CN113645994A - 使用色素上皮衍生因子(pedf)治疗疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，其中所述疾病是眼病且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

Description

使用色素上皮衍生因子(PEDF)治疗疾病的方法

技术领域

本发明涉及用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)、用于治疗和/或预防疾病的方法中的编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA、用于筛选色素上皮衍生因子(PEDF)类似物的方法和用于筛选抗-VEGF剂的方法。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)是西方国家中法定失明的最常见原因。黄斑下视网膜色素上皮的萎缩和脉络膜新生血管形成(CNV)的发展继而导致中央视敏度的丧失。AMD的早期征象是视网膜色素上皮和玻璃膜(Bruch's membrane)之间的沉积物(玻璃疣)。存在两种形式的AMD——湿性的和干性的。

在湿性AMD的疾病期间，脉络膜血管向黄斑的视网膜下腔出芽。这些新血管经常出现异常、渗漏并造成视网膜下水肿。这些水肿导致中央视觉和阅读能力的丧失。

在患有干性AMD的患者中，主要影响是脉络膜毛细管层的丧失(Biesemeier,Taubitz等人.2014)。随后，视网膜色素上皮(RPE)和光感受器退化，这导致地图样萎缩(GA)。对于干性AMD，目前没有可用的治疗方法来防止脉络膜毛细管层的丧失。

具有视网膜中央凹下CNV的患者目前用降低或阻断血管内皮生长因子(VEGF)的药物进行治疗。自2004年以来，抗-VEGF疗法已成为湿性AMD的标准治疗方法，并彻底改变了这种疾病的管理。在2004年至2006年间，在获得监管部门批准用于治疗AMD(培加他尼、雷珠单抗)或在核准标示以外使用(贝伐珠单抗)后，三种抗-VEGF药物被引入眼科(Browning,Kaiser等人.2012)。它们在以下方面表现出重要差异：它们的活性位点、配制方法、结合亲合力和生物活性(Julien,Biesemeier等人.2014)。培加他尼(Macugen)是一种寡核苷酸适体，其通过连接到其肝素结合结构域而选择性地结合并中和VEGF的主要病理学异构体(VEGF-A165)。雷珠单抗(Lucentis,Genentech/Novartis)是一种亲和力成熟的人源化的单克隆抗体片段(Fab)，而贝伐珠单抗(阿瓦斯丁,Genentech/Roche)是一种全长的人源化的单克隆抗体。两者都通过阻断VEGF-A的所有异构体的受体结合结构域而起作用(Ferrara,Damico等人.2006)。阿柏西普(VEGF Trap-Eye,Eylea,Regeneron/Bayer)是一种最近获得食品和药品管理局批准的抗-VEGF剂。它是一种由与人IgG1的片段可结晶(Fc)区融合的VEGFR1的第二免疫球蛋白(Ig)结合结构域和VEGFR2的第三Ig结合结构域组成的全人重组融合蛋白。

阿柏西普结合所有VEGF-A异构体、VEGF-B和PlGF(Papadopoulos,Martin等人.2012)。已经广泛描述了在猴子的眼睛中经玻璃体内注射的贝伐珠单抗的作用(Peters,Heiduschka等人.2007,Julien,Biesemeier等人.2013,Schraermeyer和Julien 2013)。作用包括脉络膜毛细管层开窗、光感受器损伤、免疫复合物的形成和血栓性微血管病的减少。Meyer和同事提出了在贝伐珠单抗治疗后血栓形成的流行原理(Meyer,Robles-Carrillo等人.2009)。他们发现，贝伐珠单抗可以通过与VEGF、肝素形成复合物以及激活血小板FcγRIIa受体来诱导血小板聚集、去粒和血栓形成。此外，其它结果已经证实，贝伐珠单抗的Fc结构域通过Fc受体或膜结合的VEGF而有效结合人RPE和人脐带血管内皮细胞膜，这激活补体级联并导致细胞死亡(Meyer和Holz 2011)。尚不清楚阿柏西普是否存在类似问题，因为它也含有人IgG1的Fc结构域。此外，已知IgG1同种型在通过经典途径激活补体***方面是非常有效的(Daha,Banda等人.2011)。实际上，IgG1的Fc部分具有高的结合Clq的能力，从而造成经典途径的后续激活(Daha,Banda等人.2011)。相比之下，雷珠单抗不具有Fc结构域，从而避免了补体级联的激活，但尽管如此也会在非临床研究中诱导溶血和血纤蛋白形成(Julien,Biesemeier等人.2014)。

据报道，VEGF抑制可以激活接受癌症(Meyer,Robles-Carrillo等人.2009)或新生血管性AMD(Schraermeyer和Julien 2013)的治疗的人类中的凝血细胞。此外，VEGF药物在玻璃体内应用后会在猴子的脉络膜毛细管层中诱导血栓性微血管病(Peters,Heiduschka等人.2007,Schraermeyer和Julien 2012)。抗-VEGF药物还会诱导脉络膜毛细管层内的溶血、淤滞和血纤蛋白形成(Schraermeyer和Julien 2012,Schraermeyer和Julien 2013,Julien,Biesemeier等人.2014)。阿瓦斯丁与肝素和VEGF蛋白一起形成复合物，该复合物诱导血栓性事件(Julien,Biesemeier等人.2013)。在从患有湿性AMD的患者手术切离的脉络膜的血管中，抗-VEGF(贝伐珠单抗)治疗会诱导血栓形成和蛋白复合物形成(Schraermeyer,Julien等人.2015)。

这些副作用是不利的，因为AMD患者由于他们的年龄原因具有较高的患中风或其它血管相关疾病的风险。因此，据报道，与没有湿性AMD的相同年龄和性别组相比，用贝伐珠单抗治疗的具有湿性AMD的个体的长期死亡率增加(Hanhart,Comaneshter等人.2017)。特别是在心肌梗塞后(Hanhart,Comaneshter等人.2018)和脑血管事件后(Hanhart,Comaneshter等人.2018)，由抗-VEGF治疗引起的死亡率大大增加。此外，抗-VEGF药物的长期治疗会导致具有湿性AMD的患者中在视网膜周围部分中的原始脉络膜毛细管层的丧失和地图样萎缩(Schutze,Wedl等人.2015)。因此，这种治疗会诱导额外的视力丧失，而如果没有这种治疗就不会发生这样额外的视力丧失。

最近，由于将血管造影术与眼相干断层摄影术(OCTA)一起使用的新可能性(Treister,Nesper等人.2018)，克服了早期荧光素血管造影术仅在已经发生渗漏后检测CNV的缺点，检测到具有单侧渗出性CNV的对侧眼中的亚临床CNV的显著患病率、以及显著更多的与所有CNV病变相邻的脉络膜毛细管层无灌注。Treister等人(Treister等人.2018)鉴定了与它们的对侧亚临床CNV眼相比在渗出性AMD眼中的增加的脉络膜毛细管层无灌注的趋势。这清楚地表明，亚临床CNV的存在不会降低这些患者的视敏度。这些新发现支持对晚期湿性AMD眼睛的早期观察，其中新生血管形成可以帮助光感受器存活(Biesemeier,Julien等人.2014)。

关于湿性AMD治疗的悠久历史，始终使用相同的原则，即除去或阻塞新形成的血管。为了实现这一点，已经使用了不同的方法：激光凝固、手术、辐射、光动力学疗法和现在的玻璃体内抗-VEGF药物。虽然第一方法都不能改善视力，但抗-VEGF(雷珠单抗)的使用是成功的，并可以暂时改善视敏度，但距离最佳恢复还很远。

发明内容

本发明的一个根本问题是提供一种用于治疗眼病诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法。

本发明的另一个根本问题是提供一种用于治疗眼病诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)从而在延长的时间段内提供改善的视敏度的方法。

本发明的这些和其它根本问题由所附独立权利要求的主题解决。优选的实施方案可以从所附的从属权利要求获得。

本发明的根本问题也在第一方面由以下内容解决，其也是第一方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第一方面的第二个实施方案中，其也是第一方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述疾病是眼病。

在第一方面的第三个实施方案中，其也是第一方面的第二个实施方案的一个实施方案，所述眼病是黄斑变性，优选地黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

在第一方面的第四个实施方案中，其也是第一方面的第三个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制湿性AMD和/或干性AMD中的地图样萎缩的生长和/或形成。

在第一方面的第五个实施方案中，其也是第一方面的第二个实施方案的一个实施方案，所述疾病选自包括以下的组：中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变、早产儿视网膜病变以及视网膜和脉络膜纤维化。

在第一方面的第六个实施方案中，其也是第一方面的第五个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制视网膜和/或脉络膜纤维化的进展。

本发明的根本问题也在第二方面由以下内容解决，其也是第二方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用编码PEDF的mRNA，且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第二方面的第二个实施方案中，其也是第二方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述疾病是眼病。

在第二方面的第三个实施方案中，其也是第二方面的第二个实施方案的一个实施方案，所述眼病是黄斑变性，优选地黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

在第二方面的第四个实施方案中，其也是第二方面的第三个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制湿性AMD和/或干性AMD中的地图样萎缩的生长和/或形成。

在第二方面的第五个实施方案中，其也是第二方面的第二个实施方案的一个实施方案，所述疾病选自包括以下的组：中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变、早产儿视网膜病变以及视网膜和脉络膜纤维化。

