JP2022129868A - Methods and reagents for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis b vaccines - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬に関する。 The present invention relates to methods and reagents for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine.
現在、世界１８０か国以上でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対してＢ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）接種が行われている。ＨＢＶには複数の遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が存在しており、本邦ではＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）が最も多い。そのため、ＨＢＶ／Ｃに対応する組換え沈降ＨＢワクチン（酵母由来）であるビームゲン（登録商標）（以下、「登録商標」との記載を省略する）、及び、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する組換え沈降ＨＢワクチン（酵母由来）であるヘプタバックス（登録商標）（以下、「登録商標」との記載を省略する）－ＩＩが使用されている。しかしながら、ビームゲン接種者及びヘプタバックス－ＩＩ接種者のうち、約１０％はその中和抗体であるＨＢｓ抗体を獲得できないという問題があるが、その原因は未だ不明である。 Currently, hepatitis B vaccine (HB vaccine) is administered against hepatitis B virus (HBV) in more than 180 countries around the world. HBV has multiple genotypes, and genotype C (HBV/C) is the most common in Japan. Therefore, Beamgen (registered trademark), which is a recombinant precipitated HB vaccine (derived from yeast) corresponding to HBV/C (hereinafter, the description of "registered trademark" is omitted), and corresponds to Genotype A (HBV/A) Heptavax (registered trademark) (hereinafter abbreviated as “registered trademark”)-II, which is a recombinant precipitated HB vaccine (derived from yeast), is used. However, there is a problem that approximately 10% of those vaccinated with Biemgen and heptavax-II cannot acquire HBs antibodies, which are neutralizing antibodies, and the cause is still unknown.
発明者らは、日本人成人に対するビームゲン接種におけるワクチン低反応（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ以下）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１の２つのハプロタイプが強く寄与することを明らかにしている。一方でビームゲン応答性（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ超）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２の２つのハプロタイプ、並びに、ＢＴＮＬ２遺伝子が強く寄与することを明らかにしている（例えば、非特許文献１参照）。 The inventors found that HLA class II genes HLA-DRB1 * 04:05-DQB1 * 04:01 and HLA- Two haplotypes, DRB1 * 14:06-DQB1 * 03:01, reveal strong contributions. On the other hand, for Bimgen responsiveness (HBs antibody titer exceeding 10 mIU/mL), HLA class II genes HLA-DRB1 * 08:03-DQB1 * 06:01 and HLA-DRB1 * 15:01-DQB1 * 06: It has been clarified that the two haplotypes of 02 and the BTNL2 gene strongly contribute (see, for example, Non-Patent Document 1).
しかしながら、ＨＢワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因については未だ不明な点が多く、その検出方法は確立されていない。 However, there are still many unclear points about the genetic factors of immune responsiveness to HB vaccine, and no detection method has been established.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides methods and reagents for detecting genetic factors of immune responsiveness to novel hepatitis B vaccines.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ；ヒト白血球抗原） ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ法により、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプとＢ型肝炎ワクチンの効果との関連解析を行なった結果、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を有するとビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩのいずれのＢ型肝炎ワクチンを接種しても効果は低く（免疫応答性が低いままであり）、一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有するとヘプタバックス－ＩＩを接種することによる効果は得にくい（免疫応答性が低いままである）が、ビームゲンを接種することによる効果が得られる（免疫応答性が上昇する）ことを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, analyzed the relationship between the HLA class II gene haplotype and the effect of hepatitis B vaccine by the HLA (Human Leukocyte Antigen; human leukocyte antigen) imputation method. As a result, it was found that in those with HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01, the effect of both Bimgen and Heptavax-II hepatitis B vaccines was low (immune responsiveness remained low). Yes), on the other hand, if you have HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, it is difficult to obtain the effect of heptabax-II inoculation (immune responsiveness remains low), but Biemgen inoculation The present inventors have found that the effect (increase in immune responsiveness) is obtained by doing so, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、
前記Ｂ型肝炎ワクチンがビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩであり、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、
を含む、方法。
（２） 前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定することを更に含む、（１）に記載の方法。
（３） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する試薬であって、
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、試薬。
（４） ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（３）に記載の試薬。
That is, the present invention includes the following aspects.
(1) A method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine, comprising:
the hepatitis B vaccine is Bimgen and Heptavax-II;
detecting HLA class II gene haplotypes in a DNA-containing sample from a subject;
when HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 is detected as the haplotype, the subject has immunoreactivity to the Beamgen and does not have immunoreactivity to the heptabax-II, or Determining that immune responsiveness is low;
A method, including
(2) When HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 is detected as the haplotype, the subject is determined to have no immune reactivity to the Beamgen and the heptabax-II. The method of (1), further comprising:
(3) A reagent for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine, comprising:
A reagent comprising one or more nucleic acid probes or primers that detect the HLA class II gene haplotype HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04.
(4) The reagent according to (3), further comprising one or more nucleic acid probes or primers that detect HLA class II gene haplotype HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01.
上記態様の方法及び試薬によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。 According to the method and reagent of the above aspects, the genetic factor of immune responsiveness to hepatitis B vaccine in a subject can be detected simply and reliably.
本発明の一実施形態に係るＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬（以下、「本実施形態の方法」、「本実施形態の試薬」とそれぞれ略記する場合がある）の詳細を以下に説明する。 A method and reagent for detecting a genetic factor of immune responsiveness to a hepatitis B vaccine according to an embodiment of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as "method of the present embodiment" and "reagent of the present embodiment") ) is described below.
＜Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）＞
本明細書において、Ｂ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染や再活性化を予防するために用いられるものであり、例えば、ヘプタバックス－ＩＩ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）由来のワクチン；Ｅｎｇｅｒｉｘ－Ｂ、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ２（ＨＢＶ／Ａ２）由来のワクチン；ビームゲン等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のワクチン等が挙げられる。
中でも、本実施形態の方法で対象となるＨＢワクチンとしては、本邦にＨＢワクチンとしての使用実績のあるビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩである。
<Hepatitis B vaccine (HB vaccine)>
As used herein, the hepatitis B vaccine is used to prevent infection or reactivation of hepatitis B virus, and is, for example, a vaccine derived from Genotype A (HBV/A) such as heptavax-II. Genotype A2 (HBV/A2)-derived vaccines such as Engerix-B and Recombivax HB; Genotype C (HBV/C)-derived vaccines such as Beamgen.
Among them, the HB vaccines targeted by the method of the present embodiment are Beamgen and Heptavax-II, which have been used as HB vaccines in Japan.
＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法＞
本実施形態の方法は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、前記Ｂ型肝炎ワクチンがビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩであり、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、
を含む。
<Method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine>
The method of this embodiment is a method for detecting a genetic factor of immune responsiveness to hepatitis B vaccine, wherein the hepatitis B vaccine is Beamgen and Heptavax-II,
detecting HLA class II gene haplotypes in a DNA-containing sample from a subject;
when HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 is detected as the haplotype, the subject has immunoreactivity to the Beamgen and does not have immunoreactivity to the heptabax-II, or Determining that immune responsiveness is low;
including.
発明者らは、ビームゲンワクチンを接種した日本人成人１１９３検体及びヘプタバックス－ＩＩを接種した日本人成人５５５検体について、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行ない、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連するＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を同定した。 The inventors performed a genome-wide association study (GWAS) on 1193 Japanese adult specimens vaccinated with Biemgen vaccine and 555 Japanese adult specimens vaccinated with heptabax-II, and investigated immune responsiveness to hepatitis B vaccine. HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 were identified as related HLA class II gene haplotypes.
よって、本実施形態の方法は、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定することを更に含むことが好ましい。 Therefore, in the method of this embodiment, when HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 is detected as a haplotype, the subject does not have immune reactivity to the Beamgen and the heptabax-II It is preferable to further include determining that
本実施形態の方法によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。 According to the method of the present embodiment, genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine in a subject can be detected simply and reliably.
