KR101637545B1 - Her2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 her2 저해제 내성 암을 진단하는 방법 - Google Patents

Her2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 her2 저해제 내성 암을 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 마커를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HER2 양성 암환자에게 통상적으로 처방되는 HER2 저해제에 대한 HER2 양성 암환자의 내성여부를 보다 용이하고, 현저히 높은 신뢰도로 판단할 수 있는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단키트 및 마커를 검출하는 방법 에 관한 것이다.

Description

HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법{Marker for diagnosing HER2 inhibitor resistance cancer, diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing HER2 inhibitor resistance cancer}
본 발명은 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HER2 양성 암환자에게 통상적으로 처방되는 HER2 저해제에 대한 HER2 양성 암환자의 내성여부를 보다 용이하고, 현저히 높은 신뢰도로 판단할 수 있는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
제약 업계는 현재 투여되는 약물보다 더 효과적이고, 더 특이적이거나 또는 더 적은 부작용을 가지는 신규한 약물 치료 선택권을 지속적으로 추구한다. 많은 확립된 약물의 효과에서 실질적인 차이를 야기하는 인간 집단 내 유전적 변이성으로 인해 약물 요법의 대안이 꾸준히 개발되고 있다. 따라서, 광범위한 약물 요법 선택권이 현재 이용 가능함에도 불구하고, 환자가 응답하지 못할 경우에 추가적인 요법이 항상 요구된다.
전통적으로, 전문의에 의해 사용되는 치료 패러다임은 질환을 치료하는데 있어서 가능한 제일 높은 성공률을 야기하는 제일선 약물의 요법을 처방하는 것이었다. 만일 첫 번째가 효과가 없으면 대안적인 약물 요법이 이후 처방된다. 이러한 패러다임은 분명 특정한 질환에 있어서는 최고의 치료 방법이 아니다. 예를 들어, 암과 같은 질환에서, 최초의 치료가 흔히 가장 중요하며 성공적인 치료를 위한 최고의 기회를 제공하고, 따라서 특정 환자의 질환에 대해 가장 효과적일 최초 약물을 선택할 증대된 필요성이 존재한다. 이러한 필요성은 암환자도 예외가 아니며, 암환자 역시 치료시점에서 가장 효과적인 약물을 통한 접근이 요구된다.
한편, HER 족의 수용체 티로신 키나아제는 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개체이다. 이러한 수용체 족에는 표피성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1, 또는 HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)가 포함되는 4가지 별개의 구성원이 포함된다. 이러한 HER족의 유전자들은 인간의 악성 종양에 인과적으로 연루되어 있는 것으로 보고 되고 있으며, 그 중에서도 HER2와 관련된 P185neu는 화학적으로 처치된 래트의 신경모세포종으로부터의 형질전환 유전자의 생성물로서 최초로 단리되었다. 활성화 형태의 neu 원(原)-종양유전자는 코딩된 단백질의 막통과 영역에서의 점돌연변이(발린에서 글루탐산으로의 돌연변이)로부터 유래된 밝혀졌다. 상기 neu의 인간 상동체의 증폭이 유방암 및 난소암에서 관찰되고, 불량한 예후와 상관된다는 것이 [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)], [Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)] 등의 문헌에 기 보고되었다. 또한, 상기 HER2의 과발현이 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 암종이 포함되는 또 다른 암종에서 또한 관찰되어 상기와 같은 암에도 HER2가 연관되어 있음이 지속적으로 보고되고 있다.
현재까지 보고되는 자료에 의하면 모든 유방암의 약 15 내지 20%는 그의 세포 표면에서 HER2 단백질의 과발현을 갖고, 이러한 종양은 HER2 단백질 과발현이 없는 경우보다 더 나쁜 예후를 갖는 것으로 알려지고 있다.
이에 종래에는 HER2 단백질의 과발현을 갖는 암세포의 성장을 중지시키기 위한 수단으로 HER2 시그널링(signaling)을 표적화한 다수의 약물이 개발되었다. 이들 약물 중의 하나는 제넨테크(Genentech)에 의해서 개발된 허셉틴 (Herceptin, Trastuzumab)이다. 허셉틴은 HER2 과발현이 있는 진행된 유방암으로 진단된 환자에게서 생존을 연장시키는데 효과적인 것으로 나타났으며, 또한, HER2 단백질 과발현 또는 HER2 유전자 증폭을 갖는 초기 단계 유방암을 갖는 환자에게서 재발 및 사망을 감소시키는 것으로도 보고되고 있다.
이에 따라, HER2 양성 암, 특히 유방암으로 진단될 경우, 통상적으로 허셉틴을 처방하게 되는데, 처방 후 유방암이 완치된 환자가 일정기간 경과 후 암이 재발하거나 암 전이까지 발생하는 경우가 속출하였고, 이러한 원인으로 허셉틴 내성의 획득기전이 발생한 것으로 입증되고 있다. 상기와 같은 입증의 일예로 종양유전자인 HER2/neu의 돌연변이에 의해 정해진 시기에 유선 종양을 일으킨 후 멈추도록 프로그램화된 형질전환시킨 쥐들은 HER2/neu 전이유전자(transgene)의 발현이 멈춘 이후 1 ~ 9개월 사이에 대부분의 쥐들에게서 새로운 종양들이 생겨났으며, 이 종양들은 명백히 초기에 생성된 종양의 변종들로써, HER2/neu의 과다발현과 무관한 것으로 밝혀졌다.
결국 암세포들의 불안정한 유전체들은 새로운 대립유전자들을 생성하여 새로운 성질을 갖춰 증식 능력을 향상시키게 되고, 이러한 유전적/후생유전적 변화를 획득한 세포들은 그 수를 확장하여 암 재발을 유발함으로써, 초기의 종양세포 수 감소에 대한 성공을 거둔 후 그에 대한 내성을 지닌 새로운 형태의 암세포가 증식을 하게 됨에 따라 암치료에 있어 처방약물의 내성여부를 판별하는 것이 매우 중요하다.
그러나 현재까지 HER2 양성 암환자에 처방되는 허셉틴 등의 HER2 저해제에 대해 암환자가 내성을 갖는지 여부를 판별할 수 있는 바이오 마커, 진단 키트는 연구개발 중에 있어 상용품이 없으며, 시제품의 경우에도 높은 신뢰성을 갖지 못하는 문제점이 있다. 이러한 현 상황으로 인해 HER2 양성 암환자에게 통상적으로 허셉틴과 더불어 고가의 라파티닙(lapatinib)과 같은 약제를 복합 처방할 수밖에 없는 경우가 대부분이고, 이러한 복합처방은 환자별 맞춤진료가 아닌 여러 경우의 수를 모두 포함시킨 처방이어서 과다 진료에 해당되는 문제점이 있다. 나아가, 이러한 과다진료는 불필요한 약물의 처방에 따른 환자의 약물부작용 발생 및 진료비용을 상승시키는 치명적인 문제점이 초래하고 있다.
