JP2022520819A - 遺伝子改変ナトリウムチャネルを有する齧歯類およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列などの外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列を含むように、内因性Ｓｃｎ９ａ座位で遺伝子改変された齧歯類（マウスおよびラットなど）が本明細書に開示されている。また、かかる齧歯類を作製するのに有用な方法および組成物、ならびに抗－ＮａＶ１．７抗体を生成するためのかかる齧歯類を使用する方法が開示されている。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／８０８，９５７号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／８０８，９５７号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の援用
２０２０年２月２０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６３２８ＰＣＴ＿１０４０３ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の７８１ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
２０２０年２月２０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６３２８ＰＣＴ＿１０４０３ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の７８１ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電位開口型チャネルアルファサブユニット９（Ｓｃｎ９ａ）は、ＮａＶ１．７タンパク質をコードする遺伝子である。ＮａＶ１．７は、電位開口型ナトリウムチャネルのファミリーのメンバーであり、ほとんどの興奮性細胞による電気的シグナル伝達に重要である。ＮａＶ１．７は、疼痛感知神経である侵害受容体に存在し、疼痛の感覚伝達を助ける。ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子における機能獲得変異は、疼痛症候群と関連し、機能喪失変異は、疼痛に対する無感覚を引き起こした。
本明細書では、外因性ＮａＶ１タンパク質、例えば、ＮａＶ１．２タンパク質を発現するように遺伝子改変された非ヒト動物の実施形態が開示される。一部の実施形態では、非ヒト動物は、外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列（例えば、Ｓｃｎ２ａ遺伝子配列、例えば、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子配列）を含む。また、当該遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに有用な方法および組成物の実施形態、ならびにＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）またはその機能的部分に結合する抗体を作製するために当該遺伝子改変非ヒト動物を使用する方法の実施形態が本明細書に開示されている。Ｓｃｎ９ａは、ＮａＶ１．７タンパク質をコードする遺伝子の名前である。Ｓｃｎ２ａは、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする遺伝子の名前である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類（例えば、マウスまたはラット）である。
実施形態の一態様では、ゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）がＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含む、遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位にある。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、侵害受容体で発現される遺伝子を含む座位にある。一部の実施形態ではＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、転写活性または許容座位、例えばＲＯＳＡ２６ 座位（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：３７８９－３７９４、これは参照により本明細書に組み込まれる）、ＢＴ－５ 座位（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５－４７、これは参照により本明細書に組み込まれる）、またはＯｃｔ４１ｏｃｕｓ（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１４５５－１４６４、これは参照により本明細書に組み込まれる）にある。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質は、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のゲノム中のＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子から発現される。
一部の実施形態では、核酸分子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラのＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、ヒトＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎプロモーターに操作可能に連結している。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結している。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位で、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結している。
一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ＡＴＧ開始コドンからＳｃｎ２ａ遺伝子の終止コドンまでの連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子の５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の３’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子の３’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位で、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子のゲノム断片の代わりになる。一部の実施形態では、ゲノム断片は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＮａＶ１．７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子のコード領域（例えば、ＡＴＧコドンから終止コドンまで）が置換されている。
一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、組み換えＤＮＡである。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列から改変されたヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列、例えば、野生型配列から最適化されたコドンから改変されたヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列から改変されたヌクレオチド配列、例えば、野生型配列からＴ細胞エピトープを除去するために改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子に関してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子に対してホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の不活性化（例えば、全部または一部における欠失、または全部もしくは一部における逆位などだが、これらに限定されない）、または置換（全部または一部）の結果として、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＮａＶ１．７タンパク質を発現することができない。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）で免疫化されたときに、ＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）に対する抗体を産生する。一部の実施形態では、ＮａＶ１．７免疫原は、タンパク質免疫原、ＤＮＡ免疫原、またはそれらの組み合わせであり得る。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、本明細書に記載されるように、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、またはそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＨｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＨｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各重鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む、重鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各免疫グロブリン鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃκであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃλであるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＫｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各κ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む、κ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＬ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子および一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｉＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、機能的な内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠くヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片を発現する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位と同じ染色体上に含まれる、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を置換する一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。
一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類は、第一および第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間の一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列とを含む、ゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチドをコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、オス齧歯類の生殖能力を復元または強化する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性ＴｄＴ遺伝子を持たない齧歯類と比較して、抗原受容体の多様性を高めることができた。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、転写調節因子に操作可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、外因性ＴｄＴは、免疫グロブリンκ軽鎖座位、免疫グロブリンλ軽鎖座位、免疫グロブリン重鎖座位、ＲＡＧ１座位、またはＲＡＧ２座位に位置する。
一部の実施形態では、ＴｄＴはヒトＴｄＴである。一部の実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴ（ＴｄＴＳ）の短いアイソフォームである。
実施形態の別の態様では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変齧歯類（例えば、マウスまたはラット）を作製する方法であって、改変齧歯類ゲノムがＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含むように、齧歯類ゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を改変することを含む方法である。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位にある。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、侵害受容体で発現される遺伝子を含む座位にある。一部の実施形態ではＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、転写活性または許容座位、例えばＲＯＳＡ２６座位（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：３７８９－３７９４、これは参照により本明細書に組み込まれる）、ＢＴ－５座位（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５－４７、これは参照により本明細書に組み込まれる）、またはＯｃｔ４１ｏｃｕｓ（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１４５５－１４６４、これは参照により本明細書に組み込まれる）にある。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質は、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のゲノム中のＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子から発現され、改変ゲノムを含む齧歯類を作製する。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性ＮａＶ１．７を発現しない。
本方法の一部の実施形態では、齧歯類ゲノムが、（ｉ）ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を、核酸分子が内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に組み込まれるように、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することと、（ｉｉ）核酸分子が内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位内に組み込まれた改変ゲノムを含む齧歯類ＥＳ細胞を取得することと、（ｉｉｉ）取得された改変ゲノムを含む齧歯類ＥＳ細胞から齧歯類を作製することと、を含む、プロセスによって改変される。
本方法の一部の実施形態では、核酸分子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラのＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、ヒトＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。
本方法の一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎプロモーターに操作可能に連結している。本方法の一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結している。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位で、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結している。
本方法の一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ＡＴＧ開始コドンからＳｃｎ２ａ遺伝子の終止コドンまでの連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子の５’ＵＴＲに操作可能に連結される。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の３’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子の３’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列を含む。
本方法の一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ座位で、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子のゲノム断片の代わりになる。一部の実施形態では、ゲノム断片は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＮａＶ１．７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子のコード領域（例えば、ＡＴＧコドンから終止コドンまで）が置換されている。
本方法の一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のゲノム断片である。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、組み換えＤＮＡである。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列から改変されたヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列、例えば、野生型配列から最適化されたコドンから改変されたヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子は、野生型配列から改変されたヌクレオチド配列、例えば、Ｔ細胞エピトープを除去するために野生型配列から改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子に対してホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＳｃｎ９ａ遺伝子の不活性化（例えば、全部または一部における欠失、または全部もしくは一部における逆位などだが、これらに限定されない）、または置換（全部または一部）の結果として、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のＮａＶ１．７タンパク質を発現することができない。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）で免疫化されたときに、ＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）に対する抗体を産生する。一部の実施形態では、ＮａＶ１．７免疫原は、タンパク質免疫原、ＤＮＡ免疫原、またはそれらの組み合わせであり得る。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、本明細書に記載されるように、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、またはそれらの組み合わせを含む。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＨｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＨｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各重鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む、重鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各免疫グロブリン鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃκであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃλであるか、またはこれを含む。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＫｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各κ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む、κ軽鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＬ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子および一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｉＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でヘテロ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
