ES2667169T3 - Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética - Google Patents
Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética Download PDFInfo
- Publication number
- ES2667169T3 ES2667169T3 ES14163635.7T ES14163635T ES2667169T3 ES 2667169 T3 ES2667169 T3 ES 2667169T3 ES 14163635 T ES14163635 T ES 14163635T ES 2667169 T3 ES2667169 T3 ES 2667169T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mouse
- cells
- embryo
- cell
- donor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title description 53
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title description 53
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title description 53
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 147
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 16
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 claims description 15
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 101100317378 Mus musculus Wnt3 gene Proteins 0.000 claims 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 101100373143 Drosophila melanogaster Wnt5 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 187
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 100
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 52
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 42
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 40
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 102100033553 Delta-like protein 4 Human genes 0.000 description 4
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 description 4
- -1 Wnt3a Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101150010310 WNT-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150109862 WNT-5A gene Proteins 0.000 description 2
- 101150019524 WNT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000052556 Wnt-2 Human genes 0.000 description 2
- 108700020986 Wnt-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000052548 Wnt-4 Human genes 0.000 description 2
- 108700020984 Wnt-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000043366 Wnt-5a Human genes 0.000 description 2
- 108700020483 Wnt-5a Proteins 0.000 description 2
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 2
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 2
- 101100485097 Xenopus laevis wnt11b gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 2
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 108700029631 X-Linked Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700029634 Y-Linked Genes Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000144987 brood Species 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/02—Cells from transgenic animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un método para generar un embrión de ratón que comprende: (a) introducir una célula donante de ratón en un embrión de ratón huésped en pre-mórula, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES de un ratón endógamo, y (b) cultivar el embrión de ratón huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadio de blastocisto, en donde al menos el 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética
Antecedentes
Campo de la invención
La invención se refiere a métodos mejorados para generar un animal homocigótico para una modificación genética. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos para aumentar la eficiencia de generación de animales capaces de transmitir una modificación deseada a su descendencia posterior, para generar animales que tienen una alta contribución de material genético de células donantes, y para aumentar la eficiencia y disminuir el tiempo necesario para generar animales homocigóticos que porten la modificación genética deseada.
Descripción de la técnica relacionada
Se conocen en la técnica métodos para modificar células donantes eucarióticas. Véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos N° 6.586.251. También se conocen en la técnica métodos para generar animales transgénicos. En Yagi et al. (1993) Analytical Biochemistry 214: 70-76 se describe un método propuesto para mejorar la eficiencia en la generación de animales capaces de transmitir una modificación deseada en células ES TT2.
Breve sumario de la invención
La invención se basa en parte en la realización de que la introducción de una célula modificada en un embrión huésped en estadio temprano aumenta sustancialmente el material genético y la contribución celular de las células donantes al embrión huésped, de tal forma que el animal producido tiene una fracción incrementada de células del donante y por tanto tienen una probabilidad aumentada de transmitir la modificación a través de la línea germinal. Además, los métodos de la invención permiten emplear un intervalo más amplio de células donantes de lo que se practicaba con los métodos de la técnica anterior. Los métodos de la presente invención por tanto reducen el número de animales y cruzamientos necesarios para generar un animal homocigótico para una modificación.
La invención proporciona un método para generar un embrión de ratón que comprende (a) introducir una célula donante de ratón en un embrión huésped de ratón en pre-mórula, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES procedentes de un ratón endógamo; y (b) cultivar el embrión de ratón huésped en premórula de (a) hasta el estadio de blastocisto, en donde al menos un 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.
La invención proporciona adicionalmente un cultivo, que comprende: a) un embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide, en el que el embrión de ratón quimérico comprende una célula ES de ratón donante modificado genéticamente y en el que un ratón generado a partir del embrión de ratón quimérico tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante; b) un primer componente que comprende un primer medio adecuado para cultivar una célula ES de ratón; y c) un segundo componente que comprende un segundo medio que comprende una proteína Wnt 3 o Wnt3a de la familia Wnt producida por células L de ratón.
La invención proporciona además un método para realizar el cultivo de la invención, que comprende: a) sembrar en placas células L de ratón que expresan y secretan Wnt3 o Wnt3a, una proteína de la familia Wnt en un medio adecuado para cultivar células L de ratón; b) cultivar las células L de ratón de la etapa (a) hasta su confluencia; c) recoger las células L de la etapa (b) y volver a sembrar aproximadamente 10 % de las células L recogidas y cultivar las células L que se han vuelto a sembrar en el medio adecuado para cultivar células L de ratón de la etapa (a) para producir un medio acondicionado por células L de ratón; d) recoger el medio acondicionado de (c); e) combinar el medio recogido de (d) con un volumen aproximadamente igual de un medio de cultivo de embrión de ratón adecuado para cultivar una célula ES de ratón que comprende KSOM de reemplazo de suero y aminoácidos no esenciales; y f) cultivar un embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide en el medio combinado de (e), en donde el embrión de ratón quimérico comprende una célula ES de ratón donante modificada genéticamente y en donde un ratón generado a partir del embrión de ratón quimérico tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante.
La invención proporciona adicionalmente un método para preparar un ratón a partir de una célula ES donante que comprende: (a) cultivar un embrión hospedador en estadio de premórula que comprende una célula ES donante de una cepa endógama en medio de cultivo hasta estadio de blastocisto en un medio, en el que el medio comprende: (i) un componente que comprende un medio adecuado para cultivar una célula ES de ratón; y (ii) un componente que comprende un medio que comprende Wnt3 o Wnt3a producido por células L de ratón; (b) transferir el embrión en estadio de blastocisto a una madre subrogada; y (c) gestar el embrión en estadio de blastocisto en la madre subrogada, en el que un ratón generado a partir del embrión en estadio de blastocisto tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante.
La invención proporciona además un método para preparar un ratón de una célula ES donante que comprende: (a)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cultivar un embrión huésped en estadio de premórula que comprende una célula ES donante de una cepa endógama en medio de cultivo hasta estado de blastocisto en un medio de cultivo de embrión; (b) transferir el embrión en estadio de blastocisto a una madre subrogada; y (c) gestar el embrión en estadio de blastocisto en la madre subrogada, en el que un ratón generado a partir del embrión en estadio de blastocisto tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante.
En un primer aspecto, se describe en el presente documento un método para generar un mamífero modificado, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadio temprano; y (b) introducir el embrión de (a) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero modificado. El embrión en estadio temprano es una célula en estadio pre-mórula. En una realización más específica, el embrión en estadio temprano es un embrión de 8 células. El embrión en estadio temprano puede derivarse de cualquier cepa. En una realización, se emplea un embrión endógamo, por ejemplo C57BL/6, como embrión huésped. En otra realización, se emplea un embrión exógamo, por ejemplo Swiss Webster, como embrión huésped.
La célula donante eucariótica es una célula madre. Más específicamente, la célula madre es una célula madre embrionaria (ES) o una célula de tipo ES. Pueden emplearse células ES de cualquier línea celular ES adecuadas en el método descrito en el presente documento. En una realización, la célula ES se deriva de una cepa endógama, por ejemplo, 129, C57BL/6 o BalbC. En otra realización, la célula ES se deriva de una cepa híbrida, por ejemplo, C57BL/6 x 129. En una realización específica, la célula es una célula ES de ratón. Sin embargo, el método descrito en el presente documento, puede practicarse con células derivadas de otros mamíferos, por ejemplo, una célula ES o tipo ES de rata. En una realización, la célula ES o tipo ES es una célula modificada que comprende una modificación genética. En una realización más específica, la modificación puede surgir espontáneamente, puede ser al azar, puede ser el resultado de una manipulación experimental, por ejemplo, mediante la introducción de un ácido nucléico exógeno. Se puede introducir un ácido nucléico exógeno mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por recombinación homóloga.
En un segundo aspecto, en el presente documento se describe un método para generar un mamífero homocigótico para una modificación genética, que comprende: (a) introducir una célula femenina donante eucariótica en un embrión huésped en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica es heterocigótica para la modificación genética; (b) mantener al embrión de (a) en cultivo para desarrollo posterior; (c) introducir al embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero hembra modificado; (a') introducir una célula masculina donante eucariótica en un embrión huésped en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica es heterocigótica para la modificación genética; (b') mantener al embrión de (a') en cultivo para desarrollo posterior; (c') introducir el embrión de (b') en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero macho modificado; y (d) cruzar al macho y hembra sexualmente maduros de (c y c'), en donde se genera un mamífero homocigótico para la modificación genética.
En un aspecto, la célula femenina donante eucariótica de la etapa (a) se deriva de la misma línea celular que la célula masculina donante eucariótica de la etapa (a'). En un aspecto más específico, la célula femenina donante eucariótica de la etapa (a) es una célula XO y el mamífero hembra modificado de la etapa (c) es un mamífero XO.
