JP2022524094A - 色素上皮由来因子（ｐｅｄｆ）を使用する疾患の処置のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、疾患が眼疾患であり、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）に関する。

Description

本発明は、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡ、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体のスクリーニングのための方法、ならびに抗ＶＥＧＦ剤のスクリーニングのための方法に関する。

加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は西洋諸国における法的盲の最も一般的な原因である。黄斑下網膜色素上皮の萎縮および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発生は、中心視力の低下を二次的にもたらす。ＡＭＤの早期徴候は網膜色素上皮とブルッフ膜との間の沈着物（ドルーゼン）である。２つの形態（滲出型および萎縮型）のＡＭＤが存在する。

滲出型ＡＭＤの疾患の間、黄斑の網膜下空間への脈絡膜血管の発芽が存在する。これらの新たな血管は多くの場合、異常血管を発生させ、漏出性となり、網膜下浮腫を引き起こす。これらの浮腫は中心視野および読書能力の低下を引き起こす。

萎縮型ＡＭＤを有する患者では、一次効果は脈絡毛細管板の消失である（Biesemeier, Taubitz et al. 2014）。その後、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および視細胞が変性して、地図状萎縮（ＧＡ）を引き起こす。萎縮型ＡＭＤに関して、脈絡毛細管板の消失を防止するために利用可能な処置は現在のところ存在しない。

中心窩下ＣＮＶを有する患者は一般に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を減少または遮断する薬物を用いて処置されていた。２００４年以来、抗ＶＥＧＦ療法は、滲出型ＡＭＤの標準的な処置となっており、この疾患の管理を一新した。２００４～２００６年の間に、３種の抗ＶＥＧＦ薬が、ＡＭＤの処置に関する規制当局の承認を受けた（ペガプタニブ、ラニビズマブ）、または適応外で使用された後に（ベバシズマブ）、眼科学に導入された（Browning, Kaiser et al. 2012）。これらは、活性の部位、製剤方法、結合親和性、および生物活性の点で重要な相違を呈する（Julien, Biesemeier et al. 2014）。ペガプタニブ（マクジェン）は、ＶＥＧＦの主要な病的アイソフォーム（ＶＥＧＦ－Ａ１６５）のヘパリン結合ドメインに結合することによってＶＥＧＦ－Ａ１６５に選択的に結合し、それを中和するオリゴヌクレオチドアプタマーである。ラニビズマブ（ルセンティス、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、親和性成熟ヒト化モノクローナル抗体断片（Ｆａｂ）であり、ベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、全長ヒト化モノクローナル抗体である。両者は、ＶＥＧＦ－Ａの全てのアイソフォームの受容体結合ドメインを遮断することによって機能する（Ferrara, Damico et al. 2006）。アフリベルセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ－Ｅｙｅ、Ｅｙｌｅａ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｂａｙｅｒ）は、米国食品医薬品局によって近年承認された抗ＶＥＧＦ剤である。これは、ヒトＩｇＧ１の断片結晶化可能（Ｆｃ）領域と融合したＶＥＧＦＲ１の第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）結合ドメインおよびＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ結合ドメインから構成される完全ヒト組換え融合タンパク質である。

アフリベルセプトは、全てのＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム、ＶＥＧＦ－Ｂ、およびＰｌＧＦに結合する（Papadopoulos, Martin et al. 2012）。サルの眼に硝子体内注射されたベバシズマブの効果は広範に記載されている（Peters, Heiduschka et al. 2007、Julien, Biesemeier et al. 2013、Schraermeyer and Julien 2013）。その効果には、脈絡毛細管板有窓構造の減少、視細胞損傷、免疫複合体の形成、および血栓性微小血管症が含まれた。ベバシズマブ処置後の血栓症に関する有力な理論的根拠はＭｅｙｅｒおよび共同研究者らによって提示された（Meyer, Robles-Carrillo et al. 2009）。彼らは、ベバシズマブがＶＥＧＦ、すなわちヘパリンとの複合体形成および血小板ＦｃガンマＲＩＩａ受容体の活性化を介して、血小板凝集、脱顆粒、および血栓症を誘導する可能性があることを見出した。さらに、他の結果は、補体カスケードを活性化して細胞死を引き起こす、ベバシズマブのＦｃドメインとヒトＲＰＥおよびヒト臍帯血管内皮細胞膜とのＦｃ受容体または膜結合ＶＥＧＦを介した効果的な結合を実証している（Meyer and Holz 2011）。アフリベルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインも含有するため、アフリベルセプトにおいて類似した問題が存在するか否かは不明確である。さらに、ＩｇＧ１アイソタイプは、古典的経路を介した補体系の活性化において非常に効果的であることが公知である（Daha, Banda et al. 2011）。実際、ＩｇＧ１のＦｃ部分は、その後の古典的経路の活性化を引き起こすＣ１ｑと結合する高い能力を有する（Daha, Banda et al. 2011）。対照的に、ラニビズマブは、補体カスケードの活性化を回避するＦｃドメインを保有しないが、にもかかわらず、非臨床研究において溶血およびフィブリン形成も誘導する（Julien, Biesemeier et al. 2014）。

ＶＥＧＦ阻害は、がん（Meyer, Robles-Carrillo et al. 2009）または新生血管性ＡＭＤ（Schraermeyer and Julien 2013）に関して処置されたヒトにおいて、血小板を活性化させることができると報告された。加えて、硝子体内適用後のＶＥＧＦ薬は、サルの脈絡毛細管板に血栓性微小血管症を誘導した（Peters, Heiduschka et al. 2007、Schraermeyer and Julien 2012）。抗ＶＥＧＦ薬はまた、脈絡毛細管板内に溶血、うっ滞、およびフィブリン形成も誘導する（Schraermeyer and Julien 2012、Schraermeyer and Julien 2013、Julien, Biesemeier et al. 2014）。アバスチンは、ヘパリン・ＶＥＧＦタンパク質複合体と一緒に形成されて血栓性事象を誘導する（Julien, Biesemeier et al. 2013）。滲出型ＡＭＤに罹患している患者から外科的に切除した脈絡膜の血液血管において、抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）処置は血栓症およびタンパク質複合体形成を誘導した（Schraermeyer, Julien et al. 2015）。

ＡＭＤ患者は年齢のために脳卒中または他の血管関連疾患に罹患するより高いリスクを有するため、これらの副作用は不都合である。したがって、ベバシズマブを用いて処置された滲出型ＡＭＤを有する個体における、滲出型ＡＭＤを有しない同じ年齢および性別の群と比較して増加した長期死亡率が報告された（Hanhart, Comaneshter et al. 2017）。特に、心筋梗塞後（Hanhart, Comaneshter et al. 2018）および脳血管事象後（Hanhart, Comaneshter et al. 2018）に、抗ＶＥＧＦ処置によって引き起こされる死亡率は大きく上がる。さらに、抗ＶＥＧＦ薬を用いる長期処置は、滲出型ＡＭＤを有する患者の網膜の末梢部分において本来の脈絡毛細管板の消失および地図状萎縮を引き起こす（Schutze, Wedl et al. 2015）。したがって、この処置は、この処置を行わなければ生じなかった可能性があるさらなる視力低下を誘導する。

近年、漏出がすでに生じた後にのみＣＮＶを検出する以前のフルオレセイン蛍光眼底造影検査の欠点を克服する、光干渉断層計を用いた血管造影法（ＯＣＴＡ）（Treister, Nesper et al. 2018）を使用する新たな可能性のため、片側滲出性ＣＮＶの僚眼における潜在性ＣＮＶの顕著な有病率、および全てのＣＮＶ病変に隣接する有意に大きな脈絡毛細管板無灌流が検出されている。Ｔｒｅｉｓｔｅｒら（Treister et al. 2018）は、滲出性ＡＭＤの眼における、その潜在性ＣＮＶの僚眼と比較して増加した脈絡毛細管板無灌流の傾向を同定した。このことは、潜在性ＣＮＶがこれらの患者の視力を低下させずに存在していることを明確に示す。これらの新たな所見は、新生血管が視細胞の生存に役立ち得る後期滲出型ＡＭＤを有する眼における以前の観察を支持する（Biesemeier, Julien et al. 2014）。

滲出型ＡＭＤの処置の長い歴史に関して、常に同じ原則、すなわち新たに形成された血液血管を除去または遮断することが使用されている。これを達成するために、種々の方法、例えば、レーザー凝固、外科的処置、放射線、光線力学療法、および今日の硝子体内抗ＶＥＧＦ薬が使用されている。主要な方法のいずれも視野を改善することができなかった一方で、抗ＶＥＧＦ（ラニビズマブ）の使用は成功を収め、視力をしばらくの間改善することができるが、依然として最適な救済には到底達していない。

本発明の根底にある課題は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）等の眼性疾患の処置のための手段の提供である。

本発明の根底にあるさらなる課題は、改善した視力を長期間実現する、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）等の眼性疾患の処置のための手段の提供である。

本発明の根底にあるこれらおよび他の課題は、添付の独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態は、添付の従属請求項から得てもよい。

本発明の根底にある課題であり、また、第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管（ｌａｂｙｒｉｎｔｈ ｃａｐｉｌｌａｒｙ）形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または、血管発生を導くことを含む使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）によっても解決される。

第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、疾患は眼疾患である。

第１の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、眼疾患は黄斑変性症であり、好ましくは、黄斑変性症は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である。

第１の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、ＰＥＤＦは滲出型ＡＭＤおよび／または萎縮型ＡＭＤにおける地図状萎縮の成長および／または形成を阻害する。

第１の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、疾患は、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、未熟児網膜症、ならびに網膜および脈絡膜線維症を含む群から選択される。

第１の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、ＰＥＤＦは網膜および／または脈絡膜線維症の進行を阻害する。

本発明の根底にある課題であり、また、第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、ｍＲＮＡによっても解決される。

第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２の実施形態では、疾患は眼疾患である。

第２の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３の実施形態では、眼疾患は黄斑変性症であり、好ましくは、黄斑変性症は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である。

