JP6521382B2 - Method for detecting hereditary factors of chronicity and / or progression of hepatitis B - Google Patents

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Description

本発明は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎又はその病態進展の検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットに関する。   The present invention relates to a method of detecting a predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B, including allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B, examination of chronic hepatitis B or its disease progression , A reagent for detecting chronic disease of hepatitis B and / or a predisposition for disease progression, and a test kit for chronic disease and / or disease progression of hepatitis B including the reagent.

世界人口の１／３にあたる人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しているといわれている。Ｂ型肝炎は、一過性に終息する一過性感染と慢性肝炎に大別される。急性肝炎は感染後１〜６か月後の潜伏期間を経て症状が出現し、数週間で回復過程に入る。しかし急性肝炎を発症した患者のうち１〜２％の人は劇症肝炎を発症する危険性があり、劇症肝炎を発症した人の７０〜８０％は死亡する。   One third of the world's population is said to be infected with hepatitis B virus (HBV). Hepatitis B is roughly classified into transient infection and chronic hepatitis, which are transiently terminated. In acute hepatitis, symptoms appear after an incubation period of 1 to 6 months after infection, and enter a recovery process in several weeks. However, 1-2% of patients who develop acute hepatitis are at risk of developing fulminant hepatitis, and 70-80% of people who develop fulminant hepatitis die.

一方、感染したＨＢＶが体内から排除されず６か月以上にわたって肝臓の中に住み着くことでキャリアとなる。キャリアの８〜９割は無症候期、一過性の肝炎期、肝炎沈静期を経て、その後は無症候キャリアのまま経過する。しかし、１〜２割は慢性肝炎に移行し、さらに、その一部が肝硬変や肝がんへと移行する。Ｂ型肝炎ウイルス慢性保菌者は東南アジアや東太平洋地域に多く分布し、特に、日本にはおよそ１５０万人のＢ型肝炎感染者がいるといわれている。   On the other hand, infected HBV becomes a carrier by staying in the liver for 6 months or more without being excluded from the body. Eighty to ninety percent of carriers go through an asymptomatic phase, a transient hepatitis phase, a hepatitis settling phase, and then an asymptomatic carrier. However, 12 to 20% shift to chronic hepatitis, and further, some shift to cirrhosis or liver cancer. Hepatitis B virus chronic carrier carriers are widely distributed in Southeast Asia and the East Pacific region, and in particular, it is said that Japan has approximately 1.5 million hepatitis B infected people.

このように、ＨＢＶ感染後の経過は多岐にわたり、主として慢性肝炎、肝がんに関与するウイルス側の遺伝要因が調べられてきた。しかしながら、近年では、宿主側の遺伝要因の探索も進み、日本人を含むアジア人サンプルを用いたゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study: ＧＷＡＳ）により、Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）に関連する新たな遺伝要因が報告されている。ＨＢＶ持続感染やウイルス排除にはHLA-DPA1及びHLA-DPB1の関連が示唆されており（非特許文献１、非特許文献２）、HLA-DRと連鎖不平衡のあるHLA-DQの関与も示唆された（非特許文献３）。しかしながら、ＧＷＡＳを用いた解析では、慢性化に関与するそれ以外の強い遺伝要因は見つかっていない。また、がん化についても近年のＧＷＡＳにより、中国から幾つかの宿主遺伝要因が報告されている（非特許文献４及び５）。   Thus, the course after HBV infection is diverse, and the genetic factors on the virus side mainly involved in chronic hepatitis and liver cancer have been investigated. However, in recent years, genetic factors on the host side have been searched, and new genome related association with chronic hepatitis B (CHB) has been made by genome wide association study (GWAS) using Asian samples including Japanese. Genetic factors have been reported. Association of HLA-DPA1 and HLA-DPB1 is suggested for HBV persistent infection and virus elimination (Non-patent document 1, Non-patent document 2), and involvement of HLA-DQ having linkage disequilibrium with HLA-DR is also suggested (Non-Patent Document 3). However, analysis using GWAS has not found any other strong genetic factors involved in chronicity. In addition, with regard to canceration, recent host researchers have reported some host genetic factors from China by GWAS (Non-patent Documents 4 and 5).

Kamatani Y, Wattanapokayakit S, Ochi H, Kawaguchi T, Takahashi A, et al. (2009) A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians. Nat Genet 41: 591-595.Kamatani Y, Wattanapokayakit S, Ochi H, Kawaguchi T, Takahashi A, et al. (2009) A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians. Nat Genet 41: 591-595 . Nishida N, et.al., Genome-Wide Association Study Confirming Association of HLA-DP with Protection against Chronic Hepatitis B and Viral Clearance in Japanese and Korean Plos ONE June 2012 vol. 7, Issue 5, e39175Nishida N, et. Al., Genome-Wide Association Study Confirming Association of HLA-DP with Protection against Chronic Hepatitis B and Viral Clearance in Japanese and Korean Plos ONE June 2012 vol. 7, Issue 5, e39175 Mbarek H, Ochi H, Urabe Y, Kumar V, Kubo M, et al. (2011) A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population. Hum Mol Genet 20: 3884-3892Mbarek H, Ochi H, Urabe Y, Kumar V, Kubo M, et al. (2011) A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population. Hum Mol Genet 20: 3884-3892 Li S, Qian J, Yang Y, Zhao W, Dai J, et al. (2012) GWAS Identifies Novel Susceptibility Loci on 6p21.32 and 21q21.3 for Hepatocellular Carcinoma in Chronic Hepatitis B Virus Carriers. PloS Genet 7(5): e39175LiS, Qian J, Yang Y, Zhao W, Dai J, et al. (2012) GWAS Identifies Novel Susceptibility Loci on 6p 21.32 and 21q 21.3 for Hepatocellular Carcinoma in Chronic Hepatitis B Carriers. PloS Genet 7 (5) : e39175 Jiang DK, Sun J, Cao G, Liu Y, Lin D, et al. (2013) Genetic variants in STAT4 and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. Nat Genet 45: 72-5Jiang DK, Sun J, Cao G, Liu Y, Lin D, et al. (2013) Genetic variants in STAT4 and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. Nat Genet 45: 72-5

HLA-DPについては、アリル頻度をＢ型慢性肝炎患者群と比較対照群で比較した報告があるものの（非特許文献１）、当該アリル頻度の研究では、比較対照群として非肝炎患者群を用いているため、当該実験結果にはＢ型慢性肝炎患者群と健常者群との相違が反映されているか不明確であるという問題があった。また、病態進展に関してはHLA-DPBアリルとの関連は調べられていない。   For HLA-DP, although there has been a report that allyl frequency is compared between chronic hepatitis B patient group and comparison control group (Non-patent document 1), in the study of allele frequency, non-hepatitis patient group is used as comparison control group. Therefore, there is a problem that the difference between the chronic hepatitis B patient group and the healthy subject group is reflected or unclear in the experimental result. In addition, with regard to disease progression, the association with HLA-DPB allele has not been investigated.

そこで、本発明は、健常者群、ＨＢＶ患者群、Ｂ型慢性肝炎群及びＢ型肝炎病態進展群（肝硬変又は肝がん）を用いて解析を実施し、Ｂ型慢性肝炎及び病態進展に感受性及び抵抗性のアリルを同定することにより、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎、肝硬変又は肝がんの検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットを提供することを目的とする。   Therefore, in the present invention, analysis is performed using a group of healthy persons, a group of HBV patients, a group of chronic hepatitis B and a group of hepatitis B disease progression (hepatic cirrhosis or liver cancer) and is sensitive to chronic hepatitis B and disease progression. And a method for detecting a hereditary predisposition for the development of chronic hepatitis B and / or disease progression, including allyl related to chronic hepatitis B and / or disease progression by identifying resistant and resistant alleles, chronic B HELP A method for testing for hepatitis C, cirrhosis or liver cancer, a reagent for detecting chronic disease of hepatitis B and / or a predisposition for disease progression and chronicity and / or disease progression of hepatitis B containing the reagent The purpose is to provide a test kit.

本発明者らは、健常者群、ＨＢＶ患者群、Ｂ型慢性肝炎群及びＢ型肝炎病態進展群（肝硬変又は肝がん）を用いてHLA-DPに関するタイピングを実施し、Ｂ型肝炎の慢性化に関連するアリルを見出した。それにより、当該アリルを用いた、Ｂ型肝炎の慢性化及び病態進展の素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎、肝硬変又は肝がんの検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び病態進展の検査キットを構築するに至った。   The present inventors conducted typing on HLA-DP using a group of healthy subjects, a group of HBV patients, a group of chronic hepatitis B and a group of hepatitis B disease progression (hepatic cirrhosis or liver cancer), and chronic hepatitis B. Found an allyl related to Thus, using the allyl, a method of detecting a predisposition for chronicity of hepatitis B and disease progression, a method for testing chronic hepatitis B, cirrhosis or liver cancer, chronicity of hepatitis B and disease progression It came to construct the test kit of the reagent for the detection of a predisposition, and the chronicity of hepatitis B containing the said reagent, and a pathological condition progress.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法であって、以下の：
ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；
ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及び
ｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む、方法。
（２） （１）記載の方法であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、方法。
（３） （２）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、方法。
（４） （２）又は（３）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、方法。
（５） （２）〜（４）いずれか１項記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、方法。
（６） （１）〜（５）記載の方法により、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査を行う方法。
（７） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを検出するプライマーを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬。
（８） （７）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、試薬。
（９） （８）記載の試薬であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、試薬。
（１０） （８）又は（９）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、試薬。
（１１） （８）〜（１０）いずれか１項記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、試薬。
（１２） （７）〜（１１）いずれか１項記載のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬を含むキット。That is, the present invention is as follows.
(1) A method of detecting a predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B, which comprises the following:
a) comparing the nucleotide sequence or amino acid sequence corresponding to the allele in the sample with the allele related to chronicization of hepatitis B and / or disease progression;
b) analyzing whether the base or amino acid residue at the site corresponding to the allyl of the sample corresponds to the base or amino acid residue of allyl; and c) whether the hepatitis B in the sample has become chronic and / or Identifying whether the pathological condition is progressing.
(2) The method according to (1), wherein the allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B is susceptible or resistant to chronicity and / or disease progression of hepatitis B There is a way.
(3) The method according to (2), wherein the combination of alleles related to chronicity and / or disease progression of hepatitis B is a combination of only susceptible alleles, only the resistant alleles. Or a combination of any of the combination of the sensitive allyl and the resistant allyl.
(4) The method according to (2) or (3), wherein the allele susceptible to chronicity of hepatitis B is HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01, and said B Alleles resistant to chronic hepatitis B are HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01, which are resistant to the progression of the pathological condition of chronic hepatitis B The method, wherein one allyl is HLA-DPB1 * 02: 01.
(5) The method according to any one of (2) to (4), wherein the combination of alleles resistant to chronic hepatitis B is HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * Method: 04:01 or HLA-DPB1 * 04: 02 and HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01.
(6) A method of examining chronicity and / or disease progression of hepatitis B by the method described in (1) to (5).
(7) A reagent for detecting a predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B, comprising a primer for detecting allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B.
(8) The reagent according to (7), wherein the allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B is susceptible or resistant to chronicity and / or disease progression of hepatitis B Is the reagent.
(9) The reagent according to (8), wherein the combination of alleles related to chronicity and / or disease progression of hepatitis B is a combination of only the susceptible alleles, only the resistant alleles A reagent, which is a combination or any combination of the sensitive allyl and the resistant allyl.
(10) The reagent according to (8) or (9), wherein the allele susceptible to chronicity of hepatitis B is HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01, and the B Alleles resistant to chronic hepatitis B are HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01, which are resistant to the progression of the pathological condition of chronic hepatitis B The reagent in which one allyl is HLA-DPB1 * 02: 01.
(11) The reagent according to any one of (8) to (10), wherein the combination of alleles resistant to chronic hepatitis B is HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * The reagent which is 04:01 or HLA-DPB1 * 04: 02 and HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01.
(12) (7) to (11) detection of a predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B, including allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B according to any one of the above Kit containing reagents for the

本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連するアリルをＨＢＶ患者群に対して解析することにより、Ｂ型肝炎慢性化及び／又は病態進展の分子機構の解明や創薬ターゲット候補分子の同定が可能になる。また、ＨＢＶキャリアに対して解析することにより、当該キャリアを慢性化及び病態進展がおきやすい群と慢性化及び病態進展がおきにくい群とに分類することが可能となり、その後の治療方針の決定に役立つ情報を提供できるという利点がある。それにより、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展を予防し、進行を防止し、適切な治療を行うことが可能となる。   Elucidation of the molecular mechanism of hepatitis B chronicification and / or disease progression and drug target candidates by analyzing alleles related to chronicity and / or disease progression of hepatitis B of the present invention to HBV patient group It enables identification of molecules. In addition, analysis on HBV carriers makes it possible to classify the carriers into a group that is likely to cause chronic disease and disease progression and a group that is unlikely to cause chronic disease and disease progression, and to decide on the treatment plan thereafter. It has the advantage of providing useful information. Thereby, it becomes possible to prevent chronicization and / or disease progression of hepatitis B, to prevent progression, and to perform appropriate treatment.

