JP2022517821A - プロテインａクロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化質量分析計 - Google Patents

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Abstract

プロテインＡクロマトグラフィー樹脂と非変性条件下で運転されるエレクトロスプレーイオン化質量分析計とを有するクロマトグラフィーシステムを使用してタンパク質をキャラクタリゼーションするための方法及びシステムが提供される。TIFF2022517821000003.tif85131

Description

分野
本発明は、概して、プロテインＡクロマトグラフィー及びエレクトロスプレー質量分析計を使用して少なくとも１種のタンパク質をキャラクタリゼーションするための方法及びシステムに関する。
背景
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のための重要な薬品として台頭してきており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントのうちの１つである。
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たさなければならない。バイオ医薬品で見られるプロセス関連の不純物と製品関連の不純物が複数存在する。これらの不純物は、活性、有効性、及び安全性に関して、目的の製品の特性に匹敵する特性を有していない。一例は、治療用途に関連するタンパク質の特性に大きく影響を及ぼすタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。これらの不純物は、製品と比較して異なる作用機序及び潜在的な毒性または免疫原性を示す可能性がある。さらに、それらは製品よりも低い安定性を有する場合があり、これは凝集及び免疫原性の高いリスクになる。最近の進歩にもかかわらず、そのような不純物の定量的評価のための純度試験方法を開発する課題は残ったままである。加えて、二重特異性抗体の分析方法開発における重要な課題は、方法が主要な目的種に対して２％以下のレベルで存在する不純物を正確かつ再現性よく検出しなければならないことである。したがって、薬品の開発及び製造の様々な段階中に、このような不純物を監視及びキャラクタリゼーションすることが重要である。生物学的機能のための不純物の重要性にもかかわらず、大スケールのこれらの研究は、適切な方法がないことにより妨げられてきた。
純度試験のための分析方法は、望まれる生成物及び不純物を検出及び定量するのに十分な精度及び感度を示さなければならない。抗体中のＰＴＭ及び二重特異性抗体中のホモ二量体などの不純物の評価は、そのような不純物と目的生成物との間の構造的及び物理化学的特性が類似していることから困難な場合がある。そのような不純物の直接分析は、試験に十分な多い量で目的生成物を単離することを要し、これは望ましくなく、選択された事例でのみ可能であった。
したがって、タンパク質ベースのバイオ医薬品中のタンパク質－不純物及び／または目的生成物を同定及び定量するための方法及び／またはシステムが当該技術分野で長年必要とされている。
概要
タンパク質ベースのバイオ医薬品の開発、製造、及び販売の成長は、バイオ医薬品中の医薬品有効成分及び不純物の存在をキャラクタリゼーションする需要の増加をもたらした。
本明細書に開示の例示的な実施形態は、プロテインＡクロマトグラフィー及びエレクトロスプレー質量分析計を使用して少なくとも１種のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法及びシステムを提供することによって、前述した要求を満たす。
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中のタンパク質を同定するための方法を提供する。例示的な一実施形態では、タンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を同定する工程、を含む。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を同定する工程、を含むことができ、クロマトグラフィーシステムはエレクトロスプレーイオン化質量分析計と連結されている。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びネイティブエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を同定する工程、を含むことができ、クロマトグラフィーシステムはネイティブエレクトロスプレーイオン化質量分析計と連結されている。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに約１０μｇ～約１００μｇのサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計と適合性を有することができる移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含むことができ、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択することができる。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、追加の機能を備えたプロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解生成物であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体のバリアントであってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は不純物である。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は二重特異性抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は非変性条件下で運転することができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計をクロマトグラフィーシステムに連結するために少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用して、クロマトグラフィーシステムをエレクトロスプレーイオン化質量分析計と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用してクロマトグラフィーシステムを紫外線検出器と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用してクロマトグラフィーシステムを紫外線検出器と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して溶離液を得る工程、を含むことができ、前記溶離液は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入することができ、エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流量は約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分である。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を同定するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して溶離液を得る工程、を含むことができ、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の洗浄から得られる溶離液はエレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧は約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶである。
