び/又は、アミノ酸配列の配列番号7-9、17-19、27-29、37-39、47-49、57-59、67-69、77-79、87-89、97-99、107-109、117-119、127-129、137-139、147-149、237-239、242-244、247-249、252-254、257-259、262-264、267-269又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖CDRを含む、ヒトクローディン18.2に結合する抗体又はその抗原結合部分を提供する。
(実施例)
Balb/cマウスを免疫するとともにスクリーニングして、クローディン18.2にのみ特異的に結合し、クローディン18の異なるスプライセオソームであるクローディン18.1に結合しないモノクローナル抗体を取得するために複数のポリシーが同時に適用される。具体的には以下のとおりである。
ヒトクローディン18.1(UniProtKB-P56856)の全長配列を含むプラスミド遺伝子クローディン18.1-puc57-Amp(蘇州鴻迅生物、SynbioTech)を合成した。該プラスミドをテンプレートとし、上流プライマー5’-ttggcaaagaattgctagatgtccaccaccacatgcc-3’及び下流プライマー5’-tgttcgggccctcctcgattacacatagtcgtgcttgg-3’を使用して、ヒトクローディン18.1の全長断片(Met1-Val261)をPCRで増幅した。増幅産物を、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB、Cat:M0530L)により酵素に連結した後、真核発現プラスミドシステムにクローニングした。同様に、ヒトクローディン18.2(UniProtKB-P56856-2)の全長配列を含むプラスミド遺伝子クローディン18.2-puc57-Amp(蘇州鴻迅生物、SynbioTech)を合成した。該プラスミドをテンプレートとし、上流プライマー5’-ttggcaaagaattgctagatggccgtgactgcctgtc-3’及び下流プライマー5’-tgttcgggccctcctcgattacacatagtcgtgcttgg-3’を使用して、ヒトクローディン18.2の全長断片(Met1-Val261)をPCRで増幅した。増幅産物を、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB、Cat:M0530L)により酵素に連結した後、真核発現プラスミドシステムにクローニングした。このプラスミドをそれぞれNIH3T3細胞とHEK293細胞に電気的に形質転換し、1~10μg/mLのPuromycin(Gibco、Cat:A1113803)を使用して安定発現細胞株を段階的に加圧してスクリーニングした。
6~8週間の雌性Balb/cマウスに対して、3T3-クローディン18.2安定形質転換細胞又はクローディン18.2をコードするプラスミドでそれぞれ免疫を行い、又は交互に免疫を行った。細胞で免疫を行う場合、毎回1×106 3T3-クローディン18.2安定形質転換細胞を完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントと混合した後、大腿部と足蹠に注射し、2週間後に異なる部位で再び免疫した。DNAで免疫を行う場合、20μgのプラスミドを1μgのCpGと混合した後、遺伝子銃(Biorad)を用いて40psiでマウスの腹部に直接投与し、毎週1回免疫した。融合準備の3日前に、高発現のHEK293-クローディン18.2安定形質転換細胞株を1×106細胞/50μL/匹とし、ショック免疫のために尾静脈注射した。3日後、マウスを殺し、膝窩リンパ節、鼠径リンパ節及び腸骨リンパ節を収集し、DMEMで研磨してB細胞に富む懸濁液を得、マウスの脾臓を取り出し、DMEMで研磨した後に遠心分離し、脾臓細胞懸濁液を得た。適量のリンパ節及び脾細胞の懸濁液とSP2/0を混合して、エレクトロフュージョン装置を用いて細胞融合を行った。
収集された一部のマウス脾臓と末梢リンパ節の細胞懸濁液に対して、Trizol RNA抽出キットで全RNAを抽出し、逆転写キット(SuperScript First-Strand Synthesis System、品番18080051)を用いて、軽鎖、重鎖の特異的プライマーを使用して逆転写を行い、それぞれ抗体の軽鎖、重鎖cDNAライブラリを得た。当該cDNAをテンプレートとし、軽鎖、重鎖可変領域プライマーPCRで抗体の軽鎖、重鎖可変領域断片を増幅し、ヒト抗体軽鎖定常領域Ckappa又はヒトIgG1重鎖定常領域CH1を含むファージプラスミド担体に制限酵素クローニングし、それぞれキメラ軽鎖ライブラリと重鎖ライブラリを形成した。軽鎖ライブラリにおける抗体断片をBspQIとSfiIで二重酵素切断した後、重鎖ライブラリに連結し、糸状ファージM13に基づくマウスキメラFabファージ表示ライブラリを形成し、ライブラリサイズは1.2×1010個であった。0.8mLのファージ(力価が約1x1013/mLである)と200μLの5%BSA/PBSを混合した後、1x107個のHEK293-クローディン18.1細胞を加え、1時間氷浴し、1000rpmで10分間遠心分離し、上清を収集し、上清と1x106個のHEK293-クローディン18.2細胞を混合し、1時間氷浴し、1000rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、1%BSA/PBSを1mL加え、5~10回繰り返して洗浄し、100mMのTEA(トリエチルアミン)溶解細胞を1mL加え、室温で10分間静置し、1MのTris-HCl(pH7.5)を0.5mL加えて中和した後、対数増殖期にあるTG1 E.coli.細胞を10mL感染し、37℃で30分間静置した。分子生物学の従来のプロセスに従って、ファージを回収し、力価を検出し、次のスクリーニングを行った。
HEK293-クローディン18.1、HEK293-クローディン18.2及びHEK293に対して、それぞれ5μM、0.5μM及び0μMのCell Tracker Green CMFDA Dye(Thermo、品番C2925)で指定されたように生細胞予備染色を行い、染料を洗浄した後、1:1:1で混合し、96ウェルプレート(2x105細胞/ウェル)に加え、ハイブリドーマ上清又は細菌誘導上清と結合し、氷浴で1時間インキュベートした後、AlexaFluro647で標識された第2の抗体抗mouse IgG Fc又は抗ヒトIgG F(ab)’2(Jackson ImmunoResearch)を加え、氷上で45分間インキュベートした。洗浄した後、PBS再懸濁細胞をウェルあたり100μL加え、フローサイトメーター(iQue Screener)を準備し、FL2チャンネルの蛍光強度によって、それぞれ3種類の異なる細胞群を特定した後、FL4チャンネルの被験抗体と各細胞群の結合状況を検出した。スクリーニングした抗体は、高い親和性でHEK293-クローディン18.2安定形質転換細胞に特異的に結合し、HEK293-クローディン18.1安定形質転換細胞及びHEK293細胞には結合しなかった。FACS検出により、クローディン18.2に結合できるがクローディン18.1に結合しないクローンをハイブリドーマ細胞から合計320個スクリーニングし、3回のpanningを経て、クローディン18.2に高い親和性で結合するがクローディン18.1に結合しないクローンをファージFabライブラリから62個スクリーニングした。
重鎖VH
<----------FR1----------> CDR1 <----FR2-----> CDR2 <----------
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTFGINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGSIKYNEKFKGKATLTTDKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMQISSLTSEDSAVYFCARFYYGNSFVSWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACAACTTTTGGTATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGACTTGAATGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGATGGTAGTATTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTACAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGATCAGCAGTTTGACATCTGAGGACTCGGCTGTCTATTTCTGTGCAAGGTTCTACTATGGTAACTCCTTTGTTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <--------------
DIVMTQSPSSLAVTAGEKVTMTCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQRPGQPPKLLLYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
ALTITSVQAEDLAVYYCQNDYTYPFTFGSGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGACTGCAGGAGAGAAGGTCACTATGACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAACAGAGACCAGGGCAGCCTCCTAAACTTTTGCTCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCGCTCTCACCATCACCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATACTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