また、Ｂ型肝炎慢性化及び病態進展の遺伝要因に関しては、日本人を含むアジア人と欧米人の間で同様な傾向があるか否かということが明らかではない。本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連するアリルにより、日本人を含むアジア人に特化したＢ型肝炎慢性化及び／又は病態進展の治療方針の決定や創薬ターゲット候補分子の同定が可能となる。   In addition, it is not clear whether there is a similar tendency between Asians including Japanese and Westerners with respect to the hereditary factors of chronic hepatitis B and disease progression. Determination of therapeutic policy for hepatitis B and / or disease progression and drug development target candidates specialized for Asians including Japanese by the allyl associated with the chronic and / or disease progression of hepatitis B of the present invention It is possible to identify molecules.

さらに、当該アリルに加えて、他の免疫関連遺伝子のＳＮＰも含むより精度の高い検査キットの開発も可能となるという効果がある。   Furthermore, in addition to the allele, it is possible to develop a more accurate test kit that also includes SNPs of other immune related genes.

本発明に係るアリルとDPB1*01:01:01のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the alignment of the allele according to the present invention with the amino acid sequence of DPB1 * 01: 01: 01.

本発明は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎／又はその病態進展の検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットに関する。以下に本発明を説明する。   The present invention relates to a method for detecting a genetic predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B, including allyl associated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B, chronic hepatitis B / or disease progression thereof And a reagent for detecting the predisposition to chronicity of hepatitis B and / or disease progression, and a test kit for chronicity and / or disease progression of hepatitis B including the reagent. The present invention will be described below.

（１）本発明に係るＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル
本発明はＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルに関する。Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に関連のあるアリルとは、Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に感受性である（Ｂ型肝炎が慢性化しやすく、病態進展しやすい）か又は抵抗性である（Ｂ型肝炎が慢性化しにくく、病態進展しにくい）アリルをいう。(1) Allele Associated with Chronicization and / or Progression of Hepatitis B According to the Present Invention The present invention relates to an allyl associated with chronicization and / or progression of hepatitis B. Chronicization of hepatitis B, allyl related to disease progression is susceptible to chronicity of hepatitis B, disease progression (hepatitis B is prone to chronicity and disease progression) or resistance (Hepatitis B is less likely to become chronic and less likely to develop the disease state).

本発明において、「Ｂ型肝炎の慢性化」とは、ＨＢＶが持続感染している状態をいい、発症要因としては、以下の：ＨＢＶ持続感染者からの母児感染(垂直感染)；乳幼児期の医療行為等の理由で、ＨＢＶ持続感染者の血液や体液が体内に侵入した場合；体の免疫力が低下するような免疫抑制剤や抗がん剤の使用中にＨＢＶに感染した結果、ＨＢＶを体内から排除できずに持続感染を起こす場合；及び健常者が近年ジェノタイプＡ型という欧米型やアジア・アフリカ型等の外来種ＨＢＶに感染した場合等があげられる。このように、ＨＢＶに感染すると、８〜９割が無症候キャリアとなるが、１〜２割は慢性肝炎に移行する。さらにその中の一部が肝硬変や肝がんへ移行する。そこで、ＨＢＶの慢性化から肝硬変や肝がんに移行する群を、本発明の「Ｂ型肝炎の病態進展」という。「肝硬変」とは、肝炎ウイルス感染により損傷した肝臓が修復されるときにできる線維が肝臓に拡がった状態をいい、肝臓が硬くなったために腹水や食道静脈瘤が生じたり、肝臓機能が低下するために肝性脳症や黄疸が生じたりする原因となる。「肝がん」とは、肝炎ウイルスの感染が原因で生じる肝細胞がんをいう。   In the present invention, “chronicization of hepatitis B” refers to a state in which HBV is persistently infected, and the causes include the following: mother-infant infection from a person with HBV persistent infection (vertical infection); If the blood or body fluid of HBV persistently infected persons invades the body because of medical treatment etc., as a result of being infected with HBV while using immunosuppressive drugs and anticancer drugs that cause the body's immunity to decline, Examples include cases where persistent infection can not occur because HBV can not be excluded from the body; and cases in which healthy individuals are recently infected with foreign type HBV such as Western-type such as genotype A type or Asia-African type. Thus, when infected with HBV, 8 to 90% become asymptomatic carriers, but 1 to 2% shift to chronic hepatitis. Furthermore, some of them shift to liver cirrhosis and liver cancer. Therefore, a group that shifts from chronic HBV to cirrhosis or liver cancer is referred to as "progression of pathological condition of hepatitis B" of the present invention. "Circal cirrhosis" refers to a state in which the fibers formed when the liver damaged by hepatitis virus infection is repaired spread to the liver, and asthe liver becomes hard, ascites and esophageal varices occur, and the liver function decreases. Cause hepatic encephalopathy and jaundice. "Hepatocarcinoma" refers to hepatocellular carcinoma caused by hepatitis virus infection.

Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの検索は、慢性Ｂ型肝炎患者、肝硬変又は肝がん患者又は健常人から採取した生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製し、ダイレクトシークエンス法等によって遺伝子配列を解析することによって行う。このようにして得られた新規アリルは、慢性Ｂ型肝炎患者又は肝硬変又は肝がん患者から見出されたものであるため、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展との関連性が高い、本発明に係るアリルとして有望な候補である。上記のように選択したアリルとＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展との関連性を確認するには、統計的な検定によって行うことができる。例えば、Ｂ型肝炎の慢性化を有する群と健常人群における該候補アリルの出現率をそれぞれ算出し、当該候補アリルとＢ型肝炎の慢性化との関連を統計的に検定する。検定は、χ2検定、フィッシャーの正確確率検定（Fischer’s exact test）等、統計学上適当な方法によって行うことができ、必要に応じて有意水準の補正を行ってもよい。   Search for alleles related to chronicity and / or disease progression in hepatitis B involves preparing genomic DNA directly from biological samples collected from chronic hepatitis B patients, patients with liver cirrhosis or liver cancer, or healthy individuals, It is carried out by analyzing the gene sequence by the sequencing method or the like. The novel allyl thus obtained is found from patients with chronic hepatitis B or patients with cirrhosis or liver cancer, and is thus highly correlated with chronicity and / or disease progression of hepatitis B. , It is a promising candidate as allyl according to the present invention. Statistical analysis can be performed to confirm the relationship between the allele selected as described above and the chronicity and / or disease progression of hepatitis B. For example, the appearance rates of the candidate allele in the group having chronicity of hepatitis B and the group of healthy persons are calculated respectively, and the association between the candidate allele and chronicity of hepatitis B is statistically tested. The test can be performed by a statistically appropriate method such as? 2 test, Fischer's exact test, etc., and may be corrected at a significant level as necessary.

上記アリルを検出する方法は、特に制限はなく、当業者にとって公知の方法の中から選択することができる。例えば、TaqMan PCR法、MALDI-TOF/MS法、ASO (allele-specific oligonucleotide)法、直接シークエンス法、RFLP法、インベーダー法、TGGE, DGGE法、MutY 酵素法、マイクロアレイ、Protein truncation test (PTT)法、Snipper法等の公知のタイピング方法の中から、目的等に応じて選択することができる。PCR法を応用した方法が多いが、PCR法によらない方法もある。   The method of detecting the above-mentioned allyl is not particularly limited, and can be selected from methods known to those skilled in the art. For example, TaqMan PCR method, MALDI-TOF / MS method, ASO (allele-specific oligonucleotide) method, direct sequencing method, RFLP method, Invader method, TGGE, DGGE method, MutY enzyme method, microarray, Protein truncation test (PTT) method It can be selected from among known typing methods such as the Snipper method according to the purpose and the like. There are many methods to which the PCR method is applied, but there is also a method not based on the PCR method.

本発明者らは、日本人のＨＢＶ患者群４８９検体と健常対照群４６７検体、韓国人のＨＢＶ患者群３４０検体と健常対照群１４０検体についてHLA-DPB1のタイピングを行い、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルとしてHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01を、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を同定した。また、Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルとしてHLA-DPB1*02:01を同定した。HLAはヒトの主要組織適合性複合体（MHC; Major Histocompatibility Complex）であり、移植片や細菌、ウイルス等の外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質である。HLAには多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報についてはHLA nomenclature (http://hla.alleles.org/announcement.html)等に記載がある。なお、本明細書のアリルや多型の表記は、HLA nomenclatureによる表記方法に基づく。   The present inventors performed typing of HLA-DPB1 on 489 specimens of Japanese HBV patients and 467 specimens of healthy controls, 340 specimens of HBV patients of Koreans and 140 specimens of healthy controls, and resulted in chronic hepatitis B HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01 as alleles susceptible to uracil, and HLA-DPB1 * 04: 02 and HLA-DPB1 * 04 as alleles resistant to chronic hepatitis B. 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 were identified. In addition, HLA-DPB1 * 02: 01 was identified as an allele resistant to the progression of the pathological condition of chronic hepatitis B. HLA is a human major histocompatibility complex (MHC), and is a membrane protein that is presented to T cells by binding to foreign antigenic peptides such as grafts, bacteria and viruses. Many alleles are known to exist in HLA, and such information is described in HLA nomenclature (http://hla.alleles.org/announcement.html) and the like. In addition, the expression of allyl and polymorphism in the present specification is based on the expression method by HLA nomenclature.

上記アリルに関するシークエンスデータは、例えばGenBank（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されているデータを用いてよい。ここで、例えば、HLA-DPB1*05:01のｃＤＮＡは９１７塩基でありGenBankにAY804138（配列番号１）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78743（配列番号２）と登録されている。HLA-DPB1*09:01のｃＤＮＡは９０７塩基でありGenBankにAY804139（配列番号３）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78744（配列番号４）と登録されている。HLA-DPB1*04:02のｃＤＮＡは９１７塩基でありGenBankにAY804137（配列番号５）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78742（配列番号６）と登録されている。HLA-DPB1*04:01のｃＤＮＡは８８３塩基でありGenBankにAY804136（配列番号７）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78741（配列番号８）と登録されている。HLA-DPB1*02:01のｃＤＮＡは９０８塩基でありGenBankにAY804134（配列番号９）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78739（配列番号１０）と登録されている。DPB1*01:01:01のアミノ酸配列を配列番号１１（AAW78748）に示し、本発明の上記アリルとのアラインメントを示したのが図１である。
なお、上記のアリルHLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を「本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」、「本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連のあるアリル」「本発明に係るアリル」、また、アリルにかえて多型やＳＮＰという場合がある。The sequence data on the allele may be, for example, data registered in a database such as GenBank (NIH genetic sequence database) or DDBJ (DNA Data Bank of Japan). Here, for example, the cDNA of HLA-DPB1 * 05: 01 has 917 bases, and is registered in GenBank as AY804138 (SEQ ID NO: 1), and amino acid is 258 residues as AAW78743 (SEQ ID NO: 2). The cDNA of HLA-DPB1 * 09: 01 has 907 bases and is registered in GenBank as AY804139 (SEQ ID NO: 3) and amino acid as AAW78744 (SEQ ID NO: 4) with 258 residues. The cDNA of HLA-DPB1 * 04: 02 has 917 bases, and is registered in GenBank as AY804137 (SEQ ID NO: 5) and amino acid at 258 residues as AAW78742 (SEQ ID NO: 6). The cDNA of HLA-DPB1 * 04: 01 has 883 bases, and is registered in GenBank as AY804136 (SEQ ID NO: 7) and amino acid at 258 residues as AAW 78741 (SEQ ID NO: 8). The cDNA of HLA-DPB1 * 02: 01 has 908 bases and is registered in GenBank as AY804134 (SEQ ID NO: 9) and amino acid at 258 residues as AAW 78739 (SEQ ID NO: 10). The amino acid sequence of DPB1 * 01: 01: 01 is shown in SEQ ID NO: 11 (AAW78748), and FIG. 1 shows the alignment with the above allyl of the present invention.
The above-mentioned allyl HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 “the B of the present invention Allyl associated with chronic hepatitis and / or disease progression, Allyl associated with chronic hepatitis B of the present invention, Allyl according to the present invention It may be called SNP.

本発明で用いられるアリルは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。なお、本発明においてポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが２以上結合しているものをいい、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものを含む。また本発明におけるポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。   The allyl used in the present invention includes single-stranded and double-stranded DNA as well as the RNA complement thereof, and may be naturally derived or artificially produced. Examples of DNA include genomic DNA, cDNA corresponding to the genomic DNA, chemically synthesized DNA, DNA amplified by PCR, a combination thereof, and a hybrid of DNA and RNA. It is not limited. In the present invention, the term "polynucleotide" refers to a polynucleotide in which two or more nucleotides are linked, and generally includes those having a length called oligonucleotide. The polynucleotide in the present invention may be DNA or RNA.