この実施形態の一態様では、サンプル中のタンパク質を同定するための方法は、サンプルとの接触を含むことができ、サンプルは少なくとも２種のタンパク質を含むことができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のタンパク質を同定するための方法は、サンプルとの接触を含むことができ、サンプルは、過酸化水素、酸化、熱、紫外光、低温白色光、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される条件に供され得る。
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中のタンパク質を定量するための方法を提供する。例示的な一実施形態では、タンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を定量する工程、を含む。
この実施形態の一態様では、サンプル中のタンパク質を定量するための方法は、サンプル中のタンパク質の相対存在量を定量することもできる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を定量する工程、を含むことができ、クロマトグラフィーシステムは、エレクトロスプレーイオン化質量分析計と連結されている。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに約１０μｇ～約１００μｇのサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計と適合性を有することができる移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含むことができ、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択することができる。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄することを含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用してプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、追加の機能を備えたプロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解生成物であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体のバリアントであってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は不純物であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡ樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、タンパク質は二重特異性抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は非変性条件下で運転することができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、質量分析計を使用してタンパク質を同定する工程を含むことができ、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計をクロマトグラフィーシステムに連結するための少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用して、クロマトグラフィーシステムをエレクトロスプレーイオン化質量分析計と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用してクロマトグラフィーシステムを紫外線検出器と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、少なくとも２つの経路を有するスプリッターを使用してクロマトグラフィーシステムを紫外線検出器と流体接続する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して溶離液を得る工程、を含むことができ、前記溶離液は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入することができ、エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流量は、約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分とすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のサンプル中のタンパク質を定量するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して溶離液を得る工程、を含むことができ、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の洗浄から得られる溶離液はエレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧は約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶとすることができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のタンパク質を定量するための方法は、サンプルとの接触を含むことができ、サンプルは少なくとも２種のタンパク質を含むことができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中のタンパク質を定量するための方法は、サンプルとの接触を含むことができ、サンプルは、脱グルコシル化、酸化、熱、紫外光、低温白色光、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される条件に供され得る。
本開示は、少なくとも一部において、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムとエレクトロスプレーイオン化質量分析計とを含むシステムを提供する。
例示的な一実施形態では、システムは、クロマトグラフィーカラムにオンラインで連結可能なエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含み得る。
この実施形態の一態様では、システムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、クロマトグラフィーカラムは、移動相とタンパク質を含むサンプルとを受け入れることができる。
この実施形態の一態様では、システムは、スプリッターを使用して紫外線検出器に連結することが可能なクロマトグラフィーカラムを含み得る。
この実施形態の一態様では、システムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器に連結することが可能なクロマトグラフィーカラムを含み得る。
この実施形態の一態様では、システムは、非変性条件下で運転可能なエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含み得る。
この実施形態の一態様では、システムは、非変性条件下で運転可能なナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含み得る。
この実施形態の一態様では、システムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムとエレクトロスプレーイオン化質量分析計とを含むことができ、システムはタンパク質を同定することができる。
この実施形態の一態様では、システムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムとエレクトロスプレーイオン化質量分析計とを含むことができ、システムは、モノクローナル抗体バリアントのプロテインＡ親和性をランク付けすることができる。
この実施形態の一態様では、システムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムとエレクトロスプレーイオン化質量分析計とを含むことができ、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択される移動相と適合性を有することができる。