第２の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４の実施形態では、ＰＥＤＦは滲出型ＡＭＤおよび／または萎縮型ＡＭＤにおける地図状萎縮の成長および／または形成を阻害する。

第２の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第５の実施形態では、疾患は、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、未熟児網膜症、ならびに網膜および脈絡膜線維症を含む群から選択される。

第２の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第６の実施形態では、ＰＥＤＦは網膜および／または脈絡膜線維症の進行を阻害する。

本発明の根底にある課題であり、また、第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が眼疾患である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

第３の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第３の実施形態では、眼疾患は黄斑変性症であり、好ましくは、黄斑変性症は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である。

第３の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第４の実施形態では、ＰＥＤＦは滲出型ＡＭＤおよび／または萎縮型ＡＭＤにおける地図状萎縮の成長および／または形成を阻害する。

第３の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第５の実施形態では、疾患は、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、未熟児網膜症、ならびに網膜および／または脈絡膜線維症を含む群から選択される。

第３の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第６の実施形態では、ＰＥＤＦは網膜および／または脈絡膜線維症の進行を阻害する。

本発明の根底にある課題であり、また、第４の態様の第１の実施形態でもある第４の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が黄斑変性症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

第４の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第３の実施形態では、黄斑変性症は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である。

第４の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第４の実施形態では、ＰＥＤＦは滲出型ＡＭＤおよび／または萎縮型ＡＭＤにおける地図状萎縮の成長および／または形成を阻害する。

本発明の根底にある課題であり、また、第５の態様の第１の実施形態でもある第５の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が中心性漿液性脈絡網膜症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が糖尿病網膜症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第６の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第７の態様の第１の実施形態でもある第７の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が虹彩ルベオーシスである、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第７の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第８の態様の第１の実施形態でもある第８の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が角膜新生血管である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第８の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第８の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第９の態様の第１の実施形態でもある第９の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患がポリープ状脈絡膜血管症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第９の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第９の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第１０の態様の第１の実施形態でもある第１０の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が未熟児網膜症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第１０の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１０の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

本発明の根底にある課題であり、また、第１１の態様の第１の実施形態でもある第１１の態様では、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡを対象に投与することを含み、疾患が網膜および／または脈絡膜線維症である、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡによっても解決される。

第１１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１１の態様の第２の実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

第１１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１１の態様の第３の実施形態では、ＰＥＤＦおよび／またはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡは網膜および／または脈絡膜線維症の進行を阻害する。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、迷路状毛細血管形成は好ましくは眼疾患の眼における迷路状毛細血管形成である。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、脈絡毛細管板の成長を誘導することは、新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することを含むか、または新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することである。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、脈絡毛細管板の成長を誘導することは、本来の脈絡毛細管板に取って代わることができる脈絡毛細管板を提供し、好ましくは、本来の脈絡毛細管板は患部脈絡毛細管板である。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、脈絡毛細管板を密着させることは、病的脈絡毛細管板を密着させることを含む。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、細胞外マトリックス形成を阻害することは、血液血管の内腔に対するおよび／または血液血管の周辺の細胞外マトリックス形成の阻害を含む。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の中止の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、血管発生を導くことは、機能的血液血管、好ましくは病的血液血管からの機能的血液血管の発生を含む。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、病的血液血管は病的状態、好ましくは対象の病的状態の結果であり、より好ましくは、病的状態は、対象が罹患しているかもしくは罹患するリスクがある、および／またはその処置のためにＰＥＤＦもしくはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡが使用されるかもしくは使用されることが意図される疾患である。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、ＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡは硝子体内または網膜下投与される。

第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のありとあらゆる実施形態を含むそれらの態様の一実施形態では、方法は抗ＶＥＧＦ療法を適用することをさらに含み、好ましくは、抗ＶＥＧＦ療法は対象への抗ＶＥＧＦ薬の投与を含み、抗ＶＥＧＦ薬は、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトを含む群から選択される。それらの態様の一実施形態では、ＰＥＤＦと抗ＶＥＧＦ療法との併用は、抗ＶＥＧＦ療法の単独での使用と比較して、対象に投与される抗ＶＥＧＦ療法の量の減少を可能にする。そのような対象に投与される抗ＶＥＧＦ療法の量の減少は典型的には、副作用、特に前記抗ＶＥＧＦ療法の副作用、例えば心血管副作用の軽減をもたらす。

いかなる理論に拘束されることも望むものではないが、本発明者は、驚くべきことに、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が、健康かつ機能的な脈絡毛細管板の成長、ならびにそれと関連する効果、例えば、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを誘導することができ、眼疾患の処置に有益であることを見出した。これまでのところ、本発明は、血管成長を阻止することまたは血管を除去することに基づく眼疾患の処置における現時点の最新技術から逸脱している。

ＰＥＤＦによるそのような迷路状毛細血管形成の阻害を考慮すると、眼疾患の処置におけるＰＥＤＦの治療効力は、特に迷路状毛細血管形成を示す眼疾患、例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、すなわち萎縮型ＡＭＤと滲出型ＡＭＤの両方、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、および未熟児網膜症に関して妥当である。例えば、滲出型ＡＭＤを有する患者がフルオレセインを注射される場合、多量の液体が病的血管から短時間で漏出することが観察される。この所見の最も妥当な原因は、内皮壁の間または内部に大きな間隙が存在するというものである。しかしながら、血液細胞と細胞外マトリックスとを接続する内皮における間隙であれば、血小板によって直ちに塞がれるため、この間隙は生じていない。近年、迷路様構造を血管の内腔に形成した、内皮の多くの微絨毛様突起を有する毛細血管がＡＭＤ患者から外科的に切除した脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に見出された。そのような毛細血管の内腔は間質に対して開放された接続部を示した。これらの毛細血管は、血漿で満たされていたため、血液血管網に接続しており、したがって漏出の原因であった。この種類の毛細血管は、多くの場合ＣＮＶにおいて観察され、「迷路状毛細血管」と称された。これらの迷路状毛細血管における漏出性部位は、迷路状毛細血管の縮小した内腔のために血小板が進入することができないため、血小板によって塞ぐことができない。したがって、この血管の種類は、慢性血漿滲出を引き起こし、浮腫の起源である（Schraermeyer, Julien et al. 2015）。

さらに、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は非常に強力な神経栄養および神経保護効果を有する（King and Suzuma 2000）。この因子は正常酸素圧条件下のＲＰＥによって産生される。産生は、低酸素中は停止する。このことは新生血管を大いに促進する。加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）では、損傷したＲＰＥ細胞はＰＥＤＦをほとんど産生しない。このことは制御されない血管新生を生じる。ＰＥＤＦの眼における主な効果は血管の新生を防止することであると考えられていたが（King and Suzuma 2000）、本発明においては、ＰＥＤＦは、病的血管形成がＶＥＧＦによって開始された場合に、ＣＮＶ血管を安定化させ、迷路状毛細血管形成を回避することができる。

第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様では、本発明の根底にある課題は、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）によって解決される。

その態様の好ましい実施形態では、ＰＥＤＦはヒトＰＥＤＦタンパク質であり、より好ましい実施形態では、ＰＥＤＦは配列番号１のアミノ酸配列を含む。

QNPASPPEEG SPDPDSTGAL VEEEDPFFKV PVNKLAAAVS
NFGYDLYRVR SSTSPTTNVL LSPLSVATAL SALSLGAEQR
TESIIHRALY YDLISSPDIH GTYKELLDTV TAPQKNLKSA
SRIVFEKKLR IKSSFVAPLE KSYGTRPRVL TGNPRLDLQE
INNWVQAQMK GKLARSTKEI PDEISILLLG VAHFKGQWVT
KFDSRKTSLE DFYLDEERTV RVPMMSDPKA VLRYGLDSDL
SCKIAQLPLT GSMSIIFFLP LKVTQNLTLI EESLTSEFIH
DIDRELKTVQ AVLTVPKLKL SYEGEVTKSL QEMKLQSLFD
SPDFSKITGK PIKLTQVEHR AGFEWNEDGA GTTPSPGLQP
AHLTFPLDYH LNQPFIFVLR DTDTGALLFI GKILDPRGP（配列番号１）

その態様の好ましい実施形態では、ＰＥＤＦはＰＥＤＦの、好ましくはヒトＰＥＤＦの、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＥＤＦの誘導体である。ＰＥＤＦが上記効果、特に、迷路状毛細血管形成を阻害する、脈絡毛細管板の成長を誘導する、脈絡毛細管板を密着させる、細胞外マトリックス形成を阻害する、脈絡毛細管板を保護する、および血管発生を導く効果を引き起こすことができる限り、ＰＥＤＦのいかなる誘導体が使用されてもよいことは当業者によって理解されるだろう。一実施形態では、ＰＥＤＦは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するＰＥＤＦである。さらなる実施形態では、ＰＥＤＦの誘導体は、配列番号１のアミノ酸位２０においてアミノ酸残基がピロリドンカルボン酸である、配列番号１のアミノ酸位２４においてアミノ酸残基がホスホセリンである、配列番号１のアミノ酸位１１４においてアミノ酸残基がホスホセリンである、配列番号１のアミノ酸位２２７においてアミノ酸残基がホスホセリンである、および／または配列番号１のアミノ酸位２８５においてアミノ酸残基がＮ結合型（ＧｌｃＮＡｃ）アスパラギンである誘導体である。

