CN113164522A - 用于制备血小板释出物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一定量的一种或更多种水溶性钙盐和一定量的玻璃颗粒用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的用途,其中玻璃颗粒的所述量为0.010g至0.60g/ml所述样品,并且所述一种或更多种水溶性钙盐的所述量为1.0μmol至12.0μmol/ml所述样品。还公开了用于制备血小板释出物的***和方法,以及由此获得的血小板释出物及其在体外和体内应用中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于制备血小板来源产物的***和方法,以及血小板来源产物用于制备血小板来源制品的用途。
背景技术
在专业实验室中,细胞和/或组织在生长培养基中培养。生长培养基专门设计成支持细胞生长,并且除营养物和矿物质之外还包含(生物)分子(例如激素、生长因子和附着因子)的复杂混合物。历史上,作为这些(生物)分子以及许多低分子量营养物的提供者,血清并且尤其是胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)一直是生长培养基的重要组分。用于产生蛋白质药物的工业规模哺乳动物细胞培养的出现极大地提高了血清消耗。估计每年从多于一百万头胎牛中分离约800 000升FBS,以满足全球细胞和/或组织培养中对血清的需求。
再生医学(包括细胞治疗和工程化组织移植)是新兴的医学领域。在再生医学中,人细胞或整个组织再生或被替代以恢复或建立正常功能。随着这些医学方面的进步,需要越来越集中于开发用于人细胞(缺乏动物来源的产物)的安全且无污染的培养方法,因为动物来源的产物可引起针对外源因素的免疫反应以及跨物种病原体感染。
在寻找替代传统使用的FBS作为细胞培养基中的生长补充剂时,最近的研究集中于可通过裂解从血小板浓缩物产生的血小板裂解物(platelet lysate,PL)或可通过血小板活化从血小板浓缩物产生的血小板释出物(platelet releasate,PR)的应用。已提出在用于人治疗的细胞的离体培养中,将PL作为FBS的可行替代物。
目前用于制备血小板来源产物的方法分为两种主要类别:(i)冻融(用于制备PL)和(ii)血小板活化(用于制备PR)。在前一种(i)方法中,富血小板组合物(platelet-richcomposition)反复进行冻融循环。这有效地裂解了血小板,但是没有去除纤维蛋白原,导致当在培养基中原样使用时凝固(coagulation)。目前这些类型的解决方案需要添加肝素以防止凝固,但是肝素本身来源于非人动物,这抵消了使用PL优于FBS的优势。此外,该方法耗费时间且劳动密集。血小板活化(ii)方法使用血小板活化剂,如凝血酶。然而,目前凝血酶的使用未被批准用于人的下游临床使用。在大多数情况下,凝血酶在本质上也是非人(例如牛)的。或者,血小板可通过添加至少15μmol/ml钙盐来活化。然而,这些在补充有经常在全球血库中使用的血小板添加剂溶液的富血小板组合物的情况下将引起磷酸盐沉淀。组织培养(一般)在恒定pH 7.4下进行,该恒定pH由湿润且温度受控的培养箱中的碳酸盐缓冲体系维持。在该pH下,钙和磷酸盐的组合理论溶解度为1.7mM。这意味着当两种离子(Ca2+)和(HPO4 2-)在pH为7.4的溶液中以≥1.7mM的浓度存在时,很可能发生沉淀。另外,在包含碳酸根离子的溶液中沉淀也可能发生得更快。在现有技术中,用于制备富血小板释出物的方法,Ca2+被用于活化血小板,并且在典型的富血小板释出物分数10%(体积/体积)时所使用的浓度经常导致最终培养基中Ca2+的最终浓度高于1.7mM。此外,当从储存在现代血小板添加剂溶液中的血小板浓缩物中制备释出物时,HPO4 2-浓度也将超过该溶解度标准,并且将发生沉淀。这样的钙复合物沉淀使培养基中培养的细胞应激,所述培养基包含通过使用至少15μmol/ml钙盐的血小板活化(ii)方法获得的PR。
另外,期望限制细胞培养基中离子钙的量,因为公知钙离子在信号传导途径中发挥功能,并且因此可在几乎所有哺乳动物细胞中影响多种细胞功能。钙还充当许多酶的关键辅因子并参与细胞分泌。因此,胞外Ca2+浓度受到严格调控。人血浆中的总钙浓度的正常范围为2.2至2.6mM。该元素与多种血浆蛋白结合,从而将游离离子Ca2+浓度严格控制为1.1至1.4mM。这些水平在这一严格窗口内积极地维持,并且很少随时间波动超过5%(Atchison,D.K.and Beierwltes,W.H.European Journal of Physiology,2013;465(1):59-69)。在人生理学中Ca2+浓度的偏离导致低钙血症或高钙血症和并发疾病。因此,组织培养基中的Ca2+浓度同样得到理想地控制。例如,软骨细胞的离体培养需要小心控制Ca2+以维持表型(Gigout,A.et al,Osteo Arthritis and Cartilage 2005;13:1012e1024)。这就是为什么组织培养基的商业供应商提供添加Ca2+(例如Gibco目录号11960)和不添加Ca2+(例如Gibco目录号21068)的基础培养基的原因。
因此,需要用于制备血小板来源产物的新的、快速且临床相关的方法。
发明概述
如举例说明本发明的某些代表性实施方案的实验部分所证实的,本发明人发现,可使用0.010g至0.60g玻璃颗粒/ml所述样品和1.0μmol至12.0μmol一种或更多种水溶性钙盐/ml所述样品从获自对象的富血小板血液组合物的样品(例如过期(expired)人血小板浓缩物)中制备血小板释出物或裂解物。目前要求保护的方法提供了最大限度降低最终Ca2+浓度的手段。我们已计算出,当在典型的培养基中以10%(体积/体积)的分数使用时,总(100%)血小板释出物中约0.8mM的最终Ca2+浓度使得能够保持低于磷酸钙的溶解度。
另外,本发明人已开发了用于制备血小板释出物或血小板裂解物的封闭无菌***。此外,本发明人已发现,由此获得的血小板释出物可在细胞培养或组织培养中用作血清添加剂例如胎牛血清(FBS)的替代物。未发现本文中教导的血小板释出物在生长培养基中诱导沉淀。另外,本文中教导的血小板释出物或裂解物还可用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病(degenerative disc disease)、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩(vaginal atrophy)、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病(neurodegenerative disorder)、外周动脉疾病和疼痛并且用于改善皮肤和/或毛发外观。
因此,本发明提供以下方面:
方面1.一定量的一种或更多种水溶性钙盐和一定量的玻璃颗粒用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的用途,其中玻璃颗粒的所述量为0.010g/ml至0.60g/ml所述样品,并且所述一种或更多种水溶性钙盐的所述量为1.0μmol/ml至12.0μmol/ml所述样品。
方面2.用于制备血小板释出物的***,其包含:
-具有第一容纳空间(1’)的第一容器(1),其中所述第一容纳空间(1’)
-配置成接收第二容器(2)的第二容纳空间(2’)中所包含的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;
-容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3);并且
-容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4),或者配置成接收由第三容器(5)的第三容纳空间(5’)容纳的一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4);
其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60g/ml所述样品并且比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述样品。
方面3.根据方面2所述的***,其还包含第一管,所述第一管的近端由所述第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端由所述第三容纳空间(5’)中的开口保持,其中所述管配置成将第一容器(1)连接至所述第三容器(5)并且使所述第一容纳空间(1’)与所述第三容纳空间(5’)流体连通。
方面4.根据方面3所述的***,其中所述第一管包含用于可逆地中断所述第一容纳空间(1’)与所述第三容纳空间(5’)之间的流体连通的装置,优选地,其中所述装置是外部夹具或阀。
方面5.根据方面2至4中任一项所述的***,其中所述第一容纳空间(1’)还包含:
-第二开口,其配置成连接至第二容器(2)的第二容纳空间(2’)的开口;以及
-第三开口,其配置成连接至第四容器的第四容纳空间的开口,其中所述第四容纳空间配置成接收和/或容纳使用所述***制备的血小板释出物。
方面6.根据方面5所述的***,其还包含:
-第二管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第二开口保持并且远端可连接至第二容纳空间(2’),其中所述第二管配置成将第一容器(1)连接至第二容器(2)并且使第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)流体连通;
-第三管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第三开口保持并且远端可连接至第四容器的第四容纳空间,其中所述管配置成使第一容器(1)与第四容器连接并且使第一容纳空间(1’)与第四容纳空间流体连通;以及
-任选地过滤装置(7),其定位在第一容纳空间(1’)中的第三开口与第四容纳空间之间。
方面7.根据方面6所述的***,其中通过焊接所述第二管的远端可连接至所述第二容纳空间(2’)和/或所述第三管的远端可连接至所述第四容纳空间。
方面8.根据方面2至7中任一项所述的***,其中比值Qgp∶Qbc为0.10至0.40g/ml所述样品并且比值Qcc∶Qbc为3.0至8.0μmol/ml所述样品。
方面9.根据方面2至8中任一项所述的***用于产生血小板释出物或血小板裂解物的用途。
方面10.用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的方法,其包括以下步骤:
a)使所述样品与每ml所述样品0.010g至0.60g的玻璃颗粒和每ml所述样品1.0μmol至12.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触,从而获得混合物;
b)使步骤a)中获得的所述混合物凝固,从而获得凝固物(coagulum)和血小板释出物;以及
c)从所述混合物中回收步骤b)中获得的所述血小板释出物。
方面11.根据方面1所述的用途或根据方面10所述的方法,其中所述样品与每ml所述样品0.10g至0.40g的玻璃颗粒和每ml所述样品3.0μmol至8.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触。
方面12:根据方面1所述的用途,根据方面2至8中任一项所述的***,或根据方面10或11所述的方法,其中所述玻璃颗粒的平均直径为1.0mm至5.0mm,优选2.0mm至4.0mm。
方面13:根据方面1、11或12中任一项所述的用途,根据方面2至8或12中任一项所述的***,或根据方面10至12中任一项所述的方法,其中所述玻璃颗粒是基于二氧化硅的玻璃颗粒,优选钠钙硅玻璃颗粒或钠钙玻璃颗粒、硼硅酸钠玻璃颗粒、铝硅酸盐玻璃颗粒、氧化铅玻璃颗粒或者熔融石英玻璃颗粒。
方面14.根据方面1或11至13中任一项所述的用途,根据方面2至8、12或13中任一项所述的***,或根据方面10至13中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种水溶性钙盐选自:氯化钙、氢氧化钙、乙酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氯酸钙、高氯酸钙、硫酸钙、硝酸钙、亚硝酸钙、乳酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙和葡萄糖酸钙或其混合物,优选氯化钙。
方面15.根据方面10至14中任一项所述的方法,其中在步骤c)中,通过使所述混合物通过至少一个滤器从所述混合物中回收步骤b)中获得的所述血小板释出物。
方面16.根据方面10至15中任一项所述的方法,其中在步骤b)中,使所述混合物凝固1小时至20小时的时间,优选2至6小时的时间,更优选2至4小时的时间。
方面17.根据方面1或11至14中任一项所述的用途或者根据方面10至16中任一项所述的方法,其中所述富血小板血液组合物选自血小板浓缩物、血浆和全血,优选血小板浓缩物。
方面18.根据方面10至17中任一项所述的方法,其还包括以下步骤:裂解存在于步骤b)中获得的凝固物和/或获得的血小板释出物中的血小板,从而获得血小板裂解物。
方面19.通过根据方面10至17中任一项所述的方法获得的血小板释出物,优选地其中这样的释出物在总(100%)血小板释出物中的最终钙离子浓度(Ca2+)低于0.8mM。
方面20.通过根据方面18所述的方法获得的血小板裂解物,优选地其中这样的释出物在总(100%)血小板释出物中的最终钙离子浓度(Ca2+)低于0.8mM。
方面21.药物组合物,其包含根据方面19所述的血小板释出物或根据方面20所述的血小板裂解物。
方面22.化妆品组合物,其包含根据方面19所述的血小板释出物或根据方面20所述的血小板裂解物。
方面23.包含富血小板血液组合物的组合物,其除存在于所述富血小板血液组合物中的Ca2+离子之外,还具有1.0mM至12.0mM Ca2+离子,以及0.010g至0.60g玻璃颗粒/ml所述富血小板血液组合物。
方面24.容器,其包含根据方面23所述的组合物。
方面25:根据方面19所述的血小板释出物,根据方面20所述的血小板裂解物或根据方面21所述的药物组合物,其用于医学。
方面26.根据方面19所述的血小板释出物,根据方面20所述的血小板裂解物或根据方面21所述的药物组合物,其用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛,所述治疗包括向对象施用有效量的所述血小板释出物、所述血小板裂解物或所述药物组合物。
方面27:根据方面19所述的血小板释出物、根据方面20所述的血小板裂解物或根据方面22所述的化妆品组合物用于改善皮肤和/或毛发外观的用途。
方面28.根据方面19所述的血小板释出物或根据方面20所述的血小板裂解物在细胞培养或组织培养中的用途。
本发明的这些和另一些方面以及优选实施方案在以下部分和所附权利要求书中描述。所附权利要求书的主题在此特别地并入本说明书中。
附图简述
图1.(A)包含30%(v/v)血浆的血小板浓缩物(platelet concentrate,PC)以及单独的或与玻璃珠组合的CaCl2的凝固。(B)通过将15mM CaCl2与40ml PC组合(左图)或通过将10g玻璃珠、4mM CaCl2与40ml PC组合(右图)获得的凝固物。
图2.用于在封闭***中制备人血小板释出物(human platelet releasate,hPR)的***。(A)将PC从PC袋(2)的容纳空间(2’)转移至包含玻璃珠(3)和CaCl2(4)的转移袋(1)的容纳空间(1’)。在将PC转移至容纳空间(1’)之后,使溶液凝固。转移袋可连接至过滤装置(7)以将在凝固之后获得的血小板释出物与玻璃珠、凝固物以及任选地与碎片和颗粒物质分离。转移袋可在容器(recipient)(6)中洗脱。(B)将PC从PC袋(2)的容纳空间(2’)转移至包含玻璃珠(3)的转移袋(1)的容纳空间(1’)。转移袋(1)的容纳空间(1’)连接至由分离阀(break-away valve)密封的包含CaCl2(4)的小袋(5)的容纳空间(5’)。在将CaCl2转移至包含PC和玻璃珠的转移袋(1)的容纳空间(1’)之后,使溶液凝固。转移袋可连接至过滤装置(7)以将在凝固之后获得的血小板释出物与玻璃珠、凝固物以及任选地与碎片和颗粒物质分离。转移袋可在容器(6)中洗脱。
图3.在转移袋中的(A)和从袋中移出的(B)通过本文中教导的方法获得的凝固物。
图4.在不同重量的玻璃珠和不同浓度的Ca2+下的收缩(retraction)速度。
图5.(A)用不同重量的玻璃珠和不同浓度的Ca2+凝固的PC(40ml)中的释出物收率。(B)用15mM CaCl2/ml PC或用4mM CaCl2和0.20g玻璃珠/ml PC凝固的PC(350ml)中的释出物收率。
图6.在凝固完成之后获得的血小板释出物中Ca2+的剩余浓度。这是在使用Ca2+离子选择电极的血气分析仪中确定的。
图7.向Dulbecco改良Eagle(DMEM)细胞培养基添加10%(v/v)人血小板释出物的作用(左图)或添加胎牛血清(FBS)的作用(右图),所述人血小板释出物是在没有玻璃珠的情况下使用15mM CaCl2从包含65%血小板添加剂溶液的血小板浓缩物中获得的。