本方法の一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、機能的な内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠くヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片を発現する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位と同じ染色体上に含まれる、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を置換する一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。
本方法の一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類は、第一および第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間の一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする、一つまたは複数のヌクレオチド配列とを含む、ゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
本方法の一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
本方法の一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチドをコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、オス齧歯類の生殖能力を復元または強化する。
本方法の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性ＴｄＴ遺伝子を持たない齧歯類と比較して、抗原受容体の多様性を高めることができた。
本方法の一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、転写調節因子に操作可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含むゲノムを有する。
本方法の一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本方法の一部の実施形態では、外因性ＴｄＴは、免疫グロブリンκ軽鎖座位、免疫グロブリンλ軽鎖座位、免疫グロブリン重鎖座位、ＲＡＧ１座位、またはＲＡＧ２座位に位置する。
本方法の一部の実施形態では、ＴｄＴはヒトＴｄＴである。一部の実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴ（ＴｄＴＳ）の短いアイソフォームである。
実施形態のさらなる態様では、本明細書に開示されるのは、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織であり、そのゲノムは、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位でＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、マウス細胞もしくはマウス組織、またはラット細胞もしくはラット組織である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、マウス細胞またはマウス組織である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ラット細胞またはラット組織である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類ＥＳ細胞である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、Ｂ細胞である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＨｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＨｏＨ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各重鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む、重鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃκであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃλであるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＫｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＫｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＫｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＫｏＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各κ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む、κ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＬ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子および一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＬ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＬ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＬ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＬ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｉＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｉＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｉＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｉＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに）、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠くヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、本明細書に提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片を発現する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位と同じ染色体上に含まれる、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする、一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を置換する、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする、一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、第一および第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間の一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列と、を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む、単離された齧歯類細胞は、Ｂ細胞または脾細胞であり、外因性ＴｄＴ遺伝子を持たない単離された齧歯類細胞（例えば、Ｂ細胞または脾細胞）と比較して、抗原受容体の多様性を高めることができた。
一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、転写調節因子に操作可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、外因性ＴｄＴは、免疫グロブリンκ軽鎖座位、免疫グロブリンλ軽鎖座位、免疫グロブリン重鎖座位、ＲＡＧ１座位、またはＲＡＧ２座位に位置する。
一部の実施形態では、ＴｄＴはヒトＴｄＴである。一部の実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴ（ＴｄＴＳ）の短いアイソフォームである。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載の齧歯類ＥＳ細胞を含む齧歯類胚が本明細書に開示される。
実施形態の一態様では、本明細書に開示されるのは、相同組み換えを介在し、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を組み込むことができる５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列に隣接する、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含む、標的化核酸構築物である。
実施形態の別の態様では、本明細書において、抗－ＮａＶ１．７抗体を産生する方法が開示されており、当該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）を、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）で免疫化することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体を産生する方法は、抗－ＮａＶ１．７抗体を免疫化齧歯類から単離することを含む。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体を産生する方法は、免疫化齧歯類から抗－ＮａＶ１．７抗体を発現するＢ細胞を単離することを含む。一部の実施形態では、抗ヒトＮａＶ１．７抗体を産生するハイブリドーマも提供される。一部の実施形態では、抗ヒトＮａＶ１．７抗体を産生するハイブリドーマは、免疫化齧歯類から単離されたＢ細胞に由来する。
実施形態の別の態様では、本明細書において、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを産生する方法が開示されており、当該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）を、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）で免疫化することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを産生する方法は、遺伝子改変マウスに、ＮａＶ１．７免疫原に対する免疫応答を開始させることを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを産生する方法は、抗－ＮａＶ１．７抗体を発現する遺伝子改変マウスから、Ｂ細胞を単離することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを産生する方法は、遺伝子改変マウスによって生成された抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を決定することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを産生する方法は、特定されたヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを発現することを含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を決定することは、ヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を決定することを含む。
実施形態の別の態様では、本明細書において、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする、ヒト重鎖および／または軽鎖可変領域をそれぞれ産生する方法が開示されており、当該方法は、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）を、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）で免疫化することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする、ヒト重鎖および／または軽鎖可変領域をそれぞれ産生する方法は、遺伝子改変齧歯類に、ＮａＶ１．７免疫原に対する免疫応答を開始させることを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする、ヒト重鎖および／または軽鎖可変領域をそれぞれ産生する方法は、抗－ＮａＶ１．７抗体を発現する遺伝子改変齧歯類からＢ細胞を単離することを含む。一部の実施形態では、抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードするヒト重鎖および／または軽鎖領域をそれぞれ産生する方法は、遺伝子改変齧歯類によって生成された抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変領域の核酸配列を決定することを含む。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載される齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）と同一であるか、またはそれから取得される抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸が本明細書に開示される。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載される齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）と同一であるか、またはそれから取得される抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸が本明細書に開示される。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、ヒト重鎖定常ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）重鎖定常ドメインをさらに含む。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載される齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）と同一であるか、またはそれから取得される抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸が本明細書に開示される。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸は、ヒト軽鎖定常ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）軽鎖定常ドメインをさらに含む。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載される齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）と同一である、それから取得される、またはそれに由来する抗－ＮａＶ１．７抗体のヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインが本明細書に開示される。
実施形態の別の態様では、本明細書に記載される齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）と同一である、それから取得される、またはそれに由来する抗－ＮａＶ１．７抗体の重鎖および軽鎖を含む、抗－ＮａＶ１．７抗体を発現する哺乳類細胞が本明細書に開示される。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ ５細胞、Ｃｏｌｏ２０５細胞、ＨＢ ８０６５細胞、ＨＬ－６０細胞、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ａ４３１細胞（表皮）、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＭＭＴ ０６０５６２細胞、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株の細胞である。
本特許または本出願のファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも一点含まれている。カラー図面を含む本特許のコピーは、要請時および必要料金の支払時に特許商標庁から提供されることになる。
本明細書では、外因性ＮａＶ１タンパク質、例えば、ＮａＶ１．２タンパク質を発現するように遺伝子改変された非ヒト動物の実施形態が開示される。一部の実施形態では、非ヒト動物は、外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列（例えば、Ｓｃｎ２ａ遺伝子配列、例えば、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子配列）を含む。また、当該遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに有用な方法および組成物の実施形態、ならびにＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）またはその機能的部分に結合する抗体を作製するために当該遺伝子改変非ヒト動物を使用する方法の実施形態が本明細書に開示されている。Ｓｃｎ９ａは、ＮａＶ１．７タンパク質をコードする遺伝子の名前である。Ｓｃｎ２ａは、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする遺伝子の名前である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類（例えば、マウスまたはラット）である。
ＮａＶファミリー
電位開口型ナトリウムチャネルのファミリーは九つの公知のメンバーを有し、膜貫通セグメントおよび細胞外ループ領域において５０％超のアミノ酸同一性を有する。これらのチャネルのタンパク質は、ＮａＶ１．１～ＮａＶ１．９と名付けられ、遺伝子名はＳｃｎ１ａ～Ｓｃｎ１１ａと呼称される。以下の表１を参照のこと。