在第二方面的第六个实施方案中，其也是第二方面的第五个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制视网膜和/或脉络膜纤维化的进展。

本发明的根本问题也在第三方面由以下内容解决，其也是第三方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是眼病。

在第三方面的第二个实施方案中，其也是第三方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第三方面的第三个实施方案中，其也是第三方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述眼病是黄斑变性，优选地黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

在第三方面的第四个实施方案中，其也是第三方面的第三个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制湿性AMD和/或干性AMD中的地图样萎缩的生长和/或形成。

在第三方面的第五个实施方案中，其也是第三方面的第二个实施方案的一个实施方案，所述疾病选自包括以下的组：中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变、早产儿视网膜病变和视网膜和/或脉络膜纤维化。

在第三方面的第六个实施方案中，其也是第三方面的第五个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制视网膜和/或脉络膜纤维化的进展。

本发明的根本问题也在第四方面由以下内容解决，其也是第四方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是黄斑变性。

在第四方面的第二个实施方案中，其也是第四方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第四方面的第三个实施方案中，其也是第四方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

在第四方面的第四个实施方案中，其也是第四方面的第三个实施方案的一个实施方案，PEDF抑制湿性AMD和/或干性AMD中的地图样萎缩的生长和/或形成。

本发明的根本问题也在第五方面由以下内容解决，其也是第五方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是中心性浆液性脉络膜视网膜病变。

在第五方面的第二个实施方案中，其也是第五方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第六方面由以下内容解决，其也是第六方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是糖尿病性视网膜病变。

在第六方面的第二个实施方案中，其也是第六方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第七方面由以下内容解决，其也是第七方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是虹膜发红。

在第七方面的第二个实施方案中，其也是第七方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第八方面由以下内容解决，其也是第八方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是角膜新生血管形成。

在第八方面的第二个实施方案中，其也是第八方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第九方面由以下内容解决，其也是第九方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是息肉样脉络膜血管病变。

在第九方面的第二个实施方案中，其也是第九方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第十方面由以下内容解决，其也是第十方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是早产儿视网膜病变。

在第十方面的第二个实施方案中，其也是第十方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

本发明的根本问题也在第十一方面由以下内容解决，其也是第十一方面的第一个实施方案：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF或编码PEDF的mRNA，其中所述疾病是视网膜和/或脉络膜纤维化。

在第十一方面的第二个实施方案中，其也是第十一方面的第一个实施方案的一个实施方案，治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第十一方面的第三个实施方案中，其也是第十一方面的第一和第二个实施方案的一个实施方案，PEDF和/或编码PEDF的mRNA抑制视网膜和/或脉络膜纤维化的进展。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，迷宫毛细血管形成是眼中、优选眼病中的迷宫毛细血管形成。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，诱导脉络膜毛细管层的生长包含或者是诱导新脉络膜毛细管层的生长。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，诱导脉络膜毛细管层的生长会提供能够替换原始脉络膜毛细管层的脉络膜毛细管层，优选地原始脉络膜毛细管层是患病的脉络膜毛细管层。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，收紧脉络膜毛细管层包含收紧病理性脉络膜毛细管层。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，抑制细胞外基质形成包含抑制朝向血管腔和/或在血管周围的细胞外基质形成。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物的损伤效应。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物停用的损伤效应。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，引导血管发育包含功能性血管、优选来自病理性血管的功能性血管的发育。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，所述病理性血管是病理学状况、优选受试者的病理学状况的结果，更优选地所述病理学状况是这样的疾病：受试者正在遭受该疾病或处于遭受该疾病的风险中，和/或使用或意图使用PEDF或编码PEDF的mRNA来治疗该疾病。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，PEDF或编码PEDF的mRNA经玻璃体内或经视网膜下施用。

在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的一个实施方案中，包括其每个和任何实施方案，所述方法进一步包括应用抗-VEGF疗法，优选地抗-VEGF疗法包括给受试者施用抗-VEGF药物，其中所述抗-VEGF药物选自培加他尼、雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普。在其一个实施方案中，PEDF和抗-VEGF疗法的组合使用允许与抗-VEGF疗法的单独使用相比减少施用给受试者的抗-VEGF疗法的量。施用给受试者的抗-VEGF疗法的量的这种减少通常导致副作用、尤其是所述抗-VEGF疗法的副作用(诸如心血管副作用)的减少。

不希望受任何理论约束，本发明人已经惊奇地发现，色素上皮衍生因子(PEDF)能够诱导健康和功能性脉络膜毛细管层的生长以及与其相关的作用，诸如抑制迷宫毛细血管形成、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育，其有利于眼病的治疗。就此而言，本发明远离了基于阻断血管生长或除去血管的眼病治疗的当前技术水平。

鉴于通过PEDF对迷宫毛细血管形成的这种抑制，PEDF在治疗眼病方面的治疗有效性是合理的，特别是对于表现出迷宫毛细血管形成的那些眼病，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、干性AMD和湿性AMD、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变和早产儿视网膜病变。例如，如果给湿性AMD患者注射荧光素，就会观察到大量液体在短时间内从病理性血管中渗出。这一发现的最合理原因是，在内皮壁之间或内部存在大间隙。但是，连接血细胞和细胞外基质的内皮中的间隙会立即被凝血细胞封闭，而这并没有发生。最近，在来自AMD患者的手术切离的脉络膜新生血管形成(CNV)中发现了具有许多内皮微绒毛状突起的毛细血管，所述突起在血管腔中形成迷宫状结构。这种毛细血管的管腔显示出与间质组织的开放连接。这些毛细血管与血管网络相连，因为它们充满了血浆，且因此它们是渗漏的来源。这种类型的毛细血管在CNV中经常观察到，且被称为“迷宫毛细血管”。这些迷宫毛细血管中的渗漏部位不能被凝血细胞封闭，因为由于迷宫毛细血管的管腔减小，凝血细胞无法进入。因此，这种血管类型造成慢性血浆渗出，并且是水肿的根源(Schraermeyer,Julien等人.2015)。

此外，色素上皮衍生因子(PEDF)具有非常强的神经营养和神经保护作用(King和Suzuma 2000)。该因子由RPE在常氧条件下产生。在缺氧时停止产生。这极大地促进新生血管形成。在年龄相关性黄斑变性(AMD)中，受损的RPE细胞产生太少的PEDF。这会产生不受控制的新生血管形成。据信，PEDF在眼中的主要作用是防止血管的新生(King和Suzuma2000)，但根据本发明，如果病理性血管形成已经由VEGF引起，PEDF可以稳定CNV血管并避免迷宫毛细血管形成。

在第一方面，其也是第一方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在其一个优选的实施方案中，PEDF是人PEDF蛋白，在一个更优选的实施方案中，PEDF包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列：

QNPASPPEEG SPDPDSTGAL VEEEDPFFKV PVNKLAAAVS NFGYDLYRVR SSTSPTTNVLLSPLSVATAL SALSLGAEQR TESIIHRALY YDLISSPDIH GTYKELLDTV TAPQKNLKSA SRIVFEKKLRIKSSFVAPLE KSYGTRPRVL TGNPRLDLQE INNWVQAQMK GKLARSTKEI PDEISILLLG VAHFKGQWVTKFDSRKTSLE DFYLDEERTV RVPMMSDPKA VLRYGLDSDL SCKIAQLPLT GSMSIIFFLP LKVTQNLTLIEESLTSEFIH DIDRELKTVQ AVLTVPKLKL SYEGEVTKSL QEMKLQSLFD SPDFSKITGK PIKLTQVEHRAGFEWNEDGA GTTPSPGLQP AHLTFPLDYH LNQPFIFVLR DTDTGALLFI GKILDPRGP(SEQ ID NO:1)

在其一个优选的实施方案中，PEDF是PEDF的衍生物，优选人PEDF的衍生物，且更优选包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PEDF的衍生物。本领域技术人员将明白，可以使用PEDF的任何衍生物，只要PEDF能够造成以上作用，且尤其是抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和引导血管发育的作用。在一个实施方案中，PEDF是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的PEDF。在另一个实施方案中，PEDF的衍生物是这样的衍生物：其中在SEQID NO:1的氨基酸位置20，氨基酸残基是吡咯烷酮羧酸，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置24，氨基酸残基是磷酸丝氨酸，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置114，氨基酸残基是磷酸丝氨酸，在SEQ ID NO:1的氨基酸位置227，氨基酸残基是磷酸丝氨酸，和/或在SEQ ID NO:1的氨基酸位置285，氨基酸残基是N-连接的(GlcNAc)天冬酰胺。

应当理解，以上作用中的任一种，和具体地，迷宫毛细血管形成及其任何变化(包括其抑制)、脉络膜毛细管层的生长的诱导、脉络膜毛细管层的收紧、细胞外基质形成的抑制、脉络膜毛细管层的保护和血管发育的引导可以通过光相干性体层摄影术(OCT-A)进行评估，优选与荧光素血管造影术(FA)组合，后者适用于分别检测和评估渗漏性血管(Spaide等人.2015)。光相干性体层摄影术血管造影术(OCT-A)作为用于对视网膜和脉络膜的微脉管***进行成像的非侵入性技术出现(Spaide等人.2015)。简而言之，OCT-A技术使用移动红血细胞的表面的激光反射来准确描绘穿过眼睛的不同分段区域的血管，从而消除对血管内染料的需求。患者视网膜的OCT扫描由多个单独的A-扫描组成，所述A-扫描编译成B-扫描提供横截面结构信息。使用OCT-A技术，同一组织区域被重复成像并分析扫描之间的差异，从而允许检测包含高流速的区域，即扫描之间有显著变化，以及检测较慢流动或根本没有流动的区域，这在扫描之间是相似的。