ＨＬＡはヒトの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ；Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）であり、移植片や細菌、ウイルス等の外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質である。ＨＬＡには多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報についてはＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（http://hla.alleles.org/announcement.html)等に記載がある。なお、本明細書のアリルや多型の表記は、ＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる表記方法に基づく。 HLA is a human major histocompatibility complex (MHC; Major Histocompatibility Complex), and is a membrane protein that binds to foreign antigen peptides such as grafts, bacteria, and viruses and presents them to T cells. HLA is known to have many alleles, and information on these is described in HLA nomenclature (http://hla.alleles.org/announcement.html) and the like. The notation of alleles and polymorphisms in this specification is based on the notation method according to the HLA nomenclature.
上記ハプロタイプに関するシークエンスデータは、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｂａｓｅ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）等のデータベースに登録されているデータを用いてよい。ここで、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１のうち、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のｇＤＮＡは１１０７４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＲＢ１（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２４．４）と、アミノ酸は２６６残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ（配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４２０７２．１）と登録されている。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１のうち、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のｇＤＮＡは７１９１ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＱＢ１（配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２３．５）と、アミノ酸は２２９残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＨＬＡ－ＤＱ－ｂｅｔａ－１（配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４１９６７．１）と登録されている。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４のうち、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のｇＤＮＡは１１７０４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＲＢ１（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２４．４）と、アミノ酸は８９残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ ＨＬＡ－ＤＲＢＩ， ｐａｒｔｉａｌ（配列番号５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ５０９７１．１）と登録されている。 ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４のうち、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のｇＤＮＡは７１９１ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＱＢ１（配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２３．５）と、アミノ酸は１８３残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ， ｐａｒｔｉａｌ（配列番号６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＢＦ３５７３６．１）と登録されている。
なお、以降において、上記ハプロタイプＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連のあるアリル」、「本実施系に係るアリル」と称する場合がある。また、アリルに変えて多型やＳＮＰという場合がある。
For the sequence data on the haplotypes, data registered in databases such as GenBank (NIH genetic sequence data base) and DDBJ (DNA Data Bank of Japan) may be used. Here, for example, among HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01, the gDNA of the HLA-DRB1 gene is 11074 bp, and HLA-DRB1 (SEQ ID NO: 1, Genbank accession number NM_002124.4) is available in GenBank. The amino acid is 266 residues and registered as MHC class II antigen (SEQ ID NO: 2, Genbank accession number AAB42072.1).
Among HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01, the gDNA of the HLA-DQB1 gene is 7191 bp, and HLA-DQB1 (SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. NM_002123.5) and 229 amino acids are listed in GenBank. The residue is registered as MHC class II HLA-DQ-beta-1 (SEQ ID NO: 4, Genbank Accession No. AAC41967.1).
Among HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, the gDNA of the HLA-DRB1 gene is 11704 bp, and GenBank has HLA-DRB1 (SEQ ID NO: 1, Genbank Accession No. NM_002124.4) with 89 amino acids. The residue is registered as MHC class II antigen HLA-DRBI, partial (SEQ ID NO: 5, Genbank accession number AAD50971.1). Among HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, the gDNA of the HLA-DQB1 gene is 7191 bp, and HLA-DQB1 (SEQ ID NO: 3, Genbank Accession No. NM_002123.5) is listed in GenBank, and the amino acid is 183 bp. The residue is registered as MHC class II antigen, partial (SEQ ID NO: 6, Genbank accession number CBF35736.1).
Hereinafter, the haplotypes HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 will be referred to as "alleles associated with immunoreactivity to hepatitis B vaccine". , may be referred to as "allyl according to the present system". Polymorphisms and SNPs are sometimes used instead of alleles.
アリルは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書においてポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが２以上結合しているものをいい、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものを含む。また、本明細書におけるポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。 Alleles include single- and double-stranded DNA, as well as their RNA complements, and may be of natural origin or man-made. Examples of DNA include genomic DNA, cDNA corresponding to the genomic DNA, chemically synthesized DNA, DNA amplified by PCR, combinations thereof, hybrids of DNA and RNA, and the like. It is not limited to these. As used herein, the term "polynucleotide" refers to a substance in which two or more nucleotides are linked together, and includes those having a length generally referred to as oligonucleotides. Also, the polynucleotides used herein may be either DNA or RNA.
これらの塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。 These nucleotide sequences are obtained by preparing probes using appropriate fragments by methods known to those skilled in the art, and using these probes to perform cDNA live analysis by known hybridization methods such as colony hybridization, plaque hybridization, and Southern blotting. It can be obtained from rallies, genomic libraries, and the like.
被験者由来のＤＮＡ含有試料としては、被験者の生体から採取されたものであれば特別な限定はないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、***、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、毛髪、便、生体から直接採取された細胞又は組織等が挙げられ、これらに限定されない。これら試料からＤＮＡを抽出して、後述する検出に用いられる試料とすることが好ましい。 The subject-derived DNA-containing sample is not particularly limited as long as it is collected from the subject's body. Fluid, tears, sputum, mucus, lymph, ascites, pleural fluid, amniotic fluid, bladder lavage, bronchoalveolar lavage, hair, stool, cells or tissues directly collected from a living body, and the like, but are not limited thereto. It is preferable to extract DNA from these samples and use it as a sample to be used for detection, which will be described later.
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、検体からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連のあるアリルを検出することができる。また、検体からヒトＨＬＡ－ＤＰ分子タンパク質を調製し、例えば抗体等を用いてＤＰ分子におけるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。 Detection of HLA class II gene haplotypes can be performed at the gene level or the protein level. For example, genomic DNA or mRNA can be prepared from a sample, and alleles associated with immunoreactivity to hepatitis B vaccine in the genomic DNA or mRNA can be detected based on the base sequence. Alternatively, a human HLA-DP molecule protein is prepared from a sample, and HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 in the DP molecule are prepared using, for example, antibodies. can be detected. These methods are briefly described below.
［ＤＮＡ含有試料からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製］
ＤＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法等が挙げられる。ＤＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）等が挙げられる。
[Preparation of genomic DNA or mRNA from DNA-containing sample]
The method for extracting DNA is not particularly limited, and any known method can be used for extraction. For example, the phenol/chloroform method, the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, and the like can be mentioned. A commercially available kit may be used for DNA extraction. Examples of such kits include Wizard Genomic DNA Purification Kit (manufactured by Promega) and the like.
また、ＤＮＡは、ｍＲＮＡを抽出し、当該ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡであってもよい。ｍＲＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、グアニジンイソチオシアネート法等が挙げられる。ｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ（登録商標） ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等が挙げられる。ｃＤＮＡの合成方法についても、特別な限定はなく、公知の方法を用いて合成することができる。例えば、ランダムプライマー又はポリＴプライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成することができる。 Alternatively, the DNA may be cDNA synthesized by extracting mRNA and using the mRNA as a template. The method for extracting mRNA is not particularly limited, and it can be extracted using a known method. Examples include the guanidine isothiocyanate method. A commercially available kit may be used for the extraction of mRNA. Examples of such kits include NucleoTrap (registered trademark) mRNA Kit (manufactured by Clontech) and the like. The method for synthesizing cDNA is also not particularly limited, and it can be synthesized using a known method. For example, cDNA can be synthesized from RNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) using random primers or polyT primers.
上記のように調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４の検出は、当技術分野で公知の遺伝子多型検出法を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ法（以下、「登録商標」との記載を省略する）、質量分析法等を用いる方法が挙げられる。ただし、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子では、特に第２エクソン内に多型部位が多数あるため、これらのアリルを検出するために、多数の多型を判別する必要がある。以下に当該方法について説明する。 Detection of HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 in genomic DNA or mRNA prepared as described above is a gene polymorphism known in the art. It can be detected using a type detection method. For example, direct sequencing method, polymerase chain reaction (PCR) method, restriction fragment length polymorphism (RFLP) method, hybridization method, TaqMan (registered trademark) PCR method (hereinafter, the description of "registered trademark" is omitted) ), a method using mass spectrometry, and the like. However, since the HLA-DRB1 gene has many polymorphic sites especially in the second exon, it is necessary to discriminate many polymorphisms in order to detect these alleles. The method will be described below.