上記効果、特に、迷路状毛細血管形成およびその阻害を含むその任意の変化、脈絡毛細管板の成長の誘導、脈絡毛細管板の密着化、細胞外マトリックス形成の阻害、脈絡毛細管板の保護、ならびに血管発生の導きのいずれも、それぞれ漏出血管を検出および評価するのに好適であるフルオレセイン蛍光眼底造影検査（ＦＡ）と組み合わせた場合に好ましい光干渉断層計（ＯＣＴ－Ａ）によって評価することができることが理解されるだろう（Spaide et al. 2015）。光干渉断層計アンギオグラフィー（ＯＣＴ－Ａ）は、網膜および脈絡膜の微小血管系を撮像するための非侵襲性技法として登場した（Spaide et al.2015）。簡潔に述べると、ＯＣＴ－Ａ技術は、移動する赤血球の表面のレーザー光反射率を使用して、眼の種々の分割された領域を通る血管を正確に描写し、したがって血管内色素の必要性を排除する。患者の網膜のＯＣＴスキャンは、複数の個々のＡスキャンで構成され、Ａスキャンは収集されて、断面構造情報を提供するＢスキャンとなる。ＯＣＴ－Ａ技術においては、同じ組織領域が繰り返し撮像され、スキャン間の差が分析されるため、高流量を含有する、すなわちスキャン間で著しい変化を有する範囲、およびスキャン間で類似すると考えられる、緩徐な流動を有するかまたは流動を一切有しない範囲を検出することが可能である。

ＯＣＴ－ＡおよびＦＡはそれぞれ、網膜および／または網膜下空間内に位置する浮腫の検出および評価のために使用することもできる。

第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、疾患は眼または眼性疾患である。

第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、眼疾患は、黄斑変性症、好ましくは加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である。

第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、眼疾患は、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、および未熟児網膜症を含む群から選択される。

第１の態様の第１、第２、第３、および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、迷路状毛細血管形成は好ましくは眼疾患の眼における迷路状毛細血管形成である。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、脈絡毛細管板の成長を誘導することは、新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することを含むか、または新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することである。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、および第６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態では、脈絡毛細管板の成長を誘導することは本来の脈絡毛細管板に取って代わることができる脈絡毛細管板を提供し、好ましくは、本来の脈絡毛細管板は患部脈絡毛細管板である。それに関連して、患部脈絡毛細管板はブルッフ膜とＲＰＥとの間に位置し、ＯＣＴ－Ａにおいて見ることができることが当業者によって認められるだろう。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態では、脈絡毛細管板を密着させることは病的脈絡毛細管板を密着させることを含む。それに関連して、ブルッフ膜とＲＰＥとの間または網膜下空間内に位置する各新生血管性脈絡毛細管板または血管は好ましくは病理的と考えられることが認められるだろう。より好ましくは、脈絡毛細管板は、迷路状の毛細血管に発達するかまたは他の理由によって漏出性となった場合にのみ病理的と考えられる。その診断はＯＣＴ－Ａおよび／またはフルオレセイン蛍光眼底造影検査（ＦＡ）によって実施することができる。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態では、細胞外マトリックス形成を阻害することは、血液血管の内腔に対するおよび／または血液血管の周辺の細胞外マトリックス形成の阻害を含む。好ましくは、そのような血管は、内腔への内皮突起の非存在のために赤血球の流動を阻害しない。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、および第９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態では、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。そのような抗ＶＥＧＦ薬は好ましくは、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトを含む群から選択される抗ＶＥＧＦ薬である。それに関連して、そのような損傷作用は血液血管の退縮ならびに地図状萎縮をもたらすＲＰＥおよび視細胞の変性を包含し得ることが認められるだろう。地図状萎縮は、ＲＰＥの自家蛍光が消失するため、走査型レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）において暗い点として検出することができる。ＳＬＯ画像はＲＰＥにおけるリポフスチンの自家蛍光の結果である。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、および第１０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態では、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の中止の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。それに関連して、好ましくは、血液血管は漏出性となって迷路状毛細血管に変化し、内皮細胞は増殖および遊走することが理解されるだろう。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態では、血管発生を導くことは、機能的血液血管、好ましくは病的血液血管からの機能的血液血管の発生を含む。それに関連して、好ましくは、病的血液血管は、適切な血流を可能としないか、漏出性であるか、または非常に多くのもしくは異型の細胞外マトリックスタンパク質を形成する血液血管である。

第１の態様の第１２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態では、病的血液血管は病的状態の結果である。そのような病的状態は、低酸素、ＨＩＦ１アルファの上方調節、成長因子の異型形成、およびＶＥＧＦのうちの１つまたは組合せであり得る。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、および第１３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態では、ＰＥＤＦは硝子体内もしくは網膜下投与されるか、またはＰＥＤＦをコードするアデノ随伴ウイルス等のベクターとして投与される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、および第１４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態では、方法は抗ＶＥＧＦ療法を適用することをさらに含み、好ましくは、抗ＶＥＧＦ療法は対象への抗ＶＥＧＦ薬の投与を含み、抗ＶＥＧＦ薬は、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトを含む群から選択される。それに関連して、ＰＥＤＦは早期に使用されてもよい、例えば、ＣＮＶが一方の眼に検出される場合に僚眼が予防的に処置されてもよく、さらに、正常な視野の眼に関して潜在性ＣＮＶが診断される場合にＣＮＶを安定に保つために処置が開始されてもよいということが当業者によって認められるだろう。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、および第１５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態では、対象は、抗ＶＥＧＦ処置の副作用、好ましくは抗ＶＥＧＦ処置から生じる視力低下に苦しんでいる対象である。

第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様では、本発明の根底にある課題は、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、ｍＲＮＡによって解決される。一実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号１のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡである。ＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡが本発明に従って、例えば疾患の処置および／または防止のための方法において使用される場合、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを小胞体（ＥＲ）に導き切断されるシグナルペプチドをコードする配列を含有することが当業者によって理解される。一実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号２のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡである。

ATGCAGGCCCTGGTGCTACTCCTCTGCATTGGAGCCCTCCTCGGGCACAGCAGCTGCCAGAACCCTGCCAGCCCCCCGGAGGAGGGCTCCCCAGACCCCGACAGCACAGGGGCGCTGGTGGAGGAGGAGGATCCTTTCTTCAAAGTCCCCGTGAACAAGCTGGCAGCGGCTGTCTCCAACTTCGGCTATGACCTGTACCGGGTGCGATCCAGCACGAGCCCCACGACCAACGTGCTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGGCCACGGCCCTCTCGGCCCTCTCGCTGGGAGCGGAGCAGCGAACAGAATCCATCATTCACCGGGCTCTCTACTATGACTTGATCAGCAGCCCAGACATCCATGGTACCTATAAGGAGCTCCTTGACACGGTCACCGCCCCCCAGAAGAACCTCAAGAGTGCCTCCCGGATCGTCTTTGAGAAGAAGCTGCGCATAAAATCCAGCTTTGTGGCACCTCTGGAAAAGTCATATGGGACCAGGCCCAGAGTCCTGACGGGCAACCCTCGCTTGGACCTGCAAGAGATCAACAACTGGGTGCAGGCGCAGATGAAAGGGAAGCTCGCCAGGTCCACAAAGGAAATTCCCGATGAGATCAGCATTCTCCTTCTCGGTGTGGCGCACTTCAAGGGGCAGTGGGTAACAAAGTTTGACTCCAGAAAGACTTCCCTCGAGGATTTCTACTTGGATGAAGAGAGGACCGTGAGGGTCCCCATGATGTCGGACCCTAAGGCTGTTTTACGCTATGGCTTGGATTCAGATCTCAGCTGCAAGATTGCCCAGCTGCCCTTGACCGGAAGCATGAGTATCATCTTCTTCCTGCCCCTGAAAGTGACCCAGAATTTGACCTTGATAGAGGAGAGCCTCACCTCCGAGTTCATTCATGACATAGACCGAGAACTGAAGACCGTGCAGGCGGTCCTCACTGTCCCCAAGCTGAAGCTGAGTTACGAAGGCGAAGTCACCAAGTCCCTGCAGGAGATGAAGCTGCAATCCTTGTTTGATTCACCAGACTTTAGCAAGATCACAGGCAAACCCATCAAGCTGACTCAGGTGGAACACCGGGCTGGCTTTGAGTGGAACGAGGATGGGGCGGGAACCACCCCCAGCCCAGGGCTGCAGCCTGCCCACCTCACCTTCCCGCTGGACTATCACCTTAACCAGCCTTTCATCTTCGTACTGAGGGACACAGACACAGGGGCCCTTCTCTTCATTGGCAAGATTCTGGACCCCAGGGGCCCCTAA

配列番号２のヌクレオチド配列の最初の５７個のヌクレオチドは、ヒトＰＥＤＦのシグナルペプチドをコードする。しかしながら、前記シグナルペプチドおよびそれをコードするヌクレオチド配列が、それぞれ、異なるシグナルペプチドおよびそのような異なるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と置き換えられることは本発明の範囲内である。そのような異なるシグナルペプチドは当技術分野で公知である。

代替的な実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号３のヌクレオチド配列である。

GGACGCTGGATTAGAAGGCAGCAAAAAAAGATCTGTGCTGGCTGGAGCCCCCTCAGTGTGCAGGCTTAGAGGGACTAGGCTGGGTGTGGAGCTGCAGCGTATCCACAGGCCCCAGGATGCAGGCCCTGGTGCTACTCCTCTGCATTGGAGCCCTCCTCGGGCACAGCAGCTGCCAGAACCCTGCCAGCCCCCCGGAGGAGGGCTCCCCAGACCCCGACAGCACAGGGGCGCTGGTGGAGGAGGAGGATCCTTTCTTCAAAGTCCCCGTGAACAAGCTGGCAGCGGCTGTCTCCAACTTCGGCTATGACCTGTACCGGGTGCGATCCAGCATGAGCCCCACGACCAACGTGCTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGGCCACGGCCCTCTCGGCCCTCTCGCTGGGAGCGGACGAGCGAACAGAATCCATCATTCACCGGGCTCTCTACTATGACTTGATCAGCAGCCCAGACATCCATGGTACCTATAAGGAGCTCCTTGACACGGTCACTGCCCCCCAGAAGAACCTCAAGAGTGCCTCCCGGATCGTCTTTGAGAAGAAGCTRCGCATAAAATCCAGCTTTGTGGCACCTCTGGAAAAGTCATATGGGACCAGGCCCAGAGTCCTGACGGGCAACCCTCGCTTGGACCTGCAAGAGATCAACAACTGGGTGCAGGCGCAGATGAAAGGGAAGCTCGCCAGGTCCACAAAGGAAATTCCCGATGAGATCAGCATTCTCCTTCTCGGTGTGGCGCACTTCAAGGGGCAGTGGGTAACAAAGTTTGACTCCAGAAAGACTTCCCTCGAGGATTTCTACTTGGATGAAGAGAGGACCGTGAGGGTCCCCATGATGTCGGACCCTAAGGCTGTTTTACGCTATGGCTTGGATTCAGATCTCAGCTGCAAGATTGCCCAGCTGCCCTTGACCGGAAGCATGAGTATCATCTTCTTCCTGCCCCTGAAAGTGACCCAGAATTTGACCTTGATAGAGGAGAGCCTCACCTC（配列番号３）

