JP2022514122A - タンパク質を同定及び定量化する方法及びシステム - Google Patents

Abstract

タンパク質を同定及び／または定量化するための方法及びシステムが、本明細書に提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、タンパク質を同定及び／または定量化する方法及びシステムに関する。

タンパク質ベースのバイオ医薬製品は、非常に高い純度基準を満たさなければならない。バイオ医薬品に見出されるプロセス関連不純物及び生成物関連不純物が幾つか存在する。これらの不純物は、活性、効力、及び安全性に関して、目的物質の性質に匹敵する性質を有していない。一例は、タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）であり、これはそれらの治療用途に関連するタンパク質の性質に多大な影響を与える。別のそのような例として、理想的には下流の精製によって除去されなければならない、二重特異性抗体の生成中に存在することがあるホモ二量体混入汚染物質が挙げられる。これらの不純物は、製品と比較して異なる作用様式及び潜在的な毒性または免疫原性を呈することがあり得ると思われる。加えて、それらは、製品よりも安定性が低い場合があり、より高い凝集及び免疫原性のリスクを示す。最近の進歩にもかかわらず、そのような不純物の定量的評価のための純度アッセイ法を開発するという課題は残っている。加えて、二重特異性抗体の分析法開発における鍵となる課題は、その方法が主たる目的の化学種に対して２％以下のレベルで存在する不純物を正確かつ再現性よく検出しなければならないことであり得る。したがって、薬物の開発と製造の様々な段階で、そのような不純物をモニタリング及び特性解析することが重要である。生物学的機能にとって不純物が重要であるにもかかわらず、それらの大規模な研究は適切な方法がないことによって妨げられてきた。

純度アッセイのための分析法は、目的物質及びその不純物を検出及び定量化するのに十分な精度及び分解能を示さなければならない。抗体中のＰＴＭ及び二重特異性抗体中のホモ二量体などの不純物の評価は、そのような不純物と目的物質の構造的及び物理化学的性質が類似しているため、困難な場合がある。そのような不純物を直接分析するには、アッセイするのに十分なほど多い量の目的物質を単離することが必要とされるが、これは望ましくなく、選択された場合にしかできない。

したがって、当技術分野ではタンパク質ベースのバイオ医薬品中のタンパク質－不純物及び／または目的物質の生成物を同定及び定量化するための方法及び／またはシステムに対する長年にわたる切実な必要性が存在する。

タンパク質ベースのバイオ医薬製品の開発、製造、及び販売の成長により、製品中の不純物を同定及び定量化するための方法及び／またはシステムに対する需要が高まっている。

本明細書に開示する実施形態は、タンパク質を迅速に特性解析するための方法及びシステムを提供することにより、前述の需要を満たす。

本開示は、少なくとも一部分では、試料中の不純物を定量化するための方法を提供する。

例示的な一実施形態では、該方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させること、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ること、及び質量分析計を使用して溶出液中の不純物の量を定量化することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、疎水性相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、電荷－電荷相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに約１０μｇ～約１００μｇの試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、質量分析計と適合性があり得る移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができ、該移動相は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせから選択することができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、６００ｍＭまでの総塩濃度を含有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を定量化するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、生成物関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、プロセス関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の分解生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の消化生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、多重特異性抗体生成物のホモ二量体種であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の翻訳後修飾であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、質量分析計を使用して前記溶出液中の不純物の量を定量化することを含むことができ、該質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を定量化するための方法は、質量分析計を使用して前記溶出液中の不純物の量を定量化することを含むことができ、該質量分析計は、ネイティブ質量分析計であり得る。

本開示は、少なくとも一部分では、試料中の不純物を検出するための方法を提供する。

例示的な一実施形態では、該方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させること、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ること、及び質量分析計を使用して溶出液中の不純物を定量化することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、疎水性相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、電荷－電荷相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに約１０μｇ～約１００μｇの試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、質量分析計と適合性があり得る移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

幾つかの特定の例示的な態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができ、該移動相は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせから選択することができる。

幾つかの特定の例示的な態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、６００ｍＭまでの総塩濃度を含有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の不純物を検出するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、生成物関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、プロセス関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の分解生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の消化生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、多重特異性抗体生成物のホモ二量体種であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該不純物は、タンパク質の翻訳後修飾であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、質量分析計を使用して溶出液中の不純物の量を検出することを含むことができ、該質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

この実施形態の一態様では、不純物を検出するための方法は、質量分析計を使用して前記溶出液中の不純物の量を検出することを含むことができ、該質量分析計は、ネイティブ質量分析計であり得る。

本開示は、少なくとも一部分では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法を提供する。

例示的な一実施形態では、該方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させること、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して標的タンパク質を含む溶出液を得ること、ならびに質量分析計を使用して溶出液中の標的タンパク質を検出及び／または定量化することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、疎水性相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、電荷－電荷相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに約１０μｇ～約１００μｇの試料を接触させることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ることを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、質量分析計と適合性があり得る移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。特定の態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができ、該移動相は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせから選択することができる。別の特定の態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、６００ｍＭまでの総塩濃度を含有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、試料中の標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有する移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含むことができる。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、抗体であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、二重特異性抗体であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、治療用タンパク質であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、タンパク質のバイオ医薬品製造プロセスのプロセス関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、タンパク質のバイオ医薬品製造プロセスの生成物関連不純物であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、タンパク質の分解生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、タンパク質の消化生成物であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させることを含むことができ、該標的タンパク質は、多重特異性抗体生成物のホモ二量体種であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、質量分析計を使用して前記溶出液中の標的タンパク質の量を定量化することを含むことができ、該質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

この実施形態の一態様では、標的タンパク質を検出及び／または定量化するための方法は、質量分析計を使用して前記溶出液中の標的タンパク質の量を定量化することを含むことができ、該質量分析計は、ネイティブ質量分析計であり得る。

例示的な一実施形態では、本開示は、少なくとも一部分では、混合モードクロマトグラフシステムに、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラム及び質量分析計を提供する。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、疎水性相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、電荷－電荷相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、約１０μｇ～約１００μｇの試料の溶出に使用することができる追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、移動相を受け入れることが可能な混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、標的タンパク質を有する試料をさらに受け入れることが可能な混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、移動相で洗浄可能な混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラムに連結された質量分析計を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、タンデム質量分析計を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、ネイティブ質量分析計を含むことができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラムを含むことができ、該混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせから選択される移動相と適合性があり得る。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラムを含むことができ、該混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、６００ｍＭまでの総塩濃度を含有する移動相を使用して洗浄することができる。

この実施形態の一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラムを含むことができ、該クロマトグラフカラムは、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有する移動相で洗浄することができる。

サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用してタンパク質を定量化及び／または検出するために使用されるシステムの例を示す図である。 例示的な実施形態を使用してホモ二量体種から二重特異性抗体を精製する試みを表す図である。 タンパク質の沈殿（または疎水性相互作用の促進）に及ぼす陰イオン及び陽イオンの作用を示すホフマイスター系列を示す図である。 例示的な実施形態による混合モードサイズ排除クロマトグラフィー質量分析システムを示す図である。 例示的な実施形態によって３０ｍＭ～３００ｍＭの範囲の移動相濃度で実行されたＢＥＨ２００ ＳＥＣカラムでの試料混合物中の８種のｍＡｂの保持時間のグラフを示す図であり、２つの挿入図は、対応する濃度での８種のｍＡｂのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析からのベースピーククロマトグラム（ＢＰＣ）を表す。 １５０ｍＭの総塩濃度及び４５０ｍＭの総塩濃度の移動相を使用した例示的な混合モードサイズクロマトグラフィー質量分析システムを使用した二重特異性抗体試料のクロマトグラフプロファイルを示す図である。 例示的な実施形態によって混合モードサイズ排除クロマトグラフィー質量分析を使用して分離及び分析された二重特異性抗体、ホモ二量体１及びホモ二量体２の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）及びネイティブ質量スペクトルを示す図である。 例示的な実施形態による抗体検出分光法の、ＬｕｍｏｓでのＲＰ ＬＣ－ＭＳ、ＥＭＲでのＳＥＣ－ＭＳ、及びＥＭＲでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳの場合の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）及びネイティブＭＳスペクトルの比較を示す図である。 図８－１の説明を参照されたい。 例示的な実施形態によるＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍを使用した抗体のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ検出の連続ランの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）及びネイティブ質量スペクトルを示す図である。 例示的な実施形態によって二重特異性抗体生成物中のホモ二量体種の検出を実行したときに得られた抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す図である。 例示的な実施形態によって流量０．４ｍＬ／分でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍ、及び流量０．３ｍＬ／分でＺｅｎｉｘＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、４．６×３００ｍｍを使用して二重特異性抗体生成物中のホモ二量体種の検出を実行したときに得られた抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の比較を示す図である。 例示的な実施形態によって異なる塩濃度の移動相を使用して二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときに得られた抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す図である。 例示的な実施形態によってＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときの、二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物についてのタンパク質の保持時間（分）対移動相の総塩濃度のチャートを示す図である。 例示的な実施形態によってＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときの、総塩濃度の変化に基づく保持時間の傾向を示すチャートを表す図である。 例示的な実施形態によってＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときの、総塩濃度の変化に基づく保持時間の差の傾向を示すチャートを表す図である。 例示的な実施形態によってＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍｎで二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を行ったときに得られた抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す図である。 例示的な実施形態によってＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ ＣｏｌｕｍｎでＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときの、二重特異性抗体、ホモ二量体１及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物についてのタンパク質の保持時間（分）対移動相の総塩濃度のチャートを示す図である。 例示的な実施形態によってＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍｎで抗体及びその酸化バリアントのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を行ったときに得られた抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す図である。 例示的な実施形態によってＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ ＣｏｌｕｍｎでＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行したときの、抗体及びその酸化バリアントについてのタンパク質の保持時間（分）対移動相の総塩濃度のチャートを示す図である。 例示的な実施形態による二重特異性抗体及びそのホモ二量体種を含有する混合物の試料調製の方法を示す図である。 例示的な実施形態による３００ｍＭの塩濃度を有する移動相を使用した二重特異性抗体及びそのホモ二量体種の混合物のインタクトレベルでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を示す図である。 例示的な実施形態による７０ｍＭの塩濃度を有する移動相を使用した二重特異性抗体及びそのホモ二量体種の混合物のサブユニットレベルでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析を示す図である。 例示的な実施形態による二重特異性抗体及びそのホモ二量体種の混合物のインタクトレベルでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析からのホモ二量体定量化の結果を示す図である。 例示的な実施形態による二重特異性抗体及びそのホモ二量体種の混合物のサブユニットレベルでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析からのホモ二量体定量化の結果を示す図である。 例示的な実施形態によって実施された、ＢＥＨカラム（左）またはＺｅｎｉｘカラム（右）のいずれかでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳによる二重特異性抗体混合物［４種の異なるｂｓＡｂ／Ｈ２Ｌ２ホモ二量体／Ｈ^＊２Ｌ２ホモ二量体混合物］の分析を示す図であり、図中、各ＢＰＣトレースは、示された移動相の塩濃度を使用した個別の１つの分析を表す。 例示的な実施形態によって実施された、分析用にそれぞれ０．０１％及び０．１％のスパイクイン標準物質を使用した、ｂｓＡｂ２（左パネル）及びｂｓＡｂ４（右パネル）中のホモ二量体不純物についてのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳによる検出限界試験を示す図であり、図中、ネイティブＭＳスペクトル（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆ）は、対応するＴＩＣ領域で平均化し、２つの最も豊富な荷電状態を示した。 図２６－１の説明を参照されたい。 連続希釈された既知の比率（左パネルの灰色の線及び印を付けた値）でｂｓＡｂ２にスパイクされたホモ二量体を使用して例示的な実施形態によって実施された定量化試験を示し、及びまた生の質量スペクトルで最も豊富な４つの荷電状態のＸＩＣ強度に基づいた（右パネルに示す例として、各ホモ二量体の相対存在量０．１％）ｂｓＡｂ２に対するＨ２Ｌ２ホモ二量体（赤）及びＨ^＊２Ｌ２ホモ二量体（青）の測定比率を示す図である。

