JP2022517963A - 養子細胞療法のクローン性及び持続性をモニタリングする系及び方法 - Google Patents
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Abstract
腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定する方法及び系が開示される。養子細胞療法産物に由来する持続性独特なクローンを同定する方法も開示される。
Description
関連出願の相互参照
[001] 本出願は、それぞれ参照により全体として本明細書に援用される２０１９年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７９０，８９８号、２０１９年４月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，２０９号、及び２０１９年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，３５４号の優先権を主張する。
[001] 本出願は、それぞれ参照により全体として本明細書に援用される２０１９年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７９０，８９８号、２０１９年４月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，２０９号、及び２０１９年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，３５４号の優先権を主張する。
本発明の分野
[002] 本明細書に記載の発明は、一般に、腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定すること、より特定すると、限定されるものではないが、Ｔ細胞の臨床的に有効な集団を同定することに関する。
[002] 本明細書に記載の発明は、一般に、腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定すること、より特定すると、限定されるものではないが、Ｔ細胞の臨床的に有効な集団を同定することに関する。
本発明の背景
[003] 癌患者におけるＴ細胞受容体をプロファイリングする一般的方法、例えば、Kirsch et al.,Molecular Oncology,9:2063-2070(2015)が公知である一方、それらの方法は、癌療法に対する潜在的な臨床奏功の評価においてほとんど有用でないことが証明されている。特に、そのようなプロファイリング研究は、Ｔ細胞多様性に対する特定の治療の影響並びに臨床奏功及び／又は臨床転帰に対する測定された多様性の関係に関して明確な結論を有さない無数のデータをもたらす、例えば、Snyder et al.,PLOS Medicine,14:e1002309(2017)。この困難は、それ自体で患者の免疫レパトアを変化させる養子細胞療法に特に深刻である、例えば、Milone and Bhoj,Molecular Therapy:Methods & Clinical Development 8:210-221(2018)。
[003] 癌患者におけるＴ細胞受容体をプロファイリングする一般的方法、例えば、Kirsch et al.,Molecular Oncology,9:2063-2070(2015)が公知である一方、それらの方法は、癌療法に対する潜在的な臨床奏功の評価においてほとんど有用でないことが証明されている。特に、そのようなプロファイリング研究は、Ｔ細胞多様性に対する特定の治療の影響並びに臨床奏功及び／又は臨床転帰に対する測定された多様性の関係に関して明確な結論を有さない無数のデータをもたらす、例えば、Snyder et al.,PLOS Medicine,14:e1002309(2017)。この困難は、それ自体で患者の免疫レパトアを変化させる養子細胞療法に特に深刻である、例えば、Milone and Bhoj,Molecular Therapy:Methods & Clinical Development 8:210-221(2018)。
[004] 特に、養子細胞療法の処置において、細胞の不均一ポリクローナル治療集団内の細胞の臨床的に関連する亜集団の同定は、重要な問題である。本明細書において、特に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団の同定を容易にすることにより腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法及び系が提示される。
本発明の概要
[005] 本発明は、リンパ球クローン多様性の種々の核酸配列ベースプロファイルを使用して腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定する方法及び系を対象とする。本発明は、多数の実施及び用途において例示され、その一部が以下及び本明細書全体にわたりまとめられる。
[005] 本発明は、リンパ球クローン多様性の種々の核酸配列ベースプロファイルを使用して腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定する方法及び系を対象とする。本発明は、多数の実施及び用途において例示され、その一部が以下及び本明細書全体にわたりまとめられる。
[006] 一態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定することを含み、
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定すること
を含む方法を対象とする。
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定すること
を含む方法を対象とする。
[007] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定すること；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定すること；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定すること
を含む方法を対象とする。
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定すること；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定すること；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定すること
を含む方法を対象とする。
[008] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、メモリ；１つ以上のプロセッサ；及びメモリ中に保存され、１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）ステップ（ｄ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な亜集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系を対象とする。
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）ステップ（ｄ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な亜集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系を対象とする。
[009] 上記方法及び系のさらなる実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方を使用してＴＩＬの治療集団のＣＤＲ３クローン多様性又はＰＢＭＣのＣＤＲ３クローン多様性を決定する。
[0010] 別の態様において、本発明は、ＴＣＲレパトア分析を使用してＴＩＬ産生プロセス同等性を決定する方法であって、
第１のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第１のセットを決定すること；
第２のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第２のセットを決定すること；
（ｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比、及び／又は（ｉｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定すること；並びに
前記比に基づき、第１のサンプル中のＴＩＬ及び第２のサンプル中のＴＩＬの同等性を決定すること
を含む方法を対象とする。
第１のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第１のセットを決定すること；
第２のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第２のセットを決定すること；
（ｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比、及び／又は（ｉｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定すること；並びに
前記比に基づき、第１のサンプル中のＴＩＬ及び第２のサンプル中のＴＩＬの同等性を決定すること
を含む方法を対象とする。
[0011] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプルのＴＩＬを第１の施設において産生し、第２のサンプルのＴＩＬを第２の施設において産生する。
[0012] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数は、第１のサンプル中のＴＩＬの治療有効性と相関する。
[0013] 上記方法のさらなる実施形態において、第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数は、第２のサンプル中のＴＩＬの治療有効性と相関する。
[0014] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプル及び第２のサンプルは、同じサンプルに由来する。
[0015] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプル及び第２のサンプルの少なくとも一方は、固形腫瘍癌を有する対象から得る。
[0016] 上記方法のさらなる実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫（例として、ブドウ膜黒色腫）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる癌、頭頸部癌（例として、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、脳癌膠芽腫（例として、ＧＢＭ）、消化管癌、腎臓癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。上記方法のさらなる実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫である。上記方法のさらなる実施形態において、固形腫瘍癌は、子宮頸癌である。
[0017] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプル中のＴＩＬ及び第２のサンプル中のＴＩＬは、急速拡大プロセス（ＲＥＰ）後ＴＩＬである。
[0018] 上記方法のさらなる実施形態において、約０．４以上、約０．４２以上、約０．４４以上、約０．４６以上、約０．４８以上、約０．５０以上、約０．５２以上、約０．５４以上、約０．５６以上、約０．５８以上、又は約０．６０以上の値を有する比は、第１のサンプル及び第２のサンプル間の同等性を示す。
[0019] 上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプル及び／又は第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性は、ＤＮＡシーケンシングにより決定する。上記方法のさらなる実施形態において、第１のサンプル及び／又は第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性は、ＲＮＡシーケンシングにより決定する。
[0020] 上記方法のさらなる実施形態において、独特なＣＤＲ３配列の第１のセットは、第１のサンプル中のＴＩＬにより最大頻度において発現される所与数のＣＤＲ３配列からなる。上記方法のさらなる実施形態において、独特なＣＤＲ３配列の第２のセットは、第２のサンプル中のＴＩＬにより最大頻度において発現される所与数のＣＤＲ３配列からなる。
[0021] 上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、及び約５００超からなる群から選択される。
[0022] 上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、独特なＣＤＲ３配列の第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、又は約１００％と相関する。
[0023] 上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、約１０～約２０である。上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、独特なＣＤＲ３配列の第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約４０％と相関する。上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、約３００～約４００である。上記方法のさらなる実施形態において、所与数は、独特なＣＤＲ３配列の第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約８０％と相関する。
[0024] 本発明のこれらの上記で特徴付けされる態様、及び他の態様は、多数の説明される実施及び用途において例示され、それらの一部は、図面及び実施例において示され、以下の特許請求の範囲のセクションにおいて特徴付けられる。しかしながら、上記の概要は、本発明のそれぞれの説明される実施形態もあらゆる実施も記載するものではない。
図面の簡単な説明
[0025] 本発明の上記の概要、及び以下の詳細な説明は、添付の図面とともに精読される場合に良好に理解される。
[0025] 本発明の上記の概要、及び以下の詳細な説明は、添付の図面とともに精読される場合に良好に理解される。
本発明の詳細な説明
[0049] 特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、参照により全体として援用される。
[0049] 特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、参照により全体として援用される。
定義
[0050] 用語「免疫レパトア」は、適宜１つ又は複数の個体のリンパ球中で検出される区別されるＣＤＲ３配列のセットを意味する。
[0050] 用語「免疫レパトア」は、適宜１つ又は複数の個体のリンパ球中で検出される区別されるＣＤＲ３配列のセットを意味する。
[0051] 免疫レパトアのクロノタイプは、「クローン型」としても公知であり、免疫系の免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）産生の初期における体細胞組換えを介する可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）及び結合（Ｊ）遺伝子セグメントの再構成により決定される。Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成は、Ｔ細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ鎖から、並びに免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖（ＩｇＫ、ＩｇＬ）から増幅させ、検出することができる。細胞は、患者から、例えば、末梢血、リンパ組織、癌組織、又は他の器官及び／又は器官系からの組織若しくは体液を得ることにより得ることができる。これらのサンプル、例えば、血液サンプルを得るための技術は、当業者に公知である。細胞カウントは、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングにより検出される配列の数から推定することができる。
[0052] 約３０～９０ヌクレオチドを含むＣＤＲ３領域は、遺伝子の組換え可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）及び結合（Ｊ）セグメントのジャンクションを包含する。これは受容体の結合特異性をコードし、独特なＶ（Ｄ）Ｊ再構成を同定するための配列タグとして有用である。
[0053] Wangらは、ＰＣＲを使用して検体中の標的分子の数の定量的又は半定量的評価を得ることができることを開示した（Wang,M.et al,“Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.86:9717-9721(1989)）。定量的増幅を達成するために特に有効な方法は、本発明者らにより既に記載されている。１つのそのような方法はａｒｍ－ＰＣＲとして公知であり、それは米国特許出願公開第２００９／０２５３１８３Ａ１号に記載されている。
[0054] 用語「インビボ」は、対象の体内で起きるイベントを指す。
[0055] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起きるイベントを指す。インビトロアッセイは、生存又は死滅細胞を用いる細胞ベースアッセイを包含し、インタクト細胞を用いない無細胞アッセイも包含する。
[0056] 用語「エクスビボ」は、対象の身体から除去された細胞、組織、及び／又は器官に対してある手順を処理し、又は実施することを含むイベントを指す。適切に、細胞、組織及び／又は器官は、手術又は処置の方法において対象の身体に戻すことができる。
[0057] 本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」は、対象の血流を離れ、腫瘍中に移動した白血球として最初に得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定されるものではないが、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬとしては、初代又は二次ＴＩＬの両方が挙げられる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織サンプルから得られる（「フレッシュに得られる」又は「フレッシュに単離される」と称されることがある）ものであり、「続発性ＴＩＬ」は、本明細書に考察されるとおり拡大され、又は増殖された任意のＴＩＬ細胞集団、例として、限定されるものではないが、バルクＴＩＬ及び拡大ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ＲＥＰ後ＴＩＬ」）である。ＴＩＬ細胞集団としては、遺伝子改変ＴＩＬを挙げることができる。
[0058] 本明細書における「細胞の集団」（例として、ＴＩＬ）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、一般に、１×１０６～１×１０１０個の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、ほぼ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡大は、一般に、輸注のための１．５×１０９～１．５×１０１０個の細胞の集団を提供するために行われる。一部の実施形態において、ＲＥＰ拡大は、２．３×１０１０～１３．７×１０１０個の集団を提供するために行われる。
[0059] 本明細書における「凍結保存ＴＩＬ」は、ＴＩＬが、初代、バルク、又は拡大（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかで、約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理され、保存されることを意味する。凍結保存の一般的な方法は、本明細書の他箇所に、例として、実施例においても記載されている。明確性のため、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの資源として使用することができる冷凍組織サンプルと区別可能である。