第２の態様のいずれかの実施形態を含む第２の態様のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、好ましくは、ＰＥＤＦのコード配列が得られるｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲと異なる５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ等の構成エレメントを含む組換えまたは異種ｍＲＮＡである。

第１の態様のいずれかの実施形態を含む第１の態様の開示は、第２の態様に等しく適用される。換言すれば、第１の態様のありとあらゆる実施形態は、第２の態様のいずれかの実施形態を含む第２の態様の一実施形態でもある。

第１２の態様の第１の実施形態でもある第１２の態様では、本発明の根底にある課題は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡのいずれかを含む医薬組成物であって、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための医薬組成物であり、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、医薬組成物によっても解決される。好ましくは、医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む。

第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１２の態様のいずれかの実施形態を含む第１２の態様に等しく適用される。換言すれば、第１の態様および第２の態様のありとあらゆる実施形態は、第１２の態様のいずれかの実施形態を含む第１２の態様の一実施形態でもある。

第１３の態様の第１の実施形態でもある第１３の態様では、本発明の根底にある課題は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡのいずれかを含む医薬組成物であって、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための医薬組成物であり、疾患が眼疾患である、医薬組成物によっても解決される。

第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１３の態様のいずれかの実施形態を含む第１３の態様に等しく適用される。換言すれば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様のありとあらゆる実施形態は、第１３の態様のいずれかの実施形態を含む第１３の態様の一実施形態でもある。

第１４の態様の第１の実施形態でもある第１４の態様では、本発明の根底にある課題は、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡの使用であって、疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、使用によって解決される。

第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１４の態様に等しく適用される。換言すれば、第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態は、第１４の態様のいずれかの実施形態を含む第１４の態様の一実施形態でもある。

第１５の態様の第１の実施形態でもある第１５の態様では、本発明の根底にある課題は、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡの使用であって、疾患が眼疾患である、使用によっても解決される。

第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１５の態様のいずれかの実施形態を含む第１５の態様に等しく適用される。換言すれば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様のありとあらゆる実施形態は、第１５の態様のいずれかの実施形態を含む第１５の態様の一実施形態でもある。

第１６の態様の第１の実施形態でもある第１６の態様では、本発明の根底にある課題は、対象における疾患の処置および／または防止のための方法であって、疾患の処置および／または防止が、対象に治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡを投与すること、ならびに迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、方法によって解決される。

第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１６の態様のいずれかの実施形態を含む第１６の態様に等しく適用される。換言すれば、第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態は、第１６の態様のいずれかの実施形態を含む第１６の態様の一実施形態でもある。

第１７の態様の第１の実施形態でもある第１７の態様では、本発明の根底にある課題は、対象における疾患の処置および／または防止のための方法であって、疾患の処置および／または防止が、対象に治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡを投与することを含み、疾患が眼疾患である、方法によっても解決される。

第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１７の態様のいずれかの実施形態を含む第１７の態様に等しく適用される。換言すれば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および第１１の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様のありとあらゆる実施形態は、第１７の態様のいずれかの実施形態を含む第１７の態様の一実施形態でもある。好ましい実施形態では、疾患の処置および／または防止は、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む。

第１８の態様の第１の実施形態でもある第１８の態様では、本発明の根底にある課題は、迷路状毛細血管形成を阻害するため、脈絡毛細管板の成長を誘導するため、脈絡毛細管板を密着させるため、細胞外マトリックス形成を阻害するため、脈絡毛細管板を保護するため、および／または血管発生を導くための方法における、対象への使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含む、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）によって解決される。

第１の態様のいずれかの実施形態を含む第１の態様の開示は、第１８の態様のいずれかの実施形態を含む第１８の態様に等しく適用される。換言すれば、第１の態様のいずれかの実施形態は、第１６の態様のいずれかの実施形態を含む第１６の態様の一実施形態でもある。

第１９の態様の第１の実施形態でもある第１９の態様では、本発明の根底にある課題は、迷路状毛細血管形成を阻害するため、脈絡毛細管板の成長を誘導するため、脈絡毛細管板を密着させるため、細胞外マトリックス形成を阻害するため、脈絡毛細管板を保護するため、および／または血管発生を導くための方法における、対象への使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をコードするｍＲＮＡであって、方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含む、ｍＲＮＡによって解決される。

第１の態様および第２の態様のいずれかの実施形態を含むそれらの態様の開示は、第１９の態様に等しく適用される。換言すれば、第１および第２の態様のいずれかの実施形態は、第１９の態様のいずれかの実施形態を含む第１９の態様の一実施形態でもある。

第２０の態様の第１の実施形態でもある第２０の態様では、本発明の根底にある課題は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体のスクリーニングのための方法であって、
－ ＶＥＧＦを動物モデルに硝子体内または網膜下投与すること、
－ 色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質を動物モデルに投与すること、
－ １～７２時間後に色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質の効果を決定すること
を含み、
ＶＥＧＦの効果が遮断される場合、血液血管の漏出が生じない場合、細胞外マトリックスの増加が生じない場合、および／またはブルッフ膜の肥厚化が生じない場合に、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質が色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体となる、方法によって解決される。

第２１の態様の第１の実施形態でもある第２１の態様では、本発明の根底にある課題は、抗ＶＥＧＦ剤のスクリーニングのための方法であって、
－ ＶＥＧＦを動物モデルに硝子体内または網膜下投与すること、
－ 抗ＶＥＧＦ剤候補物質を動物モデルに投与すること、
－ １～７２時間後に抗ＶＥＧＦ剤候補物質の効果を決定すること
を含み、
ＶＥＧＦの効果が遮断される場合、血液血管の漏出が生じない場合、細胞外マトリックスの増加が生じない場合、および／またはブルッフ膜の肥厚化が生じない場合に、抗ＶＥＧＦ剤候補物質が抗ＶＥＧＦ剤となる、方法によって解決される。

第２０および第２１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第２の実施形態では、動物モデルは動物の硝子体または網膜下空間であり、好ましくは、動物は、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル、および類人猿を含む群から選択される。

第２０および第２１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第３の実施形態では、ＶＥＧＦと抗ＶＥＧＦ剤候補物質のＰＥＤＦ類似体候補物質とは、逐次または一緒に投与され得る。

第２０および第２１の態様の第１、第２、および第３の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第４の実施形態では、血液血管、好ましくは眼の血液血管、より好ましくは脈絡毛細管板に対するＶＥＧＦの効果、そのような血液血管の漏出に対する効果、細胞外マトリックスの増加に対する効果、および／またはブルッフ膜の肥厚化に対する効果に基づく色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質および抗ＶＥＧＦ剤候補物質それぞれの効果が決定される。

第２０および第２１の態様の第４の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第５の実施形態では、効果は動物モデルに適用されるＶＥＧＦから生じる効果である。

第２０および第２１の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第６の実施形態では、効果は、電子顕微鏡検査、細胞化学、および分子生物学を含む群から選択される手段によって決定される。

第２０および第２１の態様の第６の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第７の実施形態では、分子生物学から選択される手段は、逆ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、および質量分析によるタンパク質の特性解析を含む。

第２０および第２１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の実施形態の一実施形態でもある第２０および第２１の態様の第８の実施形態では、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。

第２０および第２１の態様のスクリーニング方法に関連して、ＰＥＤＦ類似体候補物質および抗ＶＥＧＦ剤候補物質がそれぞれ網膜下投与される場合、上記効果は早ければ投与の１時間後に観察され得ることが当業者によって理解されるだろう。第２０および第２１の態様のスクリーニング方法に関連して、ＰＥＤＦ類似体候補物質および抗ＶＥＧＦ剤候補物質がそれぞれ硝子体内投与される場合、上記効果は早ければ投与の１２～２４時間後に観察され得ることもまた当業者によって理解されるだろう。

本明細書で好ましく使用される場合、迷路状毛細血管形成は好ましくは眼疾患の眼における迷路状毛細血管形成である。

本明細書で好ましく使用される場合、脈絡毛細管板の成長を誘導することは、新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することを含むか、または新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することである。

本明細書で好ましく使用される場合、脈絡毛細管板の成長を誘導することは本来の脈絡毛細管板に取って代わることができる脈絡毛細管板を提供し、好ましくは、本来の脈絡毛細管板は患部脈絡毛細管板である。

本明細書で好ましく使用される場合、脈絡毛細管板を密着させることは病的脈絡毛細管板を密着させることを含む。

本明細書で好ましく使用される場合、細胞外マトリックス形成を阻害することは、血液血管の内腔に対するおよび／または血液血管の周辺の細胞外マトリックス形成の阻害を含む。

本明細書で好ましく使用される場合、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。

本明細書で好ましく使用される場合、脈絡毛細管板を保護することは、抗ＶＥＧＦ薬の中止の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む。

本明細書で好ましく使用される場合、血管発生を導くことは、機能的血液血管、好ましくは病的血液血管からの機能的血液血管の発生を含む。

本明細書で好ましく使用される場合、ＰＥＤＦはヒトＰＥＤＦである。

医薬組成物は、少なくともＰＥＤＦまたはＰＥＤＦをコードするｍＲＮＡ、および好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含むことが理解されるだろう。そのような賦形剤は、当技術分野で使用される、および／または公知のいかなる賦形剤であってもよい。より詳細には、そのような賦形剤は、本明細書に開示される医薬の製造に関連して議論される任意の賦形剤である。さらなる実施形態では、医薬組成物は薬学的にさらに活性な薬剤を含む。