詳細な説明
バイオ医薬品中の不純物は、目的物質の効力、クリアランス、安全性、及び免疫原性に潜在的に影響を与えるおそれのある変化を引き起こす可能性がある。例えば、メチオニン及びトリプトファン側鎖が酸化すると、Ｆｃ受容体及び抗原への抗体結合に影響を与える可能性がある（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ－Ｃｉａｒｌｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）４６：１８７８－１８８２；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２００９）１８：４２４－４３３；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７）７９：２７９７－２８０５；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１）４８：８６０－８６６）。

電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ベースの方法などの、従来の分離ベースの抗体純度アッセイでは、これらの不純物を目的物質と区別するために必要な分解能が不足している。ＰＴＭをモニタリングするために使用される、質量分析に連結された逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるペプチドマッピングには幾つかの限界がある。何故なら、ＲＰ－ＬＣ－ＭＳ用の試料調製プロセスは非常に長く、ある場合には、高温、有機溶媒、及び酸性ｐＨなどのクロマトグラフ条件が酸化アーチファクトを誘導するおそれがあるからである。

加えて、幾つかのサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー法も、目的物質から不純物を分離するために使用することができる。分離された不純物及び目的物質は、質量分析計を使用してさらに分析することができる。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフカラムからの移動相を質量分析計に直接注入することはできず、移動相の交換を含めた追加ステップが必要とされる（図１参照）。

既存の方法の限界を考慮して、本明細書に開示する通りの、新規混合モード－サイズ排除クロマトグラフィー－質量分析システムを使用する不純物を同定及び定量化するための有効かつ効率的な方法を開発した。混合モード－サイズ排除クロマトグラフィー－質量分析システムは、他の典型的なアッセイでは実現できない効率的な混合モード分離及び高感度のオンラインＭＳ検出により、極めて低いレベルで存在する不純物を定量化する感度及び能力を改善する。

別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。実践または試験には本明細書に記載するものと同様または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、特定の方法及び材料を以下に記載する。言及する全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者であれば理解するように標準偏差を許容すると理解すべきである。また、範囲が示される場合、端点が含まれる。

標的タンパク質
バイオ医薬製品は、高レベルの力価、純度、及び低レベルの構造不均質性を示すことが必要とされる。構造不均質性は、薬物の生物活性及び効力に影響を与えることが多い。したがって、治療用タンパク質及び／または不純物の特性解析及び定量化は、医薬開発に重要である。タンパク質における構造不均質性は、翻訳後修飾だけでなく、製造中及び保存条件に内在する化学修飾からも生じることがある。バイオテクノロジー業界で生成されるタンパク質の場合、標的タンパク質を精製するためと、最終製品の品質を正確に把握するための両方で、補完的な分離技法が必要とされることがある。生成物が複雑であることから、単純な一次元分離戦略の使用は排除される。したがって、治療用タンパク質及び／または不純物を検出及び／または定量化する正確かつ効率的な方法が必要である。

幾つかの例示的な実施形態では、本開示は、試料中のタンパク質及び／または不純物を定量化及び／または検出するための方法を提供する。

本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で一般に「ポリペプチド」として公知の１つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基、その関連する天然に存在する構造バリアント及び天然に存在しない合成類似体から構成されたポリマー、その関連する天然に存在する構造バリアントならびに天然に存在しない合成類似体を指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」とは、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために１つまたは複数のポリペプチドを含有し得る。タンパク質として、生体治療用タンパク質、研究または療法に使用される組換えタンパク質、捕捉用タンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに二重特異性抗体をいずれかを挙げることができる。別の例示的な態様では、タンパク質として、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを挙げることができる。タンパク質は、組換え細胞ベースの産生系、例えば昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳類系（例えばＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ派生細胞）を使って生成することができる。生体治療用タンパク質及びその生成について考察する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照されたい。幾つかの実施形態において、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合部分を含む。これらの修飾、付加物、及び部分として、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン質結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、及び他の染料などが挙げられる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類することができ、よって、それらとして、単純タンパク質、例えば、球状タンパク質及び繊維状タンパク質；複合タンパク質、例えば、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質；ならびに誘導タンパク質、例えば、一次誘導タンパク質、及び二次誘導タンパク質などを挙げることができる。

幾つかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、またはそれらの組み合わせであり得る。

「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略記する）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分される。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよいし、天然の修飾または人工的な修飾を受けていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの対比分析に基づいて定義されてもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、本明細書で使用する場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、完全な抗体分子から、任意の適切な標準的技法を使って、例えば、タンパク質消化、または抗体の可変ドメイン及び任意選択により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技法などを使って誘導されてもよい。そのようなＤＮＡは公知であり、及び／または、例えば、商業的供給元、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーが含まれる）から容易に入手することができるか、または合成することができる。ＤＮＡは、配列決定し、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することによって操作して、例えば、１つまたは複数の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置したり、あるいはコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を修飾する、付加する、もしくは欠失させたりすることができる。

本明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに抗体フラグメントから形成されるトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え一本鎖ポリペプチド分子である。幾つかの例示的な実施形態では、抗体フラグメントは、親抗体と同じ抗原に結合するのに十分な、そのフラグメントの元となった親抗体のアミノ酸配列を含有する。幾つかの例示的な実施形態では、フラグメントは、親抗体の親和性に匹敵する親和性で抗原に結合し、及び／または抗原への結合に関して親抗体と競合する。抗体フラグメントは、任意の手段によって生成されてもよい。例えば、抗体フラグメントは、インタクトな抗体のフラグメント化によって酵素的にまたは化学的に生成されてもよく、及び／または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって生成されてもよい。あるいは、または加えて、抗体フラグメントは、全体的にまたは部分的に合成によって生成されてもよい。抗体フラグメントは、任意選択により一本鎖抗体フラグメントを含んでもよい。あるいは、または加えて、抗体フラグメントは、例えばジスルフィド結合によって、一緒に結合された複数の鎖を含んでもよい。抗体フラグメントは、任意選択により多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体フラグメントは、典型的には少なくとも約５０のアミノ酸、より典型的には少なくとも約２００のアミノ酸を含む。

「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は一般に２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば抗原）または同じ分子（例えば同じ抗原）のいずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することが可能なら、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は一般に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性より、少なくとも１桁～２桁または３桁または４桁低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的（例えば、同じまたは異なるタンパク質）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列を、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合することができ、そのような配列を、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中で発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、それぞれが３つの重鎖ＣＤＲ、それに続くＣ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、及びＣ_Ｈ３ドメインを有する２つの重鎖と免疫グロブリン軽鎖とを有し、該軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが各重鎖に会合することができるもの、または各重鎖に会合することができ、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されるエピトープの１つもしくは複数に結合することができるもの、または各重鎖に会合することができ、かつ重鎖の一方もしくは両方が一方もしくは両方のエピトープに結合できるようにするものである。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を有するもの（ＩｇＧ様）とＦｃ領域がないものの２つの主要なクラスに分割することができ、後者は通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、限定するものではないが、トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）ＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツー・イン・ワン（Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）または二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、またはκλボディなどの様々な形式を有することができる。非ＩｇＧ様の様々な形式として、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂｓ）、二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、またはドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ－ａｎｄ－ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）法によって生成される抗体が挙げられる。Ｆａｎら、ならびにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＢｒｉｎｋｍａｎｎは、二重特異性抗体についての詳細な総説を発表している（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）８：１３０；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ．“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２０１５）２０：８３８－８４７）。ＢｓＡｂを生成する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞系の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的コンジュゲーション、及び組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝学的アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例として、以下の特許出願に開示されるものが挙げられ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる：２０１０年６月２５日に出願された米国特許第８，５８６，７１３号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願公開第２０１３／００４５４９２号；２０１３年９月１９日に出願された米国特許第９，６５７，１０２号；２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願公開第２０１６／００２４１４７号；２０１７年９月２２日出願された米国特許出願公開第２０１８／０１１２００１号；２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１０４３５７号；２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願公開第２０１７／０１７４７７９号；２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願公開第２０１７／０１７４７８１号；２０１６年７月２９日に出願された米国特許第１０，１７９，８１９号；及び２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１３４７９４号。二重特異性抗体の製造中の幾つかのステップにおいて、低レベルのホモ二量体不純物が存在し得る。そのようなホモ二量体不純物の検出は、ホモ二量体不純物の存在量が低いこと、及び通常の液体クロマトグラフ法を使って実施した場合にはこれらの不純物が主要化学種と共溶出することから、インタクト質量分析を使って実行するときには困難な場合がある（図２に図示する通り）。

治療用二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、２つの別個の標的に同時に結合することができ、二重機能性または新規な作用機序を提供することによって治療効力の強化を実現する可能性を秘めている（Ｍａｒｉｅ Ｇｏｄａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ：ａ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｉｅｗ（１９９４－２０１７），２８ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ ２５１－２７６（２０１８））。現在までに、様々な疾患を治療するために６０を超える二重特異性分子が開発及び評価されており、それらの多くは、治療用途における公知の利点（安定性、血清半減期など）のためにＩｇＧ様アーキテクチャを採用している（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｓｐｉｅｓｓ，Ｑｉａｎｔｉｎｇ Ｚｈａｉ＆Ｐａｕｌ Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，６７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９５－１０６（２０１５）；Ｍ Ｘ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ＆Ｉ Ｍｅｌｌｍａｎ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．，３４１ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１９２－１１９８（２０１３）；Ｐａｕｌ Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ，６ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４３－３５７（２００６））。二重特異性抗体は、往々にして、異なる軽鎖及び重鎖を共発現させることによって単一の細胞で産生される。続いて、ｂｓＡｂ構築物を組立てるには、同族の軽鎖及び重鎖の正しい対合、ならびに２つの異なる半分子のヘテロ二量体化が必要とされる。残念なことに、このプロセスは、誤って組立てられた分子構築物、例えば、単一特異性分子（例えば、ホモ二量体種）の形成をもたらすこともある。他の不純物とは異なり、下流での精製によるホモ二量体種の除去は、それらが予期されるｂｓＡｂ生成物と極めて類似した物理化学的性質を示すことが多いために困難な場合がある。ポリペプチド鎖対合の忠実度を改善するために、したがってｂｓＡｂの形成が有利になるように、近年では様々な戦略が開発されてきた（Ｓｈｉｘｕｅ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇａｍｍａ－Ｌｉｋｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １－１３（２０１９））。例えば、ｂｓＡｂの各抗原結合アームに同一の軽鎖を使用することは、特に成功裡に軽鎖と重鎖の間の誤対合を回避している（Ａ．Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ，１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６７７－６８１（１９９８））。加えて、異なる重鎖のヘテロ二量体化は、ヘテロ二量体の形成が有利になるように特定の変異が抗体のＦｃ部分に遺伝子操作された、ノブ・イントゥ・ホール（Ｊｏｈｎ Ｂ．ｂ．Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ＆Ｐａｕｌ Ｃａｒｔｅｒ，‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，９“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”６１７－６２１（１９９６））設計を使用することで大幅に促進することができる。あるいは、Ｆｃ部分でのアミノ酸置換を介してプロテインＡ結合親和性を調節することによって、プロテインＡ精製ステップの間にｂｓＡｂをホモ二量体不純物から効率的に単離することもできる（Ａｄａｍ Ｚｗｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｉａ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｂｉｎｄｉｎｇ，７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １５５２１（２０１７））。この戦略は、既に成功裡に実装されて、臨床試験を支援するためのｂｓＡｂの大量生産が実現されている（Ａｎｄｒｅｗ Ｄ．Ｔｕｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｕｐｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｖｉｄｉｔｙ，８ ｍＡｂｓ ８２８－８３８（２０１６））。