이에 따라 HER2 저해제에 대해 암환자가 내성을 갖는지 여부를 높은 신뢰성을 가지고 용이하게 판별할 수 있는 바이오 마커, 진단 키트 등이 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HER2 양성 암환자에게 통상적으로 처방되는 HER2 저해제에 대한 HER2 양성 암환자의 내성여부를 보다 용이하고, 현저히 높은 신뢰도로 판별함을 통해 HER2 저해제 내성 암환자에게 2차 계열 약제(second-line drug) 처방을 통한 완치기회를 제공하고, 이러한 HER2 저해제 내성환자에게 HER2 저해제 처방을 방지하여 환자의 약물 부작용 발생가능성을 최소화함과 동시에 진료비용 상승을 방지할 수 있는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 하기 (1) 및 (2) 조건 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가됨.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 하기의 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상을 만족할 수 있다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 35% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 13% 이상 발현 증가됨.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 ARHGEF12(Entrez Gene ID 23365), ATF4(Entrez Gene ID 468), CCL22(Entrez Gene ID 6367), CHEK2(Entrez Gene ID 11200), CTNNA1(Entrez Gene ID 1495), CYCS(Entrez Gene ID 54205), EGF(Entrez Gene ID 1950), EGLN2(Entrez Gene ID 112398), ENAH(Entrez Gene ID 55740), EPAS1(Entrez Gene ID 2034), FARP2(Entrez Gene ID 9855), FES(Entrez Gene ID 2242), FRAT1(Entrez Gene ID 10023), ICOSLG(Entrez Gene ID 23308), JAM3(Entrez Gene ID 83700), JUP(Entrez Gene ID 3728), LIMK2(Entrez Gene ID 3985), MAPK10(Entrez Gene ID 5602), MAPKAPK5(Entrez Gene ID 8550), MMP9(Entrez Gene ID 4318), NFATC4(Entrez Gene ID 4776), PER2(Entrez Gene ID 8864), PTPRF(Entrez Gene ID 5792), RAD51(Entrez Gene ID 5888), RPS6KA5(Entrez Gene ID 9252), SMAD1(Entrez Gene ID 4086), STAT3(Entrez Gene ID 6774), TIAM1(Entrez Gene ID 7074), TICAM1(Entrez Gene ID 148022), TJP2(Entrez Gene ID 9414), TPM1(Entrez Gene ID 7168) 및 VAMP4(Entrez Gene ID 8674)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 ATF4(Entrez Gene ID 468), CHEK2(Entrez Gene ID 11200), EGF(Entrez Gene ID 1950), EGLN2(Entrez Gene ID 112398), ENAH(Entrez Gene ID 55740), FARP2(Entrez Gene ID 9855) 및 RAD51(Entrez Gene ID 5888)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)이고, 상기 HER2 저해제 내성 세포주는 JIMT-1일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 암은 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암, 편평 세포암, 전립성암, 위암, 유방암 및 결장직장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 하기의 조건 (3)을 더 만족할 수 있다.
(3) HER2 저해제 민감 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 민감 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 17% 이상 발현 감소됨.
한편, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 HER2 저해제 내성 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 및 단백질 칩 키트 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 하기 (1) 및 (2) 조건 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;를 포함하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가됨.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 하기의 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상을 만족할 수 있다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 35% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 13% 이상 발현 증가됨.
한편, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, HER2 저해제 내성 여부에 대한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 통해 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA 발현 수준의 측정은 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하여, 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행;하고, 상기 단백질 발현 수준의 측정은 해당 단백질에 특이적인 항체를 포함하여, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행;할 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, HER2 양성 암환자의 HER2 저해제 복용에 따른 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 HER2 양성 암환자의 시료로부터 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현수준을 대조구 시료에서의 해당 유전자 발현수준과 비교하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 제공한다.
한편, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, HER2 저해제 내성 연관 유전자의 HER2 저해제 내성 진단용 마커로써의 용도를 제공한다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 HER2 저해제 내성 환자를 진단하는 단계; 및
진단 결과 HER2 저해제에 대한 내성이 음성으로 진단된 환자에 대해 HER2 저해제를 투여하여 암세포를 치료하는 단계;를 포함하는 HER2 양성종양 치료방법을 제공한다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 HER2 저해제 내성 환자를 진단하는 단계; 및
진단 결과 HER2 저해제에 대한 내성이 양성으로 진단된 환자에 대해 HER2 내성 억제제 및 HER2 저해제를 투여하여 암세포를 치료하는 단계;를 포함하는 HER2 양성종양 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대해 정의한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “대상” 또는 “환자”는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
본 발명에서 사용한 용어인 “샘플” 또는 “조직 샘플” 또는 “환자 샘플” 또는 “환자 세포 또는 조직 샘플” 또는 “표본” 각각은 대상체 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 수집을 지칭한다. 조직 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 기관으로부터의 고체 조직 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인액; 혈액 또는 임의의 혈액 구성요소; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복강액 또는 간질액; 또는 대상체의 임신 또는 발생의 임의의 시간으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 사실상 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다. 통상적인 방식으로, 예컨대 FFPE 방식으로 세포가 고정될 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어인 “마커”는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물(예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “핵산”은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두 개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “유전자”는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절 시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어인 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “표지”는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어인 “암”, “종양” 은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다.
본 발명에서 사용한 용어인 “저해제(inhibitor)”는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 HER2 저해제는 HER2의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질이다. 상기 저해제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함할 수 있다.
본 발명은 HER2 양성 암환자에게 통상적으로 처방되는 HER2 저해제에 대한 HER2 양성 암환자의 내성여부를 보다 용이하고, HER2 저해제 중에서도 특히 허셉틴 내성 여부를 현저히 높은 신뢰도로 판단할 수 있다. 또한, 높은 신뢰도로 HER2 저해제 내성여부를 판별할 수 있기 때문에 HER2 저해제 내성으로 판별된 환자에게는 처음부터 HER2 저해제를 처방하지 않을 수 있어 불필요한 HER2 저해제 처방에 따른 암환자의 HER2 저해제 부작용 및 과다 진료에 따른 비용상승을 줄일 수 있다. 나아가, 암환자에게 맞지 않은 처방을 방지해 암환자가 적합한 치료시기를 놓치거나 2차 계열 약제(second-line drug) 등 새로운 처방을 통해 치료를 받을 수 있는 기회 상실을 최소화할 수 있다. 더 나아가, HER2 저해제에 대한 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 포함된 HER2 시그널링에 관계된 여러 경로에 대한 표이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 상기 시스템 생물학 접근에 의해 선별된　HER2　저해제 내성 관련 시그널링 경로들을　나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 [GSE15043] 데이터세트에서 유도된　HER2　저해제 내성 네트워크와　4개의 HER2　저해제 내성 관련 데이터세트들을 비교한 벤 다이어그램을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 허셉틴 투여 후 24시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 허셉틴 투여 후 48시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 넉다운된 HER2 저해제 민감 세포주 및 HER2 저해제 내성 세포주의 세포 생존성 평가 그래프이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대한 임상실험 결과에 대한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대한 임상실험 결과에 대한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대한 임상실험 결과에 대한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 임상평가에 사용된 HER2 저해제 민감성 환자에 대한 임상적 정보에 대한 모식도이다.
도 11은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 임상평가에 사용된 HER2 저해제 내성 환자에 대한 임상적 정보에 대한 모식도이다.
도 12는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 처리에 따른 HER2 저해제 민감 세포주 및 HER2 저해제 내성 세포주의 일수별 생존곡선 그래프이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 처리에 따른 HER2 저해제 민감 세포주 및 HER2 저해제 내성 세포주의 HER2 단백질 발현정도를 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이 현재까지 HER2 양성 암환자에 처방되는 허셉틴 등의 HER2 저해제에 대해 암환자가 내성을 갖는지 여부를 판별할 수 있는 상용화된 바이오 마커, 진단 키트는 존재하지 않으며, 현재까지 연구만 계속되고 있는 실정이고, 연구된 시제품의 경우에도 높은 신뢰성을 갖지 못하는 문제점이 있었다. 신뢰성이 높지 않은 마커를 통해 HER2 저해제 내성 여부를 진단하기 용이하지 않음에 따라 HER2 양성 암환자에게 통상적으로 허셉틴과 더불어 고가의 라파티닙(lapatinib)과 같은 약제를 복합 처방할 수밖에 없는 경우가 대부분이고, 이러한 복합처방은 환자별 맞춤진료가 아닌 여러 경우의 수를 모두 포함시킨 처방임에 따라 과다 진료로써, 불필요한 약물의 처방에 따라 환자의 약물부작용이 발생하고, 진료비용이 상승되는 치명적인 문제점이 있었다.