直接配列決定法は、上記被験者由来のＤＮＡ含有試料中の検出対象であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し、当該領域の塩基配列を決定することにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ－Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ｐＡｍｐ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ製）、ｐ－Ｄｉｒｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知の方法を用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４に相当する配列を有するか否かを決定する。 In the direct sequencing method, the regions containing HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, which are the detection targets in the DNA-containing sample derived from the subject, are identified. , by cloning into a vector or amplifying by PCR and determining the base sequence of the region. As a cloning method, cloning can be performed by screening a cDNA library using an appropriate probe. Alternatively, it can be cloned by amplifying by PCR reaction using appropriate primers and ligating into an appropriate vector. Furthermore, it can be subcloned into another vector, but is not limited to these. Examples of vectors include pBlue-Script SK (+) (manufactured by Stratagene), pGEM-T (manufactured by Promega), pAmp (manufactured by Gibco-BRL), p-Direct (manufactured by Clontech), pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogene ) and other commercially available plasmid vectors, virus vectors, artificial chromosome vectors, and cosmid vectors can be used. A known method can be used for determining the base sequence. Examples include, but are not limited to, manual sequencing using a radioactive marker nucleotide and automatic sequencing using a dye terminator. Whether or not the sample has sequences corresponding to HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 based on the nucleotide sequences thus obtained to decide.
ＰＣＲ法は、本実施形態に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー（以下、「本実施形態に係るアリル検出用プライマー」と称する場合がある）を用いて行う。上述のとおりＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子には複数のＳＮＰが存在本実施形態に係るアリル検出用プライマーは、全てのＳＮＰを検出し得るプライマーを１種単独で用いてもよく、各ＳＮＰを検出し得るプライマーを２種以上組み合わせて用いてもよい。このプライマーを使用して検体のＤＮＡを増幅する。本実施形態に係るアリル検出用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体は本実施形態に係るアリルを有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体には本実施形態に係るアリルがないことが示される。 The PCR method uses an oligonucleotide primer that hybridizes only to the sequence having the allele according to the present embodiment or the sequence having other alleles (hereinafter sometimes referred to as "allele detection primer according to the present embodiment"). do. As described above, multiple SNPs exist in the HLA-DRB1 gene. As the allele detection primers according to the present embodiment, a single primer capable of detecting all SNPs may be used alone, or a primer capable of detecting each SNP. may be used in combination of two or more. The primers are used to amplify the sample's DNA. When only the allele detection primer according to this embodiment produces a PCR product, the sample has the allele according to this embodiment. If only the primers for the other alleles produced a PCR product, it indicates that the specimen does not have the allele according to this embodiment.
ＲＦＬＰ法は、まず、検出対象の本実施形態に係るアリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本実施形態に係るアリルを含む領域に適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー、並びに、対照として、制限酵素処理していない上記ＰＣＲ産物等と比較して、検体における本実施形態に係るアリルの存在を検出することができる。 In the RFLP method, first, a region containing the allele according to the present embodiment to be detected is amplified by PCR. This PCR product is then cut with a restriction enzyme suitable for the region containing the allele according to this embodiment. The restriction enzyme-digested PCR products are separated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. The presence of the allele according to the present embodiment in the sample can be detected by comparing the fragment length with a molecular weight marker and, as a control, the above-mentioned PCR product or the like that has not been treated with a restriction enzyme.
ハイブリダイゼーション法は、検体由来のＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、検体における本実施形態に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６－７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３－６．４)、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；ハイブリダイゼーション条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本実施形態に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。 The hybridization method is a method for determining the presence or absence of the allele according to this embodiment in a sample based on the property of DNA from the sample to hybridize with complementary DNA molecules (eg, oligonucleotide probes). Various techniques for hybridization and detection, such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, and other known hybridizations, can be used for this hybridization method. For detailed procedures of the hybridization method, see "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed." (Cold Spring Harbor Press (2001); especially Sections 6-7), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley, 1987; ); especially Section 6.3-6.4), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995); especially Section 2.10 for hybridization conditions) can. Furthermore, hybridization can also be detected using a DNA chip. As the method, an allele-specific oligonucleotide probe according to the present embodiment is designed and attached to a solid phase support. Then, a DNA sample derived from the specimen is brought into contact with the DNA chip to detect hybridization.
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、本実施形態に係るアリルに特異的なＴａｑＭａｎプローブとＴａｑポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約２０塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Ｔａｑポリメラーゼは５’→３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼ存在下で目的のＳＮＰ部位を含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該ＳＮＰ部位を含む領域を増幅すると、増幅と並行して、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡの目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズした、ＴａｑＭａｎプローブに到達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。 The TaqMan PCR method is a method in which the allele-specific TaqMan probe and Taq polymerase according to this embodiment are used to detect SNPs and amplify regions containing SNPs in parallel. A TaqMan probe is an oligonucleotide of about 20 bases labeled with a fluorescent substance at the 5' end and a quencher at the 3' end, and is designed to hybridize to the SNP site of interest. Taq polymerase has 5' to 3' nuclease activity. When a region containing the SNP site of interest is amplified using these TaqMan probes and PCR primers designed to amplify the region containing the SNP site of interest in the presence of Taq polymerase, the TaqMan probe is converted to template DNA in parallel with the amplification. hybridizes to the SNP site of interest. When the extension reaction from the forward primer side reaches the TaqMan probe hybridized to the template, the 5' to 3' nuclease activity of Taq polymerase cleaves the fluorescent substance bound to the 5' end of the TaqMan probe. . As a result, the liberated fluorescent substance is no longer affected by the quencher and emits fluorescence. Measurement of fluorescence intensity enables SNP detection.
質量分析法を用いた方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法を応用したＳＮＰタイピング方法として、プライマー伸長法と組み合わせた方法もあげられる。この方法はハイスループットな解析が可能であり、１）ＰＣＲ、２）ＰＣＲ産物の精製、３）プライマー伸長反応、４）伸長産物の精製、５）質量分析、６）ジェノタイプ決定、のステップにより解析する。まずＰＣＲによって、目的とするＳＮＰ部位を含む領域をゲノムＤＮＡから増幅する。ＰＣＲプライマーは、ＳＮＰ部位塩基と重複しないように設計する。そして、エキソヌクレアーゼとエビのアルカリホスファターゼを用いて酵素的除去方法により精製するかエタノール沈殿法を用いて精製する。次に、３’末端がＳＮＰ部位に直接隣接するように設計したジェノタイピングプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。ＰＣＲ産物を高温で変性し、過剰のジェノタイピングプライマーを加えて、アニールさせる。ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを反応系に添加し、サーマルサイクル反応させると、ジェノタイピングプライマーよりも１塩基長いオリゴマーが生じる。この伸長反応で生じる１塩基長いオリゴマーは、ジェノタイピングプライマーの上記設計により、アリルに応じて異なる。精製した伸長反応産物について質量分析を行い、マススペクトルから解析する。 As a method using mass spectrometry, for example, a SNP typing method applying MALDI-TOF/MS method may be combined with a primer extension method. This method enables high-throughput analysis, and by the steps of 1) PCR, 2) purification of PCR products, 3) primer extension reaction, 4) purification of extension products, 5) mass spectrometry, and 6) genotyping. To analyze. First, a region containing the SNP site of interest is amplified from genomic DNA by PCR. PCR primers are designed so as not to overlap with the SNP site bases. It is then purified by enzymatic removal using exonuclease and shrimp alkaline phosphatase or by ethanol precipitation. A primer extension reaction is then performed using genotyping primers designed so that the 3' end immediately flanks the SNP site. The PCR products are denatured at elevated temperature and excess genotyping primers are added and allowed to anneal. When ddNTP and DNA polymerase are added to the reaction system and subjected to thermal cycle reaction, an oligomer one base longer than the genotyping primer is produced. Oligomers one base longer generated in this extension reaction differ according to alleles due to the above design of genotyping primers. The purified elongation reaction product is subjected to mass spectrometry and analyzed from the mass spectrum.