医薬および医薬組成物の調製は、本開示を考慮すれば、当業者に公知である。典型的には、そのような組成物は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとしての注射剤；注射前の液体への溶解もしくは懸濁に好適な固体形態；経口投与のための錠剤もしくは他の固体；徐放性カプセル剤；または点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤等を含む、現在使用されている任意の他の形態として調製することができる。手術野における特定の領域を処置するための、外科医、医師、または医療従事者による生理食塩水系洗浄剤等の滅菌製剤の使用もまた、特に有用である場合がある。組成物はまた、マイクロデバイス、微小粒子、またはスポンジを介して送達してもよい。

製剤化後、医薬は、投薬剤形と適合性の方法、および薬理学的に有効であるような量で投与することができる。製剤は、多様な剤形、例えば上に記載した種類の注射用溶液において容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤等も用いることができる。

この文脈では、投与される有効成分の分量および組成物の容量は、処置される個体または対象に依存する。投与に必要とされる活性化合物の具体的な量は、実施者の判断に依存し、各個人に特有である。

活性化合物を分散させるために必要とされる最小容量の医薬が典型的には利用される。好適な投与計画もまた可変的であるが、初めに化合物を投与して結果をモニタリングし、次いでさらに制御された用量をさらに間隔を空けて投与することが典型的であり得る。

医薬組成物または医薬は、滅菌され得る、ならびに／あるいはアジュバント、例えば、保存、安定化、湿潤、もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝液を含有し得る。加えて、医薬組成物または医薬はまた、他の治療的に役立つ物質を含有してもよい。組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法によって調製され、典型的には約０．１％～７５％、好ましくは約１％～５０％の有効成分を含有する。

液体、特に注射用組成物は例えば、溶解すること、分散すること等によって調製することができる。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に純粋な溶媒に溶解されるかまたはそれと混合され、それによって注射用溶液または懸濁液を形成する。加えて、注射前に液体に溶解するのに好適な固体形態が製剤化されてもよい。

また、所望される場合、投与される医薬組成物および医薬は、それぞれ、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびに例えば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミン等の他の物質を含有してもよい。

本発明の核酸分子および医薬をそれぞれ利用する投薬計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；処置される状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに用いられる特定のアプタマーまたはその塩を含む多様な因子に従って選択される。通常の技能を有する医師または獣医師は、状態の進行を防止、軽減、または停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。

本発明は、さらなる特徴、実施形態、および利点が引き出され得る図面、実施例、および配列表によってさらに例示される。それに関連して、以下の通りである。

眼球除去直後に固定した未処置ラットの脈絡毛細管板を示す電子顕微鏡写真である。矢印は内皮におけるブルッフ膜に対する有窓構造を示す。表示されているバー＝２μｍ。 低酸素の１４時間後に撮影した電子顕微鏡写真である。大幅に縮小している毛細血管内腔内に多くの糸状仮足様突起が存在した。毛細血管を取り囲む細胞外マトリックスが増強し（鏃）、細胞がブルッフ膜内に現れた（矢印）。表示されているバー＝２μｍ。 低酸素後に撮影した電子顕微鏡写真である。毛細血管内腔に突き出した内皮の個々の糸状仮足は１０μｍ超の長さであった（矢印）。表示されているバー＝２μｍ。 低酸素後に撮影した電子顕微鏡写真である。迷路状毛細血管の内皮細胞の間または内部に多くの開放された間隙が存在した（鏃）。表示されているバー＝２μｍ。 硝子体内ＰＥＤＦ注射および低酸素後に撮影した電子顕微鏡写真である。迷路状毛細血管は発生せず、毛細血管の内腔はインビボと同様に維持された（星印）。表示されているバー＝５μｍ。 低酸素後に撮影した硝子体内ＰＥＤＦ注射を行わなかった場合の電子顕微鏡写真である。迷路状毛細血管が発生し、毛細血管の内腔が虚脱した（矢印）。表示されているバー＝５μｍ。 低酸素およびアバスチン処置、ＰＥＤＦ処置、または無処置後の超薄切片における、脈絡毛細管板、脈絡毛細管板内腔、および内皮が占める面積の定量分析を示す棒グラフである。 準超薄切片に示されるＣＮＶの電子顕微鏡写真である。左および右の矢印は、ＣＮＶの伸長およびＲＰＥが依然として単層である部位を示す。視細胞核層はより薄く、外側のセグメントは不規則にＣＮＶに面している。 ＶＥＧＦベクター注射の６週間後の眼に対する、色素の注射の約２０分後の代表的なＳＬＯ蛍光眼底造影検査画像である（左、フルオレセイン蛍光眼底造影検査（ＦＡ）；右（インドシアニングリーン蛍光眼底造影検査（ＩＣＧ））。 各群の、ベクター注射の６週間後（処置前）の測定と７週間後（処置１週間後）の測定との間のＣＮＶ病変領域の最大厚さの変化の平均を示す棒グラフである。平均標準偏差を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。 ブルッフ膜（黒鏃）とＲＰＥとの間に位置する新たに形成された脈絡毛細管板を示す電子顕微鏡写真である。血管は赤血球（ＲＢ）を含有する。ＲＰＥと新たな血管との間に新たなブルッフ膜（白鏃）がＰＥＤＦ処置後に形成された。 ブルッフ膜（黒鏃）とＲＰＥとの間に位置する新たに形成された脈絡毛細管板を示す電子顕微鏡写真である。血管は赤血球（ＲＢ）を含有する。ＲＰＥと新たな血管との間に新たなブルッフ膜（白鏃）が形成された。周皮細胞（Ｐ）は、ＰＥＤＦ処置後、ＲＰＥに面する内皮に有窓構造（矢印）も有するこの血管に結合する。 ＰＥＤＦ処置後の２個のＲＰＥ細胞間の極度に高電子密度の密着結合（鏃）を示す電子顕微鏡写真である。 ＰＥＤＦ処置後の脈絡毛細管板細胞の２つの内皮間のいくつかの極度に高電子密度の顕著な結合（鏃）を示す電子顕微鏡写真である。 細胞外マトリックスの厚層（鏃）によって取り囲まれ、本来のＲＰＥ単層由来のＲＰＥ細胞のいくつかの層によって分離されている、ＰＥＤＦ処置の非存在下における、新たに形成された血液血管を示す電子顕微鏡写真である。細胞外マトリックスの突出は内皮皺壁を血管内腔の方向へ変化させた（白星印）。内皮内に、ヒトＣＮＶにおける病的血管に典型的な大きな液胞が形成される（黒星印）（Schraermeyer, Julien et al. 2015）。そのような突出または液胞は、ＰＥＤＦ処置後には見られなかった。表示されているバー＝５μｍ。 偏光顕微鏡によって撮影した画像のパネルである。下段は、ピクロシリウスレッド染色後のＣＮＶを有する眼由来の切片を示す。上段は偏光下の同じ切片を示す。黒鏃はＣＮＶと脈絡膜との境界を示す。白鏃は未成熟ＩＩＩ型コラーゲンを示す。黒矢印はＰＥＤＦを用いた処置後の血液血管を取り囲むＩ型コラーゲンの周縁の位置を示す。星印は成熟コラーゲン（Ｉ型）からなる強膜を表す。左列は、ＰＥＤＦおよびアバスチンの注射後の眼の一例を示す。中央列は、アバスチンのみを用いて処置した眼を示す。右列は、ＰＥＤＦを単独で用いて処置した眼の一例を示す。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは未処置のままであった。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは２５０ｎｇ／ｍＬのＰＥＤＦを単独で用いて処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは５００ｎｇ／ｍＬのＰＥＤＦを単独で用いて処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは２５０μｇ／ｍＬのベバシズマブを単独で用いて処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは１ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを単独で用いて処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣは２ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを単独で用いて処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣはＰＥＤＦ（２５０ｎｇ／ｍＬ）＋ベバシズマブ（２５０μｇ／ｍＬ）の組合せとして処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。 成長因子低減マトリゲル上でのＨＵＶＥＣの内皮細胞管腔形成の顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣはＰＥＤＦ（２５０ｎｇ／ｍＬ）＋ベバシズマブ（１ｍｇ／ｍＬ）の組合せとして処置された。写真は３７℃での５時間のインキュベーション後に撮影した。

［実施例１：眼球の低酸素への曝露］
１６匹のラット由来の３２の眼球を軽度低酸素に曝露した。虚血を、眼球を１５ｍｌファルコンチューブにおいて眼球除去後１４時間４℃のＤＭＥＭ中でインキュベートすることによってモデル化した（チューブ１つ当たり１つの眼球）。低体温は虚血発作に対する耐性時間を延長する可能性がある。チューブに７ｍｌのＤＭＥＭおよび空気を満たした。チューブを水平に保管して、ＤＭＥＭと空気との間の酸素交換を増強した。１４時間後、半分の眼球を免疫細胞化学のためにパラフィンに、または電子顕微鏡検査のためにエポンに包埋した。１２の眼球を眼球除去直後に包埋し、対照として役立てた。

酸素圧を、このエクスビボ実験における眼球の硝子体に挿入した較正済み光ファイバー酸素センサー（ＷＰＩ、Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、麻酔下の生きているラットの眼球との比較のために測定した。眼球除去直後に酸素圧はインビボ濃度の２％まで低下し、次いで漸進的に増加し、１時間後にインビボ濃度に達した。その後、インビボ酸素濃度は下がらなかった。