これらの塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。For these base sequences, a probe is prepared using an appropriate fragment by a method known to those skilled in the art, and this probe is used to obtain cDNA live by known hybridization methods such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot and the like. It can be obtained from Larry and genomic libraries etc.
For a detailed procedure of the hybridization method, see “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001); in particular Section 6-7), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons 1987-1997); see, in particular, Section 6.3-6.4), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995); see Section 2.10, in particular, for hybridization conditions). Can.

（２）本発明に係るアリルを用いたＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法
本発明は、上記本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル（以下の記載では、「多型」「ＳＮＰ」という場合もある）を用いてＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因を検出する方法（タイピング方法）に関する。具体的には、以下の工程：ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及びｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む。本発明の上記方法は、「（１）本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」に記載したとおり、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルはHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*02:01であるという知見に基づく。上記方法について以下に詳細に説明する。(2) Method for Detecting Predisposition to Chronicization of Hepatitis B and / or Progression of Disease State Using Allyl According to the Present Invention The present invention relates to the above-mentioned chronicity and / or progress of disease state of hepatitis B of the present invention. The present invention relates to a method (typing method) of detecting a predisposition for chronicity and / or disease progression of hepatitis B using allyl (hereinafter sometimes referred to as "polymorphism" or "SNP"). Specifically, the following steps: a) comparing the nucleotide sequence or amino acid sequence corresponding to the allele in the sample with the allele related to chronicization of hepatitis B and / or disease progression; b) the sample Analyzing whether the base or amino acid residue at the site corresponding to the above allyl corresponds to the base or amino acid residue of allyl; and c) whether the hepatitis B in the sample has become chronic and / or the disease state has progressed Identifying the presence or absence of According to the above-mentioned method of the present invention, as described in “(1) Allyl associated with chronicization and / or disease progression of hepatitis B according to the present invention”, allyl susceptible to chronicization of hepatitis B is HLA- Allyls that are DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01 and are resistant to chronic hepatitis B are HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02 : 01, based on the finding that allyl, which is resistant to the progression of chronic hepatitis B disease, is HLA-DPB1 * 02: 01. The above method is described in detail below.

「ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程」は、換言すれば配列番号１〜１０で示される塩基配列及びアミノ酸配列のアリルの検出である。   “A) a step of comparing the nucleotide sequence or amino acid sequence corresponding to the allele related to chronicity and / or disease progression of hepatitis B with the allele in the sample”, in other words, SEQ ID NO: 1 to 10 It is a detection of the allele of the shown base sequence and amino acid sequence.

本発明では、アリルの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、検体からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおける本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連のあるアリルを検出することができる。また、検体からヒトHLA-DP分子タンパク質を調製し、例えば抗体等を用いてDP分子におけるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。   In the present invention, detection of alleles can be performed at the genetic or protein level. For example, genomic DNA or mRNA can be prepared from a sample, and alleles related to chronicization of hepatitis B of the present invention in genomic DNA or mRNA can be detected based on the nucleotide sequence. In addition, human HLA-DP molecule protein is prepared from the sample, and for example, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 in DP molecule using antibody etc. * 04: 01 and / or HLA-DPB 1 * 02: 01 Allyl can be detected. These methods are briefly described below.

（２−１）検体からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製
本発明の方法で用いる試料は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるかを検査しようとする検体から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを用いることができる。本発明の方法で用いる検体から採取する生物学的試料は、例えば、検体の細胞又は組織、毛髪、便、尿、唾液、細胞、鼻腔粘膜からこすりとった細胞等を用いることができるが、これらに限定されない。(2-1) Preparation of Genomic DNA or mRNA from Specimens Specimens to be examined whether the specimens used in the method of the present invention are susceptible or resistant to chronic hepatitis and / or disease progression. Based on the biological sample collected from the above, genomic DNA or mRNA prepared by methods well known to those skilled in the art can be used. The biological sample collected from the sample used in the method of the present invention may be, for example, cells or tissues of the sample, hair, stool, urine, saliva, cells, cells scraped from nasal cavity mucosa, etc. It is not limited to.

ゲノムＤＮＡは、いかなる公知の方法によっても調製することができ、例えば、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法等があげられる。また、ｍＲＮＡの調製もいかなる公知の方法によっても調製することができ、例えば、グアニジンイソチオシアネート法等があげられる。ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡの調製には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、ゲノムＤＮＡの調製用としては、Wizard Genomic DNA Purification Kit （Promega）、ｍＲＮＡの調製用としては、NucleoTrap(登録商標)mRNA Kit（Clontech）等があげられる。なお、以下で説明するアリルの検出のために、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。ｃＤＮＡの合成方法は当技術分野で公知のいかなる方法をも用いてよい。例えば、ランダムプライマー又はポリＴプライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成することができる。
（２−２）アリルの検出
上記のように調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルの検出は、当技術分野で公知のいかなる遺伝子多型検出手段を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ハイブリダイゼーション法、プライマー伸長反応、質量分光法等を用いる方法があげられるが、これらに限定されない。ただし、HLA-DRB1遺伝子では、特に第２エクソン内に多型部位が多数あるため、これらのアリルを検出するために、多数の多型を判別する必要がある。以下に当該方法について説明する。
（２−２−１）直接配列決定法
本発明では、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いた直接配列決定法によりHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。直接配列決定法は、上記で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し；検出対象であるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し；当該領域の塩基配列を決定する；ことにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogene）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知のいかなる方法をも用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法があげられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルアリルに相当する配列を有するか否かを決定する。
（２−２−２）ＰＣＲ法
本発明に係るアリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、本発明に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。このプライマーセットを使用して検体のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。本発明に係るアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体は本発明に係るアリルをホモで有し、本発明に係るアリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、検体は本発明に係るアリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体には本発明に係るアリルがないことが示される。
（２−２−３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
本発明に係るアリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象の本発明に係るアリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本発明に係るアリルに適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー並びに他のアリル及び本発明に係るアリルの対照により生じた断片長と比較して、検体における本発明に係るアリルの存在を検出することができる。
（２−２−４）ハイブリダイゼーション法
本発明に係るアリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、検体由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、本発明に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10)等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本発明に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。
（２−２−５）その他の方法
例えば、TaqMan PCR法は、アレル特異的なTaqmanプローブとTaqポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Taqmanプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約20塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Taqポリメラーゼは５’-３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのTaqmanプローブ及びTaqポリメラーゼ存在下で目的のアリルを含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該アリル領域を増幅すると、増幅と並行して、Taqmanプローブが鋳型ＤＮＡの目的アリル部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたTaqmanプローブに到達すると、Taqポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、Taqmanプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。Genomic DNA can be prepared by any known method, and examples include the phenol / chloroform method, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method and the like. The mRNA can also be prepared by any known method, for example, the guanidine isothiocyanate method. A commercially available kit may be used for preparation of genomic DNA or mRNA. Examples of the kit include Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) for preparation of genomic DNA, and NucleoTrap (registered trademark) mRNA Kit (Clontech) for preparation of mRNA. In addition, cDNA may be synthesized from mRNA for the detection of allyl described below. The cDNA synthesis method may be any method known in the art. For example, cDNA can be synthesized from RNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) using random primers or polyT primers.
(2-2) Detection of Allyl HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 in genomic DNA or mRNA prepared as described above Detection of HLA-DPB 1 * 02: 01 alleles can be detected using any genetic polymorphism detection means known in the art. For example, methods using direct sequencing, polymerase chain reaction (PCR), restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP), hybridization method, primer extension reaction, mass spectroscopy etc. may be mentioned, but not limited thereto. However, in the HLA-DRB1 gene, in particular, there are many polymorphic sites in the second exon, so it is necessary to discriminate a large number of polymorphisms in order to detect these alleles. The method will be described below.
(2-2-1) Direct Sequencing In the present invention, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * by direct sequencing using genomic DNA or cDNA derived from mRNA 04:02, HLA-DPB1 * 04: 01 and / or HLA-DPB1 * 02: 01 Allyl can be detected. Direct sequencing method prepares cDNA from genomic DNA or mRNA prepared above; HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA- to be detected A region containing DPB1 * 04: 01 and / or HLA-DPB1 * 02: 01 allyl is cloned into a vector or amplified by PCR; the base sequence of the region is determined; As a method of cloning, cloning can be carried out by screening from a cDNA library using an appropriate probe. Alternatively, they can be amplified by PCR reaction using appropriate primers and cloned by ligating into an appropriate vector. Furthermore, it can be subcloned into another vector, but is not limited thereto. Examples of vectors include pBlue-ScriptTM SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp (TM: Gibco-BRL), p-Direct (Clontech), pCR2.1-TOPO (Invitrogene) Etc.), viral vectors, artificial chromosome vectors and cosmid vectors can be used. For determination of the base sequence, any known method can be used, for example, manual sequencing using a radioactive marker nucleotide, automatic sequencing using a dye terminator, etc. I will not. Based on the nucleotide sequences thus obtained, the specimens were HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and / or HLA- Determine whether it has a sequence corresponding to DPB 1 * 02: 01 allyl allyl.
(2-2-2) PCR method The allyl which concerns on this invention can also be detected using PCR method. PCR is performed using oligonucleotide primers that only hybridize to sequences with and / or other alleles according to the invention. This primer set is used to amplify cDNA from genomic DNA or mRNA of the sample. When only the primer for allyl according to the present invention produces a PCR product, the sample has the allele according to the present invention in homo, and a PCR product is produced from the primer for allyl according to the present invention and other primers for allyl. If so, the analyte will have the allele according to the invention in hetero. If only the other allylic primer produces a PCR product, it is indicated that the sample is free of allyl according to the present invention.
(2-2-3) PCR-RFLP Method The allele according to the present invention can also be detected by using restriction enzyme fragment length polymorphism (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP). First, the region containing the allele according to the present invention to be detected is amplified by PCR. The PCR product is subsequently digested with a restriction enzyme suitable for allyl according to the invention. The PCR products digested with restriction enzymes are separated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. The fragment lengths can be compared to the fragment lengths generated by molecular weight markers and other allyl and allyl controls according to the invention to detect the presence of the allyl according to the invention in the sample.
(2-2-4) Hybridization method The allyl which concerns on this invention can also be detected using hybridization. The hybridization method is a method of determining the presence or absence of an allele according to the present invention based on the property of genomic DNA or mRNA derived from a specimen to hybridize with a DNA molecule (for example, an oligonucleotide probe) complementary thereto. This hybridization method can be performed using various techniques for hybridization and detection, such as known hybridization such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot and the like. For a detailed procedure of the hybridization method, see Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed. (Cold Spring Harbor Press (2001); in particular Section 6-7), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-1997); in particular, see Sections 6.3-6.4), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995); see Section 2.10 in particular for hybridization conditions, etc.). Can. Furthermore, hybridization can also be detected using a DNA chip. As the said method, what designed the oligonucleotide probe specific to the aryl based on this invention, and affixed it on the solid-phase support is used. Then, the sample-derived DNA sample is brought into contact with the DNA chip to detect hybridization.
(2-2-5) Other Methods For example, TaqMan PCR method is a method of performing detection of SNP and amplification of a region containing SNP in parallel using allele-specific Taqman probe and Taq polymerase. The Taqman probe is an oligonucleotide of about 20 bases, which is labeled with a fluorescent substance at the 5 'end and a quencher at the 3' end, and is designed to hybridize to a target SNP site. Taq polymerase has 5'-3 'nuclease activity. When the allyl region is amplified using these Taqman probes and a PCR primer designed to amplify a region containing the allele of interest in the presence of Taq polymerase, in parallel with the amplification, the Taqman probe is the allele region of interest in the template DNA. Hybridize to When the extension reaction from the forward primer side reaches the Taqman probe hybridized to the template, the 5 'nuclease activity of Taq polymerase cleaves the fluorescent substance bound to the 5' end of the Taqman probe. As a result, the released fluorescent substance is not affected by the quencher and emits fluorescence. Measurement of fluorescence intensity enables SNP detection.