この実施形態の一態様では、システムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、クロマトグラフィーカラムは、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用して洗浄することができる。
この実施形態の一態様では、システムは、モノクローナル抗体バリアントのプロテインＡ親和性をランク付けすることができる。
通常及びネイティブのエレクトロスプレーイオン化質量分析から得られたスペクトルを示す。 例示的な一実施形態によるプロテインＡクロマトグラフィー－ネイティブエレクトロスプレー質量分析システムを示す。 例示的な一実施形態によるプロテインＡクロマトグラフィー－ネイティブナノエレクトロスプレー質量分析システムを示す。
詳細な説明
組換えにより製造された製品は、製造及び保管中に生成されるサイズバリアント（例えば凝集体、断片、分解産物など）を含み得る。凝集体及び断片は免疫原性及び効力に影響を及ぼす可能性があるため、これらのレベルは、典型的には、ロットの出荷、安定性、及びキャラクタリゼーション中に監視される（Ａｍｙ Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，８ ＴＨＥ ＡＡＰＳ ＪＯＵＲＮＡＬ（２００６））。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、これらの分子の開発が長く多大な努力を要するものであるものの、バイオ医薬品の最も重要な分類の１つとして台頭してきている。プロセスの理解を深め、且つプロセス改善のための機構的な洞察を提供する高感度で高スループットの分析方法は、高品質の治療用ｍＡｂの制御された製造及び精製のためにバイオ製薬業界で依然として重要である。
プロテインＡクロマトグラフィーは、治療用ｍＡｂ精製における最も重要なステップの１つである。二重特異性生成物と単一特異性不純物との間の異なるプロテインＡ結合親和性に依存する戦略を使用した二重特異性ｍＡｂの精製についてはなおさらである（Ａｎｄｒｅｗ Ｄ．Ｔｕｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｕｐｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｖｉｄｉｔｙ，８ ＭＡＢＳ ８２８－８３８（２０１６））。しかしながら、プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの移動相を質量分析計に直接注入することはできず、移動相の変更を含む追加の工程が必要とされる。
既存の方法の限界を踏まえ、インタクトレベルでの修飾によって誘導されるｍＡｂバリアントとのプロテインＡ結合相互作用の減衰を評価するために、親和性に基づくクロマトグラフィーをネイティブ質量分析と組み合わせた迅速オンライン手法が開発された。この方法は、その後、治療用ｍＡｂ及び二重特異性ｍＡｂのプロテインＡ精製に対する様々な修飾の影響を調査するために使用された。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法及び材料を実施または試験において使用できるものの、以降では特定の方法及び材料について説明する。言及される全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。「約」及び「おおよそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変化形が可能なように理解されるべきである。範囲が示されている場合には終点が含まれる。
バイオ医薬品は、高レベルの有効性、純度、及び低レベルの構造的不均一性を示すことが必要とされる。構造の不均一性は、多くの場合、薬品の生物活性及び有効性に影響を及ぼす。そのため、治療用タンパク質及び／または不純物のキャラクタリゼーション及び定量は、医薬品開発において重要である。タンパク質の構造的不均一性は、翻訳後修飾、ならびに製造及び保管条件中の固有の化学的修飾に起因する場合がある。バイオテクノロジー産業において製造されるタンパク質では、標的タンパク質を精製することと、最終製品の品質を正確に把握することの両方のために、補完的な分離技術が必要とされる。製品の複雑さは、単純な一次元分離戦略の使用を排除する。
本明細書において、「タンパク質」という用語には、共有結合しているアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーが含まれる。タンパク質は、当該技術分野で「ポリペプチド」として一般的に知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの合成による天然に存在しない類似体、関連する天然に存在する構造バリアント、及びそれらの合成による天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば自動化されたポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成方法が当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、バイオ治療用タンパク質、研究または治療で使用される組み換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれも含まれ得る。別の例示的な態様では、タンパク質には、抗体断片、ナノボディ、組み換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが含まれ得る。タンパク質は、昆虫バッキュロウイルス系、酵母系（例えばピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳動物系（例えばＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組み換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質及びその製造に関して説明されているレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照のこと。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾物、付加物、及び他の共有結合された部位を含む。これらの修飾物、付加物、及び部位には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類できることから、タンパク質には、球状タンパク質や繊維状タンパク質などの単純なタンパク質；核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質；ならびに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質が含まれ得る。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはこれらの組み合わせであってもよい。
本明細書で使用される「抗体」という用語には、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ．ｓｕｂ．Ｌ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。様々な例示的な実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、あるいは天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合断片も含まれる。本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」や抗体の「抗原結合断片」などの用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解または組み換え遺伝子工学技術（抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む）などの任意の適切な標準的手法を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知である、及び／または例えば販売元のＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、例えば１つ以上の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を形成するため、アミノ酸を修飾、追加、もしくは削除するなどのために化学的に、または分子生物学手法を使用することによって、配列決定及び操作をすることができる。