图8.向DMEM细胞培养基添加人血小板释出物的作用。(A)具有用15mM CaCl2制备的10%(v/v)hPR的生长培养基;(B)没有hPR的生长培养基;(C)具有未用钙制备的10%(v/v)hPR的生长培养基;(D)具有用4mM CaCl2和0.20g/mL玻璃珠制备的10%(v/v)hPR的生长培养基;以及(E)具有用5mM CaCl2和0.20g/mL玻璃珠制备的10%(v/v)hPR的生长培养基。
图9.在补充有10%(v/v)不同类型hPR的DMEM生长培养基中培养的脂肪组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的细胞倍增时间(cell doubling time)。‘标准’hPR是通过两个冻融循环以及随后的离心产生的,‘CaCl2+玻璃’hPR是用5mM CaCl2和0.2g钠钙玻璃珠/ml PC制备的。包含三种商业竞争物,包含FBS作为金标准。
图10.在DMEM生长培养基中培养的MSC的显微图像,所述培养基补充有(A)在没有玻璃珠的情况下用15mM CaCl2制备的10%(v/v)hPR,以及(B)用4mM CaCl2和0.20g玻璃珠/ml PC制备的10%(v/v)hPL。
图11.实施例8的实验条件和结果的示意性概图。在上排中示出了不同的CaCl2浓度,而在左列中示出了不同的玻璃颗粒重量和浓度。在小于3小时内不存在收缩用‘X’表示,而在小于3小时内成功收缩用‘V’表示。
图12.实施例9的实验条件和结果的示意性概图。在上排中示出了不同的CaCl2浓度,而在左列中示出了不同的玻璃颗粒重量和浓度。不存在收缩用‘X’表示,而在小于3小时内成功收缩用‘V’表示。开圆表示在3小时至21小时之间凝块收缩。
图13.根据引用的现有技术制备的血小板释出物中Ca2+(离子钙)的浓度。在配对实验中,用要求保护的方法(TReC)或来自现有技术文献中的那些对添加剂溶液(PAS-血浆)或纯血浆(血浆)中的血小板浓缩物进行处理。
图14.在组织培养基中化学磷酸根(PO4 3-)与钙(Ca2+)的复合物的沉淀。
发明详述
除非上下文另外明确指出,否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。
本文中使用的术语“包含/括”和“由……构成”与“包括/含”或“包含/含有”同义且是包括性的或开放式的,并且不排除另外的未记载的成员、要素或方法步骤。该术语还涵盖“由……组成”和“基本上由……组成”,这在专利术语中享有公认的含义。
通过端点对数值范围的列举包括包含在相应范围内的所有数字和分数,以及所列举的端点。
当涉及可测量值例如参数、量、时距(temporal duration)等时,本文中使用的术语“约”或“大约”意在涵盖指定值的和相对于指定值的变化,例如指定值的和相对于指定值的±10%或更小,优选±5%或更小,更优选±1%或更小,并且还更优选±0.1%或更小的变化,在此范围内这样的变化适合于在所公开的发明中执行。应理解,修饰语“约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。
尽管术语“一个或更多个”或“至少一个”(例如一组成员中一个或更多个成员或至少一个成员)本身是清楚的,但通过进一步例证,该术语尤其涵盖对所述成员中的任意一个,或者对所述成员中的任意两个或更多个,例如所述成员中的任意3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、或7个或更多个等以及多至所有所述成员的提及。在另一个实例中,“一个或更多个”或“至少一个”可以是指1、2、3、4、5、6、7或更多个。
本文中包括对本发明背景的讨论以说明本发明的背景。这不应被视为承认所提及的任何材料截至任何权利要求的优先权日已在任何国家公开、已知或作为公知常识的一部分。
在本公开内容通篇,通过标识引文引用了多种出版物、专利和公开的专利说明书。本说明书中引用的所有文件均在此通过引用整体并入。特别地,本文中具体提及的这样的文件的教导或部分通过引用并入。
除非另外定义,否则公开本发明中使用的所有术语,包括技术和科学术语,均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导,包括术语定义以更好地理解本发明的教导。除非另外定义,否则当结合本发明的具体方面或本发明的具体实施方案来定义特定术语时,这样的含义意在在本说明书通篇适用,即也适用于本发明的另一些方面或实施方案的情况。
在以下段落中,更详细地限定了本发明的不同方面或实施方案。除非明确相反指出,否则如此限定的每个方面或实施方案可与任何其他方面或实施方案组合。特别地,指示为优选的或有利的任何特征可与指示为优选的或有利的任何其他一个或更多个特征组合。
在本说明书通篇,对“一个实施方案”、“实施方案”的提及意指与所述实施方案相关的所描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此,在本说明书通篇多个位置中出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不必都(但可以)涉及同一个实施方案。此外,在一个或更多个实施方案中,如对于本领域技术人员根据本公开内容将变得明显的是,特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。此外,虽然本文中所述的一些实施方案包含一些特征但不包含包含在另一些实施方案中的另一些特征,但是不同实施方案的特征的组合意在处于本发明的范围之内,并且形成不同的实施方案,如本领域技术人员将理解的。例如,在所附权利要求书中,任何要求保护的实施方案都可以以任意组合使用。
如举例说明本发明的某些代表性实施方案的实验部分所证实的,本发明人发现,可使用0.010g至0.60g玻璃颗粒/ml所述样品和1.0μmol至12.0μmol一种或更多种水溶性钙盐/ml所述样品从获自对象的富血小板血液组合物的样品(例如过期人血小板浓缩物)中制备血小板释出物。此外,本发明人已发现,由此获得的血小板释出物可在细胞培养或组织培养中用作血清添加剂例如胎牛血清(FBS)的替代物。未发现本文中教导的血小板释出物在生长培养基中诱导沉淀。另外,本文中教导的血小板释出物或裂解物还可用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛,并且用于改善皮肤和/或毛发外观。
因此,第一方面提供了一定量的一种或更多种可溶性钙盐和一定量的玻璃颗粒用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的用途,其中玻璃颗粒的所述量为0.010g至0.60g/ml所述样品并且一种或更多种水溶性钙盐的所述量为1.0μmol至12.0μmol/ml所述样品。
本文中使用的术语“血小板释出物”或“血小板分泌组”是指包含由一种或更多种活化的血小板分泌的颗粒和外排体内容物的溶液。所述颗粒和外排体内容物的一些非限制性实例包括凝血因子(coagulation factor)、小分子、能当量(energy equivalent)、趋化因子、细胞因子、黏附分子、激素、免疫分子和生长调节剂(或生长因子)、细胞***调节剂、凋亡调节剂和/或血管生成调节剂,以及附着因子。在一些特别的实施方案中,该术语不涵盖血小板裂解物。本文中使用的术语“血小板裂解物”是指包含一种或更多种裂解血小板的内容物的溶液。该术语还可涵盖血小板释出物。用于获得血小板裂解物的方法是本领域已知的,并且包括血小板的冻融。
优选地,血小板释出物或血小板裂解物基本上不含细胞(即至多50000个细胞/μl血小板释出物或裂解物,优选至多40000个细胞/μl血小板释出物或裂解物)。本文中使用的术语“细胞”不涵盖胞外囊泡。
除非指出时,否则术语“对象”或“患者”可互换使用并且是指动物,优选温血动物,更优选脊椎动物,甚至更优选哺乳动物,例如黑猩猩以及其他猿和猴物种、牛、绵羊、猪、山羊、马、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠等,还更优选灵长类,并且特别地包含人患者和非人哺乳动物以及灵长类。优选的对象是人对象。术语“对象”或“患者”包括需要治疗的对象,更特别地是将受益于给定病症的治疗的对象,所述病症特别是硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛。这样的对象可包括但不限于已被诊断患有所述病症的那些、易于发生所述病症的那些和/或在其中要预防所述病症的那些。术语“对象”或“患者”包括需要改善皮肤和/或毛发外观的对象。除非上下文另有明确地指出,否则术语“对象”或“患者”包括一名或更多名对象或患者。
本文中使用的术语“富血小板血液组合物”是指来源于全血的组合物,其包含至少50 000个,优选至少600 000个血小板/μl或至少800 000个血小板/μl。富血小板血液组合物的一些非限制性实例是血小板浓缩物(例如血沉棕黄层(buffy coat)来源的血小板浓缩物、单采血小板(apheresis-platelet)浓缩物或富血小板血浆来源的血小板浓缩物)、全血、血浆和富血小板血浆。用于从全血中获得血小板浓缩物、血浆或富血小板血浆的方法是本领域已知的并且包括差速离心和Hardwick J.,Blood processing.2008.3(20):148-176并且尤其是第164至175页中所述的方法,包括单采、血沉棕黄层的合并或富血小板血浆产生。
优选地,富血小板血液组合物基本上不包含(例如,少于10个白细胞/μl,优选少于5个白细胞/μl)白细胞和/或少于4 000个红细胞/μl。
本说明书通篇关于从对象获得(分离、移出)的富血小板血液组合物使用的术语“样品”或“生物样品”涵盖从对象直接或间接获得(分离、移出)的富血小板血液组合物的样品。间接获得的富血小板血液组合物的样品包括通过对全血进行加工而获得的样品,所述全血可从对象直接获得,以便例如通过单采或离心得到富血小板血液组合物。优选地,可通过微创方法例如血液收集(“液体活检”)容易地获得样品,从而使得从对象提供/移出/分离样品。
在一些特别的实施方案中,样品是合并样品,意味着该样品取自单个样品池,其中所述样品池包含两名或更多名对象的样品和/或在不同时间点从单个对象获取的样品。
在一些特别的实施方案中,样品的体积为5.0ml至50 000.0ml、10.0ml至10000.0ml、10.0ml至5 000.0ml、10.0ml至2 500.0ml、10.0ml至1 000.0ml、50.0ml至750.0ml、50.0ml至500.0ml、100.0ml至500.0ml、150.0ml至450.0ml,优选100.0至500.0ml。
本文中使用的术语“血小板浓缩物”是指富血小板血液组合物,其包含至少50 000个血小板/μl,优选至少600 000个血小板/μl或至少800 000个血小板/μl,以及血浆和/或一种或更多种血小板添加剂溶液(例如,血小板储存液(SSP+))。血小板添加剂溶液可用于代替一部分(例如5.0至95.0%(v/v))血浆。血小板浓缩物可通过本领域已知的用于制备血小板浓缩物的任何方法来制备,例如Hardwick J.,Blood processing.2008.3(20):148-176并且尤其是第164至175页中所描述的,包括单采、血沉棕黄层的合并或富血小板血浆产生。因此,术语“血小板浓缩物”还涵盖富血小板血浆,例如浓缩的富血小板血浆,其通常不包含血小板添加剂溶液。
优选地,血小板浓缩物基本上不包含(例如,少于10个白细胞/μl,优选少于5个白细胞/μl)白细胞。
在一些特别的实施方案中,富血小板血液组合物包含至少50 000个血小板/μl、至少100 000个血小板/μl、至少200 000个血小板/μl、至少300 000个血小板/μl、至少400000个血小板/μl、至少500 000个血小板/μl、至少600 000个血小板/μl、至少700 000个血小板/μl、至少800 000个血小板/μl、至少900 000个血小板/μl或至少1 000 000个血小板/μl,优选至少600 000个血小板/μl或至少800 000个血小板/μl。例如,800 000至1 200 000个血小板/μl,富血小板血液组合物可包含100 000至3 000 000个血小板/μl、200 000至2000 000个血小板/μl、或200 000至1 500 000个血小板/μl,优选200 000至2 000 000个血小板/μl,更优选800 000至1 200 000个血小板/μl。
在一些特别的实施方案中,富血小板血液组合物包含至少5.0%(v/v)、至少10.0%(v/v)、至少15.0%(v/v)、至少20.0%(v/v)、至少25.0%(v/v)、至少30.0%(v/v)、至少35.0%(v/v)、至少40.0%(v/v)、至少45.0%(v/v)、至少50.0%(v/v)、至少55.0%(v/v)、至少60.0%(v/v)、至少65.0%(v/v)、至少70.0%(v/v)、至少75.0%(v/v)或至少85.0%(v/v),优选至少30.0%(v/v)的血浆。血浆通常包含一种或更多种凝血因子,例如凝血因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII和/或因子XIII。优选地,所述一种或更多种凝血因子以正常生理水平(即所述一种或更多种凝血因子在健康对象中的生理浓度)存在于血浆中。
在一些特别的实施方案中,富血小板血液组合物选自血小板浓缩物、血浆(例如富血小板血浆)和全血。在一些更具体的实施方案中,富血小板血液组合物是血小板浓缩物或富血小板血浆,优选血小板浓缩物。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物包含至少600 000个血小板/μl、至少700000个血小板/μl、至少800 000个血小板/μl、至少900 000个血小板/μl或至少1 000 000个血小板/μl,优选至少1 000 000个血小板/μl。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物包含600 000至3 000 000个血小板/μl、700 000至2 500 000个血小板/μl、800 000至2 000 000个血小板/μl或800 000至1 500000个血小板/μl。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物是通过单采或血沉棕黄层获得的血小板浓缩物。在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物是例如由医学博士或其他临床医师例如护士制备并批准用于医学输注用途的血小板浓缩物。
本文中使用的术语“血小板添加剂溶液(platelet additive solution)”或“PAS”是指用于保存血小板的电解质溶液。血小板添加剂溶液通常包含乙酸盐以及任选地钾、镁和/或磷酸盐。血小板添加剂溶液可延长血小板保质期、降低血小板活化、改善血小板的功能、维持pH并降低变应性反应。血小板添加剂溶液可以是本领域已知的任何血小板添加剂溶液,例如,如Tynngard et al.Preparation,storage and quality control ofplatelet concentrates.2009.Transfusion and Apheresis Science.41:97-104的表1中所述的。PAS的一些非限制性实例包括PAS-B(即包含乙酸盐)、PAS-C(即包含乙酸盐和磷酸盐)、PAS-F(即包含乙酸盐、镁和钾作为关键成分)、PAS-E(即包含乙酸盐、镁、钾和磷酸盐)或其组合。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物包含至少5.0%(v/v)、至少10.0%(v/v)、至少15.0%(v/v)、至少20.0%(v/v)、至少25.0%(v/v)、至少30.0%(v/v)、至少35.0%(v/v)、至少40.0%(v/v)、至少45.0%(v/v)、至少50.0%(v/v)、至少55.0%(v/v)、至少60.0%(v/v)、至少65.0%(v/v)、至少70.0%(v/v)、至少75.0%(v/v)或至少85.0%(v/v),优选至少60.0%(v/v)的一种或更多种血小板添加剂溶液。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物包含0.0%至95.0%(v/v)、5.0%至95.0%(v/v)、10.0%至90.0%(v/v)、20.0%至80.0%(v/v)、30.0%至80.0%(v/v)、40.0%至80.0%(v/v)、50.0%至80.0%(v/v)、60%至80.0%(v/v)或65.0%至75.0%(v/v),优选60.0%至90.0%(v/v)的一种或更多种血小板添加剂溶液。
在一些更具体的实施方案中,血小板添加剂溶液是PAS-E溶液,并且包含至少32.50mM乙酸盐、至少5.0mM钾、至少1.50mM镁和至少28.20mM磷酸盐。
在一些更具体的实施方案中,血小板添加剂溶液包含柠檬酸Na3-2H2O、乙酸钠3H2O、NaCl和任选地NaH2PO4 2H2O、Na2HPO4、KCl和/或MgCl2 6H2O。
在一些甚至更具体的实施方案中,血小板添加剂溶液是PAS-E溶液,并且包含:
-2.0至4.0g/L,优选2.90至3.20g/L柠檬酸Na3 2H2O,
-3.0至5.0g/L,优选4.0至4.50g/L乙酸钠3H2O,
-3.0至8.0g/L,优选4.0至7.0g/L NaCl,
以及任选地