MALDI-TOF/MS法を応用したＳＮＰタイピング方法として、プライマー伸長法と組み合わせた方法もあげられる。この方法はハイスループットな解析が可能であり、１）ＰＣＲ、２）ＰＣＲ産物の精製、３）プライマー伸長反応、４）伸長産物の精製、５）質量分析、６）ジェノタイプ決定、のステップにより解析する。まずＰＣＲによって、目的とするＳＮＰ部位を含む領域をゲノムＤＮＡから増幅する。ＰＣＲプライマーは、アリル部位塩基と重複しないように設計する。そして、エキソヌクレアーゼとエビのアルカリホスファターゼ（shrimp alkaline phosphatase）を用いて酵素的除去方法により精製するかエタノール沈殿法を用いて精製する。次に、３’末端がＳＮＰ部位に直接隣接するように設計したジェノタイピングプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。ＰＣＲ産物を高温で変性し、過剰のジェノタイピングプライマーを加えて、アニールさせる。ddNTPとＤＮＡポリメラーゼを反応系に添加し、サーマルサイクル反応させると、ジェノタイピングプライマーよりも1塩基長いオリゴマーが生じる。この伸長反応で生じる1塩基長いオリゴマーは、ジェノタイピングプライマーの上記設計により、アリルに応じて異なる。精製した伸長反応産物について質量分析を行い、マススペクトルから解析する。   As a SNP typing method to which the MALDI-TOF / MS method is applied, a method combined with a primer extension method is also mentioned. This method is capable of high-throughput analysis: 1) PCR, 2) purification of PCR product, 3) primer extension reaction, 4) purification of extension product, 5) mass spectrometry, 6) genotyping, To analyze. First, a region containing the target SNP site is amplified from genomic DNA by PCR. PCR primers are designed so as not to overlap with allyl site bases. Then, the protein is purified by an enzymatic removal method using exonuclease and shrimp alkaline phosphatase or purified using ethanol precipitation. Next, a primer extension reaction is performed using a genotyping primer designed so that the 3 'end is directly adjacent to the SNP site. The PCR products are denatured at high temperature and excess genotyping primers are added and allowed to anneal. When ddNTP and DNA polymerase are added to the reaction system and subjected to thermal cycle reaction, an oligomer one base longer than the genotyping primer is generated. The single base long oligomer generated in this extension reaction differs depending on the allele due to the above design of the genotyping primer. Mass analysis is performed on the purified extension reaction product and analyzed from mass spectrum.

ハイスループットが可能なＳＮＰタイピング法として、1分子蛍光分析法を応用した方法があげられる。例えば、MF20/10S(オリンパス)は、当該方法を採用したシステムである。具体的には、共焦点レーザー光学系と高感度光検出器を用いて、約1フェムトリットル（1000兆分の１リットル）の超微小領域中で、相補的・非相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した蛍光ラベルプライマーの1分子レベルの並進拡散時間を計測及び解析するものである。   As a SNP typing method capable of high throughput, there is a method to which single molecule fluorescence analysis is applied. For example, MF20 / 10S (Olympus) is a system adopting the method. Specifically, complementary and non-complementary primers are used in a very small area of about 1 femtoliter (one thousand trillion liters) using confocal laser optics and a high sensitivity photodetector. The translational diffusion time of one molecule level of the fluorescently labeled primer amplified by the PCR method is measured and analyzed.

またＤＮＡチップによる方法も、ハイスループットが可能なタイピングの1つである。ＤＮＡチップは、基板上に多種類のＤＮＡプローブを整列して固定したもので、標識したＤＮＡ試料をチップ上でハイブリダイゼーションし、プローブによる蛍光シグナルを検出する。   The DNA chip method is also one of the typing methods capable of high throughput. The DNA chip is a substrate in which many kinds of DNA probes are aligned and fixed on a substrate, and a labeled DNA sample is hybridized on the chip to detect a fluorescent signal by the probe.

ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の例として、Snipper法があげられる。当該方法は、環状一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを合成するＤＮＡ増幅方法であるＲＣＡ（rolling circle amplification）法を応用したＳＮＰタイピング法である。プローブは８０-９０塩基長のオリゴＤＮＡで、標的ＳＮＰの５’及び３’末端近傍のそれぞれに相補的な１０-２０塩基長の配列を両末端に含んでおり、標的ＤＮＡにアニールして環状になるように設計されている。また、プローブの３’末端が標的アレルに相補的配列となるよう設計されている。プローブの3’末端が標的アレルと完全に相補的であれば、プローブは環状化されるが、プローブの3’末端がミスマッチであるとプローブは環状化されない。またプローブには、４０-５０塩基長のバックボーン配列があり、２種類のＲＣＡ増幅プライマーと相補的な配列が含まれる。   The Snipper method is mentioned as an example of the SNP typing method using gene amplification methods other than PCR method. The said method is the SNP typing method which applied the RCA (rolling circle amplification) method which is a DNA amplification method which synthesize | combines complementary strand DNA, DNA polymerase moves above it, using cyclic | annular single stranded DNA as a template. The probe is an oligo DNA of 80-90 bases in length and contains a sequence of 10-20 bases in length at both ends complementary to each of the 5 'and 3' ends of the target SNP, and is annealed to the target DNA. It is designed to be. Also, the 3 'end of the probe is designed to be complementary to the target allele. If the 3 'end of the probe is perfectly complementary to the target allele, then the probe is circularized, but if the 3' end of the probe is mismatched, the probe is not circularized. The probe also has a backbone sequence of 40-50 bases in length and contains sequences complementary to the two RCA amplification primers.

ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法としては、例えば、UCAN法やLAMP法を利用したタイピング方法があげられる。UCAN法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるICAN法を応用した方法である。UCAN法では、プライマー前駆体としてDNA-RNA-DNAキメラオリゴヌクレオチド（DRD）を用いる。このDRDプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないように、３'末端のＤＮＡが修飾してあり、ＳＮＰサイトにRNA部分が結合するように設計されている。このDRDプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、DRDプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみ、共存するRNase Hが対合したDRDプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー3'末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、DRDプライマーと鋳型ＤＮＡがマッチしない場合、RNase HはDRDプライマーを切断せず、ＤＮＡ増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたDRDプライマー前駆体がRNase Hによって切断されたあとの増幅反応は、ICAN反応メカニズムによって進行する。   Examples of SNP typing methods using gene amplification methods other than the PCR method include typing methods using the UCAN method or LAMP method. The UCAN method is a method applying the ICAN method, which is a gene isothermal amplification method developed by Takara Bio. In the UCAN method, a DNA-RNA-DNA chimeric oligonucleotide (DRD) is used as a primer precursor. This DRD primer precursor is designed such that the DNA at the 3 'end is modified so that replication of the template DNA by DNA polymerase does not occur, and the RNA portion is bound to the SNP site. When this DRD primer precursor is incubated with the template, the RNA portion of the coexisting RNase H-paired DRD primer is cleaved only when the DRD primer and the template completely match. As a result, since the modified DNA is released and the primer 3 'end is renewed, the extension reaction by the DNA polymerase proceeds to amplify the template DNA. On the other hand, if the DRD primer and the template DNA do not match, RNase H does not cleave the DRD primer and DNA amplification does not occur. The amplification reaction after cleavage of the perfectly matched DRD primer precursor by RNase H proceeds by the ICAN reaction mechanism.

LAMP法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的遺伝子の６箇所の領域（3’末端側からF3c、F2c、F1c、5’末端側からB3、B2、B1）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマー、B3プライマー）を用いて増幅する。タイピングを目的とする場合は、F1-B1間は標的ＳＮＰ部位（1塩基）のみでよく、FIPプライマー及びBIPプライマーを、その5'端にＳＮＰの1塩基がくるように設計する。WTアリルの場合、LAMP法の起点構造であるダンベル構造からＤＮＡの合成反応が起こり、増幅反応が連続的に進行する。アリルがある場合は、ダンベル構造からのＤＮＡ合成反応が起こらず、増幅反応は進行しない。   The LAMP method is a gene isothermal amplification method developed by Eiken Chemical Co., Ltd., which defines six regions (F3c, F2c, F1c from the 3 'end side, B3, B2, B1 from the 5' end side) of the target gene. Then, amplification is performed using four types of primers (FIP primer, F3 primer, BIP primer, B3 primer) for the 6 regions. For the purpose of typing, only the target SNP site (1 base) is sufficient between F1-B1, and the FIP primer and the BIP primer are designed such that one base of the SNP is at the 5 'end thereof. In the case of WT allyl, a synthesis reaction of DNA occurs from a dumbbell structure which is an origin structure of LAMP method, and an amplification reaction proceeds continuously. If there is an allele, the DNA synthesis reaction from the dumbbell structure does not occur and the amplification reaction does not proceed.

インベーダー(Invader)法は、核酸増幅法を用いず、２種類の非蛍光標識プローブ（アレルプローブ、インベーダープローブ）と１種類の蛍光標識プローブ（FRETプローブ）及びエンドヌクレアーゼであるcleavaseを用いる方法である。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡに対しＳＮＰ部位から３’末端側に相補的な配列があり、プローブの５’側にフラップという鋳型ＤＮＡと無関係な配列がある。インベーダープローブは、鋳型ＤＮＡのＳＮＰ部位から５’側に相補的な配列があり、ＳＮＰ部位に相当する部分の塩基は任意の塩基がある。FRETプローブは、３’側にフラップ配列に相補的な配列がある。一方の５’側は蛍光色素及びクエンチャーで標識されているが、FRETプローブは分子内で２本鎖を形成するよう設計されており、通常は消光されている。これらを鋳型ＤＮＡと反応させると、アレルプローブが鋳型ＤＮＡと２本鎖を形成したときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端（任意塩基部分）が侵入する。cleavaseは、当該塩基が侵入した構造を認識して、アレルプローブのフラップ部分を切断する。次に、この遊離したフラップがFRETプローブの相補配列と結合すると、フラップの３’末端がFRETプローブの分子内二本鎖部分に侵入する。cleavaseは、上記アレルプローブとインベーダープローブの場合と同様に、このFRETプローブにフラップの塩基が侵入した構造を認識し、FRETプローブの蛍光色素を切断する。蛍光色素はクエンチャーから離れるため、蛍光が発生する。アレルプローブがアレルとマッチしない場合は、cleavaseが認識する、上記特異的な構造が形成されないため、フラップは切断されない。   The Invader method is a method that uses two non-fluorescently labeled probes (allelic probe, invader probe), one fluorescently labeled probe (FRET probe) and cleavase, which is an endonuclease, without using nucleic acid amplification. . The allele probe has a sequence complementary to the template DNA at the 3 'end from the SNP site, and has a sequence unrelated to the template DNA called a flap at the 5' side of the probe. The invader probe has a complementary sequence 5 'to the SNP site of the template DNA, and the base corresponding to the SNP site has any base. The FRET probe has a sequence complementary to the flap sequence on the 3 'side. One 5 'side is labeled with a fluorescent dye and a quencher, but the FRET probe is designed to form a double strand in the molecule and is usually quenched. When these are reacted with the template DNA, when the allele probe forms a double strand with the template DNA, the 3 'end (arbitrary base portion) of the invader probe intrudes into the SNP site. cleavase recognizes the structure into which the base invades and cleaves the flap portion of the allele probe. Next, when the released flap is bound to the complementary sequence of the FRET probe, the 3 'end of the flap penetrates into the intramolecular double-stranded portion of the FRET probe. As in the case of the allele probe and the invader probe, cleavase recognizes the structure in which the base of the flap invades the FRET probe, and cleaves the fluorescent dye of the FRET probe. As the fluorescent dye leaves the quencher, fluorescence is generated. If the allele probe does not match the allele, the flap is not cut because the above-mentioned specific structure recognized by cleavase is not formed.

（２−２−６）アリルの検出に用いる物質
本発明の方法でアリルを検出するポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アリルの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはアリル部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとアリル部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするアリルを含む配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列の一部領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０〜１００塩基以上が好ましく、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基である。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。(2-2-6) Substance used for detection of allyl The polynucleotide for detecting allyl by the method of the present invention is described below.
When using a primer for allyl detection, it is designed to be a primer in accordance with the region to be amplified and the typing method. For example, it is preferable to be able to amplify the above region completely, and the sequence can be designed based on the sequence near both ends of the above region. Primer design techniques are well known in the art, and the primers usable in the present invention satisfy the conditions capable of specific annealing, for example, length and base composition (melting temperature) capable of specific annealing It is designed to have The length of the region to be amplified is not limited as long as there is no problem in typing, and may be appropriately increased or decreased depending on the detection method. In addition, although the allyl site is contained in a part of the region to be amplified, the position of the site in the region to be amplified is not limited, and may be disposed at an appropriate position according to the detection method (typing method). Therefore, in designing the primer, the positional relationship between the primer and the allyl site can be freely designed according to the detection method, and the base sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 and 9 including the allele to be detected The primers can be designed while considering the characteristics of the typing method as long as hybridization is performed to a partial region (for example, 50 bases or more and 500 bases or less continuously). As a length which exhibits the function as a primer, 10 to 100 bases or more are preferable, Usually, 15 to 50 bases, Preferably it is 15 to 30 bases. Also, in designing, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer, which is the temperature at which 50% of any nucleic acid strand hybridizes with its complementary strand. In order for the template DNA and the primers to form a double strand and be annealed, it is necessary to optimize the annealing temperature, but on the other hand, if this temperature is too low, nonspecific reactions will occur. It is because it is not preferable because it happens. For confirmation of Tm, known primer design software can be used.