La célula donante eucariótica masculina o femenina es una célula madre, preferentemente una célula ES o tipo ES heterocigótica. En un aspecto, la célula ES heterocigótica se genera mediante (i) la obtención de un fragmento genómico elongado clonado que contiene una secuencia de interés de ADN; (ii) el uso de recombinación homóloga bacteriana para modificar genéticamente el fragmento genómico elongado clonado de (i) para crear un vector de elongación orientado para usarlo en células eucarióticas donantes (LTVEC, o vector de elongación orientado); (iii) la introducción del LTVEC de (ii) en las células donantes eucarióticas para modificar un gen endógeno o locus cromosómico en las células donantes eucarióticas; y (iv) emplear un ensayo cuantitativo para detectar la modificación de alelos en las células donantes eucarióticas de (iii) para identificar a aquellas células donantes eucarióticas en las cuales el gen endógeno o locus cromosómico se ha modificado genéticamente.
En varios aspectos, las condiciones de cultivo de la etapa (b) y/o (b') permiten al embrión desarrollarse hasta un estadio post-mórula o posterior. En un aspecto, las condiciones de cultivo de la etapa (b) y/o (b') se proporcionan con un medio de cultivo condicionado por un factor de crecimiento. En un aspecto preferido, el factor de crecimiento es una proteína de la familia de Wnt. En un aspecto, la proteína Wnt se añade directamente al medio de cultivo. En otro aspecto, la proteína Writ se produce por células L de ratón. En otro aspecto más, el medio de cultivo comprende un factor inhibidor de leucemia (LIF).
En un aspecto específico, un embrión en estadio de blastocisto de (b) y/o (b') se introduce en una madre subrogada para la gestación y desarrollo posterior.
La célula donante eucariótica puede introducirse en un embrión en estadio temprano mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la célula donante eucariótica se introduce bajo la zona pelúcida del embrión en estadio temprano. Otras metodologías incluyen la retirada de la membrana de la zona pelúcida. En una realización más específica, la célula donante eucariótica puede introducirse bajo la zona pelúcida mediante inyección u otros métodos que creen una abertura en la zona pelúcida. En una realización específica, se genera una abertura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en la zona pelúcida mediante un láser. En una realización, el láser comprende un láser diodo infrarrojo en estado sólido. En otra realización, la célula donante eucariótica se introduce en el embrión huésped mediante métodos de fusión celular.
En un aspecto, se cría en la etapa (d) un mamífero modificado que comprende más del 90 % de células derivadas de las células donantes. En un aspecto preferido, el mamífero modificado comprende más del 95 % de células derivadas de las células donantes. Más preferentemente, el mamífero modificado comprende el 100 % de células derivadas de las donantes.
En un tercer aspecto, se describe en el presente documento un método para generar un embrión homocigótico para una modificación genética, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica femenina en un embrión huésped en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica femenina es heterocigótica para la modificación genética; (b) mantener al embrión de (a) en cultivo para desarrollo posterior; (c) introducir el embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero hembra modificado; (a') introducir una célula donante eucariótica masculina en un embrión huésped en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica masculina es heterocigótica para la modificación genética; (b') mantener el embrión de (a1) en cultivo para desarrollo posterior; (c') introducir el embrión de (b') en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero macho modificado; y (d) cruzar al mamífero macho modificado con el mamífero hembra modificado de (c y c'), en donde se genera un embrión homocigótico para la modificación genética.
En un cuarto aspecto, se describe en el presente documento un método para generar un mamífero homocigótico para una modificación genética, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica es homocigótica para la modificación genética; (b) mantener al embrión de (a) en cultivo para desarrollo posterior; (c) introducir el embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero homocigótico para la modificación genética.
En un aspecto, el método para generar la célula donante eucariótica homocigótica para la modificación genética comprende una conversión génica, dirigiendo ambos alelos del mismo gen, o dirigiendo tanto un gen ligado a X- o a Y- en una célula ES masculina.
En un quinto aspecto, se describe en el presente documento un método para generar un embrión homocigótico para una modificación genética que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica es homocigótica para la modificación genética; y (b) cultivar el embrión en estadio temprano de la etapa (a), en donde se genera un embrión homocigótico para la modificación genética.
En un sexto aspecto se describe en el presente documento un método para aumentar la contribución relativa de material genético procedente de una célula donante eucariótica a un embrión huésped, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadio temprano; y (b) cultivar el embrión en estadio temprano de la etapa (a) en condiciones que permiten al embrión desarrollarse hasta un estadio post-mórula o posterior.
En un aspecto, las condiciones de cultivo de la etapa (b) permiten al embrión desarrollarse hasta el estadio de blastocisto. En otro aspecto, las condiciones de cultivo de la etapa (b) permiten al embrión desarrollarse hasta una gástrula o posterior. En varios aspectos, las condiciones de cultivo de la etapa (b) permiten al embrión desarrollarse hasta un estadio post-mórula o posterior. En un aspecto, las condiciones de cultivo de la etapa (b) se proporcionan con un medio condicionado por un factor de crecimiento. En una realización preferida, el factor de crecimiento es una proteína de la familia de Wnt. En un aspecto, la proteína Wnt se añade al medio de cultivo directamente. En otro aspecto, la proteína Wnt se introduce por células L. En otro aspecto más, el medio de cultivo comprende además un factor inhibidor de leucemia (LIF).
En un séptimo aspecto, en el presente documento se describe un método para generar un mamífero que tiene una contribución relativa aumentada de material genético de una célula donante eucariótica a un embrión huésped, que comprende: (a) introducir una célula eucariótica donante en un embrión en estadio temprano; (b) cultivar el embrión en estadio temprano de la etapa (a) en condiciones que permiten al embrión desarrollarse a un estadio de postmórula o posterior; y (c) introducir el embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero que tiene una fracción aumentada de células procedentes de la célula eucariótica donante.
En un octavo aspecto, se describe en el presente documento un método para generar un mamífero capaz de transmitir una modificación genética, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadio temprano, en donde la célula donante eucariótica porta una modificación genética; (b) cultivar el embrión en estadio temprano de la etapa (a) en condiciones que permitan al embrión desarrollarse hasta un estadio post-mórula o posterior; y (c) introducir el embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero capaz de transmitir la modificación genética.
En un noveno aspecto, se describe en el presente documento un mamífero modificado genéticamente generado
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mediante un método descrito en el presente documento. En un aspecto preferido, el 90 % o más de las células del mamífero son células derivadas de la célula donante; más preferentemente, el 95 % o más de las células del mamífero son células derivadas de la célula donante; aún más preferentemente, el 99 % o más de las células del mamífero son células derivadas de la célula donante. En una realización, el 100 % de las células del mamífero son células derivadas de la célula donante.
En un décimo aspecto se describe en el presente documento un embrión modificado genéticamente generado mediante un método de la invención. En un aspecto preferido, el 90 % o más de las células del embrión son células derivadas de la célula donante; más preferentemente, el 95 % o más de las células son células derivadas de la célula donante; aún más preferentemente, el 99 % o más de las células son células derivadas de la célula donante. En un aspecto, el 100 % de las células del embrión son células derivadas de la célula donante.
En un undécimo aspecto se describe en el presente documento un medio de cultivo para mantener y/o desarrollar un embrión en estadio temprano, en donde el medio de cultivo comprende un factor de crecimiento.
En un aspecto, el factor de crecimiento es una proteína de la familia de Wnt. La proteína de la familia de Wnt se selecciona del grupo que consiste en Wnt1, Wnt3a, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16. En una realización preferida, la proteína Wnt es Wnt3a. En un aspecto, la proteína Wnt es una proteína recombinante. En otro aspecto, el medio de cultivo se condiciona por células L de ratón productoras de Wnt.
En un aspecto, el medio de cultivo además comprende un agente de mantenimiento. En un aspecto, el agente de mantenimiento es un factor de inhibición de leucemia (LIF).
Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.
Descripción detallada
Antes de describir los métodos, constructos y animales transgénicos descritos en el presente documento, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a los métodos, constructos, animales transgénicos y condiciones experimentales descritas, ya que todos pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no se pretende que sean limitantes, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "uno" y "el", "la" incluyen referencias al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, por ejemplo, "una célula" incluye una pluralidad de células. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o las cuales sean evidentes para aquellos expertos en la técnica al leer esta divulgación.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden emplear cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento, en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos, constructos y materiales preferidos se describen a continuación.
Definiciones
El término "célula madre embrioide tipo ES" incluye una célula la cual, tras ser introducida en un embrión, puede contribuir en cualquier tejido del embrión en desarrollo.
Los términos "contribución aumentada", "mayor porcentaje relativo" y similares, incluyen una contribución de material genético mejorada de una célula donante eucariótica a un organismo resultante del desarrollo posterior de un embrión huésped modificado en estadio temprano. El método de la invención proporciona medios de aumentar la probabilidad de que las células introducidas en el embrión huésped contribuyan a todos los tejidos, incluyendo los tejidos de la línea germinal, del animal generado.