クローン9A8:配列番号11-20
重鎖
<----------FR1----------> CDR1 <----FR2-----> CDR2 <---------
QVQLQQSGREVVRPGTSVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVKQRPGQGLEWIGGINPGSGDTVYNEKFKAKATLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TANMQLSSLTSDDSAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACGTGAGGTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACTTGATAGACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGGGATTAATCCTGGAAGTGGTGACACTGTGTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCATGACTGCCAACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGCGCAAGAAGGGTCCGTGGTAATTCGTTTGATTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIQMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKTGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTINSVQAEDLAVYYCQNNYYYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAAACAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACTGATTTCACTCTCACCATCAACAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTATTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
クローン9C9:配列番号21-30
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVSWIRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLSIRKDNSKSQ
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
VFLKMNSLQTDDTAMYYCARVGYGNSFANWGQGTLVTVSA
核酸配列
GAGGTCCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTGACCAACTATGGTGTTTCCTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGCAATATGGGCTGGTGGAAACACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGGAAAGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGTAGGGTATGGTAACTCGTTTGCTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTLSCKSSQTLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPLTFGAGTRLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTCTGAGCTGCAAGTCCAGTCAGACTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAGACTGGAAATAAAA
クローン9D12:配列番号31-40
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLQQSGREVVRPGTSVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVKQRPGQGLEWIGGINPGSGDTVYNERFKDKATLTADKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
SANMQLSSLTSDDSAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSA
核酸配列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACGTGAGGTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACTTGATAGACTGGGTTAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGGGATTAATCCTGGAAGTGGTGACACTGTGTACAATGAGAGGTTCAAGGACAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCTCTGCCAACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGCGCAAGAAGGGTCCGTGGTAATTCGTTTGATTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGQKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGKDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVFYCQNNYFYPLTFGAGTKLELK
核酸配列
GACATTGTGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTAACTGTGACAGCAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCGGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGGTCTGGAAAAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTTTTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
クローン13A8:配列番号41-50
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVKLVESGGGLVRPGGSLKVSCAASGITFSRYAISWVRQTPEKRLEWVATISSGDSYTYYLDSVKGRFTISRDDAKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TLYLQMSSLRSEDTAMYYCGRLGYGNAMDYWGQGTSVTVSS
核酸配列
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAAGTGTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCACTTTCAGTCGCTATGCCATATCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACTATTAGTAGCGGTGATAGTTACACCTACTATTTGGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACGATGCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGGAAGACTGGGGTATGGTAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
NIMMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
AACATTATGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン14H11:配列番号51-60
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTINNYGMSWVRQTPEKRLEWVATIIGGGSSTYYPDSLKGRFTISRDNAKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
NLYLQMSSLRSEDTALYYCVRLYFGNSFAYWGQGTLVTVSA
核酸配列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTATCAATAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTATTGGTGGTGGTAGTTCCACCTACTATCCTGACAGTTTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGTAAGACTCTACTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTVSCKSSQSLSNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPLTFGAGTKLELK
核酸配列
GACATTGTGATGACTCAGTCTCCATCCTCTCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTGTGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTCAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
クローン15A7:配列番号61-70
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQQSGAELVKPGYSVKLSCKASGYTFTNFGINWVRQRPEKGLEWIGWIFPGDGTTKYNENFKGKATLTTDKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMQLSRLTSEDSAVYFCARFYYGNSFVNWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGGAGCTGAACTGGTCAAGCCTGGGTATTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAATTTTGGTATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAAAAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGATGGCACTACTAAATACAATGAGAACTTCAAGGGTAAGGCCACACTGACAACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGGCTGACATCTGAAGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGGTTCTACTACGGTAACTCCTTTGTTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTLSCKSSQTLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIHWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTCTGAGCTGCAAGTCCAGTCAGACTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACGTGGTACCAGCAGAAACCGGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCCACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン15D11:配列番号71-80
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVSWIRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLSIRKDNSKSQ
------FR3----------> CDR3 <---FR4--->
VFLKMNSLQTDDTAMYYCARVGYGNSFANWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTGACCAACTATGGTGTTTCCTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGCAATATGGGCTGGTGGAAACACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGGAAAGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGTAGGGTATGGTAACTCGTTTGCTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNLRNYLTWYQQKPGRPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPLTFGAGTKLELK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCTAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCGGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
クローン15F9:配列番号81-90
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGINWVKQAPGKGLKWMGWINPNTGETTYAEEFKGRFALSWKTSAS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYLQINNLKNEDTATYFCARLYYGNRFDYWGQGTTLTVSS
核酸配列
GAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATACCTTTACAAACTATGGAATAAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACCCCAACACTGGAGAAACAACATATGCTGAAGAGTTCAAGGGACGGTTTGCCCTCTCTTGGAAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGACTCTACTATGGTAATCGATTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNAYYYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCCTCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTATTAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTATTTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGCCTCCTAAACTATTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCCAGAATGCTTATTATTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン18A9:配列番号91-100
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQQSGREVVRPGTSVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVKQRPGQGLEWIGGINPGSGDTVYNEKFKAKATLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TANMQLSSLTSDDSAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACGTGAGGTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACTTGATAGACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGGGATTAATCCTGGAAGTGGTGACACTGTGTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCATGACTGCCAACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGCGCAAGAAGGGTCCGTGGTAATTCGTTTGATTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMSQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGKDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLALYYCQNNYFYPLTFGAGTKLELK
核酸配列
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAATTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAAAAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
クローン18G5:配列番号101-110
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLQQSGREVVRPGTSVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVKQRPGQGLEWIGGINPGSGDTVYNEKFKAKATLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TTNMQLSSLTSDDSAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSA
核酸配列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACGTGAGGTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGATACGCCTTCACTAATTACTTGATAGACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGGGATTAATCCTGGAAGTGGTGACACTGTGTACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCTCCATGACTACCAACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGCGCAAGAAGGGTCCGTGGTAATTCGTTTGATTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVRAGEKVTMTCKSSQSLFNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLLYWATARESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLSISSVQAEDLAVYYCQNVYFYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGAGAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTTAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTTTTGCTCTACTGGGCAACCGCTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGTTCTGGAACAGATTTCACTCTCTCCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGTTTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
クローン18D10:配列番号111-120
重鎖VH
<----------FR1----------> CDR1 <----FR2-----> CDR2 <----------
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGNTNYNPSLKSRISITRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFFLQLNSVTAEDTATYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSA
核酸配列
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTAATTATGCCTGGAACTGGATCCGACAGTTTCCAGGAAACAAACTAGAGTGGATGGGCTACATAAACTACAGTGGGAACACTAACTATAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTGCTGAGGACACAGCCACATATTATTGTGCAACCTCCTATTATGGTAATTCCTTTATTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <--------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNAYSFPWTFGGGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAGTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGCTTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン19B2:配列番号121-130
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQQSGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTTYGLNWVRQRPKQGLEWIGWIFPGDGNVNYNEKFQGQATLTTDKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMQLSRLTSEDSAVYFCARFYYGNSLNYWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCACAACCTATGGTCTAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTAAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTCCCTGGAGATGGTAATGTTAACTACAATGAGAAATTTCAGGGCCAGGCCACACTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGGTTTTATTACGGTAACTCCTTAAATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNLRNYLTWYQQKPGRPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCTAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCGGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATTTTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン25A5:配列番号131-140
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVSWIRQPPGKGLEWLGAIWAGGNTNYNSALMSRLSIRKDNSKSQ
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
VFLKMNSLQTDDTAMYYCARVGYGNSFANWGQGTLVTVSA
核酸配列
GAGGTCCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTGACCAACTATGGTGTTTCCTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGCAATATGGGCTGGTGGAAACACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGGAAAGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGTAGGGTATGGTAACTCGTTTGCTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGIPDRFIGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDVSVYYCQNNYIFPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGATCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACGTGTCAGTTTATTACTGTCAGAATAATTATATTTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
クローン25F5:配列番号141-150
重鎖
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLKQSGAELVKPGASLKLSCKASGYTFTTYGINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDATTMYNEKFKGTATLTADKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMQLSGLTSEDSAVYFCARFYYGNSFVDWGQGTLVTVSA
核酸配列
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTCAAGCCTGGGGCTTCACTCAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAACTTATGGTATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGATGCAACCACTATGTACAATGAGAAATTCAAGGGCACGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGGTTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGGTTCTACTACGGTAACTCCTTTGTTGACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
軽鎖
<----------FR1--------> CDR1 <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
TLTISSVQAEDLAVYYCQNAYYYPLTFGAGTKLEIK
核酸配列
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGCTTATTATTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