OCT-A和FA也可以用于分别检测和评估位于视网膜和/或视网膜下腔内的水肿。

在第一方面的第二个实施方案中，其也是第一方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述疾病是眼或眼部疾病。

在第一方面的第三个实施方案中，其也是第一方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述眼病是黄斑变性，优选年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选地干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

在第一方面的第四个实施方案中，其也是第一方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述眼病选自包括以下的组：中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变和早产儿视网膜病变。

在第一方面的第五个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三和第四个实施方案的一个实施方案，迷宫毛细血管形成是眼中、优选眼病中的迷宫毛细血管形成。

在第一方面的第六个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四和第五个实施方案的一个实施方案，诱导脉络膜毛细管层的生长包含或者是诱导新脉络膜毛细管层的生长。

在第一方面的第七个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六个实施方案的一个实施方案，诱导脉络膜毛细管层的生长会提供能够替换原始脉络膜毛细管层的脉络膜毛细管层，优选地原始脉络膜毛细管层是患病的脉络膜毛细管层。与此相关，本领域技术人员将承认，患病的脉络膜毛细管层位于玻璃膜和RPE之间并且可以在OCT-A中看到。

在第一方面的第八个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七个实施方案的一个实施方案，其中收紧脉络膜毛细管层包含收紧病理性脉络膜毛细管层。与此相关，应当承认，位于玻璃膜和RPE之间或视网膜下腔内的每个新生血管脉络膜毛细管层或血管优选地被视为病理性的。更优选地，仅当脉络膜毛细管层发展成迷宫毛细血管或由于其它原因变得渗漏时，才将脉络膜毛细管层视为病理性的。其诊断可以通过OCT-A和/或荧光素血管造影术(FA)来进行。

在第一方面的第九个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八个实施方案的一个实施方案，抑制细胞外基质形成包含抑制朝向血管腔和/或在血管周围的细胞外基质形成。优选地，这样的血管由于内皮向管腔中的突出的缺乏不会抑制红血细胞的流动。

在第一方面的第十个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九个实施方案的一个实施方案，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物的损伤效应。这样的抗-VEGF药物优选地是选自培加他尼、雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普的药物。与此相关，应当承认，这样的损伤效应可能涵盖血管的退化以及RPE和光受体的变性，从而导致地图样萎缩。由于RPE的自发荧光消失，因此在扫描激光检眼镜检查(SLO)时，地图样萎缩可能被检测为黑点。SLO图片是RPE中脂褐素的自发荧光的结果。

在第一方面的第十一个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十实施方案的一个实施方案，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物停用的损伤效应。与此相关，应当理解，优选地，血管变得渗漏并变成迷宫毛细血管；内皮细胞增殖和迁移。

在第一方面的第十二个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案，引导血管发育包含功能性血管、优选来自病理性血管的功能性血管的发育。与此相关，优选地，病理性血管是不允许适当的血流量的血管，是渗漏的，形成过多或非典型细胞外基质蛋白。

在第一方面的第13个实施方案中，其也是第一方面的第十二实施方案的一个实施方案，所述病理性血管是病理学状况的结果。这样的病理学状况可以是缺氧、HIF 1α的上调、生长因子和VEGF的非典型形成中的一种或组合。

在第一方面的第14个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第13个实施方案的一个实施方案，PEDF经玻璃体内或经视网膜下施用，或作为载体诸如编码PEDF的腺伴随病毒施用。

在第一方面的第15个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第13和第14个实施方案的一个实施方案，所述方法进一步包括应用抗-VEGF疗法，优选地抗-VEGF疗法包括给受试者施用抗-VEGF药物，其中所述抗-VEGF药物选自培加他尼、雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普。与此相关，本领域技术人员应当承认，可以在早期使用PEDF，例如当在一只眼睛中检测到CNV时，可以预防性地治疗对侧眼；此外，如果诊断出具有正常眼部视力的亚临床CNV，则可以开始治疗以保持CNV稳定。

在第一方面的第16个实施方案中，其也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第13、第14和第15个实施方案的一个实施方案，所述受试者是遭受抗-VEGF治疗的副作用、优选由抗-VEGF治疗引起的视力丧失的受试者。

在第二方面，其也是第二方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：用于治疗和/或预防疾病的方法中的编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。在一个实施方案中，所述mRNA是编码根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的mRNA。本领域技术人员会明白，如果根据本发明使用编码PEDF的mRNA，诸如在用于治疗和/或预防疾病的方法中，所述mRNA含有编码指导mRNA进入内质网(ER)并且其被切除的信号肽的序列。在一个实施方案中，所述mRNA是编码根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的mRNA：

ATGCAGGCCCTGGTGCTACTCCTCTGCATTGGAGCCCTCCTCGGGCACAGCAGCTGCCAGAACCCTGCCAGCCCCCCGGAGGAGGGCTCCCCAGACCCCGACAGCACAGGGGCGCTGGTGGAGGAGGAGGATCCTTTCTTCAAAGTCCCCGTGAACAAGCTGGCAGCGGCTGTCTCCAACTTCGGCTATGACCTGTACCGGGTGCGATCCAGCACGAGCCCCACGACCAACGTGCTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGGCCACGGCCCTCTCGGCCCTCTCGCTGGGAGCGGAGCAGCGAACAGAATCCATCATTCACCGGGCTCTCTACTATGACTTGATCAGCAGCCCAGACATCCATGGTACCTATAAGGAGCTCCTTGACACGGTCACCGCCCCCCAGAAGAACCTCAAGAGTGCCTCCCGGATCGTCTTTGAGAAGAAGCTGCGCATAAAATCCAGCTTTGTGGCACCTCTGGAAAAGTCATATGGGACCAGGCCCAGAGTCCTGACGGGCAACCCTCGCTTGGACCTGCAAGAGATCAACAACTGGGTGCAGGCGCAGATGAAAGGGAAGCTCGCCAGGTCCACAAAGGAAATTCCCGATGAGATCAGCATTCTCCTTCTCGGTGTGGCGCACTTCAAGGGGCAGTGGGTAACAAAGTTTGACTCCAGAAAGACTTCCCTCGAGGATTTCTACTTGGATGAAGAGAGGACCGTGAGGGTCCCCATGATGTCGGACCCTAAGGCTGTTTTACGCTATGGCTTGGATTCAGATCTCAGCTGCAAGATTGCCCAGCTGCCCTTGACCGGAAGCATGAGTATCATCTTCTTCCTGCCCCTGAAAGTGACCCAGAATTTGACCTTGATAGAGGAGAGCCTCACCTCCGAGTTCATTCATGACATAGACCGAGAACTGAAGACCGTGCAGGCGGTCCTCACTGTCCCCAAGCTGAAGCTGAGTTACGAAGGCGAAGTCACCAAGTCCCTGCAGGAGATGAAGCTGCAATCCTTGTTTGATTCACCAGACTTTAGCAAGATCACAGGCAAACCCATCAAGCTGACTCAGGTGGAACACCGGGCTGGCTTTGAGTGGAACGAGGATGGGGCGGGAACCACCCCCAGCCCAGGGCTGCAGCCTGCCCACCTCACCTTCCCGCTGGACTATCACCTTAACCAGCCTTTCATCTTCGTACTGAGGGACACAGACACAGGGGCCCTTCTCTTCATTGGCAAGATTCTGGACCCCAGGGGCCCCTAA。

SEQ ID NO:2的核苷酸序列的前57个核苷酸编码人PEDF的信号肽。但是，在本发明内，所述信号肽和编码它的核苷酸序列分别被不同的信号肽和编码这种不同信号肽的核苷酸序列替换。这种不同信号肽是本领域已知的。

在一个替代实施方案中，所述mRNA是SEQ ID NO:3的核苷酸序列：

GGACGCTGGATTAGAAGGCAGCAAAAAAAGATCTGTGCTGGCTGGAGCCCCCTCAGTGTGCAGGCTTAGAGGGACTAGGCTGGGTGTGGAGCTGCAGCGTATCCACAGGCCCCAGGATGCAGGCCCTGGTGCTACTCCTCTGCATTGGAGCCCTCCTCGGGCACAGCAGCTGCCAGAACCCTGCCAGCCCCCCGGAGGAGGGCTCCCCAGACCCCGACAGCACAGGGGCGCTGGTGGAGGAGGAGGATCCTTTCTTCAAAGTCCCCGTGAACAAGCTGGCAGCGGCTGTCTCCAACTTCGGCTATGACCTGTACCGGGTGCGATCCAGCATGAGCCCCACGACCAACGTGCTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGGCCACGGCCCTCTCGGCCCTCTCGCTGGGAGCGGACGAGCGAACAGAATCCATCATTCACCGGGCTCTCTACTATGACTTGATCAGCAGCCCAGACATCCATGGTACCTATAAGGAGCTCCTTGACACGGTCACTGCCCCCCAGAAGAACCTCAAGAGTGCCTCCCGGATCGTCTTTGAGAAGAAGCTRCGCATAAAATCCAGCTTTGTGGCACCTCTGGAAAAGTCATATGGGACCAGGCCCAGAGTCCTGACGGGCAACCCTCGCTTGGACCTGCAAGAGATCAACAACTGGGTGCAGGCGCAGATGAAAGGGAAGCTCGCCAGGTCCACAAAGGAAATTCCCGATGAGATCAGCATTCTCCTTCTCGGTGTGGCGCACTTCAAGGGGCAGTGGGTAACAAAGTTTGACTCCAGAAAGACTTCCCTCGAGGATTTCTACTTGGATGAAGAGAGGACCGTGAGGGTCCCCATGATGTCGGACCCTAAGGCTGTTTTACGCTATGGCTTGGATTCAGATCTCAGCTGCAAGATTGCCCAGCTGCCCTTGACCGGAAGCATGAGTATCATCTTCTTCCTGCCCCTGAAAGTGACCCAGAATTTGACCTTGATAGAGGAGAGCCTCACCTC(SEQ ID NO:3)