이에 본 발명에서는 하기 (1) 및 (2) 조건 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 HER2 저해제에 대한 HER2 양성 암환자의 내성여부를 보다 용이하고, 현저히 높은 신뢰도로 판별함을 통해 HER2 저해제 내성 암환자에게 2차 계열 약제(second-line drug) 처방을 통한 완치기회를 제공하고, 이러한 환자에게 HER2 저해제 처방을 방지하여 환자의 약물 부작용 발생가능성을 최소화함과 동시에 진료비용 상승을 방지할 수 있다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가됨.
먼저, 상기 HER2 저해제에 대해 설명한다.
상기 HER2 저해제는 HER2의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질이다. 상기 저해제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않으며, 이에 대한 비제한적인 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함할 수 있다. 다만, 바람직하게는 상기 HER2 저해제는 통상적으로 널리 사용되는 허셉틴 틴(Herceptin, trastuzumab)일 수 있고, 이에 따라 본 발명에 따른 마커 검출 조성물은 허셉틴에 의해 획득된 내성의 유무를 진단하는데 현저히 유용할 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 마커 검출용 조성물이 검출하려고 하는 mRNA 또는 이의 단백질과 관련된 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대해 설명한다.
먼저, HER2 저해제 내성 연관 유전자의 선별과정에 대해 설명한다.
구체적으로 도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 포함된 HER2 시그널링에 관계하는 각종 경로에 대한 표로써, 본 발명의 발명자는 HER2 저해제 내성 연관 유전자를 선별하기 위한 HER2 저해제 내성 네트워크를 시스템 생물학 접근(system biology approach)을 통해 선별하였다. 해당 내성 네트워크를 선발하기 위하여 미국 NCBI의 GEO에 보관되어 있는 [GSE15043] 데이터세트를 이용하였다.　
또한, 도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 상기 시스템 생물학 접근에 의해 선별된　HER2　저해제 내성 관련 시그널링 경로들을　나타낸 모식도이다.　
상기 경로들 중에는 허셉틴과　같은　HER2　저해제가 내성을 겪을 때 관여한다고 알려진　PI3K/Art　및　MAPK　경로도 포함하고 있다.　해당 모식도의 경로들은 상호소통 유전자(cross-talk gene,　구체적으로 도　2에서 노란색 음영으로 구획된 유전자)에 의해 아주 밀접하게 서로 연결되어 있음을 알 수 있다.
또한, 도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라GSE15043 데이터세트에서 유도된　HER2　저해제 내성 네트워크와　4개의 HER2　저해제 내성 관련 데이터세트들을 비교한 벤 다이어그램을 나타낸 모식도이다. 벤 다이어그램의 각 집합(set)은 해당 HER2 저해제 내성 관련 데이터세트와 [GSE15043] 데이터 세트에서 유도된 네트워크에서 공통으로 발현이 증가한 유전자들을 의미한다.　도　2의　HER2　저해제 내성 네트워크와 도 3의 4개 공인기관의　HER2　저해제 내성 연관 데이터세트에서 공통된 유전자를 선별함을 통해 도　3의 표와 같은　32개의 유전자를 선별할 수 있었다.
다음으로, 상기 선별된 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 어떤 세포가 HER2 저해제에 의해 내성이 있는지 여부를 진단할 수 있는 현저히 유용한 마커가 될 수 있음에 대해 설명한다.
구체적으로 상기 유전자가 HER2 저해제 내성여부를 진단하는데 유용한 마커일 수 있음은 HER2 저해제 내성 세포주 및 HER2 저해제 민감 세포주에 HER2 저해제 처리 후 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현량을 측정함을 통해 명확히 입증할 수 있다.
구체적인 설명에 앞서, HER2 저해제 내성 세포주 및 HER2 저해제 민감 세포주에 대해 설명한다. 상기 HER2 저해제 내성 세포주는 HER2 양성 종양(tumor)세포임에도 불구하고 HER2 저해제에 의해 내성이 획득되어 HER2 저해제가 처리되어도 세포생존이 크게 감소하지 않는 세포주로써, 당업계에 널리 공지된 HER2 저해제 내성 세포주일 수 있다. 다만, 바람직하게는 JIMT-1, MCF7 및 MDA-MB-231 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 JIMT-1일 수 있다. 상기 HER2 저해제 내성 세포주가 HER2 저해제에 대해 세포생존이 크게 감소하지 않는다는 것은 후술될 실시예 4의 실험을 통해 명확히 입증되며, JIMT-1에 HER2 저해제인 허셉틴을 처리 후 4일 경과 시에 허셉틴 비처리시에 비교해 세포 생존 감소가 오직 15% 이하에 불과함을 확인할 수 있다.(도 12 참조)
또한, 상기 HER2 저해제 민감 세포주란 HER2 양성 종양(tumor)세포로써 HER2 저해제에 대해 약물반응의 감수성이 높아 HER2 저해제 처리 시 세포생존이 크게 감소하는 세포주로써, 당업계에 널리 공지된 HER2 저해제 민감 세포주일 수 있다. 바람직하게는 상기 HER2 저해제 민감 세포주는 SKBR3, BT474, 및 MDA-453 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 SKBR2일 수 있다. 상기 HER2 저해제 내성 세포주가 HER2 저해제에 대해 세포생존이 크게 감소한다는 것은 후술될 실시예 4의 실험을 통해 명확히 입증되며, SKBR3에 HER2 저해제인 허셉틴을 처리 후 4일 경과 시에 허셉틴 비처리시에 비교해 세포 생존 감소가 30%를 초과함을 확인할 수 있다.(도 12 참조)
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 HER2 저해제 내성 세포주인 JIMT-1 및 HER2 저해제 민감 세포주인 SKBR3에 10 ㎍/㎖ 허셉틴 투여 후 24시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프로써, JIMT-1에서 허셉틴 처리로 인해 유전자 ARHGEF12는 발현량 약 65% 증가, 유전자 ATF4는 발현량 약 40%증가, 유전자 EGF는 발현량 약 37% 증가하는 등 HER2 내성 세포주인 JIMT-1에서는 대부분 유전자의 발현량이 증가한 반면에 HER2 저해제 민감 세포주인 SKBR3에서는 유전자 ATF4 발현량 약 33% 감소, 유전자 CHEK2 발현량 약 32% 감소되는 등 대부분의 유전자의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1 및 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에 10 ㎍/㎖ 허셉틴 투여 후 48시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프로써, 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1에서는 허셉틴 처리로 인해 유전자 ARHGEF12는 발현량이 약 128% 증가하였고, 유전자 ENAH는 발현량 약 51% 증가되는 등 거의 모든 유전자의 발현량이 증가한 반면에 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에서는 유전자 ICOSLG발현량 약 45% 감소되는 등 거의 모든 유전자의 발현량이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다.