-9.0至1.20g/L,优选1.0至1.10g/L NaH2PO4 2H2O,
-2.90至3.20g/L,优选3.0至3.10g/L Na2HPO4,
-0.30至0.45g/L,优选0.350至0.40g/L KCl,和/或
-0.250至0.350g/L,优选0.290至0.310g/L MgCl2 6H2O。
例如,血小板添加剂溶液是SSP+(Macopharma)或T-PAS+(TerumoBCT,Inc.)。
在一些特别的实施方案中,富血小板血液组合物包含至少700 000个血小板/μl和60.0%至90.0%(v/v)的一种或更多种血小板添加剂溶液。
在一些特别的实施方案中,对富血小板血液组合物进行病原体灭活(也称为病原体降低)。全血或血液来源产物的病原体灭活是本领域已知的并且可使用Intercept BloodSystem(CERUS,Concord CA)、Mirasol Pathogen Reduction(Terumo BCT,Denver,CO)或Theraflex UVC(Macopharma,Tourcoing,FR)进行。
在一些特别的实施方案中,富血小板血液组合物基本上不含可在施用富血小板血液组合物或其衍生物的对象中引起疾病的任何感染剂(例如微生物,包括细菌、病毒和原生动物)。在一些更具体的实施方案中,富血小板血液组合物基本上不含人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、肝炎(例如乙型肝炎或丙型肝炎)病毒和***(Treponema pallidum)(即引起梅毒的细菌)。
血小板浓缩物的保质期短(例如5至7天),并且因此需要许多供体以在任何给定时间维持用于输注的血小板浓缩物的最低供应。由于血小板浓缩物的保质期短以及需求和供应的变化,血库难以管理血小板浓缩物储备。作为此结果,3%至5%捐献的血小板浓缩物在其可用于输注之前就已过期(即不再被认为对于人输注是安全的),并且因此作为生物危害性废物被丢弃。由于在室温下在储存期间病原体向外生长的风险提高,因此血小板浓缩物的保质期保持较短。除此之外,在储存期间血小板功能下降,也称为血小板储存损伤(lesion)。血小板浓缩物是昂贵的产品,因此丢弃过期血小板浓缩物的财务成本是高的。本发明人发现,过期血小板浓缩物可通过本文中教导的方法用于制备血小板释出物。在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法任选地包括裂解存在于富血小板血液组合物中的血小板从而获得血小板裂解物。如果存在这样的裂解步骤,则本文中教导的方法将是用于制备血小板裂解物的方法并且从所述血小板释出物中获得血小板裂解物。本发明人还发现,所述血小板释出物或血小板裂解物可用于细胞培养,用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛,并且用于改善皮肤和/或毛发外观。
在一些特别的实施方案中,血小板浓缩物是过期血小板浓缩物。
本文中有关血小板浓缩物使用的术语“过期”表示不再被认为适合用于输注的血小板浓缩物。血小板浓缩物的过期时间和/或过期条件可因管辖而异。例如,可认为血小板浓缩物在捐献之后至少3天、捐献之后至少4天、捐献之后至少5天、捐献之后至少6天、捐献之后至少7天、捐献之后至少8天、捐献之后至少9天、捐献之后至少10天、捐献之后至少11天、捐献之后至少12天、捐献之后至少13天、捐献之后至少14天或捐献之后至少15天,优选捐献之后至少10天过期。
在一些特别的实施方案中,在从对象获得血小板浓缩物之后至少5天,优选至少10天时使用血小板浓缩物。
本文中使用的术语“水溶性钙盐”是指钙盐或钙复合物,优选地当在1atm的大气压力下、在20.0℃的温度下和pH 7.4下测量时,其溶解度为至少0.010g/100ml水。优选地,水是蒸馏水。水溶性钙盐的一些非限制性实例是氯化钙、氢氧化钙、乙酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氯酸钙、高氯酸钙、硫酸钙、硝酸钙、亚硝酸钙、乳酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙和葡萄糖酸钙。钙复合物的一些非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)钙和喷替酸钙或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)钙等。
在一些特别的实施方案中,一种或更多种水溶性钙盐选自氯化钙、氢氧化钙、乙酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氯酸钙、高氯酸钙、硫酸钙、硝酸钙、亚硝酸钙、乳酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙和葡萄糖酸钙,或其混合物。在一个优选实施方案中,水溶性钙盐是氯化钙。本文中使用的术语“氯化钙”或“CaCl2”是指CAS编号为10043-52-4的氯化钙。
在一些特别的实施方案中,所述一种或更多种水溶性钙盐在体内是无毒的。在一些更具体的实施方案中,所述一种或更多种水溶性钙盐不包含溴化钙。
在一些特别的实施方案中,所述一种或更多种水溶性钙盐的量为0.010μmol至20.0μmol、0.050μmol至20.0μmol、0.10μmol至15.0μmol、0.050μmol至12.0μmol、1.0μmol至12.0μmol、0.050μmol至10.0μmol、0.50μmol至10.0μmol、1.0μmol至10.0μmol、1.0μmol至9.0μmol、1.0μmol至8.0μmol、1.0μmol至7.0μmol、1.0μmol至6.0μmol、2.0μmol至12.0μmol、2.0μmol至10.0μmol、2.0μmol至9.0μmol、0.050μmol至8.0μmol、2.0μmol至8.0μmol、3.0μmol至8.0μmol、2.0μmol至7.0μmol、3.0μmol至7.0μmol、2.0μmol至6.0μmol或3.0μmol至6.0μmol/ml样品,优选1.0μmol至12.0μmol或2.0μmol至10.0μmol/ml样品,更优选3.0μmol至8.0μmol/ml样品。例如,4.0μmol或5.0μmol/ml样品。所述一种或更多种水溶性钙盐的量通常是指外源添加的一种或更多种水溶性钙盐的量,而不是指已存在于富血小板血液组合物中的那些。
在一些特别的实施方案中,所述一种或更多种水溶性钙盐的量为0.010mM至20.0mM、0.050mM至20.0mM、0.10mM至15.0mM、0.050mM至12.0mM、1.0mM至12.0mM、0.050mM至10.0mM、0.50mM至10.0mM、1.0mM至10.0mM、1.0mM至9.0mM、1.0mM至8.0mM、1.0mM至7.0mM、1.0mM至6.0mM、2.0mM至12.0mM、2.0mM至10.0mM、2.0mM至9.0mM、0.050mM至8.0mM、2.0mM至8.0mM、3.0mM至8.0mM、2.0mM至7.0mM、3.0mM至7.0mM、2.0mM至6.0mM或3.0mM至6.0mM,优选1.0mM至12.0mM或2.0mM至10.0mM,更优选3.0mM至8.0mM。例如,4.0mM或5.0mM。
在一些特别的实施方案中,在将所述一种或更多种水溶性钙盐添加至富血小板血液组合物之前,将所述一种或更多种水溶性钙盐溶解在水,优选蒸馏水中。在一些特别的实施方案中,所述一种或更多种水溶性钙盐溶解于其中的水的体积为向其添加所述一种或更多种水溶性钙盐的富血小板血液组合物体积的至多5.0%(v/v)、至多4.0%(v/v)、至多3.0%(v/v)、至多2.0%(v/v)或至多1.0%(v/v),优选至多1.0%(v/v)。
本文中使用的术语“颗粒”是指具有特定形状,优选对称且均匀形状的小物体。颗粒形状的一些非限制性实例包括立方体、球体、圆柱体、锥体、角锥体、棱柱体、长方体和圆环体;优选球体。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒是球体、立方体、圆柱体、锥体、角锥体、棱柱体、长方体、圆环体或其组合,优选球体。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒的平均颗粒尺寸或平均直径为0.20mm至40.0mm、0.50mm至35.0mm、0.50mm至30.0mm、0.50mm至25.0mm、0.50mm至20.0mm、0.50mm至15.0mm、0.50mm至10.0mm、1.0mm至10.0mm、1.0mm至9.0mm、1.0mm至8.0mm、1.0mm至7.0mm、1.0mm至6.0mm、1.0mm至5.0mm或1.0mm至4.0mm,优选2.0mm至4.0mm。在一些优选实施方案中,玻璃颗粒的平均颗粒尺寸或平均直径为1.0mm至5.0mm,优选2.0mm至4.0mm。
可基于给定颗粒的表面积来计算颗粒尺寸,也称为基于面积的颗粒尺寸。基于面积的颗粒尺寸等于具有与给定颗粒相同的表面积的球体的直径。技术人员将理解,如果颗粒是球体,则颗粒尺寸等于颗粒的直径。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒的最大直径为至多4.0cm、至多3.50cm、至多3.0cm、至多2.50cm、至多2.0cm、至多1.50cm、至多1.0cm或至多0.50cm。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒具有均匀的尺寸分布,其中随机抽取的至少40个珠的总体的平均归一化标准偏差低于20%,优选低于10%。
术语“均匀的尺寸分布”在本文中是指均一的物理量级。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒不是多孔的和/或不是空心的。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒由基于二氧化硅的玻璃,例如钠钙硅玻璃(本文中也称为钠钙玻璃)、硼硅酸钠玻璃、铝硅酸盐玻璃、氧化铅玻璃或熔融石英玻璃制成。
在一些优选实施方案中,玻璃颗粒是钠钙玻璃颗粒。本发明人观察到,与其他类型玻璃的凝固时间相比,在本文中教导的使用钠钙玻璃颗粒的方法中的凝固时间可降低。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒的量为0.010g至1.0g、0.010g至0.60g、0.020g至0.60g、0.030g至0.60g、0.040g至0.60g、0.050g至0.60g、0.10g至0.50g、0.10g至0.450g、0.10g至0.40g、0.10g至0.350g、0.10g至0.30g、0.150g至0.30g或0.20g至0.30g/ml样品,优选0.10g至0.40g/ml样品。例如,0.25g玻璃颗粒/ml样品。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒的量为0.10g至0.40g/ml所述样品并且所述一种或更多种水溶性钙盐的量为2.0μmol至10.0μmol或3.0μmol至8.0μmol/ml样品,优选3.0μmol至8.0μmol/ml样品。例如,玻璃颗粒的量为0.250g/ml样品并且所述一种或更多种水溶性钙盐的量为5.0μmol/ml样品。如果所述一种或更多种水溶性钙盐的量接近于本文中所公开范围的上限,则玻璃颗粒的量可接近于本文中所公开范围的下限。
另一个方面提供了用于制备血小板释出物或血小板裂解物的***,其包含具有第一容纳空间(1’)的第一容器(1),其中所述第一容纳空间容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)并且配置成接收由第二容器(2)的第二容纳空间(2’)容纳的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物,优选地,第一容纳空间配置成连接至容纳一定量(Qbc)的富血小板血液组合物的第二容器(2)的第二容纳空间(2’);其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60克/ml。
在一些特别的实施方案中,
-(i)第一容纳空间(1’)还容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4);或者
-(ii)第一容纳空间(1’)配置成接收由第三容器(5)的第三容纳空间(5’)容纳的一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4),优选地第一容纳空间(1’)配置成连接至容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)的第三容器(5)的第三容纳空间(5’),更优选地第一容纳空间(1’)包含第一开口,优选可密封开口,其配置成连接至容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)的第三容器(5)的第三容纳空间(5’)的开口;
其中在(i)或(ii)中,比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述富血小板血液组合物。
在一个优选实施方案中,第一容纳空间(1’)容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)和一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4),优选地第一容纳空间(1’)容纳0.10g至0.40g玻璃颗粒/ml富血小板血液组合物和3.0μmol至8.0μmol一种或更多种水溶性钙盐/ml富血小板血液组合物。
第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)和/或第三容纳空间(5’)之间的连接可通过本领域已知的任何方法获得。例如,通过导管装置(例如如本文中其他地方所述的一种或更多种管)、通过鲁尔锁(Luer-lock)连接(例如如果第二和/或第三容器是无针注射器)、通过用空心刺钉穿透可刺穿的塞子或盖子(例如如果第二和/或第三容器是具有空心针的注射器)、通过易碎/分离插头(frangible/breakaway plug)(例如如WO8101105或US5152755A中所述)或其组合。这样的组合可以是其近端可连接至第一容纳空间(1’)中的开口并且远端可连接至第二容纳空间(2’)和/或第三容纳空间(5’)中的开口的管,其中远端包含母鲁尔锁组件(例如当第二和/或第三容器是无针注射器时),或者作为替代地,其中远端被可刺穿的塞子或盖子密封(例如当第二和/或第三容器是具有空心针的注射器时)。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的***包含:
-第一容器(1),其包含容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)和一种或更多种水溶性钙盐(4)的第一容纳空间(1’),所述第一容纳空间(1’)配置成接收由第二容器(2)的第二容纳空间(2’)容纳的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;其中第一容纳空间包含第一开口,优选可密封开口,其配置成连接至第二容器(2)的第二容纳空间(2’)的开口;以及
-第一管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端配置成连接至第二容纳空间(2’)中的开口;其中第一管配置成例如通过焊接使第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)流体连通;
其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60克/ml所述富血小板血液组合物,并且比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述富血小板血液组合物。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间(1’)的第一开口配置成保持第一管的近端,并且第三容纳空间(5’)的开口配置成保持所述第一管的远端。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的***包含第一管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端配置成连接至第三容纳空间(5’)中的开口或由第三容纳空间(5’)中的开口保持,其中第一管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)连接至第三容器(5),并且使第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)流体连通。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的***包含:
-第一容器(1),其包含容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)的第一容纳空间(1’),所述第一容纳空间(1’)配置成接收由第二容器(2)的第二容纳空间(2’)容纳的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;其中第一容纳空间包含第一开口,优选可密封开口,其配置成连接至第三容器(5)的第三容纳空间(5’)的开口;