[0060] 本明細書における「解凍凍結保存ＴＩＬ」は、事前に凍結保存され、次いで室温以上、例として、限定されるものではないが、細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与することができる温度に戻すように処理されたＴＩＬの集団を意味する。
[0061] ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し、処置を達成するそれらの能力により機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５の発現により分類することができる。さらに、及び或いは、ＴＩＬは、患者中への再導入時に固形腫瘍に浸潤するそれらの能力により機能的に定義することができる。
[0062] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトにおいてＣＤ４５Ｒ０＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型としては、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも挙げられる。セントラルメモリーＴ細胞についての転写因子としては、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が挙げられる。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲ誘発後に主にＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌをエフェクター分子として分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトにおいて、リンパ節及び扁桃腺中で相対的に高濃度である。
[0063] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現を損失しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、ＣＤ６２Ｌ発現について不均一であり、又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型としては、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも挙げられる。セントラルメモリーＴ細胞についての転写因子としては、ＢＬＩＭＰ１が挙げられる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原性刺激後に高レベルの炎症性サイトカイン、例として、インターフェロン－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８コンパートメント中で優勢であり、ヒトにおいて、肺、肝臓、及び腸中で相対的に高濃度である。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを担持する。
[0064] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、円形核を有する末梢血細胞、例として、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を指す。抗原提示細胞として使用する場合（ＰＢＭＣは、抗原提示細胞のタイプである）、末梢血単核球は、放射線照射された同種異系末梢血単核球である。
[0065] 用語「末梢血リンパ球」及び「ＰＢＬ」は、末梢血から拡大されたＴ細胞を指す。一部の実施形態において、ＰＢＬは、ドナーからの全血又はアフェレシス産物から分離される。一部の実施形態において、ＰＢＬは、ドナーからの全血又はアフェレシス産物からＴ細胞表現型、例えば、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋のＴ細胞表現型の陽性又は陰性選択により分離される。
[0066] 本明細書において使用される用語「治療効果」は、治療利益及び／又は予防利益を包含する。予防効果としては、疾患又は病態の出現の遅延又は排除、疾患又は病態の症状の発生の遅延又は排除、疾患又は病態の進行の減速、停止、又は好転、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。
[0067] 本明細書において使用されるＴＩＬ又は他のＴ細胞の集団に関する用語「臨床的に有効な」は、臨床的に検出可能な治療効果及び／又は予防効果を包含する。臨床的に検出可能な治療効果の非限定的な例としては、固形腫瘍塊の低減；及び患者により報告される症状、例えば、疼痛又は不快感の低減が挙げられる。予防効果としては、疾患又は病態の出現の遅延又は排除、疾患又は病態の症状の発生の遅延又は排除、疾患又は病態の進行の減速、停止、又は好転、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。
[0068] 例えば、本明細書において物理的又は化学的特性、例えば、分子量又は化学式を説明するために範囲が使用される場合、範囲及びその具体的な実施形態の全ての組合せ及び組合せの構成要素が含められるものとする。用語「約」の使用は、数又は数値範囲を指す場合、言及されるその数又は数値範囲が実験変動内（又は総計的実験誤差内）の近似値であることを意味し、ゆえに数又は数値範囲は変動し得る。変動は、典型的には、記述される数又は数値範囲の０％～１５％、好ましくは、０％～１０％、より好ましくは、０％～５％である。用語「含む（comprising）」（及び関連用語、例えば、「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」又は「有する」又は「含む（including）」）は、それらの実施形態、例えば、記載される特徴「からなる」又は「から本質的になる」物質、方法又はプロセスの任意の構成の実施形態などを含む。
[0069] 本発明の化合物としては、抗体も挙げられる。用語「抗体（antibody）」及びその複数形「抗体（antibodies）」は、全免疫グロブリン及びその任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）又は単鎖を指す。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分をさらに指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在し得る超可変性領域にさらに下位分類することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んだ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つ又は複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例として、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
[0070] 用語「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」又はそれらの複数形は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープについての単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して（例えば、そのモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、シーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい資源として機能する。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に装入することができ、次いでそれは宿主細胞、例えば、免疫グロブリンタンパク質を本来産生しない大腸菌（E. coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中に形質移入され、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載される。
[0071] 本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単に「抗体部分」又は「断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能が発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward,et al.,Nature,1989,341,544-546）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え方法を使用して合成リンカーによりつなぎ合わせてＶＬ及びＶＨ領域が対合して単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてのそれらの作製を可能とすることができる；例えば、Bird et al.,Science 1988,242,423-426；及びHuston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,5879-5883参照）。このようなｓｃＦｖ抗体も、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語の範囲内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。
[0072] 本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲの領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により又はインビボで体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、他の哺乳類種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含まないものとする。
[0073] 用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲの領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、例として、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランス遺伝子及び軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞により産生される。
[0074] 本明細書において使用される用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により調製され、発現され、作出され、又は単離される全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランス染色体の動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下にさらに記載する）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングが関わる任意の他の手段により調製され、発現され、作出され、又は単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又はヒトＩｇ配列についてトランスジェニックの動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、ゆえに組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それに関連する一方、天然ではインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパトア内に存在し得ない配列である。
[0075] 本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。哺乳類において、５つの抗体アイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＥが存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧアイソタイプの４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡアイソタイプの２つのサブクラス：ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が存在する。
[0076] 語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
[0077] 用語「ヒト抗体誘導体」は、任意の修飾された形態のヒト抗体、例えば、その抗体と別の活性医薬成分又は抗体とのコンジュゲートを指す。用語「コンジュゲート」、「抗体－薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」、又は「イムノコンジュゲート」は、治療部分、例えば、細菌毒素、細胞毒性薬又は放射性核種含有毒素にコンジュゲートされた抗体、又はその断片を指す。毒性部分は、当該技術分野において利用可能な方法を使用して本発明の抗体にコンジュゲートさせることができる。
[0078] 用語「ヒト化抗体（humanized antibody）」、「ヒト化抗体（humanized antibodies）」及び「ヒト化」は、別の哺乳類種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を指すものとする。ヒトフレームワーク配列内で追加のフレームワーク領域修飾を作製することができる。ヒト化形態の非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の１５超可変領域からの残基によりレシピエントの超可変領域からの残基が置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中でもドナー抗体中でも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらにリファインするために作製される。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 1986,321,522-525；Riechmann et al.,Nature 1988,332,323-329；及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.1992,2,593-596参照。
[0079] 用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すものとする。
[0080] 「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片である。断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に同じポリペプチド鎖中で接続したもの（ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を許容しないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作出する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号；及びBolliger,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90,6444-6448にさらに詳細に記載されている。
[0081] 用語「グリコシル化」は、抗体の修飾誘導体を指す。非グリコシル化（aglycoslated）抗体は、グリコシル化を欠く。グリコシル化は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させるように変更することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変更することにより達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸置換を作製することができる。非グリコシル化は、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されるとおり抗原についての抗体の親和性を増加させ得る。さらに又は或いは、変更されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加した二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を作製することができる。このような変更グリコシル化パターンは、抗体の能力を増加させることが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変更グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。変更グリコシル化機構を有する細胞は当該技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより変更グリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞系中で発現される抗体は、その炭水化物上のフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９ＦＵＴ８－／－細胞系は、２つの置換ベクターを使用したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により作出された（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号又はYamane-Ohnuki,et al.,Biotechnol.Bioeng.,2004,87,614-622参照）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の機能が破壊された細胞系であって、そのような細胞系中で発現される抗体がアルファ１，６結合関連酵素の低減又は排除により低フコシル化を示す細胞系を記載しており、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンへのフコースの付加について低酵素活性であり、又はその酵素活性を有さない細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ATCC CRL1662）も記載している。国際公開第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に付着させる能力が低下しており、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞系のＬｅｃ１３細胞について記載している（Shields,et al.,J.Biol.Chem.2002,277,26733-26740も参照。国際公開第９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系であって、その操作細胞系中で発現される抗体が二分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、それが抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすような操作された細胞系について記載している（Umana,et al.,Nat.Biotech.1999,17,176-180も参照）。或いは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して開裂させることができる。例えば、Tarentino,et al.,Biochem.1975,14,5516-5523に記載されるとおり、フコシダーゼアルファ－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する。