その他の検出方法としては、ハイスループットが可能なＳＮＰタイピング法として、１分子蛍光分析法を応用した方法等が挙げられる。例えば、ＭＦ２０／１０Ｓ（オリンパス製）は、当該方法を採用したシステムである。具体的には、共焦点レーザー光学系と高感度光検出器を用いて、約１フェムトリットル（１０００兆分の１リットル）の超微小領域中で、相補的及び非相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した蛍光ラベルプライマーの１分子レベルの並進拡散時間を計測及び解析するものである。 Other detection methods include SNP typing methods capable of high throughput, methods applying single-molecule fluorescence spectrometry, and the like. For example, MF20/10S (manufactured by Olympus) is a system that employs this method. Specifically, using a confocal laser optical system and a highly sensitive photodetector, complementary and non-complementary primers are used in an ultra-small area of about 1 femtoliter (1/1000 trillion liter). This is to measure and analyze the single-molecule-level translational diffusion time of fluorescent labeled primers amplified by the PCR method.
また、ＤＮＡチップによる方法も、ハイスループットが可能なタイピングの１つである。ＤＮＡチップは、基板上に多種類のＤＮＡプローブを整列して固定したもので、標識したＤＮＡ試料をチップ上でハイブリダイゼーションし、プローブによる蛍光シグナルを検出する。 A method using a DNA chip is also one type of typing that allows high throughput. A DNA chip has many types of DNA probes arrayed and immobilized on a substrate, and a labeled DNA sample is hybridized on the chip to detect fluorescent signals from the probes.
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の例として、Ｓｎｉｐｐｅｒ法が挙げられる。当該方法は、環状一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを合成するＤＮＡ増幅方法であるＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を応用したＳＮＰタイピング法である。プローブは８０塩基長以上９０塩基長以下のオリゴＤＮＡで、標的ＳＮＰ部位の５’末端及び３’末端近傍のそれぞれに相補的な１０塩基長２０塩基長以下の配列を両末端に含んでおり、標的ＤＮＡにアニールして環状になるように設計されている。また、プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位に相補的配列となるよう設計されている。プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位と完全に相補的であれば、プローブは環状化されるが、プローブの３’末端がミスマッチであるとプローブは環状化されない。またプローブには、４０塩基長以上５０塩基長以下のバックボーン配列があり、２種類のＲＣＡ増幅プライマーと相補的な配列が含まれる。 An example of the SNP typing method using a gene amplification method other than the PCR method is the Snipper method. This method is a SNP typing method that applies the RCA (rolling circle amplification) method, which is a DNA amplification method in which complementary strand DNA is synthesized while DNA polymerase moves over circular single-stranded DNA as a template. The probe is an oligo DNA with a length of 80 bases or more and 90 bases or less, and contains sequences of 10 base lengths and 20 base lengths or less complementary to the vicinity of the 5' end and 3' end of the target SNP site at both ends, It is designed to anneal to the target DNA and become circular. Also, the 3' end of the probe is designed to have a sequence complementary to the target SNP site. If the 3' end of the probe is perfectly complementary to the target SNP site, the probe will be circularized, but if the 3' end of the probe is mismatched, the probe will not be circularized. The probe also has a backbone sequence of 40 to 50 nucleotides in length and contains sequences complementary to two types of RCA amplification primers.
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の他の例としては、例えば、ＵＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を利用したタイピング方法が挙げられる。 Other examples of SNP typing methods using gene amplification methods other than the PCR method include, for example, typing methods using the UCAN method and the LAMP method.
ＵＣＡＮ法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるＩＣＡＮ法を応用した方法である。ＵＣＡＮ法では、プライマー前駆体としてＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド（ＤＲＤ）を用いる。このＤＲＤプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないように、３’末端のＤＮＡが修飾されており、ＳＮＰサイトにＲＮＡ部分が結合するように設計されている。このＤＲＤプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみ、共存するＲＮａｓｅ Ｈが対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー３’末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがマッチしない場合、ＲＮａｓｅ ＨはＤＲＤプライマーを切断せず、ＤＮＡ増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたＤＲＤプライマー前駆体がＲＮａｓｅ Ｈによって切断された後の増幅反応は、ＩＣＡＮ反応メカニズムによって進行する。 The UCAN method is a method that applies the ICAN method, which is an isothermal gene amplification method developed by Takara Bio. The UCAN method uses DNA-RNA-DNA chimeric oligonucleotides (DRD) as primer precursors. This DRD primer precursor is designed such that the DNA at the 3' end is modified so that replication of the template DNA by DNA polymerase does not occur, and the RNA portion binds to the SNP site. When this DRD primer precursor is incubated with the template, the coexisting RNase H cleaves the RNA portion of the paired DRD primer only when the DRD primer and template are perfectly matched. As a result, the modified DNA is removed from the 3' end of the primer and a new one is formed, so that the elongation reaction by the DNA polymerase proceeds and the template DNA is amplified. On the other hand, if the DRD primer and template DNA do not match, RNase H will not cleave the DRD primer and no DNA amplification will occur. The amplification reaction after the perfectly matched DRD primer precursor is cleaved by RNase H proceeds by the ICAN reaction mechanism.
ＬＡＭＰ法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的遺伝子の６箇所の領域（３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を用いて増幅する。タイピングを目的とする場合は、Ｆ１－Ｂ１間は標的ＳＮＰ部位（１塩基）のみでよく、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを、その５’末端にＳＮＰの１塩基がくるように設計する。ＳＮＰがない場合、ＬＡＭＰ法の起点構造であるダンベル構造からＤＮＡの合成反応が起こり、増幅反応が連続的に進行する。ＳＮＰがある場合は、ダンベル構造からのＤＮＡ合成反応が起こらず、増幅反応は進行しない。 The LAMP method is a gene isothermal amplification method developed by Eiken Chemical, which defines six regions of the target gene (F3c, F2c, F1c from the 3' end, B3, B2, B1 from the 5' end). , using four types of primers (FIP primer, F3 primer, BIP primer, B3 primer) for the six regions. For the purpose of typing, only the target SNP site (1 base) is sufficient between F1 and B1, and the FIP primer and BIP primer are designed so that the 1 base of the SNP is at the 5' end. In the absence of SNPs, a DNA synthesis reaction occurs from the dumbbell structure, which is the origin structure of the LAMP method, and the amplification reaction proceeds continuously. When SNP is present, DNA synthesis reaction from dumbbell structure does not occur, and amplification reaction does not proceed.
インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法は、核酸増幅法を用いず、２種類の非蛍光標識プローブ（アレルプローブ、インベーダープローブ） と１種類の蛍光標識プローブ（ＦＲＥＴプローブ）及びエンドヌクレアーゼであるＣｌｅａｖａｓｅを用いる方法である。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡに対しＳＮＰ部位から３’末端側に相補的な配列があり、プローブの５’末端側にフラップという鋳型ＤＮＡと無関係な配列がある。インベーダープローブは、鋳型ＤＮＡのＳＮＰ部位から５’末端側に相補的な配列があり、ＳＮＰ部位に相当する部分の塩基は任意の塩基がある。ＦＲＥＴプローブは、３’末端側にフラップ配列に相補的な配列がある。一方の５’末端側は蛍光色素及びクエンチャーで標識されているが、ＦＲＥＴプローブは分子内で２本鎖を形成するよう設計されており、通常は消光されている。これらを鋳型ＤＮＡと反応させると、アレルプローブが鋳型ＤＮＡと２本鎖を形成したときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端（任意塩基部分）が侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、当該塩基が侵入した構造を認識して、アレルプローブのフラップ部分を切断する。次に、この遊離したフラップがＦＲＥＴプローブの相補配列と結合すると、フラップの３’末端がＦＲＥＴプローブの分子内二本鎖部分に侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、上記アレルプローブとインベーダープローブの場合と同様に、このＦＲＥＴプローブにフラップの塩基が侵入した構造を認識し、ＦＲＥＴプローブの蛍光色素を切断する。蛍光色素はクエンチャーから離れるため、蛍光が発生する。アレルプローブが鋳型ＤＮＡとマッチしない場合は、Ｃｌｅａｖａｓｅが認識する、上記特異的な構造が形成されないため、フラップは切断されない。 The Invader method is a method that uses two types of non-fluorescent labeled probes (allele probe, invader probe), one type of fluorescent labeled probe (FRET probe), and Cleavase, which is an endonuclease, without using a nucleic acid amplification method. . Allele probes have a sequence complementary to the template DNA on the 3'-end side from the SNP site, and a sequence unrelated to the template DNA called a flap on the 5'-end side of the probe. The invader probe has a complementary sequence on the 5' end side from the SNP site of the template DNA, and the portion corresponding to the SNP site has any base. The FRET probe has a sequence complementary to the flap sequence on the 3' end side. One 5' end is labeled with a fluorescent dye and a quencher, but the FRET probe is designed to form a double strand intramolecularly and is usually quenched. When these are reacted with the template DNA, the 3' end (arbitrary base portion) of the invader probe penetrates into the SNP site when the allele probe forms a double strand with the template DNA. Cleavase recognizes the structure invaded by the base and cleaves the flap portion of the allele probe. When this released flap then binds to the complementary sequence of the FRET probe, the 3' end of the flap penetrates the intramolecular double-stranded portion of the FRET probe. Cleavase recognizes the structure in which the base of the flap penetrates into the FRET probe, and cleaves the fluorescent dye of the FRET probe, as in the case of the allele probe and the invader probe. As the fluorochrome moves away from the quencher, fluorescence is generated. If the allele probe does not match the template DNA, the specific structure recognized by Cleavase is not formed, and the flap is not cleaved.
ＳＮＰの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本実施形態の方法において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはＳＮＰ部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとＳＮＰ部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするＳＮＰを含む領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がさらに好ましい。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。 When primers are used for SNP detection, they are designed to be suitable for the region to be amplified and the typing method. For example, it is preferable to be able to fully amplify the region, and sequences can be designed based on the sequences near the ends of the region. Techniques for designing primers are well known in the art, and primers that can be used in the method of the present embodiment satisfy conditions that allow specific annealing, such as length and base composition that allow specific annealing ( melting temperature). The length of the region to be amplified is not limited as long as it does not interfere with typing, and may be increased or decreased as appropriate depending on the detection method. Moreover, although a part of the region to be amplified contains the SNP site, the position of the site in the region to be amplified is not limited, and may be arranged at an appropriate position according to the detection method (typing method). Therefore, when designing primers, the positional relationship between the primer and the SNP site can be freely designed according to the detection method, and the region containing the SNP to be detected (for example, a continuous base length of 50 bases or more and 500 bases or less). As long as you do so, you can design primers while taking into account the characteristics of your typing method. The length that exhibits the function as a primer is preferably 10 to 100 bases, more preferably 15 to 50 bases, and even more preferably 15 to 30 bases. In designing, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer, which is the temperature at which 50% of any nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand. In order for the template DNA and the primer to form double strands and anneal, the annealing temperature must be optimized. It is not desirable because it will cause Known primer design software can be used to confirm the Tm.
ＳＮＰの検出にプローブを用いる場合は、プローブがＳＮＰ部位を認識するように設計する。プローブ設計において、ＳＮＰ部位は、タイピング方法にあわせて、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で認識されてもよい。ＳＮＰ検出用ポリヌクレオチドをプローブとする場合、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５塩基以上２００塩基以下であり、１５塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましいが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。 When probes are used to detect SNPs, they are designed to recognize SNP sites. In designing a probe, the SNP site may be recognized anywhere in the probe according to the typing method, and may be recognized at the end of the probe depending on the typing method. When the SNP detection polynucleotide is used as a probe, the length of the base sequence complementary to the genomic DNA is usually 15 to 200 bases, preferably 15 to 100 bases, and 15 to 50 bases. Although more preferred, it may be longer or shorter depending on the typing method.
本実施形態の方法において、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定する。すなわち、当該被験者がビームゲンを接種した後である場合には、当該被験者がＨＢｓ抗体を有する可能性があることを示す。
また、本実施形態の方法において、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定する。
In the method of the present embodiment, when HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 is detected as a haplotype, the subject has immunoreactivity to the Beamgen, and an immune response to the heptabax-II It is determined that the patient is not sexually active or has low immune responsiveness. That is, if the subject has been inoculated with Beamgen, it indicates that the subject may have HBs antibodies.
Further, in the method of the present embodiment, when HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01 is detected as a haplotype, the subject does not have immune reactivity to the Beamgen and the heptabax-II. I judge.
また、診断実用性の計算に用いて、ビームゲンに対する免疫応答性の陽性率を解析することもできる。ここでいう陽性率とは、検体全体のうち、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する検体の割合を意味する。例えば、本明細の実施例に記載した日本人成人１１９３人については、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する検体は１２３人であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１を有さない検体は１０７０人であり、陽性率は約１０．３％となる。 It can also be used in diagnostic utility calculations to analyze positive rates of immune responsiveness to Beamgen. The positive rate here means the proportion of specimens having HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 as a haplotype among all specimens. For example, for 1193 Japanese adults described in the examples of this specification, 123 specimens have HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, and HLA-DRB1*13:02-DQB1 is There are 1070 specimens who do not have it, and the positive rate is about 10.3%.
ＨＢワクチンに対する免疫応答性の有無は、ＨＢワクチンをこれから接種する健常者やＨＢワクチンを接種した健常者だけでなく、ＨＢＶ感染者にとっても重要な情報であり、例えば、Ｂ型肝炎の治療方法や治療薬の選定及びＢ型肝炎の予防及び発症防止に関する重要な情報となる。特に、ＨＢＶ感染者においては、免疫力が低下等することでＨＢＶが再活性化して肝炎が劇症化することを予防するために重要な情報となり得る。 The presence or absence of immune responsiveness to the HB vaccine is important information not only for healthy individuals who will be vaccinated with the HB vaccine and healthy individuals who have received the HB vaccine, but also for HBV-infected individuals. It provides important information regarding the selection of therapeutic agents and the prevention and onset of hepatitis B. In particular, in HBV-infected persons, the information may be important for preventing reactivation of HBV and fulminant hepatitis due to weakened immunity.
本実施形態の方法において、上記ハプロタイプの検出に加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出してもよい。上記ハプロタイプの検出と組み合わせてこれら他のＳＮＰやハプロタイプを検出することで、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無をより精度が高く判断することができ、診断の信頼度がより高まる。 In the method of the present embodiment, in addition to the detection of the above haplotypes, other SNPs or haplotypes associated with the presence or absence of immune responsiveness to hepatitis B vaccine may be detected. By detecting these other SNPs and haplotypes in combination with the detection of the above haplotypes, the presence or absence of immune responsiveness to hepatitis B vaccine can be determined with higher accuracy, and the reliability of diagnosis is further increased.
他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰとしては、例えば、ＢＴＮＬ２遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ４２４８１６６等）、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ９６４６９４４等）、ＳＴＯＸ２遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２８７１３８５等）、ＭＣＰＨ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２７３２９７７等）、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ３１３２９６９等）、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１９５１１２２等）が挙げられる。これらのＳＮＰを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にこれらのＳＮＰが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。 Other SNPs related to the presence or absence of immune responsiveness to hepatitis B vaccines include, for example, SNPs at the BTNL2 locus (accession number rs4248166 in the NCBI SNP Database), SNPs at the IL1RL1 locus (accession number rs9646944 in the NCBI SNP Database). etc.), SNPs at the STOX2 locus (registration number rs2871385 etc. in the NCBI SNP Database), SNPs at the MCPH1 locus (registration number rs2732977 etc. in the NCBI SNP Database), SNPs at the OXA1L locus (registration number rs3132969 etc. in the NCBI SNP Database) , SNPs in the BCL11B locus (accession number rs1951122 in the NCBI SNP Database, etc.). One type of these SNPs may be used as a detection target alone, or two or more types may be used in combination as a detection target. When these SNPs are detected in a sample, it can be determined that the sample has immunoreactivity to the HB vaccine.
Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するハプロタイプとしては、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１－ＤＱＢ１＊０５：０１等）等が挙げられる。これらのハプロタイプを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。一方で、検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有さない、又は免疫応答性が低いと判定することができる。
また、検体中に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、及び、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、の両方が検出された場合には、ワクチンへの高反応性が有意となることから、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。
Haplotypes related to the presence or absence of immune responsiveness to hepatitis B vaccine include HLA class II gene haplotypes (HLA-DRB1 * 08:03-DQB1 * 06:01, HLA-DRB1 * 14:06-DQB1 * 03: 01, HLA-DRB1 * 15:01-DQB1 * 06:02, HLA-DRB1 * 01:01-DQB1 * 05:01, etc.). One of these haplotypes may be used as a detection target alone, or two or more types may be used in combination as a detection target. When at least one haplotype of HLA-DRB1 * 08:03-DQB1 * 06:01 and HLA-DRB1 * 15:01-DQB1 * 06:02 is detected in the sample, the sample is HB vaccine can be determined to have immunoreactivity to On the other hand, when at least one haplotype of HLA-DRB1 * 04:05-DQB1 * 04:01 and HLA-DRB1 * 14:06-DQB1 * 03:01 is detected in the sample, the sample can be determined to have no or low immunoresponsiveness to the HB vaccine.
In addition, at least one haplotype of HLA-DRB1 * 08:03-DQB1 * 06:01 and HLA-DRB1 * 15:01-DQB1 * 06:02, and HLA-DRB1 * 04: If both haplotypes of 05-DQB1 * 04:01 and at least one of HLA-DRB1 * 14:06-DQB1 * 03:01 are detected, high reactivity to the vaccine is significant. Therefore, it can be determined that the specimen has immunoreactivity to the HB vaccine.
これら他のＳＮＰやハプロタイプの検出方法としては、上述したハプロタイプの検出方法と同様の方法が挙げられる。 Methods for detecting these other SNPs and haplotypes include methods similar to the methods for detecting haplotypes described above.
＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する試薬＞
本実施形態の試薬は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する核酸プローブ又はプライマーを含む。本実施形態の試薬は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無の検査用試薬として有用である。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４としては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ハプロタイプの検出方法として記載した方法を用いて適宜作製することができる。
<Reagent for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine>
The reagent of this embodiment includes a nucleic acid probe or primer that detects HLA class II gene haplotype HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04. The reagent of this embodiment is useful as a test reagent for the presence or absence of immunoreactivity to hepatitis B vaccine. Examples of HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 include those exemplified in the above "Method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine". In addition, with respect to nucleic acid probes or primers, those skilled in the art can appropriately prepare them using the method described as the method for detecting haplotypes in the above "Method for detecting genetic factors of immunoresponsiveness to hepatitis B vaccine". be able to.
本実施形態の試薬は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含むことが好ましい。当該核酸プローブ又はプライマーを更に含むことで、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い被験者の検出をより効率良く行うことができる。 The reagent of this embodiment preferably further contains one or more nucleic acid probes or primers that detect the HLA class II gene haplotype HLA-DRB1*04:05-DQB*04:01. By further including the nucleic acid probe or primer, detection of subjects with no or low immunoreactivity to Beamgen and Heptabax-II can be performed more efficiently.
本実施形態の試薬は、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、ＳＮＰタイピングに通常用いられる試薬、陽性コントロール、溶媒及び溶質を更に含むことができる。当該試薬としては、例えば、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）やＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。溶媒及び溶質としては、例えば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等が挙げられる。 In addition to the above nucleic acid probes or primers, the reagents of this embodiment can further include reagents, positive controls, solvents and solutes commonly used for SNP typing. Examples of such reagents include deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) and DNA polymerase. Solvents and solutes include, for example, distilled water, pH buffer reagents, salts, proteins, surfactants, and the like.
上記核酸プローブ又はプライマーは、上述した２種類のハプロタイプとは無関係な配列が含まれていてもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質、酵素、放射性同位元素、発光物質等で標識されていてもよい。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネート等が挙げられる。酵素としては、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体等が挙げられる。 The nucleic acid probes or primers may contain sequences unrelated to the two types of haplotypes described above. Also, the nucleic acid probe or primer may be a chimera of DNA and RNA. In addition, the nucleic acid probe or primer may be labeled with a fluorescent substance, a binding affinity substance such as biotin or digoxin, an enzyme, a radioisotope, a luminescent substance, or the like. Examples of fluorescent substances include fluorescamine and fluorescein isothiocyanate. Examples of enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, malate dehydratase, α-glucosidase, α-galactosidase and the like. Examples of radioactive isotopes include 125 I, 131 I, 3 H, 14 C and the like. Luminescent substances include, for example, luciferin, lucigenin, luminol, and luminol derivatives.
本実施形態の試薬は、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器等も含んでもよい。検出器としては、例えば、分光器、放射線検出器、光散乱検出器等の上記核酸プローブ又はプライマーの標識を検出可能なものが挙げられる。 In addition to the nucleic acid probes or primers described above, the reagent of the present embodiment may also contain a reference sample, a detector, etc., for use as a reference for comparison or for creating a calibration curve. The detector includes, for example, spectrometers, radiation detectors, light scattering detectors, and the like, which can detect the label of the above nucleic acid probe or primer.
本実施形態の試薬は、上述した２種類のハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーに加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーを含むことができる。当該ＳＮＰやハプロタイプとしては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、これらＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ハプロタイプの検出方法として記載した方法を用いて適宜作製することができる。 In addition to the nucleic acid probes or primers that detect the two types of haplotypes described above, the reagents of the present embodiment include nucleic acid probes or primers that detect other SNPs and haplotypes associated with the presence or absence of immunoreactivity to hepatitis B vaccine. can contain. Examples of the SNPs and haplotypes include those exemplified in the above "Method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine". In addition, nucleic acid probes or primers for detecting these SNPs and haplotypes are described as methods for detecting haplotypes in the above "Method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine" by those skilled in the art. It can be produced as appropriate using the method.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
＜材料及び測定方法＞
［試料及び臨床データ］
本研究でビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て組換え沈降ＨＢワクチン（ビームゲン、化学及血清療法研究所製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ヘプタバックス－ＩＩワクチン（ＭＳＤ ＫＫ製）の予防接種を受けた個人は上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
一方、本研究でヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て全て組換え沈降ＨＢワクチン（ヘプタバックス－ＩＩ、ＭＳＤ ＫＫ製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ビームゲンワクチン（化学及血清療法研究所製）の予防接種を受けた個人は上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
<Material and measurement method>
[Samples and clinical data]
Genomic DNA samples from 1193 Japanese adults used in this study to detect genetic factors of immune responsiveness to Biemgen were all recombinant precipitated HB vaccine (Biemgen, Chemo- and Serum Therapy Laboratory), They were obtained from healthy adult volunteers (18 years and older) who received 3 vaccinations (0.5 mL) at 1 and 6 months. Individuals vaccinated with the Heptavax-II vaccine (manufactured by MSD KK) are not included in the 1193 genomic DNA samples.
On the other hand, the genomic DNA samples of 555 Japanese adults used in this study to detect genetic factors of immunoreactivity to heptavax-II were all recombinant precipitated HB vaccine (Heptavax-II, manufactured by MSD KK). ) from healthy adult volunteers (18 years and older) who received 3 vaccinations (0.5 mL) at 0, 1 and 6 months. Individuals vaccinated with Beamgen vaccine (Laboratory of Chemo-Serotherapy) are not included in the above 555 genomic DNA samples.