本明細書で使用される「抗体断片」には、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクト抗体の一部が含まれる。抗体断片の例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組み換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって製造することができる。例えば、抗体断片は、インタクト抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に製造することができる、及び／またはこれは部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み換えにより製造することができる。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成により製造することができる。抗体断片は、任意選択的には一本鎖抗体断片を含んでいてもよい。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、例えばスルフィド結合によって一体に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的には多分子複合体を含んでいてもよい。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能なまたは公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して作製することができる。
本明細書で使用される「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、２つ以上のタンパク質の一部または全部を含み、そのうちの１つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、それらのネイティブ状態では融合されない。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部位に結合している受容体の１つ以上の細胞外ドメインの１つまたは複数を含み、これは、いくつかの実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインの後にヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、単一または複数のリガンドに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えばＩＬ－１トラップ（例えばｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９２７，００４を参照のこと、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはＶＥＧＦトラップ（例えばｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；例えば配列番号１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，０８７，４１１及び７，２７９，１５９を参照のこと、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）などのトラップである。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は不純物であってもよい。いくつかの特定の例示的な実施形態では、タンパク質は製品に関連する不純物であってもよい。
本明細書で使用される「不純物」という用語には、タンパク質バイオ医薬品中に存在する任意の望ましくないタンパク質が含まれ得る。不純物には、プロセス及び製品に関連する不純物が含まれ得る。不純物はさらに、既知の構造のもの、部分的にキャラクタリゼーションされたもの、または同定されていないものであってもよい。プロセスに関連する不純物は、製造プロセスに由来する場合があり、細胞基質由来、細胞培養由来、及び下流由来の３つの主要なカテゴリーが含まれ得る。細胞基質由来の不純物としては、限定するものではないが、宿主生物及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）に由来するタンパク質が挙げられる。細胞培養由来の不純物としては、限定するものではないが、誘導物質、抗生物質、血清、及びその他の培地成分が挙げられる。下流由来の不純物としては、限定するものではないが、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば臭化シアン、グアニジン、酸化剤、及び還元剤）、無機塩（例えば重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えばモノクローナル抗体）、及びその他の浸出物が挙げられる。製品に関連する不純物（例えば前駆体、特定の分解生成物）は、活性、有効性、及び安全性に関して望まれる製品の特性に匹敵する特性を有さない製造及び／または保管中に生じる分子バリアントである場合がある。そのようなバリアントは、修飾のタイプを特定するために、分離及びキャラクタリゼーションにかなりの労力を要する場合がある。製品に関連する不純物には、切断された形態、修飾された形態、及び凝集物が含まれる。切断された形態は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾された形態には、限定するものではないが、脱アミド化、異性化、ミスマッチのＳ－Ｓ結合、酸化、または改変された複合体形態（例えばグリコシル化、リン酸化）が含まれる。修飾された形態には、翻訳後修飾された任意の形態も含まれ得る。凝集物には、目的製品の二量体及びより高次の多量体が含まれる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、翻訳後修飾されたタンパク質であってもよい。いくつかの特定の例示的な実施形態では、翻訳後修飾されたタンパク質は、設計によって導入されてもよく、あるいはストレッサーによって誘導されてもよい。ストレッサーの非限定的な例としては、過酸化水素、酸化、熱、紫外光、低温白色光、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される一般用語「翻訳後修飾」または「ＰＴＭ」は、それらのリボソーム合成中（同時翻訳修飾）または後（翻訳後修飾）のいずれかでポリペプチドが受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは、通常、特定の酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で生じる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は常にタンパク質の構造または機能のいくつかの特徴に影響を与える（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４） ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、限定するものではないが、切断、Ｎ－末端伸長、タンパク質分解、Ｎ－末端のアシル化、ビオチン化（リシン残基のビオチンによるアシル化）、Ｃ－末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常はタンパク質のＮ－末端におけるアセチル基の付加）、アルキル化（通常はリシンまたはアルギニン残基におけるアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有結合による架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリシンヒドロキシル化及びカルボキシ末端アミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ここでのビタミンＫは、γ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌｕ残基）を形成するグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子である）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、またはスレオニンのいずれかへグリコシル基を付加させて糖タンパク質を得る）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポエート官能基の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシン生合成の場合のような補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部位の付加）、リン酸化（リン酸基の付加、通常はセリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンへの付加）、及び硫酸化（硫酸基の付加、通常はチロシン残基への付加）が挙げられる。