상기와 같은 도 4 및 도 5의 실험결과는 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 HER2 저해제 내성 세포주 및 HER2 저해제 민감 세포주에서 HER2 저해제의 처리 후 발현양상이 달라 어떤 세포가 HER2 저해제에 대해 내성 또는 민감성인지를 진단할 수 있는 마커로써 유용할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 시간의존적인 경향을 보일 수 있고, 구체적으로 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 허셉틴이 투여된 후 허셉틴 내성 세포주 및 허셉틴 민감 세포주에서 시간-의존적으로 상향조절(up-regulation) 또는 하향조절(down-regulation)되는 경향을 보일 수 있다.
더 구체적으로 도 4 및 도 5의 실험결과를 통해 허셉틴 투여 후 시간이 24시간에서 48시간 경과할 때, 허셉틴 내성 세포주에서 유전자 ARHGER12, ICOSLG 등의 유전자는 허셉틴 투여 후 24시간 일 때 보다 48시간 일 때 현저하게 상향조절(up-regulation)됨을 확인할 수 있는 반면에, 허셉틴 민감 세포주에서 유전자 ARHGER12, CHECK2, CTNNA1 등 대부분의 유전자는 허셉틴 투여 후 24시간 일 때 보다 48시간 일 때 현저하게 하향조절(down-regulation)됨을 확인할 수 있다. 이를 통해 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 일부는 HER2 저해제 처리 후 시간이 증가할수록 상향조절 또는 하향조절이 더욱 심화되는 시간-의존적 경향을 보인다는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 HER2 저해제 처리에 따른 시간-의존적 경향은 다른 의미를 내포하는데, 구체적으로 도 4의 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1에서 TJP2 유전자는 허셉틴 처리 후 24시간 경과했을 때 다른 유전자들과 다르게 하향 조절된 반면에 48시간 경과했을 때에 동일 세포주에서 TJP2 유전자(도 5의 JIMT-1 참조)는 다른 유전자들과 마찬가지로 상향조절 되었고, 더 구체적으로 허셉틴 처리 후 24시간 경과시 TJP2 유전자의 발현량에 대비하여 48시간 경과시 TJP2 유전자는 발현량이 약 86% 증가했음을 확인할 수 있다. 또한, 도 4의 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에서 ICOSLG 유전자는 허셉틴 처리 후 24시간 경과했을 때 다른 유전자들과 다르게 상향조절된 반면에 48시간 경과 후 동일 세포주에서 ICOSLG 유전자는 허셉틴 처리 후 48시간 경과했을 때 다른 유전자들과 마찬가지로 하향조절 되었고, 더 구체적으로 허셉틴 처리 후 24 시간 경과시 ICOSLG 유전자 발현량에 대비하여 48 시간 경과시 ICOSLG 유전자는 발현량이 약 64%로 현저히 감소했음을 확인할 수 있다.
상기와 같은 결과는 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 허셉틴 투여 후 세포주의 허셉틴 민감성 정도에 따라 발현이 하향조절 또는 상향조절되기까지 소요되는 시간이 상이할 수 있어도, 종국에는 허셉틴 민감성 세포주에서는 발현이 하향조절되고, 허셉틴 내성 세포주에서는 발현이 상향조절된다는 것을 의미할 수 있고, 이러한 경향을 보이는 HER2 저해제 내성 연관 유전자(예를 들어 TJP2, ICOSLG)는 HER2 시그널링의 다운스트림(downstream)에 관여함에 따라 허셉틴에 따른 내성발현이 하향조절 또는 상향조절되기까지 소요된 시간이 다른 HER2 내성 연관 유전자보다 늦어진 것으로 볼 수 있다. 결국 HER2 저해제(예를 들어, 허셉틴) 처리는 HER2시그널링에 일시적으로 영향을 미치는 것이 아니고, HER2 시그널링의 다운스트림까지 영향을 지속적으로 미칠 수 있는 시간-의존적 경향을 보일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 마커 검출용 조성물의 검출 대상이 되는 마커가 유래된 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 HER2 저해제의 처리로 유전자 발현량에 있어 시간-의존적 경향을 나타냄에 따라 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 HER2 시그널링에 관계하는 각종 경로(pathway)에 포함된 유전자로써 HER2 저해제에 의해 상향조절(up-regulation)되고, 이러한 유전자는 하기의 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상을 만족한다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가된다.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가된다.
각 조건의 설명에 앞서, 상기 조건 (1) 및 (2) 중 어느 하나만을 만족해도 HER2 저해제 내성 여부를 판별함에 유용한 마커가 될 수 있는 이유를 먼저 설명한다. 상기 HER2 저해제 내성 연관 유전자 각각은 HER2 시그널링의 여러 경로에 포함되며, 상기 경로들은 HER2 저해제에 의해 직접적/간접적, 동시/순차적으로 시그널이 전달됨에 따라 상기 유전자의 발현량은 HER2 저해제 처리시부터 시간-의존적 경향을 보일 수밖에 없고, HER2 처리 후 특정 시간, 예를 들어 HER2 저해제 처리 후 24시간 경과 후 어떤 유전자의 발현량이 기준치보다 적어도, 48시간 경과 후에는 발현량이 증가할 수 있기 때문에 상기 (1) 조건을 만족하지 못한다 하여 HER2 저해제 내성 여부를 판별하는 마커로 부적당하다고 볼 수 없고, 이에 따라 (1) 및 (2) 조건 중 어느 하나만 만족해도 HER2 저해제 내성 여부를 판별함에 유용한 마커가 될 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 조건 (1)로써 HER2 저해제 내성 연관 유전자는, HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현이 증가한다.
도 4에서 살펴본 바와 같이 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1세포의 경우 허셉틴 처리 후 24시간 경과 시에 유전자 ARHGEF12는 발현량 약 65% 증가, 유전자 ATF4는 발현량 약 40%증가, 유전자 EGF는 발현량 약 37% 증가하는 등 HER2 내성 세포주인 JIMT-1에서는 대부분 유전자의 발현량이 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현이 증가하며, 바람직하게는 22% 이상 발현이 증가할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 35%이상 발현이 증가할 수 있다. 이러한 유전자에 의한 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정함을 통해 암환자가 HER2 저해제에 내성인지 여부를 판별함에 있어 보다 향상된 신뢰성을 가질 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 조건 (2)로써 HER2 저해제 내성 연관 유전자는, HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가한다.
도 5에서 살펴본 바와 같이 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1세포의 경우 허셉틴 처리후 48시간 경과시 유전자 ARHGEF12는 발현량이 약 128% 증가하였고, 유전자 ENAH는 발현량 약 51% 증가되며, 허셉틴 처리 후 24시간까지는 오히려 발현량이 감소했던 TJP2 유전자도 발현량이 약 35% 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현이 증가하며, 바람직하게는 9%이상, 보다 바람직하게는 13% 이상 발현이 증가할 수 있고, 이러한 유전자에 의한 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정함을 통해 암환자가 HER2 저해제에 내성인지 여부를 판별함에 있어 보다 향상된 신뢰성을 가질 수 있다.