対数増殖期にある細胞を予熱培地で1回洗浄し、1000rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、血清を含まない培地を加えて、細胞を1×106細胞/mLに再懸濁させ、細胞をEP管に200μL/管で吸引し、予冷された0.5%BSA/PBSを500μL加え、1000rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、10μg/mLの抗体を加え、37℃で15分間、30分間、60分間、120分間、180分間、240分間それぞれインキュベートし、各時点で第1の抗体のインキュベートが終了した後、予冷された0.5%BSA/PBSを500μL加えて2回洗浄し、次に1:300で希釈された第2の抗体を直接加えて45分間インキュベートした。第2の抗体のインキュベートが終了した後、500μLの0.5%BSA/PBSで2回洗浄し、細胞を200μLに再懸濁させてFACS検出を行った。結果は図5に示すとおり、15D11、15F9、18A9及び18D10などの抗体は、細胞内取り込みを媒介する機能を有することが分かった。
選択されたモノクローナル抗体の可変領域配列をヒト胚抗体配列と比較し、相同性が高い配列を見つけてCDR移植を行い、その後にコンピュータを利用して相同性モデリングを行い、CDR領域及びその周辺のフレームワークアミノ酸配列を分析し、その空間立体結合方式を考察した。静電気力、ファンデルワールス力、親疎水性、及びエントロピーを計算することによって、陽性モノクローナル抗体の遺伝子配列における、標的と相互作用し空間的フレームワークを維持し得る重要な個々のアミノ酸を分析し、これに基づいて復帰変異部位を設計した。HLA-DRの親和性を分析して考察し、免疫原性の低いヒト胚フレームワーク配列を選択した。発酵過程において修飾され得るアミノ酸残基を分析し、かつ突然変異を設計することにより修飾が発生する可能性を低減した。
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGETTYAEGFTGRFVLSWDTSVS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYLQISSLKAEDTAVYFCARLYYGNRFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGATTCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACATTCACCAACTACGGCATCAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCTGGATCAACCCCAACACCGGCGAGACAACATACGCCGAGGGCTTCACAGGCAGATTCGTGCTGAGCTGGGATACCAGCGtCAGCACAGCTTACCTGCAGATCaGcAGCCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGACTGTACTACGGCAACAGATTCGACTCTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT
15F9VHv5r1:配列番号156-160
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGETTYAEEFKGRFVFSLDTSVS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYLQISSLKAEDTAVYFCARLYYGNRFDSWGQGTLVTVSS
CAGgtgCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACATTCACCAACTACGGCATCAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCTGGATCAACCCCAACACCGGCGAGACAACATACGCCGAGGAGTTCAAGGGCAGATTCGTGtTcAGCctgGATACCAGCgtcAGCACAGCTTACCTGCAGATCaGcAGCCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGACTGTACTACGGCAACAGATTCGACTCTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT
15F9VHv5r2:配列番号161-165
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGETTYAEEFKGRFVFSLDTSVS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYLQISSLKAEDTAVYFCARLYYGNRFDSWGQGTLVTVSS
GAGgtgCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACATTCACCAACTACGGCATCAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCTGGATCAACCCCTACACCGGCGAGACAACATACGCCGAGGAGTTCAAGGGCAGATTCGTGtTcAGCctgGATACCAGCgtcAGCACAGCTTACCTGCAGATCaGcAGCCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGACTGTACTACGGCAACAGATTCGACTCTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT
15F9VHv6:配列番号166-170
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWINPGTGETTYAEGFTGRFVLSWDTSVS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYLQISSLKAEDTAVYFCARLYYGNRFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGATTCAGCTGGTGCAGTCTGGCAGCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACATTCACCAACTACGGCATCAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCTGGATCAACCCCGGCACCGGCGAGACAACATACGCCGAGGGCTTCACAGGCAGATTCGTGCTGAGCTGGGATACCAGCGtCAGCACAGCTTACCTGCAGATCaGcAGCCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGACTGTACTACGGCAACAGATTCGACTCTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT
18A9VHv1:配列番号171-175
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACGCCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCATGACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv2:配列番号176-180
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGYTFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADESTS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACGAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv3:配列番号181-185
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGYTFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCATGACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv4:配列番号186-190
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADKSSM
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCATGACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv5:配列番号191-195
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGYTFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTITADESTS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGTCTACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv6:配列番号196-200