タンパク質工学及びプロセス開発による新規ｂｓＡｂ形式の進歩により、高純度の治療用ｂｓＡｂの大規模生産が可能となってきている。しかしながら、ｂｓＡｂ製剤に低存在量のホモ二量体不純物が存在する可能性は依然としてあり得、開発及び放出試験中に日常的にモニタリングする必要がある。生成物関連不純物と見なされるホモ二量体抗体は、多くの性質で目的のｂｓＡｂと極めて類似している可能性があり、現在の分析技法では検出及び定量化が独特で困難な作業となる。ホモ二量体種は通常、対応するｂｓＡｂと比較して特徴的な分子量を呈するため、ＬＣ－ＭＳベースの技法を使用したインタクトなタンパク質レベルでの質量測定が、それらの特性解析の選択法となっている（Ｒ．Ｊｅｒｅｍｙ Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．，ＬＣ－ＭＳ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ，５ ｍＡｂｓ ７１１－７２２（２０１３）；Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒｉｎｇ ｏｆ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｑｕａｄｒｏｍａ ａｎｄ ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＵＨＲ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８ ｍＡｂｓ ４９－５５（２０１５）；Ｆｒａｎｋ Ｄ． Ｍａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８７ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０４７５－１０４８２（２０１５）；Ｌｕｉｓ Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｉｎ Ｐａｉｒｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ ｂｙ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８８ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２１２２－１２１２７（２０１６）；Ｙｉｙｕａｎ Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８ ｍＡｂｓ １４６７－１４７６（２０１６）；Ｃｈｕｎｌｅｉ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，１０ ｍＡｂｓ １２２６－１２３５（２０１８）；Ｍａｒｋｕｓ Ｈａｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８ ｍＡｂｓ ３３１－３３９（２０１５）；Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｄｅｂａｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｎａｔｉｖｅ Ｉｏｎ－Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＩｇＧ４ Ｆａｂ Ａｒｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ “Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ” Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，８５ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９７８５－９７９２（２０１３））。例えば、ｂｓＡｂ試料中のホモ二量体不純物を定量化するために、高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）質量分析計に連結された逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を使用することが幾つかの研究室によって報告されている （Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ，２０１３，前出；Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出）。これらの研究のほとんどにおいて、ホモ二量体は、主要なｂｓＡｂ種からクロマトグラフ分離をすることなく検出及び定量化することができた。実際には、サイズが大きいだけでなく（約１５０ｋＤａ）物理化学的性質の類似性も考えると、ＲＰＬＣ法を使用してホモ二量体抗体とｂｓＡｂの十分な分離を実現することは多くの場合困難な作業になり得る。結果として、ＲＰＬＣ－ＭＳベースの方法では、往々にして、低レベルで存在するホモ二量体種を検出する際の感度が不足し（報告されている最も低いＬＬＯＱは約１％である（Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出）、それは主に共溶出する圧倒的に存在量が多いｂｓＡｂ種からのイオン抑制に起因する。さらに、ＰＴＭ（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓでは＋１２８Ｄａ、及びグリケーションでは＋１６２）または内転位の形成からのｂｓＡｂのバリアント型が分析を妨害する可能性があると考えられるので、クロマトグラフ分離を行わないと、分子量がｂｓＡｂに近いホモ二量体種の検出は特に困難になり得る。最後に、ホモ二量体とｂｓＡｂのクロマトグラフ分離がＲＰＬＣ法によって実現される場合、異なる溶媒組成では異なる保持時間で溶出する抗体のイオン化効率の不一致によって、やはりＭＳベースの定量化が損なわれるおそれがあることから、定量化を行うときにはスパイクイン標準物質を使用して外部検量線を作成することが必要とされる（Ｒｉｓｔｏ Ｋｏｓｔｉａｉｎｅｎ＆Ｔｉｉｎａ Ｊ．Ｋａｕｐｐｉｌａ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｕｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１２１６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ６８５－６９９（２００９））。代替的に、ネイティブ質量分析がインタクトなタンパク質の分析における別の価値ある技法となり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の不均質性評価のために多くの日常的な分析ワークフローに組み込まれてきた（Ｈａｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出；Ｓａｒａ Ｒｏｓａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８４ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２２７－７２３２（２０１２）；Ａｎｔｈｏｎｙ Ｅｈｋｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｈｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１０８６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ １７６－１８３（２０１８）；Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｔｅｒｒａｌ，Ａｌａｉｎ Ｂｅｃｋ＆Ｓａｒａｈ Ｃｉａｎｆｅｒａｎｉ，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，１０３２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ７９－９０（２０１６）；Ｏｓｃａｒ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，９０ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８８６５－８８７２（２０１８））。ネイティブＭＳは、より少ない荷電状態から生じた信号がより集中するために，ＲＰＬＣ－ＭＳよりも改善された感度を有することができる。例えば、Ｒｏｓａｔｉら（前出） によって、２つの共発現したＩｇＧ１抗体の二成分混合物を研究するためのネイティブＭＳの使用が報告された。しかしながら、効率的なクロマトグラフ分離がなければ、低レベルで存在するホモ二量体種の検出と定量化は、上で考察したのと同じ理由で相変わらず困難である。

現在までに、ｂｓＡｂ試料中のホモ二量体種の検出及び定量化をクロマトグラフ分離に依拠する分析法については限られた報告しか存在していない。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，前出）またはイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）（Ａ．Ｆ．Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ，１１０ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５１４５－５１５０（２０１３）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ，５ ｍＡｂｓ ９６２－９７３ （２０１３））は、ｂｓＡｂ及びそのホモ二量体がそれぞれ疎水性または等電点（ｐＩ）における十分に異なる値を呈するならば、ｂｓＡｂをそのホモ二量体から分離することが示されている。加えて、オンラインＩＥＸ－ネイティブＭＳ技術の最近の進歩（Ｙｕｅｔｉａｎ Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｒｇｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，９０ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３０１３－１３０２０（２０１８）；Ｆｌｏｒｉａｎ Ｆｕｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒｇｅ Ｖａｒｉａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｐＨ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，９０ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６６９－４６７６（２０１８）；Ａａｒｏｎ Ｏ．Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｍａｓｓ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ，１０ ｍＡｂｓ １２１４－１２２５（２０１８））は、ｂｓＡｂ中の低レベルのホモ二量体種の高感度検出に対する有効なアプローチを提供している。しかしながら、分解能が高いため、ＩＥＸは通常、各抗体についてそれらの電荷の不均質性に基づいて、おそらく互いに重なり合うと思われる複雑な電荷プロファイルを生じる。さらに、このアプローチを使用するＭＳベースの定量化は、各分子から分離された電荷バリアント型のすべてを集計して算出する必要があるために、複雑になる可能性がある。加えて、ＲＰＬＣベースのアプローチと同様に、ＩＥＸ法は勾配溶離を利用するが、異なる溶媒条件下（例えば、ｐＨや塩濃度）で溶出する抗体のイオン化効率が異なるために、その勾配溶離によっておそらくＭＳベースの定量化が損なわれると思われる。近年、流体力学的体積とカラムマトリックスとの疎水性相互作用の両方によって分析物を分離する、ＳＥＣベースの混合モードクロマトグラフィー（ＭＭ－ＳＥＣ）法が、抗体の不均質性の研究に適用されている（Ｘｉａｏｙｕ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ４ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ａ ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，４８４ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７３－１７９（２０１５）；Ｃｉｎｔｙｕ Ｗｏｎｇ，Ｃａｍｉｌｌｅ Ｓｔｒａｃｈａｎ－Ｍｉｌｌｓ＆Ｓｕｄｈｉｒ Ｂｕｒｍａｎ，Ｆａｃｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｄｅｇｒａｄａｎｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１２７０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １５３－１６１（２０１２）；Ｊｏｒｇｅ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｐａｖｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１４３１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １５４－１６５（２０１６））。ＵＶまたは蛍光検出と連結して、ＭＭ－ＳＥＣ法はｂｓＡｂ試料中のホモ二量体種の相対的定量化に成功裡に適用された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１５，前出）。しかしながら、この方法の有用性は、ＵＶまたは蛍光ベースの定量化のためにベースライン分離を実現することができるようにホモ二量体種とｂｓＡｂ種の疎水性が十分に異なる場合に限定され得ることは明らかである。さらに、ホモ二量体種の同定が標準物質に対する保持時間アラインメントのみに基づいていたため、それらがｂｓＡｂ分子のオリゴマー型または短縮型と共溶出するならば、相対存在量を過大評価するリスクが常にあった。

ＳＥＣカラムを使用する混合モードクロマトグラフィーの概念は、タンパク質分析物とカラムマトリックス間の望まれない二次相互作用に由来する。理想的には、ＳＥＣは、タンパク質分析物の流体力学的体積のみに基づいて、タンパク質分析物を分離するべきである。実際には、静電、疎水性、及び水素結合相互作用はすべて、カラムマトリックス、緩衝液条件、及びタンパク質の特性に応じて、タンパク質の保持及び分離に様々な度合いで寄与し得ると思われる（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｍｙｓｔｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔｈｅ ｗａｙ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１０９２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ３６８－３７８（２０１８）；Ｔｓｕｔｏｍｕ Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６７４－１６９２（２０１０））。クロマトグラフ条件を適切に最適化することによってＳＥＣ分離中にこれらの二次相互作用を利用することで、流体力学的体積は類似しているが表面特性（例えば、電荷及び疎水性）が異なる抗体の分離を改善する機会が与えられる。ＭＳ適合性移動相を使用することによって、混合モードＳＥＣのネイティブＭＳ検出とのオンライン連結（ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ）は、ＵＶベースの方法に優る多くの利点を有することができ、それには、正確な質量測定によるホモ二量体種の明瞭な同定、共溶出種からの最小限の干渉、及びクロマトグラフ分解能についてのあまり厳しくない要件が含まれる（Ｔｅｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６，前出；Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，前出）。

本明細書で使用する場合、「多重特異性抗体」または「Ｍａｂ」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体を指す。そのような分子は通常、２つの抗原に結合するだけだが（すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性体など、追加的特異性を持つ抗体も、本明細書に開示するシステム及び方法によって対処することができる。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用できるまたは公知の任意の手段によって、任意の真核クローン、原核クローンまたはファージクローンを含めた単一のクローンから誘導することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術またはそれらの組み合わせの使用を含めた、当技術分野において公知の多種多様な技法を使用して調製することができる。

バイオ医薬品の生成の多くの段階で、不純物が形成される可能性がある。バイオテクノロジーに由来する不純物は、特性解析及び定量化を行うことが極めて難しい場合がある。何故なら、それらは極めて低いレベルで存在することが多く、非常に複雑な化学種または化学種の混合物になる可能性があるからである。不純物のピークの信用できる標準品を得ることが極めて困難な場合もある。しかしながら、微量の不純物タンパク質の完全な特性解析を行うことは、時間がかかり、非常に長く、そして極めて費用のかかることの多いプロセスになる。多くの場合、不純物として、バリアント、アイソフォーム、分解生成物、生成物関連不純物、プロセス関連不純物、軽微な翻訳後修飾、凝集物、またはインタクトな組換えタンパク質の切り出されたフラグメントを挙げることができる。考えられる不純物はほぼ無限にあり、そのほとんどは公知であり得ると思われるが、すべてが公知であるわけではない。

本明細書で使用する場合、「標的タンパク質」という用語は、目的物質もしくは不純物、またはその両方を含むことができる。

本明細書で使用する場合、「目的物質」という用語は、目的の構造、機能、または効力プロファイルを有するタンパク質を指す。

本明細書で使用する場合、「不純物」という用語は、バイオ医薬製品に存在する任意の望ましくないタンパク質を含むことができる。不純物は、プロセス及び生成物に関連する不純物を含むことができる。不純物はさらに、公知の構造のもの、部分的に特性解析されたもの、または同定されていないものであり得る。プロセス関連不純物は製造プロセスに由来し得るものであり、細胞基質由来、細胞培養物由来及び下流由来の３つの主要カテゴリーを含むことができる。細胞基質由来の不純物として、宿主生物由来のタンパク質及び核酸（宿主細胞ゲノムＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、または総ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養物由来の不純物として、インデューサー、抗生物質、血清、及び他の培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。下流由来の不純物として、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、ならびに他の溶出物が挙げられるが、これらに限定されない。生成物関連不純物（例えば、前駆体、ある種の分解生成物）は、活性、効力、及び安全性に関して目的物質のそれに匹敵する性質を有していない、製造及び／または保存中に生じる分子バリアントであり得る。このようなバリアントは、修飾（複数可）のタイプを同定するための単離及び特性解析にかなりの労力を必要とすることがある。生成物関連不純物として、短縮型、修飾型、及び凝集物を挙げることができる。短縮型は、加水分解酵素またはペプチド結合の開裂を触媒する化学物質によって形成される。修飾型として、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ結合化、酸化、または改変された複合化型（例えば、グリコシル化、リン酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾型として、任意の翻訳後修飾型を挙げることもできる。凝集物として、目的物質の二量体及び高次多量体が挙げられる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。