이에 따라 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자로 ARHGEF12(Entrez Gene ID 23365), ATF4(Entrez Gene ID 468), CCL22(Entrez Gene ID 6367), CHEK2(Entrez Gene ID 11200), CTNNA1(Entrez Gene ID 1495), CYCS(Entrez Gene ID 54205), EGF(Entrez Gene ID 1950), EGLN2(Entrez Gene ID 112398), ENAH(Entrez Gene ID 55740), EPAS1(Entrez Gene ID 2034), FARP2(Entrez Gene ID 9855), FES(Entrez Gene ID 2242), FRAT1(Entrez Gene ID 10023), ICOSLG(Entrez Gene ID 23308), JAM3(Entrez Gene ID 83700), JUP(Entrez Gene ID 3728), LIMK2(Entrez Gene ID 3985), MAPK10(Entrez Gene ID 5602), MAPKAPK5(Entrez Gene ID 8550), MMP9(Entrez Gene ID 4318), NFATC4(Entrez Gene ID 4776), PER2(Entrez Gene ID 8864), PTPRF(Entrez Gene ID 5792), RAD51(Entrez Gene ID 5888), RPS6KA5(Entrez Gene ID 9252), SMAD1(Entrez Gene ID 4086), STAT3(Entrez Gene ID 6774), TIAM1(Entrez Gene ID 7074), TICAM1(Entrez Gene ID 148022), TJP2(Entrez Gene ID 9414), TPM1(Entrez Gene ID 7168) 및 VAMP4(Entrez Gene ID 8674)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 유전자들은 상술한 바와 같이 HER2 저해제 처리에 따라 유전자 발현량이 시간-의존적 경향을 보인다는 것은 도 4 및 도 5를 통해 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 발명자는 상기 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자들이 실제로 HER2 저해제 내성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 어느 하나의 유전자를 넉다운(knockdown)시켜 HER2 저해제를 처리한 후 세포 생존여부를 확인했다. 구체적으로 도 6은 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 넉다운된 HER2 저해제 민감 세포주 및 HER2 저해제 내성 세포주의 세포 생존성 평가 그래프로써, 32개의 유전자 중 어느 하나의 유전자가 넉다운된 세포의 경우 상기 세포가 HER2 저해제에 내성이 있다고 하더라도 HER2 저해제에 의해 세포 생존이 감소하였음을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 통해 상기 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 어느 하나가 넉다운된 세포는 그것이 HER2 저해제 내성 세포일지라도 HER2 저해제에 대해 민감성을 회복한 것을 알 수 있고, 상기 32개의 유전자는 HER2 저해제 내성에 연관된 유전자임을 보다 명확히 확인할 수 있으며, 상기 32개의 유전자는 HER2 저해제 내성 여부를 판별하는데 보다 유용한 마커임을 알 수 있다.
또한, 상술한 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상을 만족함에 더 나아가 하기의 조건(3)을 더 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자는 어떤 세포가 HER2 저해제에 내성이 있는지 여부를 보다 더 신뢰성 있게 판별할 수 있다.
(3) HER2 저해제 민감 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 민감 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 17% 이상 발현 감소됨.
상기 조건 (3)에서 HER2 저해제 민감 세포주는 바람직하게는 SKBR3일 수 있고, HER2 저해제는 허셉틴일 수 있다. 구체적으로 도 5에서 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에서는 허셉틴이 10㎍/㎖ 처리된 후 48시간 경과시 유전자 ICOSLG발현량이 약 45% 감소되는 등 거의 모든 유전자의 발현량이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 이에 반하여 HER2 저해제 내성 세포주인 JIMT-1에서는 허셉틴 처리 후 48시간 경과 후 해당 유전자, 예를 들어 ICOSLG의 발현량은 약 194% 증가함을 확인 할 수 있고, 이에 따라 상기 조건 (3)을 더 만족하는 유전자의 경우 어떤 세포가 HER2 저해제에 대해 내성인지 여부에 따라 HER2 저해제 처리 시 발현정도가 명확히 구별됨에 따라 HER2 저해제 내성인지 여부를 보다 명확히 판별하기에 유리할 수 있다.
한편, 상술한 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 일부는 실제 임상에서도 HER2 저해제 내성여부를 진단하는데 현저히 유용한 마커일 수 있는데, 구체적으로 도 7내지 9는 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대한 임상실험 결과에 대한 그래프로써, HER2 저해제에 민감한 3명의 환자와 HER2 저해제에 내성인 3명의 환자에게서 채취된 암세포의 32개 유전자별 발현정도를 평가하였다. 평가결과 ATF4(Entrez Gene ID 468), CHEK2(Entrez Gene ID 11200), EGF(Entrez Gene ID 1950), EGLN2(Entrez Gene ID 112398), ENAH(Entrez Gene ID 55740), FARP2(Entrez Gene ID 9855) 및 RAD51(Entrez Gene ID 5888)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자가 HER2 저해제에 민감한 3명의 환자군에서 채취한 암세포에서는 현저히 적게 발현된 반면에 HER2 저해제에 내성인 3명의 환자군에서 채취한 암세포에서는 현저히 과다 발현되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 상기 7개의 유전자들은 세포의 HER2 저해제 내성여부에 따라 해당 유전자의 발현량이 현저히 상향조절 또는 현저히 하향조절될 수 있음에 따라 암환자가 HER2 저해제에 내성인지 여부를 진단하는데 현저하게 효율적이고 동시에 진단의 신뢰성이 높을 수 있다.
다음으로 상술한 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제에 대해 설명한다.
본 발명에서 사용한 "HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현수준을 측정하는 제제"란 HER2 저해제에 의해 발현이 상향조절되는 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하고, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 의미한다.
HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현 수준은 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA의 발현수준 또는 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 HER2 저해제 내성 여부를 판별하기 위하여 생물학적 시료에서 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 HER 저해제 내성 여부를 판별하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
먼저, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있고, HER2 저해제 내성 연관 유전자, 바람직하게는 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 대한 정보에 따라 당업자는 상기 정보에 따른 유전자 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4기지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 HER2 저해제 내성 연관 유전자 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용해 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부 및 그 수준의 측정을 통해 HER2 저해제 내성 여부를 판별할 수 있다. 상기 PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 HER2 저해제 내성 연관 유전자 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 HER2 저해제 내성여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
다음으로 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물은 바람직하게는 상기 HER2 저해제에 대한 내성이 발생된 암이 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암, 편평 세포암, 전립성암, 위암, 유방암 및 결장직장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 암일 수 있다. 다만, 상기의 종류에 한정되는 것은 아니고 HER2 양성 암의 경우 대상기관, 암의 구체적 형태에 관계없이 해당될 수 있다.
다음으로 본 발명은 상술한 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는 HER2 저해제 내성 암 진단용 키트를 포함한다.
상기 키트는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 상기 키트에는 HER2 저해제 내성 암을 진단할 수 있는 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로 먼저 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대하여 당업자가 디자인한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로는 18s rRNA를 사용하였는데, 이에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
다음으로 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 (1) 및 (2) 조건 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;를 포함하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마이크로어레이를 포함하며, 이를 통해 통해 높은 신뢰성을 가지고 HER2 저해제 내성여부를 판별할 수 있다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 48시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가됨.
상기 조건 (1) 및 (2)에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 동일한바 생략하며, 이하 마이크로 어레이에 대해 구체적으로 설명한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성 조성물 또는 장치로 이루어진다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 널리 알려진 방법에 의할 수 있고 본 발명에서 이를 특별히 한정하지 않는다.
또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 널리 알려져 있는 방법에 의할 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
다음으로 본 발명은 HER2 저해제 내성 여부에 대한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 하기 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하는HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 포함한다.
(1) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 9% 이상 발현 증가됨.
(2) HER2 저해제 내성 세포주에 10 ㎍/㎖ HER2 저해제 투여시 24시간 경과 후 HER2 저해제 내성 연관 유전자 발현량이 HER2 저해제 비투여된 HER2 저해제 내성 세포주의 상기 유전자 발현량 대비 5% 이상 발현 증가됨.