電位開口型ナトリウムチャネルのファミリーは九つの公知のメンバーを有し、膜貫通セグメントおよび細胞外ループ領域において５０％超のアミノ酸同一性を有する。これらのチャネルのタンパク質は、ＮａＶ１．１～ＮａＶ１．９と名付けられ、遺伝子名はＳｃｎ１ａ～Ｓｃｎ１１ａと呼称される。以下の表１を参照のこと。
例示的なヒトＮａＶタンパク質配列のアライメントを図３Ａに提供し、受入番号および配列識別子を表２に記載する。ヒトＮａＶタンパク質の関連性を図３Ｂに示す。
ナトリウムチャネルファミリーのこれらのメンバー（表１を参照）は、四つのリピートドメインを有し、各々が六つの膜貫通セグメントを含有する。図３Ａを参照。第四のセグメントは、高度に保存されており、チャネルの電圧センサとして機能する。このチャネルの電圧感度は、第四セグメントの三番目毎に位置する正のアミノ酸に起因する（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）“Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ ｔｏ Ｂｒａｉｎ，”５ｔｈ ｅｄ．ｐｇ．８６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。膜貫通電圧の変化によって刺激されると、このセグメントは細胞膜の細胞外側に向かって移動し、チャネルがイオンを透過するようになる。イオンは、細孔を通して伝導され、これは二つの領域に分割され得る。細孔のより外側（すなわち、より細胞外側）部分は、四つのドメインのそれぞれの第五の膜貫通セグメントと第六の膜貫通セグメント（「Ｐループ」としても知られる）との間の領域によって形成される。この領域は細孔のより狭い部分であり、そのイオン選択性に関与する。細孔の内側部分（すなわち、より細胞質側）は、四つのドメインの第五の膜貫通セグメントと第六の膜貫通セグメントとの組み合わせによって形成される。
ＮａＶ１．７
ＮａＶ１．７は、後根神経節、交感神経細胞、シュワン細胞、および神経内分泌細胞において侵害受容性（疼痛）ニューロンで発現される。ＮａＶ１．７は、膜の興奮性の重要な要素であり、痛みの感覚に重要である。ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子における機能獲得変異は、疼痛症候群と関連し、機能喪失変異は、疼痛に対する重度の無感覚と関連している。鎮痛剤として選択的ＮａＶ１．７チャネル遮断薬を開発することが望ましい。
ＮａＶ１．７は、後根神経節、交感神経細胞、シュワン細胞、および神経内分泌細胞において侵害受容性（疼痛）ニューロンで発現される。ＮａＶ１．７は、膜の興奮性の重要な要素であり、痛みの感覚に重要である。ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子における機能獲得変異は、疼痛症候群と関連し、機能喪失変異は、疼痛に対する重度の無感覚と関連している。鎮痛剤として選択的ＮａＶ１．７チャネル遮断薬を開発することが望ましい。
ＮａＶ１．７は、図４Ａの１５の動物種由来のＮａＶ１．７タンパク質の例示的な配列のアライメント、および図４Ｂの関係樹から明らかなように、種を超えて高度に保存されている。アライメントに含まれる例示的な配列の受入番号および配列識別子を、以下の表３に記載する。
ＮａＶ１．２
ＮａＶ１．２は、中枢ニューロンおよび末梢ニューロンで発現する。ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子（ＮａＶ１．２をコードする）の変異は、いくつかの発作障害および自閉症スペクトラム障害と関連している。
ＮａＶ１．２は、中枢ニューロンおよび末梢ニューロンで発現する。ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子（ＮａＶ１．２をコードする）の変異は、いくつかの発作障害および自閉症スペクトラム障害と関連している。
ＮａＶ１．２は、図５Ａに提供された１５の動物種由来のＮａＶ１．２タンパク質の例示的な配列のアライメントから明らかなように、種を超えて高度に保存されている。アライメントに含まれる例示的な配列の受入番号および配列識別子を、以下の表４に記載する。
遺伝子改変齧歯類
一部の実施形態の一態様では、本開示は、遺伝子改変が、内因性Ｓｃｎ９ａ座位への外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部の挿入を含む、遺伝子改変齧歯類動物を対象とする。
一部の実施形態の一態様では、本開示は、遺伝子改変が、内因性Ｓｃｎ９ａ座位への外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部の挿入を含む、遺伝子改変齧歯類動物を対象とする。
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムが内因性Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を含み、核酸分子がＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、遺伝子改変齧歯類動物を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」は、ヒト配列を含むように改変されたものを含む。例えば、ヒト化座位は、ヒト配列（例えば、遺伝子セグメントまたは遺伝子）を含むように改変された座位（例えば、内因性座位）である。
本明細書において使用される場合、用語「生殖系列ゲノム」は、動物の形成に使用される生殖細胞（例えば、配偶子、例えば、***または卵子）に見られるゲノムを指す。生殖系列ゲノムは、動物の細胞のゲノムＤＮＡの供給源である。したがって、その生殖系列ゲノムに改変を有する動物（例えば、マウスまたはラット）は、そのすべての細胞のゲノムＤＮＡに改変を有するとみなされる。
本明細書で使用される場合、用語「の代わりに」は、第一の核酸配列が、染色体中の第二の核酸配列の位置（例えば、第二の核酸配列が、以前に（例えば、元々）染色体中に位置していた場所、例えば、第二の核酸配列の内因性座位）に位置する位置置換を指す。語句「の代わりに」は、第二の核酸配列が、例えば、座位または染色体から除去される必要はない。一部の実施形態では、第二の核酸配列および第一の核酸配列は、例えば、第一および第二の配列が互いに相同であり、対応する要素（例えば、タンパク質コード要素、調節エレメントなど）を含有する、および／または類似または同一の配列を有するという点で互いに同等である。一部の実施形態では、第一および／または第二の核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライス供与部位、スプライスアクセプター部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうち一つまたは複数を含み、一部の実施形態では、第一および／または第二の核酸配列は、一つまたは複数のコード配列を含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、第二の核酸配列のホモログまたはバリアント（例えば変異体）である。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、第二の配列のオルソログまたはホモログである。一部の実施形態では、第一の核酸配列はヒト核酸配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを含む場合を含め、第二の核酸配列は齧歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを含む場合を含め、第二の核酸配列はヒト配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、第二の配列のバリアントまたは変異体（すなわち、第二の配列と比較して、例えば置換などの一つまたは複数の配列の違いを含有する配列）である。そのように配置された核酸配列は、そのように配置された配列を得るために使用されるソース核酸配列の一部である一つまたは複数の調節配列を含む場合がある（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’－または３’－非翻訳領域など）。例えば、様々な実施形態で、第一の核酸配列は、そのように配置された核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の産生を生じる異種配列を伴う内因性配列の代替であるが、内因性配列の発現の代替ではない。第一の核酸配列は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を持つ内因性ゲノム配列のものである（例えば内因性ゲノム配列は非ヒト可変領域ポリペプチドのすべてまたは一部をコードし、ＤＮＡ断片は一つまたは複数のヒト可変領域ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする）。様々な実施形態において、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはその断片は、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたは断片の代わりである。
本明細書で使用される場合、用語「ＮａＶタンパク質」は、（１）ＮａＶファミリー、すなわち、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．２、ＮａＶ１．３、ＮａＶ１．４、ＮａＶ１．５、ＮａＶ１．６、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、およびＮａＶ１．９の天然型（野生型）電位開口型ナトリウムチャネル、および（２）操作された電位開口型ナトリウムチャネルを含む。操作されたＮａＶタンパク質は、天然型ＮａＶタンパク質に特徴的な四つの繰り返しドメイン構造を維持し、各ドメインには六つの膜貫通セグメントが含まれ、また天然型ＮａＶタンパク質のように電位開口型ナトリウムチャネルとして機能する。操作された電位開口型ナトリウムチャネルの非限定的な実施形態は、ＮａＶ１．２タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラタンパク質である。
本明細書において使用される場合、用語「Ｓｃｎ遺伝子」は、天然型ＮａＶタンパク質をコードする核酸を含む。「外因性Ｓｃｎ遺伝子」とは、齧歯類Ｓｃｎ９ａｎ座位が自然界に見られるため、当該座位内に存在しないＳｃｎ遺伝子を意味する。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、齧歯類Ｓｃｎ９ａではない、Ｓｃｎ遺伝子である。一部の実施形態では、Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ１ａ、Ｓｃｎ２ａ、Ｓｃｎ３ａ、Ｓｃｎ４ａ、Ｓｃｎ５ａ、Ｓｃｎ８ａ、Ｓｃｎ１０ａ、またはＳｃｎ１１ａ遺伝子であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、Ｓｃｎ遺伝子は、限定されないが、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラを含む動物種由来である。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、改変されている齧歯類とは異なる動物種由来のＳｃｎ９ａ遺伝子である。例えば、齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の外因性Ｓｃｎ遺伝子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラのＳｃｎ９ａ遺伝子、または遺伝子改変されている齧歯類とは異なる齧歯類種由来のＳｃｎ遺伝子であり得る。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子（ヒトＮａＶ１．２タンパク質をコードする）である。
遺伝子の「一部」への言及は、遺伝子の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、これはエクソンのヌクレオチド、またはエクソンとイントロンとの組み合わせであり得る。遺伝子の「部分」は、全長遺伝子よりも短いと理解される。
「外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸分子」への言及は、例えば、外因性Ｓｃｎ遺伝子の全部または一部のゲノムＤＮＡ；外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列（ＡＴＧコドンから終止コドンまで）を含む核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）；外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の一つまたは複数の細胞外ドメインのアミノ酸をコードする、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一つまたは複数のエクソンのヌクレオチドを含む核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）への言及を含む。
本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類の一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類のゲノムは、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を含み、核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質と同一のタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、Ｓｃｎ１ａ、Ｓｃｎ２ａ、Ｓｃｎ３ａ、Ｓｃｎ４ａ、Ｓｃｎ５ａ、Ｓｃｎ８ａ、Ｓｃｎ１０ａ、およびＳｃｎ１１ａからなる群から選択される外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列を含む。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のコード配列を含む。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、およびキングコブラからなる群から選択される種由来の外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列を含む。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のコード配列を含み、Ｓｃｎ２ａ遺伝子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、およびキングコブラから選択される種由来である。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード領域（例えば、ＡＴＧコドンから終止コドンまで）を含むゲノム断片である。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列はｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。
本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類の一部の実施形態では、齧歯類のゲノムは、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を含み、核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部および内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の一部を含み、核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の一部を含む、ＮａＶタンパク質をコードする。ＮａＶタンパク質の「一部」とは、ＮａＶタンパク質の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸の連続配列だが、全長ＮａＶタンパク質よりも短いものへの言及を含むことを意味する。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも２個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも３個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも４個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも６個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも８個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも９個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１１個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１２個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１３個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１４個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１５個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１６個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１７個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１８個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも１９個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、ＮａＶタンパク質の少なくとも２０個のアミノ酸の連続配列を含む。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質の一部は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインなどのＮａＶタンパク質のドメインである。
一部の実施形態では、核酸分子は、内因性Ｓｃｎ９座位の核酸分子が、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインを含むＮａＶタンパク質をコードするように、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含む。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ１ａ、Ｓｃｎ２ａ、Ｓｃｎ３ａ、Ｓｃｎ４ａ、Ｓｃｎ５ａ、Ｓｃｎ８ａ、Ｓｃｎ１０ａ、およびＳｃｎ１１ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ１ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ２ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ３ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ５ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ８ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ１０ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によりコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ遺伝子は、Ｓｃｎ１１ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ２ａ遺伝子によりコードされるＮａＶ１．２タンパク質の細胞外ドメインをコードする、Ｓｃｎ２ａ遺伝子の一部を含む。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、およびキングコブラを含むがこれらに限定されない、改変された齧歯類種とは異なる種由来の外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含む。