-第三容器(5),其具有容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)的第三容纳空间(5’);以及
-第一管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端由第三容纳空间(5’)中的开口保持,其中第一管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)连接至第三容器(5),并且使第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)流体连通;
其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60克/ml所述富血小板血液组合物,并且比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述富血小板血液组合物。
在一些特别的实施方案中,第一容器(1)的第一容纳空间(1’)与第三容器(5)的第三容纳空间(5’)之间的流体连通可通过本领域已知的任何方式完全中断。例如,第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通可通过在第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的第一管上放置可移除夹具(例如,管夹具(例如,Halkay,的340TCS管夹具)或Kocher夹具)来完全中断。或者,第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通可通过在第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间并入阀来完全中断,优选易碎套管阀,其允许调节第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通。所述阀可用于打开和/或关闭管,从而允许或防止第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通。用于可逆地中断第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通的阀可以是本领域中已知适合用于这样的装置的任何类型的阀,包括易碎或分离套管阀(例如如WO8101105或US5152755A中所述)、旋塞阀(stopcock)、压力/卸压阀(pressure/reliefvalve)和单向阀。易碎或分离套管阀通常以其关闭形式安装在管中,并且一旦打开阀,就不能再通过所述阀关闭流体连通。
在一些特别的实施方案中,其近端由第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端配置成连接至第三容纳空间(5’)中的开口或由第三容纳空间(5’)中的开口保持的第一管包含用于可逆地中断第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)之间的流体连通的装置,例如外部夹具或阀,优选易碎或分离套管阀,如本文中其他地方所述的。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间包含第二开口,优选可密封开口,其配置成将第一容纳空间连接至容纳一定量(Qbc)的富血小板血液组合物的第二容器(2)的第二容纳空间(2’)。第一容纳空间(1’)中的第二开口与第二容纳空间(2’)中的开口之间的连接可通过本领域已知的任何方法来获得,如本文中其他地方所述的。例如,第一容纳空间(1’)的第二开口可配置成保持导管装置,例如管,如本文中其他地方所述的。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的***包含第二管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第二开口保持并且远端配置成连接至第二容纳空间(2’)中的开口,其中所述第二管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)连接至第二容器(2),并且使第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)流体连通。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间(1’)配置成将由第一容器(1)的第一容纳空间(1’)容纳的一定量的血小板释出物释放到第四容器的第四容纳空间中,其中第四容纳空间配置成接收(例如收集)和/或容纳使用本文中教导的***制备的血小板释出物。优选地,第一容纳空间(1’)配置成连接至第四容器的第四容纳空间。
第一容纳空间(1’)与第四容纳空间之间的连接可通过本领域已知的任何方法获得,如本文中其他地方所述的。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间包含第三开口,优选可密封开口,其配置成将第一容纳空间连接至第四容器的第四容纳空间,其中第四容纳空间配置成接收(例如收集)和/或容纳使用本文中教导的***制备的血小板释出物。第一容纳空间(1’)中的第三开口与第四容纳空间中的开口之间的连接可通过本领域已知的任何方法获得,如本文中其他地方所述的。例如,第一容纳空间(1’)的第三开口可配置成保持导管装置,例如管,如本文中其他地方所述的。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的***包含第三管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第三开口保持并且远端配置成连接至第四容器的第四容纳空间(4’)中的开口,其中所述管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)与第四容器连接,并且使第一容纳空间(1’)与第四容纳空间流体连通。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间(1’)中的第一、第二和/或第三开口是指第一容纳空间(1’)中的一个且相同的开口。第一容纳空间中的开口可相继连接至第二容纳空间(2’)、第三容纳空间(5’)和第四容纳空间。
其近端分别由第一容纳空间中的第一、第二和第三开口保持的第一、第二和第三管的远端可通过将第一、第二和第三管的远端分别直接连接至第三、第二或第四容纳空间中的开口来分别连接至第三、第二或第四容纳空间中的开口,例如通过鲁尔锁连接或通过刺穿密封一个容纳空间的开口的可刺穿的塞子(通过与其他容纳空间流体连通的空心针),或者作为替代地,通过将第一、第二和第三管的远端与其近端分别由第三、第二或第四容纳空间中的开口保持的管的远端互连,例如通过无菌管连接,例如通过将管彼此焊接使得管彼此流体连通。无菌焊接装置使得连接或断开至少两个管端部,同时在切割和焊接期间维持无菌。在一些特别的实施方案中,如果使用无菌焊接来断开至少两个管端部,则两个管通常被永久密封,并且只能通过切割和/或焊接重新打开。
焊接可用于连接或断开管并允许打开或关闭如本文中所公开的容器的容纳空间之间的流体连通,而不将容纳空间或其内容物暴露于本文中所教导的***外部的环境(以及可存在于该环境中的病原体)。
在一些特别的实施方案中,第一、第二和第三管是柔性管。管可由本领域已知的用于制备柔性管的任何医用级材料,例如塑料或硅酮制成。在一些特别的实施方案中,第一、第二和第三管由塑料组成,例如热塑性弹性体管,例如聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)、聚氨酯(polyurethane,PU)、氟化乙烯丙烯(fluorinated ethylene propylene,FEP)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚乙烯(polyethylene,PE)例如高密度PE(high-density PE,HDPE)或低密度PE(low-density PE,LDPE),或其组合,优选PVC、PU或其组合。可通过本领域已知的任何方法或装置对塑料进行灭菌。例如,可用环氧乙烷对塑料进行处理。
在一些特别的实施方案中,所述***还包含过滤装置(7),所述过滤装置(7)配置成将玻璃颗粒和/或碎片保留在第一容器的第一容纳空间内,同时使得本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物离开第一容器的第一容纳空间进入到第四容器的第四容纳空间中。如果存在以下情况,则第一容纳空间的第三开口可作为这样的过滤装置(7)发挥作用:第三开口配置成将玻璃颗粒保留在第一容纳空间内同时使得本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物离开第一容纳空间进入到第四容纳空间中,例如通过提供直径小于最小玻璃颗粒的颗粒尺寸或直径的第三开口或者提供包含孔径小于最小玻璃颗粒的颗粒尺寸或直径的滤器(例如网格)的第三开口。
在一些特别的实施方案中,过滤装置(7)与第一容器的第一容纳空间和第四容器的第四容纳空间流体连通。在一些特别的实施方案中,过滤装置(7)定位在第一容器的第一容纳空间中的第三开口与第四容器的第四容纳空间之间。例如,过滤装置(7)可存在于第一容器的第一容纳空间中的第三开口与第四容器的第四容纳空间之间的导管装置(例如,本文中其他地方所述的管)中。
在一些特别的实施方案中,过滤装置(7)是一个或更多个(例如,一个、两个、三个、四个、五个或更多个)滤器。在一些特别的实施方案中,过滤装置(7)包含至少一个滤器,其孔径小于最小玻璃颗粒的颗粒尺寸或直径,例如孔径小于3.0mm。在一些更具体的实施方案中,过滤装置(7)包含至少一个滤器,其孔径小于0.20μm。
在一个优选实施方案中,本文中教导的***包含:
-第一容器(1),其具有容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)的第一容纳空间(1’),所述第一容纳空间(1’)配置成接收由第二容器(2)的第二容纳空间(2’)容纳的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;其中第一容纳空间包含:
-第一开口,优选可密封开口,其配置成连接至第三容器(5)的第三容纳空间(5’)的开口;
-第二开口,优选可密封开口,其配置成连接至第二容器(2)的第二容纳空间(2’)的开口;
-第三开口,优选可密封开口,其配置成连接至第四容器的第四容纳空间的开口;
-第三容器(5),其具有容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)的第三容纳空间(5’);
-第一管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第一开口保持并且远端由第三容纳空间(5’)中的开口保持,其中所述管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)连接至第三容器(5),并且使第一容纳空间(1’)与第三容纳空间(5’)流体连通;
-第二管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第二开口保持并且远端可连接至第二容纳空间(2’),其中所述第二管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)连接至第二容器(2),并且使第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)流体连通;
-第三管,其近端由第一容纳空间(1’)中的第三开口保持并且远端可连接至第四容器的第四容纳空间,其中所述管配置成优选地以无泄漏方式将第一容器(1)与第四容器连接,并且使第一容纳空间(1’)与第四容纳空间流体连通;以及
-任选地过滤装置(7),其定位在第一容纳空间(1’)中的第三开口与第四容纳空间之间;
其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60克/ml所述富血小板血液组合物,并且比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述富血小板血液组合物。
在一些特别的实施方案中,比值Qgp∶Qbc(g/ml)为0.010至1.0、0.010至0.60、0.050至0.60、0.10至0.50、0.10至0.450、0.10至0.40、0.10至0.350、0.10至0.30、0.150至0.30或0.20至0.30,优选0.10至0.40。例如0.20g/ml。
在一些特别的实施方案中,比值Qcc∶Qbc(μmol/ml)为0.010至20.0、0.050至20.0、0.10至15.0、0.050至12.0、1.0至12.0、0.050至10.0、0.50至10.0、1.0至10.0、1.0至9.0、1.0至8.0、1.0至7.0、1.0至6.0、2.0至10.0、2.0至9.0、0.050至8.0、2.0至8.0、3.0至8.0、2.0至7.0、3.0至7.0、2.0至6.0或3.0至6.0,优选1.0至12.0或2.0至10.0,更优选3.0至8.0。例如,4.0或5.0μmol/ml。
在一些特别的实施方案中,Qbc为100.0ml至500.0ml,Qgp为20.0g至100.0g并且Qcc为2.0μmol至10.0μmol。
在一些特别的实施方案中,第一容纳空间的体积为5.0ml至50 000.0ml、10.0ml至10 000.0ml、10.0ml至5 000.0ml、10.0ml至2 500.0ml、10.0ml至1 000.0ml、50.0ml至750.0ml、50.0ml至500.0ml、100.0ml至500.0ml、150.0ml至450.0ml,优选100.0至500.0ml。
在一些特别的实施方案中,第三容纳空间的体积为第一容纳空间体积的至多5.0%(v/v)、至多4.0%(v/v)、至多3.0%(v/v)、至多2.0%(v/v)、或至多1.0%(v/v),优选至多1.0%(v/v)。
在一些特别的实施方案中,第三容纳空间的体积为0.10ml至25.0ml、0.50ml至20.0ml、1.0ml至15.0ml、5.0ml至15.0ml、5.0ml至10.0ml,优选1.0至15.0ml。
技术人员将理解,关于本文中教导的用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物或裂解物的用途和方法(例如关于玻璃颗粒和水溶性钙盐的类型)的一些特别的实施方案也可适用于本文中教导的***。
另一个方面提供了本文中教导的***用于产生血小板释出物或血小板裂解物的用途。
另一个方面提供了用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的方法,其包括以下步骤:
a)使所述样品与每ml所述样品0.010g至0.60g的玻璃颗粒和每ml所述样品0.10μmol至20.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触,从而获得混合物;
b)使步骤a)中获得的混合物凝固,从而获得凝固物和血小板释出物;以及
c)从所述混合物中回收步骤b)中获得的血小板释出物。
本文中使用的术语“接触”意指使一种或更多种第一组分(例如一种或更多种分子、生物实体或材料)与一种或更多种第二组分(例如一种或更多种分子、生物实体或材料)以这样的方式在一起:第一组分可(如果能够由此)结合或调节第二组分,或者第二组分可(如果能够由此)结合或调节第一组分。这样的调节可直接发生,即通过第一与第二组分之间的直接相互作用;或者间接发生,例如当第一组分与一种或更多种另外的组分相互作用或调节一种或更多种另外的组分,所述一种或更多种另外的组分中的一种或更多种进而与第二组分相互作用或调节第二组分时,反之亦然。根据上下文,术语“接触”可与“暴露”、“孵育”、“混合”、“反应”、“处理”等同义。
在一些特别的实施方案中,样品与每ml样品0.010g至1.0g、0.010g至0.60g、0.050g至0.60g、0.10g至0.50g、0.10g至0.450g、0.10g至0.40g、0.10g至0.350g、0.10g至0.30g、0.150g至0.30g或0.20g至0.30g的玻璃颗粒、优选每ml样品0.10g至0.40g的玻璃颗粒接触。
在一些特别的实施方案中,样品与每ml样品0.010μmol至20.0μmol、0.050μmol至20.0μmol、0.10μmol至15.0μmol、0.050μmol至12.0μmol、1.0μmol至12.0μmol、0.050μmol至10.0μmol、0.50μmol至10.0μmol、1.0μmol至10.0μmol、1.0μmol至9.0μmol、1.0μmol至8.0μmol、1.0μmol至7.0μmol、1.0μmol至6.0μmol、2.0μmol至10.0μmol、2.0μmol至9.0μmol、0.050μmol至8.0μmol、2.0μmol至8.0μmol、3.0μmol至8.0μmol、2.0μmol至7.0μmol、3.0μmol至7.0μmol、2.0μmol至6.0μmol或3.0μmol至6.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐、优选每ml样品1.0μmol至12.0μmol或2.0μmol至10.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐、更优选每ml样品3.0至8.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触。例如,每ml样品4.0μmol或5.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐。