먼저, 환자의 시료로부터 하기 조건 (1) 및 (2) 중 적어도 하나 이상의 조건을 만족하는 HER2 저해제 내성 연관 유전자;의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계에 대해 설명한다.
상기 “환자의 시료”란 HER2 저해제 내성여부 진단 마커 유전자인 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현 수준에서 차이가 발생하는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조건 (1) 및 (2) 에 대한 설명은 상술한 것과 같은바 이하 생략하기로 한다.
또한, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 구체적인 방법은 상기 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
이하, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 구체적인 방법과 상기 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;에 대해 같이 설명한다.
먼저, 상기 mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3에서의 mRNA 발현량과 HER2 저해제 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, HER2 저해제 내성 연관 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 HER2 저해제 내성 의심 환자의 실제 HER2 저해제 내성 획득 여부를 진단할 수 있다.
상기 mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, HER2 저해제 내성 진단 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용할 수 있다.
구체적으로 상기 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 HER2 저해제 내성 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하다. 또한, 상기 DNA 칩은 상기 마커인 HER2 저해제 내성 연관 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 HER2 저해제 내성의 획득 여부를 판독할 수 있다.
다음으로, 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 HER2 저해제 내성 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, HER2 저해제 내성 진단 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, HER2 저해제 내성 의심 환자의 실제 HER2 저해제 내성 획득 여부를 진단할 수 있다. 상기 “항원-항체 복합체”란 HER2 저해제 내성 연관 유전자에 따른 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
상기 단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용할 수 있다.
ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.　 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA방법에 의해서 검출한다. HER2 저해제 내성 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여 HER2 저해제 내성 획득 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는 상기 HER2 저해제 내성 진단 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다.　 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다.　 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, HER2 저해제 내성 획득 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3에서의 HER 저해제 마커 유전자의 발현량과 HER2 저해제 내성이 획득한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.　
또한, 바람직하게는, 상기 HER2 저해제 내성 진단 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 환자에게서 시료를 채취 및 고정한 후 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀포매 블록을 제조할 수 있다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 상기 파라핀포매 블록을 상기의 항체 중 선택된 어느 것과 공지의 방법에 의하여 반응시킬 수 있다. 이후 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 HER2 저해제 내성 진단 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다.　상기 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인함을 통해 HER2 저해제 내성 획득 여부를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3에서의 HER2 저해제 내성 유전자 발현 수준을 HER2 저해제 내성 의심환자에서의 상기 해당 유전자 발현 수준과 비교함으로써 HER2 저해제 내성 의심 환자의 실제 HER2 저해제 내성 여부를 진단할 수 있다. 즉, HER2 저해제 내성 의심환자의 세포로부터 본 발명에 따른 마커의 발현 수준을 측정하고, 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3에서의 본 발명에 따른 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명에 따른 마커의 발현 수준이 대조구 시료, 바람직하게는 HER2 저해제 민감성 세포주, 보다 더 바람직하게는 SKBR3세포주 에서의 발현 수준과 비교했을 때, 발현이 과다할 경우 HER2 저해제 내성으로 추정되는 세포를 HER2 저해제 내성 세포로 예측할 수 있다.
또한, 본 발명은 HER2 양성 암환자의 HER2 저해제 복용에 따른 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 HER2 양성 암환자의 시료로부터 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현수준을 대조구 시료에서의 해당 유전자 발현수준과 비교하는 HER2 저해제 내성 암을 진단하는 방법을 포함한다.
상기 HER2 저해제, HER2 저해제 내성 연관 유전자, 이의 발현수준의 측정방법은 상술한 바와 같으며, 상기 대조구 시료는 바람직하게는 HER2 저해제 민감 세포주일 수 있고, 보다 바람직하게는 SKBR3 세포주일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예 1> - HER2 저해제 내성 네트워크 및 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 선별
허셉틴 내성 네트워크를 상세히 기술하기 위해 시그널링 경로의 모든 가능한 서브세트(subset)를 확인할 수 있는 연관법칙(association rule)[Pathway-based evaluation et al ., (2012) PLoS One, 7:e31685](발현(expression) 및 도 1의 KEGG 경로에 기초함)을 적용하였다. 이 법칙은 임상전 데이터세트[GEO : GSE15043](BT474 약물-민감성(모세포) 및 4개의 BT474 딸 서브클론(daughter subclones)이 1.0 및 0.2μM 허셉틴에서 지속적으로 성장에 의한 내성을 위해 선택됨)에 적용되었다. 상기 서브세트(또는 서브 경로)는 노드(node) 뿐만 아니라 노드 간에 에지(edge)(예를 들어 활성, 저해)를 포함한다. 약물 내성에 연관된 상기 서브경로들은 916개 유전자 엔트리(gene entry)를 갖는 4502개의 서브경로를 구성하는 싸이토스케이프(Cytoscape) 소프트웨어를 사용해 도 2와 같은 네트워크를 나타낼 수 있었다.
이후에, 여러 허셉틴-내성 임상전 데이터세트([GEO: GSE15376] [Molecular profiling et al ., (2009) PLoS One, 4:e6146], [ArrayExpress: E-TABM-157] [A collection of breast cancer cell lines et al ., (2006) Cancer Cell, 10:515-527]) 및 관련된 임상 데이터세트를 통해 상기 네트워크에 포함된 복제 가능한 유전자 엔트리(reproducible gene entries)를 찾았다. HER2 양성 세포(SKBR3, BT474)는 허셉틴-반응적이었고, HER2 음성 세포(MCF7, MDA-MB-231)는 허세틴-비반응적임에 따라 상기 두 개의 임상전 데이터 세트에서 HER2-양성 세포와 HER2-음성 세포를 비교했다. 또한, 임상 데이터세트는 「The Cancer Genome Atlas」 및 「Netherlands Cancer Institute」유래의 HER2- 양성 재발성 유방암으로 점검되었다. 그 결과 도 3과 같은 HER2 저해제인 허셉틴 내성 연관 상향조절 유전자에 대한 4개 공인기관의 데이터 세트에서 공통된 32개의 상향조절 유전자를 선별할 수 있었다.
<실시예 2> - 선별된 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 HER2 저해제 처리 후 발현 수준 임상전 평가
선별된 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 하기 표 1의 유전자에 대해 HER2 저해제 처리 후 발현수준을 HER2 저해제 민감 세포주인 SKBR3 및 HER2 저해제 내성 세포주인 JIMT-1에서 평가하였다. 상기 인간 SKBR3 및 JIMT-1 세포들은 공공기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에서 제공된 것을 이용하였다. 상기 SKBR3 및 JIMT-1 인간 유방암 세포주는 세포 소생(resuscitation) 후 6개월 이내의 것을 이용하였다. SKBR3 세포들은 McCoy's 5A 배지(시그마-알드리치, 미국)에서, JIMT-1 세포들은 DMEM(하이클론, 써모피셔(Thermo Fisher), 미국) 배지에서 10% FBS(하이클론)가 투입된 37℃, 5% 이산화탄소의 배양조건에서 배양되었다. 이후 2.5×105 개의 세포들을 70 ~ 80%의 노목식(normoxic) 분위기하에서 접종(seed) 및 배양하였고, 이후 상기 두 세포주 각각에 대해 10㎍/㎖ 허셉틴 처리된 상태 및 허셉틴 미처리 상태로 4일 동안 배양하였다.