[0082] 「ペグ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に付着するようになる条件下で典型的に反応される修飾された抗体、又はその断片を指す。ペグ化は、例えば抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本明細書において使用される用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている形態のＰＥＧのいずれか、例えば、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドを包含するものとする。ペグ化すべき抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化方法は、例えば、欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号に記載されるとおり、当該技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。
[0083] 用語「バイオシミラー」は、臨床的に不活性な成分に軽微な差があるにも関わらず、米国で許可されている先発生物学的製剤と高度に類似し、それに関して製剤の安全性、純度及び効力の点で生物学的製剤及び先発製剤の間に臨床的に有意味な差が存在しない生物学的製剤を意味する。さらに、後発生物学的又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁により使用が既に認可されている別の生物学的医薬品に類似する生物学的医薬品である。用語「バイオシミラー」は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。生物学的製剤又は生物学的医薬品は、生物学的資源、例えば、細菌又は酵母により作製され、又はそれに由来する医薬品である。これらは、比較的小さい分子、例えば、ヒトインスリン若しくはエリスロポエチン、又は複合的な分子、例えば、モノクローナル抗体からなり得る。例えば、先発抗ＣＤ２０モノクローナル抗体がリツキシマブである場合、リツキシマブに準じて医薬品規制当局により承認される抗ＣＤ２０バイオシミラーモノクローナル抗体は、リツキシマブと「バイオシミラー」であり、又はリツキシマブの「そのバイオシミラー」である。欧州において、後発生物学的又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により使用が既に認可されている別の生物学的医薬品に類似する生物学的医薬品である。欧州における後発生物学的適用についての関連する法的根拠は、規則（ＥＣ）第７２６／２００４号の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）（改正された場合は、その改正版）であり、したがって欧州では、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）第７２６／２００４号の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）に基づき認可され、認可が承認され、又は認可申請の対象となり得る。既に認可されている元の生物学的医薬品製剤は、欧州において「先発医薬品製剤」と称され得る。ある製剤がバイオシミラーとみなされるための要件の一部が、後発生物学的医薬品製剤に関するＣＨＭＰガイドライン（CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products）に概説されている。加えて、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含め、製剤固有のガイドラインがＥＭＡにより製剤ごとに提供されており、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び／又は有効性の点で先発医薬品製剤に類似し得る。加えて、バイオシミラーは、先発医薬品製剤と同じ病態の処置に使用され、又はそれへの使用が意図されるものであり得る。したがって、本明細書に記載のバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似する又は高度に類似する品質特性を有するとみなすことができる。或いは又は加えて、本明細書に記載のバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似する又は高度に類似する生物学的活性を有するとみなすことができる。或いは又は加えて、本明細書に記載のバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似する又は高度に類似する安全性プロファイルを有するとみなすことができる。代わりに又は加えて、本明細書に記載のバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似する又は高度に類似する有効性を有するとみなすことができる。本明細書に記載されるとおり、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡにより認可された先発医薬品製剤と比較される。しかしながら、一部の例において、バイオシミラーは、欧州経済地域外である試験において認可された生物学的医薬品製剤（非ＥＥＡ認可「対照薬」）と比較することができる。このような試験としては、例えば、ある臨床及びインビボ非臨床試験が挙げられる。本明細書において使用される用語「バイオシミラー」は、非ＥＥＡ認可対照薬と比較されており、又は比較することができる生物学的医薬品製剤にも関する。あるバイオシミラーは、タンパク質、例えば、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）及び融合タンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない軽微なアミノ酸構造の改変（例として、例えば、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その先発医薬品製剤のアミノ酸配列と９７％以上、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、先発医薬品製剤の翻訳後修飾と異なる１つ以上の翻訳後修飾、例えば、限定されるものではないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び／又はトランケーションを含み得るが、但し、その差が医薬品製剤の安全性及び／又は有効性の変化をもたらさないものとする。バイオシミラーは、先発医薬品製剤と同一の又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、限定されるものではないが、バイオシミラーは、先発医薬品製剤に伴う安全性についての懸念をその差が対処し、又は対処するように意図される場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、例えば、その強度、医薬形態、配合、賦形剤及び／又は提供形態の点で先発医薬品製剤から逸脱し得るが、但し、医薬品製剤の安全性及び有効性が損なわれないものとする。バイオシミラーは、例えば、薬物動態学的（ＰＫ）及び／又は薬力学的（ＰＤ）プロファイルについて先発医薬品製剤と比較して差を含み得るが、依然として認可され、又は認可に好適であると考慮するのに十分に先発医薬品製剤に類似するとみなされる。ある状況において、バイオシミラーは、先発医薬品製剤と比較して異なる結合特性を示し、この異なる結合特性は、規制当局、例えば、ＥＭＡにより後発バイオ製剤としての認可を妨げるものではないとみなされる。用語「バイオシミラー」は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
[0084] ２つ以上の核酸又はポリペプチドに関する用語「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較し、アラインメント（必要に応じてギャップを導入する）した場合に同じであり、又は同じである規定の割合のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用し、又は目視検査により測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するために好適なプログラムとしては、例えば、米国政府のNational Center for Biotechnology Information BLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラムスイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。BLASTNは核酸配列を比較するために使用される一方、BLASTPは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech,South San Francisco,California）又はDNASTARから利用可能なMegAlignは、配列をアラインメントするために使用することができる追加の公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。ClustalW及びClustalXを使用してアラインメントを生成することができる、Larkin et al.,Bioinformatics 23:2947-2948(2007)；Goujon et al.,Nucleic Acids Research,38 Suppl:W 695-9(2010)；及びMcWilliam et al.,Nucleic Acids Research 41(Web Server issue):W 597-600(2013)。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントに適切なパラメータを決定することができる。ある実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[0085] 移行句「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」は、出願当初及び補正後の形態の添付の特許請求の範囲において使用される場合、記載されていない追加の請求項の要素又はステップが存在する場合にどのようなものが請求項から除外されるかに関して請求項の範囲を定義する。用語「含む」は、包含的又はオープンエンド形式であることが意図され、いかなる追加の記載されていない要素も、方法も、ステップも、材料も除外しない。用語「からなる」は、その請求項に規定されるもの以外のいかなる要素、ステップ又は材料も除外し、後者の例では、規定の材料に通常付随する不純物も除外する。用語「から本質的になる」は、請求項の範囲を規定の要素、ステップ又は材料及び特許請求される発明の基本的及び新規特徴に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替的実施形態において、移行句「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」のいずれかにより、より具体的に定義することができる。
[0086] 用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞も液体区域も含有しない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定されるものではないが、肉腫、癌腫及びリンパ腫、例えば、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散し、支持微小環境を提供し得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
[0087] 用語「血液悪性腫瘍」は、哺乳類の造血及びリンパ組織、例として、限定されるものではないが、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織の癌及び腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液悪性腫瘍を指す。
[0088] 本明細書において使用される用語「同等」又は「同等性」は、２つ以上のサンプルが類似する品質を指し得る。ある実施形態において、同等である２つ以上のサンプルは、同じ又はほぼ同じ治療有効性を有する。ある実施形態において、「同等」である２つ以上のサンプルは、同じ又はほぼ同じＣＤＲ３クローン多様性を有する。用語「約」の使用は、実験変動内（又は統計的実験誤差内）の近似値である。変動は、典型的には、記述される数又は数値範囲の０％～１５％、好ましくは、０％～１０％、より好ましくは、０％～５％である。
[0089] 誤解を避けるため、本明細書において、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と併せて記載される特定の特徴（例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基）は、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は実施例に、それと適合しない場合を除き適用可能であると理解されるべきであることが意図される。ゆえに、このような特徴は、適切な場合、本明細書に定義される定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと併せて使用することができる。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に開示される特徴の全て、及び／又はそのように開示される任意の方法又はプロセスのステップの全ては、特徴及び／又はステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、いかなる開示される実施形態のいかなる詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に開示される特徴の任意の新規の１つ、若しくは新規の組み合わせ、又はそのように開示される任意の方法、若しくはプロセスのステップの任意の新規の１つ若しくは任意の新規の組み合わせに及ぶ。
ＴＩＬ拡大法
[0090] 腫瘍浸潤リンパ球を拡大してＴＩＬの治療集団を産生する種々の方法は、当該技術分野において公知の方法である。以下の方法は、非限定的である。本明細書に開示される系及び方法がＴＩＬ、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）、及びＰＢＬの拡大、培養、及び製造の全ての方法と適合性であることが理解される。
[0090] 腫瘍浸潤リンパ球を拡大してＴＩＬの治療集団を産生する種々の方法は、当該技術分野において公知の方法である。以下の方法は、非限定的である。本明細書に開示される系及び方法がＴＩＬ、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）、及びＰＢＬの拡大、培養、及び製造の全ての方法と適合性であることが理解される。
[0091] プロセス２Ａとして公知の例示的なＴＩＬプロセスは、参照により全体として援用される米国特許第１０，１３０，６５９号に開示されており、特に米国特許第１０，１３０，６５９号に開示されている、プロセス１Ｃをプロセス２Ａと比較する図２、及びプロセス２Ａの種々の実施形態が留意される。例示的なプロセス２Ａ ＴＩＬ製造方法は、参照により全体として援用される米国特許出願公開第２０１８／０２８２６９４Ａ１号に開示されている。例示的なプロセス２Ａ ＴＩＬ製造方法は、参照により全体として援用される米国特許出願公開第２０１８／０２０７２０１Ａ１号にも開示されている。
[0092] ＴＩＬを拡大する他の方法は、以下に考察されている：Dudley,et al.,Science 2002,298,850-54；Dudley,et al.,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-57；Dudley,et al.,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-39；Riddell,et al.,Science 1992,257,238-41；Dudley,et al.,J.Immunother.2003,26,332-42。Rohann et al.,Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2018,6:102-118は、一般的なＴＩＬ製造及び治療ＴＩＬ集団の臨床使用を考察している。
[0093] ＴＩＬは、上記方法のいずれかにより拡大して本明細書に開示される方法及び系による使用に好適な細胞の集団を産生することができる。
ＣＤＲ３クロノタイプ法
核酸増幅法
[0094] 全細胞核酸をリンパ球の集団から単離し、種々の方法、例として、例えば、マルチプレックスＰＣＲの一実施形態である国際公開第２０１８／１６５５９３号、国際公開のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１８１６号に開示される二量体回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（dimer avoided multiplex polymerase chain reaction）（ｄａｍ－ＰＣＲ）を使用して増幅させることができる。Han et al.、及び／又は米国特許第９，９３８，５７８号は、混合ヌクレオチドサンプルを分析するマルチプレックス法であって、１つ以上の標的配列が非干渉、非キャンセル性標的特異的ポリヌクレオチド識別タグによりタグ付けされた増幅産物をポリヌクレオチド増幅を使用して産生し、非キャンセル性標的特異的ポリヌクレオチド識別タグ配列を介して増幅産物をパイロシーケンシングして１つ以上の特異的ポリヌクレオチド識別タグの存在を検出することを含む方法を開示している。特異的ポリヌクレオチド識別タグの存在は、特異的標的配列の存在と相関する。
核酸増幅法
[0094] 全細胞核酸をリンパ球の集団から単離し、種々の方法、例として、例えば、マルチプレックスＰＣＲの一実施形態である国際公開第２０１８／１６５５９３号、国際公開のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１８１６号に開示される二量体回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（dimer avoided multiplex polymerase chain reaction）（ｄａｍ－ＰＣＲ）を使用して増幅させることができる。Han et al.、及び／又は米国特許第９，９３８，５７８号は、混合ヌクレオチドサンプルを分析するマルチプレックス法であって、１つ以上の標的配列が非干渉、非キャンセル性標的特異的ポリヌクレオチド識別タグによりタグ付けされた増幅産物をポリヌクレオチド増幅を使用して産生し、非キャンセル性標的特異的ポリヌクレオチド識別タグ配列を介して増幅産物をパイロシーケンシングして１つ以上の特異的ポリヌクレオチド識別タグの存在を検出することを含む方法を開示している。特異的ポリヌクレオチド識別タグの存在は、特異的標的配列の存在と相関する。
[0095] 他の有用な方法としては、限定されるものではないが、参照により全体として援用される米国特許出願公開第２０１７／００８８８９５Ａ１号においてHanにより開示されているものが挙げられ、特に、ＣＤＲ３配列に指向されるプライマーを使用して資源サンプル中に存在するＣＤＲ３多様性の代表的コレクションを増幅させ、アセンブルする方法がフォーカスされる。このような方法としては、患者サンプル中のＣＤＲ３配列を、個体の指数群の最も一般に共有されるＣＤＲ３配列（すなわち、ｐＣＤＲ３）と比較することにより患者の免疫レパトアの多様性を決定する方法が挙げられる。患者のサンプル中のｐＣＤＲ３のこの割合は、「正常性指数」と称され、そのような患者における免疫レパトア多様性の診断指標として機能し得る。本開示は、高度に共有されるｐＣＤＲ３のそのようなサブセットを決定する方法をさらに含む。本開示の一態様において、患者の免疫レパトアは、患者の正常性指数が最小割合に一致し、又はそれを超過する場合に正常とみなされる一方、患者の免疫レパトアは、患者の正常性指数がそのような最小割合未満である場合に異常とみなされる。
[0096] 個体により発現されるＣＤＲ３は、極めて大きい多様性を示し、最大１０１５個の独特なＣＤＲ３が考えられる。したがって、本開示は、免疫系多様性の基準としてＣＤＲ３を使用する。Han（米国特許出願公開第２０１７／００８８８９５Ａ１号）は、７５００万個のＣＤＲ３のサンプリングに基づき、ランダム選択されたＣＤＲ３のおよそ８１％が所与の個体に独特なであり、複数の個体の間で共有されないことを開示している。Han（米国特許出願公開第２０１７／００８８８９５Ａ１号）は、高度に共有されるＣＤＲ３のプールを決定し、それにより、個体の免疫レパトアの多様性を同定することができる共有ＣＤＲ３の標準指数を可能とする方法を提供している。さらに、２つの異なる時点における単一対象の免疫レパトアを決定することができ、次いで本明細書に開示される方法を使用して以下に詳述されるとおり比較することができる。