在一些特别的实施方案中,样品与0.010mM至20.0mM、0.050mM至20.0mM、0.10mM至15.0mM、0.050mM至12.0mM、1.0mM至12.0mM、0.050mM至10.0mM、0.50mM至10.0mM、1.0mM至10.0mM、1.0mM至9.0mM、1.0mM至8.0mM、1.0mM至7.0mM、1.0mM至6.0mM、2.0mM至10.0mM、2.0mM至9.0mM、0.050mM至8.0mM、2.0mM至8.0mM、3.0mM至8.0mM、2.0mM至7.0mM、3.0mM至7.0mM、2.0mM至6.0mM或3.0mM至6.0mM一种或更多种水溶性钙盐,优选1.0mM至12.0mM或2.0mM至10.0mM一种或更多种水溶性钙盐,更优选3.0mM至8.0mM一种或更多种水溶性钙盐接触。例如,4.0mM或5.0mM一种或更多种水溶性钙盐。
在一些特别的实施方案中,样品与每ml所述样品0.10g至0.40g的玻璃颗粒和每ml所述样品3.0μmol至8.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触。例如,样品与每ml样品约0.100至0.300g的玻璃颗粒、例如每ml样品约0.150至0.250g的玻璃颗粒、例如每ml样品约0.200g的玻璃颗粒和每ml样品4.0至6.0μmol、例如约5.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法的步骤a)(即,使样品与玻璃颗粒和钙盐接触)包括使用混合装置例如旋转器、搅拌器或摇床(例如摇摆摇床)将样品、玻璃颗粒和一种或更多种水溶性钙盐混合。
本文中使用的术语“凝固”或“凝块”是指从全血或全血衍生物形成完全收缩的凝固物或凝块的顺序过程。凝固可通过活化内源性或外源性凝血途径引起。两种途径均导致凝血因子Xa的产生。凝血因子Xa的活化将引起常见的凝血途径,其最终导致凝固物或凝块的形成。外源性途径通常由对组织因子(tissue factor,TF)做出响应而引起,这可在血管的外表面与内表面之间存在开放连接(例如破裂的血管)时发生。TF活化因子VII,从而形成因子VIIa,这触发了导致快速产生因子Xa的级联反应。在另一方面,内源性途径被血管内发生的损伤活化。该途径由因子XII的活化引起。因子XII活化为因子XIIa可在当血液与带负电荷的表面接触时,例如与非生物基质接触时的任何时间发生。交叉活化可在内源性途径与外源性途径之间发生。例如,除活化因子Xa之外,因子VIIa还活化因子IX,所述因子IX是内源性途径的必要组分。因子Xa的产生导致凝血酶原(因子II)切割为凝血酶(因子IIa)。接下来,凝血酶催化纤维蛋白原(因子I)转化为不溶性纤维蛋白的长黏性线。纤维蛋白线形成捕获血小板、血浆以及任选地血细胞的网。纤维蛋白网络随后收缩并挤出其原始流体内容物的至少95%,也称为凝块收缩,从而获得凝固物或凝块和排出的流体。
通过使用与本文中教导的一种或更多种水溶性钙盐组合的玻璃颗粒,将形成稳定的凝固物截留玻璃颗粒以及血小板残留物(remnant)。通过本文中教导的方法、用途或方法获得的血小板释出物或血小板裂解物在使用之前将需要较少的过滤或不需要过滤,因为血小板被捕获在由玻璃颗粒稳定的凝固物中。
在一些特别的实施方案中,玻璃颗粒和一种或更多种水溶性钙盐是在本文中教导的用途或方法中使用的唯一凝血活化剂(即,除了已存在于富血小板血液组合物中的潜在凝血活化剂例如FXII之外)。重要的是,在一些实施方案中,不添加另外的血液凝血活化剂。
本文中使用的术语“凝血活化剂”是指可通过内源性和/或外源性凝血途径引起凝血的物质。凝血活化剂的一些非限制性实例包括:凝血酶(例如如外源性人纯化的或重组的凝血酶或(冻干的)牛凝血酶)、组织因子(例如如外源性兔组织因子或者纯化的或重组的人组织因子)、与氨基磷脂组合的合成磷脂、Russel蝰蛇毒(Russel’s viper venom)、蛇静脉酶(ecarin)、textarin、鞣花酸(elagic acid)、高岭土和其他黏土矿物。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用途或方法不包括使用本文中定义的一种或更多种凝血活化剂。
在一些特别的实施方案中,在本文中教导的方法的步骤b)(即,使混合物凝固)中,使所述混合物凝固以下时间:1小时至20小时、1至18小时、1至16小时、1至14小时、1至12小时、1至10小时、1至8小时、1至6小时、1至4小时,优选2至6小时,更优选2至4小时。例如,使所述混合物凝固3小时的时间。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法的步骤b)在5℃至42℃、15℃至40℃、20℃至40℃、15℃至25℃、20℃至25℃,优选15℃至40℃的温度下进行。例如,本文中教导的方法的步骤b)在室温下或在约37℃下进行。在使富血小板血液组合物与玻璃颗粒和一种或更多种水溶性钙盐接触并且使步骤a)中获得的混合物凝固从而获得凝固物和血小板释出物之后,优选地从全部或部分血小板释出物中移除(例如被凝固物包围的)玻璃颗粒,以防止玻璃颗粒干扰血小板释出物的进一步使用。因此,在一些特别的实施方案中,从样品中回收(即,从与(例如被凝固物包围的)玻璃颗粒的物理接触中移除)至少部分,优选地基本上全部(例如,至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%,优选至少95%)血小板释出物。
在一些特别的实施方案中,在所述步骤c)中,通过简单地收集包含释出物的液相或通过离心来从混合物中回收在步骤b)中获得的所述血小板释出物。
在一些特别的实施方案中,在所述步骤c)中,通过使混合物通过至少一个滤器来从混合物中回收在步骤b)中获得的所述血小板释出物。
本文中使用的术语“滤器”具有其普通含义,因为它是指使液体通过其以去除悬浮的杂质或固体颗粒和/或回收固体的多孔物质、装置或膜。
在一些特别的实施方案中,滤器是膜滤器,例如微孔硝化纤维素、聚氨酯和/或聚酯膜。
术语“孔径”是指膜表面或滤器上一个或更多个孔的平均尺寸。孔径还与滤器过滤出特定尺寸颗粒的能力相关。例如,孔径为0.50μm的滤器将从过滤流中过滤出直径为0.50μm或更大的颗粒。孔径可通过技术人员已知的确定孔径的任何方法,例如使用扫描电子显微镜的视觉检查、孔隙度测量法、相关光谱学和/或单粒子追踪来确定。孔可以是圆柱形孔或海绵孔。
在一些特别的实施方案中,滤器具有至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个)孔。
在一些特别的实施方案中,在所述步骤c)中,通过使混合物通过至少一个(例如一个、二个、三个、四个、五个或更多个)滤器来从混合物中回收在步骤b)中获得的所述血小板释出物,其中所述至少一个滤器的孔径小于最小玻璃颗粒的颗粒尺寸或直径。滤器可以是本领域已知的用于过滤血小板释出物或血小板裂解物的任何滤器,例如MZP SeriesCapsules的MZP(ZenPure,Hitma)、GF Plus滤器(Sartorius stedimbiotech)和PP3滤器(Sartorius stedim biotech)。
在一些特别的实施方案中,在所述步骤c)中,通过使混合物通过至少一个滤器(例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个)来从混合物中回收在步骤b)中获得的所述血小板释出物,其中所述至少一个滤器的孔径小于最小玻璃颗粒的颗粒尺寸或直径,并且小于0.2μm。
在一些特别的实施方案中,使血小板释出物通过滤器可通过技术人员已知的任何方法来实现。例如,使血小板释出物通过滤器可通过重力、真空或压力来实现。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物的方法不包括裂解存在于富血小板血液组合物中的血小板的步骤。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法任选地包括裂解存在于富血小板血液组合物中的血小板以获得血小板裂解物。如果存在这样的裂解步骤,则本文中教导的方法将是用于制备血小板裂解物的方法,并且将从如此获得的凝固物和/或血小板释出物中获得血小板裂解物。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法任选地包括裂解存在于步骤b)中获得的凝固物和/或获得的血小板释出物中的血小板,从而获得血小板裂解物。血小板裂解可通过本领域已知的用于裂解血小板的任何方法,包括冻融循环、声处理、化学裂解(例如使用Triton X-100)、机械破坏和液体或高压均质来获得。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的方法还包括至少一个(例如一个、二个、三个、四个、五个或更多个)冷冻和解冻步骤b)中获得的凝固物和/或血小板释出物的步骤,从而获得血小板裂解物。对步骤b)中获得的凝固物和/或血小板释出物进行冷冻和解冻可通过本领域已知的用于冷冻和解冻富血小板血液组合物以破坏血小板的任何方法来进行。例如,如在Fekete et al,Platelet lysate from whole blood-derived pooledplatelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for theisolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells:production process,content and identification of activecomponents.Cytotherapy2012;14(5):540-54)中所述。技术人员将理解,将冻融循环次数提高至多于三次可能不进一步提高血小板裂解物中的生长因子浓度(Strandberg et al.,Standardizing the freeze-thaw preparation of growth factors from plateletlysate.Transfusion,2017;57(4):1058-65)。此外,冻融循环通常耗费时间并且可损坏容纳血小板裂解物的容器。鉴于此,本文中教导的方法优选地包含至多三个、至多两个或至多一个,优选至多一个冷冻和解冻步骤。
在一些特别的实施方案中,步骤a)中获得的混合物在-20℃或更低、-25℃或更低、-30℃或更低、-35℃或更低、-40℃或更低、-45℃或更低、-50℃或更低、-55℃或更低、-60℃或更低、-65℃或更低、-70℃或更低、-75℃或更低、-80℃或更低、-100℃或更低、-150℃或更低、-200℃或更低,优选-80℃或更低下冷冻。例如,步骤a)中获得的混合物在-80℃的温度下或-196℃至-210℃的温度下(例如在液氮中)冷冻。
在一些特别的实施方案中,步骤a)中获得的混合物冷冻至少0.5小时、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时、至少20小时、至少22小时、至少24小时、至少26小时、至少28小时或至少30小时,优选至少24小时。例如,步骤a)中获得的混合物冷冻24小时。
在一些特别的实施方案中,步骤a)中获得的混合物在至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少36℃或至少37℃的温度下冷冻之后解冻。例如,步骤a)中获得的混合物可在4℃下(例如在冰箱中)、在室温下或在37℃下(例如在温水浴中)解冻。
在一些特别的实施方案中,至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)冷冻和解冻步骤在步骤c)之前进行。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物的方法包括储存步骤c)中回收的血小板释出物的步骤。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物的方法包括冻干血小板释出物或血小板裂解物的步骤。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物或裂解物的方法不包括向富血小板组合物、玻璃颗粒、一种或更多种水溶性钙盐、血小板释出物和/或血小板裂解物主动添加非人哺乳动物的多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物或核酸的步骤。例如,本文中教导的用于制备血小板释出物或裂解物的方法不包括向富血小板组合物、玻璃颗粒、一种或更多种水溶性钙盐、血小板释出物和/或血小板裂解物主动添加来源于非人哺乳动物的肝素(例如牛或猪肝素)的步骤。
目前,当前现有的用于制备血小板释出物或裂解物的方法未在封闭***中进行,这提高了血小板释出物或裂解物被环境病原体污染的风险。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物或血小板裂解物的方法在无菌条件下进行并且在基本上封闭的***中进行。作为此结果,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物或血小板裂解物基本上不含环境病原体(即在开始本文中教导的方法之前富血小板血液组合物中尚不存在的病原体)。
在一些特别的实施方案中,使用本文中教导的用于制备血小板释出物的***来进行本文中教导的用于制备血小板释出物的方法。
在一个优选实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物的方法包括以下步骤:
-使第一容器(1)的第一容纳空间(1’)与第二容器(2)的第二容纳空间(2’)流体连通;其中所述第一容纳空间(1’)(i)配置成接收由第二容器(2)的第二容纳空间(2’)容纳的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;以及(ii)容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3)和一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4);并且其中所述第二容纳空间(2’)容纳一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;
-使富血小板血液组合物从第二容纳空间(2’)流入第一容纳空间(1’);
-任选地破坏第二容纳空间(2’)与第一容纳空间(1’)之间的流体连通;
-将富血小板血液组合物、玻璃颗粒(3)和一种或更多种水溶性钙盐(4)混合,从而获得混合物;
-使获得的混合物凝固,从而获得凝固物和血小板释出物;
-使第一容器(1)的第一容纳空间(1’)与第四容器的第四容纳空间流体连通,其中第四容纳空间配置成接收和/或容纳使用该***制备的血小板释出物;
-从混合物中回收步骤b)中获得的血小板释出物;以及
-任选地破坏第四容纳空间与第一容纳空间(1’)之间的流体连通。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的用于制备血小板释出物的方法包括以下步骤:
-使第一容器(1)的第一容纳空间(1’)与第二容器(2)的第二容纳空间(2’)流体连通;其中所述第二容纳空间(2’)容纳一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;其中所述第一容纳空间(1’)(i)配置成接收第二容器(2)的第二容纳空间(2’)中所包含的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;(ii)容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3);以及(iii)包含第一开口,所述第一开口配置成与第三容器(5)的第三容纳空间(5’)的开口连接,并且其中所述第三容纳空间(5’)包含一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4);
-使富血小板血液组合物从第二容纳空间(2’)流入第一容纳空间(1’);
-任选地破坏第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)之间的流体连通;
-使容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)的第三容器(5)的第三容纳空间(5’)与第一容纳空间(1’)流体连通,使得一种或更多种水溶性钙盐(4)从第三容纳空间(5’)流入第一容纳空间(1’);以及任选地破坏第三容纳空间(5’)与第一容纳空间(1’)之间的流体连通;