허셉틴 처리 후 시간에 따른 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 발현수준을 평가하기 위해 허세팁 처리후 24시간 경과했을 때 허셉틴 처리된 SKBR3 및 JIMT-1/허셉틴 미처리된 SKBR3 및 JIMT-1및 48시간 경과했을 때 허셉틴 처리된 SKBR3 및 JIMT-1/허셉틴 미처리된 SKBR3 및 JIMT-1세포에서의 유전자 발현수준을 하기의 방법에 의해 측정하였다.
총 RNA를 분리하기 위해 RNA 분리액(Isol-RNA Lysis Reagent, 5PRIME社, 독일)을 이용해 세포 용해액(cell lysates)으로부터 RNA를 분리하였다. 이후 RT-PCR 분석에 대한 주형을 얻기 위해 RNA를 gDNA 리무버 키트가 함유된 ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix(도요보, 일본)를 통해 cDNA로 합성했다. 정량 PCR은 CFX384 TouchTM Real-Time PCR Detection System(바이오래드社)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 iQTM SYBR® Green Supermix(바이오래드社) 시약을 사용해 수행하였다. 모든 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. 상기 과정을 통해 분석된 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.
Figure 112014103079661-pat00001
구체적으로 도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1 및 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에 10 ㎍/㎖ 허셉틴 투여 후 24시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프로써, 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1에서는 대부분의 유전자의 발현량이 증가한 반면에, 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에서는 대부분의 유전자의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있다.
구체적으로 도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1 및 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에 10 ㎍/㎖ 허셉틴 투여 후 48시간 경과 후 허셉틴 내성 연관 유전자 25개의 발현량에 대한 그래프로써, 허셉틴 내성 세포주인 JIMT-1에서는 거의 모든 유전자의 발현량이 현저하게 증가한 반면에 허셉틴 민감 세포주인 SKBR3에서는 거의 모든 유전자의 발현량이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다.
<실시예 3> - HER2 저해제 내성 연관 유전자의 넉다운 후 HER2 저해제 처리 후 세포생존 평가
먼저, 4,000개의 SKBR3 세포 및 2,000개의 JIMT-1 세포를 384-well 플레이트 (Greiner社, 독일)에 플레이팅 했다. 이후 세포를 3배로 플레이트하고 각 웰당 6개의 이미지를 촬영하였다. HER2 저해제 내성 연관유전자를 넉다운 시키기 위한 siRNA는 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)사로부터 구입했으며, 최종 농도가 50nM이 되도록 준비하였다. 각 웰마다 0.5 ㎕의 DharmaFECT1이 사용되었다. 상기 siRNA 처리 48시간 후, 10㎍/㎖의 허셉틴을 세포에 처리하였다. 허셉틴 처리 48시간 경과 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 통해 세포를 고정하고 HCS Cellmask (H32712, Molecular Probes, Thermo Scientific)를 이용해 염색하였고, 핵은 Draq5(Cell Signaling Technology社)를 통해 염색한 후, 생존된 세포를 카운팅하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 상기 이미지 촬영 및 세포 카운팅에 OPERA(Opera High Content Screening System, PerkinElmer社)가 사용되었다. 또한, siRNA 데이터의 분석은 PRISM (version 5) 소프트웨어가 사용되었다.
구체적으로 도 6은 HER2 저해제 내성 연관 유전자가 넉다운된 HER2 저해제 민감 세포주(SKBR3) 및 HER2 저해제 내성 세포주(JIMT-1)의 세포 생존성을 평가한 그래프로써, 선별한 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 어느 하나의 유전자를 넉다운(knockdown)시켜 HER2 저해제를 처리한 후 세포 생존여부를 확인한 결과 HER2 저해제 내성 세포주인 JIMT-1에서 HER2 저해제인 허셉틴에 의해 세포 생존이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 선별된 32개의 HER2 저해제 내성 연관 유전자 중 어느 하나의 유전자가 넉다운된 세포는 상기 세포가 HER2 저해제에 내성(JIMT-1)이 있다고 하더라도 HER2 저해제에 대해 민감성을 회복했다 볼 수 있다.
<실시예 4> - 선별된 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 HER2 저해제 처리 후 발현 수준 임상평가
선별된 HER2 저해제 내성 연관 유전자의 HER2 저해제 처리 후 발현 수준의 임상평가를 위한 표본으로써, 총 6개의 유방암 샘플을 사용하였다. 상기 유방암 샘플을 채취한 대상환자는 본 발명에 따른 연구의 목적으로 임상표본 조직의 사용을 동의하였고, 대한민국 국립 암센터의 IRB(Institutional Review Board) 역시 이에 대해 승인하였다. 상기 총 6개의 유방암 샘플을 채취한 대상환자들의 조직학 분류(Histologic classification) 및 종양기(tumor stage)는 국립암센터의 병리학자에 의해 검토되었으며, 검토된 환자별 임상정보는 도 10 및 11과 같다.
상기 총 6개의 유방암 샘플 중 3개의 샘플은 허셉틴 민감 샘플(환자 1 ~ 3, 도 10)이며, 나머지 3개의 샘플은 허셉틴 내성 샘플(환자 4 ~ 6, 도 11)이다. 상기의 총 6개 유방암 샘플 각각에 대해 선별된 HER 저해제 내성 연관 유전자 발현수준을 하기의 방법에 의해 측정하였다.
먼저, RNA를 분리하기 위해 RNA 분리액(Isol-RNA Lysis Reagent, 5PRIME社, 독일)을 이용해 세포 용해액(cell lysates)으로부터 RNA를 분리하였다. 이후 RT-PCR 분석에 대한 주형을 얻기 위해 RNA를 gDNA 리무버 키트가 함유된 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(도요보, 일본)를 통해 cDNA로 합성했다. 정량 PCR은 CFX384 TouchTM Real-Time PCR Detection System(바이오래드社)을 sx이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 iQTM SYBR® Green Supermix(바이오래드社) 시약을 사용해 수행하였다. 모든 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 상기 표 1과 같다. 상기 과정을 통해 분석된 결과는 도 7 내지 9에 나타내었고, 이때 상기 도 7 내지 9에 나타난 각 샘플에서 특정 유전자별 발현수준은 상기 각 샘플내 ACTB 유전자의 발현량을 기준으로 상대적으로 나타내었다.
구체적으로 도 7내지 9는 은 HER2 저해제 내성 연관 유전자 32개 중 25개에 대한 임상실험 결과에 대한 그래프로써, HER2 저해제에 민감한 3명의 환자와 HER2 저해제에 내성인 3명의 환자에게서 채취된 암세포에서 32개 유전자별 발현정도를 평가한 결과 ATF4, CHEK2, EGF, EGLN2, ENAH, FARP2, ICOSLG, JUP및 RAD5 유전자가 HER2 저해제인 허셉틴에 민감한 3명의 환자군(환자 1 ~ 3)에서 채취한 암세포에서는 현저히 하향조절된 반면에 HER 저해제인 허셉틴에 내성인 3명의 환자군(환자 4 ~ 6)에서 채취한 암세포에서는 반대로 현저히 상향조절됨을 확인할 수 있다.
<실시예 5> - HER2 저해제 처리에 따른 HER2 저해제 민감 세포주 및 HER2 저해제 내성 세포주의 일수별 생존율 평가 및 일수별 HER2 발현량 평가
HER2 저해제 민감 세포주인 SKBR3 및 HER2 저해제 내성 세포주인 JIMT-1의 HER2 저해제인 허셉틴 약물에 대한 민감성 및 HER2 단백질 발현을 평가하기 위해 이들 세포의 허셉틴 처리시 생존율 및 HER2 단백질 발현정도를 측정하였다.