アミノ酸の化学的性質を変える翻訳後修飾としては、限定するものではないが、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられる。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、限定するものではないが、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質分解切断（ペプチド結合におけるタンパク質の切断）が挙げられる。特定の翻訳後修飾には、ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン活性化遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン様修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの付加が含まれる。ＵｎｉＰｒｏｔによって収集されたＰＴＭのより詳細な統制されている用語については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＲｅｓｏｕｒｃｅＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＤＲＳ－ＤＲＯＳＯＭＹＣＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ－ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ ＭＥＬＡＮＯＧＡＳＴＥＲ （ＦＲＵＩＴ ＦＬＹ）－ＤＲＳ ＧＥＮＥ＆ＰＲＯＴＥＩＮ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最終訪問日２０１９年１月１５日）を参照のこと。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂と質量分析計とを含むシステムを使用して同定することができる。
本明細書で使用される「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学混合物を、液体固定相または固体固定相の周囲または上を流れる際の化学物質の異なる分布の結果として複数の成分に分離することができるプロセスを指す。
本明細書で使用される「プロテインＡ」という用語は、その天然供給源から回収されたプロテインＡ、合成的に（例えばペプチド合成または組換え技術によって）製造されたプロテインＡ、及びＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそのバリアントを包含する。プロテインＡの市販品製造業者の非限定的な例としては、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、及びＦｅｒｍａｔｅｃｈが挙げられる。
プロテインＡは、固相に固定化されている。「固相」とは、プロテインＡが付着できる非水系マトリックスを意味する。本明細書の対象の固相は、ガラスまたはシリカ表面を含み得る。固相は、精製カラムであってもよく、あるいは離散粒子の不連続相であってもよい。
本明細書で使用される「質量分析計」という用語には、特定の分子種を識別し、それらの正確な質量を測定することができる装置が含まれる。この用語は、検出及び／またはキャラクタリゼーションのためにポリペプチドまたはペプチドを中で溶離させることができる任意の分子検出器を含むことを意図している。質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの主要部分を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを形成することである。分析対象の原子、分子、またはクラスターは、気相に移され、同時にイオン化することができる（エレクトロスプレーイオン化と同様）。イオン源の選択は用途に大きく依存する。
いくつかの実施形態では、質量分析計はエレクトロスプレー質量分析計である。
本明細書で使用される「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液中の陽イオンまたは陰イオンのいずれかが、溶液を含むエレクトロスプレーニードルチップと対極との間に電位差を加えることによって得られる高度に帯電した液滴の流れの大気圧における形成及び脱溶媒和によって気相に移動する、スプレーイオン化のプロセスを指す。溶液中の電解質イオンからの気相イオンの生成には、通常３つの主要な段階が存在する。これらは、（ａ）ＥＳ注入チップにおける帯電した液滴の生成；（ｂ）気相イオンを生成可能な小さい高度に帯電した液滴の生成をもたらす、溶媒蒸発及び繰り返しの液滴崩壊による帯電液滴の縮小；ならびに（ｃ）気相イオンが非常に小さくかつ高度に帯電した液滴から生成されるメカニズム；である。段階（ａ）～（ｃ）は、通常装置の大気圧領域で生じる。
本明細書で使用される「エレクトロスプレー注入セットアップ」という用語は、タンパク質の質量分析に使用される質量分析計との適合性を有するエレクトロスプレーイオン化システムを指す。エレクトロスプレーイオン化では、エレクトロスプレーニードルは、分光計の入口オリフィスの近くに配置されたそのオリフィスを有する。目的のタンパク質を含むサンプルは、シリンジニードルからポンプで送ることができる。シリンジニードルのオリフィスと質量分析計につながるオリフィスとの間の電位が、溶液のスプレー（「エレクトロスプレー」）を形成する。エレクトロスプレーは大気圧で行うことができ、高度に帯電した溶液の液滴を供給する。エレクトロスプレー注入セットアップは、エレクトロスプレーエミッター、噴霧ガス、及び／またはＥＳＩ電源を含み得る。セットアップは、任意選択的には、サンプルの吸引、サンプルの分配、サンプルの供給、及び／またはサンプルの噴霧の実行が自動化されていてもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であってもよい。
本明細書で使用される「ナノエレクトロスプレー」または「ナノスプレー」という用語は、非常に低い溶媒流量、典型的には毎分数百ナノリットル以下のサンプル溶液におけるエレクトロスプレーイオン化を指し、多くの場合、外的な溶媒供給を使用しない。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入セットアップは、静的ナノエレクトロスプレーエミッターまたは動的ナノエレクトロスプレーエミッターを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッターは、長期間にわたって少量のサンプル（分析物）溶液体積の連続分析を行う。ダイナミックナノエレクトロスプレーエミッターは、質量分析計による分析の前に、キャピラリーカラムと溶媒供給システムを使用して混合物のクロマトグラフィー分離を行う。
明細書で使用される「質量分析器」という用語には、種、すなわち原子、分子、またはクラスターをそれらの質量に応じて分離できる装置が含まれる。高速タンパク質配列解析に使用可能な質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクター型、四重極質量フィルター型（Ｑ）、四重極イオントラップ型（ＱＩＴ）、オービトラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴＩＣＲ）、及び加速器質量分析法（ＡＭＳ）である。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析は、非変性条件下で実施することができる。