［実施例２：内皮細胞の糸状仮足様突起の内周輪郭の測定］
各プラスチック包埋眼球由来の脈絡毛細管板血管の電子顕微鏡写真を、糸状仮足様突起の内周輪郭に関して分析した。また、切片にした血管領域１つ当たりの内皮細胞外周輪郭の長さを測定した。ｉＴＥＭ画像分析ソフトウェア（ｉＴＥＭバージョン５．０；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を測定のために使用した。結果を、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用することによって、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１１およびＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ２２ソフトウェアにおいて分析した。０．０５未満のｐ値を群間で有意に異なるとした。内皮細胞内周輪郭の長さは、血管内腔に対する微絨毛内皮細胞突起の形成を示す対照群と比較して５８％増加した（ｐ＜０．００１）。これらの血管はヒトＣＮＶにおける迷路状毛細血管に厳密に対応する（Schraermeyer, Julien et al. 2015）。

［実施例３：脈絡毛細管板に対する低酸素の効果］
低酸素への曝露が行われていない脈絡毛細管板は、ブルッフ膜の側に対して有窓構造を有する規則的な薄い内皮を含有する（図１矢印を参照のこと）。毛細血管の内腔はいかなる細胞突起も欠如している。低酸素の１４時間後、毛細血管内腔内に多くの糸状仮足様突起が存在した（図２を参照のこと）。毛細血管を取り囲む細胞外マトリックスが増強し（鏃）、細胞がブルッフ膜内に現れた（矢印）。毛細血管内腔内の個々の糸状仮足は１０μｍ超の長さであった（図３矢印を参照のこと）。低酸素後、内皮細胞の間または内部に多くの開放された間隙が存在した（図４鏃を参照のこと）。

［実施例４：低酸素後のＶＥＧＦおよびＨＩＦ－１αの発現］
対照および虚血性眼球を標準的な手順に従ってホルマリン固定パラフィン包埋した。４μｍ厚切片を切り出し、脱パラフィンおよび再水和し、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）において煮沸した。ＴＢＳ（ｐＨ＝７．６）中での３回の洗浄ステップ後、ＨＩＦ－１αおよびＶＥＧＦの免疫組織化学染色を、製造業者によって提供された説明書に従って湿潤チャンバーにおいて実施した。スライドを一次ウサギ抗ＨＩＦ－１α抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と共に３７℃で１２０分間インキュベートし、次いでＤＡＫＯ ＲＥＡＬ検出システムアルカリホスファターゼ／レッドキットウサギ／マウスを使用して処理し、次いでヘマトキシリンを用いて対比染色し、蓋をした。同じ手順を、ＶＥＧＦに対する免疫反応性分析のために、一次マウス抗体（１：５０、Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ、ＵＳＡ）を使用し、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ＝９．０）において煮沸して実施した。

対照ラットでは、ＨＩＦ－１αは脈絡膜において発現しなかった。低酸素後、ＨＩＦ－１αは脈絡膜において検出された。対照眼球におけるＶＥＧＦはＲＰＥ内に検出された。虚血の１４時間後、ＶＥＧＦの染色は網膜および脈絡膜にさらに現れた。

［実施例５：ＰＥＤＦによる迷路状毛細血管形成の阻害］
１２の眼球に２０μｇのＰＥＤＦ（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）を注射し、次いで実施例１に記載されているように低酸素に曝露した。３つの眼球に０．８μｌのベバシズマブ（アバスチン）を注射した。６つの眼球も低酸素に曝露したが、いかなる注射も行わなかった。眼球の超薄切片を電子顕微鏡下にて調査した。

処置を行わなかった場合、脈絡毛細管板は、図１～４に示すように内皮間に間隙を有する迷路状毛細血管に変化し、虚脱して、多くの場合毛細血管内腔の完全な消失を引き起こした（図５の矢印を参照のこと）。対照的に、脈絡毛細管板の内腔は、インビボでの固定後のように見え、良好に保存された（図６の星印を参照のこと）。

切片にした血管１つ当たりの内皮細胞内周輪郭と内皮細胞外周輪郭とによって囲まれる面積を、全ての眼球の電子顕微鏡写真において測定した。これらの測定から、脈絡毛細管板全体、脈絡毛細管板の内腔、および内皮が占める面積を算出した。ＰＥＤＦは、血管内腔および間隙に対する内皮糸状仮足の形成を阻害しただけでなく、さらに血管内腔を、処置を行わなかった場合（図７を参照のこと）（ｐ＜０．００００００３）よりも、およびアバスチン処置（ｐ＜０．０２３）と比較して有意に良好に保存した。また、細胞の体積と比例する可能性が高い切片にした内皮細胞の面積は、未処置と比較して有意に大きかった（図７右を参照のこと）（ｐ＜０．０３）が、アバスチンは効果を有しなかった（ｐ＝０．７５）。

スチューデントのｔ検定を実施して、異なる実験群の結果を比較した。分析のためにエクセルソフトウェアを使用した。過誤率は５％であった（ｐ＜０．０５ 統計的に有意）。

［実施例６：ＶＥＧＦ過剰発現およびＰＥＤＦ処置後の機能的密着脈絡毛細管板およびブルッフ膜の形成］
新たなベクター系をこの計画のために、以前のアデノベクター研究（Julien, Kreppel et al. 2008）と同じＶＥＧＦカセットを使用して設計した。プラスミドｐＢＬＡＳＴ４９－ｈＶＥＧＦ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５ｃＤＮＡを、Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって作製された最新技術のＡＡＶ２ベクター（亜型４）骨格に挿入した。新たなＡＡＶベクターは、アデノウイルス研究において以前に使用されていた非特異的ＣＭＶプロモーターに代わってＲＰＥ特異的ＲＰＥ６５プロモーターを含有するという利益を有する。これらの新たなＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ－ＶＥＧＦ）は、アデノベクターと比較して毒性が少なく、より長い発現時間を伴うより緩徐な発現速度を有し、数か月の時間枠にわたる処置のための薬物候補物質の評価に専念する長時間発現研究に好都合である（Rolling, Le Meur et al. 2006）。

ＡＡＶ．ＶＥＧＦ－Ａ１６５ベクターのラット眼への網膜下注射

２μｌのＰＢＳに希釈したＡＡＶ－ＶＥＧＦベクターの２×１０９個のウイルス粒子を３０匹のＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの両眼に網膜下注射した。簡潔に述べると、３成分麻酔（フェンタニル０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、ミダゾラム２ｍｇ／ｋｇ体重、およびメデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を用いた麻酔後、１～２滴のＭｅｄｒｉａｔｉｃｕｍ点眼薬（Ｐｈａｒｍａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて瞳孔を散大させ、１滴の局所麻酔薬Ｎｏｖｅｓｉｎｅ（ＯｍｎｉＶｉｓｉｏｎ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（ＯｍｎｉＶｉｓｉｏｎ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）点眼薬を使用して、眼の乾燥を回避した。注射を、手術用顕微鏡を使用して実施した。角膜縁付近の強膜を、まず２５Ｇ針を用いて切開し、次いで２μｌのベクター懸濁液（２μｌは２×１０９個のウイルス粒子のＡＡＶ－ＶＥＧＦを含有する；最大可能用量）を、ＮａｎｏＦｉｌ３４Ｇ鈍針を備えた１０μｌ ＮａｎｏＦｉｌシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して網膜下（毛様体扁平部）注射した。局所抗生物質点眼薬のＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ－ＰＯＳ（登録商標）（Ｕｒｓａｐｈａｒｍ、Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を注射後に適用した。麻酔を、解毒薬（ナロキソン０．１２ｍｇ／ｋｇ体重、フルマゼニル０．２ｍｇ／ｋｇ体重、アチパメゾール０．７５ｍｇ／ｋｇ体重）の皮下注射によって中和した。

＜硝子体内注射＞
治療物質の硝子体内注射をＶＥＧＦベクター注射の６週間後に行った。

硝子体内注射のために、小切開を目尻の結膜に対して行った。眼球を、１本の微細ピンセットを用いて結膜を把持し、穏やかに引っ張ることで回転させた。５μｌの容量を、ＮａｎｏＦｉｌ３４ゲージベベル針を備えた１０μｌ ＮａｎｏＦｉｌシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して孔を介して硝子体内注射した。注射後、針は、逆流を抑制するために追加の３または４秒間眼に留め、次いで引き抜いた。眼球を正常な位置に戻し、抗生物質軟膏剤を眼に塗布した。全手順を、照明を備えた手術用顕微鏡を使用して実施した。３つの群を調査した。

１）Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ；２５ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）を２０の眼に硝子体内注射した。
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）はＰｈａｒｍａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎによって購入および等分された。１００ｍｇのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）を、２４０ｍｇのａ，ａ－トレハロース２Ｈ２Ｏ、２３．２ｍｇのＮａ２ＨＰＯ４ Ｈ２Ｏ、４．８ｍｇのＮａＨ２ＰＯ４、および１．６ｍｇのポリソルベート２０を含有する４ミリリットルのビヒクル溶液に希釈した。

２）ＰＥＤＦヒトＨＥＫ２９３組換えタンパク質（１μｇ／μｌ；ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）を２０の眼に硝子体内注射した。
組換えタンパク質のペレットを濾過（０．４μｍ）し、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中０．５ｍｇ／ｍＬに凍結乾燥した。製品データシートに従って、ペレットを脱イオン水（Ａｍｐｕｗａ水）に溶解して、１μｇ／μｌの使用原液を取得した。