在第二方面的另一个实施方案中，包括其任何实施方案，mRNA是重组或异源mRNA，其优选地包含结构元件诸如5’UTR和/或3’UTR，其不同于PEDF的编码序列的来源mRNA的5’UTR和/或3’UTR。

第一方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第二方面。换而言之，第一方面的每个和任何实施方案也是第二方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第十二方面，其也是第十二方面的第一个实施方案，本发明的根本问题也由以下内容解决：药物组合物，其包含色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病的方法中，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。优选地，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

第一方面和第二方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第十二方面，包括其任何实施方案。换而言之，第一方面和第二方面的每个和任何实施方案也是第十二方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第13方面，其也是第13方面的第一个实施方案，本发明的根本问题也由以下内容解决：药物组合物，其包含色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病的方法中，其中所述疾病是眼病。

第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第13方面，包括其任何实施方案。换而言之，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的每个和任何实施方案，包括其任何实施方案，也是第13方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第14方面，其也是第14方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病，其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

第一方面和第二方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第14方面。换而言之，第一方面和第二方面的任何实施方案也是第14方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第15方面，其也是第15方面的第一个实施方案，本发明的根本问题也由以下内容解决：色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA用于制备药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病，其中所述疾病是眼病。

第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第15方面，包括其任何实施方案。换而言之，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的每个和任何实施方案，包括其任何实施方案，也是第15方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第16方面，其也是第16方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其中治疗和/或预防疾病包括给所述受试者施用治疗有效量的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，并且抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

第一方面和第二方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第16方面，包括其任何实施方案。换而言之，第一方面和第二方面的任何实施方案也是第16方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第17方面，其也是第17方面的第一个实施方案，本发明的根本问题也由以下内容解决：用于治疗和/或预防受试者中的疾病的方法，其中治疗和/或预防疾病包括给所述受试者施用治疗有效量的色素上皮衍生因子(PEDF)或编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA，其中所述疾病是眼病。

第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第17方面，包括其任何实施方案。换而言之，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一方面的每个和任何实施方案，包括其任何实施方案，也是第17方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。在一个优选的实施方案中，所述治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

在第18方面，其也是第18方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：色素上皮衍生因子(PEDF)，其用于在受试者中用于抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育的方法，且其中所述方法包括给所述受试者施用PEDF。

第一方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第18方面，包括其任何实施方案。换而言之，第一方面的任何实施方案也是第16方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第19方面，其也是第19方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：编码色素上皮衍生因子(PEDF)的mRNA和色素上皮衍生因子(PEDF)，其用于在受试者中用于抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育的方法，且其中所述方法包括给所述受试者施用PEDF。

第一方面和第二方面的公开内容，包括其任何实施方案，同样适用于第19方面。换而言之，第一和第二方面的任何实施方案也是第19方面的一个实施方案，包括其任何实施方案。

在第20方面，其也是第20方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：用于筛选色素上皮衍生因子(PEDF)类似物的方法，其中所述方法包括：

-将VEGF经玻璃体内或经视网膜下施用进动物模型，

-将色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物施用进动物模型，

-在1-72h后确定色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物的作用，

其中如果VEGF的作用被阻断、不发生血管渗漏、不发生细胞外基质的增加和/或不发生玻璃膜的增厚，则所述色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物是色素上皮衍生因子(PEDF)类似物。

在第21方面，其也是第21方面的第一个实施方案，本发明的根本问题由以下内容解决：用于筛选抗-VEGF剂的方法，其中所述方法包括：

-将VEGF经玻璃体内或经视网膜下施用进动物模型，

-将抗-VEGF剂候选物施用进动物模型，

-在1-72h后确定抗-VEGF剂候选物的作用，

其中如果VEGF的作用被阻断、不发生血管渗漏、不发生细胞外基质的增加和/或不发生玻璃膜的增厚，则所述抗-VEGF剂候选物是抗-VEGF剂。

在第20和第21方面的第二个实施方案中，其也是第20和第21方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述动物模型是动物的玻璃体腔或视网膜下腔，优选地所述动物选自包括以下的组：小鼠、大鼠、豚鼠、猪、猴和猿。

在第20和第21方面的第三个实施方案中，其也是第20和第21方面的第一和第二个实施方案的一个实施方案，可以依次或一起施用VEGF和抗-VEGF剂候选物的PEDF类似物候选物。

在第20和第21方面的第四个实施方案中，其也是第20和第21方面的第一、第二和第三个实施方案的一个实施方案，分别确定色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物和抗-VEGF剂候选物关于VEGF对血管(优选在眼中的血管，更优选脉络膜毛细管层)的作用的作用，对这样的血管的渗漏的作用，对细胞外基质的增加的作用和/或对玻璃膜的增厚的作用。

在第20和第21方面的第五个实施方案中，其也是第20和第21方面的第四个实施方案的一个实施方案，所述作用是由应用于动物模型的VEGF产生的作用。

在第20和第21方面的第六个实施方案中，其也是第20和第21方面的第一、第二、第三、第四和第五个实施方案的一个实施方案，通过选自电子显微术、细胞化学和分子生物学的方式确定所述作用。

在第20和第21方面的第七个实施方案中，其也是第20和第21方面的第六个实施方案的一个实施方案，选自分子生物学的方式包含反向PCR(RT-PCR)和通过质谱法对蛋白的表征。

在第20和第21方面的第八个实施方案中，其也是第20和第21方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七个实施方案的一个实施方案，VEGF是人VEGF。

关于根据第20和第21方面的筛选方法，本领域技术人员会明白，如果分别经视网膜下施用PEDF类似物候选物和抗-VEGF剂候选物，则可以早至施用后1小时观察到以上作用。关于根据第20和第21方面的筛选方法，本领域技术人员还会明白，如果分别经玻璃体内施用PEDF类似物候选物和抗-VEGF剂候选物，则可以早至施用后12-24小时观察到以上作用。

如本文中优选地使用的，迷宫毛细血管形成是眼中、优选眼病中的迷宫毛细血管形成。

如本文中优选地使用的，诱导脉络膜毛细管层的生长包含或者是诱导新脉络膜毛细管层的生长。

如本文中优选地使用的，诱导脉络膜毛细管层的生长会提供能够替换原始脉络膜毛细管层的脉络膜毛细管层，优选地原始脉络膜毛细管层是患病的脉络膜毛细管层。

如本文中优选地使用的，收紧脉络膜毛细管层包含收紧病理性脉络膜毛细管层。

如本文中优选地使用的，抑制细胞外基质形成包含抑制朝向血管腔和/或在血管周围的细胞外基质形成。

如本文中优选地使用的，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物的损伤效应。

如本文中优选地使用的，保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物停用的损伤效应。

如本文中优选地使用的，引导血管发育包含功能性血管、优选来自病理性血管的功能性血管的发育。

如本文中优选地使用的，PEDF是人PEDF。

应当理解，药物组合物至少包含PEDF或编码PEDF的mRNA和优选的药学上可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是本领域中使用的和/或已知的任何赋形剂。更具体地，这样的赋形剂是如与本文公开的药物的制备相关讨论的任何赋形剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含另一种药学活性剂。

本领域技术人员考虑到本公开内容会知晓药物和药物组合物的制备。通常，这样的组合物可以制备为：注射剂，作为液体溶液或悬浮液；适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式；作为用于口服施用的片剂或其它固体；作为限时释放胶囊剂；或以目前使用的任何其它形式，包括滴眼剂、乳膏剂、洗剂、油膏剂、吸入剂等。外科医生、医师或健康护理工作者使用无菌制剂(诸如基于盐水的洗液)来处理手术区域中的特定区域也可能是特别有用的。组合物也可以通过微型装置、微粒或海绵递送。

在配制后，药物将以与剂量制剂相容的方式并且以药理学上有效的这样的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，诸如上述可注射溶液的类型，但也可以采用药物释放胶囊剂等。

在该背景下，要施用的活性成分的量和组合物的体积取决于要治疗的个体或受试者。施用所需的活性化合物的具体量取决于从业人员的判断，并且是每个个体所特有的。

通常使用分散活性化合物所需的药物的最小体积。合适的施用方案也是可变的，但典型的方式是最初施用化合物并监测结果，然后以进一步的间隔施用进一步的受控剂量。

药物组合物或药物可以被灭菌和/或含有辅助剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可能含有其它治疗上有价值的物质。根据常规混合、制粒或包衣方法制备组合物，且通常含有约0.1％至75％、优选约1％至50％的活性成分。