本明細書で使用される「非変性条件」または「ネイティブＭＳ」または「ネイティブＥＳＩ－ＭＳ」という用語には、分析物中の非共有結合性の相互作用を保存する条件下で質量分析を行うことが含まれ得る。ネイティブＭＳの詳細なレビューについては、レビュー：Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅｔｏｓａ， Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ１１７６－１１９２（２０１５）を参照のこと。ネイティブＥＳＩと通常のＥＳＩとの間の相違のいくつかを表１及び図１に示す（Ｈａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，５８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１２－１０２０（２０１３））。
Figure 2022517821000002
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であってもよい。
本明細書で使用される「タンデム質量分析」という用語には、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによってサンプル分子に関する構造情報が得られる技術が含まれる。前提条件は、サンプル分子を気相に移して完全なままイオン化できること、及び最初の質量選択段階の後に何等かの予測可能かつ制御可能な形で壊れるようにこれらを誘導できることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、有意義な情報を取得できるか、フラグメントイオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択及び分離してフラグメント化し、一次フラグメントイオン（ＭＳ３）を分離してこれをフラグメント化し、二次フラグメントイオン（ＭＳ４）を分離するなどして行うことができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせを用いて首尾よく行われてきた。特定の用途のために組み合わせられる分析器が何であるかは、感度、選択性、及び速度などの多くの様々な要因だけでなく、サイズ、コスト、及び有効性によっても決定される。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、空間的タンデムと時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析器が空間的にまたは空間的タンデム分析器と連結されているハイブリッドも存在する。
例示的な実施形態
本明細書に開示の複数の実施形態は、サンプル中のタンパク質の迅速なキャラクタリゼーションのための組成物、方法、及びシステムを提供する。
本明細書において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、及びｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、「包含する（それぞれｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
本開示は、少なくとも一部において、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を同定する工程、を含む、サンプル中のタンパク質を同定するための方法を提供する。
本開示は、少なくとも一部において、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を定量する工程、を含む、サンプル中のタンパク質を定量するための方法を提供する。
本開示は、少なくとも一部において、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにタンパク質を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄してタンパク質を含む溶離液を得る工程、及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中のタンパク質を定量する工程、を含む、サンプル中のタンパク質の相対存在量を定量するための方法を提供する。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質はモノクローナル抗体であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は治療用抗体であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は免疫グロブリンタンパク質であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は二重特異性抗体であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体の消化時に形成される抗体フラグメントであってもよい。
一実施形態では、タンパク質は翻訳後修飾タンパク質であってもよい。
一実施形態では、タンパク質は抗体バリアントであってもよい。
さらに別の例示的な実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬品中で見られる不純物であってもよい。
別の例示的な実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬品の製造中に見られる不純物であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は抗体の消化産物であってもよい。消化産物は、加水分解剤によって形成することができる。加水分解剤には、酵素的消化または非酵素的消化を使用して消化を行う薬剤が含まれ得る。加水分解剤は、酵素的消化を使用して消化を行うことができる薬剤であってもよく、これにはトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼが含まれ得る。加水分解剤は、非酵素的消化を使用して消化を行うことができる薬剤であってもよく、これには、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒の使用が含まれ得る。消化産物は、製品に関連する不純物である場合がある。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。
例示的な一実施形態では、タンパク質は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有し得る。
例示的な一実施形態では、サンプル中のタンパク質の数は少なくとも２種であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムにロードされるサンプル中のタンパク質の量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲とすることができる。例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーシステムにロードされるサンプル中のタンパク質の量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質を溶離するために使用される移動相は、質量分析計と適合性を有することができる移動相とすることができる。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、タンパク質を溶離するために使用される移動相は、揮発性塩を含み得る移動相とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせであってもよい。