[0097] リンパ球、例えば、Ｔ細胞及び／又はＴ細胞サブセットは、当該技術分野において公知の技術、例として、限定されるものではないが、アフェレシス、Ficoll-paque勾配を使用するＰＢＭＣの分離、ＦＡＣＳ、及び磁気ビーズ分離法を使用して単離し、及び／又はソートすることができる。
[0098] 区別されるＣＤＲ３配列を含むセットを含む免疫レパトアを決定するため、以下の例示的なアプローチを使用することができる：（ａ）標的特異的ネステッドプライマーを含む反応ミックス中で患者からの白血球の集団からポリヌクレオチドを増幅させて第１のアンプリコンのセットを産生し、標的特異的ネステッドプライマーの少なくとも一部は、増幅の間、第１のアンプリコン中への少なくとも１つの共通プライマーのための結合部位の取り込みのためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含むこと；（ｂ）第１のアンプリコンを含有する第１の反応ミックスの一部を、少なくとも１つの共通プライマーを含む第２の反応ミックスに移すこと；（ｃ）少なくとも１つの共通プライマーを使用して、第１のアンプリコンを増幅させて第２のアンプリコンのセットを産生すること；（ｄ）第２のアンプリコンをシーケンシングして白血球の亜集団におけるＣＤＲ３配列を同定すること、及び（ｅ）同定されたＣＤＲ３配列を使用してサンプルにより表されるｐＣＤＲ３の割合を定量して正常性指数を提供すること；及び（ｆ）正常性指数が正常であるか異常であるかを同定し、正常状態は、ｐＣＤＲ３の最小割合の存在により特徴付けられ、異常状態は、ｐＣＤＲ３の最小割合の不存在により特徴付けられること。このような方法は当該技術分野において公知であり、米国特許出願公開第２０１７／００８８８９５Ａ１号においてHanにより記載されている。
[0099] 他の有用な方法は、参照により全体として援用される米国特許第７，９９９，０９２号においてHanにより開示されており、ａｒｍ－ＰＣＲ及びａｒｍ－ＲＴ－ＰＣＲが留意される。まとめると、Han（米国特許第７，９９９，０９２号）は、核酸を増幅させてそれらの核酸の検出を可能とする方法であって、第１の増幅反応において高濃度の標的特異的プライマーを使用して１つ以上の標的核酸を増幅させ、それにより少なくとも１つの共通プライマー結合部位を含有する少なくとも１つの核酸アンプリコンを産生するステップ；少なくとも１つの核酸アンプリコンをレスキューするステップ；及び少なくとも１つの共通プライマー結合部位に結合する共通プライマーを利用して第２の増幅反応において少なくとも１つの核酸アンプリコンを増幅させるステップを含む方法を記載している。本発明の一態様は、ネステッド標的特異的プライマーを利用する。標的核酸は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み得、ヒトゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又はＲＴ－ＰＣＲにより実施することができる。標的核酸の資源は、１つ以上の臨床、環境、又は食料サンプルからのものであり得、方法は、種々の方式で、例として、例えば、臨床診断、環境サンプリング、プラント試験、食料安全性分析、遺伝障害の検出、及び／又は疾患病態の検出において使用することができる。方法は、ヒト及び／又は動物医学診断に使用することができる。
[00100] リンパ球の集団のＣＤＲ３レパトアを決定するための上記の及び参照により本明細書に援用される種々のHan開示を用いる別の例示的アプローチとしては、免疫レパトアを定量的に増幅させるマルチステップ反応におけるａｒｍ－ＰＣＲ及び／又はａｒｍ－ＲＴ－ＰＣＲが挙げられる。ＰＣＲの１回目のラウンドの間、Ｖ及びＣ遺伝子のそれぞれを標的化するネステッド遺伝子特異的プライマーを使用する。フォワードプライマー、Ｆｏ（フォワードアウト）及びＦｉ（フォワードイン）をＶ遺伝子中に局在させる。リバースプライマー、Ｒｏ（リバースアウト）及びＲｉ（リバースイン）をＣ遺伝子のそれぞれに局在させる。Ｆｉ及びＲｉプライマーは、それぞれRoche 454プラットフォーム（454及びGS Junior）のためのシーケンシングアダプターＢ及びＡも含む。Ｒｉプライマーについて、シーケンシングプライマーＡ及びＣ遺伝子特異的プライマー間にバーコードも存在する。結果として、シーケンシングは、プライマーＡのみからの単一末端リードに制限される。ＰＣＲの２回目のラウンドは、共用（シーケンシング）プライマーＢ及びＡを使用して実施する。ゲル精製後、得られた産物はRoche 454プラットフォームによるハイスループットシーケンシングに利用可能である。追加の酵素ステップは要求されない。ＰＣＲの１回目のラウンドは、バーコード及びシーケンシングプライマーをＰＣＲ産物中に導入する。増幅の指数増殖期はＰＣＲの２回目のラウンドにおいて共用プライマーにより達成され；したがってレパトア全体は、追加の増幅バイアスを導入せずに均等及び半定量的に増幅される。ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、混合細胞核酸サンプル、及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、そのような免疫レパトア増幅法に好適な出発点である。
[00101] クロノタイププロファイルを測定し、決定する代替アプローチは、参照により全体として援用される米国特許１０，１５５，９９２号に開示されており、特に再構成Ｔ細胞受容体ＣＤＲ３コード領域ＤＮＡ分子を増幅させる方法が留意される。Faham及びWillisは、増幅させたＤＮＡからＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤＲ３クロノタイプを展開させる詳細な方法を教示している。このような方法はＲＮＡフォーカス法を補うものであり、本発明により有利に使用される。一態様において、本発明は、ｍＲＮＡクロノタイプデータ及びＤＮＡの両方を利用して臨床的に有効なＴＩＬ集団を同定する方法を提供する。
[00102] それぞれの個体の適応免疫細胞のＤＮＡ及びそれらの関連ＤＮＡ転写産物中に組換えが存在するため、ＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）及びＤＮＡのいずれかを提供される発明の方法においてシーケンシングすることができる。Ｔ細胞受容体又は免疫グロブリン分子、又はその一部をコードするＴ細胞又はＢ細胞からの組換え配列は、クロノタイプと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子又は抗体をコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子からの配列に対応し得る。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ＴＣＲのα、β、γ、又はδ鎖をコードする配列に対応し得る。大多数のＴ細胞において、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖はＶＪ組換えにより生成され、β鎖受容体はＶ（Ｄ）Ｊ組換えにより生成される。ＴＣＲβ鎖について、ヒトにおいて４８個のＶセグメント、２つのＤセグメント、及び１３個のＪセグメントが存在する。２つのジャンクションのそれぞれにおいていくつかの塩基が欠失され得、他の塩基が付加され得る（Ｎ及びＰヌクレオチドと呼ばれる）。少数のＴ細胞において、ＴＣＲはγ及びδデルタ鎖からなる。ＴＣＲγ鎖はＶＪ組換えにより生成され、ＴＣＲδ鎖はＶ（Ｄ）Ｊ組換えにより生成される（Kenneth Murphy et al.,Janeway’s Immunology 9th edition,Garland Science,2016,ISBN-13:978-0815345503）。
[00103] 米国特許第１０，５５９，９９２号において教示される方法の特徴は、クロノタイプ発現を細胞レベルにおいて測定することができることである。例えば、クロノタイプを使用してゲノムＤＮＡに由来するクロノタイプ及びＲＮＡに由来する同じクロノタイプを測定することによりリンパ球を計数することができ、それによりクロノタイプの細胞ベース発現を決定することができる。サンプル中のリンパ球数及びクロノタイプ発現レベルを同時に測定する方法は、（ａ）個体から、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を含むサンプルを得るステップ；（ｂ）前記細胞のゲノムＤＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子をシーケンシングし、そのような空間的に単離された分子は、サンプル中のリンパ球の数に対応するクロノタイプの数を含むステップ；（ｃ）前記細胞のＲＮＡに由来する空間的に単離された個々の分子をシーケンシングし、そのような空間的に単離された個々の分子は、サンプルのリンパ球中のその発現レベルに対応するクロノタイプの数を含むステップ；並びに（ｄ）それぞれのクロノタイプについて、前記細胞のゲノムＤＮＡに由来する単離された個々の分子から決定された数及び前記細胞のＲＮＡに由来する単離された個々の分子から決定された数を比較することによりサンプルのリンパ球中のクロノタイプ発現レベルを決定するステップを含み得る。
[00104] このような免疫分子のマルチプレックスＰＣＲを実施するための指針は、参照により援用される以下の参照文献に見い出される：Morley、米国特許第５，２９６，３５１号；Gorski、米国特許第５，８３７，４４７号；Dau、米国特許第６，０８７，０９６号；Von Dongen et al.、米国特許出願公開第２００６／０２３４２３４号；欧州特許第１５４４３０８Ｂ１号、これらの全ては参照により本明細書に援用される。
[00105] 提供される発明の方法において使用することができる核酸を増幅させる他の手段としては、例えば、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、デジタルエマルジョンＰＣＲ（ｄｃＰＣＲ）、クローンＰＣＲ、増幅断片長多型ＰＣＲ（ＡＦＬＰ ＰＣＲ）、アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ（選択鎖のための大過剰のプライマーを使用する）、コロニーＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、インサイチュＰＣＲ、ロングＰＣＲ（約５キロベース超のＤＮＡの伸長）、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ（２つ以上のプライマーのペアを使用する）、シングルセルＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ループ介在等温ＰＣＲ（ＬＡＭＰ）、及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。他の増幅スキームとしては、リガーゼ鎖反応、ブランチＤＮＡ増幅、ローリングサークル増幅、サークル・サークル増幅（Circle to Circle Amplification）、ＳＰＩＡ増幅、捕捉及びライゲーションによる標的増幅（Target Amplification by Capture and Ligation）（ＴＡＣＬ）増幅、及びＲＡＣＥ増幅が挙げられる。
[00106] サンプル中のＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）中の情報は、逆転写を使用することによりｃＤＮＡに変換することができる。ポリＡプライマー、ランダムプライマー、及び／又は遺伝子特異的プライマーを慣用のプロトコルに従って逆転写反応において使用することができる。
[00107] さらに、例えば、ゲノムからのＤＮＡの増幅（又はＲＮＡ若しくはｍＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの形態の核酸の増幅）により、個々の核酸分子を単離し、任意選択で再増幅させ、次いで個々にシーケンシングすることができる。例示的な増幅プロトコルは、参照により全体として援用されるvan Dongen et al.,Leukemia,17:2257-2317(2003)又はvan Dongen et al.、米国特許第８，８５９，７４８号において形成することができる。簡潔に述べると、例示的なプロトコルは、以下のとおりである：反応緩衝液：ABI Buffer II又はABI Gold Buffer（Life Technologies,San Diego,Calif.）；５０μＬの最終反応容量；１００ｎｇのサンプルＤＮＡ；１０ｐｍｏｌのそれぞれのプライマー（下記のとおり増幅を均衡させるように調整に供する）；２００μＭの最終濃度におけるｄＮＴＰ；１．５ｍＭの最終濃度におけるＭｇＣｌ２（標的配列及びポリメラーゼに応じて最適化に供する）；Ｔａｑポリメラーゼ（１～２Ｕ／チューブ）；サイクリング条件：９５℃における予備活性化、７分；６０℃におけるアニーリング；サイクリング時間：３０秒間の変性；３０秒間のアニーリング；３０秒間の伸長。
[00108] プールから核酸を単離する方法としては、限定されるものではないが、固相基板（例えば、ガラススライド）上の二次元での分子の空間的分離、ミセル内の溶液中の三次元での分子の空間的分離（例えば、固相表面、例えば、ビーズ上の分子の固定化あり又はなしで油エマルジョンを使用して達成することができる）、又は例えば、マイクロ流体若しくはナノ流体チップ中のマイクロ反応チャンバの使用が挙げられる。希釈を使用して所与の容量、空間的領域、ビーズ、又は反応チャンバ中に平均して単一の分子が存在することを確保することができる。個々の核酸分子を単離するこのような方法についての指針は、以下の参照文献に見出される：Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012,ISBN:978-936113-42-2);Shendure et al.,Science,309:1728-1732（補足資料を含む）(2005)；米国特許第６，３００，０７０号；Bentley et al.,Nature 456:53-59（補足資料を含む）(2008)；米国特許第７，３２３，３０５号；Matsubara et al.,Biosensors & Bioelectronics,20:1482-1490(2005)；米国特許第６，７５３，１４７号、これらの全ては参照により本明細書に援用される。
[00109] さらに、核酸をシーケンシングするための任意のハイスループット技術を本発明の方法において使用することができる。ＤＮＡシーケンシング技術としては、標識ターミネーター又はプライマー及びスラブ又はキャピラリー中のゲル分離を使用するジデオキシシーケンシング反応（Sangar法）、可逆的に終結される標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、454シーケンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーションとそれに続くライゲーションを使用する合成によるシーケンシング、重合ステップの間の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニー（polony）シーケンシング、及びSOLiDシーケンシングが挙げられる。分離された分子のシーケンシングは、近年、ポリメラーゼ又はリガーゼを使用する連続又は単一伸長反応により、及びプローブのライブラリーを用いる単一又は連続ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより実証されている。これらの反応は、多くのクローン配列に対して並行して実施されており、例として、並行した１億個を超える配列の現在の商業的適用における実証が挙げられる。
[00110] ゆえに、これらのシーケンシングアプローチを使用してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のレパトアを試験することができる。本発明の一態様において、固相表面上で個々の分子を空間的に単離し、その表面上でそれらを並行してシーケンシングするステップを含むシーケンシングのハイスループット法が用いられる。このような固相表面としては、非多孔性表面（例えば、Solexaシーケンシングにおけるもの、例えば、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)又はComplete Genomicシーケンシング、例えば、Drmanac et al.,Science 327:78-81(2010)）、ビーズ又は粒子結合テンプレートを含み得るウェルのアレイ（例えば、454を用いるもの、例えば、Margulies et al.,Nature 437:376-380(2005)；Ion Torrentシーケンシング、米国特許第８，５７４，８３５号）、微細加工膜（例えば、SMRTシーケンシングを用いるもの、例えば、Eid et al.,Science 323:133-138(2009)）、又はビーズアレイ（例えば、SOLiDシーケンシング又はポロニーシーケンシングを用いるもの、例えば、Kim et al.,Science 316:1481-1414(2007)）を挙げることができる。種々のクロノタイプ増幅において、そのような核酸は、Bentley et al（上記引用）及び製造業者の説明書（例えば、TruSeq（商標）Sample Preparation Kit and Data Sheet,Illumina,Inc.,San Diego,Calif.,2010)；並びにさらに以下の参照文献：参照により援用される米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号；又は欧州特許第０９７２０８１Ｂ１号に記載のとおりブリッジＰＣＲにより並行して増幅させて別個のクローン集団、又はクラスタを形成し、次いでシーケンシングする。
[00111] 一実施形態において、固相表面上で配置され、増幅される個々の分子は、１ｃｍ２当たり少なくとも１０５個のクラスタの密度において；又は１ｃｍ２当たり少なくとも５×１０５個の密度において；又は１ｃｍ２当たり少なくとも１０６個のクラスタの密度においてクラスタを形成する。一実施形態において、比較的高いエラー率を有するシーケンシングケミストリーが用いられる。このような実施形態において、そのようなケミストリーにより産生される平均品質スコアは、配列リード長の単調減少関数である。一実施形態において、このような減少は、１～７５位における少なくとも１つのエラーを有する配列リードの０．５パーセント；７６～１００位における少なくとも１つのエラーを有する配列リードの１パーセント；及び１０１～１２５位における少なくとも１つのエラーを有する配列リードの２パーセントに対応する。
[00112] 免疫細胞クロノタイプの決定、特に、ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの同定に有用な追加の方法は、米国特許第１０，１５０，９９６号；米国特許第１０，０７７，４７８号；米国特許第１０，０７７，４７３号；米国特許第１０，０６６，２６５号；米国特許第９，８２４，１７９号；米国特許第９，５２８，１６０号；及び米国特許第９，４９９，８６５号に開示されており、それらのそれぞれは参照により全体として援用され、特に増幅法がフォーカスされる。
[00113] 同様に、免疫細胞クロノタイプを決定する有用な方法、特にＰＢＭＣの集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定する方法は、米国特許第１０，１５０，９９６号；米国特許第１０，０７７，４７８号；米国特許第１０，０７７，４７３号；米国特許第１０，０６６，２６５号；米国特許第９，８２４，１７９号；米国特許第９，５２８，１６０号；及び米国特許第９，４９９，８６５号に開示されている。このような方法は、本明細書に記載のｍＲＮＡベース法と同等であり、又はそれを補うものであり得る。
ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法
[00114] 一態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定することを含み、
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定すること
を含む方法を対象とする。
[00114] 一態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定することを含み、