液体，特别是可注射的组合物，可以例如通过溶解、分散等来制备。将活性化合物溶解在药学上纯的溶剂(例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等)中或与其混合，从而形成可注射的溶液或混悬液。此外，可以配制适合在注射前溶解在液体中的固体形式。

如果需要的话，分别要施用的药物组合物和药物还可以含有少量无毒辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其它物质，例如，醋酸钠和三乙醇胺油酸酯。

根据多种因素选择分别利用本发明的核酸分子和药物的剂量方案，所述因素包括：患者的类型、物种、年龄、重量、性别和医学病症；要治疗的病症的严重程度；施用途径；患者的肾和肝功能；以及采用的特定适体或其盐。普通技术医师或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或阻止病症进展所需的药物的有效量。

通过附图、实施例和序列表进一步说明本发明，从它们可以得到其它特征、实施方案和优点。与此相关的是：

图1是电子显微照片，显示未经治疗的大鼠的脉络膜毛细管层，所述脉络膜毛细管层在摘出术后直接固定；箭头标记了内皮中朝向玻璃膜的开窗；指示的条＝2μm；

图2是缺氧后14小时拍摄的电子显微照片；在毛细血管腔内有许多线状伪足样突起，毛细血管腔大大减小；在毛细血管周围的细胞外基质增强(箭头)，且细胞出现在玻璃膜内(箭号)；指示的条＝2μm；

图3是缺氧后拍摄的电子显微照片；伸入毛细血管腔内的内皮的单个线状伪足具有超过10μm的长度(箭号)；指示的条＝2μm；

图4是缺氧后拍摄的电子显微照片；在迷宫毛细血管的内皮细胞(箭头)之间或内部有许多开放的间隙；指示的条＝2μm；

图5是玻璃体内PEDF注射和缺氧以后拍摄的电子显微照片；迷宫毛细血管未发生，且毛细血管的管腔像在体内那样维持(星号)；指示的条＝5μm；

图6是缺氧以后且未玻璃体内PEDF注射所拍摄的电子显微照片；迷宫毛细血管发生，且毛细血管的管腔塌陷(箭号)；指示的条＝5μm；

图7是条形图，显示了在缺氧以后且用阿瓦斯丁、PEDF处理或者不经处理的超薄切片中被脉络膜毛细管层、被脉络膜毛细管层腔和被内皮占据的区域的定量分析。

图8是在半薄切片中显示的CNV的电子显微照片；左右箭号标记CNV的延伸和RPE保持单层的位置；光感受器核层较薄，且外段不规则面向CNV；

图9显示了在VEGF-载体注射后6周的眼，在染料注射后约20分钟的代表性SLO血管造影术图像(左：荧光素血管造影术(FA),右：(吲哚菁绿血管造影术(ICG))；

图10是条形图，显示了每组在载体注射后6周(处理前)和7周(处理后1周)测量之间的CNV病变区域的最大厚度变化的平均值；显示了平均值标准差*＝p<0.05,***＝p<0.0001；

图11是电子显微照片，显示了位于玻璃膜(黑色箭头)和RPE之间的新形成的脉络膜毛细管层；该血管含有红血细胞(RB)；在RPE和新血管之间，在PEDF处理后形成了新的玻璃膜(白色箭头)；

图12是电子显微照片，显示了位于玻璃膜(黑色箭头)和RPE之间的新形成的脉络膜毛细管层；该血管含有红血细胞(RB)；在RPE和新血管之间，形成了新的玻璃膜(白色箭头)；周细胞(P)与该血管相关联，在PEDF处理后，该血管也在面向RPE的内皮中开窗(箭号)；

图13是电子显微照片，显示了在PEDF处理后在两个RPE细胞之间的电子密度极高的紧密连接部(箭头)；

图14是电子显微照片，显示了在PEDF处理后在脉络膜毛细管层细胞的两个内皮之间的几个电子密度极高的且突出的连接部(箭头)；

图15是电子显微照片，显示了在没有PEDF处理存在下新形成的血管，其被一层厚厚的细胞外基质(箭头)包围并被来自原始RPE单层的几层RPE细胞隔开；细胞外基质的突起将内皮折叠移向血管腔(白色星号)；在内皮内形成大空泡(黑色星号)，这是人CNV中的病理血管的典型特征(Schraermeyer,Julien等人.2015)；在PEDF处理后未见这样的突起或空泡；指示的条＝5μm；

图16是偏振光显微镜拍摄的一组照片；下一行显示了在天狼猩红染色后具有CNV的眼睛的切片；上一行显示了在偏振光下的相同切片；黑色箭头标记了CNV和脉络膜之间的边界。白色箭头指示未成熟的III型胶原；黑色箭号指示用PEDF处理后在血管周围的I型胶原的环的位置；星号标记由成熟胶原(I型)组成的巩膜；左列显示了注射PEDF和阿瓦斯丁以后眼睛的实例；中间列显示了只用阿瓦斯丁处理的眼睛；且右列显示了单独用PEDF处理的眼睛的实例；和

图17a-h显示了HUVEC在生长因子减少的基质胶上形成的内皮细胞管的显微照片；HUVEC未经处理(a)，或单独用250ng/mL PEDF(b)、500ng/mL PEDF(c)、250μg/mL贝伐珠单抗(d)、1mg/mL贝伐珠单抗(e)、2mg/mL贝伐珠单抗(f)处理，或作为组合PEDF(250ng/mL)+贝伐珠单抗(250μg/mL)(g)、PEDF(250ng/mL)+贝伐珠单抗(1mg/mL)(h)；在37℃温育5小时后拍摄照片。

实施例1：眼睛对缺氧的暴露

将来自16只大鼠的32只眼睛暴露于轻度缺氧。通过在摘出术后14小时内将眼睛在15ml Falcon试管(每个试管1只眼)中在4℃的DMEM中温育来建立缺血模型。低温可以延长对缺血性损伤的耐受时间。给试管填充7ml DMEM和空气。将它们水平存放以增强DMEM和空气之间的氧气交换。14小时后，将一半的眼睛包埋在石蜡中进行免疫细胞化学，或包埋在Epon中进行电子显微术。摘出术后直接包埋十二只眼睛并作为对照。

通过校准的纤维光学氧传感器(WPI,Friedberg,德国)测量氧压，该传感器在该离体实验中被***眼睛的玻璃体中，并用于对比在麻醉下活体大鼠的眼睛。摘出术后立即将氧压下降至体内浓度的2％，并然后逐渐升高，并在1小时后达到体内浓度。之后，体内氧浓度没有被削弱。

实施例2:测量内皮细胞的线状伪足样突起的内周轮廓

对来自每个塑料包埋的眼的脉络膜毛细管层血管的电子显微照片分析了线状伪足样突起的内周轮廓。并且，测量了每个切片的血管区域的外内皮细胞周向轮廓的长度。iTEM图像分析软件(iTEM 5.0版；Olympus Soft Imaging Solutions,Münster,德国)用于测量。通过使用非参数Mann-Whitney检验，在Microsoft Excel 2011和IBM SPSSStatistics 22软件中分析结果。小于0.05的p-值被认为在组之间显著不同。与对照组相比，内侧内皮细胞周边轮廓的长度增加了58％(p<0.001)，这指示朝向血管腔的微绒毛内皮细胞突起的形成。这些血管与人CNV中的迷宫毛细血管完全对应(Schraermeyer,Julien等人.2015)。

实施例3：缺氧对脉络膜毛细管层的影响

未暴露于缺氧的脉络膜毛细管层含有规则的薄内皮，其具有朝向玻璃膜侧的开窗(参见，图1箭号)。毛细血管管腔没有任何细胞突起。缺氧14小时后，在毛细血管腔内出现许多线状伪足样突起(参见，图2)。在毛细血管周围的细胞外基质增强(箭头)，且细胞出现在玻璃膜内(箭号)。在毛细血管腔内的单个线状伪足是超过10μm长(参见，图3箭号)。缺氧后，在内皮细胞之间或内部存在许多开放间隙(参见，图4箭头)。

实施例4:缺氧后VEGF和HIF-1α的表达

将对照和缺血眼根据标准程序进行***固定和石蜡包埋。切下4-μm厚切片，将其脱石蜡和再水合，并在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)中煮沸。在TBS(pH＝7.6)中进行三个洗涤步骤后，根据制造商提供的说明书在湿室中进行HIF-1α和VEGF的免疫组织化学染色。将载玻片与一级兔抗-HIF-1α抗体(1：100,Abcam,丹麦)一起在37℃温育120分钟，并然后使用DAKO REAL检测***碱性磷酸酶/RED试剂盒兔/小鼠(DAKO REAL Detection SystemAlkaline Phosphatase/RED kit rabbit/mouse)进行处理，然后用苏木精复染色和覆盖。使用一级小鼠抗体(1：50,Gene Tex,USA)并在TBS缓冲液(pH＝9.0)中煮沸，进行相同的程序，以进行针对VEGF的免疫反应性分析。

在对照大鼠中，HIF-1α在脉络膜中不表达。缺氧后，在脉络膜中检测到HIF-1α。在RPE内检测到对照眼中的VEGF。缺血14小时后，在视网膜和脉络膜中另外出现VEGF的染色。