例示的な一実施形態では、移動相の総濃度は、最大約６００ｍＭの範囲とすることができる。例示的な一実施形態では、移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１１００ｍＭ、１２０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、クロマトグラフィーシステム中で約０．１ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。例示的な一実施形態では、移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計における流量は、約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶの噴霧電圧を有し得る。
いくつかの例示的な実施形態では、同定には、タンパク質配列決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の同定、または適合分析、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。
例示的な一実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はタンデム質量分析計であってもよい。
別の例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計はナノエレクトロスプレー質量分析計であってもよい。
方法は、前述したタンパク質、断片、不純物、及びカラムのいずれかに限定されず、同定または定量するための方法は任意の適切な手段によって行い得ることが理解される。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、移動相を用いて洗浄して溶離液を得ることが可能なクロマトグラフィーカラム１１０と、クロマトグラフィーカラム１１０に連結された質量分析計１２０とを含むシステムを提供する（図２を参照）。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂１３０を含み得る。
図２は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂１５０を含むクロマトグラフィーカラムを示しており、このクロマトグラフィーカラムは、非変性条件下で運転可能なエレクトロスプレーイオン化質量分析計１２０に流体的に接続または連結されている。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、タンパク質を含むサンプルと接触可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０にロードすることができるサンプルの量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲とすることができる。例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０にロードできるサンプルの量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は移動相で洗浄可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、揮発性塩を含む移動相で洗浄可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせであってもよい。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０を洗浄するために使用できる移動相の総濃度は、最大約６００ｍＭの範囲とすることができる。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０を洗浄するために使用できる移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１１００ｍＭ、１２０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであってもよい。
別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相は、０．１ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は質量分析計１２０と連結可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、質量分析計１２０はナノスプレーを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はタンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はエレクトロスプレータンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はナノエレクトロスプレータンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はネイティブエレクトロスプレータンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はネイティブナノエレクトロスプレータンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、システムは、タンパク質を同定１４０及び／または定量１５０可能にすることができる（図２に図示の通り）。タンパク質としては、抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体バリアント、翻訳後修飾抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
さらに別の例示的な実施形態では、システムは、バイオ医薬品で見られる不純物である可能性があるタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０可能にすることができる。
別の例示的な実施形態では、システムは、バイオ医薬品の製造中に見られる不純物である可能性があるタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、システムは、約４．５から約９．０の範囲のｐＩを有し得るタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、システムは、製品に関連する不純物の可能性があるタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、システムは、２種以上のタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０するために使用することができる。例示的な一実施形態では、システムは、２種のタンパク質を同定１４０及び／または定量１５０するために使用することができる。
システムの別の例示的な実施形態が図３に示されている。ＵＶ／ＭＳ二重検出を有効にするために、少なくとも３つの経路を有するポストカラムスプリッター１６０が使用される。少量のフラクションをＭＳ１２０に向けることができる一方で、多量のフラクションがＵＶ検出器１７０に送られる。検出はほぼ同じ保持時間を共有する。ＵＶ検出器からのフラクションは、サンプル回収のために集めることができる。
システムは、前述したタンパク質、不純物、移動相、質量分析計、またはクロマトグラフィーカラムのいずれかに限定されないことが理解される。
本明細書で示される方法の工程の数字及び／または文字による連続したラベル付けは、方法またはその任意の実施形態を特定の示された順序に限定することを意図するものではない。
特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物が、明細書全体にわたって引用されている。これらの引用された参考文献のそれぞれは、その全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、本開示をより詳細に説明するために示されている以降の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。これらは説明を目的としており、開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