El término "knock-out génico" tal como se emplea en el presente documento significa una modificación genética resultante de la disrupción de la información genética codificada en un locus cromosómico. Por "knock-in génico" tal como se emplea en el presente documento se entiende una modificación genética resultante de un reemplazo de información genética codificada en un locus cromosómico con una secuencia de ADN distinta o la inserción de información genética exógena en un locus cromosómico. Por "animal knock-out" tal como se emplea en el presente documento se entiende un animal en el cual una proporción significativa de las células del animal portan un knock- out génico. Por "animal knock-in" tal como se emplea en el presente documento se entiende un animal en que una proporción significativa de las células del animal portan knock-in génico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Descripción general
Uno de los componentes deseados de un estudio con animales transgénicos es generar un animal transgénico modificado genéticamente capaz de transmitir la modificación genética a su progenie, es decir, un animal transgénico que comprende la modificación genética en su línea germinal. Los métodos actuales para crear tales animales transgénicos con capacidad de transmisión tienden a ser ineficientes en términos de recursos y tiempo empleado. Por ejemplo, para generar un animal transgénico modificado genéticamente capaz de transmitir la modificación genética a su progenie, se inyecta una célula ES modificada heterocigótica para una modificación genética deseada en un embrión blastocístico receptor, y el embrión receptor se implanta en una madre subrogada para la gestación y alumbramiento de la progenie transgénica. La progenie transgénica resultante es quimérica ya que algunos de los tejidos de la progenie se derivan de las células ES inyectadas mientras que otros tejidos de la progenie se derivan de las células procedentes del embrión receptor. Debido a este quimerismo, las células ES inyectadas que comprenden la modificación genética pueden o no formar tejidos de la línea germinal en la progenie y ser capaces de transmitir la modificación genética a la generación siguiente. Para determinar si una quimera es capaz de transmitir la modificación genética, se debe cruzar la quimera con otro animal que no porte la misma modificación genética para establecer si la modificación deseada se transmite a la progenie resultante (F1). La detección de la modificación genética deseada en la progenie F1 del cruce entre la quimera y el otro animal establece que la quimera porta la modificación genética deseada en su línea germinal y es capaz de transmitir la modificación a su progenie (transmisión de la línea germinal). Típicamente, aproximadamente el 50 % de las quimeras exhiben transmisión por la línea germinal, El color del pelaje es el marcador que se emplea con más frecuencia del alcance de la contribución de la célula ES a la quimera y la transmisión del contenido genético de la célula ES a la progenie F1.
La actual necesidad de generar una generación F1 para determinar si la quimera es capaz de transmitir la modificación genética es ineficiente y costosa en términos de tiempo y de costes de cría y mantenimiento de la progenie F1. Se proporciona un método para mejorar la eficiencia del proceso para generar animales transgénicos mediante la presente invención la cual permite la introducción, en embriones en pre-mórula, de células que generan animales que tienen una contribución aumentada de material genético de las células exógenas en relación a los resultados obtenidos cuando las células donantes se introducen en embriones en estadios posteriores, por ejemplo, blastocistos. Como resultado, un porcentaje mucho mayor de los animales de F0 son transmisores de la línea germinal. En muchos casos los animales de F0 son transmisores al 100 % en la línea germinal y por tanto esos animales de F0 pueden transmitir los materiales de las células ES a toda su descendencia.
Introducir células donantes en embriones en estadios tempranos, por ejemplo, embriones de 8 células, proporciona varios beneficios importantes respecto de los métodos actuales, que enseñan el uso de embriones huésped en estadios posteriores, por ejemplo, blastocistos. Tal como se muestra en el Ejemplo 1 a continuación, el número de embriones en estadio temprano recolectados de una madre donante (por ejemplo, un ratón BL/6 hembra) es mayor que el número de embriones en estadios posteriores recolectados. Por tanto, se necesitan menos ratones hembra preñados como donantes, disminuyendo el coste de obtención y mantenimiento de ratones hembra preñados.
Además, tal como se muestra a continuación, las células donantes pueden introducirse en un número menor de embriones en estadios tempranos que en los embriones en estadios posteriores para generar el mismo número de animales quiméricos, reduciendo el tiempo y coste de introducción de células donantes en embriones, por ejemplo, cuando la introducción se efectúa mediante microinyección, la cantidad de tiempo empleada en las microinyecciones se reduce en gran medida.
La presente invención también permite cultivar el embrión huésped que contiene a la célula donante hasta estadios post-mórula, por ejemplo, hasta un estadio de blastocisto o un estadio de gástrula, antes introducirlos en una madre subrogada para la gestación. Ya que las condiciones de cultivo in vitro son más favorables para las células donantes que para el embrión huésped, el embrión resultante tiene un contenido mayor de células derivadas de las células donantes en comparación con el método mediante el cual el embrión huésped en estadio de mórula se introduce en una madre subrogada para la gestación.
Una mejora importante proporcionada por la presente invención es que el número de animales generados que son capaces de transmitir el ADN donante aumenta sustancialmente con el uso de embriones huésped en estadios tempranos, de tal forma que se elimina una generación entera de cría. Esto es una mejora práctica significativa con implicaciones comerciales importantes.
Un método conocido en la técnica que permite eliminar una generación entera de cría emplea embriones tetraplontes como receptores de las células donantes modificadas. Ya que las células tetraploides del embrión receptor son incapaces de contribuir a los tejidos del animal en desarrollo, los animales que nacen se derivan completamente de las células donantes modificadas. Si los animales resultantes no tienen una modificación genética que afecte a la fertilidad, serán capaces de transmitir la modificación genética deseada a su progenie tras el emparejamiento. Este proceso es laborioso e ineficiente, produciendo una pequeña fracción de animales nacidos vivos únicamente a partir de líneas celulares ES híbridas. Las inyecciones de células bajo la zona pelúcida de los embriones diploides en estadio de pre-mórula producen una supervivencia aumentada y una generación de un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
número mayor de animales vivos derivados completamente o prácticamente por completo de células ES. Se pueden obtener machos y hembras mediante este método.
El método de la invención puede aplicarse para introducir células ES endógamas en embriones receptores exógamos mediante microinyección.
Otras características de la invención serán evidentes en el transcurso de las siguientes descripciones de realizaciones ejemplares, las cuales se proporcionan a modo de ilustración de la invención y que no pretenden ser limitativas de la misma.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la técnica ejemplos de cómo efectuar y emplear los métodos, composiciones y animales de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión respecto de los números empleados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se pueden esperar algunas desviaciones experimentales como es conocido para un experto en la técnica. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es próxima a o la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de animales transmisores de la línea germinal
Los embriones para la inyección se obtuvieron a partir de cruzamientos naturales donde la mañana de la implantación se designó a los 0,5 días p.c (post coitus). Se recogieron los oviductos de las hembras implantadas 2,5 días p.c. y se irrigaron con medio de Dulbecco para recolectar embriones de 8 células. Los embriones se mantuvieron en este medio para su cultivo (en un incubador a 37 °C al 5 % de CO2) y para los procedimientos de microinyección.
La inyección de los embriones de 8 células se realizó empleando técnicas estándar de microinyección excepto en que antes de la introducción de células ES, se generó un agujero en la zona pelúcida del embrión de 8 células utilizando un sistema láser XYClone según las instrucciones del fabricante. La aguja de inyección se inserta a través de este agujero y se depositan entre 6 y 10 células ES en el espacio perivitelino.
Los embriones inyectados se transfirieron a una placa de cultivo con KSOM+AA y se cultivaron durante la noche hasta el estadio de blastocisto. Los embriones supervivientes se transfirieron como blastocistos a hembras subrogadas en la tarde del día siguiente (3,5 días p.c).
Ejemplo 2. Generación de un ratón “knock-out” homocigótico para DLL4
Tal como se describe anteriormente se microinyectaron células ES knock-out homólogas para DLL4 en un embrión de ratón de 8 células. Los embriones inyectados se cultivaron hasta el estadio de blastocisto y se transfirieron a una hembra subrogada para su gestación. Todos los embriones knock-out para DLL4 murieron durante la gestación. La causa de la muerte fue idéntica a la observada en embriones producidos mediante el cruzamiento convencional de ratones heterocigóticos. La observación de la ausencia de fenotipo nulo en DLL en la generación F0 evitó el cruzamiento de dos generaciones que normalmente se requiere para generar ratones con fenotipo nulo en DLL4.