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKPSGYAFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADKSSS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TAYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACGCCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18A9VHv7:配列番号201-205
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKPSGYTFTNYLIDWVRQAPGQGLEWMGGINPGSGDTVYNEKFQGRVTLTADTSTS
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
TVYMELSSLRSEDTAVYFCARRVRGNSFDSWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGCCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACCTGATCGACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCATCAACCCTGGCAGCGGCGATACAGTGTACAACGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACACCTCTACCAGCACCGTCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGAAGAGTGCGGGGCAACAGCTTCGATTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv1:配列番号206-210
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSNYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATCGGCTACATCAACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv2:配列番号211-215
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINYSGNTNYNPSLKSRITISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGGCAGCATCAGCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATGGGCTACATCAACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAATCACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv3:配列番号216-220
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGGCAGCATCAGCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATCGGCTACATCAACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv4:配列番号221-225
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGYTNYNPSLKSRVTISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGGCAGCATCAGCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATCGGCTACATCAACTACAGCGGCTACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv5:配列番号226-230
<-----------FR1---------> CDR1 <-----FR2----> CDR2 <----------
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTAYNPSLKSRVTISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGGCAGCATCAGCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATCGGCTACATCAACTACAGCGGCAACACCGCCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
18D10VHv6:配列番号231-235
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QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNYAWNWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKN
------FR3-----------> CDR3 <---FR4--->
QFSLKLSSVTAADTAVYYCATSYYGNSFIYWGQGTLVTVSS
核酸配列
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCGGCAGCATCAGCAGCAACTACGCCTGGAACTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTCGAGTGGATCGGCTACATCTACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCTACTACGGCAACAGCTTCATCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT
15F9VLv1:配列番号236-240
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FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAGAAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGAACGCCTACTACTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
15F9VLv2:配列番号241-245
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FR3-------------> CDR3 <--FR4--->
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGCAGGCCTACTACTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
15F9VLv3:配列番号246-250
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCGGCAACCAGAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGCAGGCCTACTACTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
18A9VLv1:配列番号251-255
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAAAGGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACAACTACTTCTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
18A9VLv2:配列番号256-260
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACTACTTCTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
18D10VLv1:配列番号261-265
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核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGAACGCCTACAGCTTCCCCTGGACATTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
18D10VLv2:配列番号266-270
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TLTISSLQAEDVAVYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK
核酸配列
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGTCAGCAGGCCTACAGCTTCCCCTGGACATTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
1)ヒト化抗体の親和性測定(EC50)