血清抗ＨＢＶ表面抗体（ＨＢｓＡｂ）及び血清抗ＨＢＶコア抗体（ＨＢｃＡｂ）は、それぞれ、抗ＨＢｓキット及び抗ＨＢｃ ＩＩ キットを使用し、且つ、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉ２０００ＳＲアナライザー（Ａｂｂｏｔｔ Ｊａｐａｎ製）を使用した完全自動化学発光酵素免疫測定システムで、ワクチン接種前及び最終接種の１か月後に確認した。ＨＢｃＡｂ陽性（＞１．０ Ｓ／ＣＯ）の個人は、本研究には含まれない。
本研究では、上記ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例を以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３５１。
ｇｒｏｕｐ＿２、高応応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝７３５。
１１９３例の個人の臨床情報は、グループ毎に以下のＵＲＬにまとめられている（http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.29876/suppinfo）。
また、上記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例についても同様に、以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。
ｇｒｏｕｐ＿２、高反応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝３０５。
Serum anti-HBV surface antibody (HBsAb) and serum anti-HBV core antibody (HBcAb) were measured using anti-HBs kit and anti-HBc II kit, respectively, and fully automated chemiluminescence using Architect i2000SR analyzer (manufactured by Abbott Japan). An enzyme immunoassay system was used to confirm pre-vaccination and one month after the last vaccination. HBcAb positive (>1.0 S/CO) individuals were not included in the study.
In this study, 1193 Japanese adults used to detect genetic factors of immune responsiveness to Beamgen were classified into the following three groups:
group_0, low response group, HBsAb <10 mIU/mL, n=107.
group_1, medium response group, 10 mIU/mL<HBsAb≦100 mIU/mL, n=351.
group_2, high response group, 100 mIU/mL<HBsAb≦1000 mIU/mL, n=735.
Individual clinical information of 1193 cases is summarized for each group at the following URL (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.29876/suppinfo).
In addition, the 555 Japanese adults used to detect genetic factors of immunoreactivity to heptabax-II were similarly classified into the following three groups:
group_0, low response group, HBsAb <10 mIU/mL, n=66.
group_1, medium response group, 10 mIU/mL<HBsAb≦100 mIU/mL, n=124.
group_2, high response group, 100 mIU/mL<HBsAb, n=305.
［ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）］
上記ゲノムＤＮＡサンプルについて、製造元の指示に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｘｉｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ ＡＳＩ １ Ａｒｒａｙを使用して、ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施した。
[Genome-wide association analysis (GWAS)]
Genome-wide SNP analysis was performed on the above genomic DNA samples using the Affymetrix Axiom Genome-Wide ASI 1 Array according to the manufacturer's instructions.
［ＨＬＡ ｉｍｕｐｕｔａｔｉｏｎ法］
上記５５５例のＳＮＰデータは、ｈｇ１９の位置に基づいて、２５，７５９，２４２ｂｐ以上３３，５３４，８２７ｂｐ以下の範囲の拡張ＭＨＣ（ｘＭＨＣ）領域から抽出した。以前の報告（非特許文献１）と同じ方法を用いて、ＨＩＢＡＧ Ｒパッケージを使用して、３つのＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子に対して、２－ｆｉｅｌｄ ＨＬＡ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎを実施した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、及びＤＰＢ１の場合には、ＨＬＡ遺伝子型ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎには、当所が所有する日本語参照ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎが使用された。呼び出した閾値（ＣＴ＞０．５）を使用して、ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ後の品質管理を適用した。Ｇｒｏｕｐ＿０の６３例、Ｇｒｏｕｐ＿１の１７４例、及びＧｒｏｕｐ＿２の２７８例からなる合計５１５例のサンプルは、３つの推定ＨＬＡ遺伝子型を示し、すべてが閾値を満たしていた 合計で、２２個のＨＬＡ―ＤＲＢ１、１４個のＨＬＡ－ＤＱＢ１、及び１１個のＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子型をＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子に代入した。
[HLA Imputation Method]
The above 555 SNP data were extracted from the extended MHC (xMHC) region ranging from 25,759,242 bp to 33,534,827 bp based on the position of hg19. 2-field HLA genotype imputation was performed for three HLA class II genes using the HIBAG R package using the same method as a previous report (Non-Patent Document 1). For HLA-DRB1, DQB1, and DPB1, the HLA genotype imputation used our proprietary Japanese reference imputation. A post-imputation quality control was applied using the recalled threshold (CT>0.5). A total of 515 samples, consisting of 63 cases in Group_0, 174 cases in Group_1, and 278 cases in Group_2, showed 3 putative HLA genotypes, all meeting thresholds. 14 HLA-DQB1 and 11 HLA-DPB1 genotypes were assigned to HLA class II genes.
［実施例１］
上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－２中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。
[Example 1]
Using the 555 genomic DNA samples, the genome-wide SNP analysis was performed, and a genome-wide association analysis (GWAS) was performed to compare two groups in Status-1 and Status-2 shown below.
Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ＿０（低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６）に対する、ｇｒｏｕｐ＿１＋ｇｒｏｕｐ＿２（中反応群＋高反応群、ＨＢｓＡｂ＞１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝４８９）
Ｓｔａｔｕｓ－２：ｇｒｏｕｐ＿０（低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６）に対する、ｇｒｏｕｐ＿２（高反応群、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３０５）
Status-1: group_1 + group_2 (medium response group + high response group, HBsAb > 10mIU/mL, n = 489) for group_0 (low response group, HBsAb ≤ 10mIU/mL, n = 66)
Status-2: group_2 (high response group, HBsAb > 100 mIU/mL, n = 305) against group_0 (low response group, HBsAb < 10 mIU/mL, n = 66)
以前の研究により、ビームゲンを対象としたＧＷＡＳにおいてビームゲン応答性との関連が有意（Ｐ値＜０．０００１）となったＳＮＰの中で、ヘプタバックス－ＩＩを対象としたＧＷＡＳでも応答性が有意（Ｐ値＜０．０５）となった７２個のＳＮＰのオッズ比は非常に高い相関を示した（Ｒ２＝０．８８５６）。一方で、ヘプタバックス－ＩＩ接種者とビームゲン接種者を３群ごとに比較した結果、ゲノムワイドで有意となるＳＮＰが存在しなかった。
これらのことから、ＧＷＡＳでは、２種類のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関わる遺伝子に有意な違いを検出できないことが分かった。
A previous study showed that among the SNPs that were significantly associated with Beamgen responsiveness (P value < 0.0001) in the GWAS for Biemen, responsiveness was also significant in the GWAS for heptabax-II. The odds ratios of the 72 SNPs with (P-value < 0.05) showed a very high correlation (R2 = 0.8856). On the other hand, as a result of comparing heptabax-II inoculated subjects and Biemgen inoculated subjects in three groups, no SNP was found to be significant genome-wide.
From these results, it was found that GWAS could not detect significant differences in the genes involved in immune responsiveness to the two types of hepatitis B vaccines.
続いて、ＨＬＡ関連解析を実施した。
具体的には、ＨＬＡ関連解析においても、まずはヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例を同様に、以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。
ｇｒｏｕｐ＿２、高反応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝３０５。
Subsequently, HLA association analysis was performed.
Specifically, in the HLA association analysis, first, 555 Japanese adults used to detect genetic factors of immunoreactivity to heptabax-II were similarly classified into the following three groups:
group_0, low response group, HBsAb <10 mIU/mL, n=66.
group_1, medium response group, 10 mIU/mL<HBsAb≦100 mIU/mL, n=124.
group_2, high response group, 100 mIU/mL<HBsAb, n=305.
次いで、それぞれの応答群におけるハプロタイプ及びアリルとの関連をＨＬＡ ｉｍｕｐｕｔａｔｉｏｎ法により解析した。 Next, the association with haplotypes and alleles in each response group was analyzed by the HLA imputation method.