实施例5：PEDF对迷宫毛细血管形成的抑制

给12只眼睛注射20μg PEDF(BioVendor)，然后如实施例1所述暴露于缺氧。给3只眼睛注射0.8μl贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)。6只眼睛也暴露于缺氧，没有任何注射。在电子显微镜下研究眼睛的超薄切片。

未经处理，脉络膜毛细管层变成迷宫毛细血管，在内皮之间有间隙，如在图1-4中所示，并塌陷导致毛细血管腔的经常完全丧失(参见，图5中的箭号)。相比之下，脉络膜毛细管层腔看起来如同在体内固定后，并且保存完好(参见，图6中的星号)。

在来自所有眼睛的电子显微照片中测量每个切片的血管的内部和外部内皮细胞圆周轮廓所包围的区域。从这些测量，计算被整个脉络膜毛细管层、被脉络膜毛细管层腔和被内皮占据的面积。PEDF不仅抑制朝向血管腔和间隙的内皮线状伪足的形成，而且与未处理相比(p<0.0000003)和与阿瓦斯丁处理相比(p<0.023)，它还显著更好地保护血管腔(参见，图7)。并且，切片的内皮细胞的面积(其可能与细胞体积成正比)与未处理相比明显更大(参见，图7右侧)(p<0.03)，而阿瓦斯丁没有影响(p＝0.75)。

进行Students t-检验以对比不同实验组的结果。使用excel软件进行分析。错误概率为5％(p<0.05为统计上显著的)。

实施例6：VEGF过表达和PEDF处理后功能性紧密脉络膜毛细管层和玻璃膜的形成

使用与之前腺载体研究中相同的VEGF盒(Julien,Kreppel等人.2008)，为该项目设计了一个新的载体***。将来自质粒pBLAST49-hVEGF(Invivogen,San Diego,CA)的人VEGF-A165 cDNA***由Sirion Biotech GmbH(慕尼黑,德国)生产的现有技术水平AAV2载体(亚型4)主链中。新的AAV载体的优点是，它含有RPE特异性的RPE65启动子，而不是以前在腺病毒研究中使用的非特异性CMV启动子。与腺载体相比，这些新的AAV-载体(例如AAV-VEGF)具有更小的毒性且具有更慢的表达速度和更长的表达时间，这有利于长时间表达研究，专门用于评价在几个月的时间范围内进行治疗的药物候选物(Rolling,Le Meur等人.2006)。

AAV.VEGF-A165载体在大鼠眼睛中的视网膜下注射

将在2μl PBS中稀释的AAV-VEGF载体的2x10⁹个病毒颗粒经视网膜下注射到30只Long Evans大鼠的双眼中。简而言之，在腹膜内注射三组分麻醉剂(0.005mg芬太尼、2mg咪达***和0.15mg美托咪定/kg体重)麻醉后，用1至2滴Medriaticum滴剂(Pharmacy of theUniversity of Tübingen,德国)散瞳，并应用一滴局部麻醉剂Novesine(OmniVision,Puchheim,德国)。Methocel(OmniVision,Puchheim,德国)滴眼剂用于避免眼睛干燥。使用手术显微镜进行注射。首先用靠近巩膜缘的25G针打开巩膜，然后使用具有NanoFil 34G钝针(World Precision Instruments)的10μl NanoFil注射器视网膜下地(扁平部)注射2μl载体悬浮液(2μl含有2x10⁹个病毒颗粒AAV-VEGF,最大可能剂量)。注射后应用局部抗生素滴眼剂

(Ursapharm,Saarbrücken,德国)。通过皮下注射解毒剂(0.12mg纳洛酮、0.2mg氟马西尼、0.75mg阿替美唑/kg体重)中和麻醉。

玻璃体内注射

在VEGF载体注射后6周，进行治疗物质的玻璃体内注射。

对于玻璃体内注射，在眼睛的外角处在结膜中做一个小切口。通过用一对细镊子夹住结膜并轻轻拉动来旋转眼球。使用具有NanoFil 34号斜角针头(World PrecisionInstruments)的10μl NanoFil注射器通过该孔在玻璃体内注射5μl体积。注射后，针头在眼内停留另外3或4秒以减少回流，然后将其收回。将眼球恢复到其正常位置，并将抗生素软膏应用于眼睛。使用配备照明的手术显微镜进行整个过程。研究了三组。

1)将阿瓦斯丁

(贝伐珠单抗；25mg/ml；Roche)经玻璃体内注射到20只眼中：

它由蒂宾根大学医院(University Hospital of Tübingen)的药房购买和等分分装。将100mg阿瓦斯丁

稀释在4毫升媒介物溶液中，所述媒介物溶液含有240mg a,a-海藻糖2H₂O、23.2mg Na₂HPO₄ H₂O、4.8mg NaH₂PO₄和1.6mg聚山梨酯20。

2)将PEDF人HEK293重组蛋白(1μg/μl；BioVendor)经玻璃体内注射到20只眼中。

将重组蛋白的沉淀物过滤(0.4μm)，并在20mM TRIS、50mM NaCl、pH 7.5中以0.5mg/mL冻干。根据产品数据单，将其溶解在去离子水(Ampuwa水)中，以获得1μg/μl的工作储备溶液。

3)20只眼睛没有治疗

根据(Wang,Rendahl等人.2003)进行体内成像(SLO/OCT、FA和ICG血管造影术)和定量。在注射后5周至20个月，视网膜下AAV-VEGF导致RPE增殖，从2-12个月开始可通过荧光素血管造影术观察到渗漏。因此，在载体注射后6周进行扫描激光检眼镜检查(SLO)、光相干性体层摄影术(OCT)、荧光素血管造影术(FA)和吲哚菁绿血管造影术(ICG)。在注射VEGF载体后7周，使用SpectralisTM HRA+OCT(Heidelberg Engineering,Heidelberg,德国)装置重新研究眼睛，所述装置根据来自(Fischer,Huber等人.2009,Huber,Beck等人.2009)的方案经过修改用于与动物一起使用。一个78dpt双非球面透镜(Volk Optical,Inc.,Mentor,OH44060,U.S.A.)直接放置在装置的出口处，另外一个定制的+3.5dpt隐形镜片直接放在大鼠的眼睛上。将大鼠麻醉，散瞳，并用Methocel处理以避免眼睛干燥并更好地粘附3.5dpt镜片。将ICG染料(250μl(VERDYE,5mg/ml,Diagnostic Green)注射到尾静脉中，皮下注射荧光素染料(Alcon10％(1/10稀释),250μl)。对于早期血管造影术成像，在注射后约2-5分钟进行SLO/OCT，且对于晚期血管造影术成像则在约15-20分钟进行。由于SLO/OCT机器针对人眼使用进行校准，x轴和y轴的尺寸没有针对大鼠使用进行校正。z轴的尺寸，如视网膜高度，会适当地显示。因此，此处执行的血管造影术测量中CNV高荧光区域的测量以任意单位(au)呈现，而不是使用原始Heidelberg校准以μm为单位。在OCT数据集中执行的厚度测量的量化以μm显示，因为它们位于光束的z方向。

用于组织学的眼睛的处理

对于电子显微术(EM)，将整个眼睛在0.1M二甲基胂酸盐缓冲液(pH7.4)中的5％戊二醛中固定过夜。然后，将可以切割病变区域，因为它在血管造影术中是可见的，并将其包埋。

统计学

进行Students t-检验以对比处理动物与对照组的结果。使用excel软件进行分析。错误概率为5％(p<0.05为统计上显著的)。为避免多重比较问题，使用Holm-Bonferroni方法校正结果。

通过血管造影术研究在大鼠眼睛中经视网膜下注射AAV.VEGF-A165后6周的CNV

AAV-VEGF触发的大鼠CNV模型在VEGF转导后6周显示完全生长的CNV，如体内成像所记录。显示了代表性图像(参见，图8)。

所有60只过表达VEGF的眼睛在FA和ICG成像中都显示出典型的CNV病变样高荧光(图9)，这意味着VEGF转导效率为100％。

在下面，将用VEGF载体成功转导并出现CNV样病变的眼称为“CNV眼”，将CNV样病变称为“CNV病变”。

通过血管造影术研究所有眼睛。大多数CNV病变在FA和ICG血管造影术中都显示出典型的环形图案。中央低荧光区域被明亮的高荧光环包围，尤其是在FA图像中(参见，图9左图)。这种图案与OCT分析非常相关，表明高反射区中明显的视网膜下病变。相比之下，ICG信号显示出相对点状图案，通常在病变的低荧光中心周围的更大区域上伸展。

ICG是一种具有非常长半衰期并与腔蛋白结合的染料。因此，如果它保留在组织内，则可以在单次静脉内注射后的几个时间点记录它。例如，随着蛋白从CNV血管渗漏到周围组织中，这会发生。

如在图9(参见，右图，绿色通道)中所示和与FA信号相反，ICG高荧光在CNV病变周围显示出相对点状图案，其随着时间的推移而扩散(在20分钟内，但也在ICG的重新研究时，在稍后时间点没有额外的染料注射，在这里是第一个血管造影术期间后一周)。最后，这导致单个高荧光的更大区域的形成，表明可以在稍后时间点覆盖整个眼睛背景。但是，在注射额外的ICG染料后，这些图案不会立即发生显著变化。