-将富血小板血液组合物、玻璃颗粒和一种或更多种水溶性钙盐混合,从而获得混合物;
-使所获得的混合物凝固,从而获得凝固物和血小板释出物;
-使第一容器(1)的第一容纳空间(1’)与第四容器的第四容纳空间流体连通;
-从混合物中回收步骤b)中获得的血小板释出物(6);以及
-任选地破坏第四容纳空间与第一容纳空间(1’)之间的流体连通。
在一些特别的实施方案中,使第二容器(2)的第二容纳空间(2’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通、使第三容器(5)的第三容纳空间(5’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通;和/或使第四容器的第四容纳空间与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通是通过本领域已知的无菌管连接来进行的。
这种方式,本文中公开的方法和***提供了用于制备血小板释出物或血小板裂解物的完全无菌且封闭的***。
在一些特别的实施方案中,如果例如第三容器是包含空心针的注射器,则使第三容器(5)的第三容纳空间(5’)与第一容纳空间(1’)流体连通可通过将一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4)注入来进行。
在一些特别的实施方案中,使第二容器(2)的第二容纳空间(2’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通和/或破坏第一容纳空间(1’)与第二容纳空间(2’)之间的流体连通可通过焊接进行。例如,为了使第二容器(2)的第二容纳空间(2’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通,可如本领域已知的将与第一容纳空间(1’)流体连通的管焊接至与第二容纳空间(2’)流体连通的管。
类似地,在一些特别的实施方案中,使第三容器(3)的第三容纳空间(3’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通可通过焊接进行。例如,为了使第三容器(3)的第三容纳空间(3’)与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通,可将与第三容纳空间(3’)流体连通的管焊接至与第一容纳空间(1’)流体连通的管。
在一些特别的实施方案中,使第四容器的第四容纳空间与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通和/或破坏第一容纳空间(1’)与第四容纳空间之间的流体连通可通过焊接进行。例如,为了使第四容器的第四容纳空间与第一容器(1)的第一容纳空间(1’)流体连通,可如本领域已知的将与第一容纳空间(1’)流体连通的管焊接至与第四容纳空间(2’)流体连通的管。
在一些特别的实施方案中,使用无菌管焊机进行焊接。例如,来自TerumoTM的II或无菌管焊机。技术人员将理解,关于本文中教导的用于制备血小板释出物的用途和***的一些特别的实施方案也适用于用于从本文中教导的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的方法,并且反之亦然。另一个方面提供了通过本文中教导的方法获得的血小板释出物。
在一些特别的实施方案中,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物包含凝血因子、小分子、能当量、趋化因子、细胞因子、黏附分子、激素、免疫分子和生长调节剂(或生长因子)、细胞***调节剂、凋亡调节剂和/或血管生成调节剂和/或附着因子。
本文中使用的术语“附着因子”是指具有黏附能力并提高锚定依赖性细胞与基底例如细胞培养瓶之间的细胞-基底相互作用的结构蛋白或蛋白质样物质。附着因子的一些非限制性实例包括纤连蛋白、玻连蛋白、冯·维勒布兰德因子(Von willebrand factor)、糖盏蛋白(glycocalicin)和sCD62P。
在一些特别的实施方案中,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物包含选自以下的一种或更多种生长因子:血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血小板来源生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子-β(transforming growthfactor-beta,TGF-β)、***(IGF)、表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)、血小板因子4和血管生成素。血小板释出物中这些生长因子的存在或不存在可通过本领域已知的任何方法,例如免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹)和蛋白质组测定来确定。
在一些特别的实施方案中,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物包含选自以下的一种或更多种激素:羟色胺、肾上腺素、组胺、血栓烷、***素、神经酰胺和鞘脂。
另一个方面提供了通过本文中教导的方法获得的血小板裂解物。
在一些特别的实施方案中,优选地当在680nm的波长下测量时,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物或血小板裂解物的透光率为蒸馏水透光率的至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
在一些特别的实施方案中,优选地当在680nm的波长下测量时,通过本文中教导的方法获得的血小板释出物或血小板裂解物的透光率为蒸馏水透光率的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%,优选至少90%,其中本文中教导的方法包括至少一个使血小板释出物或血小板裂解物通过孔径为至多0.2μm的滤器的步骤。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在凝固之后包含以下的残余Ca2+浓度:至多1.5mM、至多1.4mM、至多1.3mM、至多1.2mM、至多1.1mM、至多1mM、至多0.9mM、至多0.8mM、至多0.7mM、至多0.6mM、至多0.5mM、至多0.4mM、至多0.35mM、至多0.34mM、至多0.33mM、至多0.32mM、至多0.31mM、至多0.3mM、至多0.29mM、至多0.28mM、至多0.27mM、至多0.26mM或至多0.25mM,优选至多0.35mM。血小板释出物或血小板裂解物中Ca2+(即钙离子)的浓度可通过本领域已知的用于确定Ca2+离子的任何方法,例如通过使用内置离子选择电极的血气分析来确定。
在一些特别的实施方案中,例如如果血小板释出物或血小板裂解物从人富血小板的血液组合物中获得,则本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物基本上不含来源于非人哺乳动物的任何多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物(例如多糖)或核酸。当本文中提及来源于非人哺乳动物的多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物(例如多糖)或核酸时使用的术语“基本上不含”是指未向其主动添加(即不固有地存在于其中)非人哺乳动物的多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物或核酸的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物。例如,本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物基本上不含来源于非人哺乳动物的肝素,例如牛或猪肝素。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物可包含在药物组合物或化妆品组合物中。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物是液体、半固体或固体。本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物的固体形式可通过冻干该血小板释出物或血小板裂解物来获得。
另一个方面提供了药物组合物,其包含本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物以及任选地一种或更多种可药用载体。
另一个方面提供了化妆品组合物,其包含本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物以及任选地一种或更多种化妆品可接受的载体。
另一个方面提供了包含富血小板血液组合物的组合物,其除存在于富血小板血液组合物中的Ca2+离子之外,还具有0.10mM至20.0mM Ca2+离子,以及0.010g至0.60g玻璃颗粒/ml所述富血小板血液组合物。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的组合物包含激素、生长因子和/或附着因子。这些激素、生长因子和/或附着因子通常从富血小板血液组合物中存在的血小板释放。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的组合物包含选自以下的一种或更多种生长因子:血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、***(IGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板因子4和血管生成素。组合物中这些生长因子的存在或不存在可通过本领域已知的任何方法,例如免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹)和蛋白质组测定来确定。
在一些特别的实施方案中,所述组合物包含在容器,优选医用级容器中。合适容器的一些非限制性实例包括医用级转移袋、烧瓶或瓶。
因此,本文中还提供了包含本文中教导的组合物的容器。
在一些特别的实施方案中,所述组合物或包含所述组合物的容器在-210℃至25℃的温度下储存。例如,所述组合物或容器可在-196℃至-210℃的温度下(例如在液氮中)、-80℃的温度下(例如在冷冻机中)、-20℃的温度下(例如,在冷冻机中)、4℃的温度下(例如,在冰箱中)或室温下储存。如果所述组合物或容器在室温下储存,则组合物优选地在储存之前冻干。所述组合物可储存多至一年或更长的时间(例如2年)。
另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物,其用作药物。
本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物可用于治疗许多医学次级专业领域(包括风湿病学、骨科、皮肤病学、牙科学、口腔学、眼科学、妇科学、内分泌学和整形外科)中的疾病或病症。这样的疾病或病症的一些非限制性实例包括创伤(例如慢性或急性创伤)、硬组织(例如骨)和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、骨坏死、眼表疾病、神经退行性疾病、外周动脉疾病、骨关节炎、椎间盘退变、肩袖损伤、奈绳肌损伤、大转子疼痛综合征(greater trochanteric pain syndrome)、关节成形术、腕管综合征、上髁炎、足底筋膜炎、肌腱病、白癜风、脱发、黑斑病(melisma)、静脉腿溃疡、烧伤、(痤疮)瘢痕、牙植入、牙槽裂、牙髓操作、颌面外科手术、青光眼并发症、神经营养性角膜溃疡、严重干眼综合征、苔藓硬化(lichen sclerosis)、子宫内膜疾病、***萎缩、糖尿病溃疡和术后感染、肿胀和疼痛。
另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物,其用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病(例如腱炎、牙周炎、足底筋膜炎、转子滑囊炎和上髁炎)、骨疾病(例如骨坏死)、退行性关节病(例如骨关节炎)、退行性椎间盘疾病(例如椎间盘退变)、皮肤病症(例如苔藓硬化、皮肤色素异常(例如白癜风和黑斑病))、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病(例如严重干眼综合征、青光眼并发症例如干眼)、腕管综合征、神经退行性疾病(例如帕金森病(Parkinson’sdisease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease))、外周动脉疾病和疼痛(例如术后疼痛、神经根痛和下背痛(low back pain,LBP)、膝痛、踝痛、髋痛和肩痛),所述治疗包括向对象施用有效量的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物。
另一方面提供了用于治疗以下的方法:硬组织和软组织损伤、炎性疾病(例如腱炎、牙周炎、足底筋膜炎、转子滑囊炎和上髁炎)、骨疾病(例如骨坏死)、退行性关节病(例如骨关节炎)、退行性椎间盘疾病(例如椎间盘退变)、皮肤病症(例如苔藓硬化、皮肤色素异常(例如白癜风和黑斑病))、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病(例如严重干眼综合征、青光眼并发症例如干眼)、腕管综合征、神经退行性疾病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)、***动脉疾病和疼痛(例如术后疼痛、神经根痛和下背痛(LBP)、膝痛、踝痛、髋痛和肩痛),所述方法包括向对象施用有效量的本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物。
术语“治疗”涵盖对已发展的疾病或病症的治疗性治疗(例如对已发展的硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛的治疗)以及预防性或预防措施二者,其中目的是预防或降低不期望痛苦的发生机会,例如预防硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛的发生、发展和进展。有益或期望的临床结果可包括但不限于减轻一种或更多种症状或者一种或更多种生物标志物、减轻疾病的程度、使疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态等。与如果不接受治疗的预期存活相比,“治疗”也可意味着延长存活。
本文中关于本文中教导的血小板释出物或裂解物的治疗性用途所使用的术语“有效量”是指外科医生、研究者、兽医、医学博士或其他临床医生所寻求的在对象中引起生物学或医学响应(“治疗有效量”)和/或在对象中抑制或延迟病症发作(“预防有效量”)(其尤其可包括减轻所治疗疾病或病症的症状)的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物或者包含本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物的量。用于确定本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物或者包含本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物的治疗和/或预防有效剂量的方法是本领域已知的。
硬组织和软组织损伤的一些非限制性实例包括溃疡(例如神经营养性角膜溃疡、糖尿病足溃疡、静脉腿溃疡、压力溃疡和肛裂)、手术创伤、烧伤和瘢痕。由于本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物可用于治愈硬组织(例如骨)以及软组织(例如皮肤),因此本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的药物组合物可用于治愈由以下造成的组织损伤:肩袖损伤、奈绳肌损伤、牙植入、牙槽裂修复、牙髓操作、颌面外科手术、关节成形术、睑成形术和面部注脂术。另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的化妆品组合物用于改善皮肤和/或毛发外观用途。
在一些特别的实施方案中,用于使皮肤恢复活力、改善皮肤和/或毛发外观的本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的化妆品组合物的用途包含减少皱纹(例如面部皱纹)和瘢痕、提高皮肤的紧致性(firmness)和弹性、改善皮肤的质地、皮肤色调和/或色泽和/或提高毛发生长、毛发数量、毛发厚度和/或毛发周期生长期。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的化妆品组合物用于改善皮肤和/或毛发外观的用途包括在皮肤上表面施用一定体积的本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的化妆品组合物,或者优选地通过微针刺在皮肤的表皮、真皮或皮下注射一定体积的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物。