本明細書で使用する場合、「翻訳後修飾」または「ＰＴＭ」という一般用語は、ポリペプチドが、そのリボソーム合成中（翻訳時修飾）またはリボソーム合成後（翻訳後修飾）のいずれかに受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは一般に、特異的な酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（特徴的配列）の部位で行われる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、タンパク質の構造または機能のある側面に必ず影響を与える（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾として、開裂、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンでのリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（アセチル基の付加、通常はタンパク質のＮ末端で行われる）、アルキル化（アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加、通常はリジン又はアルギニン残基で行われる）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内または鎖間での共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化ならびにカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシル化における補助因子となってγカルボキシグルタミン酸（ｇｌｕ残基）の形成をもたらす）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（グリシン残基の共有結合）、グリコシル化（糖タンパク質をもたらす、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはトレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能基の結合）、ホスホパンテテイニル化（補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加、脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシン生合成におけるようなもの）、リン酸化（リン酸基の付加、通常はセリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンへの付加）、及び硫酸化（硫酸基の付加、通常はチロシン残基への付加）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾として、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの転化）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸への転化又はアスパラギンからアスパラギン酸への転化）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を含む翻訳後修飾として、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）、及びタンパク質開裂（ペプチド結合でのタンパク質の開裂）が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の翻訳後修飾は、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン刺激遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン様修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）など、他のタンパク質またはペプチドの付加を含む。ＵｎｉＰｒｏｔによって管理されるＰＴＭのより詳細な統制語彙についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔを参照されたい。

混合モードサイズ排除クロマトグラフィー
本明細書で使用する場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって担持される化学物質混合物を、化学成分が固定相液体または固相の周辺または上を流れたときのその分配の差の結果として成分に分離することができるプロセスを指す。

本明細書で使用する場合、「混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）」または「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語は、溶質が２つ以上の相互作用モードまたは機序を通して固定相と相互作用するクロマトグラフ法を含む。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）の代替または補完ツールとして使用することができる。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン性相互作用がそれぞれ優勢な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードの２つ以上の組み合わせを用いることができる。混合モードクロマトグラフィー媒体は、単一モードクロマトグラフィーでは再現することができない独特な選択性を提供することができる。混合モードクロマトグラフィーは、親和性に基づく方法と比較して費用削減の可能性及び操作の柔軟性も提供することができる。

「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」または「ゲルろ過」という語句は、溶液中の分子のサイズに従って分子を分別することができる液体カラムクロマトグラフ技法を含む。

本明細書で使用する場合、「ＳＥＣクロマトグラフィー樹脂」または「ＳＥＣクロマトグラフィー媒体」という用語は、本明細書で相互に交換可能に使用され、目的物質から不純物（例えば、二重特異性抗体生成物の場合のホモ二量体混入汚染物質）を分離する、ＳＥＣに使用される任意の種類の固相を含むことができる。使用しようとする樹脂の体積、カラムの長さ及び直径、ならびに動的容量及び流量は、幾つかのパラメータ、例えば、処理しようとする流体の体積、本発明の方法に供しようとする流体中のタンパク質の濃度などに依存し得る。各ステップでのこれらのパラメータの決定は、十分に当業者の平均的な技能の範囲内である。

本明細書で使用する場合、「混合モードサイズ排除クロマトグラフィー」または「ＭＭ－ＳＥＣ」という用語は、それらのサイズに基づく分離以外の追加の相互作用を通してタンパク質を分離する任意のクロマトグラフ法を含むことができる。追加または二次相互作用は、以下の機序：陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、電荷－電荷相互作用、水素結合、パイ－パイ結合、及び金属親和性のうちの１つまたは複数を活用することができる。混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、ＭＭ－ＳＥＣ分離に使用される任意の種類の固相を指すことができる。非限定的な例は、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ３００、またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－３である。

本明細書で使用する場合、「疎水性官能性」という用語は、二次相互作用としてのタンパク質とＳＥＣクロマトグラフ樹脂との疎水性相互作用を指す。疎水性官能性はピーク形状にも相当な影響を与える可能性があり、それはプロセスの分解能に顕著な作用を及ぼす可能性がある。疎水性相互作用は、移動相のイオン強度が高いときに最も強い。疎水性官能性を樹脂に含むように移動相を選択する場合、様々なイオンを、それらが疎水性相互作用（塩析作用）を促進するのか、または水の構造を撹乱して（カオトロピック作用）疎水性相互作用を弱化させるのかに応じて、いわゆる疎溶媒性系列（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ ｓｅｒｉｅｓ）に配置することができる（図３に示す通り）。陽イオンは、塩析作用の増大という観点から、Ｂａ^＋＋；Ｃａ^＋＋；Ｍｇ^＋＋；Ｌｉ^＋；Ｃｓ^＋；Ｎａ^＋；Ｋ^＋；Ｒｂ^＋；ＮＨ４^＋とランク付けされ、一方陰イオンは、カオトロピック作用の増大という観点から、ＰＯ^－；ＳＯ_４ ^－；ＣＨ_３ＣＯ_２ ^－；Ｃｌ^－；Ｂｒ^－；ＮＯ_３ ^－；ＣｌＯ_４ ^－；Ｉ^－；ＳＣＮ^－と順位付けすることができる。一般に、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ_４硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド－タンパク質相互作用を効率的に促進する。以下の関係によって示されるように相互作用の強度に影響を与える塩を配合することができる：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４＞Ｎａ_２ＳＯ_４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ_４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮ。

質量分析
本明細書で使用する場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を検出し、それらの正確な質量を測定することが可能なデバイスを含む。この用語は、ポリペプチドまたはペプチドを入れて溶出させ、検出及び／または特性解析することができる任意の分子検出器を含むことが意味される。質量分析計は、３つの主要部分、すなわちイオン源、質量分析器、及び検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを作り出すことである。分析物である原子、分子、またはクラスターを気相中に移し、イオン化することができ、（エレクトロスプレーイオン化の場合には）同時に行うこともできる。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

本明細書で使用する場合、「質量分析器」という用語は、化学種、すなわち、原子、分子、またはクラスターをそれらの質量に従って分離することができるデバイスを含む。高速タンパク質シーケンシングに用いることができると思われる質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場／電場型、四重極質量フィルター型（Ｑ）、四重極イオントラップ型（ＱＩＴ）、オービトラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴＩＣＲ）、及びまた加速器質量分析（ＡＭＳ）の技法である。

本明細書で使用する場合、「タンデム質量分析」という用語は、試料分子に関する構造情報が多段の質量選択及び質量分離を使用して得られる技法を含む。前提条件は、試料分子を気相に移し、インタクトな状態でイオン化することができること、及び最初の質量選択ステップ後にそれらを何らかの予測可能かつ制御可能な様式で解離するように誘導できることである。多段ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳ^ｎは、最初にプリカーサーイオンを選択及び単離し（ＭＳ^２）、それをフラグメント化し、一次フラグメントイオンを単離し（ＭＳ^３）、それをフラグメント化し、二次フラグメントを単離すること（ＭＳ^４）などによって、意味のある情報を得ることができるかまたはフラグメントイオンシグナルが検出可能である限り実行することができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせで成功裡に実行されている。ある種の用途のためにどんな分析器を組み合わせるのかは、多くの様々な要因、例えば、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、費用、及び有用性によっても決定される。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、空間的タンデム及び時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析器が空間的に連結されるかまたは空間的タンデム分析器と連結されたハイブリッドも存在する。

幾つかの例示的な実施形態では、質量分析は、ネイティブ条件下で実行することができる。

本明細書で使用する場合、「ネイティブ条件」または「ネイティブＭＳ」または「ネイティブＥＳＩ－ＭＳ」という用語は、分析物中の非共有結合相互作用を保存する条件下で実行する質量分析を含むことができる。ネイティブＭＳに関する詳細な総説については、この総説：Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７６－１１９２（２０１５）を参照されたい。ネイティブＥＳＩと通常のＥＳＩの相違の幾つかを表１に示す（Ｈａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，５８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１２－１０２０（２０１３））。

例示的な実施形態
本明細書に開示する実施形態は、試料中のタンパク質の迅速な特性解析のための組成物、方法、及びシステムを提供する。

本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

本開示は、試料中の不純物を検出または定量化するための方法であって、混合モードクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させること；移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して不純物を含む溶出液を得ること；及び質量分析計を使用して溶出液中の不純物を検出することを含む方法を提供する。

本開示は、試料中の標的タンパク質を検出または定量化するための方法であって、混合モードクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに試料を接触させること、移動相を使用して混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して標的タンパク質を含む溶出液を得ること；及び質量分析計を使用して溶出液中の標的タンパク質を検出または定量化することを含む方法を提供する。

幾つかの特定の例示的な態様では、クロマトグラフシステムは、追加の相互作用を有するサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

幾つかの特定の例示的な態様では、クロマトグラフシステムは、疎水性相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

幾つかの特定の例示的な態様では、クロマトグラフシステムは、電荷－電荷相互作用官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。

幾つかの例示的な実施形態では、試料中の不純物を検出または定量化するための方法は、少なくとも１種の望ましくないタンパク質を含み得る不純物を含むことができる。不純物（複数可）は、公知の構造のもの、または部分的に特性解析されたもの、または同定されていないものであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、不純物は、生成物関連不純物であり得る。生成物関連不純物は、分子バリアント、前駆体、分解生成物、フラグメント化タンパク質、消化された生成物、凝集物、翻訳後修飾型、またはそれらの組み合わせであり得る。

幾つかの特定の例示的な態様では、不純物は、プロセス関連不純物であり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスに由来する不純物、すなわち、核酸及び宿主細胞タンパク質、抗生物質、血清、他の培地成分、酵素、化学的及び生化学的処理試薬、無機塩、溶媒、担体、リガンド、ならびに製造プロセスに使用される他の溶出物を含み得る。

幾つかの例示的な実施形態で、不純物は、約４．５～約９．０の範囲内のｐＩを有するタンパク質であり得る。一態様では、不純物は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有するタンパク質であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、不純物は、ホモ二量体種であり得る。一態様では、不純物は、二重特異性抗体の生成中に形成されることがあるホモ二量体種であり得る。別の態様では、試料中の不純物の数は少なくとも２つであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフシステムに負荷する試料の量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲であり得る。例示的な一実施形態では、クロマトグラフシステムに負荷する試料の量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、不純物を溶出するのに使用される移動相は、質量分析計と適合性があり得る移動相であり得る。

幾つかの特定の例示的な態様では、移動相は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様では、移動相の総濃度は、約６００ｍＭまでの範囲であり得る。特定の態様では、移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１１００ｍＭ、１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、移動相は、約０．１ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。例示的な一実施形態では、移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、不純物を検出または定量化するための方法は、質量分析計を使用して溶出液中の不純物を検出または定量化することを含むことができる。一態様では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の態様では、質量分析計は、ナノスプレーを含むことができる。

幾つかの例示的な実施形態では、溶出液は、不純物に加えて標的タンパク質を含むことができる。一態様では、標的タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、または多重特異性抗体を含み得る。特定の態様では、標的タンパク質は、モノクローナル抗体であり得る。特定の態様では、標的タンパク質は、治療用抗体であり得る。特定の態様では、標的タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質であり得る。別の特定の態様では、免疫グロブリンタンパク質は、ＩｇＧ１であり得る。さらに別の特定の態様では、免疫グロブリンタンパク質は、ＩｇＧ４であり得る。一態様では、標的タンパク質は、二重特異性抗体であり得る。特定の態様では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０／ＣＤ３モノクローナル抗体であり得る。一態様では、標的タンパク質は、マウス線維芽細胞株ＭＧ８７を使用して作製された抗体であり得る。一態様では、標的タンパク質は、抗体の消化時に形成される抗体フラグメントであり得る。

