JP2008161164A - Method for detecting gene with primer containing artificial mismatched nucleic acid - Google Patents

Method for detecting gene with primer containing artificial mismatched nucleic acid Download PDF

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康正 三谷
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a gene by an isothermal amplification method, by which the synthesis of a complementary strand from a non-targeted base sequence can surely be prevented, even in various nucleic acid sequences to more accurately detect the gene. <P>SOLUTION: This method for detecting the gene by the isothermal amplification method is characterized by making a targeted base sequence to contain an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide, capable of specifically annealing the targeted base sequence to enhance the specificity of the synthesis of the complementary strand from the targeted base sequence. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子検出法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止し、より正確な検出方法を提供する。より詳細には標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーやオリゴヌクレオチド中に、標的塩基配列とのアニールを阻害しない程度に、標的塩基配列とミスマッチを形成する塩基を含ませることにより非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する方法に関する。The present invention provides a more accurate detection method by reliably preventing synthesis of complementary strands from non-target nucleotide sequences in various nucleic acid sequences in a gene detection method using an isothermal amplification method. More specifically, a non-target base can be obtained by including a base that forms a mismatch with the target base sequence in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to the target base sequence to such an extent that the annealing with the target base sequence is not inhibited. It relates to a method for preventing complementary strand synthesis in a sequence.

遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、標的塩基配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する標的塩基配列のコピー数が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、標的塩基配列そのものを予め増幅することが必要となる。特に、特異性良く標的塩基配列を増幅することが重要である。In the field of genetic engineering, analysis based on complementarity of target base sequences is known as a method capable of directly analyzing genetic characteristics. In such an analysis, when the number of copies of the target base sequence present in the sample is small, it is generally not easy to detect the target base sequence, and thus it is necessary to amplify the target base sequence itself. In particular, it is important to amplify the target base sequence with high specificity.

さらに、標的塩基配列上における遺伝子の変異は、タンパク質の構造的・機能的変化の原因となる。そのため、変異の検出は遺伝的疾患の診断や治療に対して有用な情報を与えとされており、その変異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異を多型、もしくは遺伝子多型と言い、特に近年、一塩基多型（以下、ＳＮＰｓ；ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓと省略する）の変化により様々な疾患に関与すると言われている。Furthermore, gene mutations on the target nucleotide sequence cause structural and functional changes in the protein. Therefore, the detection of mutations is supposed to give useful information for diagnosis and treatment of genetic diseases, and among those mutations, mutations present at a frequency of 1% or more within a certain group are polymorphic or gene It is said to be a polymorphism, and in particular, recently, it is said that it is involved in various diseases due to changes in single nucleotide polymorphisms (hereinafter abbreviated as SNPs; single nucleotide polymorphisms).

一方、単にＳＮＰと疾患の連鎖関係のみならず、特定の薬剤の代謝に関わるＳＮＰを診断すること、副作用を生じる恐れのあるような薬剤の投薬を判断したり、投薬量を変更したりするような薬剤関連のＳＮＰ診断も重要になりつつある。さらに、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌やウイルスのサブタイプも一種の多型と考えられているが、各種薬剤の治療効果はこれらのサブタイプによって異なる。特にピロリ菌などの除菌に関与する菌の特定の変異を診断することで除菌治療効果が効果的かどうか判断する診断方法も確立されつつある。よって、菌やウイルス等の多型を調べることも、治療方法の選択、特に最適な薬剤の決定において重要な情報を与えると考えられる。On the other hand, not only the linkage relationship between SNPs and diseases, but also diagnosis of SNPs involved in the metabolism of specific drugs, determination of drug dosages that may cause side effects, and changing dosages Drug-related SNP diagnosis is also becoming important. Furthermore, subtypes of bacteria and viruses such as HIV, HCV, and Helicobacter pylori are also considered as a kind of polymorphism, but the therapeutic effect of various drugs varies depending on these subtypes. In particular, a diagnostic method for determining whether or not a sterilization treatment effect is effective by diagnosing a specific mutation of a bacterium involved in sterilization such as Helicobacter pylori has been established. Therefore, examining polymorphisms such as bacteria and viruses is considered to give important information in selecting a treatment method, particularly in determining an optimal drug.