対数増殖期にある細胞を3%BSAで30分間密封し、5×104細胞/100μLで96ウェルU底プレートに播き、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を軽く振動させて分散させ、段階希釈された抗体(抗体濃度を100nMから8段階に5倍希釈した)をウェルあたり50μL加え、4℃で1時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、0.5%BSAをウェルあたり140μL加えて3回洗浄し、30μL/ウェルでAF 647 APC抗ヒト第2の抗体を加えて4℃で40分間インキュベートした。インキュベートが終了した後、0.5%BSAをウェルあたり140μL加えて3回洗浄し、最後にウェルあたり50μLのPBSに再懸濁させ、iQue(Intellicyt、USA)検出を行った(表2参照)。
新しく抽出した血液を30mL収集して50mLの遠心管に加え、15mLの1×PBSと均一に混合し、別の50mLの遠心管にFicoll.Paque Pluを20mL加え、次に上記希釈された新鮮な血液30mLを軽く加えてFicoll.Paque Pluの表面に広げ、それを20℃に置き、2000rpmで30分間遠心分離した。遠心分離が終了した後、使い捨て吸引管を用いて遠心管中の最上層の血清を吸引し、上から下まで4層の液体のうち第2層の白膜層(即ちPBMC)を管あたり10mLで50mLの遠心管に吸引した。分離して得られたPBMCを、その体積の3倍よりも大きい1×PBSに加えて均一に混合し、4℃で10分間、1300rpmで遠心分離し、上清を吸引して除去した後、10mLの1×PBSを加えて再懸濁してカウントした。
対数増殖期にあるKato III細胞をPBSで洗浄した後に、密度1×107細胞/mLに再懸濁させ、一定量のCFSE(Sigma、87444-5MG-F)を加えてその終濃度を1μMにした。細胞を室温で置いて10分間インキュベートした後、3倍体積の培地を追加して終了し、4℃で5分間、1000rpmで遠心分離し、培地を追加して細胞の密度を2×106細胞/mLに調整した。懸濁した細胞を50μL/ウェルで96ウェルプレートに播き、それぞれ希釈された抗体(抗体を30μg/mLから0.12μg/mLまで5段階に3倍希釈した)を50μL/ウェルで加え、最後に培地を用いて30%に希釈した補体を50μL/ウェルで加えた。5%CO2インキュベーター内に置いて2時間培養した後、取り出して1000rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、1:200で希釈されたPI及び5×104個/ウェルのSulfate latex(Invitrogen、S37227)を均一に混合し、96ウェルプレートに100μL/ウェルで加え、氷上で10分間インキュベートした後にFACS検出を行った。結果は図7に示したとおり、ヒト化組み換えた抗体18D10及び15F9は、いずれも強いCDC効果を有することが分かった。
PBSで10μg/mLのポリリジン溶液を調製し、24ウェルプレートにウェルあたり0.5mL加え、37℃で静置して15~30分間インキュベートした。2×104細胞/ウェルで細胞を接種し、予熱されたDMEM培地で10μg/mLの抗体溶液を調製し、ウェルプレート中の上清を吸引し、対応する抗体を含む培地をウェルあたり0.5mL加え、37℃のインキュベーターで30分間インキュベートした。上清を丁寧に吸引し、PBSを0.5mL加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。各ウェルに10%ホルムアルデヒドを加え、20~40分間固定した。ホルムアルデヒドを丁寧に吸引・除去し、0.2%Triton-PBSを0.5mL加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。PBSでAF594-F(ab’)2ヤギ抗hIgG(H+L)第2の抗体溶液(1:300)を調製し、ウェルあたり100μL加え、室温で45分間インキュベートした。第2の抗体溶液を丁寧に吸引・除去し、0.2%Triton-PBSを0.5mL加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。8μg/mLのヒトLamp-1/CD 107a MAbを調製し、ウェルあたり100μL加え、室温で45分間インキュベートした。抗体溶液を丁寧に吸引・除去し、0.2%Triton-PBSを0.5ml加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。PBSでAF488-F(ab’)2ヤギ抗mIgG(H+L)溶液(1:300)を調製し、ウェルあたり100μL加え、室温で45分間インキュベートした。上清を丁寧に吸引・除去し、0.1%Triton-PBSを0.5mL加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。PBSで1μg/mLのDAPI溶液を調製し、室温で5分間染色し、上清を丁寧に吸引・除去し、0.1%Triton-PBSを0.5mL加え、5分間静置し、上記操作を繰り返して3回洗浄した。90%グリセリンで密封し、写真を撮った。結果は図8に示したとおり、ヒト化Claudin18.2抗体が主に細胞膜に結合し、一部の抗体は細胞内に取り込まれた後にリソソームに入ることができる(矢印に示されたとおりである)ことが分かった。
Claims (10)
- アミノ酸配列の配列番号2-4、12-14、22-24、32-34、42-44、52-54、62-64、72-74、82-84、92-94、102-104、112-114、122-124、132-134、142-144、152-154、157-159、162-164、167-169、172-174、177-179、182-184、187-189、192-194、197-199、202-204、207-209、212-214、217-219、222-224、227-229、232-234又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖CDR、及び/又は、アミノ酸配列の配列番号7-9、17-19、27-29、37-39、47-49、57-59、67-69、77-79、87-89、97-99、107-109、117-119、127-129、137-139、147-149、237-239、242-244、247-249、252-254、257-259、262-264、267-269又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖CDRを含む、ヒトクローディン18.2に結合する抗体又はその抗原結合部分。
- アミノ酸配列の配列番号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、157、162、167、172、177、182、187、192、197、202、207、212、217、222、227、232又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖CDR1、アミノ酸配列の配列番号3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、158、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、213、218、223、228、233又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖CDR2、アミノ酸配列の配列番号4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、159、164、169、174、179、184、189、194、199、204、209、214、219、224、229、234又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖CDR3、及び/又は、アミノ酸配列の配列番号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、237、242、247、252、257、262、267又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖CDR1、アミノ酸配列の配列番号8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118、128、138、148、238、243、248、253、258、263、268又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖CDR2、アミノ酸配列の配列番号9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、239、244、249、254、259、264、269又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖CDR3を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- アミノ酸配列の配列番号1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、156、161、166、171、176、181、186、191、196、201、206、211、216、221、226、231又はそれらの任意の変異体から選択された重鎖可変領域、及び/又は、アミノ酸配列の配列番号6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、236、241、246、251、256、261、266又はそれらの任意の変異体から選択された軽鎖可変領域を含む、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- (1)それぞれ配列番号152-154を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号237-239を