一態様では、標的タンパク質は、翻訳後修飾タンパク質であり得る。特定の態様では、翻訳後修飾タンパク質は、開裂、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化、Ｃ末端のアミド化、酸化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化、アルキル化、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内または鎖間での共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾、ビタミンＫ依存性修飾、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、脱グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、硫酸化、シトルリン化、脱アミド化、ジスルフィド架橋の形成、タンパク質開裂、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、またはユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）によって形成され得る。

別の態様では、標的タンパク質は、タンパク質の分解生成物であり得る。

さらに別の態様では、標的タンパク質は、バイオ医薬製品に見出される不純物であり得る。特定の態様では、標的タンパク質は、バイオ医薬製品の製造中に見出される不純物であり得る。

一態様では、標的タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲内のｐＩを有するタンパク質であり得る。

一態様では、標的タンパク質は、生成物関連不純物であり得る。生成物関連不純物は、分子バリアント、前駆体、分解生成物、フラグメント化タンパク質、消化された生成物、凝集物、翻訳後修飾型、またはそれらの組み合わせであり得る。

一態様では、標的タンパク質は、プロセス関連不純物であり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスに由来する不純物、すなわち、核酸及び宿主細胞タンパク質、抗生物質、血清、他の培地成分、酵素、化学的及び生化学的処理試薬、無機塩、溶媒、担体、リガンド、ならびに製造プロセスに使用される他の溶出物を含み得る。

一態様では、試料中の不純物の数は少なくとも２つであり得る。

一態様では、翻訳後修飾タンパク質は、タンパク質の酸化時に形成され得る。

別の態様では、標的タンパク質は、分解生成物を含み得る。

別の態様では、分解生成物は、治療用タンパク質の翻訳後修飾を含み得る。

幾つかの例示的な実施形態では、移動相を使用して混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄することは、約３０分未満が必要とされる。一態様では、移動相を使用して混合モードクロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに必要とされる時間は、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、または約３０分であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフシステムは、クリーニングせずに少なくとも約３回の試料ランに使用することができる。一態様では、クロマトグラフシステムは、クリーニングせずに少なくとも約３回の試料ラン、少なくとも約４回の試料ラン、少なくとも約５回の試料ラン、少なくとも約６回の試料ラン、少なくとも約７回の試料ラン、または少なくとも約８回の試料ランに使用することができる。

該方法が前述のタンパク質、不純物、カラムのいずれかに限定されないこと、及び検出または定量化するための方法が任意の適切な手段で行われることが理解される。

幾つかの例示的な実施形態では、本開示は、移動相を使用して洗浄して標的タンパク質を含む溶出液を得ることが可能なクロマトグラフカラム１１０と、該クロマトグラフカラムに連結された質量分析計１２０とを含む混合モードクロマトグラフシステムを提供する（図４に示す通り）。一態様では、クロマトグラフカラム１１０は、試料ローディングデバイス１００を使用して、試料と接触することが可能である。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフカラム１１０に負荷することができる試料の量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲であり得る。一態様では、クロマトグラフカラム１１０に負荷することができる試料の量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフカラム１１０は、移動相で洗浄することが可能であり得る。一態様では、移動相は、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様では、クロマトグラフカラム１１０で使用することができる移動相の総濃度は、約６００ｍＭまでの範囲であり得る。特定の態様では、クロマトグラフカラム１１０で使用することができる移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１１００ｍＭ、１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであり得る。別の態様では、クロマトグラフカラム１１０で使用することができる移動相は、０．１ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。特定の態様では、クロマトグラフカラム１１０で使用することができる移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であり得る。別の態様では、クロマトグラフカラム１１０で使用することができる移動相は、不純物を溶出するために使用することができる。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフカラム１１０は、質量分析計１２０と連結することが可能であり得る。一態様では、質量分析計１２０は、ナノスプレーを含むことができる。

幾つかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０は、タンデム質量分析計であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０は、ネイティブ質量分析計であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る（図４参照）。一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、１つの標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０に使用することができる。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、モノクローナル抗体の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、治療用抗体の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、免疫グロブリンタンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、ＩｇＧ１タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、ＩｇＧ４タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、二重特異性抗体の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。さらに別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、抗ＣＤ２０／ＣＤ３モノクローナル抗体の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、抗体の消化時に形成された抗体フラグメントの検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。一態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、翻訳後修飾タンパク質であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、タンパク質の分解生成物であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。さらに別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、バイオ医薬製品に見出される不純物であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。別の態様では、混合モードクロマトグラフシステムは、バイオ医薬製品の製造中に見出される不純物であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、約４．５～約９．０の範囲内のｐＩを有するタンパク質であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、生成物関連不純物であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。生成物関連不純物は、分子バリアント、前駆体、分解生成物、フラグメント化タンパク質、消化された生成物、凝集物、翻訳後修飾型、またはそれらの組み合わせであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、混合モードクロマトグラフシステムは、プロセス関連不純物であり得る標的タンパク質の検出１４０及び／または定量化１３０が可能であり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスに由来する不純物、すなわち、核酸及び宿主細胞タンパク質、抗生物質、血清、他の培地成分、酵素、化学的及び生化学的処理試薬、無機塩、溶媒、担体、リガンド、ならびに製造プロセスに使用される他の溶出物を含み得る。一態様では、試料中の不純物の数は少なくとも２つであり得る。

幾つかの例示的な実施形態では、クロマトグラフカラム１１０は、クリーニングせずに少なくとも約３回の試料ランに使用することが可能である。一態様では、クロマトグラフカラム１１０は、クリーニングせずに少なくとも約３回の試料ラン、少なくとも約４回の試料ラン、少なくとも約５回の試料ラン、少なくとも約６回の試料ラン、少なくとも約７回の試料ラン、または少なくとも約８回の試料ランに使用することができる。

該システムが、前述のタンパク質、不純物、移動相、またはクロマトグラフカラムのいずれにも限定されないことが理解される。

本明細書に提供する方法ステップの番号及び／または文字での連続するラベル付けは、示された特定の順序に方法またはその任意の実施形態を限定することを意味するものではない。

特許、特許出願、特許出願公開、受入番号、技術論文、及び学術論文を含めた様々な刊行物を、本明細書にわたって引用する。引用したこれらの参照文献の各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、本開示をさらに詳しく説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。それらは例示を意図するものであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

材料。脱イオン水は、ＭｉｌｌｉＰａｋ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２０フィルターを装着したＭｉｌｌｉ－Ｑ一体型浄水システム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）によって得た。酢酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）、酢酸、及び炭酸水素アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４サブクラスを含めたすべてのモノクローナル抗体並びに二重特異性体はＲｅｇｅｎｅｒｏｎで生成した。

試料調製。Ｆｃ部分に２つのＮ結合型グリカンが存在することによって導入された質量の不均質性を低減するために、各抗体または抗体混合物試料をＰＮＧａｓｅ Ｆ（タンパク質１０μｇ当たり１ＩＵＢミリユニット）で１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中４５℃で１時間処理した。ｂｓＡｂ混合物のスパイクイン標準物質を調製するために、最初に分析用強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）を使用してｂｓＡｂ原薬をさらに精製して、大規模製造プロセスからのあらゆる残留ホモ二量体不純物を除去した。ＳＣＸ分画の詳細な条件は以降に示す。分画後、精製したＢｓＡｂと対応するホモ二量体標準物質の両方を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に緩衝液交換し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定される濃度に基づいて各々６μｇ／μＬに調整した。続いて、ｂｓＡｂと２つの対応するホモ二量体とを１：１：１の比率で混合した。最後に、２μｇ／μＬのｂｓＡｂ溶液を使用して段階希釈を実行して、ホモ二量体レベルが０．１％～１０％の範囲である一連のスパイクイン標準物質を調製した。

ＳＣＸによるｂｓＡｂ原薬からのｂｓＡｂの精製。各ｂｓＡｂ試料からｂｓＡｂをさらに精製するために、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳ）で分析用強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）を実行した。試料を注入する前に、カラム槽の温度を４５℃に設定し、ＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆ強陽イオン交換カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）（ＹＭＣ Ｃｏ．，ＬＴＤ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を０．４ｍＬ／分の流量の移動相Ａ（２０ｍＭ酢酸でｐＨを５．６に調整した２０ｍＭ酢酸アンモニウム）で事前コンディショニングした。一定分量（２００μｇ）のタンパク質試料の注入時に、勾配を１００％移動相Ａに２分間保持し、続いて１６分間で１００％移動相Ｂ（１４０ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７．４）に線形増加させる。勾配を１００％移動相Ｂに４分間保持し、次いで１００％移動相Ａに戻してカラムを７分間再コンディショニングし、その後次の注入を行った。次いで、分画されたＢｓＡｂを、誤対合されたホモ二量体試料と同じ緩衝液に緩衝液交換し、その後混合してスパイクイン標準物質を調製した。

ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法。混合モードサイズ排除クロマトグラフィーは、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳ）で実行した。Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ ＥＭＲ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を質量測定に使用した。試料を注入する前に、カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ ４．６×３００ｍｍ、２００Å、１．７μｍ、またはＳｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ４．６×３００ｍｍ、３００Å、３μｍ）を、酢酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムをベースとする種々の濃度の移動相（３０ｍＭ～４５０ｍＭ）を使用して０．２ｍＬ／分の流量で予め平衡化した。これは、２溶媒系（移動相Ａ：水；移動相Ｂ：４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム）を使用した定率（％）の移動相Ｂで行うことによって実現した。抗体試料（２～１０μｇ）の注入時に、定組成溶離法を２４分間行った。ＵＶとＭＳの同時検出を可能にするため、ＳＥＣ分離後にポストカラムスプリッター（約２００：１の比率）を適用して、ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ分析用には流量を約１μＬ／分に低減する一方で、残りの高流量を２８０ｎｍでのＵＶモニタリング用のＰＤＡ検出器に分流した。使い捨てのＰｉｃｏＴｉｐ Ｅｍｉｔｔｅｒ（コーティングなし、チップ：１０±１μｍ）（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳ）を使用してナノ－ＥＳＩを実現した。質量分析のために、分解能を１７，５００に、キャピラリースプレー電圧を１．５ｋＶに、インソースフラグメンテーションエネルギーを１００に、衝突エネルギーを１０に、キャピラリー温度を３５０℃に、Ｓ－レンズＲＦレベルを２００に、ＨＣＤトラッピングガス圧力を３に設定した。質量スペクトルは、２０００～１５０００の間のｍ／ｚ範囲枠内で取得した。

実施例１．ＭＳ適合性緩衝液を使用したＳＥＣ中の二次相互作用。
タンパク質の表面は高度に不均質であり、シリカまたは多糖ベースのＳＥＣカラムマトリックスとの水素結合（ヒドロキシル、アミン、及びアミド基）、静電（荷電基）、及び疎水性（疎水基）相互作用に寄与し得る多くの様々な官能基からなる。これらの相互作用は一般に、様々な結合強度を有し、ＳＥＣ用途に使用されるｐＨ、温度、及び移動相の組成に大きく依存する。例えば、中性付近のｐＨで実行すると、シリカベースのＳＥＣカラムからのシラノール基が負に帯電し、それによって塩基性タンパク質の静電相互作用が促進されることがある。そのような相互作用を抑制するために、中程度のイオン強度を有する移動相（Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１８，前出）または低ｐＨ（５未満）を有する移動相（Ｐａｖｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出）が必要とされることが今まで多かった。