３）２０の眼を処置しなかった
インビボ撮像（ＳＬＯ／ＯＣＴ、ＦＡおよびＩＣＧ蛍光眼底造影検査）ならびに定量を（Wang, Rendahl et al. 2003）に従って実施した。網膜下ＡＡＶ－ＶＥＧＦは注射の５週間～２０か月後にＲＰＥ増殖を引き起こし、漏出はフルオレセイン蛍光眼底造影検査によって２～１２か月から観察することができる。したがって、走査型レーザー検眼鏡検査（ＳＬＯ）、光干渉断層計（ＯＣＴ）、フルオレセイン蛍光眼底造影検査（ＦＡ）、およびインドシアニングリーン蛍光眼底造影検査（ＩＣＧ）を、ベクター注射の６週間後に実施した。眼を、動物に対する使用のために（Fischer, Huber et al. 2009、Huber, Beck et al. 2009）からのプロトコルに従って改変したＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）ＨＲＡ＋ＯＣＴ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）デバイスを使用して、ＶＥＧＦベクターの注射の７週間後に再調査した。７８ｄｐｔ二重非球面レンズ（Ｖｏｌｋ Ｏｐｔｉｃａｌ， Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｔｏｒ、ＯＨ ４４０６０、Ｕ．Ｓ．Ａ．）をデバイスの出口に直接取り付け、追加の特注の＋３．５ｄｐｔコンタクトレンズをラットの眼に直接取り付けた。ラットを麻酔し、瞳孔を散大させ、眼の乾燥を回避するため、および３．５ｄｐｔレンズのより良好な接着性のためにＭｅｔｈｏｃｅｌを用いて処置した。ＩＣＧ色素（２５０μｌ（ＶＥＲＤＹＥ、５ｍｇ／ｍｌ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｇｒｅｅｎ）を尾静脈に注射し、フルオレセイン色素（Ａｌｃｏｎ１０％（１／１０希釈）、２５０μｌ）を皮下注射した。ＳＬＯ／ＯＣＴを、早期蛍光眼底造影検査撮像のために注射の約２～５分後、および後期蛍光眼底造影検査撮像のためにその約１５～２０分後に実施した。ＳＬＯ／ＯＣＴ装置はヒト眼に対する使用に関して較正されるため、ｘおよびｙ軸の寸法はラットにおける使用に関して補正されない。網膜高さ等のｚ軸の寸法は適切に表示される。したがって、ここで実施した蛍光眼底造影検査測定におけるＣＮＶ過蛍光面積の測定は、本来のＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ較正を使用して、μｍ単位ではなく任意単位（ａｕ）で示される。ＯＣＴデータセットにおいて実施した厚さ測定の定量は、ＯＣＴデータセットがビームのｚ方向において提示される場合、μｍ単位で表示される。

＜組織学のための眼球の処理＞
電子顕微鏡検査（ＥＭ）のために、全眼球を０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中５％グルタルアルデヒドに一晩固定した。その場合、病変領域が蛍光眼底造影検査において可視となるため、病変領域を切り出し、包埋することが可能となる。

＜統計＞
スチューデントのｔ検定を実施して、処置動物の結果を対照群と比較した。分析のためにエクセルソフトウェアを使用した。過誤確率は５％であった（ｐ＜０．０５ 統計的に有意）。多重比較問題を回避するために、結果を、ホルム・ボンフェローニ法を使用して補正した。

＜ＡＡＶ．ＶＥＧＦ－Ａ１６５のラット眼への網膜下注射の６週間後の蛍光眼底造影検査によるＣＮＶの調査＞
ＡＡＶ－ＶＥＧＦ惹起ラットＣＮＶモデルは、インビボ撮像によって立証されるように、ＶＥＧＦ形質導入の６週間後に完全に成長したＣＮＶを示した。代表的な画像を示す（図８を参照のこと）。

ＶＥＧＦを過剰発現する６０の全ての眼はＦＡおよびＩＣＧ撮像において典型的なＣＮＶ病変様過蛍光を示し（図９）、これはＶＥＧＦ形質導入有効性が１００％であったことを意味した。

以下において、ＶＥＧＦベクターを成功裏に形質導入し、ＣＮＶ様病変を示す眼を「ＣＮＶ眼」と称し、ＣＮＶ様病変を「ＣＮＶ病変」と称す。

全ての眼を蛍光眼底造影検査によって調査した。大半のＣＮＶ病変は、ＦＡ蛍光眼底造影検査とＩＣＧ蛍光眼底造影検査の両方において典型的な環形状パターンを示した。中心の低蛍光領域は、とりわけＦＡ画像では明るい過蛍光環によって取り囲まれた（図９左パネルを参照のこと）。このパターンは、高反射領域において明瞭な網膜下病変を示すＯＣＴ分析と良好に相関した。対照的に、ＩＣＧシグナルは、病変の低蛍光中心周辺のより大きな領域にわたって通例広がるやや斑状のパターンを示した。

ＩＣＧは、非常に長い半減期を有する、内腔タンパク質に結合する色素である。したがって、ＩＣＧは、組織内に保持される場合、単回静脈内注射後のいくつかの時点において記録することができる。これは、例えばＣＮＶ血管から周囲組織へのタンパク質漏出に関して行われる。

図９に示すように（右パネル、緑色チャネルを参照のこと）、ＦＡシグナルと対照的に、ＩＣＧ過蛍光は、ＣＮＶ病変周辺の経時的に広がるやや斑状のパターンを示す（２０分以内、さらに、その後の時点、ここでは第１の蛍光眼底造影検査期間の１週間後の、追加の色素注射を伴わないＩＣＧの再調査時）。最終的に、これは、後の時点において眼の全背景を覆う可能性があるより大きな領野の単一の過蛍光部分の形成を引き起こす。しかしながら、これらのパターンは、追加のＩＣＧ色素の注射直後は劇的には変化しない。

＜ＰＥＤＦ処置によるＣＮＶ病変領域の厚さの減少＞
各眼に関して、全ＣＮＶ病変領域を有する領域（ＳＬＯ蛍光眼底造影検査によって検出した）をＯＣＴによってスクリーニングした。病変の最大厚さを有する領域を決定し、撮像した。これらの画像において最大厚さを測定した。種々の薬剤を用いた処置によって引き起こされた変化を分析するために、ベクターの網膜下注射の７週間後（処置１週間後）の分析の各眼に関する測定値と、６週間後の分析（処置前）の対応する値との差を決定した。ＰＥＤＦは、細胞増殖および線維症を阻害し、したがってＣＮＶの厚さを未処置群と比較して有意に減少させたが、血液血管はアバスチン群のように完全には虚脱しなかった。したがって、ＣＮＶはアバスチン群ではより扁平となった（図１０を参照のこと）。

＜健康な脈絡毛細管板、ブルッフ膜、および結合複合体の新たな形成に対するＰＥＤＦの効果＞
ＰＥＤＦタンパク質処置後の眼を電子顕微鏡検査によって調査し、ＰＥＤＦ処置を伴わないＶＥＧＦベクター注射後の眼を対照として使用した。ＰＥＤＦ処置の大半の顕著な効果は、新たに形成された脈絡毛細管板がいかなる処置も伴わない健康な脈絡毛細管板と非常に類似するというものであった。新たに形成された血管は、ＲＰＥの直下に位置し、新たなブルッフ膜を形成した（図１１を参照のこと）。内皮細胞は、健康な血管と同様に薄く、周皮細胞と結合し、有窓構造を発生し（図１２を参照のこと）、網膜下空間へは成長しなかった。

加えて、網膜色素上皮細胞間の結合複合体（図１４）および脈絡毛細管板の内皮細胞間の結合複合体（図１５）は、ＶＥＧＦベクター処置のみの眼と比較して劇的に拡大し、高電子密度であった。これらの複合体は、接着結合および密着結合からなる。密着結合は、脈絡毛細管板の内皮細胞間にも現れたが、これらの血管においては以前に報告されていない。血液網膜関門が網膜血管の密着結合および網膜色素上皮の密着結合によって構築されていることは一般に認められている。結合に対する効果は、ＶＥＧＦ過剰発現と組み合わせたＰＥＤＦによって媒介される。

ＰＥＤＦはまた、ＲＰＥ細胞の***を抑制し、細胞外マトリックスを含有する血管内突出の形成を阻害した（図２および１５を参照のこと）。この現象はＣＮＶのウサギモデルにおいても記載された（Julien, Kreppel et al. 2008）。そのような突出はＰＥＤＦ処置後には見られず、ＰＥＤＦ処置は、新たに形成された血管において単層基底膜の形成を引き起こしたが、処置を行わなかった場合は基底膜が多層化した。また、新たに形成された血液血管の網膜下空間および網膜への伸展は、ＰＥＤＦ処置後には生じなかったが、ＰＥＤＦ注射を行わなかった場合は見られた。

［実施例７：ＰＥＤＦと抗ＶＥＧＦ薬との組合せの効果］
ＰＥＤＦと抗ＶＥＧＦ薬、例えばベバシズマブ（アバスチン）との組合せは、相乗的に作用し、新たな機能的血管の調和した成長を支持しており、さらに新たに形成された脈絡毛細管板における有窓構造の形成を改善する。

［実施例８：ＰＥＤＦはＣＮＶにおける細胞外マトリックスの形成を抑制する］
この実施例に示すように、ＰＥＤＦはＣＮＶにおける細胞外マトリックスの形成を抑制した。したがって、ＣＮＶに典型的な瘢痕は最小化され、したがって、新たに形成された血管からＰＲＥおよび視細胞への酸素および栄養の供給距離は短縮した。

＜方法＞
２μｌのＡＡＶ．ＶＥＧＦ－Ａ^１６５（２μｌのＰＢＳに希釈したＡＡＶ－ＶＥＧＦベクターの２×１０^９個のウイルス粒子）の網膜下注射をＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの４８の眼に実施して、ＣＮＶを誘導した。３週間後、ＣＮＶ発生をインビボ検査によって確認し、１００％の眼（ｎ＝４８の眼）がＣＮＶを示した。

インビボ調査の直後、眼を、４μｌのＰＥＤＦタンパク質（１０μｇ）「第１群」（ｎ＝１２の眼）もしくはアバスチン（５０μｇ）「第２群」（ｎ＝１２の眼）を用いて、または組合せ療法（ＰＥＤＦタンパク質（１０μｇ）＋アバスチン（５０μｇ））「第３群」（ｎ＝１２の眼）として硝子体内処置した。未処置眼は対照「第４群」（ｎ＝１２の眼）として役立てた。

６週目に、ＰＥＤＦタンパク質もしくはアバスチン、または両方のタンパク質の組合せの２回目の硝子体内処置を、３週目に関して記載したように実施した。その１週間後の７週目に、ＣＮＶにおける細胞外マトリックスの成熟に対する効果を偏光顕微鏡検査によって評価した。