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(2)それぞれ配列番号152-154を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号242-244を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(3)それぞれ配列番号152-154を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号247-249を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(4)それぞれ配列番号157-159を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号237-239を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(5)それぞれ配列番号157-159を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号242-244を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(6)それぞれ配列番号157-159を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号247-249を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(7)それぞれ配列番号162-164を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号237-239を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(8)それぞれ配列番号162-164を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号242-244を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(9)それぞれ配列番号162-164を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号247-249を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(10)それぞれ配列番号167-169を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号237-239を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(11)それぞれ配列番号167-169を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号242-244を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(12)それぞれ配列番号167-169を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号247-249を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(13)それぞれ配列番号172-174を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(14)それぞれ配列番号172-174を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(15)それぞれ配列番号177-179を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(16)それぞれ配列番号177-179を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(17)それぞれ配列番号182-184を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(18)それぞれ配列番号182-184を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(19)それぞれ配列番号187-189を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(20)それぞれ配列番号187-189を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(21)それぞれ配列番号192-194を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(22)それぞれ配列番号192-194を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(23)それぞれ配列番号197-199を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(24)それぞれ配列番号197-199を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(25)それぞれ配列番号202-204を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号252-254を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(26)それぞれ配列番号202-204を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号257-259を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(27)それぞれ配列番号207-209を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(28)それぞれ配列番号207-209を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(29)それぞれ配列番号212-214を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(30)それぞれ配列番号212-214を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(31)それぞれ配列番号217-219を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(32)それぞれ配列番号217-219を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(33)それぞれ配列番号222-224を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(34)それぞれ配列番号222-224を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(35)それぞれ配列番号227-229を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(36)それぞれ配列番号227-229を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(37)それぞれ配列番号232-234を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号262-264を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、(38)それぞれ配列番号232-234を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列、及び/又はそれぞれ配列番号267-269を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列という重鎖及び軽鎖のCDR組み合わせを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 前記抗体又はその抗原結合部分はヒト化される、前記請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
- 前記請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、又はそれに対して少なくとも60%より高く、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%より高い配列同一性を有する核酸分子。
- 請求項6に記載の核酸を含む、担体。
- 請求項7に記載の担体を含む、細胞又はキット。
- 前記請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は請求項6に記載の核酸、請求項7に記載の担体、又は請求項8に記載の細胞又はキットを含む、医薬組成物。
- 前記請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は請求項6に記載の核酸、請求項7に記載の担体、又は請求項8に記載の細胞又はキット、又は請求項9に記載の医薬組成物の、哺乳動物の癌を治療するための薬物又はキットの調製における用途であって、任意選択で、前記癌は胃癌であり、任意選択で、前記抗体は、ADCC又はCDC作用によって癌細胞を死滅させ、任意選択で、前記抗体は、その他の細胞毒性薬物と結合する、用途。
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