구체적으로 상기 인간 SKBR3 및 JIMT-1 세포들은 공공기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에서 제공된 것을 이용하였다. 상기 SKBR3 및 JIMT-1 인간 유방암 세포주는 세포 소생(resuscitation) 후 6개월 이내의 것을 이용하였다. SKBR3세포들은 McCoy? 5A 배지(시그마-알드리치, 미국)에서, JIMT-1 세포들은 DMEM(하이클론, 써모피셔(Thermo Fisher), 미국) 배지에서 10% FBS(하이클론)가 투입된 37℃, 5% 이산화탄소의 배양조건에서 배양되었다. 이후 2.5×105 개의 세포들을 70 ~ 80%의 노목식(normoxic) 분위기하에서 접종(seed) 및 배양하였고, 이후 상기 두 세포주 각각에 대해 10㎍/㎖ 허셉틴 처리된 상태 및 허셉틴 미처리 상태로 4일 동안 배양하였다.
상기 배양과정 중 각 일수별로 세포 생존율을 평가하였으며, 세포 생존율의 평가방법은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 통해 처리후 일수별 세포를 고정하고 HCS Cellmask (H32712, Molecular Probes, Thermo Scientific)를 이용해 염색하였으며, 핵은 Draq5(Cell Signaling Technology社)를 통해 염색한 후, 생존된 세포를 카운팅하였다. 상기 세포 카운팅에 OPERA(Opera High Content Screening System, PerkinElmer社)가 사용되었고, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
또한, 상기 배양과정 중 각 일수별로 HER2 발현량을 평가하였으며, 구체적으로 허셉틴 처리 후 일수별 세포를 포스페이트-버퍼 식염수에 2번 세척한 후 웨스턴 블랏을 수행하였고, 그 구체적 방법은 선행문헌인 [Antitumor agent et al ., (2011) Cancer Chemother Pharmacol, 68:405-413]에 의하여 수행하였고 영상실험 소프트웨어(Image Lab software, Bio-Rad사)를 통해 발현정도를 측정하여 그 결과를 하기 도 13에 나타내었다. 이때, β-액틴을 사용해 절차 및 분석이 제대로 수행되었는지를 확인하였으며, 이의 구체적인 방법은 선행문헌인 [Analyzing real-time PCR data et al ., (2008) Nature Protocols, 3:1101-1108]와 같이2(-델타(delta)-델타 C(T)) 방법을 사용해 선행문헌인 [Antitumor agent PX-12 et al ., (2011) Cancer Chemother Pharmacol, 68:405-413]와 같이 수행하였다.
구체적으로 도 12에서 JIMT-1 세포는 10㎍/㎖의 허셉틴 처리 후 4일 동안 배양한 결과 세포생존율이 오직 15%만 감소한 것을 확인할 수 있다. 이에 반하여 SKBR3 세포는 허셉틴 처리 후 4일 동안 허셉틴 비처리된 SKBR3 세에 비교했을 때 30% 초과하여 세포생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 JIMT-1 세포는 허셉틴에 내성이 있고, SKBR3 세포는 허셉틴에 민감하다는 것을 확인할 수 있다.
구체적으로 도 13에서 JIMT-1 세포는 허셉틴 처리 후 4일 동안 HER2 단백질이 90% 초과하여 하향조절되었음을 확인할 수 있다. 한편, 허셉틴이 처리되지 않은 JIMT-1 세포조차 같은 기간 동안 HER2 단백질이 60%정도 발현이 하향조절되었음을 확인할 수 있다. 이에 반하여, 동일 기간에 SKBR3 세포는 HER2 발현에 있어 변화가 거의 없음을 확인할 수 있다.
상기와 같은 결과를 통해 허셉틴 내성의 메커니즘으로써, HER2 내재화(internalization) 또는 HER2의 세포외 도메인의 벗겨짐(shedding)이 있다는 것을 알 수 있다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Marker for diagnosing HER2 inhibitor resistance cancer, diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing HER2 inhibitor resistance cancer <130> 1040640 <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tggacatccg caaagacctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcttcattgt gctgggtgcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cggctacagt tattgcagga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tcttggcctc ttggatctct 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agtggcatct gtatgagccc a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gctcctattt ggagagcccc t 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cccaaggctc ctcctcaca 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agtgagagga ctggctggag tt 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gccagtttct caaggaggag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agggatcatc tgcgaactct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tggctagttg tggcgtttag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tgagcctggg aaatagaggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctgacactga ggatgggatg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cccattcttg aggtcttggt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aggctctccc tcagttacca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 aactctccac tcccatcctg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tgtgctggga gactcttctg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 caagtggtcc caagacaatg 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tgctcccacg gcctgtac 18 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ttgtcacacc tatggcatat caca 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 acctggtggg catagagaac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ccttcttggt gagcttgtga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ctgcagaatg acaccgtctt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ctctatgcag cagccaatgt 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tcagcagcaa gggcatcat 19 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgggtgtaag tggtggtttt ctt 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 actggagcct gagagcagag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cttgatggtg accttccctt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 caagccagcc aagtaacaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 tcaggcttga ggtctctgtg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gtgcagtgga gcagattctt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 tggtagcgga tttcattctc 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tcggagcctg taacctacta tg 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cacaccatcc acctcctgaa 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 agaattccga actgggaaga 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gcctttcctt cacctccac 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atcagaacgg ctacgatgag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gagattggaa gggaacctgt 20 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tacgccccca cctgcttac 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tttgtgtcca tcggctgaga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gatccagtcc gtggaaccat 20 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atagcccatg atgatttcag caa 23 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ctgggataga ccacaacagc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 tgaggcagaa gacaaagtcc 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 attgacggtg tttcggact 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 ggactggctg atttccaagt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 cacgaggaga gcataaggaa 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cgggctattg tccctaagtt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ttctctgaac agacgcatcc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 ctcagcttcc tccagcttct 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 atcggataat gcaacagctt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 aaaggatagc agcaaccaaa 20

Claims (8)

  1. 허셉틴 처리 하에서, ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 허셉틴 내성 유방암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 허셉틴 내성 유방암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물.
  3. 삭제
  4. 허셉틴 처리 하에서, 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 허셉틴 내성 유방암 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 및 단백질 칩 키트 중 어느 하나 이상을 포함하는 허셉틴 내성 유방암 진단용 키트.
  6. 허셉틴 처리 하에서, ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자를 포함하는 허셉틴 내성 유방암을 진단하기 위한 마이크로어레이.

  7. i) 환자의 시료에 허셉틴을 처리하여 24 시간 내지 48 시간 반응하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 반응한 시료로부터 제1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 따른 마커 검출용 조성물을 통해 ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 측정된 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 허셉틴 미처리 대조구 시료에서 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 허셉틴 내성 유방암을 진단하기 위한 마커 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준의 측정은 ATF4(Entrez Gene ID 468) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하여, 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행;하고,
    상기 단백질 발현 수준의 측정은 해당 단백질에 특이적인 항체를 포함하여, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법을 포함하여 수행; 하는 허셉틴 내성 유방암을 진단하기 위한 마커 검출방법.
KR1020140146490A 2014-10-27 2014-10-27 Her2 저해제 내성 암을 진단하기 위한 마커, 이를 포함하는 진단키트 및 her2 저해제 내성 암을 진단하는 방법 KR101637545B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Int. J. Oncol., Vol. 37, No. 3, pp. 669-678 (2010.09.)*
Sci. Rep., Vol. 4, No. 4483 (2014.03.27.)*

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