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定すること
を含む方法を対象とする。
[00115] 種々の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定することは、当業者に公知の方法、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載の方法を使用して実施される。種々の実施形態において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定することは、当業者に公知の方法、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載の方法を使用して実施される。
[00116] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、（ａ）対象へのＴＩＬの治療集団の投与前に対象から単離されたＰＢＭＣの第２の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定するステップ；及び（ｂ）ステップ（ａ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するステップをさらに含む方法を対象とする。
[00117] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＰＢＭＣの第２の集団のクローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンは、ＴＩＬの治療集団の投与後に対象から単離されたＰＢＭＣの第１の集団のクローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンと異なる方法を対象とする。
[00118] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、少なくとも１つの集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定する方法を対象とする。
[00119] 一部の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、少なくとも１つの集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＲＮＡシーケンシングにより決定する方法を対象とする。一部の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＴＩＬの治療集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度及びＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡ及びＲＮＡシーケンシングの両方により決定する方法を対象とする。
[00120] 本発明の別の態様は、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較し、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度と比較してＴＩＬの臨床的に有効な集団を示す方法を提供する。
[00121] 本発明の別の態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、そのような独特なクローンの頻度は、ＲＮＡシーケンシングにより決定された場合に大きい方法を提供する。本発明の別の態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、そのような独特なクローンの頻度は、ＤＮＡシーケンシングにより決定された場合に大きい方法を提供する。
[00122] 本発明のさらに別の態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関する方法を提供する。本発明の他の態様は、本発明のさらに別の態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関しない方法を提供する。本発明の他の態様は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関し、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関しない方法を提供する。
[00123] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンは、ＲＮＡシーケンシングにより同定されるｍＲＮＡクローンである方法を対象とする。
[00124] 本開示の方法は、細胞の治療集団の投与後の種々の時点において実施することができる。ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３１日、約３２日、約３３日、約３４日、約３５日、約３６日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日、約４１日、約４２日、約４３日、約４４日、約４５日、約４６日、約４７日、約４８日、約４９日、約５０日、約５１日、約５２日、約５３日、約５４日、約５５日、約５６日、約５７日、約５８日、約５９日、及び／又は約６０日後に実施することができる。
[00125] 一部の実施態様において、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４２日、約４５日、約５０日、約５５日、及び／又は約６０日後に実施される。他の実施形態において、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４２日、約４５日、約５０日、約５５日、約６０日、約９０日、約１２０日、約１８０日、約１年、約２年、約３年、約４年、及び／又は約５年後に実施することができる。
[00126] 一部の実施形態において、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３１日、約３２日、約３３日、約３４日、約３５日、約３６日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日、約４１日、約４２日、約４３日、約４４日、約４５日、約４６日、約４７日、約４８日、約４９日、約５０日、約５１日、約５２日、約５３日、約５４日、約５５日、約５６日、約５７日、約５８日、約５９日、及び／又は約６０日後にｍＲＮＡを検出し得る。
[00127] 一部の実施形態において、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４２日、約４５日、約５０日、約５５日、及び／又は約６０日後にｍＲＮＡを検出し得る。他の実施形態において、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定する方法は、ＴＩＬの治療集団の投与の約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４２日、約４５日、約５０日、約５５日、約６０日、約９０日、約１２０日、約１８０日、約１年、約２年、約３年、約４年、及び／又は約５年後にｍＲＮＡを検出し得る。
[00128] 本発明の別の態様は、対象のＴ細胞レパトアを向上させる方法であって、（ｉ）本開示に従って腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定すること；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定された集団を選択し、拡大してＴＩＬの第２の臨床的に有効な治療集団を産生することを含む方法を提供する。他の態様において、本発明はさらに、ステップ（ｉｉ）において産生された拡大細胞を投与し、それにより対象のＴ細胞レパトアを向上させることを提供する。
[00129] 一部の実施形態において、核酸は、細胞のサブセットのサンプルから分析される。例えば、細胞表面マーカーを使用することにより細胞を分離する方法を用いることができる。例えば、細胞は、細胞ソーティングフローサイトメトリー、フローソーティング、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ビーズベース分離、例えば、磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ；例えば、抗体コート磁気粒子を使用するもの）、サイズベース分離（例えば、篩、又はフィルター）、マイクロ流体装置中のソーティング、抗体ベース分離、沈降、親和性吸着、親和性抽出、又は密度勾配遠心分離により単離することができる。ソーティングは、細胞サイズ、形態、又は細胞内若しくは細胞外マーカーに基づき得る。腫瘍細胞を単離し、又はソートする方法は、例えば、Nagrath et al.Nature 450:1235-1239(2007)；米国特許第６，００８，００２号、同第７，２３２，６５３号及び同第７，３３２，２８８号；国際公開２００８１５７２２０Ａ１号；並びに米国特許出願公開第２００８／０１３８８０５Ａ１号及び米国特許出願公開第２００９／０１８６０６５号；又はRosenberg et al.Cytometry 49:150-158(2002)に記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に援用される。
持続性を決定する方法
[00130] 一態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定すること；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定すること；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定すること
を含む方法を対象とする。
[00130] 一態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定すること；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定すること；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定すること
を含む方法を対象とする。
[00131] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、ＴＩＬの治療集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度及びＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）シーケンシングの両方により決定する方法を対象とする。
[00132] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、ＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）シーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較し、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度と比較されたＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）シーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの頻度は、そのようなクローンの持続性及び活性を示す方法を対象とする。
[00133] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、ＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）シーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較し、そのような独特なクローンの頻度は、ＲＮＡ（例として、ｍＲＮＡ）シーケンシングにより決定された場合に大きい方法を対象とする。
[00134] 対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する本発明の方法は、対象へのＴＩＬの治療集団の投与後の種々の時点において、例えば、ＴＩＬの治療集団の投与の約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３１日、約３２日、約３３日、約３４日、約３５日、約３６日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日、約４１日、約４２日、約４３日、約４４日、約４５日、約４６日、約４７日、約４８日、約４９日、約５０日、約５１日、約５２日、約５３日、約５４日、約５５日、約５６日、約５７日、約５８日、約５９日、約６０日、約９０日、約１２０日、約１８０日、約１年、約２年、約３年、約４年、及び／又は約５年後に単離されたＰＢＭＣに適用することができる。
ＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するための系
[00135] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、メモリ；１つ以上のプロセッサ；及びメモリ中に保存され、１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）ステップ（ｄ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な亜集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系を対象とする。
[00135] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、メモリ；１つ以上のプロセッサ；及びメモリ中に保存され、１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）ステップ（ｄ）においてソートされたＰＢＭＣの第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な亜集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系を対象とする。
[00136] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、（ｉ）対象へのＴＩＬの治療集団の投与前に対象から単離されたＰＢＭＣの第２の集団のクローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定するステップ；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するステップを実施するための指示を含むモジュールをさらに含む系を対象とする。
[00137] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、ＰＢＭＣの第２の集団のＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＰＢＭＣの第１の集団のＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンと比較するための指示を含むモジュールをさらに含む系を対象とする。
[00138] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、ＤＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む系を対象とする。
[00139] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、ＲＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む系を対象とする。
[00140] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、ＲＮＡ配列データ及びＤＮＡ配列データの両方に基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む系を対象とする。
[00141] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの頻度と比較するための指示を含むモジュールをさらに含み、比較は、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を示す系を対象とする。例示的なモジュールは図９に示され、それぞれのサンプルにおける検出された全てのクローン及びクローン頻度を含めることにより対象ごとのデータセットを生成する。このモジュールからの結果を、同様に図９に示される追加のモジュールにより処理して共有クローン統計値を生成し、クローン発現パターンを決定し、持続クロノタイプを決定することができる。さらなる例示的なモジュールは、系の他のモジュールからの出力に基づき箱ひげ図、散布図、及びヒートマップを生成するための指示をコードする。
[00142] 別の態様において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、少なくとも１つのモジュールをさらに含み、モジュールは、ｍＲＮＡクローンであるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンから得られたデータを操作するための指示をコードし、そのようなデータは、ＲＮＡシーケンシングにより決定された系を対象とする。
持続性のための系
[00144] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系であって、メモリ；１つ以上のプロセッサ；及びメモリ中に保存され、１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するため
の指示を含む系を対象とする。
[00144] 別の態様において、本発明は、対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系であって、メモリ；１つ以上のプロセッサ；及びメモリ中に保存され、１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの治療集団及びＰＢＭＣの第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの第１の集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を、ＴＩＬの治療集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度と比較して対象に投与された治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するため
の指示を含む系を対象とする。
[00145] 別の態様において、本発明は、ＤＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含むように改変された、上記ＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系を対象とする。
[00146] 別の態様において、本発明は、ＤＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含むように適宜改変された、上記ＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系のいずれかを対象とする。
[00147] 別の態様において、本発明は、ＲＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含むように適宜改変された、上記ＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系のいずれかを対象とする。
[00148] 別の態様において、本発明は、ＲＮＡ配列データ及びＤＮＡ配列データの両方に基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含むように適宜改変された、上記ＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系のいずれかを対象とする。