一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ２ａ遺伝子によってコードされたＮａＶ１．２タンパク質の細胞外ドメインをコードする、外因性Ｓｃｎ２ａ遺伝子の一部を含み、外因性Ｓｃｎ２ａ遺伝子は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、およびキングコブラから選択される種由来である。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ２ａ遺伝子は、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子であり、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、ヒトＮａＶ１．２タンパク質の細胞外ドメインをコードする、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＮａＶ１．２タンパク質は、配列番号４と９９％超の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子は、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする。配列番号４のヒトＮａＶ１．２タンパク質の細胞外ドメインを、図１Ｄに示す（細胞外ドメインと膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインとの間の接合部は、図１Ｄに図示したものから１～２アミノ酸だけシフトすることができる）。
一部の実施形態では、細胞外ドメインをコードする外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部に加えて、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の一部も含む。一部の実施形態では、齧歯類動物はマウスであり、内因性マウスＳｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性マウスＮａＶ１．７タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９６％の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９７％の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号２と９９％超の同一性を有するマウスＮａＶ１．７タンパク質をコードする。特定の実施形態では、内因性マウスＮａＶ１．７タンパク質は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む。配列番号２のマウスＮａＶ１．７タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを、図１Ｄに示す（細胞外ドメインと膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインとの間の接合部は、図１Ｄに図示したものから１～２アミノ酸だけシフトすることができる）。
一部の実施形態では、齧歯類動物はラットであり、内因性ラットＳｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性ラットＮａＶ１．７タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９５％の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９６％の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９７％の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９８％の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と少なくとも９９％の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＳｃｎ９ａ遺伝子は、配列番号３９と９９％超の同一性を有するラットＮａＶ１．７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、内因性ラットＮａＶ１．７タンパク質は、配列番号３９と同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示された遺伝子改変齧歯類の一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に存在する核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に存在する核酸分子は、ゲノムＤＮＡである。
一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に存在する核酸は、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位の内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の全部または一部が、外因性Ｓｃｎ遺伝子の全部または一部で置換された遺伝子改変に起因する可能性がある。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子のコード配列（例えば、ＡＴＧコドンから終止コドンまで）を含むゲノム断片が、外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおいて、ＡＴＧコドンから終止コドンまで）によって置換され、一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子が、例えば、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラ由来のＳｃｎ２ａ遺伝子などの、Ｓｃｎ２ａ遺伝子である。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子はヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子である。一部の実施形態では、内因性齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質の細胞外ドメインの一つまたは複数またはすべてをコードする内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の一部は、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の対応する細胞外ドメインをコードする、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部によって置換されている。一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の置換に好適な外因性Ｓｃｎ遺伝子は、本明細書に前述のいずれか、例えば、Ｓｃｎ１ａ、Ｓｃｎ２ａ、Ｓｃｎ３ａ、Ｓｃｎ４ａ、Ｓｃｎ５ａ、Ｓｃｎ８ａ、Ｓｃｎ１０ａ、もしくはＳｃｎ１１ａ遺伝子、または改変される齧歯類とは異なる動物種由来のＳｃｎ９ａ遺伝子を含み、一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子が、例えば、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラ由来のＳｃｎ２ａ遺伝子などの、Ｓｃｎ２ａ遺伝子である。一部の実施形態では、外因性Ｓｃｎ遺伝子はヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子である。
一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、５’転写制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に操作可能に連結される。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に操作可能に連結される。一部の実施形態では、核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に操作可能に連結される。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性齧歯類Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の５’ＵＴＲおよび５’転写制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）の両方に操作可能に連結される。
一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の３’制御配列、例えば、３’ＵＴＲに操作可能に連結される。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質をコードし、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子の３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、外因性Ｓｃｎ遺伝子の３’ＵＴＲと、３’ＵＴＲを超える外因性Ｓｃｎ遺伝子の追加のゲノム配列、例えば、外因性Ｓｃｎ遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流の外因性Ｓｃｎ座位に見られる、３０～５００ｂｐ以上のゲノム配列とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、遺伝子改変に関して異種であり、すなわち、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子に関して異種である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、遺伝子改変に関してホモ接合性であり、すなわち、外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、内因性Ｓｃｎ９ａ座位の核酸分子に関してホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、例えば、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位への遺伝子改変、または内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の不活性化（例えば、全部または一部の欠失）の結果として、内因性齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質を発現することができない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、異種交雑または複数の遺伝子標的化戦略を介して）に、（ｉ）一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＨｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＨｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各重鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む、重鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＨ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各免疫グロブリン鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位（例えば、κおよび／またはλ）を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃκであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃλであるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＫｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＫｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各κ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む、κ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＬ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子および一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＬ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、Ｃλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｉＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｉＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、そのゲノム（例えば、その生殖系列ゲノム）に、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第８，７９１，３２３号、第９，２２６，４８４号、およびＷＯ２０１９／１１３０６５に記述されるとおりであり、それらすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。繁殖（または「交配」または「交雑」）は、当技術分野で容易に入手可能なプロトコルに従って行うことができる。例えば、ＪｏＶＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい。Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅａｎｉｎｇ、ＪｏＶＥ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、（２０１８）（ビデオ記事）、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ、Ａ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｍａｎｕａｌ、（著作権）２００７ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、すべては参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、操作されたＩｇλ軽鎖座位を、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含むＥＳ細胞に操作することができ、得られたＥＳ細胞を使用して、齧歯類動物を生成するか、またはヒト化Ｉｇλ軽鎖座位を含む齧歯類動物を、ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含む別の齧歯類動物と交雑させてもよい。ヒト化ＩｇＨ座位および／またはヒト化Ｉｇκ座位を含む様々な齧歯類動物が公知であり、例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）系統（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号および／または第８，６４２，８３５号を参照。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）系統（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５（２）：１４６－５６ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５－３５を参照。参照によりその全体が組み込まれる）がある。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物は、米国特許第９，７９６，７８８号；第９，９６９，８１４号；米国特許公開第２０１１／０１９５４５４Ａ１号、第２０１２／００２１４０９Ａ１号、第２０１２／０１９２３００Ａ１号、第２０１３／００４５４９２Ａ１号、第２０１３／０１８５８２１Ａ１号、第２０１３／０３０２８３６Ａ１号；国際特許出願公開第２０１１／０９７６０３号、第２０１２／１４８８７３号、第２０１３／１３４２６３号、第２０１３／１８４７６１号、第２０１４／１６０１７９号、第２０１４／１６０２０２号（それらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される限定された免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物は、ＷＯ２０１９／１１３０６５、ＷＯ２０１７２１４０８９、ＵＳ２０１８０１２５０４３、ならびに米国特許第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１６３，０９２号、第９，１５０，６６２号、第９，３３４，３３３号、第９，００６，５１１号、第９，０２９，６２８号、第９，２０６，２６１号、第９，０１２，７１７号、第９，３９４，３７３号、第９，２０６，２６２号、第９，２０６，２６３号、第９，２２６，４８４号、第９，５４０，４５２号、および第９，３９９，６８３号に記載の免疫グロブリン軽鎖座位を含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、機能的な内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠くヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片を発現する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位と同じ染色体上に含まれる、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を置換する一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。
一部の実施形態では、提供される遺伝子改変齧歯類は、第一および第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間の一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列とを含む、ゲノム（例えば、生殖系列ゲノム）を有する。一部の実施形態では、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、機能的オルソログ、機能的相同体、またはその機能的断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチドをコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、オス齧歯類の生殖能力を復元または強化する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物は、米国特許第８，６４２，８３５号、第９，９３２，４０８号、第８，６８７，９４０号、および第９，９４４，７１６号に記載されるＡｄａｍ６遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖座位は、機能的遺伝子、例えばＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物のゲノムは、マウス重鎖可変領域遺伝子セグメント間に位置しない、例えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方などの機能的遺伝子を備える。ＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂを発現する例示的な齧歯類動物は、米国特許第 第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載され、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、外因性ＴｄＴ遺伝子を持たない齧歯類と比較して、抗原受容体の多様性を高めることができた。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、転写調節因子に操作可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、外因性ＴｄＴは、免疫グロブリンκ軽鎖座位、免疫グロブリンλ軽鎖座位、免疫グロブリン重鎖座位、ＲＡＧ１座位、またはＲＡＧ２座位に位置する。