Ejemplo 3. Generación de ratones con modificaciones genéticas de F0 altamente y totalmente derivados de células ES
Las células masculinas ES genéticamente modificadas de la F1 H4 se microinyectaron en embriones C57BL/6, tanto de 8 células como en blastocisto. Los embriones blastocísticos microinyectados se trasfirieron a una hembra subrogada inmediatamente después de la inyección. Los embriones de 8 células microinyectados se cultivaron además en medio de cultivo KSOM+AA hasta el estadio de blastocisto y se transfirieron a una hembra subrogada para la gestación. Los porcentajes de contribución de las células ES se estimaron por el color del pelaje de los ratones macho de F0. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Tal como se muestra, cuando las células ES modificadas genéticamente se microinyectaron en embriones de 8 células, todos los ratones de F0 se derivan de células ES. Por otro lado, cuando las células modificadas genéticamente se microinyectaron en embriones en estadio de blastocisto, ninguno de los machos de F0 se derivaron completamente de la células ES y solo aproximadamente la mitad de los ratones macho de F0 (2 de 4 y 4 de 7 para 494B-F5 Y 1218X-E2, respectivamente) tienen más del 90 % de células derivadas de células ES.
5
10
15
20
25
30
35
- Embriones Número de crías N° de ratones macho de F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Línea celular ES
- Estadio N° Total Machos < 50% 50% al 80% 90 % > 90 % 100 %
- 494B-F5
- 8 células 33 11 11 0 0 0 0 11
- 494B-F5
- Blastocisto 20 5 4 0 0 2 2 0
- 1218X-E2
- 8 células 50 6 6 0 0 0 0 6
- 1218X-E2
- Blastocisto 36 7 4 0 0 0 4 0
- *Los porcentajes de contribución de células ES se estimaron por el color del pelaje de los ratones de F0.
Se emplearon más líneas celulares ES para ensayar el efecto del estadio del embrión huésped (8 células vs. blastocisto) sobre la contribución de la célula ES en el ratón macho de F0 resultante. Se obtuvieron resultados similares y se resumen en la Tabla 2 (* Los porcentajes de contribución de células ES se estimaron mediante el color del pelaje de los ratones de F0).
Tabla 2
- Embriones Número de crías N° de ratones macho de F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Línea celular ES
- Estadio N° Total Machos < 50% 50% al 80% 90 % > 90 % 100 %
- F1H4 parental
- 8 células 120 34 30 3 0 0 0 27
- F1H4 parental
- Blastocisto 125 24 20 5 1 2 12 0
- 609B-G2
- 8 células 50 17 15 2 0 0 0 13
- 609B-G2
- Blastocisto 50 21 16 1 0 1 14 0
- 698B-A8
- 8 células 25 5 4 1 0 0 1 2
- 698B-A8
- Blastocisto 25 9 6 3 3 0 0 0
- 639C-A9
- 8 células 37 12 11 1 0 0 0 10
- 639C-A9
- Blastocisto 25 7 7 0 0 0 7 0
- 619A-A1
- 8 células 25 12 11 1 0 0 0 10
- 619A-A1
- Blastocisto 25 7 6 0 0 0 6 0
- 576A-E11
- 8 células 25 12 10 1 0 0 0 9
- 576A-E11
- Blastocisto 25 21 16 2 1 1 12 0
Ejemplo 4. Generación de ratones hembra de F0 elevadamente y completamente derivados de células ES
Se microinyectaron células ES XO modificadas genéticamente (clon 648B-H12) en embriones C57BL/6 tanto en estadio de 8 células como de blastocisto. Los embriones blastocísticos microinyectados se transfirieron a una hembra subrogada para la gestación inmediatamente después de la inyección. Los embriones de 8 células microinyectados se cultivaron posteriormente en medio de cultivo KSOM+AA hasta el estadio de blastocisto y posteriormente se transfirieron a una hembra subrogada para la gestación. Los porcentajes de contribución de células ES en los ratones hembra de F0 se estimaron por el color de su pelaje. Como se muestra en la Tabla 3, cuando las células ES XO modificadas genéticamente se microinyectaron en embriones de 8 células, todas las quimeras fueron hembras. Cuando las células ES modificadas se microinyectaron en embriones en estadio de blastocisto, únicamente 7 ratones F0 de un total de 16 para 648B-H12 y 11 ratones de F0 de un total de 16 para 648C-H1 fueron hembras (* El porcentaje de contribución de células ES se determinó por el color del pelaje de los ratones F0).
Tabla 3
- Embriones SW Crías N° de quimeras N° de ratones hembra de F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Clon XO
- Estadio N° N° Total Hembras <90% >90% 100%
- 648B-H12
- 8 células 50 13 13 13 0 0 13
- 648B-H12
- Blastocisto 50 28 16 7 1 6 0
- 648C-H1
- 8 células 50 6 6 6 0 0 6
- 648C-H1
- Blastocisto 50 27 16 11 1 10 0
Ejemplo 5. Generación de ratones de F0 completa y totalmente derivados de células ES empleando embriones huésped endógamos y exógamos
Se microinyectaron células ES masculinas endógamas (C57BL/6) o híbridas (F1 H4) en embriones Swiss Webster (SW) tanto en estadio de 8 células como estadio de blastocisto. Los embriones blastocísticos microinyectados se transfirieron a una hembra subrogada para la gestación inmediatamente después de la inyección. Los embriones de 8 células microinyectados se cultivaron posteriormente en medio de cultivo KSOM+AA hasta el estadio de blastocisto y se transfirieron a continuación a una hembra subrogada para la gestación. Los resultados se resumen en la Tabla 4 (* Los porcentajes de contribución de células ES se estimaron por el color del pelaje de los ratones de F0).
5
10
15
20
25
30
35
40
- Embriones SW N° de crías N° de ratones macho F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Células ES
- Estadio N° Total Machos <90% >90% 100%
- F1H4
- 8 células 140 46 46 34 4 8
- F1H4
- Blastocisto 50 11 11 11 0 0
- C57/BL6.2
- 8 células 75 19 6 0 0 6
- C57/BL6.2
- Blastocisto 10 7 6 6 0 0
Se obtuvieron resultados similares cuando se microinyectaron células ES masculinas endógamas 129 (CJ7) y Balb/c en embriones huésped endógamos C56BL/6 tanto en estadio de 8 células como de blastocisto. Los resultados se resumen en la Tabla 5 (* Los porcentajes de contribución de células ES se estimaron por el color del pelaje de los ratones de F0).
Tabla 5
- Embriones C56B/6 N° de crías N° de ratones macho de F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Células ES
- Estadio N° Total Machos <90% >90% 100%
- 129(CJ7)
- 8 células 57 8 8 3 0 5
- 129(CJ7)
- Blastocisto 50 18 14 4 10 0
- Balb/c
- 8 células 50 11 11 5 0 6
- Balb/c
- Blastocisto 57 8 1 1 0 0
Ejemplo 6. Los ratones de F0 altamente y totalmente derivados de células ES son competentes en la transmisión de la línea germinal
Los ratones macho de F0 derivados de F1H4 que tenían más del 90 % de células derivadas de células ES (más del 90 % de contribución de células ES) se emplearon para ensayar la competencia de transmisión de la línea germinal. Empleando células ES masculinas, los ratones macho de F0 sexualmente maduros se cruzaron con hembras sexualmente maduras. El color del pelaje de la descendencia se empleó como marcador para evaluar la competencia de transmisión por la línea germinal. Los resultados se resumen en la Tabla 6. Cuando se emplearon embriones en estadio de 8 células como embriones huésped, más del 95 % (51 de 53) de los machos de F0 generados mediante microinyección en 8 células mostraron un 100 % de competencia de transmisión de la línea germinal. Cuando se emplearon embriones en estadio de blastocisto como embriones huésped, únicamente alrededor del 64 % (57 de 89) de los machos de F0 mostraron un 100 % de competencia de transmisión de la línea germinal. Además, aproximadamente el 21 % (19 de 89) de los machos de F0 generados por microinyección en blastocisto no produjeron ninguna descendencia en comparación con menos del 4 % (2 de 53) de los machos de F0 generados por microinyección en 8 células sin descendencia (** Los porcentajes de competencia de transmisión de la línea germinal se estimaron por el color del pelaje de la descendencia correspondiente).