ごく最近では、シリカ表面誘導体化（短いアルキル鎖または官能基の結合など）を介して、現代のＳＥＣカラムからの残留シラノール基を効率的に遮蔽することができ、それによって静電相互作用の存在が劇的に低減している。しかしながら、これらの新たに導入された化学基は、最近の研究に報告されるように、タンパク質分析物との他の二次相互作用（例えば、疎水性相互作用）の強化をもたらすおそれもある（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，前出；Ｙａｎ Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎ－ｌｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ，１２６２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １２２－１２９（２０１２））。Ａｒａｋａｗａらによって要約されるように、静電相互作用は低塩濃度で優勢であるのに対し、疎水性相互作用は高イオン強度の移動相で有利であり、特にホフマイスター系列で上位の塩（図３参照）が使用されるときに有利である。オンラインＳＥＣ－ＭＳ用途に適合性のある塩の選択は一般に限定されているが（例えば、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及び炭酸水素アンモニウム）、それでもタンパク質分析物とカラムマトリックスの間の異なるタイプの二次相互作用を種々の塩濃度によって調節し、タンパク質を分離することを目的として模索することができると思われる。

塩濃度に関連する混合モード相互作用を査定するために、異なる表面特性を有する８種の抗体（いずれもＩｇＧ１及びＩｇＧ４のサブクラス）の混合物を、後続のネイティブＭＳ分析で実施可能な範囲である３０ｍＭ～３００ｍＭの種々の濃度の酢酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムベースの移動相を使用して、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラムで分析した。酢酸アンモニウムと炭酸水素アンモニウムの間のモル比は１４：１に一定に保って、およそ７．４のｐＨ値を実現した。８種のｍＡｂのクロマトグラフ挙動を、抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）によって決定されたそれらのＳＥＣ保持時間を移動相濃度に対してプロットすることによって示した（図５）。総じて、８種のｍＡｂは、３０ｍＭの移動相塩濃度を使用してＳＥＣを実行したときに最もよく分離された。塩濃度が増加するにつれ、８種のｍＡｂの溶出プロファイルは近くなり、分解能が低下した（図５中挿入図）。これらの保持時間のシフトは、ｍＡｂ分子とカラムマトリックスの間の二次相互作用の変化によって説明できると思われる。その一方で、カラムマトリックスからの残留シラノール基がｐＨ７．４で負に帯電するようになるために、それらは正に帯電したタンパク質の表面と静電相互作用を介して相互作用した可能性がある。この相互作用は、使用する塩濃度を低くすると強化される。その一方で、使用する塩濃度を高くしたときに、ｍＡｂ分子とカラムマトリックスの間の疎水性相互作用が促進された可能性がある。興味深いことに、これらの８種のｍＡｂは、それらのｐＩ値に基づいて３つの異なるグループに分類することができ、それにおいて保持時間と塩濃度の間に類似した関係性が観察された。第１のグループは、３種の酸性ｍＡｂ分子、ｍＡｂ５（ｐＩ＝６．３）、ｍＡｂ６（ｐＩ６．４）、及びｍＡｂ１（ｐＩ＝６．７）を含み、これらはｐＨ７．４でタンパク質表面により少ない正電荷を有すると予想され、したがってカラムマトリックスとの最小の静電相互作用を呈した。図５に示すように、これら３種の分子はすべて塩濃度が増加するにつれて保持時間が増加する傾向を示し、それによって、イオン強度が高くなると弱い静電相互作用が排除され、疎水性相互作用がＳＥＣ分離中に優勢な役割を果たすことが示された。逆に、ｐＨ７．４でタンパク質表面により多い正電荷を有すると予想される３種の塩基性ｍＡｂ分子、ｍＡｂ３（ｐＩ＝８．０）、ｍＡｂ４（ｐＩ＝８．３）、及びｍＡｂ８（ｐＩ＝７．６はすべて、塩濃度が増加するにつれて保持時間が減少する傾向を示した。塩濃度と保持時間の間のこの逆相関は、優勢な静電相互作用に主に起因し、これは低塩濃度で促進され、高塩濃度で抑制された。最後に、酸性または塩基性のいずれのｍＡｂとも異なり、ｍＡｂ２（ｐＩ＝７．３）及びｍＡｂ７（ｐＩ＝６．９）は「中性」のグループとなり、これらはおそらくタンパク質表面に中程度の量の正電荷を有し、したがってカラムマトリックスと中間レベルの静電相互作用を呈したと思われる。このグループの分子は、種々の塩濃度（３０ｍＭ～３００ｍＭ）で比較的変化しない保持時間を維持した。この場合、塩濃度が増加したときに、疎水性相互作用の増加はおそらく静電相互作用の減少と近く、それによって打ち消されたことによって、保持時間がほとんどシフトしなかったと思われる。これらの結果から、塩濃度を適正に調節することによって、ＳＥＣカラムでの混合モード相互作用を使用して後続のＭＳ分析のために異なる抗体（例えば、ｂｓＡｂ対ホモ二量体）を分離するまたは部分的に分離することが可能であり得ることが示された。

Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨカラムでは低塩濃度で高いクロマトグラフ分解能が実現したと思われるが、塩基性ｍＡｂの場合は、これらの条件下で重度のピークテーリングが起こることがあり、タンパク質の回収に相当な影響を及ぼすおそれがあるために、注意が必要である（Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ３０ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｈｙｐｈｅｎａｔｉｏｎ，１０６５－１０６６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ３５－４３（２０１７））。

実施例２．ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した二重特異性抗体（二重特異性Ａｂ）のＯ－グリカンバリアントの検出
２．１ 二重特異性抗体の試料調製
抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＢｓＡｂ１）は、Ｆｃ結合を低減させるように修飾されたＩｇＧ４アイソタイプをベースとするヒンジ安定化ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性完全長抗体（Ａｂ）である。それは、Ｔ細胞（ＣＤ３を介して）及びＣＤ２０発現細胞に結合するように設計される。二重特異性抗体は、Ｓｍｉｔｈらによって記載される通りの手法に従うことによって生成した（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）５：１７９４３）。

２．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、上記の通りのシステムでＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（７．８×３００ｎｍ、３μｍ）を使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

２組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は１４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでおり、第２の実験では、移動相は４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．４ｍＬ／分の流量で実施した。平衡化は、移動相を使用して実行した。

分析ランのために、注入負荷を１００μｇの総タンパク質から構成した。溶出は、酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）及び炭酸水素アンモニウム（緩衝液Ｂ）からなる定組成勾配を使用して実施した。質量分析データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ製のＩｎｔａｃｔソフトウェアを使用することによって分析した。

異なる濃度の移動相での２回のランから、異なる移動相での二重特異性抗体の溶出時間から観察されるように塩濃度が高くなるとＳＥＣ分離中の疎水性相互作用を強化できることが明らかになった。この作用により、二重特異性抗体とそのＯ－グリカンバリアントの間の分離が増大した（図６参照）。

実施例３．Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍを使用したホモ二量体種の検出
３．１ 二重特異性抗体とホモ二量体との混合標準物質の試料調製
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ１）（Ｆｃ^＊／Ｆｃ）の生成中に２種のホモ二量体不純物を作製する：すなわち、ホモ二量体１（Ｆｃ^＊－Ｆｃ^＊）及びホモ二量体２（Ｆｃ／Ｆｃ）である（図２参照）。

３．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、上記の通りのシステムでＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（７．８×３００ｎｍ、３μｍ）を使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

２組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は１４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでおり、第２の実験では、移動相は４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．４ｍＬ／分の流量で実施した。

分析ランのために、注入負荷を５０μｇの総タンパク質から構成した。溶出は、酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）及び炭酸水素アンモニウム（緩衝液Ｂ）からなる定組成勾配を使用して実施した。２．２から得られた結果と同様に、異なる濃度の移動相での２回のランから、異なる移動相での二重特異性抗体及びホモ二量体の溶出時間から観察されるように塩濃度が高くなるとＳＥＣ分離中の疎水性相互作用を強化できることが明らかになった。４５０ｍＭの総塩濃度を有する移動相で実行すると、二重特異性抗体からのホモ二量体１及びホモ二量体２の分離が改善された（図７参照）。

実施例４．ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ、ＳＥＣ－ＭＳ、及びＲＰ ＬＣ－ＭＳを使用した、二重特異性抗体中のホモ二量体不純物の検出の比較。
４．１ 二重特異性抗体とホモ二量体との混合標準物質の試料調製
試料は、実施例３に示した手法を使用して調製した。

４．２ ＲＰ ＬＣ－ＭＳ
試料を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。この溶液をＬＣ－ＭＳ分析用に０．５μｇで注入した。ＬＣ－ＭＳ実験は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計で実行した。Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ（商標）ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ、４５０Å、２．７μｍ ２．１×５０ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐ．Ｎ．１８６００８９４４）を逆相分離に使用した。試料温度は５℃に設定し、カラム温度は８０℃に設定した。移動相Ａは水中０．１％ＦＡ、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ＦＡであった。質量分析実験はポジティブモードで実行した。ＭＳイオン源条件は次の通りに設定した。すなわち、スプレー電圧を３．８ ｋＶに、イオン移送管温度を３２５℃に、気化器温度を２５０℃に、シースガスを４０（Ａｒｂ）に、補助ガスを１０（Ａｒｂ）に、スイープガスを２（Ａｒｂ）に、ＲＦレンズ（％）を６０に、及びソースフラグメンテーションエネルギーを４０Ｖに設定した。ＭＳデータは、オービトラップによって１５００～４０００のｍ／ｚ範囲の高質量範囲モードで取得した。分解能は、ｍ／ｚ２００で１５，０００に設定し（１０マイクロスキャン）、ＡＧＣターゲットは１０^５、最大注入時間は５０ｍｓに設定した。質量分析データは、Ｘａｃｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して分析した。

４．３ ＳＥＣ－ＭＳ
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍｎ（２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ）で、１４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含む移動相を使用して実行した。ＳＥＣ実験は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－ｃｌａｓｓシステムで、室温、２８０ｎｍでの波長検出、０．２ｍＬ／分の流量、及び５０μｇのタンパク質注入負荷で実行した。

４．４ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムでの分析ランは、実施例３．２に示す手法を使用して、４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含有する移動相を使用して定組成で実施した。

４．５ 結果
ＬｕｍｏｓでのＲＰ ＬＣ－ＭＳ（図８参照）、ＥＭＲでのＳＥＣ－ＭＳ、及びＥＭＲでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳについての全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）及びネイティブＭＳスペクトルの比較から、ホモ二量体の二重特異性抗体からの有意な分離及び検出が示される。ＲＰ ＬＣ－ＭＳからの生質量スペクトログラムは、ホモ二量体と二重特異性抗体を区別することができなかった。ＳＥＣ－ＭＳからの生質量スペクトルは、ホモ二量体１と二重特異性抗体とを分離及び検出することができたが、分離は、ホモ二量体２と二重特異性抗体とを分離及び検出するには十分ではなかった。ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳからの生質量スペクトルだけが、ホモ二量体１、ホモ二量体２、及び二重特異性抗体の十分な分離及び検出を示した。この比較は、バイオ医薬製品中の不純物の検出に関してＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳがＳＥＣ－ＭＳ及びＲＰ ＬＣ－ＭＳより優位であることの概念実証となる。

実施例５．Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍを使用したＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ検出の連続ラン
連続ランでの検出のデータ品質を評価するために、二重特異性Ａｂ、ホモ二量体１、及びホモ二量体２を含有する試料（４．１に示す通りに調製したもの）の３回の分析ランをＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムを使用して実施した。分析ランは、４．２に示した手法、ならびに２８０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含む移動相を使用して実行した。

３回のランについての生質量スペクトル及び抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）から、データ品質及びシグナル対ノイズ比の減少が示された（図９参照）。この作用は、大きいカラム（７．８×３００ｍｍ）を使用したことが原因であり得ると思われる。これは、ＭＳの強度を確保するために多量のタンパク質試料（約５０μｇ）を必要とし、それによって高塩濃度でタンパク質の沈殿が生じるために、流路を頻繁にクリーニングすることが必要となる（クリーニング前に最大３回の試料ラン）。

さらに、大きいカラム及びナノスプリッターが処理することができる比較的低流量（最大約０．４ｍＬ／分）によって、ピーク幅が広くなった（約１．５分）。これは、場合によってＭＳの強度及び分解能に影響を及ぼす。遅い溶出時間によって、全体的な分析時間も遅くなった（各試料３０分）。