通过PEDF处理减少CNV病变区域的厚度

对于每只眼睛，通过OCT筛选整个CNV病变区域的面积(通过SLO血管造影术检测)。确定病变的最大厚度区域并成像。在这些图像中，测量了最大厚度。为了分析不同药剂治疗引起的变化，确定了在视网膜下注射载体后七周(处理后一周)分析的每只眼睛的测量值与六周分析(处理前)的相应值的差异。PEDF抑制细胞增殖和纤维化，且因此与未治疗组相比显著降低了CNV的厚度，但血管没有像在阿瓦斯丁组中那样完全塌陷。因此，阿瓦斯丁组中的CNV变得更平坦(参见，图10)。

PEDF对健康脉络膜毛细管层、玻璃膜和连接部复合物的新形成的影响

通过电子显微术研究PEDF蛋白处理后的眼睛，并将VEGF载体注射后没有PEDF处理的眼睛用作对照。PEDF处理的最突出效果是，新形成的脉络膜毛细管层与未经任何处理的健康脉络膜毛细管层非常相似。新形成的血管直接位于RPE下方并形成新的玻璃膜(参见，图11)。内皮细胞像健康血管一样薄，与周细胞相缔合，形成开窗(参见，图12)，并且没有生长进视网膜下腔。

此外，与仅用VEGF载体处理的眼睛相比，在视网膜色素上皮细胞(图14)和脉络膜毛细管层的内皮细胞(图15)之间的连接部复合物显著扩大且电子密集。这些复合物由粘附连接部和紧密连接部组成。紧密连接部也出现在脉络膜毛细管层的内皮细胞之间，尽管之前没有在这些血管中报道过它们。人们普遍认为，血液视网膜屏障由视网膜血管的紧密连接部与视网膜色素上皮的紧密连接部构成。对紧密连接部的影响由与VEGF过表达组合的PEDF介导。

PEDF还减少了RPE细胞的***并抑制了含有细胞外基质的血管内突起的形成(参见，图2和15)。这种现象在CNV的兔模型中也有描述(Julien,Kreppel等人.2008)。在PEDF处理后没有看到这样的突起，这造成在新形成的血管中形成单层基膜，而未经处理时基膜是多层的。并且，PEDF处理后未发生新形成的血管向视网膜下腔和视网膜中的穿透，但在没有PEDF注射的情况下观察到穿透。

实施例7：PEDF和抗-VEGF药物的组合的作用

PEDF和抗-VEGF药物例如贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)的组合协同地起作用，并支持新功能血管的协调生长，并且也改善新形成的脉络膜毛细管层中开窗的形成。

实施例8：PEDF减少CNV中细胞外基质的形成

如本实施例中所示，PEDF减少了CNV中细胞外基质的形成。因此，对于CNV而言典型的瘢痕形成被最小化，且因此从新形成的血管到PRE和光感受器的氧气和营养物供应的距离被缩短。

方法

在Long Evans大鼠的48只眼睛中进行2μl AAV.VEGF-A¹⁶⁵(2x10⁹个AAV-VEGF载体的病毒颗粒，在2μl PBS中稀释)的视网膜下注射，以诱导CNV。3周后，通过体内检查来检查CNV发展，且100％的眼睛(n＝48只眼睛)显示CNV。

在体内研究之后，立即将眼睛用4μl PEDF蛋白(10μg)“组1”(n＝12只眼睛)或阿瓦斯丁(50μg)“组2”(n＝12只眼睛)或作为联合疗法(PEDF蛋白(10μg)+阿瓦斯丁(50μg))“组3”(n＝12只眼睛)进行玻璃体内处理。未处理的眼睛作为对照“组4”(n＝12只眼睛)。

在第6周，如关于第3周所述，用PEDF蛋白或阿瓦斯丁或两种蛋白的组合进行第二次玻璃体内处理。一周后在第7周，通过偏振光显微术评价对CNV中细胞外基质成熟的影响。

根据以下方案对眼睛的石蜡切片染色。

天狼猩红染色方案

1.脱石蜡和在蒸馏水中水合

2.在Weigerts苏木精中染色8分钟

3.在蒸馏水中充分冲洗

4.在溶液A中放置2分钟

5.蒸馏水冲洗

6.在溶液B中放置60分钟

7.在溶液C中放置2分钟

8.用70％乙醇处理45秒

9.脱水、透化和固定

10.在偏振光显微镜(Axioplan,Zeiss)下评价载玻片。这种方法允许通过颜色区分不同类型的胶原。I型(红色，橙色)；III型(黄色，绿色)。

结果

结果显示在图16中。

在注射PEDF和阿瓦斯丁后，在脉络膜新生血管形成的区域内，胶原在偏振光显微镜下呈绿色(图16，左列)。并且，在注射单独的阿瓦斯丁后，胶原呈浅绿色，但与注射两种蛋白相比，胶原的量大大增加(图16，中间列)。绿色指示胶原是III型，其为纤维化组织的典型。在注射单独的PEDF后，胶原呈橙色并以薄层形式包围血管(图16，箭号，右列)。这指示，胶原已经成熟并且细胞外基质和血管的新形成已经停止。在PEDF注射后将样本旋转360度后未见浅绿色胶原。在未经处理下，与阿瓦斯丁注射后的结果(图16，中间列)相似，胶原呈浅绿色并占据CNV区域的大部分(未显示)。

实施例9：通过经视网膜下或玻璃体内注射VEGF来模拟人类AMD

将在2μl PBS中的100ng VEGF蛋白(hVEGF Sigma)经视网膜下或经玻璃体内注射进Long Evans大鼠的眼睛中。对于对照，仅注射PBS。

在1小时和24小时后通过电子显微术和免疫细胞化学研究眼睛。脉络膜毛细管层变为迷宫毛细血管，如在图2-4以及人CNV的早期出版物(Schraermeyer,Julien等人.2015)中所示。此外，在玻璃膜内和脉络膜毛细管层周围的细胞外基质显著增加。还存在细胞外基质的突起，其诱导内皮内陷进入血管腔，如在图15中所示。RPE和血管的基膜的合成增强到多层。此外，RPE被高度活化并迁移出单层。在脉络膜毛细管层内，凝血细胞被激活，红血细胞可能通过补体激活而裂解，并且还发展为淤滞。令人惊讶的是，所有这些发现在注射后1-24小时就已经观察到，在对照组中没有，并且模仿了在患有AMD的人眼中看到的发现。

实施例10：PEDF、贝伐珠单抗或PEDF和贝伐珠单抗的组合对血管生成的体外作用

在内皮细胞管形成测定中确定了PEDF、贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)或PEDF和贝伐珠单抗(阿瓦斯丁)的组合对血管生成的体外作用。内皮细胞管形成测定是一种经典的体外测定，用于研究潜在药物候选物的血管生成和抗血管生成作用。

方法：内皮细胞管形成测定

将96-孔平板(Corning,USA)用60μL生长因子减少的基质胶(BD Biosciences,USA)预包被，并将在ECGM培养基(Promocell,德国)中的HUVEC细胞(13000个细胞/孔)接种到平板上。给孔补充：单独的PEDF(250ng/ml、500ng/ml)、单独的贝伐珠单抗(阿瓦斯丁；Genentech,Inc.,South San Francisco,CA)(250μg/mL、1mg/mL、2mg/mL)，和一起补充一定浓度的PEDF(250ng/mL)+贝伐珠单抗(250μg/mL)和PEDF(250ng/mL)+贝伐珠单抗(1mg/mL)，以确定这些分子对内皮细胞管形成的作用。在37℃温育5小时后，使用Leica DM IL LED倒置相差显微镜分析孔中的管形成。

结果

结果显示在图17a-h中。

使用250ng/mL浓度的PEDF对内皮管形成仅有非常少的抑制(图17b)，而在500ng/mL观察到完全抑制(图17c)。贝伐珠单抗仅在2mg/mL的浓度下抑制管形成(图17f)。与用相同浓度的PEDF或贝伐珠单抗单独处理相比，PEDF和贝伐珠单抗分别以250ng/mL(PEDF)和250μg/mL(贝伐珠单抗)的浓度共同施用，对管形成的抑制作用要强得多(图17g)。这对于贝伐珠单抗尤其明显，当单独使用时，其仅在2mg/mL的高浓度抑制内皮管形成。因而，贝伐珠单抗因此在与PEDF联合处理时以低得多的浓度有效抑制管形成(图17b和17h)。该数据指示PEDF和贝伐珠单抗在抑制内皮管形成和因此抑制血管生成方面的协同作用。

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如果没有相反指示，在本文中引用的文件的完整书目数据(其公开内容通过引用并入)如下。

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在说明书、权利要求书、序列表和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地或以其任意组合适合实现各种形式的本发明。

序列表

<110> 克瑞生物科技有限公司（Curebiotec GmbH）

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<400> 1

Gln Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Glu Gly Ser Pro Asp Pro Asp Ser

1 5 10 15

Thr Gly Ala Leu Val Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val

20 25 30

Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg

35 40 45

Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Asn Val Leu Leu Ser Pro Leu

50 55 60

Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg

65 70 75 80

Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser

85 90 95

Pro Asp Ile His Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Asp Thr Val Thr Ala

100 105 110

Pro Gln Lys Asn Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val Phe Glu Lys Lys

115 120 125

Leu Arg Ile Lys Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu Lys Ser Tyr Gly

130 135 140

Thr Arg Pro Arg Val Leu Thr Gly Asn Pro Arg Leu Asp Leu Gln Glu

145 150 155 160

Ile Asn Asn Trp Val Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys Leu Ala Arg Ser