Tabla 6
- Estadio del embrión Huésped
- N° de machos de F0 criados N° de machos de F0 que mostraron varios porcentajes de competencia en la transmisión por la línea germinal** N° de machos de F0 sin descendencia
- 100%
- Parcial Cero
- 8 células
- 53 51 0 0 2
- Blastocisto
- 89 57 9 4 19
Ejemplo 7. Efecto del medio de cultivo post-microinyección en la calidad de los ratones de F0
Se microinyectaron células masculinas de C57BL/6 y F1 H4 modificadas en embriones Swiss Webster (SW) en estadio de 8 células. Los embriones microinyectados se cultivaron en distintos medios de cultivo hasta el estadio de blastocisto y se transfirieron posteriormente a una hembra subrogada para la gestación. Se emplearon tres medios de cultivo distintos: (1) KSOM, medio de cultivo para embriones de ratón; (2) LIF, medio de cultivo para células ES que contiene LIF; (3) Wnt3, medio de cultivo para células ES condicionado con Wnt3. Los resultados se resumen en la Tabla 7. El medio para ES condicionado con Wnt3 se produjo de la siguiente forma: (i) se sembraron células L de ratón en un flask (frasco de Roux) T75 en un medio preparado con DMEM alto en glucosa, FBS 10 % y L-glutamina, y se incubaron a 37 °C, con CO2 5 %; (ii) cuando la densidad de células alcanzó una confluencia del 100 %, se resembró un 10 % de las células en otro flask T75; (iii) se recogió el medio de cultivo hasta que la densidad de células alcanzó de nuevo la confluencia (aproximadamente 3 días después de la resiembra); y finalmente, (iv) el medio de cultivo recogido se mezcló con un volumen igual de medio de cultivo para células ES sin LIF pero con sustitución de suero (* los porcentajes de contribución de células ES se estimaron por el color del pelaje de los ratones de F0).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
- Células ES
- Medio de cultivo N° de embriones transferidos N° de crías N° de ratones macho de F0 con diversos porcentajes de contribución de células ES*
- Total
- Machos <100% 100%
- F1H4
- KSOM 140 55 45 37 8
- F1H4
- LIF 40 8 8 3 5
- F1H4
- Wnt3 40 9 9 2 7
- C57BL/6.2
- KSOM 75 16 16 10 6
- C57BL/6.2
- LIF 38 10 10 5 5
- C57BL/6.2
- Wnt3 38 11 11 0 11
Se obtuvieron resultados similares cuando se microinyectaron células de F1 H4 masculinas modificadas en embriones ES C57BL/6 de 8 células.
Ejemplo 8. Generación de animales homocigóticos para una modificación genética a partir de células ES heterocigóticas
Se microinyectan células ES masculinas heterocigóticas para una modificación genética deseada en un embrión de ratón de 8 células como se describe en el Ejemplo 1. Las células ES femeninas derivadas de las misma línea celular ES que las masculinas, y heterocigóticas para la misma modificación genética se microinyectan en otro embrión de ratón de 8 células como se describe anteriormente. Ambos embriones se cultivan hasta el estadio de blastocisto y se transfieren a una hembra subrogada para la gestación, Los machos y hembras resultantes de F0 transmisores de la línea germinal se cruzan para obtener progenie homocigótica para la modificación genética deseada. Se cruzan dos parejas de ratones. Nacieron un total de 39 crías y 9 de ellas eran homocigóticas para la modificación genética. Aspectos adicionales descritos en el presente documento:
A. Un método para generar un mamífero homocigoto para una modificación genética, que comprende:
(a) introducir una célula donante eucariota hembra en un embrión hospedador en estadio temprano, en el que la célula donante eucariota es una célula madre embrionaria (ES) o una célula de tipo ES heterocigota para la modificación genética;
(b) cultivar el embrión de (a) hasta el estadio de blastocisto;
(c) introducir el embrión de (b) en una madre sustituta para gestación, en la que se genera un mamífero hembra modificado que tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula donante hembra;
(a') introducir una célula donante eucariota macho en un embrión hospedador en estadio temprano, en el que la célula donante eucariota es una célula madre embrionaria (ES) o una célula de tipo ES heterocigota para la modificación genética;
(b') cultivar el embrión de (a') hasta el estadio de blastocisto;
(c') introducir el embrión de (b') en una madre sustituta para gestación, en la que se genera un mamífero macho modificado; y
(d) reproducir un mamífero macho modificado sexualmente maduro y un mamífero hembra modificado sexualmente maduro de (c y c'), en el que se genera un mamífero homocigoto para la modificación genética.
B. El método del artículo A, en el que la célula donante eucariota hembra de la etapa (a) se obtiene de la misma línea celular de la célula donante eucariota macho de la etapa (a').
C. El método del artículo A, en el que la célula donante eucariota hembra de la etapa (a) es una célula XO y el mamífero hembra modificado de la etapa (c) es un mamífero XO.
D. El método del artículo A, en el que la célula es una célula ES de una cepa endógama o una cepa híbrida.
E. El método del artículo D, en el que la cepa endógama se selecciona del grupo que consiste en 129, C57BL/6 o BalbC.
F. El método del artículo D, en el que la cepa híbrida es C57BL/6x129.
G. El método del artículo A, en el que la célula modificada genéticamente se genera:
(a) obteniendo un fragmento genómico clonado grande que contiene una secuencia de ADN de interés;
(b) usando recombinación homóloga bacteriana para modificar genéticamente el fragmento clonado grande de (a) para crear un vector de dirección grande para su uso en las células donantes eucariotas (LTVEC):
(c) introduciendo las LTVEC de (b) en las células donantes eucariotas para modificar el gen endógeno o locus cromosómico en las células; y
(d) usando un ensayo cuantitativo para detectar la modificación del alelo en las células donantes eucariotas de (c) para identificar las células donantes en las que el gen endógeno o locus cromosómico se ha
5
10
15
20
25
30
35
40
modificado genéticamente.
H. El método del artículo A, en el que el embrión hospedador comprende un embrión endógamo de la cepa C57BL/6 o un embrión exogámico de la cepa Swiss Webster.
I. El método del artículo A, en el que el cultivo de la etapa (b) y/o (b') está condicionado por un factor de crecimiento.
J. El método del artículo I, en el que el factor de crecimiento es una proteína de la familia Wnt.
K. El método del artículo J, en el que la proteína de la familia Wnt es Wnt3a.
L. El método del artículo A, en el que la célula donante eucariota se introduce en el embrión hospedador a través de una apertura en la zona pelúcida.
M. El método del artículo L, en el que la apertura se crea por un láser.
N. Un método para generar un embrión homocigoto para una modificación genética, que comprende:
(a) introducir una célula donante eucariota hembra en un embrión hospedador en estadio temprano, en el que la célula donante eucariota hembra es heterocigota para la modificación genética;
(b) cultivar el embrión de la etapa (a) hasta el estadio de blastocisto;
(c) introducir el embrión de (b) en una madre sustituta para gestación, en la que se genera un mamífero hembra modificado que tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula donante hembra:
(a') introducir una célula donante eucariota macho en un embrión hospedador en estadio temprano, en el que la célula donante eucariota es heterocigota para la modificación genética;
(b') cultivar el embrión de la etapa (a') hasta el estadio de blastocisto;
(c') introducir el embrión de (b') en una madre sustituta para gestación, en la que se genera un mamífero macho modificado; y
(d) reproducir un mamífero macho modificado sexualmente maduro y un mamífero hembra modificado sexualmente maduro de (c y c'), en el que se genera un embrión homocigoto para la modificación genética y en el que la célula donante eucariota homocigota para la modificación genética se genera por conversión génica, dirigiéndose a ambos alelos del mismo gen, o dirigiéndose a gen ligado a X o Y en una célula ES macho.
O. Un medio de cultivo para mantener y/o cultivar un embrión en estadio temprano, en el que el medio de cultivo comprende un factor de crecimiento, en el que el embrión en estadio temprano es un estadio de premórula o un embrión de 8 células, el factor de crecimiento es una proteína de la familia Wnt seleccionado del grupo que consiste en Wnt1, Wnt3a, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt6, Wnt7a, Wnt7a, Wnt8a, Wnt9a, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16.
Claims (14)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un método para generar un embrión de ratón que comprende:(a) introducir una célula donante de ratón en un embrión de ratón huésped en pre-mórula, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES de un ratón endógamo, y(b) cultivar el embrión de ratón huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadio de blastocisto,en donde al menos el 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.
- 2. El método de la reivindicación 1, que además comprende introducir el embrión de (b) en una madre ratón subrogada para la gestación.
- 3. El método de acuerdo con una reivindicación 1 o 2, en donde (i) al menos el 95 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes, o (ii) al menos el 99 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.
- 4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el embrión de ratón huésped en pre-mórula:(i) es un embrión diploide; y/o(ii) es procedente de una cepa endógama o una cepa exógama; y/o(iii) es un embrión en estadio de 8 células; y/o(iv) comprende una zona pelúcida, y en donde las células donantes de ratón se introducen en el embrión huésped de ratón a través de una abertura en la zona pelúcida; de manera opcional en donde la abertura se crea mediante un láser.
- 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cultivo de la etapa (b) se condiciona por un factor de crecimiento, opcionalmente una proteína de la familia de Wnt; preferentemente Wnt3a.
- 6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde las células donantes son células femeninas XO.
- 7. Un cultivo, que comprende:a) un embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide, en el que el embrión de ratón quimérico comprende una célula ES de ratón donante modificado genéticamente y en el que un ratón generado a partir del embrión de ratón quimérico tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante;b) un primer componente que comprende un primer medio adecuado para cultivar una célula ES de ratón; yc) un segundo componente que comprende un segundo medio que comprende Wnt 3 o Wnt3a producida por células L de ratón.