アリルの検出にプローブを用いる場合は、プローブがアリル部位を認識するように設計する。プローブ設計において、アリル部位は、タイピング方法にあわせて、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で認識されてもよい。アリル検出用ポリヌクレオチドをプローブとする場合、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜２００、好ましくは１５〜１００塩基、より好ましくは１５〜５０塩基であるが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。
（２−２−７）本発明に好ましいアリルの検出方法
本発明の方法として好ましいアリルの検出方法はＰＣＲを用いたＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法であってよく、当該方法を利用してHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰは具体的には、ビオチン標識したプライマーを用いてＰＣＲで検体の上記アリルを含む領域を増幅する。増幅ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとし、特異的な配列であるプローブと特異的に結合させる。例えば、プローブを蛍光色素で色分けされたマイクロビーズに固定し、増幅ＤＮＡが結合したマイクロビーズからビオチンを介した蛍光標識ストレプトアジピンの結合による蛍光シグナルが得られるので、この蛍光シグナルの種類と増幅ＤＮＡの結合による蛍光を識別して同時に検出することで増幅ＤＮＡが結合したビーズの種類から遺伝子タイプが決定できる。当該方法には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、多数の多型を一度に判別できるxMAP（登録商標）テクノロジー（Luminex社）等があげられるが、これらに限定されない。本方法を用いた本発明の方法の概要を以下に説明する。When using a probe for detection of allyl, the probe is designed to recognize an allyl site. In the probe design, the allyl site may be recognized anywhere in the probe according to the typing method, and depending on the typing method, may be recognized at the end of the probe. When a polynucleotide for detection of alleles is used as a probe, the length of the base sequence complementary to the genomic DNA is usually 15 to 200, preferably 15 to 100 bases, more preferably 15 to 50 bases. May be longer or shorter than this.
(2-2-7) Preferred Method of Detecting Allyl to the Present Invention The preferred method of detecting allyl as the method of the present invention may be PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probe) method using PCR, using the method HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and / or HLA-DPB1 * 02: 01 alleles can be detected. Specifically, PCR-SSOP amplifies the above allyl-containing region of the sample by PCR using a biotin-labeled primer. The amplified DNA is single-stranded DNA, which is specifically bound to a probe that is a specific sequence. For example, the probe is immobilized on a microbead colored with a fluorescent dye, and a fluorescent signal is obtained from the microbead to which the amplified DNA is bound by binding of fluorescently labeled streptadipin via biotin. The gene type can be determined from the type of beads to which amplified DNA is bound by identifying and simultaneously detecting the fluorescence due to the binding of A commercially available kit may be used for the method. Examples of the kit include, but are not limited to, xMAP (registered trademark) technology (Luminex Co.) capable of determining many polymorphisms at one time, and the like. The outline of the method of the present invention using this method is described below.

まず、最初にHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを含む領域を増幅可能なプライマーやプローブ等のポリヌクレオチドを用いて、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、上記塩基配列を有する核酸断片を増幅する。   First, first, a region containing HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and / or HLA-DPB1 * 02: 01 allyl is included. Using a polynucleotide such as an amplifiable primer or a probe, an amplification reaction is performed using the prepared genomic DNA as a template to amplify a nucleic acid fragment having the above base sequence.

アリルの検出に用いるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列をもとに、プライマー又はプローブの別及び適応する検出方法に合わせて、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができ、市販の化学合成装置を用いて合成されてよい。当業者であれば、配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列及びそれらの相補鎖並びに本発明に係るアリルの位置情報に基づいて、公知の方法を用いてポリヌクレオチドを合成することができる。さらに、当該オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチン等で修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、ポリヌクレオチドを修飾したり、合成されたポリヌクレオチドに、蛍光色素等を結合したりしてもよく、その合成方法も公知である。   The polynucleotides used for the detection of alleles are based on the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 and 9, according to the different or adapted detection methods for primers or probes, according to known oligonucleotide synthesis techniques. And may be synthesized using a commercially available chemical synthesizer. Those skilled in the art can synthesize polynucleotides using known methods based on the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 and 9 and their complementary strands and positional information of alleles according to the present invention. can do. Furthermore, in the synthesis of the oligonucleotide, a polynucleotide may be modified by using a nucleotide derivative modified with a fluorescent dye, biotin or the like, or a fluorescent dye may be bound to the synthesized polynucleotide. , And their synthesis methods are also known.

そして、検体から調製したゲノムＤＮＡに、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜１００℃
アニーリング温度：４０〜７０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
上記のサイクル数：３０〜５０回程度
増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行ってもよい。その際、各増幅反応で用いるプライマーを、同じ位置に設計してもよく、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計してもよい。このようにして、検体のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明に係るアリルの塩基配列を含む領域の核酸断片を特異的に増幅することができる。Then, the above-described primers, heat-resistant DNA polymerase and the like are allowed to act on genomic DNA prepared from a sample to carry out a PCR reaction. The above method can be easily performed by those skilled in the art according to "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed." (Cold Spring Harbor Press (2001)) etc., and conditions for the PCR reaction of the present invention can be easily For example, the following conditions may be mentioned.
Denaturation temperature: 90 to 100 ° C
Annealing temperature: 40 to 70 ° C
Elongation temperature: 60-75 ° C,
In order to increase the specificity of amplification, the number of cycles: about 30 to 50, the amplification reaction may be performed twice or more using two or more pairs of primers. At that time, the primers used in each amplification reaction may be designed at the same position, or may be designed inside of the positions of the primers in the first amplification. Thus, the nucleic acid fragment of the region containing the nucleotide sequence of the allele according to the present invention can be specifically amplified using the genomic DNA of the sample as a template.

続いて、増幅した核酸断片を精製した後、塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、本発明に係るアリルの塩基配列とを比較する。これにより、検体が本発明に係るアリルを有するかを決定することができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。配列決定は、当技術分野で公知のいかなる方法をも用いてよく、例えば、増幅した核酸断片をベクターにクローニングせずに配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法があげられるが、これらに限定されない。当該配列決定法としては、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）等の市販のキットを用いて簡易に行うことができる。上記のダイレクト・シーケンス法を行う場合には、本発明に係るアリルを含む領域の塩基配列を特異的に決定することができるプライマーを用いることが好ましい。用いるプライマーセットは公知の方法により設計できる。   Subsequently, after the amplified nucleic acid fragment is purified, the nucleotide sequence is determined, and the determined nucleotide sequence is compared with the nucleotide sequence of the allele according to the present invention. Thereby, it can be determined whether the sample has the allyl according to the present invention. Known methods can be used for purification of the obtained PCR product. For example, a method using a kit such as Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega), GENECLEAN (Funakoshi), QIAquick PCR purification Kits (QIAGEN), ExoSAP-IT (GE Healthcare Biosciences), DEAE-cellulose filter paper There are a method to use, a method to use a dialysis tube, and the like. In case of using agarose gel, agarose gel electrophoresis is carried out, the base sequence fragment is cut out from agarose gel, Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega), GENECLEAN (Funakoshi), QIAquick Gel extraction Kits (QIAGEN) , And freeze and squeeze etc. Sequencing may use any method known in the art, including, but not limited to, direct sequencing, which can sequence the amplified nucleic acid fragment without cloning it into a vector. I will not. As the said sequencing method, it can carry out simply, for example using commercially available kits, such as CEQTM DTCS Quick Start Kit (BECKMAN) and BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310 (Applied Biosystems). When the above direct sequence method is performed, it is preferable to use a primer that can specifically determine the base sequence of the region containing allyl according to the present invention. The primer set to be used can be designed by a known method.

このように、検体における本発明に係るアリルに対応する領域の塩基配列を決定した後、その塩基配列と、本発明に係るアリルの塩基配列を比較する。
（２−３）Ｂ型肝炎の慢性化に関連のあるアリルと、検体から得られたアミノ酸配列中の前記アリルのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を比較する工程
本発明の方法としては、タンパク質レベルで本発明に係るアリルを検出することもできる。具体的には、本発明に係るアリルを有するＤＰ分子を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、本発明に係るアリルを検出することができる。当該抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０に示すアミノ酸配列のいずれの領域からなるペプチドを抗原として免疫学的方法により作製できる。抗体の作製方法、及び抗体を用いた本発明に係るアリルを有するＤＰ分子の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
（２−４）Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展に対する発症抵抗性又は感受性の判定
本発明において、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症抵抗性を有することを示し、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症感受性を有することを示し、HLA-DPB1*02:01アリルは当該検体がＢ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性を有することを示す。この意味で、本発明の方法は、本発明に係るアリルを用いて慢性Ｂ型肝炎又は病態進展の検査を行う方法ともいえる。Thus, after the base sequence of the region corresponding to the allyl according to the present invention in the sample is determined, the base sequence of the region is compared with the base sequence of the allyl according to the present invention.
(2-3) a step of comparing the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of the allele related to chronicity of hepatitis B and the above-mentioned allyl in the amino acid sequence obtained from the sample Allyl according to the present invention can also be detected. Specifically, the allele according to the present invention can be detected by using an antibody capable of specifically recognizing the DP molecule having the allele according to the present invention. The antibody can be produced by an immunological method using a peptide consisting of any region of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 and 10 as an antigen. The method for producing an antibody and the method for detecting a DP molecule having allyl according to the present invention using an antibody can be carried out using methods known in the art.
(2-4) Determination of onset resistance or sensitivity to chronicity or disease state progression of hepatitis B In the present invention, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 allyl Indicates that the sample is resistant to the onset of chronic hepatitis B, and HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01 allyl indicate that the sample is chronic hepatitis B. In contrast, HLA-DPB1 * 02: 01 allyl indicates that the sample is resistant to the progression of chronic hepatitis B disease. In this sense, the method of the present invention can also be said to be a method of testing chronic hepatitis B or disease progression using the allyl according to the present invention.

さらに、Ｂ型肝炎慢性化又は病態進展に対する発症感受性アリル及び発症抵抗性アリルを診断実用性の計算に用いて、Ｂ型肝炎患者におけるＢ型肝炎慢性化又は病態進展の陽性率を解析することにより評価することもできる。Ｂ型肝炎慢性化等に関する「陽性率」とは、患者全体のうち、Ｂ型肝炎慢性化等に関する感受性アリルが1又はそれ以上ある患者の割合又はＢ型肝炎化慢性化等に関する抵抗性アリルがないか１のみある患者の割合をいう。例えば、本明細書の実施例に記載した日本人ＨＢＶ患者４８８人については、Ｂ型肝炎慢性化に関する感受性アリルであるHLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のいずれかを１又は２有する患者は４１０人であり、いずれもないのは78人であるので、陽性率は84.02%となる。さらに、Ｂ型肝炎慢性化に関する抵抗性アリルであるHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01がないか又は1つだけ有する患者は４５０人であり、いずれかを２つ有するのは３８人であるので、陽性率は92.21%となる。また、Ｂ型肝炎の病態進展に関する「陽性率」については、肝硬変及び肝がん患者２０６人のうち、Ｂ型肝炎の病態進展に関する抵抗性アリルであるHLA-DPB1*02:01がないか又は1つだけ有する患者は２０３人であり、２つ有するのは３人であるので、陽性率は98.5%となる。ここで、Ｂ型肝炎の病態進展に関する「陽性率」とは、肝硬変及び肝がん患者に関する陽性率をいう。   In addition, analysis of the positive rate of chronic hepatitis B or progression of disease in hepatitis B patients, using alleles susceptible to chronic hepatitis B or developmental susceptibility to disease progression and alleles resistant to development for the calculation of diagnostic utility. It can also be evaluated. The “positive rate” for chronic hepatitis B etc. refers to the proportion of patients with one or more susceptibility alleles for chronic hepatitis B etc. among all patients or resistant allyl alcohol for chronic hepatitis B etc. It refers to the proportion of patients who do not have only one. For example, for the 488 Japanese HBV patients described in the Examples of the present specification, either HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01, which is a susceptibility allele related to hepatitis B chronicification, can be used. The positive rate is 84.02% because there are 410 patients with or 2 and 78 with none. In addition, there are 450 patients who have no or only one HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01, HLA-DPB1 * 02: 01, which are resistant alleles for hepatitis B chronicity. Since there are 38 people who have two, the positive rate will be 92.21%. In addition, with regard to the “positive rate” for the progression of the pathological condition of hepatitis B, among 206 patients with cirrhosis and liver cancer, there is no HLA-DPB1 * 02: 01 which is a resistant allele for the progression of the pathological condition of hepatitis B or Since there are 203 patients with only one and three with two, the positive rate is 98.5%. Here, the "positive rate" about the pathological condition progress of hepatitis B means the positive rate about a liver cirrhosis and a liver cancer patient.

Ｂ型肝炎の慢性化等に対する発症感受性の有無は、Ｂ型肝炎の慢性患者だけでなく非慢性患者にとっても重要な情報であり、例えば、慢性Ｂ型肝炎の治療方法や治療薬の選定及び慢性Ｂ型肝炎の予防・発症防止に関する重要な情報となる。なお、このHLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。ヒトは各遺伝子について父親由来と母親由来の２種類を有するからである。   The presence or absence of susceptibility to the development of chronic hepatitis B is important information not only for chronic patients of hepatitis B but also for non-chronic patients. For example, selection of treatment methods and therapeutic agents for chronic hepatitis B and chronicity It is important information on the prevention and onset prevention of hepatitis B. In addition, the presence of HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 04: 01, and HLA-DPB1 * 02: 01 alleles may be homo or hetero. It may be either. This is because human has two types of genes derived from father and mother.