例示的な実施は、ＵＶ検出器及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ，ＵＳＡ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して行うことができる。質量分析計は正の分解能モードで運転することができる。
サンプルの調製。サンプルｍＡｂは、０．００１％～０．０２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で２４時間強制酸化を受けることができる。
システム。モノクローナル及び二重特異性抗体バリアントのオンラインのプロテインＡへの親和性に基づく分離は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＡｂＰａｃプロテインＡカラム（４×３５ｍｍ）を使用して行うことができる。０．４ｍＬ／分の流量で酢酸アンモニウムに基づく移動相のｐＨ７．５から３．０までのグラジエントを使用して、異なって結合される種を溶離した。分析フロースプリッター（約１：４００）を使用して、質量分析計へのポストカラム流量を約１μＬ／分まで減らすことができる。Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）イオン源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲ質量分析計をデータ取得のために使用することができる。
実施例１．
抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）によって決定された異なるｍＡｂバリアントの保持時間は、異なる修飾の結果としてのｍＡｂバリアントのプロテインＡへの親和性をランク付けするために利用することができる。
実施例２．
この方法は、プロテインＡ親和性の連続的な減少を示す二重特異性抗体（ＢｓＡｂ １）と２つの対応する単一特異性ｍＡｂ（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）との混合物にも適用することができる。
実施例３．
さらに、異なる処理（例えば、脱グリコシル化、強制酸化、及び様々なストレス条件）後のｍＡｂサンプルを、この新規な技術プラットフォームで試験することができる。

Claims (25)

  1. プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、タンパク質を含むサンプルを接触させる工程；
    移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記タンパク質を含む溶離液を得る工程；及び
    非変性条件下で運転されるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中の前記タンパク質を同定する工程
    を含む、少なくとも１種のタンパク質を同定するための方法。
  2. 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムにオンラインで連結される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計がナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計を前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムに連結するために、少なくとも２つの経路を有するスプリッターが使用される、請求項１に記載の方法。
  5. 紫外線検出器を前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムに連結するために、少なくとも２つの経路を有するスプリッターが使用される、請求項１に記載の方法。
  6. サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が酢酸アンモニウムを含む、請求項１に記載の方法。
  7. サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が揮発性塩を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が約０．２ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記クロマトグラフィーシステムに接触させる前記タンパク質を含む前記サンプルの量が約１０μｇ～約１００μｇである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の洗浄から得られる前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、前記エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流量が約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分である、請求項１に記載の方法。
  11. プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の洗浄から得られる前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧が約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記タンパク質が、製品に関連する不純物である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記タンパク質が二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記タンパク質が不純物である、請求項１に記載の方法。
  16. 前記タンパク質がモノクローナル抗体バリアントである、請求項１に記載の方法。
  17. 前記サンプルが少なくとも２種のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記タンパク質が翻訳後修飾を有する、請求項１に記載の方法。
  19. 前記サンプルが、脱グリコシル化、酸化、熱、紫外光、低温白色光、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される条件に供される、請求項１に記載の方法。
  20. プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムであって、移動相とタンパク質を含むサンプルとを受け入れることが可能な前記クロマトグラフィーカラム；及び
    前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで連結することが可能であり、かつ非変性条件下で運転可能なエレクトロスプレーイオン化質量分析計
    を含む、システム。
  21. 前記クロマトグラフィーカラムが、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器にさらに連結可能である、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計がナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項２０に記載のシステム。
  23. 前記タンパク質を同定可能である、請求項２０に記載のシステム。
  24. モノクローナル抗体バリアントのプロテインＡ親和性をランク付けすることができる、請求項２０に記載のシステム。
  25. プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、タンパク質を含むサンプルを接触させる工程；
    移動相を使用して前記プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記タンパク質を含む溶離液を得る工程；及び
    非変性条件下で運転されるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して前記溶離液中の前記タンパク質を同定する工程
    を含む、少なくとも１種のタンパク質をキャラクタリゼーションするための方法。
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