在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物、血小板裂解物或者包含血小板释出物或血小板裂解物的化妆品组合物用于改善皮肤和/或毛发外观的用途不是治疗方法。
本发明人发现,本文中教导的方法允许制备这样的血小板释出物或血小板裂解物,当将其添加至生长培养基时不导致形成沉淀。
因此,另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在体外细胞培养或组织培养中的用途。
另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物用于在体外维持细胞或组织和/或用于改善体外细胞生长的用途。
在一些特别的实施方案中,当与如果细胞的生长培养基补充有相同量的血清(更特别地FBS)的细胞生长相比时,在细胞的生长培养基中使用本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物可将细胞的生长提高约2倍至约5倍。
另一个方面提供了本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在生长培养基中作为血清例如FBS的替代物的用途。在一些特别的实施方案中,本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在体外细胞培养或组织培养中或者用于在体外维持细胞或组织和/或用于改善体外细胞生长的用途包括向细胞的生长培养基添加有效量的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物。
类似地,另一个方面提供了用于在体外维持细胞或组织或者用于改善体外细胞生长的体外方法,其包括向细胞的生长培养基添加有效量的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物。
本文中关于本文中教导的血小板释出物或裂解物的体外用途所使用的术语“有效量”是指引起期望的体外生物学响应的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物的量。用于确定本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在体外细胞和/或组织培养中的有效剂量的方法是本领域已知的。
本文中使用的术语“生长培养基”或“培养基”是指设计成支持细胞或组织生长的固体、液体或半固体。生长培养基通常包含大量元素养分(macronutrient)(例如氮、磷、钾、钙、镁或硫)、微量元素养分(micronutrient)(例如铁、锰、锌、硼、铜、钼)、维生素、氨基酸、一种或更多种糖(例如葡萄糖)、无机盐和/或蛋白质(例如转铁蛋白)。生长培养基是本领域公知的并且可根据所培养细胞或组织的类型以及培养的目的(例如分化、扩增或维持)而变化。生长培养基的一些非限制性实例包括Eagle极限必需培养基(Minimum EssentialMedium,MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)、α改良极限必需培养基(α-MEM)、基础必需培养基(Basal Medium Essential,BME)、Iscoce改良Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、改良的Eagle必需培养基(Essential Modified Eagle′s Medium,EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth MB 752/1或Williams培养基E、间充质干细胞基础培养基及其修改和/或组合。
在一些特别的实施方案中,生长培养基包含CaCl2、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl和磷酸根或其盐。
在一些特别的实施方案中,生长培养基是DMEM,例如低葡萄糖和低丙酮酸钠DMEM。在一些特别的实施方案中,生长培养基是DMEM并且包含约0.2g/L CaCl2、约0.1g/L MgSO4、约0.4g/L KCl、约3.7g/L NaHCO3、约6.4g/L NaCl和约0.1g/L Na2HPO4。
在一些特别的实施方案中,在本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物在体外细胞培养或组织培养中或者用于改善体外细胞生长的用途中,血小板释出物或血小板裂解物的有效量包括添加有效量的本文中教导的血小板释出物或血小板裂解物并且本文中教导的用于改善细胞生长的方法是生长培养基的至少0.5%(v/v)、至少1.0%(v/v)、至少2.0%(v/v)、至少3.0%(v/v)、至少4.0%(v/v)、至少5.0%(v/v)、至少6.0%(v/v)、至少7.0%(v/v)、至少8.0%(v/v)、至少9.0%(v/v)、至少10.0%(v/v)、至少11.0%(v/v)、至少12.0%(v/v)、至少13.0%(v/v)、至少14.0%(v/v)、至少15.0%、至少20.0%(v/v),优选5%至15%(v/v)、或8%至12%(v/v),例如约10.0%(v/v)。
在一些特别的实施方案中,细胞是多能干细胞(PS),例如哺乳动物PS和人PS,优选人PS。在一些更具体的实施方案中,细胞是经诱导的PS。
术语“干细胞”通常是指非特化的或相对较少特化的且具有增殖能力的细胞,其能够自我更新,即可增殖而不分化,并且其或其子代可产生至少一种相对较多特化的细胞类型。该术语涵盖能够基本上无限自我更新的干细胞(即,其中干细胞的子代或其至少一部分基本上保留了非特化或相对较少特化的表型、分化潜能和母干细胞的增殖能力),以及显示有限自我更新的干细胞(即,其中其子代或一部分进一步增殖和/或分化的能力与母细胞相比明显降低)。通过实例而非限制的方式,干细胞可产生这样的后代,其可沿一种或更多种谱系分化以产生越来越多的相对较多特化的细胞(其中这样的后代和/或越来越多的相对更多特化的细胞本身可以是本文中定义的干细胞),或者甚至以产生最终分化细胞,即完全特化的细胞,其可以是有丝***后的。
本文中使用的限定词“多能”表示细胞产生源自生物体的所有三种胚层(即,中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型的能力,以及潜在地能够产生生物体的任何和全部细胞类型的能力,但是不能生长成整个生物体。
在一些特别的实施方案中,细胞是选自以下的多能干细胞(PS):间充质干细胞(MSC)、血液来源干细胞(blood-derived stem cell,BDSC)、脐带血来源干细胞(UCBSC)和骨髓来源干细胞(BMSC)。在一些优选实施方案中,细胞是MSC。
本文中使用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指成体中胚层来源的干细胞,其能够产生间充质谱系的细胞,通常是两个或更多个间充质谱系的细胞,更通常地三个或更多个间充质谱系,例如,软骨-成骨细胞(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、腱细胞(腱)、成纤维细胞(***)、脂肪细胞(脂肪)和基质生成(骨髓基质)谱系。MSC可分离自生物样品,优选人对象的生物样品,例如,骨髓、小梁骨、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮),特别是胎儿和青少年皮肤、骨膜、牙髓、腱和脂肪组织。
术语“MSC”还涵盖MSC的子代,例如,通过获自动物或人对象的生物样品的MSC的体外或离体增殖(繁殖/扩增)获得的子代。
在一些特别的实施方案中,生长培养基是适合于培养多能干细胞,优选间充质干细胞的生长培养基。
在一些特别的实施方案中,组织是选自肝组织、脑组织和骨组织的组织。
虽然已结合本发明的一些特别的实施方案对本发明进行了描述,但明显的是,根据前述描述,许多替代、修改和变化对本领域技术人员将是明显的。因此,其旨在包含在所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有如下这样的替代、修改和变化。
以下非限制性实施例进一步支持本文中公开的本发明的一些方面和实施方案。
实施例
实施例1.用于制备本文中教导的人血小板释出物的方法
1.材料和方法
血小板浓缩物
将制备的并且批准用于输注的过期血小板浓缩物(PC)用于制备人血小板释出物(hPR)。在Flanders(Belgium),当PC在捐献之后五天内未被输注时,该PC过期。
制备方法
制备PC(包含约62.5%(v/v)血小板添加剂溶液)、CaCl2和/或钠钙玻璃珠的4种不同组合:
-将15mM CaCl2添加至50ml塑料管中的40ml PC(组合1);
-将4mM CaCl2添加至50ml塑料管中的40ml PC(组合2);
-将10g玻璃珠添加至50ml塑料管中的40ml PC(组合3);或
-将10g玻璃珠和4mM CaCl2添加至50ml塑料管中的40ml PC(组合4)。
使所有4种组合在室温下凝固3小时的时间。
钠钙玻璃珠的直径为3mm。
2.结果
只有组合1和4形成了收缩的凝固物并获得了血小板释出物(图1A至B)。在组合2和3中未观察到凝固并且未获得血小板释出物(图1A)。
这表明钠钙玻璃珠与CaCl2的组合允许较低的CaCl2浓度(即4mM)来制备血小板释出物。
实施例2.用于在封闭***中制备本文中教导的人血小板释出物和血小板裂解物的方法
同一容纳空间中的玻璃珠和CaCl2
将包含350ml PC(包含约62.5%(v/v)血小板添加剂溶液)的PC袋焊接至其初级转移袋包含70g钠钙玻璃珠(直径3mm)的袋***(图2A),从而得到0.2g钠钙玻璃珠/ml和3.5mL404mM CaCl2水溶液(蒸馏并通过高压灭菌进行灭菌)。随后,将空的PC袋焊掉(weld off)。通过温和旋转/搅拌来混合PC、CaCl2和珠。在室温下,将包含PC、玻璃珠和CaCl2的袋***标签朝下放置在桌子上以使凝固进行3小时。在该过程期间,血小板被凝固期间的凝血酶生成活化并且因此通过颗粒胞吐释放生长因子。凝固物最终收缩,此时流体从凝固物内部排出,从形成的凝块释放另外的生长因子(数据未显示),从而获得血小板释出物。如果凝块收缩完成,则通常留下长度9cm乘宽度6cm的稳定凝固物,其截留玻璃珠以及血小板残留物二者。接下来,袋***可在-80℃下储存至少24小时直至进一步使用。解冻之后,将获得血小板裂解物。
在单独容纳空间中的玻璃珠和CaCl2
将包含350ml PC(包含约62.5%(v/v)血小板添加剂溶液)的PC袋焊接至其初级转移袋包含70g钠钙玻璃珠(直径3mm)的袋***(图2B),从而得到0.2g钠钙玻璃珠/ml。接下来,打开包含3.5mL 404mM CaCl2水溶液(蒸馏并通过高压灭菌进行灭菌)的焊接附属物袋的分离套管阀以将内容物释放到包含PC和玻璃珠的转移袋中(图2B)。随后,将空的PC袋和附属物袋焊掉。通过温和旋转/搅拌来混合PC、CaCl2和珠。在室温下,将包含PC、玻璃珠和CaCl2的袋***标签朝下放置在桌子上以使凝固进行3小时。在该过程期间,血小板被凝固期间的凝血酶生成活化并且因此通过颗粒胞吐释放生长因子。凝固物最终收缩,此时流体从凝固物内部排出,从形成的凝块释放另外的生长因子(图3A),从而获得血小板释出物。出于举例说明的目的,将凝固物从袋中移出并在图3B中示出。如果凝块收缩完成,则通常留下长度9cm乘宽度6cm的稳定凝固物,其截留玻璃珠以及血小板残留物二者。接下来,袋***可在-80℃下储存至少24小时直至进一步使用。解冻之后,将获得血小板裂解物。
实施例3.不同浓度的氯化钙和玻璃颗粒的凝固参数
1.材料和方法
对于图5A中所示的结果,制备了PC(包含约62.5%(v/v)血小板添加剂溶液)、CaCl2和/或钠钙玻璃珠的8种不同的组合:
-将5mM CaCl2和2.5g(组合1)、5g(组合2)、7.5g(组合3)或10g(组合4)玻璃珠添加至40ml PC;
-将4mM CaCl2和2.5g(组合5)、5g(组合6)、7.5g(组合7)或10g(组合8)玻璃珠添加至40ml PC。
通过温和倒置来混合所有8种组合并且允许在室温下凝固5小时的时间。
对于图5B中所示的结果,hPR通过以下制备:
-将15mM CaCl2/ml PC(并且没有玻璃珠)添加至350ml PC(包含约62.5%血小板添加剂溶液);或者
-将4mM CaCl2/ml PC和0.20g玻璃珠/ml PC添加至350ml PC(包含约62.5%血小板添加剂溶液)。
钠钙玻璃珠的直径为3mm。
通过测量混合与凝固物与烧瓶边缘有效分离的时刻之间的时间(以分钟计)来确定收缩开始的时间(图4)。通过在凝固之前和之后的液体部分的容量分析来确定体积收率。将凝固之后的体积除以初始体积并乘以100来计算释出物收率。
通过使用内置离子选择电极的血气分析(RapidPoint 500,Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)来确定血小板释出物中Ca2+(即钙离子)的浓度。
2.结果
在两种低浓度的添加Ca2+离子(即5mM或4mM CaCl2)的情况下,通过添加递增量的玻璃珠,凝固物的收缩时间显著缩短(图4)。
受试组合之间的释出物收率没有差异(图5A)。与在没有玻璃珠的情况下的高浓度Ca2+离子(即15mM CaCl2)相比,与玻璃珠组合的低浓度Ca2+离子(即4mM CaCl2)之间的释出物收率没有差异(图5B)。
与具有5mM Ca2+的所有组合相比,在通过具有4mM CaCl2的所有组合获得的血小板释出物中凝固之后残余的Ca2+浓度更低(图6)。另外,图6示出了血小板释出物中的残余Ca2+浓度不是所使用玻璃珠量的函数。
实施例4.本文中教导的人血小板释出物在生长培养基中的用途
EU、加拿大和澳大利亚的大多数血库均使用添加剂溶液(如来自Macopharma,Tourcoing,FR的SSP+)来代替约70%(v/v)的PC血浆分数。该添加剂溶液包含磷酸根和碳酸根阴离子。当将通过血小板活化方法使用高浓度钙(例如15mM钙盐)制备的人血小板释出物用于细胞或组织培养时,过多的Ca2+离子将在添加了hPR的生长培养基中与多价阴离子形成化学复合物(图7,左图)。这在随后的细胞或组织培养中导致问题(例如,细胞生长降低、细胞应激并且甚至细胞死亡)。使用凝血酶来引起凝固的对照实验没有引起沉淀,并且向复合物添加EDTA使其溶解。这表明沉淀是钙依赖性的。如果将胎牛血清(FBS)添加至生长培养基,则观察不到沉淀(图7,右图)。
1.材料和方法
制备生长培养基
Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM;Thermo Fisher Scientific)补充有以下任一种:
-10%(v/v)hPR,其中所述hPR用15mM CaCl2(但没有玻璃珠)制备(生长培养基1,阳性对照);
-0%(v/v)hPR(生长培养基5,培养基(无hPR));
-10%(v/v)人血小板裂解物(hPL),其中所述hPL通过标准冻融循环制备(生长培养基2,未凝固);或者
-10%(v/v)hPR,其中所述hPR用5mM或4mM CaCl2和0.2g玻璃珠/ml PC制备(生长培养基3和4,5mM CaCl2和4mM CaCl2)。
2.结果
生长培养基1包含沉淀(图8A),而生长培养基5不包含任何沉淀(图8B)。
生长培养基2不包含任何沉淀(图8C)。然而,生长培养基2将在细胞培养期间引起整个培养基的凝固。由于不存在添加的钙,因此在制备hPL时将不发生凝固步骤。作为此结果,当将该hPL添加至生长培养基(其包含Ca2+离子)时,在细胞培养期间将发生自发凝固。生长培养基将作为凝胶黏附在细胞培养瓶的底部,而不是仍然是流体。因此,原因是大多数生长培养基包含的钙的浓度足以使得能够在37℃和5%CO2下凝固。
生长培养基3和4不包含沉淀(图8D至E),表明通过本文中教导的方法制备的hPR克服了当将通过标准方法制备的hPR添加至标准生长培养基时通常所观察到的钙依赖性沉淀的问题。另外,通过本文中教导的方法制备的hPR克服了当将通过标准方法制备的hPL或hPR添加至标准生长培养基时通常所观察到的培养基制备之后的凝固问题。
实施例5.使用15mM且无玻璃珠制备的人血小板释出物对生长培养基样溶液的作用。
从标准生长培养基(即DMEM)和血小板添加剂溶液(即SSP+)与外源添加的CaCl2组合的组合物中选择在钙沉淀中起潜在作用的离子(表1)。
表1。
在没有玻璃珠的情况下用15mM CaCl2制备的hPR中,在凝固之后测量到残余Ca2+浓度为1.5mM。假定从中制备hPR的包含富血小板的组合物包含70%(v/v)SSP+,则hPR中所选离子的理论浓度将如下:
·4mM HCO3 -
·19.7mM PO4 3-
·1.5mM Ca2+
假定生长培养基由90%(v/v)DMEM和10%(v/v)hPR构成,则生长培养基+hPR中所选离子的理论浓度将如下:
·90%(v/v)DMEM+10%(v/v)hPR:
ο39.6+0.4=40.0mM HCO3 -
ο0.8+2.82=3.6mM PO4 3-
ο1.62+0.15=1.77mM Ca2+
进行实验以检测细胞培养条件(5%CO2和37℃)下最小离子组合物中的沉淀。如下所述在水中制备离子组合物,并在细胞培养箱中孵育。使用明场显微术通过视觉控制检测到沉淀:
1.Ca2+和HCO3 -?