また、本発明者らは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のある抵抗性アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のある感受性アリルとのうち、ある特定の抵抗性アリルと感受性アリルとの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群１３８０人と健常対照群１２２５人についての９５％信頼区間におけるオッズ比（ＯＲ；Odds Ratio）を求めた。ここで、オッズ比ＯＲとは、あるアリルの組み合わせを有するヒトの群についての、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと、健常対照群のオッズＯｓＣとの比である。このＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは、ＨＢＶ患者数のうち、ある特定のアリルの組み合わせを有するＨＢＶ患者数の比によって求められる。また、この健常対照群のオッズＯｓＣは、健常対照群の人数のうち、ある特定のアリルの組み合わせを有する健常対照群の人数の比によって求められる。以下、ある特定のアリルの組み合わせの具体例として、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つだけ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つだけ有するヒトの群について説明する。   In addition, the present inventors have identified a specific resistant allele and a sensitive allele among a resistant allele resistant to chronic hepatitis B and a susceptible allele susceptible to chronic hepatitis B. The odds ratio (OR; Odds Ratio) in the 95% confidence interval for 1380 HBV patient groups and 1225 healthy control groups was determined for humans with combinations of Here, the odds ratio OR is the ratio of the odds OsP in the HBV patient group to the odds OsC in the healthy control group for a group of humans having a certain combination of alleles. The odds OsP of this HBV patient group is determined by the ratio of the number of HBV patients having a specific combination of alleles among the number of HBV patients. Also, the odds OsC of the healthy control group is determined by the ratio of the number of healthy control groups having a specific combination of alleles among the number of healthy control groups. Hereinafter, as a specific example of a certain specific combination of alleles, it has only one of HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01, or HLA-DPB1 * 02: 01 as a resistant allele. Described is a group of humans having only one of HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01 as susceptible alleles.

この具体例において、ＨＢＶ患者群１３８０人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４１１人である。すなわち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは０．４２である。また、この具体例において、健常対照群１２２５人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４７７人である。すなわち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、健常対照群のオッズＯｓＣは０．６３である。したがって、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、オッズ比ＯＲ、すなわち、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと健常対照群のオッズＯｓＣとの比は、０．６７である。   In this embodiment, of the 1380 patients in the HBV patient group, 411 people have the particular allele combination shown in this embodiment. That is, the odds OsP of the HBV patient group is 0.42 for humans with the specific allyl combination shown in this example. In addition, in this embodiment, of the 1225 healthy controls, there are 477 humans having the specific allyl combination shown in this embodiment. That is, the odds OsC of the healthy control group is 0.63 for the human having the specific allyl combination shown in this example. Thus, for humans with the particular allyl combination shown in this example, the odds ratio OR, ie, the ratio of the odds OsP in the HBV patient group to the odds OsC in the healthy control group, is 0.67.

ここで、オッズ比ＯＲが１より小さい場合には、特定のアリルの組み合わせを有するヒトが、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。この具体例においては、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つだけ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。   Here, when the odds ratio OR is smaller than 1, it can be said that a human having a specific combination of alleles is resistant to chronicization of hepatitis B. In this specific example, it has only one of either HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01, or HLA-DPB1 * 02: 01 as a resistant allele, and HLA-DPB1 as a sensitive allele. * Humans who have only one of either 05:01 or HLA-DPB1 * 09: 01 are considered to be resistant to chronic hepatitis B.

すなわち、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在が、抵抗性アリルと感受性アリルとのヘテロの場合において、少なくともHLA-DPB1アリルが上述の具体例に示す組み合わせの場合には、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有することが明らかになった。   That is, in the case where the presence of the two types of HLA-DPB1 alleles derived from the father and the mother is heterozygous between the resistant allele and the sensitive allele, at least the HLA-DPB1 allele is the combination shown in the above-mentioned specific example. It has been revealed that the sample is resistant to chronic hepatitis B.

つまり、本発明者らは、抵抗性アリルを１つだけ有し、感受性アリルを１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえることを導いた。このことから、父親由来と母親由来の２種類のアリルが、抵抗性アリルと感受性アリルとを、それぞれ１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。つまり、本発明に係るアリルを用いることにより、父親由来と母親由来の２種類のアリルの組み合わせに基づいて、Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展に対する発症抵抗性又は感受性を判定することができる。   In other words, the present inventors have found that a human having only one resistant allele and only one sensitive allele can be said to be resistant to chronic hepatitis B. From this, it can be said that a human having only one each of a resistant allyl and a sensitive allyl, of two types of alleles derived from a father and a mother, is resistant to chronic hepatitis B. That is, by using the allyl according to the present invention, it is possible to determine the onset resistance or sensitivity to chronicization or disease progression of hepatitis B based on a combination of two types of allyl derived from the father and the mother.

（３）本発明に係るアリルを含むＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因の検出のための試薬
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出することができる。したがって、上記アリルを検出する試薬は、Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展の検査用試薬として有用である。当該試薬はＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性若しくは感受性又は病態進展を判定するためにも用いることができる。具体的には、上記の本発明に係るアリルや各種プライマーやプローブ、本発明に係るアリルに特異的に結合することができる抗体、ＳＮＰタイピングを行うときに同時に用いる試薬類（例えば、デオキシヌクレオチド3リン酸（dNTPs）やDNAポリメラーゼ、緩衝液等）や陽性コントロール等に加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて試薬とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等を組み合わせることができる。
また、タイピング法によっては、プローブ又はプライマー等の本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドの一部に、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリル等とは無関係な配列が含まれていてもよい。さらに本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質で標識されていてもよい。(3) Reagent for detecting the predisposition for chronicity or disease progression of hepatitis B containing allyl according to the present invention Detecting the predisposition for chronicity or hepatitis progress of hepatitis B using the allyl according to the present invention Can. Therefore, the reagent for detecting the above-mentioned allyl is useful as a reagent for examining chronicity of hepatitis B or progression of pathological condition. The reagent can also be used to determine the development resistance or sensitivity to chronicity of hepatitis B or the progression of disease state. Specifically, the above-mentioned allyl according to the present invention, various primers and probes, an antibody capable of specifically binding to the allyl according to the present invention, reagents used simultaneously when performing SNP typing (for example, deoxynucleotide 3) In addition to phosphoric acid (dNTPs), DNA polymerase, buffer solution, etc., a positive control, etc., it can be combined with other solvents or solutes to make a reagent. For example, distilled water, pH buffer reagents, salts, proteins, surfactants and the like can be combined.
Also, depending on the typing method, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, and a part of the allele detection polynucleotide according to the present invention such as a probe or a primer. A sequence unrelated to HLA-DPB1 * 04: 01 and / or HLA-DPB1 * 02: 01 allyl or the like may be included. Furthermore, the polynucleotide for detecting an allele according to the present invention may be a chimera of DNA and RNA. The polynucleotide for detecting an allele according to the present invention may be labeled with a fluorescent substance or a binding affinity substance such as biotin or digoxin.

また、本発明の試薬には特定のアリルを検出する手段のほか、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼ等）等の反応試薬を含めてよい。反応試薬とは適当な化学的又は物理的検出手段により検出可能な標識を有する試薬である。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質等が用いられる。標識に酵素を用いたELISA法は広く利用されている。蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネート等、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ等、放射性同位元素として、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体等が例示される。   In addition to the means for detecting a specific allyl, the reagent of the present invention may further contain a reaction reagent such as a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (polymerase etc.) and the like. The reaction reagent is a reagent having a label that can be detected by appropriate chemical or physical detection means. As a labeling agent used for a measurement method using such a labeling substance, for example, a fluorescent substance, an enzyme, a radioactive isotope, a luminescent substance or the like is used. An ELISA method using an enzyme for labeling is widely used. Fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc. as fluorescent substances, peroxidase, alkaline phosphatase, malic anhydrase, α-glucosidase, α-galactosidase etc, as enzymes, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C as radioactive isotopes As luminophores, luciferin, lucigenin, luminol, luminol derivatives and the like are exemplified.

さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化等に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤等が含まれる。   Furthermore, as a reaction medium, a buffer solution useful for providing optimum conditions for the reaction, stabilization of the reaction product, etc., a stabilizer for the reaction material, etc. are included.

（４）本発明に係るアリルを含むＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因の検出のためのキット
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出する場合、特別の条件、操作等は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。(4) A kit for detecting a predisposition for chronicity or disease progression of hepatitis B containing allyl according to the present invention When detecting a predisposition for chronicity or disease progression of hepatitis B using allyl according to the present invention , Special conditions, operations etc. are not required. The reaction can be performed according to the usual conditions and procedures in each method, and if necessary, with some modifications, a suitable measurement system can be constructed.

そのためのもっとも簡便かつ効率的な測定を行なうことを可能とするのは、上記本発明の試薬をキット化することである。キット化により、通常の検査室又は実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。アッセイキットの構成及び形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には本発明に係るアリルを検出する手段に関する使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材等から構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器等も含んでもよい。本発明の遺伝子導入の検出確認手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものがあげられる。   What makes it possible to carry out the most convenient and efficient measurement is to kit the above-mentioned reagent of the present invention. By making it into a kit, quantification can be efficiently performed in a normal laboratory or laboratory without the need for special analytical instruments, skilled operations, or advanced knowledge. The configuration and form of the assay kit are not particularly limited, and the contents thereof are not limited as long as they can achieve the predetermined purpose. In general, it comprises instructions for use of the means for detecting allyl according to the present invention, reaction reagents, reaction media in which the reaction takes place, substrates for providing an assay site, and the like. Furthermore, if desired, a reference sample, a detector, etc. may be included as a comparison reference or for creating a calibration curve. Examples of the detection and confirmation means for gene transfer of the present invention include those capable of detecting the above-described label such as a spectroscope, a radiation detector, and a light scattering detector.

（５）他のアリルとの組み合わせ
本発明の上記方法は、他のＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連のあるアリルと組み合わせて用いてよい。用いるアリルについては、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルに関するアリルでよく、さらにＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連するのであれば、上記配列以外の配列中のアリルでもよい。本発明の方法は、換言すればアリルの検出による。一般にアリルとは、塩基の変化が人口の１％以上の頻度で存在しているものと定義され、１％未満のものでまれなバリエーションという。本発明として組み合わされるアリルとしては、上記アリルのほか、アリルとしての存在頻度を問わず、１％未満のものであってもよい。また本発明と組み合わされるアリルは、Ｂ型肝炎の慢性化に関する遺伝子中のどこに存在していてもよく、エクソン、イントロン、3’-UTR又は5’-UTR及びその隣接領域、及びプロモーター領域に存在してもよい。当該他のアリルを検出するためのポリヌクレオチドについては、当業者であれば、上記「（２−２）アリルの検出」に記載した方法等を用いて作製できる。また、アリルの数も特に制限はなく、１から数十の塩基の置換・欠失・挿入・付加のいずれであってもよい。また、一塩基多型（SNP:single nucleotide polymorphism）、制限酵素切断断片長多型(RFLP： restriction fragment length polymorphism)、VNTR(variable number of tandem repeat)、マイクロサテライト多型等の多型であってもよい。(5) Combination with other alleles The above-mentioned method of the present invention may be used in combination with other alleles related to chronicity or disease progression of hepatitis B. The alleles to be used are HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and / or alleles related to HLA-DPB1 * 02: 01 allyl. Well, it may be allyl in a sequence other than the above sequence as far as it is related to the chronication or disease state progression of hepatitis B. The method of the invention is, in other words, detection of allyl. In general, allyl is defined as that base changes occur at a frequency of 1% or more of the population, and is less than 1% and is a rare variation. The allyl to be combined as the present invention may be less than 1% in addition to the above-mentioned allyl regardless of the frequency of its presence as allyl. Also, the allyl to be combined with the present invention may be anywhere in the gene for chronicization of hepatitis B, and in exons, introns, 3'-UTR or 5'-UTR and its adjacent region, and promoter region. You may The polynucleotide for detecting the other allele can be prepared by those skilled in the art using the method described in the above "(2-2) detection of allyl" or the like. The number of allyls is also not particularly limited, and may be one to several tens of bases of substitution, deletion, insertion, or addition. In addition, polymorphisms such as single nucleotide polymorphism (SNP), restriction enzyme cleavage fragment length polymorphism (RFLP), variable number of tandem repeat (VNTR), microsatellite polymorphism, etc. It is also good.

アリルも多型として公知のものであっても新規な多型であってもよい。公知多型を検出対象とする場合は、例えば、公共データベース：GenBank等に公開されている公知多型の中から、検出対象候補となる多型を選択することができる。また、公的データ：ENSEMBL(http://www.ensembl.org/)を利用して、選択することもできるし、プロタイプも用いることができる。ハプロタイプを構成するＳＮＰの選択方法及びタイピング方法については上記のとおりである。当該ハプロタイプがＢ型肝炎慢性化又は病態進展に関連するか否かの評価は実施例にあるように、統計学的検定によって判断できる。   Allyl may also be known as a polymorphism or may be a novel polymorphism. When a known polymorphism is to be detected, for example, polymorphisms to be detected can be selected from known polymorphisms published in public databases: GenBank and the like. In addition, public data: ENSEMBL (http://www.ensembl.org/) can be used to make a selection, and protypes can also be used. The selection method and the typing method of the SNP which comprises a haplotype are as above-mentioned. The evaluation of whether or not the haplotype is associated with chronic hepatitis B or disease progression can be determined by a statistical test, as in the examples.