一部の実施形態では、ＴｄＴはヒトＴｄＴである。一部の実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴ（ＴｄＴＳ）の短いアイソフォームである。
一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含む。一部の実施形態では、齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科由来の動物である。一部の実施形態では、本開示の齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本開示のマウスは、ネズミ科のメンバー由来のものである。
遺伝子改変齧歯類の表現型
一部の実施形態では、ゲノムに内因性Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を含み、核酸分子が外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含むＮａＶタンパク質をコードすることができる、遺伝子改変齧歯類は、遺伝子改変齧歯類において、ＮａＶタンパク質を発現する。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質は、対照齧歯類（すなわち、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変のない齧歯類）中の齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質と同等の、または実質的に同一のパターンで発現される。齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質は、後根神経節、交感神経細胞、および神経内分泌細胞で侵害受容性（疼痛）ニューロンで発現されることが知られている。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質は、対照齧歯類（すなわち、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変のない齧歯類）中の齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質と同等の、または実質的に同一のレベルで発現される。用語「同等の」は、比較されるパターンまたはレベルが互いに同一ではない可能性があるが、観察された相違点または類似点に基づいて合理的に結論が導き出すことができるように、両者の比較を可能にすることを意味する。また、レベルを指す用語「実質的に同一」は、比較されるレベルが互いに２０％を超えて異なっていないことを意味する。
一部の実施形態では、ゲノムに内因性Ｓｃｎ９ａ座位に核酸分子を含み、核酸分子が外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含むＮａＶタンパク質をコードすることができる、遺伝子改変齧歯類は、遺伝子改変齧歯類において、ＮａＶタンパク質を発現する。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質は、対照齧歯類（すなわち、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変のない齧歯類）中の齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質と同等の、または実質的に同一のパターンで発現される。齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質は、後根神経節、交感神経細胞、および神経内分泌細胞で侵害受容性（疼痛）ニューロンで発現されることが知られている。一部の実施形態では、ＮａＶタンパク質は、対照齧歯類（すなわち、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変のない齧歯類）中の齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質と同等の、または実質的に同一のレベルで発現される。用語「同等の」は、比較されるパターンまたはレベルが互いに同一ではない可能性があるが、観察された相違点または類似点に基づいて合理的に結論が導き出すことができるように、両者の比較を可能にすることを意味する。また、レベルを指す用語「実質的に同一」は、比較されるレベルが互いに２０％を超えて異なっていないことを意味する。
一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、ＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７免疫原）による免疫化後に体液性免疫応答を高めることができる。ＮａＶ１．７免疫原は、タンパク質免疫原、ＤＮＡ免疫原、またはそれらの組み合わせであり得る。齧歯類における体液性免疫応答は、ＮａＶ１．７タンパク質に特異的な血清中の抗体の力価に基づいて決定され得る。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーベースのアッセイを含む、様々なアッセイを用いて、抗体力価を決定することができる（例えば、Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８９，１，（２．０．１～２．０．３） （２０１０）、Ｈｅｎｒｉ Ｖ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｌａｒｉａ，” Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．７１Ａ（４）：２４２～２５０（２００７）（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。一部の実施形態では、アッセイは、細胞表面上にＮａＶ１．７を発現するか、または発現するように操作された細胞を利用し、抗体力価は、細胞への抗体結合を測定することによって決定することができる。一部の実施形態では、細胞は、ヒトＮａＶ１．７タンパク質を発現するように操作されたＨＥＫ細胞である。一部の実施形態では、抗体力価は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈係数として定義される。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、対照齧歯類（すなわち、遺伝子改変のない齧歯類、すなわち、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部が挿入されていない齧歯類）と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍以上の力価で、ＮａＶ１．７（例えば、ヒトＮａＶ１．７）に対する抗体を産生する。
一部の実施形態では、齧歯類は、ＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）に特異的な抗体を生成することができる。一部の実施形態では、抗体特異性は、ＮａＶ１．７タンパク質の操作された発現なしの親細胞株への結合に対する、ＮａＶ１．７タンパク質を発現するように操作された細胞株への抗体による結合の比率に基づいて決定される。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２０を超える比率で、ＮａＶ１．７（例えば、限定されないが、ヒトＮａＶ１．７）に対する特異性を有する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、熱刺激に対する応答障害を示す。熱刺激に対する応答は、例えば、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験（後肢に向けられた放射熱刺激に対する齧歯類の退避潜時を測定する試験。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１８，３８（４７）：１０１８０～１０２０１を参照）、または有害な温度（例えば、５２．５℃または５５℃）（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２０１８、上記参照）で測定することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類（ｈＮａｖ１．２ ＫＩをｍＮａｖ１．７ ＫＯに挿入したマウスなど）は、野生型齧歯類と比較して、熱刺激（例えば、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における放射熱刺激）に応答する潜時が長く、例えば、遺伝子改変齧歯類は、野生型と比較して、熱刺激に応答するまでの時間が少なくとも２５％、５０％、７５％、または１００％長い。
一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類は、ヒスタミンに対する痒みの応答の低下を示す。痒みの応答は、齧歯類の首筋にヒスタミンを皮内注射し、指定された時間内の擦傷発作の数を測定することによって決定することができる（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８、上記参照）。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類（ｈＮａｖ１．２ ＫＩをｍＮａｖ１．７に挿入したマウスなど）は、１５分、２０分、２５分、または３０分などの時間内に、野生型齧歯類よりも擦傷発作の数が少なくとも２５％、５０％、７５％、または１００％少ないことを示して、ヒスタミンに対する痒み応答の低下を示す。
遺伝子改変齧歯類の組織および細胞
一部の実施形態の別の態様では、本明細書に記載される内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変を含む単離された齧歯類細胞または組織が本明細書に開示される。
一部の実施形態の別の態様では、本明細書に記載される内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変を含む単離された齧歯類細胞または組織が本明細書に開示される。
一部の実施形態では、齧歯類組織は、脂肪、膀胱、脳、***、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、またはその組み合わせである。
一部の実施形態では、齧歯類細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類のＢ細胞は、ＮａＶ１．７（例えば、ヒトＮａＶ１．７）に結合する抗体の産生に使用される。例えば、Ｂ細胞は、本明細書に記載される齧歯類から単離されてもよく、および直接使用されてもよく、またはハイブリドーマ作製のために不死化されてもよい。かかる齧歯類は、齧歯類からＢ細胞を単離する前に、ＮａＶ１．７免疫原（ＤＮＡまたはタンパク質）で免疫化されてもよい。Ｂ細胞および／またはハイブリドーマは、ＮａＶ１．７（例えば、ヒトＮａＶ１．７）を発現する細胞への結合についてスクリーニングすることができる。抗体は、かかる細胞からクローニングおよび配列決定され、候補治療薬を生成するために使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された齧歯類細胞または齧歯類組織から作製される不死化細胞が提供される。本明細書に開示される齧歯類由来の細胞は、その場限りで単離して使用するか、または多世代にわたって培養で維持することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類由来の細胞は、（例えば、ウイルスの使用、細胞融合などを介して）不死化され、培養（例えば、連続培養）で、無期限に維持される。
一部の実施形態では、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞が提供され、そのゲノムは、本明細書に記載される内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変を含む。齧歯類ＥＳ細胞を使用して、齧歯類胚および齧歯類動物を作製することができる。
一部の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、マウス胚性幹細胞であり、一部の実施形態では、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統、またはその混合に由来する。一部のある実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９およびＣ５７ＢＬ系統の混合である。一部の実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、ラット胚性幹細胞である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子（例えば、一つまたは複数の内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子）の上流にある（例えば、操作可能に連結している）一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＨｏＨ座位」と呼称される。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＨｏＨ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各重鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）の重鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒト重鎖可変ドメインを含む、重鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃκであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子は、Ｃλであるか、またはこれを含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン重鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＫｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＫｏＫ座位の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＫｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＫｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＫｏＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各κ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトκ軽鎖可変ドメインを含む、κ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＬ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のヒトＪλ 遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のＣλ遺伝子は、一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子および一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＬ座位の一つまたは複数のマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＬ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＬ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＬ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＬ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃκ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｏＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｏＫ座位のＣκ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖座位にある内因性齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｏＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のκ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、Ｃλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。かかるヒト化免疫グロブリン軽鎖座位は、本明細書では「ヒト化ＬｉＫ座位」と呼称される。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、ヒト化ＬｉＫ座位のＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｉＫ座位でホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｉＫ座位でヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、ヒト化ＬｉＫ座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）のλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子の上流にある（例えば、操作可能に連結された）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスターに存在する。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含むＢ細胞または脾細胞であり、特に、各λ軽鎖が、例えば抗原刺激に応答して、ヒトλ軽鎖定常ドメインに操作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、λ軽鎖を含む抗体を産生する。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに）、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠くヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、本明細書に提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片を発現する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位と同じ染色体上に含まれる、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、一つまたは複数の齧歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、ＨｏＨまたはＬｏＨ）座位を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする、一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を置換する、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする、一つまたは複数のヌクレオチド配列を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、提供される単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、第一および第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントと、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントの間の一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列と、を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、第一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第二のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