165 170 175

Thr Lys Glu Ile Pro Asp Glu Ile Ser Ile Leu Leu Leu Gly Val Ala

180 185 190

His Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser Arg Lys Thr Ser

195 200 205

Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Arg Val Pro Met

210 215 220

Met Ser Asp Pro Lys Ala Val Leu Arg Tyr Gly Leu Asp Ser Asp Leu

225 230 235 240

Ser Cys Lys Ile Ala Gln Leu Pro Leu Thr Gly Ser Met Ser Ile Ile

245 250 255

Phe Phe Leu Pro Leu Lys Val Thr Gln Asn Leu Thr Leu Ile Glu Glu

260 265 270

Ser Leu Thr Ser Glu Phe Ile His Asp Ile Asp Arg Glu Leu Lys Thr

275 280 285

Val Gln Ala Val Leu Thr Val Pro Lys Leu Lys Leu Ser Tyr Glu Gly

290 295 300

Glu Val Thr Lys Ser Leu Gln Glu Met Lys Leu Gln Ser Leu Phe Asp

305 310 315 320

Ser Pro Asp Phe Ser Lys Ile Thr Gly Lys Pro Ile Lys Leu Thr Gln

325 330 335

Val Glu His Arg Ala Gly Phe Glu Trp Asn Glu Asp Gly Ala Gly Thr

340 345 350

Thr Pro Ser Pro Gly Leu Gln Pro Ala His Leu Thr Phe Pro Leu Asp

355 360 365

Tyr His Leu Asn Gln Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp Thr Asp Thr

370 375 380

Gly Ala Leu Leu Phe Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg Gly Pro

385 390 395

<210> 2

<211> 1257

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> 色素上皮衍生因子(PEDF)的编码序列

<400> 2

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgccag 60

aaccctgcca gccccccgga ggagggctcc ccagaccccg acagcacagg ggcgctggtg 120

gaggaggagg atcctttctt caaagtcccc gtgaacaagc tggcagcggc tgtctccaac 180

ttcggctatg acctgtaccg ggtgcgatcc agcacgagcc ccacgaccaa cgtgctcctg 240

tctcctctca gtgtggccac ggccctctcg gccctctcgc tgggagcgga gcagcgaaca 300

gaatccatca ttcaccgggc tctctactat gacttgatca gcagcccaga catccatggt 360

acctataagg agctccttga cacggtcacc gccccccaga agaacctcaa gagtgcctcc 420

cggatcgtct ttgagaagaa gctgcgcata aaatccagct ttgtggcacc tctggaaaag 480

tcatatggga ccaggcccag agtcctgacg ggcaaccctc gcttggacct gcaagagatc 540

aacaactggg tgcaggcgca gatgaaaggg aagctcgcca ggtccacaaa ggaaattccc 600

gatgagatca gcattctcct tctcggtgtg gcgcacttca aggggcagtg ggtaacaaag 660

tttgactcca gaaagacttc cctcgaggat ttctacttgg atgaagagag gaccgtgagg 720

gtccccatga tgtcggaccc taaggctgtt ttacgctatg gcttggattc agatctcagc 780

tgcaagattg cccagctgcc cttgaccgga agcatgagta tcatcttctt cctgcccctg 840

aaagtgaccc agaatttgac cttgatagag gagagcctca cctccgagtt cattcatgac 900

atagaccgag aactgaagac cgtgcaggcg gtcctcactg tccccaagct gaagctgagt 960

tacgaaggcg aagtcaccaa gtccctgcag gagatgaagc tgcaatcctt gtttgattca 1020

ccagacttta gcaagatcac aggcaaaccc atcaagctga ctcaggtgga acaccgggct 1080

ggctttgagt ggaacgagga tggggcggga accaccccca gcccagggct gcagcctgcc 1140

cacctcacct tcccgctgga ctatcacctt aaccagcctt tcatcttcgt actgagggac 1200

acagacacag gggcccttct cttcattggc aagattctgg accccagggg cccctaa 1257

<210> 3

<211> 1000

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> 色素上皮衍生因子(PEDF)的编码序列

<400> 3

ggacgctgga ttagaaggca gcaaaaaaag atctgtgctg gctggagccc cctcagtgtg 60

caggcttaga gggactaggc tgggtgtgga gctgcagcgt atccacaggc cccaggatgc 120

aggccctggt gctactcctc tgcattggag ccctcctcgg gcacagcagc tgccagaacc 180

ctgccagccc cccggaggag ggctccccag accccgacag cacaggggcg ctggtggagg 240

aggaggatcc tttcttcaaa gtccccgtga acaagctggc agcggctgtc tccaacttcg 300

gctatgacct gtaccgggtg cgatccagca tgagccccac gaccaacgtg ctcctgtctc 360

ctctcagtgt ggccacggcc ctctcggccc tctcgctggg agcggacgag cgaacagaat 420

ccatcattca ccgggctctc tactatgact tgatcagcag cccagacatc catggtacct 480

ataaggagct ccttgacacg gtcactgccc cccagaagaa cctcaagagt gcctcccgga 540

tcgtctttga gaagaagctr cgcataaaat ccagctttgt ggcacctctg gaaaagtcat 600

atgggaccag gcccagagtc ctgacgggca accctcgctt ggacctgcaa gagatcaaca 660

actgggtgca ggcgcagatg aaagggaagc tcgccaggtc cacaaaggaa attcccgatg 720

agatcagcat tctccttctc ggtgtggcgc acttcaaggg gcagtgggta acaaagtttg 780

actccagaaa gacttccctc gaggatttct acttggatga agagaggacc gtgagggtcc 840

ccatgatgtc ggaccctaag gctgttttac gctatggctt ggattcagat ctcagctgca 900

agattgccca gctgcccttg accggaagca tgagtatcat cttcttcctg cccctgaaag 960

tgacccagaa tttgaccttg atagaggaga gcctcacctc 1000

Claims (18)

1.用于治疗和/或预防疾病的方法中的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述方法包括给受试者施用PEDF，其中所述疾病是眼病且其中治疗和/或预防疾病包括抑制迷宫毛细血管形成、诱导脉络膜毛细管层的生长、收紧脉络膜毛细管层、抑制细胞外基质形成、保护脉络膜毛细管层和/或引导血管发育。

2.用于权利要求1的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述眼病是黄斑变性，优选地黄斑变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)，更优选干性年龄相关性黄斑变性或湿性年龄相关性黄斑变性。

3.用于权利要求2的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中PEDF抑制湿性和/或干性AMD中的地图样萎缩的生长和/或形成。

4.用于权利要求1的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述眼病选自包括以下的组：中心性浆液性脉络膜视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、虹膜发红、角膜新生血管形成、息肉样脉络膜血管病变、早产儿视网膜病变和视网膜和/或脉络膜纤维化。

5.用于权利要求4的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述疾病是视网膜和/或脉络膜纤维化，且PEDF抑制视网膜和脉络膜纤维化的进展。

6.用于权利要求1-5中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中迷宫毛细血管形成是眼中、优选眼病中的迷宫毛细血管形成。

7.用于权利要求1-6中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中诱导脉络膜毛细管层的生长包含或者是诱导新脉络膜毛细管层的生长。

8.用于权利要求1-7中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中诱导脉络膜毛细管层的生长会提供能够替换原始脉络膜毛细管层的脉络膜毛细管层，优选地原始脉络膜毛细管层是患病的脉络膜毛细管层。

9.用于权利要求1-8中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中收紧脉络膜毛细管层包含收紧病理性脉络膜毛细管层。

10.用于权利要求1-9中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中抑制细胞外基质形成包含抑制朝向血管腔和/或在血管周围的细胞外基质形成。

11.用于权利要求1-10中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物的损伤效应。

12.用于权利要求11的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中保护脉络膜毛细管层包含保护脉络膜毛细管层免于抗-VEGF药物停用的损伤效应。

13.用于权利要求1-12中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中引导血管发育包含功能性血管、优选来自病理性血管的功能性血管的发育。

14.用于权利要求13的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述病理性血管是病理学状况的结果。

15.用于权利要求1-14中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中PEDF经玻璃体内或视网膜下施用。

16.用于权利要求1-15中的任一项的用途的色素上皮衍生因子(PEDF)，其中所述方法进一步包括应用抗-VEGF疗法，优选地抗-VEGF疗法包括给受试者施用抗-VEGF药物，其中所述抗-VEGF药物选自培加他尼、雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普。

17.一种用于筛选色素上皮衍生因子(PEDF)类似物的方法，其中所述方法包括：

-将VEGF经玻璃体内或视网膜下施用进动物模型，

-将色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物施用进动物模型，

-在1-72h后确定色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物的作用，

其中如果VEGF的作用被阻断、不发生血管渗漏、不发生细胞外基质的增加和/或不发生玻璃膜的增厚，则所述色素上皮衍生因子(PEDF)类似物候选物是色素上皮衍生因子(PEDF)类似物。

18.一种用于筛选抗-VEGF剂的方法，其中所述方法包括：

-将VEGF经玻璃体内或视网膜下施用进动物模型，

-将抗-VEGF剂候选物施用进动物模型

-在1-72h后确定抗-VEGF剂候选物的作用，

其中如果VEGF的作用被阻断、不发生血管渗漏、不发生细胞外基质的增加和/或不发生玻璃膜的增厚，则所述抗-VEGF剂候选物是抗-VEGF剂。

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