- 8. El cultivo de la reivindicación 7, en el que(i) Wnt3 se expresa a partir de un gen de Wnt3 añadido de forma exógena en las células L de ratón;(ii) Wnt3a se expresa a partir de un gen de Wnt3 añadido de forma exógena en las células L de ratón;(iii) el segundo medio comprende DMEM alto en glucosa, FBS 10 % y L-glutamina;(iv) el embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide comprende una zona pelúcida y la célula ES de ratón donante se ha introducido en el embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide a través de una apertura en la zona pelúcida; o(v) la célula ES de ratón es de una línea endógama.
- 9. Un método para realizar el cultivo de la reivindicación 7, que comprende:a) sembrar en placas células L de ratón que expresan y secretan Wnt3 o Wnt3a en un medio adecuado para cultivar células L de ratón;b) cultivar las células L de ratón de la etapa (a) hasta su confluencia;c) recoger las células L de la etapa (b) y volver a sembrar aproximadamente 10 % de las células L recogidas y cultivar las células L que se han vuelto a sembrar en el medio adecuado para cultivar células L de ratón de la etapa (a) para producir un medio acondicionado por células L de ratón;d) recoger el medio acondicionado de (c);e) combinar el medio recogido de (d) con un volumen igual de un medio adecuado para cultivar una célula ES de ratón que comprende reemplazo de suero; yf) cultivar un embrión en estadio de premórula de ratón quimérico diploide en el medio combinado de (e), en donde el embrión de ratón quimérico comprende una célula ES de ratón donante modificado genéticamente y en donde un ratón generado a partir del embrión de ratón quimérico tiene al menos 90 % de contribución celular de5101520253035la célula ES donante.
- 10. El método de la reivindicación 9, en el que el embrión de ratón en estadio de premórula quimérico es un embrión de ratón en estadio de 8 células.
- 11. Un método para realizar un ratón a partir de una célula ES donante que comprende:(a) cultivar un embrión hospedador en estadio de premórula que comprende una célula ES donante de una cepa endógama en medio de cultivo hasta estadio de blastocisto en un medio, en el que el medio comprende(i) un componente que comprende un medio adecuado para cultivar una célula ES de ratón; y(ii) un componente que comprende un medio que comprende Wnt3 o Wnt3a producido por células L de ratón;(b) transferir el embrión en estadio de blastocisto a una madre subrogada; y(c) gestar el embrión en estadio de blastocisto en la madre subrogada,en el que un ratón generado a partir del embrión en estadio de blastocisto tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante.
- 12. El método de la reivindicación 11, en el que(i) Wnt3 se expresa a partir de un gen de Wnt3 añadido de forma exógena en las células L de ratón;(ii) Wnt3a se expresa a partir de un gen de Wnt3a añadido de forma exógena en las células L de ratón; o(iii) las células L de ratón expresan y secretan Wnt3 o Wnt3a.
- 13. Un método para realizar un ratón a partir de una célula ES donante que comprende:(a) cultivar un embrión hospedador en estadio de premórula que comprende una célula ES donante de una cepa endógama en medio de cultivo hasta estadio de blastocisto en un medio de cultivo de embrión;(b) transferir el embrión en estadio de blastocisto a una madre subrogada; y(c) gestar el embrión en estadio de blastocisto en la madre subrogada,en el que un ratón generado a partir del embrión en estadio de blastocisto tiene al menos 90 % de contribución celular de la célula ES donante.
- 14. El método de la reivindicación 13, en el que el medio de cultivo de embrión es KSOM.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61999904P | 2004-10-19 | 2004-10-19 | |
US619999P | 2004-10-19 | ||
US68919205P | 2005-06-10 | 2005-06-10 | |
US689192P | 2005-06-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2667169T3 true ES2667169T3 (es) | 2018-05-09 |
Family
ID=35511302
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES14163635.7T Active ES2667169T3 (es) | 2004-10-19 | 2005-10-19 | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética |
ES05807480.8T Active ES2463476T3 (es) | 2004-10-19 | 2005-10-19 | Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES05807480.8T Active ES2463476T3 (es) | 2004-10-19 | 2005-10-19 | Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US7294754B2 (es) |
EP (2) | EP1802193B1 (es) |
JP (1) | JP5252922B2 (es) |
AU (1) | AU2005295269B2 (es) |
CA (2) | CA2827654C (es) |
CY (1) | CY1120496T1 (es) |
DK (2) | DK1802193T3 (es) |
ES (2) | ES2667169T3 (es) |
HK (1) | HK1200269A1 (es) |
PL (2) | PL2767161T3 (es) |
PT (2) | PT2767161T (es) |
SI (1) | SI1802193T1 (es) |
WO (1) | WO2006044962A1 (es) |
Families Citing this family (168)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2667169T3 (es) * | 2004-10-19 | 2018-05-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética |
US7740159B2 (en) * | 2006-08-02 | 2010-06-22 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Pneumatically powered surgical cutting and fastening instrument with a variable control of the actuating rate of firing with mechanical power assist |
TWI476280B (zh) * | 2008-03-07 | 2015-03-11 | Regeneron Pharma | 來自二倍體宿主胚胎注射之es-細胞衍生的老鼠 |
US20120204278A1 (en) | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
DK3622813T3 (da) | 2009-07-08 | 2021-05-03 | Kymab Ltd | Dyremodeller og terapeutiske molekyler |
US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
WO2011020005A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | miRNA-REGULATED DIFFERENTIATION-DEPENDENT SELF-DELETING CASSETTE |
ES2908587T3 (es) | 2009-10-06 | 2022-05-03 | Regeneron Pharma | Ratones modificados genéticamente e injerto |
DK2954779T3 (da) | 2009-12-10 | 2019-05-13 | Regeneron Pharma | Mus, der frembringer tungkædeantistoffer |
RU2549695C2 (ru) | 2009-12-21 | 2015-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ FCγR МЫШИ |
US10143186B2 (en) | 2010-02-08 | 2018-12-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
US20120021409A1 (en) | 2010-02-08 | 2012-01-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common Light Chain Mouse |
AU2011265306C1 (en) | 2010-06-11 | 2015-01-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Production of fertile XY female animals from XY ES cells |
CN105695415A (zh) | 2010-06-17 | 2016-06-22 | 科马布有限公司 | 动物模型及治疗分子 |
KR20220150430A (ko) | 2010-06-22 | 2022-11-10 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 사람 람다 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 경쇄를 발현하는 마우스 |
DK2597945T3 (da) | 2010-07-26 | 2020-09-21 | Trianni Inc | Transgene dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
NZ707327A (en) | 2010-08-02 | 2017-01-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
WO2012092284A1 (en) | 2010-12-27 | 2012-07-05 | The Jackson Laboratory | Compositions and methods relating to non-human animals modified to promote production of selected gametes |
DK3375284T3 (da) | 2011-02-15 | 2023-06-12 | Univ Yale | Humaniserede M-CSF-mus og anvendelser deraf |
DE12192727T1 (de) | 2011-02-25 | 2013-07-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | ADAM6 Mäuse |
PT2631654E (pt) | 2011-05-12 | 2015-08-21 | Regeneron Pharma | Ensaio de libertação de neuropéptidos para canais de sódio |
WO2012168399A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for predicting, treating and modelling hormone resistance |
PT3572517T (pt) | 2011-08-05 | 2021-06-23 | Regeneron Pharma | Murganhos da cadeia leve universal humanizada |
ES2612935T3 (es) | 2011-09-19 | 2017-05-19 | Kymab Limited | Anticuerpos, dominios variables y cadenas adaptados para su uso en seres humanos |
EP2761008A1 (en) | 2011-09-26 | 2014-08-06 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
SI2770821T1 (en) | 2011-10-28 | 2018-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex of mice |
US9591835B2 (en) | 2011-10-28 | 2017-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
SG10201600965YA (en) | 2011-10-28 | 2016-03-30 | Regeneron Pharma | Humanized il-6 and il-6 receptor |
RU2661106C2 (ru) | 2011-10-28 | 2018-07-11 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Генетически модифицированные в отношении т-клеточного рецептора мыши |
HUE048511T2 (hu) | 2011-10-28 | 2020-07-28 | Regeneron Pharma | Kiméra fõ hisztokompatibilitási komplex (MHC) II molekulákat expresszáló, genetikailag módosított egerek |
US9043996B2 (en) | 2011-10-28 | 2015-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
CA2853470A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Nano-suspension process |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
SI2793567T1 (sl) | 2011-12-20 | 2019-05-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanizirane lahkoverižne miši |
US10036030B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-07-31 | E I Du Pont De Nemours And Company | Use of the soybean sucrose synthase promoter to increase plant seed lipid content |
ES2753774T3 (es) | 2012-02-01 | 2020-04-14 | Regeneron Pharma | Ratones humanizados que expresan cadenas pesadas que contienen dominios VL |
MX353278B (es) | 2012-03-06 | 2018-01-05 | Regeneron Pharma | Raton con cadena ligera comun. |
BR112014022855A2 (pt) | 2012-03-16 | 2017-07-18 | Regeneron Pharma | animal não humano geneticamente modificado, mamífero geneticamente modificado, e, método para fabricar um animal não humano |