実施例６．Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、４．６×３００ｍｍを使用したホモ二量体種の検出
６．１ 二重特異性抗体とホモ二量体との混合標準物質の試料調製
二重特異性抗体とホモ二量体との混合標準物質は、３．１に示す方法によって調製することができる。

６．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、上記の通りのシステムでＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

４組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は１４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第２の実験では、移動相は２８０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第３の実験では、移動相は４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第４の実験では、移動相は５６０ｍＭ酢酸アンモニウム及び４０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．３ｍＬ／分の流量で実施した。

分析ランのために、注入負荷を１０μｇのタンパク質から構成した。溶出は、酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）及び炭酸水素アンモニウム（緩衝液Ｂ）からなる定組成勾配を使用して実施した。１５０ｍＭの総塩濃度より大きい濃度を使用すると、ホモ二量体と二重特異性抗体の分離及び検出の改善が示される（図１０参照）。大きい方のカラム（７．８×３００ｎｍ）を使用した総分析時間及びピーク幅と比較して、小さい方のカラム（４．６×３００ｎｍ）を使用した総分析時間は約１８分に減少し、ピーク幅は１分未満に減少した。その相違の表現を図１１に示す。

実施例７．二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物のＺｅｎｉｘ－ＳＥＣカラムでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析
７．１ 二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物の調製
各タンパク質をペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；タンパク質１０μｇ当たり１ＩＵＢミリユニット）で４５℃で１時間処理して、各重鎖の定常領域からグリカン鎖を完全に除去した。

７．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、上記の通りのシステムでＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

６組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は９．３ｍＭ酢酸アンモニウム及び０．７ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第２の実験では、移動相は４６．７ｍＭ酢酸アンモニウム及び３．３ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第３の実験では、移動相は９３．３ｍＭ酢酸アンモニウム及び６．７ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第４の実験では、移動相は１８６．７ｍＭ酢酸アンモニウム及び１３．３ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第５の実験では、移動相は２８０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第６の実験では、移動相は４２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び３０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．３ｍＬ／分の流量で実施した。

分析ランのために、注入負荷を１０μｇのタンパク質から構成した。

１０ｍＭの総塩濃度を使用すると、ホモ二量体１、二重特異性抗体、及びホモ二量体２の有意な分離が示される。１０ｍＭの塩濃度では、ホモ二量体２の保持時間は二重特異性抗体より遅く、それはホモ二量体１の保持時間より遅いことが示された。しかしながら、１０ｍＭより濃度が高くなると、ホモ二量体１の保持時間は二重特異性抗体より遅く、その保持時間はホモ二量体２より短いことが示された（図１２及び図１３参照）。この作用は、使用したサイズ排除クロマトグラフィー樹脂と３種のタンパク質との異なるタイプの相互作用（電荷、形状、または疎水性）に起因し得ると思われる。所与の塩濃度でのタンパク質の電荷は、それらのｐＩ値に依存する（表２）。有意な分離は、１０ｍＭの低塩濃度の移動相を使用するか、または１００ｍＭより大きい高塩濃度の移動相を使用するか、そのいずれかによって得られた。塩濃度が低くなると、保持は電荷－電荷相互作用によって推進され得る。例えば、塩基性分子は、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムでは、低い方の塩濃度を有する移動相を使用して分離することができる。塩濃度が高くなると、保持は疎水性相互作用によって推進される。例えば、酸性または疎水性分子は、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムでは、高い方の塩濃度を有する移動相を使用して分離することができる（図１４及び図１５参照）。

理想的なＳＥＣ分離は、タンパク質の流体力学的体積のみに基づくべきであり、タンパク質と固定相の間に他の相互作用が所望されるべきではない。シリカベースのカラムマトリックスはシラノール基（イオン交換特性）によって負電荷を呈することがあるため、シリカ粒子の誘導体化がシラノールの作用を低減させるのに役立つが、同時に新たな相互作用機序（疎水性）を導入する可能性がある。よってこれによって、Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－カラムに観察されるように、官能性を有するＳＥＣ樹脂が作出されることがある。これによって、Ｚｅｎｉｘ－ＳＥＣカラム中で実施したときの、異なる濃度を有するタンパク質の溶出の順序の相違が説明される。

実施例８．二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物のＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ ＣｏｌｕｍｎでのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析
８．１ 二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の脱グリコシル化混合物の調製
脱グリコシル化混合物は、７．１と同じ手法を使用して調製した。

８．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、上記の通りのシステムでＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍを使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

６組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は１４ｍＭ酢酸アンモニウム及び１ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第２の実験では、移動相は１８．７ｍＭ酢酸アンモニウム及び１．３ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第３の実験では、移動相は２８ｍＭ酢酸アンモニウム及び２ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第４の実験では、移動相は７０ｍＭ酢酸アンモニウム及び５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第５の実験では、移動相は９３．３ｍＭ酢酸アンモニウム及び６．７ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第６の実験では、移動相は２８０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．２ｍＬ／分の流量で実施した。

分析ランのために、注入負荷を１０μｇのタンパク質から構成した。

１５ｍＭの総塩濃度を使用すると、ホモ二量体１、二重特異性抗体、及びホモ二量体２の有意な分離が示される。１５ｍＭの塩濃度で、ホモ二量体２の保持時間は二重特異性抗体より早く、それはホモ二量体１より早い保持時間を示した。移動相の濃度が増加すると、保持時間の差が低減した。さらに、３００ｍＭの移動相の塩濃度では、ホモ二量体１の保持時間は二重特異性抗体より早く、それはホモ二量体２より早い保持時間を示した（図１６及び図１７参照）。図１４及び図１５に記載するように、この作用は、ＳＥＣカラム上の追加の相互作用の進展に起因する。追加の相互作用は、移動相の塩濃度に依存する。低い方の濃度では、電荷－電荷相互作用がカラムで優勢であり、カラムでのタンパク質の保持を決定する。

実施例９．Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ ＣｏｌｕｍｎでのＩｇＧ１分子及びその酸化バリアントのＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析
９．１ ＩｇＧ１分子（Ａｂ１）の酸化バリアントの調製
Ａｂ１をペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；タンパク質１０μｇ当たり１ＩＵＢミリユニット）で４５℃で１時間処理して、各重鎖の定常領域からグリカン鎖を完全に除去した。

９．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、上記の通りのシステムでＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍを使用して定組成で実行した。溶出は、２８０ｎｍでのＵＶによってモニタリングした。

３組の実験を実施した。第１の実験では、移動相は９３．３ｍＭ酢酸アンモニウム及び６．７ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第２の実験では、移動相は１４０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含み、第３の実験では、移動相は２８０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含んでいた。溶出は、０．２ｍＬ／分の流量で実施した。

分析ランのために、注入負荷を１０μｇのタンパク質から構成した。

１００ｍＭ、１５０ｍＭ、及び３００ｍＭの塩濃度の移動相を使用すると、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムで抗体Ａｂ１とその酸化バリアントが有意に分離される（図１８、上パネル参照）。ＩｇＧ１抗体Ａｂ１のｐＩは８．６５である。より高いＰＩを有するＩｇＧ１分子では、低いｐＩ値を有するＩｇＧ４分子と比較して、電荷相互作用がより優勢な役割を果たす。

実施例１０． Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ ＣｏｌｕｍｎでのＩｇＧ１分子のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析
１０．１ ＩｇＧ１分子（Ａｂ２）の調製
Ａｂ２をペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；タンパク質１０μｇ当たり１ＩＵＢミリユニット）で４５℃で１時間処理して、各重鎖の定常領域からグリカン鎖を完全に除去した。

１０．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、実施例８．２に記載する通りのシステムでＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍを使用して定組成で実行した。２種のＩｇＧ１分子－Ａｂ１及びＡｂ２の保持時間を比較すると、Ａｂ２分子の方が保持時間が短いことが観察された（図１８、下パネル参照）。

これは、Ａｂ１とＡｂ２の疎水性の相違に起因すると説明することができる。より疎水性が高い分子では、より疎水性が低い分子と比較して、「塩析」作用がより低い塩濃度で生じ始める。このポイントは、転移点とも呼ばれる（図１９参照）。

実施例１１． ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した二重特異性抗体中のホモ二量体不純物の定量化
標準物質は、図２０に示す手法を使用して作製した。

ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した取得は、記載の通りのシステムでＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用して定組成で実行した。タンパク質を溶出するために３００ｍＭの塩濃度及び７０ｍＭの塩濃度を有する移動相を使用した。インタクトレベル及びサブユニットレベルでの両方の濃度について、ホモ二量体の量が高くなると、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した検出が高度になることが観察された（図２１及び図２２参照）。移動相の塩濃度が７０ｍＭのとき、二重特異性抗体の追加のＦｃ不純物も検出された。

インタクトレベルで、検出されたホモ二量体１／二重特異性抗体に対する理論上のホモ二量体１／二重特異性抗体のプロット、及び検出されたホモ二量体２／二重特異性抗体に対する理論上のホモ二量体２／二重特異性抗体のプロットは、０．１％～５０％存在するホモ二量体の定量化に関して良好な直線性を示した（図２３参照）。

サブユニットレベルで、検出されたホモ二量体１／二重特異性抗体に対する理論上のホモ二量体１／二重特異性抗体のプロット、及び検出されたホモ二量体２／二重特異性抗体に対する理論上のホモ二量体２／二重特異性抗体のプロットは、０．１％～５０％存在するホモ二量体の定量化に関して良好な直線性を示した（図２４参照）。インタクトレベルと比較して、より良好な精度がサブユニットレベルで得られた。

実施例１２．ネイティブＭＳ検出のための二重特異性抗体とホモ二量体抗体の混合モードＳＥＣ分離
異なるｐＩ値及び疎水性を有する４種のｂｓＡｂ分子（表３）をそれらの対応するホモ二量体抗体と混合し、試験標準物質として使用した。各ｂｓＡｂ分子（ＨＨ^＊Ｌ２）は、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）及び２つの異なる重鎖（ＨＣ及びＨＣ^＊）を含有し、それに対して各ホモ二量体抗体（Ｈ２Ｌ２またはＨ^＊２Ｌ２）は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖（ＨＣまたはＨＣ^＊）を含有する。

^＊ 見かけのＨＩＣ保持係数は、ＨＩＣによって分析されたタンパク質分子の保持時間に基づいて算出した。ＹＭＣ ＢｉｏＰｒｏ ＨＩＣ ＢＦカラム（４μｍ、１００ｍｍ×４．６ｍｍ）に、３．３Ｍアンモニウム緩衝液の移動相「Ａ」及び水の移動相Ｂを適用した。勾配は、０．４ｍＬ／分の流量で、１８分間で１００％Ａから９７％Ａで実行した。見かけのＨＩＣ保持係数は、１８分間でのその保持時間を１０のスケールに正規化することによって算出した。

次いで４種のｂｓＡｂ混合物を、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨカラムで３つの異なる塩濃度（７５ｍＭ、１５０ｍＭ、及び３００ｍＭ）を使用して分析し、その後オンラインネイティブＭＳ検出を行った。得られた基準ピーククロマトグラム（ＢＰＣ）を図２５の左パネルに示す。前の試験からの観察と一致して、塩濃度が増加するにつれ、異なるｐＩ値を有するｍＡｂ分子は、異なる保持時間の動向を呈した。したがって、種々の塩濃度で異なる各抗体の保持挙動を利用して、塩濃度を調節することによってｂｓＡｂからホモ二量体を分離する可能性を模索した。例えば、ｂｓＡｂ２混合物では、塩濃度が３００ｍＭから７５ｍＭに減少するにつれて、２種の酸性分子、Ｈ２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝６．１）及びＨＨ^＊Ｌ２ ｂｓＡｂ（ｐＩ＝６．５）はいずれも、おそらく低塩濃度での疎水性の低減及び低静電相互作用のために溶出が早くなった。対照的に、中性分子、Ｈ^＊２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝７．２）は、塩濃度を調節してもほとんど保持時間が変わらないままであった。これは多分、低塩濃度での疎水性相互作用の低減が静電相互作用の強化によって打ち消されたためあると思われる。加えて、Ｈ２Ｌ２ホモ二量体は、低塩濃度でＨＨ^＊Ｌ２ ｂｓＡｂと比較して相当な保持時間の減少を呈したので（おそらくそのより低いｐＩ値、及びそれによるより弱い静電相互作用に起因すると思われる）、２つの分離の改善も実現された。その結果、両方のホモ二量体とｂｓＡｂ２の良好なクロマトグラフ分離が７５ｍＭの塩濃度で実現された。