·44mM NaHCO3
·2mM CaCl2
未观察到沉淀。
2.Ca2+和H2PO4 -?
·3.73mM NaH2PO4
·2mM CaCl2
未观察到沉淀。
3.Ca2+和HCO3 -和H2PO4 -?
·44mM NaHCO3
·3.73mM NaH2PO4
·2mM CaCl2
观察到沉淀。
数据表明,在以上测试的物理和化学条件下,不溶性钙盐的沉淀至少需要存在磷酸根阴离子以及碳酸氢根阴离子二者。数据还表明这些阴离子足以引起沉淀,表明使用用≥15mM CaCl2并且无玻璃珠制备的10%(v/v)hPR的包含这些阴离子(至少在受试浓度下)的任何商业培养基均将遭受不溶性钙盐沉淀。
实施例6.本文中教导的人血小板释出物对细胞生长的作用。
1.材料和方法
在补充有10%(v/v)不同类型的hPR或hPL或者10%(v/v)FBS的DMEM生长培养基中培养脂肪组织来源的间充质干细胞(MSC)。hPR的不同类型包括:
-通过两个冻融循环以及随后的离心制备的hPL(‘标准’);
-用5mM CaCl2和0.2g玻璃珠/ml PC制备的hPR(‘CaCl2+玻璃’);
-Cook Regentec的hPL(nLiven PRTM)(‘竞争物1’);
-EMD Merck Millipore的hPL(PLTMaxTM;SCM141)(‘竞争物2’);以及
-Macopharma的hPR(Multipl’范围;参考号BC0190020/BC0190030)
(‘竞争物3’)。
通过将血细胞计数器(Malassez型)中的细胞计数作为培养时间的函数来确定MSC的细胞倍增时间。
2.结果
图9示出‘CaCl2+玻璃’的细胞倍增时间与FBS相比快约2.4倍。此外,‘CaCl2+玻璃’的细胞倍增时间与‘标准’hPR和三种商业竞争物的hPR的细胞倍增时间或多或少是相同的。
实施例7.本文中教导的人血小板释出物对细胞应激的作用
1.材料和方法
在补充有在没有玻璃珠的情况下用15mM CaCl2制备的10%(v/v)hPR或用4mMCaCl2和0.20g玻璃珠/ml PC制备的10%(v/v)hPR的DMEM生长培养基中培养脂肪组织来源的间充质干细胞(MSC)。
用显微镜确定对细胞应激和细胞死亡的作用。
2.结果
图10示出了在补充有在没有玻璃珠的情况用15mM CaCl2制备的10%(v/v)hPR的DMEM生长培养基中培养的MSC遭受细胞应激并且甚至细胞死亡(图10A),而在补充有用4mMCaCl2和0.20g玻璃珠/ml PC制备的10%(v/v)hPR的DMEM生长培养基中培养的MSC显示出健康(图10B)。
实施例8.不同类型的基于二氧化硅的颗粒对凝固时间的作用。
将配对PC(350mL,包含约62.5%(v/v)血小板添加剂溶液)添加至包含0.20g/ml、0.15g/ml或0.10g/ml硼硅酸盐玻璃珠的袋。将6mM、5mM或4mM CaCl2添加至PC与玻璃珠的混合物。记录完成收缩的时间。当需要记录>3小时时,认为PC“未收缩”(图11,用‘X’表示)。成功收缩在图1l中用‘V’表示。
数据显示,在存在硼硅酸盐玻璃的情况下,需要多于4mM CaCl2以在小于3小时内获得完全收缩,而在使用钠钙玻璃的这样的条件下,所有20种PC均在小于3小时内成功收缩。在用5mM CaCl2的条件下,发现PC成功收缩,但是比存在相同量的钠钙玻璃的情况(平均2小时30)花费更久(平均3小时)。
实施例9.用于从不包含血小板添加剂溶液的血小板浓缩物中制备本文中教导的人血小板释出物的方法。
在不添加血小板添加剂溶液的情况下,在100%(v/v)血浆中制备血小板浓缩物。将0.25g/ml、0.15g/ml或0.05g/ml钠钙玻璃珠和10mM、8mM、6mM、4mM或2mM CaCl2添加至50mL falcon管中的40ml PC。在21小时内监测凝块收缩时间。当需要记录>21小时时,认为PC“未收缩”(图12,用‘X’表示)。成功收缩<3小时在图12中用‘V’表示。在3小时至21小时之间的凝块收缩在图12中用开圆表示。
数据表明,与在约35%(v/v)血浆和约65%(v/v)添加剂溶液中制备的PC的历史样品相比,在存在100%(v/v)血浆的情况下,凝块收缩并没有明显更快。
实施例10.根据本发明产生的血小板释出物和现有技术的血小板释出物中最终离子钙浓度的比较分析
根据引用的现有技术制备的血小板释出物中Ca2+(离子钙)的浓度。在配对实验中,用要求保护的方法(TReC)或来自以下现有技术文献中的那些对添加剂溶液(PAS-血浆)或纯血浆(血浆)中的血小板浓缩物进行处理:Ming-Li Chou et al.,2014,PLOS ONE vol.9(6),19 June 2014,pagee99145(D1)、WO2013/003356(D2)和Martina Bernardi et al.,2017,J.of Translatioal Medicine,vol.15(1)(D3)。图例中示出了各自的起始Ca2+浓度(即添加的钙量)。在所得的最终产物中,测量了Ca2+浓度并在图13中给出。如黑条所示,与竞争方法D1至D3相比,要求保护的方法的Ca2+浓度显著更低。虚线表示纯的血小板释出物中允许的最大Ca2+浓度,以防止在典型的组织培养基组合物中磷酸钙复合物沉淀。
与Ming-Li Chou et al.,2014的高钙方法相比,本发明的方法产生当在细胞培养基中使用时不倾向于磷酸钙沉淀的血小板释出物,如可在图14中描绘的比较中示出的。在组织培养基中化学磷酸根(HPO4 2-、H2PO4 -和PO4 3-)与钙(Ca2+)的复合物的沉淀。组织培养基(具有预添加Ca2+的DMEM)补充有10%血小板释出物,所述血小板释出物从包含添加剂溶液作为磷酸根阴离子来源的血小板浓缩物制备。使用两种不同的血小板释出物制备方法:我们的低Ca2+方法(A)或D1现有技术高Ca2+方法(B)。在37℃和CO2(pCO2 5%)下孵育24小时之后,磷酸钙复合物仅在条件B下使用明场显微术(200X)可见。培养基中Ca2+(封闭条)和PO4 3-(开放条)离子的残余浓度在图(下图)中示出。虚线表示Ca2+与PO4 3-在pH 7.4和理想热力学条件下的理论溶解度。
该数据清楚地示出了使用根据本发明的方法制备血小板释出物的有益作用,其降低了在细胞培养基中获得沉淀的风险、避免了细胞损伤并且避免了钙离子对例如信号传导途径的影响。
Claims (17)
1.一定量的一种或更多种水溶性钙盐和一定量的玻璃颗粒用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的用途,其中所述一种或更多种水溶性钙盐的所述量为1.0μmol/ml至12.0μmol/ml所述样品,并且玻璃颗粒的所述量为0.010g/ml至0.60g/ml所述样品。
2.用于制备血小板释出物的***,其包含具有第一容纳空间(1’)的第一容器(1),其中所述第一容纳空间(1’):
-配置成接收第二容器(2)的第二容纳空间(2’)中所包含的一定量(Qbc)的富血小板血液组合物;
-容纳一定量(Qgp)的玻璃颗粒(3);并且
-容纳一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4),或者配置成接收由第三容器(5)的第三容纳空间(5’)容纳的一定量(Qcc)的一种或更多种水溶性钙盐(4);
其中比值Qgp∶Qbc为0.010至0.60g/ml所述富血小板血液组合物,并且比值Qcc∶Qbc为1.0至12.0μmol/ml所述富血小板血液组合物。
3.根据权利要求2所述的***,其中比值Qgp∶Qbc为0.10至0.40并且比值Qcc∶Qbc为3.0至8.0。
4.根据权利要求2或3所述的***用于产生血小板释出物或血小板裂解物的用途。
5.用于从获自对象的富血小板血液组合物的样品制备血小板释出物的方法,其包括以下步骤:
a)使所述样品与每ml所述样品0.010g至0.60g的玻璃颗粒和每ml所述样品1.0μmol至12.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触,从而获得混合物;
b)使步骤a)中获得的所述混合物凝固,从而获得凝固物和血小板释出物;以及
c)从所述混合物中回收步骤b)中获得的所述血小板释出物。
6.根据权利要求1所述的用途或根据权利要求5所述的方法,其中所述样品与每ml所述样品0.10g至0.40g的玻璃颗粒和每ml所述样品3.0μmol至8.0μmol的一种或更多种水溶性钙盐接触。
7.根据权利要求1或6所述的用途,根据权利要求2或3所述的***,或根据权利要求5或6所述的方法,其中所述玻璃颗粒的平均直径为1.0mm至5.0mm,优选2.0mm至4.0mm。
8.根据权利要求1、6或7中任一项所述的用途,根据权利要求2、3或7中任一项所述的***,或根据权利要求5至7中任一项所述的方法,其中所述玻璃颗粒是基于二氧化硅的玻璃颗粒,优选钠钙硅玻璃颗粒或钠钙玻璃颗粒、硼硅酸钠玻璃颗粒、铝硅酸盐玻璃颗粒、氧化铅玻璃颗粒或者熔融石英玻璃颗粒。
9.根据权利要求1或6至8中任一项所述的用途,根据权利要求2、3、7或8中任一项所述的***,或根据权利要求5至8中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种水溶性钙盐选自:氯化钙、氢氧化钙、乙酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氯酸钙、高氯酸钙、硫酸钙、硝酸钙、亚硝酸钙、乳酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙和葡萄糖酸钙或其混合物,优选氯化钙。
10.根据权利要求1或6至9中任一项所述的用途或者根据权利要求5至9中任一项所述的方法,其中所述富血小板血液组合物选自血小板浓缩物、血浆和全血,优选血小板浓缩物。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法,其还包括以下步骤:裂解存在于步骤b)中获得的凝固物和/或获得的血小板释出物中的血小板,从而获得血小板裂解物。
12.通过根据权利要求5至10中任一项所述的方法获得的血小板释出物,其包含的Ca2+离子少于1mM。
13.通过根据权利要求11所述的方法获得的血小板裂解物,所述裂解物包含的Ca2+离子少于1mM。
14.药物组合物或化妆品组合物,其包含根据权利要求12所述的血小板释出物或根据权利要求13所述的血小板裂解物。
15.根据权利要求12所述的血小板释出物,根据权利要求13所述的血小板裂解物或根据权利要求14所述的药物组合物,其用于医学,优选地用于治疗硬组织和软组织损伤、炎性疾病、骨疾病、退行性关节病、退行性椎间盘疾病、皮肤病症、斑秃、子宫内膜疾病、***萎缩、眼表疾病、腕管综合征、神经退行性疾病、外周动脉疾病和疼痛,所述治疗包括向对象施用有效量的所述血小板释出物、所述血小板裂解物或所述药物组合物。
16.根据权利要求12所述的血小板释出物、根据权利要求13所述的血小板裂解物或根据权利要求14所述的化妆品组合物用于改善皮肤和/或毛发外观的用途。
17.根据权利要求12所述的血小板释出物或根据权利要求13所述的血小板裂解物在细胞培养或组织培养中的用途。
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