眼球のパラフィン切片を以下のプロトコルに従って染色した。

＜ピクロシリウスレッド染色プロトコル＞
１．蒸留水中で脱パラフィンおよび水和する
２．ワイゲルトヘマトキシリン中で８分間染色する
３．蒸留水中で十分に濯ぐ
４．溶液Ａに２分間入れる
５．蒸留水で濯ぐ
６．溶液Ｂに６０分間入れる
７．溶液Ｃに２分間入れる
８．４５秒間の７０％エタノール
９．脱水し、透明化し、封入する
１０．スライドを偏光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ、Ｚｅｉｓｓ）下で評価する。この方法は、異なる種類のコラーゲンを色によって識別することを可能にする。Ｉ型（赤色、橙色）、ＩＩＩ型（黄色、緑色）。

＜結果＞
結果を図１６に示す。

脈絡膜新生血管の領域内において、コラーゲンは、ＰＥＤＦおよびアバスチンの注射後、偏光顕微鏡下で緑色に見えた（図１６、左列）。また、アバスチン単独の注射後、コラーゲンは緑がかっていたが、コラーゲンの量は両方のタンパク質の注射と比較して大きく増強した（図１６、中央列）。緑色は、コラーゲンが線維組織に典型的なＩＩＩ型であったことを示した。ＰＥＤＦ単独の注射後、コラーゲンは橙色となり、薄層として血液血管を取り囲んだ（図１６、矢印、右列）。このことは、コラーゲンが成熟しており、細胞外マトリックスおよび血管の新たな形成が停止していたことを示した。緑がかったコラーゲンは、ＰＥＤＦ注射後は、検体を３６０度回転させても見られなかった。処置を行わなかった場合、コラーゲンは、アバスチン注射後の結果（図１６、中央列）と同様に、緑がかっており、大部分のＣＮＶ領域を占めた（示していない）。

［実施例９：ＶＥＧＦの網膜下または硝子体内注射によるヒトＡＭＤの模倣］
２μｌのＰＢＳ中１００ｎｇのＶＥＧＦタンパク質（ｈＶＥＧＦ Ｓｉｇｍａ）をＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの眼に網膜下または硝子体内注射した。対照に関しては、ＰＢＳのみを注射した。

眼を１および２４時間後に電子顕微鏡検査および免疫細胞化学によって調査した。脈絡毛細管板は、図２～４およびヒトＣＮＶの以前の刊行物（Schraermeyer, Julien et al. 2015）に示すように、迷路状毛細血管に変化した。加えて、ブルッフ膜内および脈絡毛細管板周辺に細胞外マトリックスの顕著な増大が存在した。図１５に示すような血管内腔への内皮陥入を誘導した細胞外マトリックスの突出も存在した。ＲＰＥの基底膜と血管との合成は多層に増強された。加えて、ＲＰＥは高度に活性化し、単層から遊走した。脈絡毛細管板内では、血小板が活性化し、赤血球は、おそらくは補体活性化によって溶血し、うっ滞も発生させた。これらの全ての所見は驚くべきことに、注射の１～２４時間後にはすでに観察され、対照群では欠如しており、ＡＭＤに罹患しているヒト眼に見られる所見を模倣した。

［実施例１０：血管形成に対するＰＥＤＦ、ベバシズマブ、またはＰＥＤＦとベバシズマブとの組合せのインビトロ効果］
血管形成に対するＰＥＤＦ、ベバシズマブ（アバスチン）、またはＰＥＤＦとベバシズマブ（アバスチン）との組合せのインビトロ効果を内皮細胞管腔形成アッセイにおいて決定した。内皮細胞管腔形成アッセイとは、潜在的な薬物候補物質の血管形成および抗血管形成効果を研究するための古典的なインビトロアッセイである。

＜方法：内皮細胞管腔形成アッセイ＞
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を、６０μＬの成長因子低減マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてプレコーティングし、ＥＣＧＭ培地中のＨＵＶＥＣ細胞（１３０００個／ウェル）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をプレートに播種した。ウェルに、ＰＥＤＦ単独（２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ）、ベバシズマブ単独（アバスチン；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）（２５０μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ）、ならびに一緒になったある濃度のＰＥＤＦ（２５０ｎｇ／ｍＬ）＋ベバシズマブ（２５０μｇ／ｍＬ）、およびＰＥＤＦ（２５０ｎｇ／ｍＬ）＋ベバシズマブ（１ｍｇ／ｍＬ）を補充して、内皮細胞管腔形成に対するこれらの分子の効果を決定した。３７℃での５時間のインキュベーション後、管腔形成を、Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＬ ＬＥＤ倒立位相差顕微鏡を使用して、ウェルにおいて分析した。

＜結果＞
結果を図１７ａ～ｈに示す。

２５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＥＤＦの場合、内皮管腔形成のごくわずかな阻害が存在し（図１７ｂ）、５００ｎｇ／ｍＬでは完全な阻害が観察された（図１７ｃ）。ベバシズマブは２ｍｇ／ｍＬの濃度でのみ管腔形成を阻害した（図１７ｆ）。それぞれ２５０ｎｇ／ｍＬ（ＰＥＤＦ）および２５０μｇ／ｍＬ（ベバシズマブ）の濃度でのＰＥＤＦとベバシズマブとの同時投与は、同じ濃度のＰＥＤＦまたはベバシズマブを用いて個々に処置した場合よりもはるかに強力な阻害効果を管腔形成に対して示した（図１７ｇ）。このことは、単独で使用した場合に２ｍｇ／ｍＬの高濃度でのみ内皮管腔形成を阻害したベバシズマブに関して特に明白であった。したがって、このように、ベバシズマブは、ＰＥＤＦと組み合わせて処置した場合にはるかに低い濃度で管腔形成を阻害することにおいて効果的であった（図１７ｂおよび１７ｈ）。このデータは、内皮管腔形成の阻害に関する、したがって血管形成の阻害におけるＰＥＤＦおよびベバシズマブの相乗効果を示す。

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本明細書、特許請求の範囲、配列表、および／または図面に開示されている本発明の特徴は、別個およびその任意の組合せのいずれにおいても、その様々な形態における本発明を実現するための材料となり得る。

Claims (18)

1. 疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）であって、前記方法がＰＥＤＦを対象に投与することを含み、前記疾患が眼疾患であり、前記疾患の処置および／または防止が、迷路状毛細血管形成を阻害すること、脈絡毛細管板の成長を誘導すること、脈絡毛細管板を密着させること、細胞外マトリックス形成を阻害すること、脈絡毛細管板を保護すること、および／または血管発生を導くことを含む、使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
2. 前記眼疾患が黄斑変性症であり、好ましくは、黄斑変性症が加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、より好ましくは萎縮型加齢黄斑変性症または滲出型加齢黄斑変性症である、請求項１に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
3. 滲出型および／または萎縮型ＡＭＤにおける地図状萎縮の成長および／または形成を阻害する、請求項２に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
4. 前記眼疾患が、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病網膜症、虹彩ルベオーシス、角膜新生血管、ポリープ状脈絡膜血管症、未熟児網膜症、ならびに網膜および／または脈絡膜線維症を含む群から選択される、請求項１に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
5. 前記疾患が網、膜および／または脈絡膜線維症であり、ＰＥＤＦが、網膜および脈絡膜線維症の進行を阻害する、請求項４に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
6. 迷路状毛細血管形成が、好ましくは眼疾患の眼における迷路状毛細血管形成である、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
7. 脈絡毛細管板の成長を誘導することが、新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することを含むか、または新たな脈絡毛細管板の成長を誘導することである、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
8. 脈絡毛細管板の成長を誘導することが、本来の脈絡毛細管板に取って代わることができる脈絡毛細管板を提供し、好ましくは、本来の脈絡毛細管板が患部脈絡毛細管板である、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
9. 脈絡毛細管板を密着させることが、病的脈絡毛細管板を密着させることを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
10. 細胞外マトリックス形成を阻害することが、血液血管の内腔に対するおよび／または血液血管の周辺の細胞外マトリックス形成の阻害を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
11. 脈絡毛細管板を保護することが、抗ＶＥＧＦ薬の損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
12. 脈絡毛細管板を保護することが、抗ＶＥＧＦ薬の中止による損傷作用から脈絡毛細管板を保護することを含む、請求項１１に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
13. 血管発生を導くことが、機能的血液血管、好ましくは病的血液血管からの機能的血液血管の発生を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
14. 前記病的血液血管が病的状態の結果である、請求項１３に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
15. 硝子体内または網膜下投与される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
16. 前記方法が抗ＶＥＧＦ療法を適用することをさらに含み、好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ療法が前記対象への抗ＶＥＧＦ薬の投与を含み、前記抗ＶＥＧＦ薬が、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびアフリベルセプトを含む群から選択される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の使用のための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
17. 色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体のスクリーニングのための方法であって、
    － ＶＥＧＦを動物モデルに硝子体内または網膜下投与するステップと、
    － 色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質を前記動物モデルに投与するステップと、
    － １～７２時間後に前記色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質の効果を決定するステップと
    を含み、
    ＶＥＧＦの効果が遮断される場合、血液血管の漏出が生じない場合、細胞外マトリックスの増加が生じない場合および／またはブルッフ膜の肥厚化が生じない場合、前記色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体候補物質が色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）類似体である、方法。
18. 抗ＶＥＧＦ剤のスクリーニングのための方法であって、
    － ＶＥＧＦを動物モデルに硝子体内または網膜下投与するステップと、
    － 抗ＶＥＧＦ剤候補物質を前記動物モデルに投与するステップと、
    － １～７２時間後に前記抗ＶＥＧＦ剤候補物質の効果を決定するステップと
    を含み、
    ＶＥＧＦの効果が遮断される場合、血液血管の漏出が生じない場合、細胞外マトリックスの増加が生じない場合および／またはブルッフ膜の肥厚化が生じない場合、前記抗ＶＥＧＦ剤候補物質が抗ＶＥＧＦ剤である、方法。
    

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