一部の実施形態では、一つまたは複数の齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、オルソログ、相同体、またはその断片をコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含む、単離された齧歯類細胞は、Ｂ細胞または脾細胞であり、外因性ＴｄＴ遺伝子を持たない単離された齧歯類細胞（例えば、Ｂ細胞または脾細胞）と比較して、抗原受容体の多様性を高めることができた。
一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された齧歯類細胞または齧歯類組織は、転写調節因子に操作可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含むゲノムを有する。
一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、外因性ＴｄＴは、免疫グロブリンκ軽鎖座位、免疫グロブリンλ軽鎖座位、免疫グロブリン重鎖座位、ＲＡＧ１座位、またはＲＡＧ２座位に位置する。
一部の実施形態では、ＴｄＴはヒトＴｄＴである。一部の実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴ（ＴｄＴＳ）の短いアイソフォームである。
遺伝子改変齧歯類を作製するための組成物および方法
一部の実施形態の一態様では、上述の遺伝子改変齧歯類を作製するための方法、ならびに遺伝子改変齧歯類の作製における使用に適した核酸ベクターが本明細書に開示される。
一部の実施形態の一態様では、上述の遺伝子改変齧歯類を作製するための方法、ならびに遺伝子改変齧歯類の作製における使用に適した核酸ベクターが本明細書に開示される。
一部の実施形態では、齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に組み込まれることが望ましい外因性Ｓｃｎ遺伝子を含む標的化ベクター（または核酸構築物）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に組み込まれることが望ましい外因性Ｓｃｎ遺伝子の少なくとも一部を含む標的化ベクター（または核酸構築物）が本明細書に開示される。一部の実施形態では、標的ベクターは、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインの連続アミノ酸をコードする、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含む。一部の実施形態では、標的ベクターは、外因性Ｓｃｎ遺伝子によってコードされるＮａＶタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸をコードする、外因性Ｓｃｎ遺伝子の一部を含み、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインのアミノ酸をコードする、内因性Ｓｃｎ９ａ遺伝子の一部も含み、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、互いに操作可能に連結されている。一部の実施形態では、標的ベクターは、外因性Ｓｃｎ遺伝子のコード配列を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターはまた、相同アームとしても知られる、齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に組み込まれるヌクレオチド配列に隣接する５’および３’齧歯類配列を含み、相同アームは、相同組み換えならびにヌクレオチド配列の標的齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位への組み込みを介在する。一部の実施形態では、相同アームは、置換される標的齧歯類座位にヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列を含む。例示的な実施形態では、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでのコード配列は、ヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子のコード配列で置換され、５’隣接配列は、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子のＡＴＧコドンの上流の配列を含んでもよく、３’隣接配列は、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の終止コドンの下流の配列を含んでもよい。
一部の実施形態では、標的化ベクターは選択マーカー遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは一つまたは複数の部位特異的組み換え部位を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは、部位特異的組み換え部位に隣接した選択マーカー遺伝子を含み、その結果、選択マーカー遺伝子は、部位間の組み換えの結果として削除され得る。
例示的な実施形態では、齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の齧歯類ゲノム断片を担持する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンは、細菌相同組み換えおよびＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、参照により本明細書にその全体がすべて援用される、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照）を使用して改変され得る。結果として、齧歯類Ｓｃｎ９ａゲノム配列は、元のＢＡＣクローンから削除され、外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列が挿入され、５’および３’齧歯類相同アームに隣接した外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列を担持する改変ＢＡＣクローンが得られる。改変ＢＡＣクローンは、直線化されると、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、本発明は、改変齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞を作るための本明細書に記述された標的化ベクターの利用法を提供する。例えば、標的化ベクターは、例えばエレクトロポレーションによって齧歯類ＥＳ細胞に導入することができる。マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞は共に当技術分野で説明されている。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８－００７８０００Ａ１は、マウスＥＳ細胞および遺伝子改変マウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載しており、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６７：２１１－２１５、およびＴｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８は、ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットを作製する方法を記述し、これを使用して改変齧歯類胚を作製することができ、次いでこれを使用して齧歯類動物を作製することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＨｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＨｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＫｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＬ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、ヒト化ＬｏＬ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＫｏＫ座位、およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｏＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｏＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、そのゲノムに、ヒト化ＬｏＨ座位およびヒト化ＬｉＫ座位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化ＬｏＨ座位、ヒト化ＬｉＫ座位、またはそれらの組み合わせでホモ接合性である。
一部の実施形態では、ゲノムに組み込まれた外因性Ｓｃｎヌクレオチド配列を有するＥＳ細胞を選択することができる。一部の実施形態では、ＥＳ細胞は、齧歯類対立遺伝子の喪失アッセイおよび／または外因性ヌクレオチド配列の獲得アッセイに基づいて選択される。一部の実施形態では、次いで選択されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８－００７８０００Ａ１を参照）、またはＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１およびＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１に記載の方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。一部の実施形態では、改変齧歯類ＥＳ細胞は、ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖座位と、外因性Ｓｃｎ配列とを含み、改変齧歯類ＥＳ細胞は胚に導入することができる。ドナーＥＳ細胞を含む胚は、胚盤胞期まで培養され、次に、代理母に移植して、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０齧歯類を生成する。外因性Ｓｃｎヒトヌクレオチド配列を保有する齧歯類の仔は、齧歯類Ｓｃｎ９ａ配列の喪失アッセイおよび／または外因性Ｓｃｎ配列の獲得アッセイを使用して、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定により特定することができる。
一部の実施形態では、内因性Ｓｃｎ９ａ座位での遺伝子改変についてヘテロ接合性の齧歯類は、例えば、当技術分野で容易に入手可能な育種プロトコルに従うことによって、交配（または交雑）して、ホモ接合性齧歯類を生成することがでる。例えば、ＪｏＶＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅａｎｉｎｇ、ＪｏＶＥ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、（２０１８）（ビデオ記事）、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｅ、Ａ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｍａｎｕａｌ、（著作権）２００７ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。すべては参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、内因性Ｓｃｎ９ａ座位に遺伝子改変を含む齧歯類は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖座位を含む齧歯類と交雑されて、上述の内因性Ｓｃｎ９ａ座位およびヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖座位の両方に遺伝子改変を含む齧歯類を取得することができる。一部の実施形態では、ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖座位を含む齧歯類ＥＳ細胞を使用して、内因性Ｓｃｎ９ａｎ配列に組み込むための外因性Ｓｃｎ配列を受け取ることができ、得られた遺伝子改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して、内因性Ｓｃｎ９ａ座位と、ヒト化免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖座位の両方に、遺伝子改変を含む遺伝子改変齧歯類を作製することができる。
遺伝子改変齧歯類を用いる方法
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類は、ＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）に対する抗体を生成するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類は、ＮａＶ１．７タンパク質（例えば、ヒトＮａＶ１．７タンパク質）に対する抗体を生成するために使用される。
一部の実施形態では、抗体は、様々な経路（例えば、限定されないが、静脈内経路または腹腔内経路）を介して、本明細書に記載される齧歯類動物にＮａＶ１．７免疫原（例えば、ヒトＮａＶ１．７）を投与することによって生成され得る。ＮａＶ１．７免疫原は、タンパク質免疫原（すなわち、ＮａＶ１．７タンパク質もしくはその断片）、ＤＮＡ免疫原（レシピエント齧歯類、例えば、ウイルスベクターで、ＮａＶ１．７タンパク質もしくはその断片を発現することができるＤＮＡ）、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、免疫原は、大腸菌、または真核細胞（例えば、酵母）もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）で発現される組み換えＮａＶ１．７タンパク質である。一部の実施形態では、標準アジュバントを使用して、一つまたは複数の追加免疫注射が投与されてもよい。追加免疫注射は、同じＮａＶ１．７免疫原を用いるか、または元のタンパク質免疫原からＤＮＡ免疫原に切り替えても、もしくはその逆でもよい。リンパ細胞（Ｂ細胞など）は、免疫化齧歯類から回収され、直接的にスクリーニングするか、または骨髄腫細胞株と融合させて不死のハイブリドーマ細胞株を調製し、次いでこれをスクリーニングして、ＮａＶ１．７に特異的な抗体を産生する細胞を特定することができる。スクリーニングは、ＮａＶ１．７タンパク質を発現するように操作された細胞（例えば、ヒトＮａＶ１．７を発現するように操作されたＨＥＫ細胞）への候補抗体の結合を、ＮａＶ１．７タンパク質を発現しない親細胞（ＨＥＫ細胞）への結合と比較して評価することに基づいてもよい。一部の実施形態では、指定された抗体濃度で ＮａＶ１．７タンパク質を発現しない親細胞への結合と比較して、ＮａＶ１．７タンパク質を発現するように操作された細胞への結合の比率を使用して、抗体の特異性を測定し、比率が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、または１０を超える比率である場合、抗体はＮａＶ１．７タンパク質に特異的な結合剤として特定され得る。
特定された細胞の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、望ましい重鎖および軽鎖定常領域に連結することができる。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞において産生されてもよい。
本記述は、以下の実施例により、さらに例示されるが、決して限定するものとして解釈されるべきではない。すべての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
実施例１ ヒトＮａＶ１．２ノックイン（ＫＩ）をマウスＮａＶ１．７ノックアウト（ＫＯ）に挿入したものを含むマウス系統の生成
本実施例は、齧歯類Ｓｃｎ遺伝子（例えば、マウスＮａＶ１．７タンパク質をコードするマウスＳｃｎ９ａ遺伝子）が、異なる種（例えば、ヒトＮａＶ１．２タンパク質をコードするヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子）由来のＳｃｎ遺伝子によって、全部または一部で置換される、遺伝子改変齧歯類（例えば、マウス）を生成する例示的な方法を示す。
本実施例は、齧歯類Ｓｃｎ遺伝子（例えば、マウスＮａＶ１．７タンパク質をコードするマウスＳｃｎ９ａ遺伝子）が、異なる種（例えば、ヒトＮａＶ１．２タンパク質をコードするヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子）由来のＳｃｎ遺伝子によって、全部または一部で置換される、遺伝子改変齧歯類（例えば、マウス）を生成する例示的な方法を示す。
内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子を改変するための標的化ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンとＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して以下のように構築された（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照のこと。それらは参照によりその全体が本明細書に援用される）。
簡潔に述べると、マウスＳｃｎ９ａ遺伝子を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３－４５４Ｈ３を、ＢＡＣクローンＲＰ１１－４２２Ｄ１８由来の９６，７３５ｂｐのヒトＳＣＮ２ＡゲノムＤＮＡ、および４８０９ｂｐの自己削除ネオマイシンカセット（ｌｏｘＰ－ｍＰｒｍ１－Ｃｒｅｉ－ｐＡ－ｈＵｂ１－ｅｍ７－Ｎｅｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰ）を含有するＤＮＡ断片を使用して、細菌細胞内の相同組み換えを介して改変した。ヒトＳＣＮ２ＡゲノムＤＮＡは、終止コドンを超えて２７３４ｂｐまでヒトＳＣＮ２Ａ ＡＴＧを含有し、これには、カセット直前のヒト３’ＵＴＲの後の約２５０ｂｐの３’ヒト配列が含まれていた。相同組み換えの結果として、ＢＡＣクローンＲＰ２３－４５４Ｈ３中の８４，８４７ｂｐのマウスヌクレオチド配列（マウスＳｃｎ９ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから終止コドンまで）を、９６，７３５ｂｐのヒト配列で置換し、続いてカセットで置換した。ヒトＳＣＮ２ＡゲノムＤＮＡおよび自己削除カセットに隣接する、５７Ｋｂの５’相同アームと、４３Ｋｂの３’相同アームとを有する、得られた改変ＢＡＣクローンを、内因性マウスＳｃｎ９ａ遺伝子を改変するための標的化ベクターとして使用した。図１Ａ～図１Ｂを参照。
改変ＢＡＣクローンは、エレクトロポレーションにより、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入された。内因性マウスＳｃｎ９ａ座位でマウスＳｃｎ９ａ遺伝子を置換したヒトＳＣＮ２Ａ遺伝子を含有する陽性標的ＥＳ細胞（「ヒトＳＣＮ２Ａ ＫＩをマウスＳｃｎ９ａ ＫＯに挿入」、または「ｈＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯに挿入」）を、ヒト配列の存在を検出し、マウス配列の喪失および／または保持を確認するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．、上記参照）により特定した。表５は、アッセイに使用されたプライマーおよびプローブを示す。アッセイに使用されたプライマーおよびプローブの位置を示す図１Ａも参照されたい。改変に成功したＳｃｎ９ａ座位のヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載されている。所望の改変を有する標的ＥＳ細胞クローンを選択した後、ネオマイシン選択カセットは、例えばエレクトロポレーションを介してＣｒｅリコンビナーゼを導入することにより、削除することができる。代替方法として、当該ネオマイシン選択カセットは、ＥＳクローンから生成した後代を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する除去（ｄｅｌｅｔｏｒ）齧歯類系統と交配することにより、除去することができる。カセット削除後の改変Ｓｃｎ９ａ座位を図１Ｃに示し、接合部配列は図１Ｃの下部に示す。