RS57414B1 (sr) | 2012-03-16 | 2018-09-28 | Regeneron Pharma | Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih |
CN104302170B (zh) | 2012-03-16 | 2016-09-28 | 瑞泽恩制药公司 | 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠 |
US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
PL2847335T3 (pl) | 2012-04-25 | 2019-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą |
ME03551B (me) | 2012-06-12 | 2020-07-20 | Regeneron Pharma | Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca |
EP4193834A1 (en) | 2012-09-07 | 2023-06-14 | Yale University | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
EP3556206B1 (en) | 2012-11-05 | 2021-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified non-human animals and methods of use thereof |
HUE045478T2 (hu) | 2013-02-20 | 2019-12-30 | Regeneron Pharma | Humanizált T-sejt koreceptorokat expresszáló egerek |
EP2958990B1 (en) * | 2013-02-20 | 2019-10-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetic modification of rats |
JP6444321B2 (ja) | 2013-02-22 | 2018-12-26 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | ヒト化主要組織適合性遺伝子複合体を発現するマウス |
US20150342163A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
CN108464278B (zh) | 2013-03-11 | 2021-05-04 | 瑞泽恩制药公司 | 表达嵌合的主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子的转基因小鼠 |
KR102313053B1 (ko) | 2013-03-11 | 2021-10-18 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 키메라 주요 조직적합성 복합체(mhc) 제i 부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스 |
WO2014160179A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
PL3501272T3 (pl) | 2013-03-13 | 2023-07-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mysz eksprymująca ograniczony repertuar lekkiego łańcucha immunoglobuliny |
US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CA2908443A1 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Blastoid, cell line based artificial blastocyst |
HUE040575T2 (hu) | 2013-04-16 | 2019-03-28 | Regeneron Pharma | A patkány genom célzott módosítása |
US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
KR102138723B1 (ko) | 2013-08-07 | 2020-07-29 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Lincrna-결핍 비인간 동물 |
MY191512A (en) | 2013-09-18 | 2022-06-28 | Regeneron Pharma | Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same |
RS64573B1 (sr) | 2013-09-23 | 2023-10-31 | Regeneron Pharma | Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom |
CA2925723A1 (en) | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
IL307495A (en) | 2013-11-07 | 2023-12-01 | Ozgene Holdings Pty Ltd | Preparations and methods for the production of genetically modified animals |
WO2015077071A1 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene |
JP6484237B2 (ja) | 2013-11-19 | 2019-03-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | ヒト化増殖誘導リガンド遺伝子を有する非ヒト動物 |
EP4349980A2 (en) * | 2013-12-11 | 2024-04-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
MX2016007654A (es) | 2013-12-11 | 2017-08-15 | Regeneron Pharma | Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma. |
SG10201808083VA (en) | 2014-03-21 | 2018-10-30 | Regeneron Pharma | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
CN106255410B (zh) | 2014-03-21 | 2020-01-10 | 瑞泽恩制药公司 | 产生单结构域结合蛋白的非人动物 |
RU2020103811A (ru) | 2014-05-05 | 2020-02-18 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Гуманизированные животные по с5 и с3 |
NO2785538T3 (es) | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
DK3841877T3 (da) | 2014-05-19 | 2023-11-27 | Regeneron Pharma | Genetisk modificeret mus, der eksprimerer human EPO |
US9497945B2 (en) | 2014-05-30 | 2016-11-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized dipeptidyl peptidase IV (DPP4) animals |
LT3152312T (lt) | 2014-06-06 | 2020-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tikslinio lokuso modifikavimo būdai ir kompozicijos |
RU2735958C2 (ru) | 2014-06-19 | 2020-11-11 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген 1 запрограммированной гибели клеток |
HUE041584T2 (hu) | 2014-06-26 | 2019-05-28 | Regeneron Pharma | Célzott genetikai módosítások és alkalmazási módszerek és készítmények |
WO2016044745A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric antigen receptors |
PL3207124T3 (pl) | 2014-10-15 | 2019-11-29 | Regeneron Pharma | Sposoby i kompozycje do wytwarzania lub utrzymywania komórek pluripotencjalnych |
LT3221457T (lt) | 2014-11-21 | 2019-06-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nukreipiančios genetinės modifikacijos būdai ir kompozicijos, naudojant suporuotas kreipiančiąsias rnr sekas |
RU2020122439A (ru) | 2014-11-24 | 2020-09-24 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3 |
US20160345549A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-12-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene |
PT3230320T (pt) | 2014-12-09 | 2021-01-08 | Regeneron Pharma | Animais não humanos tendo um gene do cluster humanizado de diferenciação 274 |
RU2707137C2 (ru) | 2014-12-19 | 2019-11-22 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленной генетической модификации посредством одноэтапного множественного нацеливания |
KR102616160B1 (ko) | 2015-03-16 | 2023-12-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 저하된 상위 및 하위 운동 뉴런 기능 및 감각 지각을 나타내는 비-인간 동물 |
CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
HRP20231039T1 (hr) | 2015-04-06 | 2023-12-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Imunosni odgovori posredovani humaniziranim t stanicama kod ne-humanih životinja |
JP6752221B2 (ja) | 2015-04-13 | 2020-09-09 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化sirpa−il15ノックインマウス及びその使用方法 |
CA2986048C (en) | 2015-05-29 | 2021-10-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus |
WO2016205523A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | The Jackson Laboratory | Genetically modified non-human animals and methods relating to complement dependent cytotoxicity |
US10412939B2 (en) | 2015-09-02 | 2019-09-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of prostate cancer |
CA2998642C (en) | 2015-09-17 | 2023-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice |
KR102454546B1 (ko) | 2015-11-20 | 2022-10-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 림프구 활성화 유전자 3을 갖는 비인간 동물 |
US10813346B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-10-27 | Trianni, Inc. | Enhanced immunoglobulin diversity |
US11053288B2 (en) | 2016-02-04 | 2021-07-06 | Trianni, Inc. | Enhanced production of immunoglobulins |
KR102487839B1 (ko) | 2016-02-04 | 2023-01-12 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 angptl8 유전자를 갖는 비인간 동물 |
CN109195443A (zh) | 2016-02-16 | 2019-01-11 | 雷杰纳荣制药公司 | 具有突变型犬尿氨酸酶基因的非人动物 |
KR102493894B1 (ko) | 2016-02-29 | 2023-01-31 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 tmprss 유전자를 갖는 설치류 |
RU2745563C2 (ru) | 2016-05-20 | 2021-03-29 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк |
SI3462853T1 (sl) | 2016-06-03 | 2023-05-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo |
KR20190041476A (ko) | 2016-07-29 | 2019-04-22 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | C-절단된 피브릴린-1의 발현을 유도하는 돌연변이를 포함하는 마우스 |
KR20190038613A (ko) | 2016-08-11 | 2019-04-08 | 더 잭슨 래보라토리 | 유전자 변형된 면역결핍 비-인간 동물에서의 개선된 인간 적혈구 생존에 관한 방법 및 조성물 |
WO2018064600A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus |
SG11201903676SA (en) | 2016-10-27 | 2019-05-30 | Jackson Lab | Genetically modified mouse model for human hepatocyte xenotransplantation |
EP3547831A1 (en) | 2016-11-30 | 2019-10-09 | The Jackson Laboratory | Humanized mouse model with improved human innate immune cell development |
WO2018157058A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal models of retinoschisis |
EP3599842A4 (en) | 2017-03-21 | 2020-12-30 | The Jackson Laboratory | GENETICALLY MODIFIED MOUSE EXPRESSING HUMAN APOE4 AND TREM.P.R47H AND ASSOCIATED PROCEDURES FOR USE |
RU2019140867A (ru) | 2017-05-12 | 2021-06-15 | Зе Джексон Лаборатори | Nsg мыши, не имеющие mhc класса i и класса ii |
EP3644722A1 (en) | 2017-06-27 | 2020-05-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus |
AU2018309716A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-01-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof |
AU2018309714A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-01-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assessment of CRISPR/Cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo |
CN111182790A (zh) | 2017-07-31 | 2020-05-19 | 瑞泽恩制药公司 | Crispr报告体非人类动物及其用途 |
AU2018313892B2 (en) | 2017-08-09 | 2024-04-18 | The Jackson Laboratory | Immunodeficient mice expressing human interleukin 15 |
EP4276185A3 (en) | 2017-09-29 | 2024-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use |
SG11202002002XA (en) | 2017-09-29 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals expressing humanized c1q complex |
CN111565566B (zh) | 2017-11-10 | 2022-10-21 | 瑞泽恩制药公司 | 包含slc30a8突变的非人动物及使用方法 |
CN116064611A (zh) | 2017-11-30 | 2023-05-05 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化trkb基因座的非人动物 |
CA3089331A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
CN112040769B (zh) | 2018-03-24 | 2023-05-16 | 瑞泽恩制药公司 | 用于产生针对肽-mhc复合物的治疗抗体的经过基因修饰的非人动物、制造方法和用途 |