[00149] 別の態様において、本発明は、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの頻度と比較するための指示を含むモジュールをさらに含むように適宜改変され、比較は、治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を示す、上記ＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定するための系のいずれかを対象とする。例示的なモジュールは図９に示され、それぞれのサンプルにおける検出された全てのクローン及びクローン頻度を含めることにより対象ごとのデータセットを生成する。このモジュールからの結果を、同様に図９に示される追加のモジュールにより処理して共有クローン統計値を生成し、クローン発現パターンを決定し、持続クロノタイプを決定することができる。さらなる例示的なモジュールは、系の他のモジュールからの出力に基づき箱ひげ図、散布図、及びヒートマップを生成するための指示をコードする。
腫瘍タイプ
[00150] 一部の実施形態において、本発明の方法は、癌を罹患する対象の腫瘍サンプルから拡大された初期ＴＩＬを利用する。腫瘍サンプルは、当該技術分野において公知の方法を使用して、一般に、外科的切除、針生検又は腫瘍及びＴＩＬ細胞の混合物を含有するサンプルを得るための他の手段を介して得ることができる。一般に、腫瘍サンプルは、任意の固形腫瘍、例として、原発性腫瘍、侵襲性腫瘍又は転移性腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、液性腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍から得られる腫瘍でもよい。固形腫瘍は、任意の癌タイプ、例として、限定されるものではないが、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、及び皮膚癌（例として、限定されるものではないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫）のものであり得る。
[00150] 一部の実施形態において、本発明の方法は、癌を罹患する対象の腫瘍サンプルから拡大された初期ＴＩＬを利用する。腫瘍サンプルは、当該技術分野において公知の方法を使用して、一般に、外科的切除、針生検又は腫瘍及びＴＩＬ細胞の混合物を含有するサンプルを得るための他の手段を介して得ることができる。一般に、腫瘍サンプルは、任意の固形腫瘍、例として、原発性腫瘍、侵襲性腫瘍又は転移性腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、液性腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍から得られる腫瘍でもよい。固形腫瘍は、任意の癌タイプ、例として、限定されるものではないが、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、及び皮膚癌（例として、限定されるものではないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫）のものであり得る。
[00151] 一部の実施形態において、対象は、固形腫瘍癌を罹患している。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫（例として、ブドウ膜黒色腫）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる癌、頭頸部癌（例として、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、脳癌膠芽腫（例として、ＧＢＭ）、消化管癌、腎臓癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、固形腫瘍は、黒色腫である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、子宮頸癌である。
[00152] 一部の実施形態において、対象は、血液悪性腫瘍又は「液性癌」を罹患している。血液悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、ＣＬＬである。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、ＡＭＬである。
[00153] 本発明の系の実施形態は、本明細書に開示の態様の一部のみを提供し得ることが理解される。
[00154] 本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載される一方、そのような実施形態は例として提供されるにすぎず、他の点で本発明の範囲を限定するものではない。本発明の記載される実施形態の種々の代替物を本発明の実施において用いることができる。
実施例
[00155] 本明細書に包含される実施形態は、目下、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、説明の目的のために提供されるにすぎず、本明細書に包含される本開示はそれらの実施例に限定されると決して解釈すべきでなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全てのバリエーションを包含すると解釈すべきである。
[00155] 本明細書に包含される実施形態は、目下、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、説明の目的のために提供されるにすぎず、本明細書に包含される本開示はそれらの実施例に限定されると決して解釈すべきでなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全てのバリエーションを包含すると解釈すべきである。
実施例１：黒色腫患者におけるｕＣＤＲ３クローン多様性
[00156] 進行性転移性黒色腫のＣ－１４４－０１試験においてリフィレウセル（lifileucel）（ＬＮ－１４４）を受容する２５人の転移性黒色腫患者を判定した。初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞の組成を分析してｕＣＤＲ３クローン多様性、及びＴＩＬ持続性を評価した。
[00156] 進行性転移性黒色腫のＣ－１４４－０１試験においてリフィレウセル（lifileucel）（ＬＮ－１４４）を受容する２５人の転移性黒色腫患者を判定した。初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞の組成を分析してｕＣＤＲ３クローン多様性、及びＴＩＬ持続性を評価した。
[00157] ＴＩＬ産物は自家Ｔ細胞のポリクローナル調製物であり、それぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定することができる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＩＬ産物及び対応する輸注後末梢血サンプルのＣＤＲ３を、市販のiRepertoire技術（Huntsville,AL）を使用するＲＮＡ－ｓｅｑに供した。iRepertoire技術の説明については、例えば、（ｉ）Han,Jian,Method for Evaluating and Comparing Immunorepertoires、米国特許第９０１２１４８号、及び（ｉｉ）Han,Jian,Method for Evaluating and Comparing Immunorepertoires、米国特許第９０１２１４８号参照、それらのそれぞれの内容は参照により全体として全ての目的のために本明細書に援用される。
[00158] ＰＢＭＣをそれぞれの患者から回収してからそれらのパーソナライズされたＴＩＬ治療物を投与した。治療ＴＩＬ投与の４２日後、患者ＰＢＭＣを再度回収した。
[00159] それぞれのサンプルについて、（１）パーソナライズされたＴＩＬ治療物；（２）処理前ＰＭＢＣ；及びＴＩＬ輸注の４２日後に回収されたＰＢＭＣのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤＲ３多様性を決定した。それぞれの個々の細胞集団について、核酸を単離し、精製した。単離ｍＲＮＡを使用してそれぞれのサンプル中のｕＣＤＲ３を同定した。
[00160] シーケンシング後、Pythonバージョン3.6.3を使用する二次分析ツールを開発した。全ての分析及び図をAnaconda3パッケージ及び環境マネジメントシステムにおいて生成した。図２～７のデータを産生するためのステップのまとめは、以下のとおりであった。
[00161] 未加工シーケンシングデータを最初に予備的に分析してサンプルごとのまとめのＣＤＲ３クローン頻度データを線iRepertoireクロノタイプ配列データ（ray iRepertoire clonotype sequence data）に基づき産生し、次いで以下を決定した：（１）総リード／ＣＤＲ３カウントをシーケンシングにより生成し；（２）サンプルについて独特なＣＤＲ３（ｕＣＤＲ３）クローンのカウント、次いでシャノン多様性指数を計算した。図２参照。
[00162] 次に、対象ごとのデータセットを系により生成した：第１のそれぞれのサンプルを１０００万リードベースラインに正規化し、次いで対象ごとのクローンの包括的リスト及び関連ｕＣＤＲ３頻度をそれぞれのサンプルについて生成した。次に、系はそれぞれの対象についての共有クローン統計値を分析した：それぞれのサンプルについてのｕＣＤＲ３カウントを確認し；次いで２つのサンプル中で見出されるｕＣＤＲ３（共有ｕＣＤＲ３）のカウントを決定した。これらは、それぞれの対象についての適合ＴＩＬ産物及びＰＢＭＣサンプルである。次いで、それぞれのサンプル中の共有ｕＣＤＲ３の頻度の和を計算し、それぞれのサンプルにおける総ｕＣＤＲ３クローンに対する共有ｕＣＤＲ３クローンの寄与を計算した。
[00163] 次に、ｕＣＤＲ３クローン拡大パターンを決定した。最初に、４２日目の１０個の最も高頻度の共有クローンを同定した。次いで、ＴＩＬ産物におけるクローンのそれぞれのパーセンタイルを決定し、例えば、１００のクローン１は１％であり；１００のクローン１００は１００％である。図６参照。最後に、系は対象ごとの全てのパーセンタイルの散布図を生成した。
[00164] 次に、持続性ｕＣＤＲ３クロノタイプを決定した。最初に、それぞれの対象において持続性のクローンの包括的リストを、全対象の持続性クローンリストに合わせた。次いで、持続クローンを強調する対象に対するクローンのヒートマップを決定した、例えば図７参照。
[00165] 最後に、系の種々のモジュールを使用して、包括的な箱ひげ図を産生して総データセットを記載し、特徴付け、以下のプロットのそれぞれを含んだ：
１．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞最良総合効果、
２．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞最良総合結果、
３．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞奏功、
４．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞奏功、
５．ＴＩＬ共有部分＞奏功、
６．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞奏功、
７．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞奏功、
８．Ｄ４２共有部分＞奏功、
９．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞奏功、
１０．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞奏功、
１１．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞奏功、
１２．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞径和の４２日目の低減、
１３．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞径和の４２日目の低減
１４．ＴＩＬ共有部分＞径和の４２日目の低減、
１５．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞径和の４２日目の低減
１６．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞径和の４２日目の低減、
１７．Ｄ４２共有部分＞径和の４２日目の低減、
１８．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞径和の４２日目の低減、
１９．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞径和の４２日目の低減、
２０．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞径和の４２日目の低減、
２１．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞ＤＣＲ、
２２．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞ＤＣＲ、
２３．ＴＩＬ共有部分＞ＤＣＲ、
２４．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞ＤＣＲ、
２５．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞ＤＣＲ、
２６．Ｄ４２共有部分＞ＤＣＲ、
２７．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞ＤＣＲ、
２８．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞ＤＣＲ、
２９．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞ＤＣＲ
１．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞最良総合効果、
２．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞最良総合結果、
３．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞奏功、
４．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞奏功、
５．ＴＩＬ共有部分＞奏功、
６．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞奏功、
７．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞奏功、
８．Ｄ４２共有部分＞奏功、
９．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞奏功、
１０．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞奏功、
１１．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞奏功、
１２．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞径和の４２日目の低減、
１３．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞径和の４２日目の低減
１４．ＴＩＬ共有部分＞径和の４２日目の低減、
１５．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞径和の４２日目の低減
１６．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞径和の４２日目の低減、
１７．Ｄ４２共有部分＞径和の４２日目の低減、
１８．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞径和の４２日目の低減、
１９．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞径和の４２日目の低減、
２０．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞径和の４２日目の低減、
２１．ＴＩＬ独特なＣＤＲ３配列（＃）＞ＤＣＲ、
２２．ＴＩＬシャノンエントロピー（指数）＞ＤＣＲ、
２３．ＴＩＬ共有部分＞ＤＣＲ、
２４．Ｄ４２独特なＣＤＲ３配列（＃）＞ＤＣＲ、
２５．Ｄ４２シャノンエントロピー（指数）＞ＤＣＲ、
２６．Ｄ４２共有部分＞ＤＣＲ、
２７．共有ＴＩＬ及びＤ４２ｕＣＤＲ３（＃）＞ＤＣＲ、
２８．ＴＩＬにおける共有ｕＣＤＲ３（％）＞ＤＣＲ、
２９．Ｄ４２における共有ｕＣＤＲ３（％）＞ＤＣＲ
[00166] 図２は、奏功しない患者（ｎ＝２８）（それぞれのプロットの左分布）の全クローン多様性及び奏功患者（ｎ＝１０）（それぞれのプロット右分布）の全クローン多様性を示す。ＴＩＬ産物及び４２日目ＰＢＭＣ間で共有されるｕＣＤＲ３クローンの頻度の詳細なまとめを、図３に報告する。独特なＴＣＲ ＣＤＲ３配列（ｕＣＤＲ３）の平均数はＴＩＬ産物にわたり１７５１１［３５７４～１１０７９７］個であり、シャノン多様性指数は２．７から１０．８まで変動した。相関分析は、いずれかのパラメータ及び臨床奏功間に関連がないことを明らかにし、腫瘍反応性Ｔ細胞は、バルクＴＩＬにおける多様性のレベルにより影響されないことを示唆した（図４及び図５参照）。
[00167] 輸注４２日後、図６に示されるとおりＴＩＬクローンを患者の１００％の循環中で検出することができた。これらの共有ｕＣＤＲ３は、２８～６９６４個の独特なクロノタイプまで変動するレベルにおいて見出され、ＴＩＬ産物及び４２日目循環Ｔ細胞の両方の高度に変動性の分画を表した。
[00168] 大多数の共有ｕＣＤＲ３は登録時に患者の末梢血中で検出されず、それらがＴＩＬ投与後に持続する腫瘍内クロノタイプを表すことを示した。さらに、ＴＩＬ産物中で高い又は低い頻度において表される共有ｕＣＤＲ３クローンは、輸注後少なくとも６週間持続し得た。最後に、図６及び７は、個々の奏功及び非奏功患者において持続クローンの９７％超が独特なに存在したことを示し、それぞれのＴＩＬ調製物における独特なレパトアを示した。
実施例２：進行性黒色腫患者における凍結保存ＴＩＬ産物の持続性
[00170] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用する養子細胞移植は、推定上それぞれの腫瘍に特異的な体細胞突然変異を標的化することにより多くの治療歴を有する患者において持続的及び完全奏功を誘発する転移性黒色腫及び他の固形腫瘍における有効な処置として認識される（Rosenberg et al.CCR 2011）。既に、抗ＰＤ－１難治性進行性黒色腫を有し、リフィレウセルにより処置された患者が、３８％の全奏効率を示すことが報告された（SITC Nov2018）。ここで、初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞（Ｄ４２）の組成を分析してクローン多様性、ＴＩＬインビボ持続性、及び抗腫瘍活性間の潜在的な結び付きを明らかにした。
[00170] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用する養子細胞移植は、推定上それぞれの腫瘍に特異的な体細胞突然変異を標的化することにより多くの治療歴を有する患者において持続的及び完全奏功を誘発する転移性黒色腫及び他の固形腫瘍における有効な処置として認識される（Rosenberg et al.CCR 2011）。既に、抗ＰＤ－１難治性進行性黒色腫を有し、リフィレウセルにより処置された患者が、３８％の全奏効率を示すことが報告された（SITC Nov2018）。ここで、初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞（Ｄ４２）の組成を分析してクローン多様性、ＴＩＬインビボ持続性、及び抗腫瘍活性間の潜在的な結び付きを明らかにした。
[00171] ＴＩＬ産物はポリクローナル自家Ｔ細胞の調製物であるため、それぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定することができる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＩＬ産物及び対応する輸注後末梢血サンプルのＣＤＲ３を、iRepertoire技術（Huntsville,AL）を使用するＲＮＡ－ｓｅｑに供した。