本発明に係るアリルと他のアリル等を組み合わせて用いるとＢ型肝炎慢性化又は病態進展をより迅速に精度よく判断できるため、診断の信頼度が高まる点でも好ましい。   The combined use of the allyl according to the present invention and other alleles and the like is preferable from the viewpoint of improving the reliability of diagnosis since it is possible to judge the hepatitis B chronicity or the progress of disease condition more quickly and accurately.

次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。   EXAMPLES The present invention will next be described by way of examples, but the present invention is not limited by these examples and includes various modifications.

（本発明に係るアリルの検出）
本実施例は、本発明を含むHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を検出することを目的とする。
日本人のＨＢＶ患者４８８人と健常者４６４人、韓国人のＨＢＶ患者２５１人と健常者１４０人由来の各試料について、QIAamp DNA Mini kit（QIAGEN）を用いて以下のように調製した。まず、マイクロチューブにQIAGEN Protease20μlをピペッティングした後、各試料200μlを添加した。さらにBuffer ALを加えて１５秒間混和した後、５６℃で１０分間インキュベートして試料を溶解した。その後、マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。さらに試料にエタノール（100％）200μlを添加し、再び１５秒間ボルテックスした後、1.5ml マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。当該溶液をQIAamp Mini Spin Columnにカラムにアプライし、6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW1を添加して6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW2を添加して、20,000×gで３分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Column を開き、200μlのBuffer AE又は精製水を添加した。室温で１分間インキュベートした後、6,000×gで１分間遠心分離して、各検体由来のＤＮＡを回収した。(Detection of allyl according to the present invention)
The present example detects HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 including the present invention. The purpose is to
Each sample from 488 Japanese patients with HBV and 464 healthy subjects, and 251 Korean patients with HBV and 140 healthy subjects was prepared using QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN) as follows. First, 20 μl of QIAGEN Protease was pipetted into a microtube, and 200 μl of each sample was added. Further, Buffer AL was added, mixed for 15 seconds, and then incubated at 56 ° C. for 10 minutes to dissolve the sample. Thereafter, the microtube was spun down for several seconds to collect the solution attached to the inside of the lid. Further, 200 μl of ethanol (100%) was added to the sample, vortexed again for 15 seconds, and then the 1.5 ml microtube was spun down for several seconds to collect the solution attached to the inside of the lid. The solution was applied to a column on a QIAamp Mini Spin Column and centrifuged at 6,000 × g for 1 minute. The QIAamp Mini Spin Column was opened, 500 μl of Buffer AW1 was added and centrifuged at 6,000 × g for 1 minute. The QIAamp Mini Spin Column was opened, 500 μl of Buffer AW2 was added and centrifuged at 20,000 × g for 3 minutes. Open the QIAamp Mini Spin Column and add 200 μl Buffer AE or purified water. After incubating for 1 minute at room temperature, the DNA from each sample was recovered by centrifugation at 6,000 × g for 1 minute.

調製されたＤＮＡ試料を用いてPCR-SSOP法を利用したLABType SSO HLA DPA1/DPB1 kit (ワンラムダ)又はWAKFlow HLA-DPB1 typing kit (湧永製薬)を用いて、4桁のHLAタイピングを実施した。実験は説明書に従って行い、xMAPテクノロジーを利用したマルチプレックス測定システム（Luminex社）を利用した。具体的には、上記ＤＮＡ試料２μｌに増幅試薬24.5μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ液0.5μｌを加えて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
変性温度：９３℃（３０秒）
アニーリング温度：６０℃（３０秒）
伸長温度：７２℃（３０秒）
上記のサイクル数：４０回
上記サイクル前に９３℃（３分）、上記サイクル後に７２℃（５分）の反応を行い、終了後は４℃で保存した。Four-digit HLA typing was performed using the LAB Type SSO HLA DPA1 / DPB1 kit (One Lambda) or WAKFlow HLA-DPB1 typing kit (Atsunaga Pharmaceutical) using PCR-SSOP method using the prepared DNA sample. The experiment was conducted according to the instruction manual, and a multiplex measurement system (Luminex) using xMAP technology was used. Specifically, 24.5 μl of the amplification reagent and 0.5 μl of the DNA polymerase solution were added to 2 μl of the above DNA sample, and a PCR reaction was performed under the following conditions.
Denaturation temperature: 93 ° C (30 seconds)
Annealing temperature: 60 ° C (30 seconds)
Extension temperature: 72 ° C (30 seconds)
The above cycle number: 40 times The reaction was performed at 93 ° C. (3 minutes) before the above cycle, 72 ° C. (5 minutes) after the above cycle, and stored at 4 ° C. after completion.

当該ＰＣＲ終了後の増幅ＤＮＡ５μｌを、変性液５μｌを分注した96穴ＰＣＲプレートの各ウエルに加えて、ボルテックスし、室温に５分間放置した。ハイブリダイゼーション溶液２０μｌ、ビーズミックス３μｌ及びSAPE２μｌを混合したハイブリミックス試薬２５μｌに上記の変性増幅ＤＮＡを加えてハイブリミックス溶液としてボルテックスで撹拌した。５５℃に設定したサーマルサイクラーに上記ハイブリミックス溶液をセットして、３０分間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄液７５μｌを各ウエルに加え、1000×gで１分間遠心分離を行った。その後、上清を除去して、洗浄液７５μｌを各ウエルに加えた。Luminex XYPのブロック温度を37℃に設定して、ビーズミックスのLot番号に対応したテンプレートファイルを用いて測定した。測定結果のＣＳＶファイルをWAKFlow（登録商標）Typing Softwareで開き、各蛍光ビーズの陽性・陰性を判定表に記載しているカットオフ値をもとに自動判定した。当該自動判定では、蛍光強度がカットオフ値以上を示すビーズを陽性、カットオフ値以下を示すビーズを陰性とし、各ビーズの陽性・陰性のパターンからHLAの遺伝子型を決定した。   After completion of the PCR, 5 μl of the amplified DNA was added to each well of the 96-well PCR plate to which 5 μl of the denaturation solution had been dispensed, vortexed, and left at room temperature for 5 minutes. The above denatured amplified DNA was added to 25 μl of the hybrid mix reagent in which 20 μl of the hybridization solution, 3 μl of bead mix and 2 μl of SAPE were mixed, and the mixture was vortexed as a hybrid mix solution. The above hybrid mix solution was set in a thermal cycler set at 55 ° C., and hybridization was performed for 30 minutes. 75 μl of washing solution was added to each well and centrifuged at 1000 × g for 1 minute. Thereafter, the supernatant was removed and 75 μl of washing solution was added to each well. The block temperature of Luminex XYP was set to 37 ° C., and measurement was performed using a template file corresponding to the lot number of the bead mix. The CSV file of the measurement results was opened with WAKFlow (registered trademark) Typing Software, and positive / negative of each fluorescent bead was automatically determined based on the cutoff value described in the determination table. In the said automatic determination, the bead which shows fluorescence intensity more than a cutoff value was positive, the bead which shows below a cutoff value was made negative, and the genotype of HLA was determined from the positive / negative pattern of each bead.

その結果を表１及び２に示す。   The results are shown in Tables 1 and 2.

Figure 0006521382
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表１は、日本及び韓国におけるＨＢＶ患者群と健常者群のHLA-DPB1アリル頻度の比較を示す。これにより、日本人では、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症感受性を有することが示された。韓国人ではHLA-DPB1*04:02アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症感受性を有することが示された。   Table 1 shows the comparison of HLA-DPB1 allele frequency of HBV patient group and healthy people group in Japan and Korea. Thus, in Japanese, HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 alleles indicate that the sample is resistant to the onset of chronic hepatitis B. It was shown that HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01 allyl showed that the sample was susceptible to the onset of chronic hepatitis B. In Koreans, HLA-DPB1 * 04: 02 alleles show that the sample has resistance to the onset of chronic hepatitis B, and HLA-DPB1 * 05: 01 alleles indicate that the sample has chronic hepatitis B Has been shown to be susceptible to the development of

表１に示されたＢ型肝炎慢性化に対する発症感受性アリル(HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01)及び発症抵抗性アリル（HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01）について、Ｂ型肝炎患者における陽性率を計算した。その結果、日本人ＨＢＶ患者４８８人で感受性アリルを有する場合を計算すると、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のいずれかを１又は２つ有する患者は４１０人であったのに対し、当該アリルがない患者は７８人であった。したがって、陽性率は84.02%となった。同様に抵抗性アリルの場合について計算すると、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01がないか又は1つ有するのは４５０人であったのに対し、いずれかを２つ有する患者は３８人であった。したがって、陽性率は92.21%となった。   Alleles susceptible to hepatitis B chronically shown in Table 1 (HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 09: 01) and alleles resistant to development (HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 *) The positive rate in hepatitis B patients was calculated for 04:01, HLA-DPB1 * 02: 01). As a result, it was calculated that there were 1 or 2 patients with either HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01 when calculating the case of having sensible allele in 488 Japanese HBV patients In contrast, there were 78 patients without the allele. Therefore, the positive rate was 84.02%. Similarly calculated for the case of resistant alleles, although HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01, HLA-DPB1 * 02: 01 were missing or had one. In contrast, there were 38 patients with two of them. Therefore, the positive rate was 92.21%.

Figure 0006521382
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表２は、日本及び韓国におけるＨＢＶ病態進展群とＢ型慢性肝炎群のHLA-DPB1アリル頻度の比較を示す。これにより、日本及び韓国共に、HLA-DPB1*02:01アリルはＢ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性があることが示された。   Table 2 shows the comparison of HLA-DPB1 allele frequency of HBV diseased disease progression group and chronic hepatitis B group in Japan and Korea. Thus, it was shown that HLA-DPB1 * 02: 01 Allyl is resistant to the progression of chronic hepatitis B in both Japan and Korea.

表２に示されたＢ型肝炎の病態進展に対する抵抗性アリル（HLA-DPB1*02:01）について、肝硬変及び肝がん患者における陽性率を計算した。その結果、肝硬変及び肝がん患者２０６人のうち、HLA-DPB1*02:01がないか又は１つだけ有するのは２０３人であり、２つ有する患者は３人であった。したがって、陽性率は98.5%となった。   The positive rates in patients with liver cirrhosis and liver cancer were calculated for allelic (HLA-DPB1 * 02: 01) resistant to the disease state progression of hepatitis B shown in Table 2. As a result, out of 206 patients with liver cirrhosis and liver cancer, 203 patients had no or only one HLA-DPB1 * 02: 01, and 3 patients had two. Therefore, the positive rate was 98.5%.

（本発明に係るアリルの検出；その２）
本実施例は、本発明を含む父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在がヘテロの場合において、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点を明らかにすることを目的とする。日本人のＨＢＶ患者１３８０人と健常者１２２５人由来の各試料についてHLAの遺伝子型を決定した。なお、この遺伝子型の決定の手順は、上述した本発明に係るアリルの検出における手順と同様であるため、説明を省略する。
その結果を表３〜５に示す。(Detection of allyl according to the present invention; Part 2)
In this example, in the case where the presence of two types of HLA-DPB1 alleles of the father-derived and the mother-derived containing the present invention is heterozygous, does the sample have resistance to chronicity of hepatitis B or have sensitivity? The purpose is to clarify the point. The HLA genotype was determined for each sample from 1380 Japanese HBV patients and 1225 healthy individuals. In addition, since the procedure of determination of this genotype is the same as the procedure in the detection of the allyl according to the present invention described above, the description is omitted.
The results are shown in Tables 3 to 5.