（カセットを有する、または有していない）選択ＥＳ細胞クローンを使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用してメスのマウスに移植し（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．、２００７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９を参照のこと）、ヒト化Ｓｃｎ９ａ座位をゲノム中に含有する一腹の仔を生成した。かかる遺伝子改変を保有するマウスを、ヒト配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，上記参照）の改良法を使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認し、同定した。ヒト化Ｓｃｎ９ａ座位に対してホモ接合性の動物が、ヘテロ接合性動物の交配により作製された。
実施例２ ｈＮａＶ１．２ノックイン（ＫＩ）をｍＮａＶ１．７ノックアウト（ＫＯ）／ＶＩ－３に挿入したマウスの免疫化および免疫原に対する血清抗体応答の分析
免疫化 ヒトＮａＶ１．２ノックイン（ＫＩ）をｍＮａＶ１．７ ＫＯ／ＶＩ－３に挿入したマウスを、全長ヒトＮａｖ１．７タンパク質をコードする全長ＤＮＡ、またはヒトＮａＶ１．７タンパク質のいずれかで免疫化した。マウスは、標準的なアジュバントを使用して、異なる経路を介して異なる時間間隔で追加免疫された。免疫化開始前、および免疫原の追加免疫に続いて定期的にマウスを採血し、抗血清力価を各抗原についてアッセイした。
免疫化 ヒトＮａＶ１．２ノックイン（ＫＩ）をｍＮａＶ１．７ ＫＯ／ＶＩ－３に挿入したマウスを、全長ヒトＮａｖ１．７タンパク質をコードする全長ＤＮＡ、またはヒトＮａＶ１．７タンパク質のいずれかで免疫化した。マウスは、標準的なアジュバントを使用して、異なる経路を介して異なる時間間隔で追加免疫された。免疫化開始前、および免疫原の追加免疫に続いて定期的にマウスを採血し、抗血清力価を各抗原についてアッセイした。
抗血清力価の決定 各免疫原に対する血清中の抗体力価を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）細胞結合ＥＬＩＳＡを使用して決定した。９６ウェルの炭素表面プレートを、ＰＢＳ中のＨＥＫ２９３／ｈＮａｖ１．７－ＧＦＰ（Ｓａｎｏｆｉ、ＳＡ製）、ＨＥＫ２９３／ｈＮａｖ１．７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびＨＥＫ２９３親細胞の４０，０００細胞／ウェルで、３７℃で１時間コーティングした。細胞コーティング溶液をデカントし、プレートを、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１５０μＬで、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。プレートを、プレートウォッシャー（ＡｑｕａＭａｘ（登録商標）２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＰＢＳで三回洗浄した。免疫前血清、および免疫抗血清を、１％ ＢＳＡ－ＰＢＳ中で連続三倍希釈し、プレートに１時間、室温で添加した。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃルテニウムコンジュゲート二次抗体を、次いで、１μｇ／ｍＬでプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ウェル当たり１５０μＬのＭＳＤの４Ｘ界面活性剤を含まないＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（１Ｘに希釈）を加えることによって発色させ、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（商標）ｉｍａｇｅｒ６０００機器で読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、抗血清力価を計算した。力価は、結合シグナルがバックグラウンドの２倍である、補間血清希釈倍数として定義された。
結果 タンパク質またはＤＮＡ免疫原を用いた免疫化後に、ｈＮａｖ１．２ ＫＩをｍＮａｖ１．７ ＫＯ／ＶＩ－３に挿入したマウスにおける体液性免疫応答を調査した。タンパク質で免疫化されたマウスの抗血清は、Ｎａｖ１．７過剰発現細胞に対して高い特異的力価を示すが、親細胞に対する結合は低い（図２）。最初にＤＮＡで免疫化して応答が低かったマウスに、タンパク質ブーストを投与したところ、Ｎａｖ１．７操作細胞に対する高い特異的力価が誘発された（図２）。
実施例３ ヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ ＶＩに挿入したマウス由来の抗体の電気化学発光細胞結合－一次スクリーニングの上清および精製された抗体
実験手順
実施例１に記載のヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ ＶＩに挿入したマウスを、精製された界面活性剤で可溶化したヒトＮａＶ１．７タンパク質で免疫化した。モノクローナル抗体は、これらの免疫化されたマウスの脾細胞と、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞との融合により生成された。ハイブリドーマからの上清を、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの検出を使用して、ヒトＮａＶ１．７発現細胞に結合する能力について評価した。陽性ＮａＶ１．７細胞結合剤を、ＮａＶ１．７操作細胞と参照細胞株との結合を比較することによって、特異性について評価した。２４個のＮａＶ１．７－特異的ハイブリドーマのサブセットを、フローサイトメトリーにより単一細胞ソーティングし、増殖させ、抗体を精製した。ＮａＶ１．７を発現するように操作された細胞に、特異的に結合するこれらの抗体の能力を決定した。
実験手順
実施例１に記載のヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ ＶＩに挿入したマウスを、精製された界面活性剤で可溶化したヒトＮａＶ１．７タンパク質で免疫化した。モノクローナル抗体は、これらの免疫化されたマウスの脾細胞と、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞との融合により生成された。ハイブリドーマからの上清を、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの検出を使用して、ヒトＮａＶ１．７発現細胞に結合する能力について評価した。陽性ＮａＶ１．７細胞結合剤を、ＮａＶ１．７操作細胞と参照細胞株との結合を比較することによって、特異性について評価した。２４個のＮａＶ１．７－特異的ハイブリドーマのサブセットを、フローサイトメトリーにより単一細胞ソーティングし、増殖させ、抗体を精製した。ＮａＶ１．７を発現するように操作された細胞に、特異的に結合するこれらの抗体の能力を決定した。
簡潔に述べると、ヒトＮａＶ１．７を発現するように操作されたヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）は、二つの供給源、Ｓａｎｏｆｉ（ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７、図２に示す略式「ＳＡ」）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７、図２に示す略式「Ｍｉｌｌｌｉｐｏｒｅ」）から取得された。ＡＴＣＣからのＨＥＫ２９３細胞は、ＴＡＱＭＡＮ分析により決定される低レベルのＮａＶ１．７ ｍＲＮＡを有するため、ＮａＶ１．７ベースライン基準として使用した。以前に単離された抗ヒトＮａＶ１．７抗体を、ＮａＶ１．７陽性細胞結合対照として使用した。無関係なマウスＩｇＧ抗体（抗－ｈＣＤ４８ ｍＩｇＧ１または抗－ｈＩｇＧ４ ｍＩｇＧ２ａ 対照のいずれか）を、アッセイにおいて陰性結合対照として使用した。
実験は、以下の手順に従って行われた。上述の系統の細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない１ｘＰＢＳ緩衝液で一回すすぎ、酵素を含まない細胞解離溶液で、３７℃で１０分間インキュベートして、フラスコから細胞を分離した。すべての細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有１ｘＰＢＳで一回洗浄し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）自動Ｔ４細胞カウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）を用いて計数した。およそ２．０ｘ１０４のＨＥＫ２９３、２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ２９３／ｈＮａＶ１．７の細胞を、９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ高結合プレート、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））に別々に播種し、３７℃で１時間インキュベートした。非特異的結合部位を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋含有１ｘＰＢＳ中２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を用いて、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。プレートに結合したＨＥＫ２９３、ＳＡ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞に、ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡで１：２０に固定希釈した抗－ＮａＶ１．７の上清または対照抗体の溶液を、シングルポイントとして添加した。精製された抗体については、１．７ｐＭ～１００ｎＭの範囲の連続希釈、および抗体が存在しない溶液を、二重に加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、洗浄して、細胞洗浄ヘッド（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を備えたＡｑｕａＭａｘ２０００プレートウォッシャーを使用して、非結合の抗体を除去した。プレート結合抗体を、Ｆｃγ断片に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて、室温で１時間検出した。プレートを洗浄し、製造業者の指示に従ってＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて発色させ、発光シグナルをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ （ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で記録した。相対光単位（ＲＬＵ）で測定された発光強度を記録して、濃度の範囲で各抗体の結合強度を標示した。
３０８０のサンプルの一次スクリーニングでは、ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞株で、直接結合シグナルが３００ＲＬＵを超える上清を、陽性として評価した。１４５の陽性サンプルを、上述の手順を用いて三つの細胞株すべてでさらに試験し、特異性比を決定した。ＨＥＫ２９３細胞と比較して、いずれかのヒトＮａＶ１．７発現細胞で２以上の結合比を有する抗体を、ＮａＶ１．７－特異的結合剤として分類し、その集計数を表６に示す。
精製された抗体について、ＨＥＫ２９３細胞に結合する同濃度の抗体と比較して、ヒトＮａＶ１．７発現細胞上の１．２ｎＭの抗体で検出された結合シグナルの比率を表７に示し、ＮａＶ１．７結合の特異性の指標として使用する。ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞上に１５０ＲＬＵ超の結合シグナルを有し、ＨＥＫ２９３細胞と比較して２以上の比率を有する抗体は、ＮａＶ１．７－特異的結合剤として分類された。結合比が２未満または結合シグナルが１５０ＲＬＵ未満の抗体を、非特異的結合剤として分類した。
結果の概要と結論
ＮａＶ１．７で免疫化した、ヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ ＶＩに挿入したマウス由来の三つの脾臓を融合して、ハイブリドーマを生成した。これらの細胞由来の上清を、電気化学発光（ＥＣＬ）を使用してヒトＮａＶ１．７細胞結合および特異性について評価した。抗体は、ヒトＮａＶ１．７発現細胞、２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７に結合し、一部の実験では、参照細胞株 ＨＥＫ２９３に結合し、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体で検出された。
ＮａＶ１．７で免疫化した、ヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ ＶＩに挿入したマウス由来の三つの脾臓を融合して、ハイブリドーマを生成した。これらの細胞由来の上清を、電気化学発光（ＥＣＬ）を使用してヒトＮａＶ１．７細胞結合および特異性について評価した。抗体は、ヒトＮａＶ１．７発現細胞、２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７に結合し、一部の実験では、参照細胞株 ＨＥＫ２９３に結合し、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体で検出された。
表６の結果が示すように、３０８０のハイブリドーマの上清を１：２０希釈で試験し、１４５をＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７および／またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞に結合させ、ＥＣＬで検出すると３００ＲＬＵ以上のシグナルを示した。三つの融合すべてで、ＮａＶ１．７陽性細胞結合剤を得た。１４５の上清を、その後、参照ＨＥＫ２９３細胞と共に、二つのＮａＶ１．７細胞株への結合について試験した。６０の陽性ハイブリドーマは、ＨＥＫ２９３細胞と比較して、ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞に２倍超の比率で、ＮａＶ１．７細胞に特異的に結合した。これらの６０の上清のうち５２は、両方の細胞株に特異的に結合した。三つの融合のうちの二つが、ＥＣＬによって決定されたように、ＮａＶ１．７－特異的ハイブリドーマを得た。
６０のハイブリドーマのうち２４のサブセットを、フローサイトメトリーにより単一細胞ソーティングし、増殖させ、抗体を精製し、二つの結合実験のうちの一つでＮａＶ１．７細胞特異的結合について評価した。表７では、ＨＥＫ２９３細胞と比較して、ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞に結合する１．２ｎＭの抗体の比率が報告された。２４個の抗体のうち２０個が、両方のＮａＶ１．７細胞株に特異的に結合し、ＳＡ ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７への結合は、ＨＥＫ２９３細胞への結合よりも２．４～５７．９倍高く、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞への結合は、ＨＥＫ２９３細胞への結合よりも２．５～４４．５倍高い。２４個の抗体のうち４個は非特異的であり、結合シグナルは１５０ＲＬＵ未満、および／またはＮａＶ１．７細胞対参照細胞の結合比は２未満であった。以前に単離された陽性ＮａＶ１．７対照抗体は、ＳＡ２９３／ＧＦＰ－ｈＮａＶ１．７ではＨＥＫ２９３細胞よりも平均２３．５倍、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ２９３／ｈＮａＶ１．７細胞ではＨＥＫ２９３細胞よりも平均１７．３倍高い結合性を有した。アイソタイプ対照抗体は、１５０ＲＬＵ未満の結合性を有し、予想通りにすべての細胞に対してほぼ等しい結合性を有した。
実施例４
選択された 抗－Ｎａｖ１．７ハイブリドーマクローンを収集し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６システムを使用して全ＲＮＡを単離した。次に、ＳＭＡＲＴｓｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびにマウスの重鎖ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびマウスカッパ軽鎖のマウスの定常領域に特異的なリバースプライマーを、鋳型スイッチングオリゴであるＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａ オリゴと共に使用して、逆転写を実施し、マウス定常領域配列の一部と共にヒト可変ドメインを含む、ｃＤＮＡを生成した（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．２０１４、ＰＭＩＤ：２４９８４８５４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｃＤＮＡおよび後続のＰＣＲ産物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して精製した。次いで、精製されたｃＤＮＡを、イルミナアダプター配列（５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、配列番号５７）を有するＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａオリゴに特異的なプライマー、およびイルミナアダプター配列（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、配列番号５８）を有するマウス定常領域に特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。断片を、マルチプレックスシーケンシング用のインデックス配列を有するプライマーを使用してＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、処理し、プールして、シーケンシングのためにＭｉｓｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって分析した。
選択された 抗－Ｎａｖ１．７ハイブリドーマクローンを収集し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６システムを使用して全ＲＮＡを単離した。次に、ＳＭＡＲＴｓｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびにマウスの重鎖ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびマウスカッパ軽鎖のマウスの定常領域に特異的なリバースプライマーを、鋳型スイッチングオリゴであるＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａ オリゴと共に使用して、逆転写を実施し、マウス定常領域配列の一部と共にヒト可変ドメインを含む、ｃＤＮＡを生成した（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．２０１４、ＰＭＩＤ：２４９８４８５４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｃＤＮＡおよび後続のＰＣＲ産物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して精製した。次いで、精製されたｃＤＮＡを、イルミナアダプター配列（５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、配列番号５７）を有するＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａオリゴに特異的なプライマー、およびイルミナアダプター配列（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、配列番号５８）を有するマウス定常領域に特異的なリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。断片を、マルチプレックスシーケンシング用のインデックス配列を有するプライマーを使用してＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、処理し、プールして、シーケンシングのためにＭｉｓｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって分析した。