[00172] 独特なＴＣＲ ＣＤＲ３配列（ｕＣＤＲ３）の平均数はＴＩＬ産物にわたり１７５１１［３５７４～１１０７９７］個であり、シャノン多様性指数は２．７から１０．８まで変動した。相関分析は、いずれかのパラメータ及び臨床奏功間に関連がないことを明らかにし、腫瘍反応性Ｔ細胞が低い及び高い多様性のバルクＴＩＬ産物中に存在し得ることを示唆した。Ｄ４２において、ＴＩＬクローンは、全ての処置患者の循環中で検出することができた。共有ｕＣＤＲ３の数は２８～６９６４個の独特なクロノタイプまでの範囲であり、ＴＩＬ産物及びＤ４２循環Ｔ細胞の両方の高度に変動性の分画を表した。共有Ｔ細胞クローン及び臨床奏功間の結び付きは、既に仮定された（Robbins et al.J Immunol 2004）。本試験において、同等の割合の共有ｕＣＤＲ３が奏功者及び非奏功者において検出された。重要なことに、大多数の共有ｕＣＤＲ３は、登録時に患者の末梢血中で検出されず、これらがＴＩＬ投与後に持続する腫瘍内クロノタイプを表すことを示した。さらに、ＴＩＬ産物中で高い又は低い頻度において表される共有ｕＣＤＲ３クローンは、輸注後少なくとも６週間持続し得た。最後に、個々の奏功及び非奏功患者において持続クローンの９７％超が独特なに存在し、それぞれのＴＩＬ調製物における独特なレパトアを示した。
[00173] まとめると、データはＴＩＬクローンの分画が全ての患者において持続したことを実証する。奏功と関連するクローンプロファイルの独特な性は、活性のメディエーターとしての単一ＴＣＲの同定の困難を強調し、関連独特な、患者特異的、突然変異及びネオ抗原スペクトルを有する固形腫瘍を処置するためのポリクローナル産物、例えば、バルクＴＩＬの使用を支持する。
実施例３：凍結保存ＴＩＬにおけるｕＣＤＲ３クローン多様性及び進行性転移性黒色腫におけるＴＩＬの持続性
[00174] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用する養子細胞移植は、推定上それぞれの腫瘍に特異的な体細胞突然変異を標的化することにより多くの治療歴を有する患者において持続的及び完全奏功を誘発する転移性黒色腫及び他の固形腫瘍における有効な処置として認識される（Rosenberg et al.CCR 2011）。既に、抗ＰＤ－１難治性進行性黒色腫を有し、リフィレウセルにより処置された患者が、３８％の全奏効率を示すことが報告された（SITC Nov2018）。ここで、初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞（Ｄ４２）の組成を分析してクローン多様性、ＴＩＬインビボ持続性、及び抗腫瘍活性間の潜在的な結び付きを明らかにした。
[00174] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用する養子細胞移植は、推定上それぞれの腫瘍に特異的な体細胞突然変異を標的化することにより多くの治療歴を有する患者において持続的及び完全奏功を誘発する転移性黒色腫及び他の固形腫瘍における有効な処置として認識される（Rosenberg et al.CCR 2011）。既に、抗ＰＤ－１難治性進行性黒色腫を有し、リフィレウセルにより処置された患者が、３８％の全奏効率を示すことが報告された（SITC Nov2018）。ここで、初期ＴＩＬ産物及び輸注の４２日後に循環するＴ細胞（Ｄ４２）の組成を分析してクローン多様性、ＴＩＬインビボ持続性、及び抗腫瘍活性間の潜在的な結び付きを明らかにした。
[00175] 臨床試験Ｃ－１４４－０１は、自家ＴＩＬ（リフィレウセル、ＬＮ－１４４とも称される）を調査する進行中の第２相多施設試験である。患者母集団は、チェックポイント阻害剤及びＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤で進行した切除不能の転移性黒色腫を有する患者を含む。ＴＩＬをハーベストし、拡大し、凍結保存し、次いで輸注のために調製し、図１０に記載の２２日間プロセスに従って患者中に輸注した。合計２７個の適合ペアサンプル（すなわち、同じ患者からの１つのＴＩＬ産物サンプル及び１つのＤ４２ＰＢＭＣサンプル）を分析した。
[00176] ＴＩＬ産物はポリクローナル自家Ｔ細胞の調製物であるため、それぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定することができる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Qiagen RNeasy Mini Kit Protocolを使用して総ＲＮＡを抽出した。ＴＩＬ産物及び対応する輸注後末梢血サンプルのＣＤＲ３を、iRepertoire技術（Huntsville,AL）を使用するＲＮＡ増幅及びシーケンシングに供した。カスタムpythonスクリプトを使用して目的ＣＤＲ３クローンを同定し、統計的分析を実施した。シーケンシング後、独特なＣＤＲ３配列カウントを計算し、図１１Ａにプロットした。相関分析は、ＴＣＲクロノタイプの数又は多様性スコア及び臨床奏功間に関連がないことを示唆すると考えられた。非奏功者（ｎ＝１７）及び奏功者（ｎ＝１０）は、類似の結果を示した（ｐ＝０．２４４７）。同じサンプルについて、シャノンエントロピーも計算し、図１１Ｂにプロットした。ここでも、非奏功者（ｎ＝１７）及び奏功者（ｎ＝１０）は類似の結果を示した（ｐ＝０．２４９９）。両方の変数についての中央値を、箱ひげ図のそれぞれにおいて水平線により示す。群は固形腫瘍における奏功評価基準に基づき、奏功群は部分又は完全奏功を有する対象を含み、非奏功群は安定又は進行疾患を有する対象を含む。独特なＴＣＲ ＣＤＲ３配列（ｕＣＤＲ３）の平均数はＴＩＬ産物にわたり１７５１１［３５７４～１１０７９７］個であり、シャノン多様性指数は２．７から１０．８まで変動した。クロノタイプの数及び臨床奏功間の相関の欠落は、腫瘍反応性Ｔ細胞が低い及び高い多様性のバルクＴＩＬ産物中に存在し得ることを示唆する。これは、バルクＴＩＬ産物が腫瘍抗原の事前知識なしで関連ＴＩＬを回収し得ることを裏付ける。
[00177] 共有ＣＤＲ３の数は、対応するＴＩＬ産物中にも存在した循環（Ｄ４２サンプル）中の検出されたＣＤＲ３クローンの数を測定することにより決定した。共有ＣＤＲ３は、２８～約６９００個のクローンで変動するレベルにおいて分析された全てのＤ４２サンプル中で検出されていた。図１２Ａは、初期ＴＩＬ産物（黒色棒）中及びＤ４２サンプル（灰色棒）中のクローンの数を説明する。クローン頻度をＴＩＬ産物、Ｄ４２サンプル、及び輸注前ＰＢＭＣについて計算してＴＩＬクローンが患者血液中に既に存在したか否かを評価した。この特定の検定について、ｎ＝１５である。結果を割合として表現される共有クローン頻度の和の棒グラフとして図１２Ｂに示す。同定された２９，７４５個の共有クローンのうち、６９％（又は２０，４８０個）は輸注前に検出可能でなかった。これは、（ｉ）インビボ持続ＴＩＬクローンがＴＩＬ輸注前の血液中に存在せず、又はかなり低い頻度において存在すること、及び（ｉｉ）ＴＩＬ産物拡大は腫瘍抗原特異的であることを示唆する。
[00178] 上位１０個の持続クローンをＴＩＬ産物及びＤ４２サンプルにおいて評価し、ランク付けした。図１３におけるそれぞれの点は、患者ごとに上位ランキングクローンのそれぞれについてのＴＩＬ産物内の割合としてのランクを説明する。ＴＩＬ産物中の最も高頻度のクローンは最小値に対応し；最小頻度クローンは最大値（１００により近い）に対応する。持続クローンはＴＩＬ産物中で高い及び低い頻度の両方において見出され、ｕＣＤＲ３クローンは、ＴＩＬ産物中の高い又は低い頻度にかかわらず輸注後少なくとも６週間持続し得た。このデータは、ＴＩＬ産物中のクローンの存在量が血液中のＤ４２循環レベルにおけるその存在量と相関しないことを示唆する。これは、クローンがそのコグネイト抗原と遭遇するためインビボでのＴＩＬの周期的拡大を示す。
[00179] 持続Ｔ細胞クローン及び臨床奏功の相関も分析した。ＴＩＬ産物及びＤ４２サンプルの両方で検出されたクローンの数を、ＴＩＬ産物中のｕＣＤＲ３クローンの数により除算して持続クローンの割合を決定した。ＴＩＬ産物及び４２日目におけるインビボ循環Ｔ細胞間の重複、又は共有ｕＣＤＲ３の尺度（％で示す、ｐ＝０．０４８４）を、非奏功者（ｎ＝１７）及び奏功者（ｎ＝１０）について図１４において箱ひげ図として示す。両方の変数の中央値を、箱ひげ図のそれぞれにおいて水平線により示す。このデータは、臨床奏功がインビボＴＩＬ持続性と関連し得ることを示唆する。
[00180] ２７人の対象から合計４７，５０８個の持続クローンを同定した。ＣＤＲ３アラインメントは、４５，９４４個の配列（９６．７％）が１人のみの対象において見出されたことを明らかにした（図１５Ａ参照）。４５個の配列が４人超の対象において見出され；それらの１７個（３７．８％）は、非腫瘍関連エピトープ（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザなどを認識することが既に同定されたＣＤＲ３に対応した（https://vdjdb.cdr3.net参照）。図１５Ｂは、このデータを表形式で説明する。データは、クローン共通性及び臨床奏功間に関連がないこと、並びにＴ細胞レパトア、例として、潜在的に腫瘍特異的なクローンがそれぞれのＴＩＬ調製物について独特なであることを示唆する。
[00181] まとめると、データは、関連独特な、患者特異的、突然変異及びネオ抗原スペクトルを有する固形腫瘍を処置するためのポリクローナル産物、例えば、バルクＴＩＬ産物の使用を支持する。データは、図１０に記載のプロセスにより製造されたＴＩＬ産物の１００％が輸注の６週間後におけるレベルのインビボ持続性を実証することを実証する。ＴＩＬ産物は高度にポリクローナルであるが、独特なクローンの数も多様性指数も臨床奏功に関連しない。個々のＴ細胞クローンのインビボ運命は、輸注産物におけるそれらの頻度に依存すると考えられず、それらの特異的抗原反応性を反映する。さらに、ＴＩＬ産物はそれぞれの患者に高度に特異的であり、独特なＴＣＲレパトアを含む。
実施例４：子宮頸癌患者における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）産物ＬＮ－１４５のインビボ持続性
[00182] 臨床試験Ｃ－１４５－０４（ＮＣＴ０３１０８４９５）は、自家ＴＩＬ（ＬＮ－１４５とも呼ばれる）を調査する進行中の第２相多施設試験である。転移性、再発性、又は持続性子宮頸癌を有する患者を、エクスビボ拡大自家ＴＩＬ産物（ＬＮ－１４５）により処置した。全奏効率は４４％であり、病勢コントロール率は８５％であった。
[00182] 臨床試験Ｃ－１４５－０４（ＮＣＴ０３１０８４９５）は、自家ＴＩＬ（ＬＮ－１４５とも呼ばれる）を調査する進行中の第２相多施設試験である。転移性、再発性、又は持続性子宮頸癌を有する患者を、エクスビボ拡大自家ＴＩＬ産物（ＬＮ－１４５）により処置した。全奏効率は４４％であり、病勢コントロール率は８５％であった。
[00183] 輸注前ＬＮ－１４５産物中の初期ＴＩＬ及び輸注の４２日後に血中で循環するＴ細胞（Ｄ４２）を分析してクローン多様性、ＴＩＬインビボ持続性、及び抗腫瘍活性間の関連を明らかにした。ＴＩＬ産物中のそれぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定可能な独特なＴ細胞受容体を発現する。これらのＴ細胞クローンについての独特なＣＤＲ３配列（ｕＣＤＲ３）及びシャノンエントロピーを、上記実施例において考察される方法を使用して同定した。試験Ｃ－１４５－０４からの初期ＬＮ－１４５ ＴＩＬ及び同じ患者からの対応するＤ４２輸注後の末梢血をＣＤＲ３ ＲＮＡシーケンシング（iRepertoire,Huntsville,AL）に供した。輸注前ＬＮ－１４５のｕＣＤＲ３カウント及びシャノン多様性指数は、それぞれ１，１６７～６１，１６７個及び４．８～１１．４の高い変動性を全奏効率及び病勢コントロール率コホートの両方において示し、低い及び高い多様性のＬＮ－１４５の両方が腫瘍反応性Ｔ細胞を含有し得ることを示唆した。Ｄ４２末梢血サンプルにおいて、平均２０７９個のＬＮ－１４５由来クローンが全ての患者において存在し、それぞれ、ＬＮ－１４５及びＤ４２血液ｕＣＤＲ３の１２％及び２０％を表した。しかしながら、これらの共有ｕＣＤＲ３は、ＬＮ－１４５（６２％）及びＤ４２サンプル（５２％）の両方の総ＣＤＲ３レパトアのかなりの部分を表した。輸注前ＬＮ－１４５及びＤ４２血液間の重複は、臨床奏功と相関しなかった。ＬＮ－１４５及びＤ４２に共通するほとんどのクローンは登録時に末梢血中で検出されず、推定されるそれらのＬＮ－１４５起源及び輸注後持続性を示した。初期ＴＩＬ産物におけるそれぞれの持続クローンの頻度は、Ｄ４２血液における普及を予測しなかった。最後に、持続クローンの９８％（３２３２９個／３２７５７個）超が個々の奏功及び非奏功患者に特異的であり、それぞれのＴＩＬ調製物における独特なレパトアを示した。
[00184] まとめると、ＴＩＬクローンの分画はこの高度に奏功する集団の全ての患者において持続した。それぞれのＴＩＬ産物と関連するクローンプロファイルの独特な性は、活性の共通メディエーターとしての単一ＴＣＲの同定の困難を強調し、関連プライベート、患者特異的、突然変異及びネオ抗原スペクトルを有する固形腫瘍を処置するためのポリクローナル産物、例えば、バルクＴＩＬの使用を支持する。
実施例５：ＴＩＬ産生プロセス同等性を決定するためのＴＣＲレパトア分析の使用
[00185] ＴＩＬ産物はポリクローナル自家Ｔ細胞の調製物であるため、それぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定することができる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＩＬ集団の治療有効性は、集団におけるＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性と相関し得る。しかしながら、施設ごとの製造プロセスにおける変動性が、軽微であるが、ＴＩＬ集団のＣＤＲ３クローン多様性、したがってその治療有効性に影響し得る。したがって、異なる施設において産生されたＴＩＬ集団の同等性を決定する方法が望まれる。ある実施形態において、本開示は、ＴＣＲレパトア分析を使用してＴＩＬ産生プロセス同等性を決定する方法であって、第１のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性、例として、第１のサンプル中でＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第１のセットを決定すること；第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性、例として、第２のサンプル中でＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第２のセットを決定すること；第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数を決定すること；（ｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比、及び／又は（ｉｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定すること；並びに前記比に基づき、第１のサンプル中のＴＩＬ及び第２のサンプル中のＴＩＬの同等性を決定することを含む方法を提供する。
[00185] ＴＩＬ産物はポリクローナル自家Ｔ細胞の調製物であるため、それぞれのＴ細胞クローンは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）により同定することができる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＩＬ集団の治療有効性は、集団におけるＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性と相関し得る。しかしながら、施設ごとの製造プロセスにおける変動性が、軽微であるが、ＴＩＬ集団のＣＤＲ３クローン多様性、したがってその治療有効性に影響し得る。したがって、異なる施設において産生されたＴＩＬ集団の同等性を決定する方法が望まれる。ある実施形態において、本開示は、ＴＣＲレパトア分析を使用してＴＩＬ産生プロセス同等性を決定する方法であって、第１のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性、例として、第１のサンプル中でＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第１のセットを決定すること；第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性、例として、第２のサンプル中でＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第２のセットを決定すること；第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数を決定すること；（ｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比、及び／又は（ｉｉ）第１のセット及び第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定すること；並びに前記比に基づき、第１のサンプル中のＴＩＬ及び第２のサンプル中のＴＩＬの同等性を決定することを含む方法を提供する。
[00186] ＴＩＬ産生プロセス同等性を試験するため、既に記載されたとおりＴ細胞はプレ急速拡大プロセスとそれに続く急速拡大を３つの独立した施設において受ける（図１６）。Qiagen RNeasy Mini Kit Protocolを使用して総ＲＮＡをそれぞれのサンプルから抽出した。ＴＩＬ産物のＣＤＲ３を、iRepertoire技術（Huntsville,AL）を使用するＲＮＡ増幅及びシーケンシングに供した。カスタムpythonスクリプトを使用して目的ＣＤＲ３クローンを同定し、統計的分析を実施した。シーケンシング後、独特なＣＤＲ３配列カウントを計算し、図１７に示した。異なる施設において産生されたサンプル（例えば、第１のサンプル及び第２のサンプル）中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性を比較するため、両方のサンプルにより共有される独特なＣＤＲ３配列の数と、第１のサンプルにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定した。同様に、両方のサンプルにより共有される独特なＣＤＲ３配列の数と、第２のサンプルにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比も決定した。得られた値は２つのサンプルにおけるＣＤＲ３クローン多様性の類似性の尺度であり、少なくとも１０％以上の値は、ある実施形態において、サンプル間のＣＤＲ３クローン多様性の類似性を示す。図１８に示されるとおり、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）サンプルからのiRepertoireデータを分析した場合に類似の結果が得られた。具体的には、２つの異なる施設において産生されたサンプルにより共有される独特なＣＤＲ３配列の数と、いずれかのサンプルにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比は、約１５％超であると決定され、サンプル間のＣＤＲ３クローン多様性の類似性を示した。対照的に、図２０、２２、及び２３に示されるとおり、約２％未満の値はサンプルが非関連である（例えば、サンプルはＣＤＲ３クローン多様性の低い同等性又は類似性を有する）ことを示した。
Claims (55)
- 対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の前記治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの前記治療集団及びＰＢＭＣの前記第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）において同定された前記独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの前記治療集団及びＰＢＭＣの前記第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）においてソートされたＰＢＭＣの前記第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの前記治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの前記臨床的に有効な集団を同定すること、