同様に、ｂｓＡｂ３とその２つのホモ二量体の分離も、塩濃度を３００ｍＭから７５ｍＭに減少させると相当に改善された。これは、Ｈ２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝６．６）、ＨＨ^＊Ｌ２ ｂｓＡｂ（ｐＩ＝７．４）、及びＨ^＊２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝８．３）の保持時間がそれぞれ、減少した、変わらないままであった、または増加したからである。注目すべきは、２つの実施例のいずれにおいてもベースライン分解能は実現されなかったが、ホモ二量体の同定及び定量化は、検出器としてのＭＳの高特異性によって、ＵＶベースの定量化にあるような共溶出種による相当な影響を受けないはずであるということである。

ｂｓＡｂ５混合物でもやはり、ＢＥＨカラムでの７５ｍＭの塩濃度で、高濃度条件より良好な分離が実現された。これは、塩濃度が減少するにつれ、比較的塩基性の分子、ＨＨ^＊Ｌ２ ｂｓＡｂ（ｐＩ＝８．１）及びＨ^＊２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝８．５）が両方とも次第に遅くなる保持時間を呈したのに対して、比較的中性のＨ２Ｌ２ホモ二量体（ｐＩ＝７．４）が保持時間の変化を示さなかったためである。しかしながら、良好なクロマトグラフ分離にもかかわらず、この条件はホモ二量体の定量化には理想的ではなかった。何故なら、Ｈ^＊２Ｌ２ホモ二量体は塩基性が高いために、低塩濃度ではピークテーリング及びタンパク質回収損失を生じ始めたからである。さらに、ｂｓＡｂ４混合物は、塩濃度を３００ｍＭから７５ｍＭに減少させることによって分離の改善を実現できなかったことを実証した。これはおそらく、３種の分子がすべて中性付近のｐＩを有し（表３）、よって相当する塩濃度の変化で類似した保持挙動を呈するためと思われる。塩濃度をさらに下げて静電相互作用を強化すれば分離を改善することができるが、おそらく重度のピークテーリングが生じることとなり、それによって定量化が損なわれると思われる。塩濃度が増加するにつれてｂｓＡｂ４混合物の溶出プロファイルが広がることも興味深い。３００ｍＭの塩濃度では、３種の分子の溶出順序は、ＸＩＣによって（データ示さず）Ｈ^＊２Ｌ２ホモ二量体、ＨＨ^＊Ｌ２ ｂｓＡｂ、及びＨ２Ｌ２ホモ二量体と決定され、これは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって決定されたそれらの疎水性の順位と一致した（表３）。したがって、さらに高い塩濃度を使用することによって疎水性相互作用をさらに強化すれば、おそらくこのカラムでのｂｓＡｂ４混合物の分離が改善されると思われる。残念なことに、本発明者らの実験に基づくと、３００ｍＭより高い塩濃度によって大抵脱溶媒和の問題が生じ、ネイティブＭＳの感度が有意に損なわれる。

ＭＳ分析に有利な塩濃度を使用しながらｂｓＡｂ混合物の分離をさらに考査するために、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ カラムを混合モード相互作用に関して評価した。このカラム中の３μｍシリカビーズは、化学的に結合されたスタンドアップ型の単相でコーティングされており、これは、以前の研究に報告されているようにこのカラムの中程度の疎水性におそらく寄与していると思われる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６，前出；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ，前出；Ｐａｖｏｎ ｅｔ ａｌ，前出）。１５０ｍＭ及び３００ｍＭの塩濃度で、４種のｂｓＡｂ混合物の各々を、後続のネイティブＭＳ検出のためにこのカラムで分離した。作成したＢＰＣを図２５の右パネルに示す。予想した通り、ｂｓＡｂ４混合物は、同じ塩濃度で操作したときに、ＢＥＨカラムと比較して改善された分離をＺｅｎｉｘカラムで示した。３種の分子の溶出順序もそれらの相対的疎水性と一致しており、最も疎水性のＨ２Ｌ２ホモ二量体が最後に溶出した。注目すべきは、ｂｓＡｂ４混合物のクロマトグラフ分解能が、１５０ｍＭでの分解能と比較して３００ｍＭ塩濃度でさらに改善されたことである。これは、塩濃度が高くなったことによって疎水性相互作用が促進されたと予想される。加えて、ｂｓＡｂ５混合物は、ＢＥＨカラムと比較してより効率的にＺｅｎｉｘカラムで分割された。これは多分、カラムマトリックスと混合物の成分との疎水性相互作用の大きな相違に起因すると思われる。要約すると、異なる性質を有する２種のＳＥＣカラムの塩濃度を調節することによって、後続のネイティブＭＳ検出に好適な塩濃度で４種のｂｓＡｂ混合物すべてについて良好なクロマトグラフ分離が実現できることが実証される。おそらく本研究で試験されていない他のＳＥＣカラムも、新規な混合モード相互作用を与えることによって、本方法の適用可能性をさらに拡大することができると思われる。

実施例１３．ネイティブＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳによるホモ二量体不純物の定量化。
ＭＳベースのアプローチによる相対的定量化は、多くの場合、各分析物からのＭＳ応答（例えば、イオン化効率及びイオン透過効率）を十分に特性解析して理解することが必要とされる。サイズが類似しているため、ｂｓＡｂ及びホモ二量体は、ネイティブＭＳ分析中に同様のイオン透過効率を呈するはずである。他方では、イオン化効率は、溶出時の溶媒組成と共溶出種の存在の両方の影響を受ける可能性があると思われる。ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法は定組成溶離を利用するので、勾配溶離法（例えば、ＩＥＸ－ＭＳ）に通常見られるような、異なる溶媒組成に起因するイオン化への影響を排除することができる。ホモ二量体不純物の相対的定量化を査定するＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法の性能を評価するために、相対存在量０．１％～１０％の範囲のホモ二量体不純物を含有する一連のｂｓＡｂ２スパイクイン試料を分析用に調製した。ｂｓＡｂ２と対応するホモ二量体間のＭＭ－ＳＥＣ分離を実現するために、７５ｍＭの塩濃度の移動相を使用するＷａｔｅｒｓ ＢＥＨカラムを適用した。ｂｓＡｂ２試料中に存在する各ホモ二量体の相対的定量化を査定するために、ホモ二量体種またはｂｓＡｂ２のいずれかの４つの最も存在量の多い荷電状態のｍ／ｚに基づいてＸＩＣを作成し、ピーク面積を積分し、各ホモ二量体の量の定量化に使用した。図２６に示すように、０．１％～１０％の範囲のホモ二量体不純物の確実な定量化がこの方法によって容易に実現することができる。加えて、０．１％のスパイクインレベルであっても、Ｈ２Ｌ２ホモ二量体種とＨ^＊２Ｌ２ホモ二量体種の両方の高品質なネイティブ質量スペクトルを得ることができるので（図２７、右パネル）、信頼性の高い同定及び定量化につながり得る。

新規ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法を開発し、ｂｓＡｂ試料中のホモ二量体不純物の高感度な検出及び定量化について評価してきた。本発明者らは最初に、異なる塩濃度でのＳＥＣ分離中の抗体分子とカラムマトリックスの混合モード相互作用を調査した。種々のｐＩの８種の別個の抗体を使用して、所定のｐＨ条件下で塩基性分子が酸性分子と比較して強いカラムマトリックスとの静電相互作用を呈し、そのような相互作用は塩濃度を下げることによって強化できることが観察された。他方で、ＳＥＣ分離中の塩濃度を増加させると、抗体とカラムマトリックスの間の静電相互作用を低減させる一方で、疎水性相互作用を促進することができる。これらの混合モード相互作用は、類似した流体力学的体積を有するが表面特性が異なる抗体を分離する、他に例を見ない機会を提供する。異なるカラムの性質を利用して、静電相互作用または疎水性相互作用のいずれかを使用してＭＭ－ＳＥＣ法によって４種のｂｓＡｂ混合物のクロマトグラフ分離を遂行した。それは塩濃度を調節することによって容易に実現された。本発明者らは、実現されたクロマトグラフ分離が、後続のネイティブＭＳ分析による低存在量のホモ二量体不純物の改善された検出を得るのに不可欠であることも実証した。２つのｂｓＡｂの実施例では、０．０１％（ｂｓＡｂ２）及び０．１％（ｂｓＡｂ４）で存在するホモ二量体不純物が、本ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法を使用して成功裡に検出された。知る限りにおいて、この新たな開発は、ｂｓＡｂ試料中のホモ二量体不純物の検出における最も高感度な方法である。最後に、一連のスパイクイン標準物質を使用することによって、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法が、様々なレベルで存在するホモ二量体不純物の確実な定量化を提供することができることを実証した。感度が高いために、０．１％ほど低いレベルであっても信頼性の高い同定及び定量化を得ることができる。要約すると、この新たに開発されたＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ法は、ｂｓＡｂ試料中のホモ二量体不純物の検出及び定量化に対する高感度のアプローチを提供し、よって治療用ｂｓＡｂの開発を支援するために使用することができる。最後に、この方法の用途は、同時に配合される治療薬に存在する抗体の混合物の特性解析など、他の分野にも広げることができると思われる。

Claims (19)

1. 試料中の不純物を定量化するための方法であって、
   追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させること；
   移動相を使用して前記混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記不純物を含む溶出液を得ること；及び
   質量分析計を使用して前記溶出液中の前記不純物の量を定量化すること
   を含む、前記方法。
2. 前記不純物を溶出するために使用される前記移動相が、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせを有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記不純物を溶出するために使用される前記移動相が、酢酸アンモニウムと炭酸水素アンモニウムとの約６００ｍＭ未満の総濃度を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記不純物を溶出するために使用される前記移動相が、約０．２ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に負荷された前記試料の量が、約１０μｇ～約１００μｇである、請求項１に記載の方法。
6. 前記不純物が生成物関連不純物である、請求項１に記載の方法。
7. 前記不純物がホモ二量体である、請求項１に記載の方法。
8. 前記試料が、溶出時に分離される前記不純物及び少なくとも１種の標的タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記標的タンパク質が抗体である、請求項８に記載の方法。
10. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項９に記載の方法。
11. 前記標的タンパク質が治療用抗体である、請求項８に記載の方法。
12. 前記質量分析計が前記クロマトグラフシステムに連結されている、請求項１に記載の方法。
13. 前記追加の官能性が疎水性相互作用官能性である、請求項１に記載の方法。
14. 前記追加の官能性が電荷－電荷相互作用官能性である、請求項１に記載の方法。
15. 前記質量分析計がネイティブ質量分析計である、請求項１に記載の方法。
16. 試料中の不純物を検出するための方法であって、
    追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させること；
    移動相を使用して前記混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記不純物を含む溶出液を得ること；及び
    質量分析計を使用して前記溶出液中の前記不純物を検出すること
    を含む、前記方法。
17. 試料中の標的タンパク質を定量化するための方法であって、
    追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させること；
    移動相を使用して前記混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記標的タンパク質を含む溶出液を得ること；及び
    質量分析計を使用して前記溶出液中の前記標的タンパク質を定量化すること
    を含む、前記方法。
18. 試料中の標的タンパク質を検出するための方法であって、
    追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフシステムに前記試料を接触させること；
    移動相を使用して前記混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記標的タンパク質を含む溶出液を得ること；及び
    質量分析計を使用して前記溶出液中の前記標的タンパク質を検出すること
    を含む、前記方法。
19. 追加の官能性を有する混合モードサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフカラムであって、移動相と標的タンパク質を有する試料とを受け入れることが可能である、前記カラム、及び
    前記標的タンパク質を検出するための、前記クロマトグラフカラムに連結された質量分析計
    を含む、混合モードクロマトグラフィーシステム。

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