まず、各反応群とＨＬＡハプロタイプとの関係性について検討した。結果を表１（ｇｒｏｕｐ＿０とｇｒｏｕｐ＿２の比較）及び表２（ｇｒｏｕｐ＿０とｇｒｏｕｐ＿１＋ｇｒｏｕｐ＿２の比較）に示す。 First, the relationship between each reaction group and HLA haplotype was examined. The results are shown in Table 1 (comparison of group_0 and group_2) and Table 2 (comparison of group_0 and group_1+group_2).
表１及び表２に示すように、ハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１）及びアリル（ＤＰＢ＊０５：０１）が有意な関連を示した。それぞれにおけるオッズ比（ＯＲ）が１より大きいことから、これらハプロタイプ及びアリルを有すると、グループ０となる確率が有意に大きい、つまり低反応群となりやすいことが示唆された。 As shown in Tables 1 and 2, the haplotype (HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01) and allele (DPB*05:01) showed significant association. The odds ratio (OR) for each was greater than 1, suggesting that having these haplotypes and alleles has a significantly higher probability of being in Group 0, that is, a low-response group.
次に、ＨＬＡハプロタイプとヘプタバックス－ＩＩ応答性との関係性と、以前行った日本人成人１，１９３例を対象としたＨＬＡハプロタイプとビームゲン応答性との関係性（非特許文献１参照）とを比較した。表３は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれの高反応群（Ｇｒｏｕｐ＿２）におけるＨＬＡハプロタイプの比率を示したものである。表４は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれの中高反応群（Ｇｒｏｕｐ＿１＋Ｇｒｏｕｐ＿２）におけるＨＬＡハプロタイプの比率を示したものである。 Next, the relationship between the HLA haplotype and heptabax-II responsiveness, and the relationship between the HLA haplotype and Beamgen responsiveness in 1,193 Japanese adults previously conducted (see Non-Patent Document 1) compared. Table 3 shows the ratio of HLA haplotypes in the high response group (Group_2) of heptabax-II and Biemgen, respectively. Table 4 shows the ratio of HLA haplotypes in the medium-high response groups (Group_1+Group_2) of Heptabax-II and Biemgen, respectively.
表３及び表４に示したように、２種のハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４）が有意な関連を示した。それぞれのオッズ比（ＯＲ）から、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１を有すると、ヘプタバックス－ＩＩの群が有意に大きい、つまりヘプタバックス－ＩＩの群で高反応群及び中高反応群となりやすい。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有すると、ビームゲンの群が有意に大きい、つまりビームゲンの群で高反応群となりやすいことが示された。
なお、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれにおける低反応群、中反、及び応群高反応群との比較により、本ハプロタイプを有すると、いずれのワクチンの場合も低反応群となりやすいことが既に示されているハプロタイプである。
他方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４はヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれにおける中高反応群との比較で初めて有意な相関が認められた。
As shown in Tables 3 and 4, two haplotypes (HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01 and HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04) showed significant association. rice field. From the respective odds ratios (OR), with HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01, the heptabax-II group was significantly larger, that is, the heptabax-II group It tends to be a reactive group. On the other hand, it was shown that with HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, the Biemgen group was significantly larger, that is, the Biemgen group tended to be a high response group.
In addition, HLA-DRB1 * 04: 05-DQB1 * 04: 01 has this haplotype by comparison with the low response group, intermediate response group, and high response group in heptabax-II and Beamgen, respectively. This is a haplotype that has already been shown to be likely to be a low-response group even in the case of the vaccine.
On the other hand, for HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, a significant correlation was observed for the first time in comparison with the medium-high response group in heptabax-II and Beamgen, respectively.
そこで、続いてＨＬＡハプロタイプと、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩの高反応群それぞれと健常者群の関係性を比較した。結果を表５に示す。 Therefore, subsequently, the relationship between the HLA haplotype and the Biemgen and Heptabax-II high-response groups and the healthy subject group was compared. Table 5 shows the results.
表５に示すように、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４がヘプタバックス－ＩＩ高反応群と健常者群との比較において有意な関連を示した。一方、健常者群とビームゲン高反応群では、同ハプロタイプにおいて有意な相関は得られなかった。なおヘプタバックス－ＩＩ高反応群と健常者群との比較におけるオッズ比（ＯＲ）が１より小さいことから、これらハプロタイプを有する確率は健常者の群が有意に大きい。つまり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する群は、ヘプタバックス－ＩＩ高反応群よりも健常者の群において割合が有意に多いことを示しており、間接的に同ハプロタイプを有する群はヘプタバックス－ＩＩ接種において高反応群となりにくいことを示唆している。 As shown in Table 5, HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 showed a significant association in comparison between the heptabax-II high response group and the healthy subject group. On the other hand, no significant correlation was obtained in the same haplotype between the healthy subject group and the Biemen high-response group. Since the odds ratio (OR) in comparison between the heptabax-II high response group and the healthy subject group is less than 1, the probability of having these haplotypes is significantly higher in the healthy subject group. That is, the group having HLA-DRB1 * 13: 02-DQB1 * 06: 04 indicates that the proportion in the group of healthy subjects is significantly higher than the heptabax-II high response group, indirectly the same haplotype , suggesting that the group with .
また、ＩＥＤＢ（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２と、ビームゲン又はヘプタバックス－ＩＩの抗原ペプチドの結合予測を行なった。 Also, using IEDB (Immune Epitope Database), prediction of binding between HLA-DRB1*04:05 or HLA-DRB1*13:02 and Biemgen or Heptabax-II antigen peptides was performed.
その結果、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５では、ヘプタバックス－ＩＩの抗原ペプチドのほうが安定的な結合を示すものが多いことが明らかとなった。また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２との結合において、ヘプタバックス－ＩＩでは不安定で、ビームゲンでは安定である抗原ペプチドの配列を探索したところ、ヘプタバックス－ＩＩに特有の配列であって、Ｎ末端から１３４番目のアミノ酸残基から１４８番目のアミノ酸残基までの１５アミノ酸残基からなる配列（FPSCCCTKP[T/S]DGNCT：配列番号７）であることが明らかとなった。 As a result, it was revealed that in HLA-DRB1*04:05, most of the heptabax-II antigen peptides exhibited stable binding. In addition, upon searching for antigen peptide sequences that are unstable with heptabax-II in binding to HLA-DRB1*13:02 but are stable with Biemgen, a sequence unique to heptabax-II, N It was found to be a sequence (FPSCCCTKP[T/S]DGNCT: SEQ ID NO: 7) consisting of 15 amino acid residues from the 134th amino acid residue to the 148th amino acid residue from the end.
以上の結果から、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１を有する場合には、当該検体は、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い傾向があり、一方で、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する場合には、当該検体は、ビームゲンに対する免疫応答性を有し、ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い傾向があることが示唆された。 From the above results, when the specimen has HLA-DRB1*04:05-DQB1*04:01, the specimen has no or low immunoreactivity to Beamgen and Heptabax-II. On the other hand, if the specimen has HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04, then the specimen has immunoreactivity to Beamgen and immunoreactivity to Heptabax-II. It was suggested that there is a tendency to have no or low immune responsiveness.
本実施形態の方法及び試薬によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。 According to the method and reagent of the present embodiment, genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine in a subject can be detected simply and reliably.
Claims (4)
前記Ｂ型肝炎ワクチンがビームゲン（登録商標）及びヘプタバックス（登録商標）－ＩＩであり、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、
を含む、方法。 A method for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine, comprising:
the hepatitis B vaccine is Beamgen® and Heptavax®-II;
detecting HLA class II gene haplotypes in a DNA-containing sample from a subject;
when HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04 is detected as the haplotype, the subject has immunoreactivity to the Beamgen and does not have immunoreactivity to the heptabax-II, or Determining that immune responsiveness is low;
A method, including
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、試薬。 A reagent for detecting genetic factors of immune responsiveness to hepatitis B vaccine, comprising:
A reagent comprising one or more nucleic acid probes or primers that detect the HLA class II gene haplotype HLA-DRB1*13:02-DQB1*06:04.
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