を含む方法。 - （ａ）前記対象へのＴＩＬの前記治療集団の投与前に前記対象から単離されたＰＢＭＣの第２の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定するステップ；及び（ｂ）ステップ（ａ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ＰＢＭＣの前記第２の集団のクローン多様性を構成する前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンは、ＴＩＬの前記治療集団の投与後に前記対象から単離されたＰＢＭＣの前記第１の集団のクローン多様性を構成する前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンと異なる、請求項２に記載の方法。
- 少なくとも１つの集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１つの集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＲＮＡシーケンシングにより決定する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- ＴＩＬの前記治療集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度及びＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＤＮＡ及びＲＮＡシーケンシングの両方により決定する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度と比較し、ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度と比較してＴＩＬの臨床的に有効な集団を示す、請求項６に記載の方法。
- そのような独特なクローンの前記頻度は、ＲＮＡシーケンシングにより決定された場合に大きい、請求項７に記載の方法。
- そのような独特なクローンの前記頻度は、ＤＮＡシーケンシングにより決定された場合に大きい、請求項７に記載の方法。
- ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関する、請求項７に記載の方法。
- ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関しない、請求項１０に記載の方法。
- ＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関し、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、向上した治療有効性を有するＴＩＬの集団と相関しない、請求項７に記載の方法。
- 前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンは、ＲＮＡシーケンシングにより同定されるｍＲＮＡクローンである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡは、ＴＩＬの治療集団の投与の約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４２日、約４５日、約５０日、約５５日、約６０日、約９０日、約１２０日、約１８０日、約１年、及び約２年後からなる群から選択される期間において検出され得る、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のＴ細胞レパトアを向上させる方法であって、
（ｉ）本開示に従って腫瘍浸潤リンパ球の臨床的に有効な集団を同定すること；及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定された前記集団を選択し、拡大してＴＩＬの第２の臨床的に有効な治療集団を産生すること
を含む方法。 - ステップ（ｉｉ）において産生された前記拡大細胞を投与し、それにより前記対象のＴ細胞レパトアを向上させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
- 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、
メモリ；
１つ以上のプロセッサ；及び
メモリ中に保存され、前記１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、前記モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の前記治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のクローン多様性を構成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンを同定するため；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの前記治療集団及びＰＢＭＣの前記第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３クローンの頻度を決定するため；
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定された前記独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＴＩＬの前記治療集団及びＰＢＭＣの前記第１の集団のそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）ステップ（ｄ）においてソートされたＰＢＭＣの前記第１の集団から、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンであって、ＴＩＬの前記治療集団におけるそのようなクローンを発現するＴＩＬが、ＴＩＬの臨床的に有効な亜集団を構成する、１０個の最大頻度の独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを選択し、それによりＴＩＬの前記臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系。 - （ｘ）前記対象へのＴＩＬの前記治療集団の投与前に前記対象から単離されたＰＢＭＣの第２の集団のクローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定するステップ；及び（ｙ）ステップ（ｘ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定するステップを実施するための指示を含むモジュールをさらに含む、請求項１７に記載の系。
- 事前にＰＢＭＣの第２の集団のＣＤＲ３クローン多様性を構成する前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを、ＰＢＭＣの前記第１の集団のＣＤＲ３クローン多様性を構成する前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンと比較するための指示を含むモジュールをさらに含む、請求項１７に記載の系。
- ＤＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の系。
- ＲＮＡ配列データに基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の系。
- ＲＮＡ配列データ及びＤＮＡ配列データの両方に基づき少なくとも１つの集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を決定するための指示を含むモジュールをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の系。
- ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの前記頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団における独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンの前記頻度と比較するための指示を含むモジュールをさらに含み、前記比較は、ＴＩＬの前記臨床的に有効な集団を示す、請求項２２に記載の系。
- 前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンは、ＲＮＡシーケンシングにより同定されるｍＲＮＡクローンである、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の系。
- 対象に投与されたＴＩＬの治療集団における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定する方法であって、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸クローンを同定すること；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の前記治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の第１の集団のＴＣＲ ＣＤＲ３クローン多様性を構成するＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンを同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＴＩＬの前記治療集団及びＰＢＭＣの前記第１の集団のそれぞれにおけるそのような独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの頻度を決定すること；並びに
（ｄ）ステップ（ｂ）において同定されたそれぞれの独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンについて、ＰＢＭＣの前記第１の集団における前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＴＩＬの前記治療集団における前記ＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度と比較して前記対象に投与された前記治療ＴＩＬ集団におけるＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの持続性及び活性を決定すること
を含む方法。 - ＴＩＬの前記治療集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度及びＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＤＮＡ及びＲＮＡシーケンシングの両方により決定する、請求項２５に記載の方法。
- ＲＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度を、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたＰＢＭＣの前記第１の集団において同定された独特なＴＣＲ ＣＤＲ３コード核酸配列クローンの前記頻度と比較し、ＤＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度と比較されたＲＮＡシーケンシングにより決定されたそのような独特なクローンの前記頻度は、そのようなクローンの持続性及び活性を示す、請求項２６に記載の方法。
- そのような独特なクローンの前記頻度は、ＲＮＡシーケンシングにより決定された場合に大きい、請求項２７に記載の方法。
- ＴＩＬの治療集団を投与された対象における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定する方法であって、
（ｉ）ＴＩＬの治療集団のＣＤＲ３クローン多様性を決定すること；
（ｉｉ）対象からステップ（ｉ）の前記治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤＲ３クローン多様性を決定すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方において同定されたＣＤＲ３クローンを同定すること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において同定された前記ＣＤＲ３クローンを、ＴＩＬの前記治療集団及び前記ＰＢＭＣのそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートすること；並びに
（ｉｖ）前記ＰＢＭＣにおいて同定されたステップ（ｉｖ）から１０個の最大頻度のＣＤＲ３クローンを選択し、それによりＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定すること
を含む方法。 - 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の臨床的に有効な集団を同定するための系であって、
メモリ；
１つ以上のプロセッサ；及び
メモリ中に保存され、前記１つ以上のプロセッサによる実行のために構成される１つ以上のモジュールを含み、前記モジュールは、
（ａ）ＴＩＬの治療集団のＣＤＲ３クローン多様性を決定するため；
（ｂ）対象からステップ（ａ）の前記治療集団を前記対象に投与した少なくとも１４日後に単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＣＤＲ３クローン多様性を決定するため；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の両方において同定された前記ＣＤＲ３クローンを同定するため；
（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された前記ＣＤＲ３クローンを、ＴＩＬの前記治療集団及び前記ＰＢＭＣのそれぞれについて最大頻度から最小頻度までにソートするため；並びに
（ｅ）前記ＰＢＭＣにおいて同定されたステップ（ｄ）から１０個の最大頻度のＣＤＲ３クローンを選択してＴＩＬの臨床的に有効な集団を同定するため
の指示を含む系。 - 前記対象は、固形腫瘍癌を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形腫瘍癌は、黒色腫（例として、ブドウ膜黒色腫）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる癌、頭頸部癌（例として、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、脳癌膠芽腫（例として、ＧＢＭ）、消化管癌、腎臓癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫である、請求項３１に記載の方法。
- 前記癌は、子宮頸癌である、請求項３１に記載の方法。
- ＴＣＲレパトア分析を使用してＴＩＬ産生プロセス同等性を決定する方法であって、
第１のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第１のセットを決定すること；
第２のサンプル中のＴＩＬにより発現される独特なＣＤＲ３配列の第２のセットを決定すること；
（ｉ）前記第１のセット及び前記第２のセットの両方において生じる独特なＣＤＲ３配列の数と、前記第１のセットにおける前記独特なＣＤＲ３配列の数との比、及び／又は（ｉｉ）前記第１のセット及び前記第２のセットの両方において生じる前記独特なＣＤＲ３配列の数と、前記第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数との比を決定すること；並びに
前記比に基づき、前記第１のサンプル中のＴＩＬ及び前記第２のサンプル中のＴＩＬの同等性を決定すること
を含む方法。 - 前記第１のサンプルのＴＩＬを第１の施設において産生し、前記第２のサンプルのＴＩＬを第２の施設において産生する、請求項３５に記載の方法。
- 前記第１のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数は、前記第１のサンプル中のＴＩＬの治療有効性と相関する、請求項３５又は３６に記載の方法。
- 前記第２のセットにおける独特なＣＤＲ３配列の数は、前記第２のサンプル中のＴＩＬの治療有効性と相関する、請求項３５又は３６に記載の方法。
- 前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルは、同じサンプルに由来する、請求項３５に記載の方法。
- 前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルの少なくとも１つを、固形腫瘍癌を有する対象から得る、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形腫瘍癌は、黒色腫（例として、ブドウ膜黒色腫）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる癌、頭頸部癌（例として、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、脳癌膠芽腫（例として、ＧＢＭ）、消化管癌、腎臓癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
- 前記固形腫瘍癌は、黒色腫である、請求項４１に記載の方法。
- 前記固形腫瘍癌は、子宮頸癌である、請求項４１に記載の方法。
- 前記第１のサンプル中のＴＩＬ及び前記第２のサンプル中のＴＩＬは、急速拡大プロセス（ＲＥＰ）後ＴＩＬである、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 約０．４以上、約０．４２以上、約０．４４以上、約０．４６以上、約０．４８以上、約０．５０以上、約０．５２以上、約０．５４以上、約０．５６以上、約０．５８以上、又は約０．６０以上の値を有する前記比は、前記第１のサンプル及び前記第２のサンプル間の同等性を示す、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のサンプル及び／又は前記第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性を、ＤＮＡシーケンシングにより決定する、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のサンプル及び／又は前記第２のサンプル中のＴＩＬのＣＤＲ３クローン多様性を、ＲＮＡシーケンシングにより決定する、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 独特なＣＤＲ３配列の前記第１のセットは、前記第１のサンプル中のＴＩＬにより最大頻度において発現される所与数のＣＤＲ３配列からなる、請求項３５～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 独特なＣＤＲ３配列の前記第２のセットは、前記第２のサンプル中のＴＩＬにより最大頻度において発現される所与数のＣＤＲ３配列からなる、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所与数は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、及び約５００超からなる群から選択される、請求項４８又は４９に記載の方法。
- 前記所与数は、独特なＣＤＲ３配列の前記第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の前記第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、又は約１００％と相関する、請求項４８又は４９に記載の方法。
- 前記所与数は、約１０～約２０である、請求項４８又は４９に記載の方法。
- 前記所与数は、独特なＣＤＲ３配列の前記第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の前記第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約４０％と相関する、請求項５２に記載の方法。
- 前記所与数は、約３００～約４００である、請求項４８又は４９に記載の方法。
- 前記所与数は、独特なＣＤＲ３配列の前記第１のセット及び独特なＣＤＲ３配列の前記第２のセットの一方又は両方における配列の総数の約８０％と相関する、請求項５２に記載の方法。
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