CA3093850A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
US10463029B1 (en) | 2018-06-07 | 2019-11-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of steel syndrome |
AU2019284762A1 (en) | 2018-06-13 | 2020-11-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
US20210195879A1 (en) | 2018-06-21 | 2021-07-01 | The Jackson Laboratory | Genetically modified mouse models of alzheimer's disease |
CN116200426A (zh) | 2018-07-16 | 2023-06-02 | 瑞泽恩制药公司 | Ditra疾病的非人动物模型及其用途 |
EP3849304B1 (en) | 2018-09-13 | 2024-01-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Complement factor h gene knockout rat as a model of c3 glomerulopathy |
EP3898672A1 (en) | 2018-12-18 | 2021-10-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing body weight and lean muscle mass using antagonists against leptin receptor, gdf8 and activin a |
IL301193A (en) | 2018-12-20 | 2023-05-01 | Regeneron Pharma | Nuclease-mediated repeat expansion |
MX2021008291A (es) | 2019-01-17 | 2021-08-05 | Regeneron Pharma | Un modelo de roedor de trastornos del estado de animo. |
US20220104468A1 (en) | 2019-01-22 | 2022-04-07 | St. Jude Children's Research Hospital | Modulation of lc3-associated endocytosis pathway and genetically modified non-human animals as a model of neuroinflammation and neurodegeneration |
JP2022520819A (ja) | 2019-02-22 | 2022-04-01 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 遺伝子改変ナトリウムチャネルを有する齧歯類およびその使用方法 |
AU2020241153A1 (en) | 2019-03-15 | 2021-09-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A loss of function rodent model of solute carrier 39 member 5 |
IL286905B1 (en) | 2019-04-04 | 2024-02-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals containing the human coagulation factor 12 locus |
JP2022532490A (ja) | 2019-05-13 | 2022-07-15 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 癌の治療における有効性の増強のためのpd-1阻害剤とlag-3阻害剤の組み合わせ |
EP3801011A1 (en) | 2019-06-04 | 2021-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use |
TW202110323A (zh) | 2019-06-05 | 2021-03-16 | 美商再生元醫藥公司 | 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途 |
KR20220017939A (ko) | 2019-06-07 | 2022-02-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 알부민 좌위를 포함하는 비-인간 동물 |
CN113966343A (zh) | 2019-06-11 | 2022-01-21 | 瑞泽恩制药公司 | 结合PcrV的抗PcrV抗体、包含抗PcrV抗体的组合物及其使用方法 |
WO2020264339A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modeling tdp-43 proteinopathy |
JP2022552112A (ja) | 2019-10-03 | 2022-12-15 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 機能性齧歯類モデルのcrnn喪失 |
WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
AU2020402885A1 (en) | 2019-12-13 | 2022-06-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Human chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) iRNA agent compositions and methods of use thereof |
CN115175559A (zh) | 2020-01-28 | 2022-10-11 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化pnpla3基因座的非人动物及其使用方法 |
EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
JP2023516052A (ja) | 2020-03-04 | 2023-04-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | B4galt1媒介性機能の齧歯類モデル |
US20230102342A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-03-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
EP4138550A1 (en) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cxcl13 gene |
RU2751237C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-07-12 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
US20230232796A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-07-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ace2 locus |
CN116323651A (zh) | 2020-10-01 | 2023-06-23 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人cr1的啮齿动物 |
IL303626A (en) | 2020-12-16 | 2023-08-01 | Regeneron Pharma | Mice expressing human FC alpha receptors |
IL303724A (en) | 2020-12-21 | 2023-08-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals with a humanized TSLP gene, a humanized TSLP receptor gene, and/or a humanized IL7RA gene |
KR20230164150A (ko) | 2021-03-31 | 2023-12-01 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | TCRβ 레퍼토리의 다양성이 개선된 인간화 세포 면역 시스템 성분을 포함하는 유전자 변형된 마우스 |
AU2022381205A1 (en) | 2021-11-04 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified cacng1 locus |
CA3238939A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Gaurang Patel | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
WO2023150798A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
WO2023154861A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents |
WO2023212560A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
WO2023235677A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animal model of tdp-43 proteinopathy |
US20230417899A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Oshkosh Corporation | Position tracking for a lift device |
WO2024020057A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified animal model and its use to model the human immune system |
WO2024026488A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus |
WO2024031053A1 (en) | 2022-08-05 | 2024-02-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Aggregation-resistant variants of tdp-43 |
WO2024064860A1 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice expressing components of human cellular immune system |
US20240130341A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
AUPP421298A0 (en) * | 1998-06-19 | 1998-07-09 | Fertilitescentrum Ab | Method and medium for in vitro culture of human embryos |
US6485972B1 (en) * | 1998-10-15 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | WNT signalling in reproductive organs |
US6784336B2 (en) * | 2000-09-20 | 2004-08-31 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Method of producing mutant mice |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US20040171153A1 (en) * | 2001-03-23 | 2004-09-02 | Peter Andrews | Stem cell |
WO2003073843A2 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-12 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Inbred embryonic stem-cell derived mice |
JP2006345702A (ja) | 2003-08-05 | 2006-12-28 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 胚性幹細胞の未分化状態の維持剤 |
US20050265980A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Becton, Dickinson And Company | Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells |
ES2667169T3 (es) | 2004-10-19 | 2018-05-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética |
-
2005
- 2005-10-19 ES ES14163635.7T patent/ES2667169T3/es active Active
- 2005-10-19 CA CA2827654A patent/CA2827654C/en active Active
- 2005-10-19 SI SI200531866T patent/SI1802193T1/sl unknown
- 2005-10-19 DK DK05807480.8T patent/DK1802193T3/da active
- 2005-10-19 EP EP05807480.8A patent/EP1802193B1/en active Active
- 2005-10-19 WO PCT/US2005/037584 patent/WO2006044962A1/en active Application Filing
- 2005-10-19 CA CA2583750A patent/CA2583750C/en active Active
- 2005-10-19 DK DK14163635.7T patent/DK2767161T3/en active
- 2005-10-19 PL PL14163635T patent/PL2767161T3/pl unknown
- 2005-10-19 PL PL05807480T patent/PL1802193T3/pl unknown
- 2005-10-19 ES ES05807480.8T patent/ES2463476T3/es active Active
- 2005-10-19 PT PT141636357T patent/PT2767161T/pt unknown
- 2005-10-19 AU AU2005295269A patent/AU2005295269B2/en active Active
- 2005-10-19 JP JP2007537999A patent/JP5252922B2/ja active Active
- 2005-10-19 EP EP14163635.7A patent/EP2767161B1/en active Active
- 2005-10-19 US US11/254,045 patent/US7294754B2/en active Active
- 2005-10-19 PT PT58074808T patent/PT1802193E/pt unknown
-
2007
- 2007-09-27 US US11/904,559 patent/US7576259B2/en active Active
- 2007-09-27 US US11/904,558 patent/US7659442B2/en active Active
- 2007-09-27 US US11/904,373 patent/US8816150B2/en active Active
-
2014
- 2014-06-20 US US14/310,651 patent/US9414575B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-27 HK HK15100913.7A patent/HK1200269A1/xx unknown
-
2016
- 2016-07-11 US US15/207,388 patent/US9730434B2/en active Active
-
2017
- 2017-06-29 US US15/638,136 patent/US10039269B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-26 CY CY20181100440T patent/CY1120496T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2667169T3 (es) | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética | |
Chapman et al. | Targeted germline modifications in rats using CRISPR/Cas9 and spermatogonial stem cells | |
US20140127812A1 (en) | Long-term culture of avian primordial germ cells (pgcs) | |
JP2000516463A (ja) | 特定の遺伝的特性を有する哺乳動物を作製する方法 | |
Yi et al. | Medaka fish stem cells and their applications | |
DeChiara et al. | Producing fully ES cell-derived mice from eight-cell stage embryo injections | |
Pascoe et al. | Genes and functions: trapping and targeting in embryonic stem cells | |
McLaren | Germ cells and germ cell transplantation | |
WO2006009297A1 (ja) | Es細胞を用いたキメラ作製 | |
US20050125853A1 (en) | Method for generating genetically modified animals | |
Eggan et al. | Differentiation of F1 embryonic stem cells into viable male and female mice by tetraploid embryo complementation | |
Lee et al. | An alternative simple method for mass production of chimeric embryos by coculturing denuded embryos and embryonic stem cells in Eppendorf vials | |
US7132282B2 (en) | Genetic modification of C57 mice | |
JP2016063841A (ja) | Es細胞の製造方法 | |
Ladiges et al. | Transgenic animals in toxicology | |
Gardner | Present perspective and future challenges |