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表３は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群との、単一のHLA-DPB1アリルについての保有頻度を示す。この表３のうち、左表（１ｓｔｓｅｔ）は、日本人のＨＢＶ患者４８８人と健常者４６４人についての結果を示し、右表（２ｎｄｓｅｔ）は、日本人のＨＢＶ患者８９２人と健常者７６１人についての結果を示す。   Table 3 shows the frequency of holding for a single HLA-DPB1 allele of the HBV patient group and the healthy control group in Japan. In this Table 3, the left table (1stset) shows the results for 488 Japanese patients with HBV and 464 healthy subjects, and the right table (2ndset) shows 892 Japanese patients with HBV and 761 healthy subjects Show the results for

本発明者らは、１ｓｔｓｅｔにおいて、ＨＢＶ患者群と健常対照群とから１５種類のHLA-DPB1アリルを検出した。この１５種類のHLA-DPB1アリルには、HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*29:01、及びHLA-DPB1*41:01が含まれる。これら、１５種類のHLA-DPB1アリルそれぞれについて、ある種類のHLA-DPB1アリルが検出されたヒトが、ＨＢＶ患者群と健常対照群とのいずれに含まれるかを計数した。一例として、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者群には１８２人が含まれ、健常対照群には２２７人が含まれていた。すなわち、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者数は１８２人であり、健常者数は２２７人であった。   The present inventors detected 15 types of HLA-DPB1 alleles in the 1st set from the HBV patient group and the healthy control group. The 15 HLA-DPB1 alleles include HLA-DPB1 * 01: 01, HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * 02: 02, HLA-DPB1 * 03: 01, HLA-DPB1 * 04: 01. HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 06: 01, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 13: 01, HLA-DPB1 * 14: 01, HLA -DPB1 * 17: 01, HLA-DPB1 * 19: 01, HLA-DPB1 * 29: 01, and HLA-DPB1 * 41: 01 are included. For each of these 15 types of HLA-DPB1 alleles, it was counted whether humans in which a certain type of HLA-DPB1 allele was detected were included in the HBV patient group or the healthy control group. As an example, among the humans in which HLA-DPB1 * 02: 01 allele was detected, the HBV patient group included 182 and the healthy control group included 227. That is, of the humans in which HLA-DPB1 * 02: 01 alleles were detected, the number of HBV patients was 182 and the number of healthy persons was 227.

また、本発明者らは、２ｎｄｓｅｔにおいて、ＨＢＶ患者群と健常対照群とから１８種類のHLA-DPB1アリルを検出した。この１８種類のHLA-DPB1アリルには、HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*21:01、HLA-DPB1*29:01、HLA-DPB1*36:01、HLA-DPB1*38:01、及びHLA-DPB1*41:01が含まれる。これら、１８種類のHLA-DPB1アリルそれぞれについて、ある種類のHLA-DPB1アリルが検出されたヒトが、ＨＢＶ患者群と健常対照群とのいずれに含まれるかを計数した。一例として、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者群には３３３人が含まれ、健常対照群には３６８人が含まれていた。すなわち、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者数は３３３人であり、健常者数は３６８人であった。   In addition, the present inventors detected 18 types of HLA-DPB1 alleles in the 2nd set from the HBV patient group and the healthy control group. Among these 18 HLA-DPB1 alleles, HLA-DPB1 * 01: 01, HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * 02: 02, HLA-DPB1 * 03: 01, HLA-DPB1 * 04: 01 HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 05: 01, HLA-DPB1 * 06: 01, HLA-DPB1 * 09: 01, HLA-DPB1 * 13: 01, HLA-DPB1 * 14: 01, HLA -DPB1 * 17: 01, HLA-DPB1 * 19: 01, HLA-DPB1 * 21: 01, HLA-DPB1 * 29: 01, HLA-DPB1 * 36: 01, HLA-DPB1 * 38: 01, and HLA- DPB 1 * 41: 01 is included. For each of the 18 types of HLA-DPB1 alleles, it was counted whether humans in which one type of HLA-DPB1 allele was detected were included in the HBV patient group or the healthy control group. As an example, among humans in which HLA-DPB1 * 02: 01 alleles were detected, the HBV patient group included 333 and the healthy control group included 368. That is, of the humans in which HLA-DPB1 * 02: 01 alleles were detected, the number of HBV patients was 333 and the number of healthy persons was 368.

また、本発明者らは、１ｓｔｓｅｔ及び２ｎｄｓｅｔのそれぞれについて、ＨＢＶ患者群と健常対照群についての９５％信頼区間におけるオッズ比（ＯＲ＊；Odds Ratio）を求めた。ここで、オッズ比ＯＲ＊とは、あるHLA-DPB1アリルを有するヒトの群についての、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰ＊と、健常対照群のオッズＯｓＣ＊との比である。このＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰ＊は、ＨＢＶ患者数のうち、ある特定のHLA-DPB1*アリルを有するＨＢＶ患者数の比によって求められる。また、この健常対照群のオッズＯｓＣ＊は、健常対照群の人数のうち、ある特定のHLA-DPB1*アリルを有する健常対照群の人数の比によって求められる。ここで、オッズ比ＯＲ＊が１より小さい場合には、当該検体が、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。また、オッズ比ＯＲ＊が１以上の場合には、当該検体が、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性があるといえる。   We also determined the odds ratio (OR *; Odds Ratio) in the 95% confidence interval for the HBV patient group and the healthy control group for each of the 1st set and 2nd set. Here, the odds ratio OR * is the ratio of the odds OsP * of the HBV patient group to the odds OsC * of the healthy control group for a group of humans with certain HLA-DPB1 alleles. The odds OsP * of this HBV patient group is determined by the ratio of the number of HBV patients having a specific HLA-DPB1 * allele among the number of HBV patients. In addition, the odds OsC * of the healthy control group is determined by the ratio of the number of healthy control groups having a specific HLA-DPB1 * allele among the number of healthy control groups. Here, when the odds ratio OR * is smaller than 1, it can be said that the sample is resistant to chronicization of hepatitis B. In addition, when the odds ratio OR * is 1 or more, it can be said that the sample is susceptible to chronicity of hepatitis B.

これにより、日本人では、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*04:02アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する感受性を有することが示された。   Thus, in Japanese, HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 04: 02 Allyl show that the sample is resistant to chronic hepatitis B. HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01 allyl were shown to have the sensitivity of the sample to chronic hepatitis B.

さらに本発明者らは、上述したＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせについて、表４に示すようにして検討した。   Furthermore, as shown in Table 4 for the combination of HLA-DPB1 allele having resistance to chronic hepatitis B as described above and HLA-DPB1 allele having susceptibility to chronic hepatitis B as described above. I examined it.

Figure 0006521382
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表４は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群とにおける、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの組み合わせについての保有頻度を示す。この表４のうち、左表は、ＨＢＶ患者１３８０人についての結果を示し、右表は、健常者１２２５人についての結果を示す。ここで、本発明者らは、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在がヘテロの場合において、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点に着目した。特に、Ｂ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせにおいて、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点に着目した。この結果を表５に示す。   Table 4 shows the frequency of possession of combinations of two types of HLA-DPB1 alleles derived from father and mother in the HBV patient group and the healthy control group in Japan. Of this Table 4, the left table shows the results for 1380 HBV patients, and the right table shows the results for 1225 healthy individuals. Here, do the present inventors have the sensitivity or resistance to chronic hepatitis B in the case where the presence of two types of HLA-DPB1 alleles from the father and the mother is heterogenous? I focused on the point. In particular, the sample is resistant to chronic hepatitis B in combination with HLA-DPB1 allele having resistance to chronic hepatitis B and HLA-DPB1 allyl having sensitivity to chronic hepatitis B. We focused on whether we had the sensitivity or the sensitivity. The results are shown in Table 5.

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表５は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群とにおける、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの組み合わせのうち、特に、Ｂ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせに着目した場合の、HLA-DPB1アリルの保有頻度を示す。   Table 5 shows HLA-DPB1 which is particularly resistant to chronic hepatitis B among combinations of two HLA-DPB1 alleles derived from father and mother in the HBV patient group and the healthy control group in Japan. The frequency of holding HLA-DPB1 alleles is shown, focusing on combinations of alleles with HLA-DPB1 alleles that are susceptible to chronic hepatitis B.

一例として、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つ有するヒトは、ＨＢＶ患者群には４１１人が含まれ、健常対照群には４７７人が含まれていた。ＨＢＶ患者群１３８０人のうち、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトは、４１１人である。また、健常対照群１２２５人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４７７人である。つまり、ＨＢＶ患者が、この具体例に示すアリルの組み合わせを有する確率Ｐｐは０．２９７であり、健常者が、この具体例に示すアリルの組み合わせを有する確率Ｐｈは０．３８８である。したがって、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは０．４２であり、健常対照群のオッズＯｓＣは０．６３である。ここから、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと健常対照群のオッズＯｓＣとの比、すなわち、オッズ比ＯＲは、０．６７であることが導出された。   As an example, it has one of either HLA-DPB1 * 04: 02, HLA-DPB1 * 04: 01, or HLA-DPB1 * 02: 01 as a resistant allele, and HLA-DPB1 * 05: 01 as a sensitive allele. Or the human having one of any of HLA-DPB1 * 09: 01 included 411 in the HBV patient group and 477 in the healthy control group. Of the 1380 people in the HBV patient group, 411 people have the combination of alleles shown in this example. Also, out of 1225 healthy controls, there are 477 humans with the specific combination of alleles shown in this example. That is, the probability Pp of the HBV patient having the combination of alleles shown in this example is 0.297, and the probability Ph of the healthy subject having the combination of alleles shown in this example is 0.388. Thus, for humans with the combination of alleles shown in this example, the odds OsP of the HBV patient group is 0.42 and the odds OsC of the healthy control group is 0.63. From here, it was derived that the ratio of the odds OsP in the HBV patient group to the odds OsC in the healthy control group, that is, the odds ratio OR, is 0.67 for the human having the combination of alleles shown in this specific example. .

以上、本発明者によってなされた発明をその実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。   As mentioned above, although the invention made by the present inventor was concretely explained based on the embodiment, the present invention is not limited to the embodiment, and can be variously changed in the range which does not deviate from the summary. It goes without saying.

本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連するアリルをＨＢＶ患者群に対して解析することにより、特に、日本人を含むアジア人に特化したＢ型肝炎慢性化の分子機構の解明や創薬ターゲット候補分子の同定が可能になるという産業上利用可能性がある。また、ＨＢＶキャリアに対して解析することにより、当該キャリアを慢性化しやすい群と慢性化しにくい群とに分類することが可能となり、その後の治療方針の決定に役立つ情報を提供できるというという産業上利用性がある。さらに、当該アリルに加えて、他の免疫関連遺伝子のＳＮＰも含む検査キットの開発により医療費削減も可能となるという点で産業上利用可能性がある。   Elucidation of the molecular mechanism of hepatitis B chronicity and drug discovery specifically for Asians including Japanese by analyzing allyl related to chronicity of hepatitis B of the present invention to HBV patient group There is industrial applicability that enables identification of target candidate molecules. In addition, it is possible to categorize the carrier into a group that is easy to become chronic and a group that is hard to become chronic by analyzing the HBV carriers, and it is possible to provide information useful for determining the treatment policy thereafter There is sex. Furthermore, there is industrial applicability in that medical cost reduction can also be achieved by the development of a test kit that includes SNPs of other immune related genes in addition to the allele.

Claims (3)

日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出方法であって、以下の：
ａ）日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるアリルと、日本人の検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程であって、
前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である工程；
ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及び
ｃ）前記検体が（ｉ）HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、（ｉｉ）HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のアリルの組み合わせを有することが、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性であることを示す工程；
を含む、方法。 A method of detecting a hereditary factor of chronicity and / or progression of hepatitis B in Japanese , comprising the following:
in the step of comparing a) and allyl is chronic and / or or resistive sensitive to pathological progression of the Japanese hepatitis B, the nucleotide sequence or amino acid sequence corresponding to the allyl in a specimen of the Japanese There,
The alleles susceptible to chronicity of hepatitis B are HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01, and the alleles resistant to chronicity of hepatitis B are HLA-DPB1 * 04 A step in which the allele that is HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01 and that is resistant to the progression of the pathological condition of hepatitis B is HLA-DPB1 * 02: 01 ;
b) analyzing whether a base or amino acid residue at a site corresponding to the allyl of the sample corresponds to the base or amino acid residue of allyl; and c) the sample is (i) HLA-DPB1 * 02: 01 Chronic combination of HLA-DPB1 * 04: 01 or HLA-DPB1 * 04: 02 and (ii) alleles of HLA-DPB1 * 05: 01 or HLA-DPB1 * 09: 01 for chronic hepatitis B Showing that it is resistant to
Method, including. 日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるアリルを検出するプライマーを含み、
前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01であり、
Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、（ｉ）HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、（ｉｉ）HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のアリルの組み合わせである、日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出のための試薬。 Primers for detecting allyl is chronic and / or or resistive sensitive to pathological progression of the Japanese hepatitis B seen including,
The alleles susceptible to chronicity of hepatitis B are HLA-DPB1 * 05: 01 and HLA-DPB1 * 09: 01, and the alleles resistant to chronicity of hepatitis B are HLA-DPB1 * 04 The allele that is: 02, HLA-DPB1 * 04: 01 and HLA-DPB1 * 02: 01, and the aforementioned resistant to hepatitis E disease progression is HLA-DPB 1 * 02: 01,
The combination of alleles resistant to chronic hepatitis B is (i) HLA-DPB1 * 02: 01, HLA-DPB1 * 04: 01 or HLA-DPB1 * 04: 02, (ii) HLA-DPB1 * 05: 01 or a combination of alleles of HLA-DPB 1 * 09: 01, a reagent for detection of hereditary factors for chronicity and / or progression of hepatitis B in Japanese . 請求項２に記載の試薬を含む、日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出のためのキット。 Containing reagent according to claim 2, kit for detection of genetic factors of chronic and / or conditions progress of Japanese B hepatitis.
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