表８は、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウスにおけるＶ遺伝子の使用と比較した抗－ＮａＶ１．７モノクローナル抗体におけるＶ遺伝子の使用を示しており、これは米国特許第８，５０２，０１８号および第８，６４２，８３５号にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例５ ヒトＮａＶ１．２ ＫＩをｍＮａＶ１．７ ＫＯ／ＶＩに挿入したマウスは、熱刺激に対する応答が損なわれ、ヒスタミンに対する痒みの応答が低下する。
方法
ホットプレート－マウスをホットプレートデバイス（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）上に配置した。後肢の跳躍、持ち上げ、および／またはなめるまでの潜時を、５２．５℃または５５℃で記録した（２つの異なる温度を１０日おきに試験した）。
方法
ホットプレート－マウスをホットプレートデバイス（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）上に配置した。後肢の跳躍、持ち上げ、および／またはなめるまでの潜時を、５２．５℃または５５℃で記録した（２つの異なる温度を１０日おきに試験した）。
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ － Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ装置（ＩＩＴＣ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）を使用して熱的痛覚過敏を測定した。マウスを、試験の少なくとも６０分前にプレキシグラスチャンバーに置いた。左側の後肢に加えられた放射熱刺激に応答するまでの熱的潜時を、試験セッション中に３回記録し、全体の平均潜時の測定値を使用した。
痒み－試験前に少なくとも１５分間、マウスをプレキシグラスチャンバーに馴化させた。マウスに１５０μｇのヒスタミン塩酸塩（ＰＢＳ中１５μＬ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１３０９００９）を、首筋の肩甲骨の間に皮内注射した。チャンバーの底面を見るために上向きに設置されたビデオカメラ（Ｎｏｌｄｕｓ）は、注射後２５分までの活動を記録した。ビデオファイルは、ヒスタミン注射後の擦傷発作の合計について、手作業でスコア付けした。
結果
結果
実施例１に記載されるｈＮａｖ１．２ ＫＩをｍＮａｖ１．７ ＫＯに挿入したマウスを、急性熱刺激に対する応答について試験した。まず、マウスを、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験としても知られる、後肢に向けられた放射熱刺激に対するその離脱潜時について試験した。ｈＮａＶ１．２をマウスＮａＶ１．７に挿入したマウスは、熱刺激に対する応答の潜時が著しく伸びることを示す（ｈＮａＶ１．２をマウスＮａＶ１．７ に挿入したマウスについては２２．９±０．９秒、ｎ＝１５に対して、ＷＴマウスについては１２．３±０．５秒、ｎ＝１９、不対のスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１）。図７Ａを参照のこと。次に、マウスを、ホットプレート装置で、５２．５℃および５５℃の２つの有害な温度で試験した（２つの温度を１０日間空けて試験した）。マウスＮａｖ１．７にｈＮａｖ１．２を発現するマウスは、どちらの温度でも応答しなかった。すべてのマウスは、３０秒のカットオフ時間に達したところで、組織損傷を防ぐために試験を停止したが、ＷＴマウスは、両温度で速やかに防衛応答を示した（５５℃で６．５±０．５秒、ｎ＝９、および５２．５℃で１０．４±０．６秒）。図７Ｂを参照のこと。
マウスＮａｖ１．７座位にｈＮａｖ１．２マウスを発現するマウスが、起痒物質に対する痒みの応答に障害があるかどうかを試験するために、マウスの首筋にヒスタミン（１５０μｇ）を皮内注射し、擦傷発作を最大２５分間記録した。ｈＮａｖ１．２をｍＮａｖ１．７に挿入したマウスは、ＷＴマウスよりも３．７倍少ない擦傷発作を示した（ｈＮａｖ１．２をｍＮａｖ１．７に挿入したマウスについては２４±１１回に対して、ＷＴについては８１±２０回の発作、不対のスチューデントｔ検定ｐ＝０．０４７）。図７Ｃを参照のこと。
特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文および学術論文を含む様々な公表文献が、本明細書に引用される。これら引用された各公表文献は、本明細書においてその全体で、すべての目的に対し、参照により援用される。
Claims (60)
- 遺伝子改変齧歯類であって、そのゲノムが、
内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位にあるＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含み、
前記ＮａＶ１．２タンパク質が、前記遺伝子改変齧歯類で発現され、
前記齧歯類がマウスまたはラットである、遺伝子改変齧歯類。 - 前記齧歯類が、齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質を発現することができない、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラから選択される動物種のＮａＶ１．２タンパク質である、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、ヒトＮａＶ１．２タンパク質である、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位で内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記Ｓｃｎ２ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから終止コドンまで連続するＳｃｎ２ａ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ヌクレオチド配列が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の５’ＵＴＲに操作可能に連結されている、請求項７に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ヌクレオチド配列が、前記Ｓｃｎ２ａ遺伝子の３’ＵＴＲに操作可能に連結されている、請求項７または８に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位で前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子のゲノム断片を置換し、
前記ゲノム断片が、前記内因性齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質をコードする、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。 - 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のゲノム断片である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、ｃＤＮＡである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記齧歯類が、前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子に対してヘテロ接合性である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記齧歯類が、前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子に対してホモ接合性である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記齧歯類が、ヒトＮａＶ１．７免疫原で免疫化すると、ヒトＮａＶ１．７タンパク質に対する抗体を産生する、請求項１４に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントが、一つまたは複数の齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト重鎖可変ドメインおよび齧歯類重鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。 - 一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト軽鎖可変ドメインおよび齧歯類軽鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。 - 一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数のヒト軽鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト軽鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。 - 前記一つまたは複数のヒトＶＬおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである、請求項１７に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記一つまたは複数のヒトＶＬおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである、請求項１７に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子が、一つまたは複数の齧歯類Ｃλ遺伝子である、請求項１７に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子が、一つまたは複数の齧歯類Ｃκ遺伝子である、請求項１７に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記齧歯類が、齧歯類ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片もしくはオルソログをコードするヌクレオチドを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 前記齧歯類が、外因性ＴｄＴ遺伝子を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類。
- 遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、
前記改変ゲノムが、内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位にＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含むように齧歯類ゲノムを改変することと、
前記ＮａＶ１．２タンパク質が、前記遺伝子改変齧歯類で発現され、前記齧歯類がマウスまたはラットである、前記改変ゲノムを含む齧歯類を生成することと、を含む、方法。 - 遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、
（ｉ）前記核酸分子が内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位内に組み込まれるように、ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することと、
（ｉｉ）前記核酸分子が内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位に組み込まれた、改変ゲノムを含む齧歯類ＥＳ細胞を取得することと、
（ｉｉｉ）前記改変ゲノムを含む前記齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を生成することと、を含む、方法。 - ステップ（ｉｉｉ）が、前記齧歯類ＥＳ細胞を胚に導入することを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マレーヒヨケザル、ウサギ、ウマ、ヒトコブラクダ、シャチ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、イヌ、ニワトリ、アオウミガメ、またはキングコブラから選択される動物種のＮａＶ１．２タンパク質である、請求項２５または２６に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、ヒトＮａＶ１．２タンパク質である、請求項２５または２６に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質が、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位で前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａプロモーターに操作可能に連結されている、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記Ｓｃｎ２ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから終止コドンまで、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子の５’ＵＴＲに操作可能に連結されている、請求項３２に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、前記Ｓｃｎ２ａ遺伝子の３’ＵＴＲに操作可能に連結されている、請求項３２または３３に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位で前記内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ遺伝子のゲノム断片を置換し、前記ゲノム断片が、前記内因性齧歯類ＮａＶ１．７タンパク質をコードする、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、Ｓｃｎ２ａ遺伝子のゲノム断片である、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．２タンパク質をコードする前記核酸分子が、ｃＤＮＡである、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子改変齧歯類が、
一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントが、一つまたは複数の齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト重鎖可変ドメインおよび齧歯類重鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変齧歯類が、
一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数の内因性齧歯類軽鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト軽鎖可変ドメインおよび齧歯類軽鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子改変齧歯類が、
一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位をさらに含み、
前記一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数の内因性ヒト軽鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結され、
前記遺伝子改変齧歯類が、抗原刺激に応答して、ヒト軽鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインを含む抗体を産生することができる、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記一つまたは複数のヒトＶＬおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントである、請求項３９に記載の方法。
- 前記一つまたは複数のヒトＶＬおよび一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、一つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントである、請求項３９に記載の方法。
- 前記一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子が、一つまたは複数の齧歯類Ｃλ遺伝子である、請求項３９に記載の方法。
- 前記一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子が、一つまたは複数の齧歯類Ｃκ遺伝子である、請求項３９に記載の方法。
- 前記齧歯類が、外因性Ａｄａｍ６遺伝子を含む、請求項２５～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯類が、外因性ＴｄＴ遺伝子を含む、請求項２５～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 単離された齧歯類細胞または組織であって、そのゲノムが、
内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位にあるＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含み、
前記齧歯類がマウスまたはラットである、単離された齧歯類細胞または組織。 - 前記齧歯類細胞が、齧歯類ＥＳ細胞である、請求項４７に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
- 前記齧歯類細胞が、Ｂ細胞である、請求項４７に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
- 前記齧歯類細胞が、
一つまたは複数の齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結された、一つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、一つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および一つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および／または
一つまたは複数の齧歯類軽鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結された、一つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、一つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントとを含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖座位をさらに含む、請求項４７または４８に記載の単離された齧歯類細胞または組織。 - 請求項４７に記載の単離された細胞から樹立された不死の細胞株。
- 請求項４８に記載の齧歯類ＥＳ細胞を含む、齧歯類胚。
- 標的化核酸構築物であって、
ＮａＶ１．２タンパク質をコードする核酸分子を含み、
前記核酸が、相同組み換えを介在し、前記核酸分子を内因性齧歯類Ｓｃｎ９ａ座位内に組み込むことができる５’および３’齧歯類ヌクレオチド配列に隣接している、標的化核酸構築物。 - 抗－ＮａＶ１．７抗体を産生する方法であって、
免疫化齧歯類を生成するように、請求項１～２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変齧歯類をＮａＶ１．７免疫原で免疫化することと、
前記免疫化齧歯類を使用して前記抗－ＮａＶ１．７抗体を作製することと、を含む、方法。 - 前記ＮａＶ１．７免疫原が、ヒトＮａＶ１．７免疫原であり、前記抗－ＮａＶ１．７抗体が、抗ヒトＮａＶ１．７抗体である、請求項５３に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．７免疫原が、ヒトＮａＶ１．７タンパク質である、請求項５３に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮａＶ１．７免疫原が、ヒトＮａＶ１．７ ＤＮＡである、請求項５４に記載の方法。
- 抗ヒトＮａＶ１．７抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項５４に記載の方法によって作製された、抗ヒトＮａＶ１．７抗体を産生するハイブリドーマ。
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