標的塩基配列の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法［特許文献１］、［特許文献２］、［特許文献３］、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法［非特許文献１］がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。さらに、それを応用した標的塩基配列の変異を検出する方法としては、検出すべき変異を含む配列に相補的な配列を有するように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う方法［非特許文献２］、［非特許文献３］が知られているが、ＰＣＲに基づく塩基配列の検出は、常にプライマーの非特異的なアニールによる問題が伴う［非特許文献４］。つまり、完全に相補的な塩基配列でなくてもプライマーがアニールして相補鎖が合成され、指数的な増幅が生じる。よって通常の条件ではＰＣＲ法によって変異やＳＮＰｓのような１塩基の相違を識別することは困難である。  Amplification of the target base sequence (nucleic acid amplification) is mainly performed by an enzymatic method using a DNA polymerase. For example, the polymerase chain reaction method [Patent Document 1], [Patent Document 2], [Patent Document 3], Furthermore, there is a reverse transcription PCR method [Non-patent Document 1] that combines a PCR method and a reverse transcriptase reaction. These methods consist of three steps: dissociation (denaturation) of a double-stranded nucleic acid serving as a template into a single-stranded nucleic acid, annealing of a primer into a single-stranded nucleic acid, and synthesis of a complementary strand from the primer (extension). By repeating the reaction, the target gene can be amplified from DNA or RNA. In these methods, it is necessary to repeat a total of three steps of adjusting the reaction solution to a temperature suitable for each of the above three steps. Furthermore, as a method for detecting a mutation of a target base sequence to which it is applied, a method of performing PCR using a primer designed to have a sequence complementary to a sequence containing a mutation to be detected [Non-patent Document 2] [Non-Patent Document 3] is known, but detection of a base sequence based on PCR always involves a problem due to non-specific annealing of primers [Non-Patent Document 4]. That is, even if the base sequence is not completely complementary, the primer anneals to synthesize a complementary strand, and exponential amplification occurs. Therefore, under normal conditions, it is difficult to discriminate single base differences such as mutations and SNPs by PCR.

さらに、核酸増幅法による変異型遺伝子の検出を行なう場合には、利用する核酸増幅法の特異性が特に重要となる。一方で、核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法以外にも様々な方法が開発されており、例えば、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法［特許文献４］）、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法（［特許文献５］）、ＮＡＳＢＡ法（［特許文献６］）、ＬＡＭＰ法（［特許文献７］）、ＩＣＡＮ法（［特許文献８］）、ローリングサークル法（［特許文献９］）に記載の方法などが知られているが、どれも完全な方法とは言いがたい。  Furthermore, when detecting a mutant gene by a nucleic acid amplification method, the specificity of the nucleic acid amplification method to be used is particularly important. On the other hand, various methods other than the PCR method have been developed as a nucleic acid amplification method. For example, a strand displacement amplification method (SDA method [Patent Document 4]), a self-sustained sequence amplification method (3SR method), Qβ Replicase method ([patent document 5]), NASBA method ([patent document 6]), LAMP method ([patent document 7]), ICAN method ([patent document 8]), rolling circle method ([patent document 9]) Are known, but none are perfect.

以上の問題点を解決すべく、本発明者らはＳＭＡＰ法（ＳＭａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法［特許文献１０］）を用いた正確かつ感度や特異性のよい検出方法を報告した。この方法では、標的塩基配列の識別のための配列がプライマーからの相補鎖合成によって初めてもたらされ、しかもこの配列がプライマーからの増幅産物に折り返し、その増幅の特異性をあげるとともに、自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となるため、標的塩基配列に対し、正確に増幅させることが可能となる。しかし、このような方法を用いても、核酸の塩基配列によってはプライマーの非標的塩基配列上への非特異的なアニールによる相補鎖合成を完全に防止することは標的核酸の配列によっては容易ではない場合もあった。
米国特許第４６８３１９５号明細書 米国特許第４６８３２０２号明細書 米国特許第４８００１５９号明細書 ＳＤＡ法；特公平７−１１４７１８号公報 日本国特許第２７１０１５９号公報 日本国特許第２６５０１５９号公報 国際公開第００／２８０８２号 国際公開第０２／１６６３９号 国際公開第２００４／０４００１９号 特願２００５−５１６６４２号 ＲＴ−ＰＣＲ法；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，ｐｐ１４６−１５２，１９９２ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１７：ｐ２５０３１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５：ｐ５３５ １９８９ Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ１１４：ｐ１０５ １９８９ Ｓ．Ｋｗｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１８：ｐ９９９ １９９０ In order to solve the above problems, the present inventors have reported an accurate, sensitive and specific detection method using the SMAP method (SMart Amplification Process method [Patent Document 10]). In this method, a sequence for identifying a target base sequence is first brought about by the synthesis of a complementary strand from a primer, and this sequence is folded back into an amplification product from the primer to increase the specificity of the amplification and to itself as a template. Therefore, it is possible to accurately amplify the target base sequence. However, even if this method is used, depending on the nucleotide sequence of the nucleic acid, it may not be easy to completely prevent complementary strand synthesis due to nonspecific annealing of the primer onto the non-target nucleotide sequence, depending on the target nucleic acid sequence. There was no case.
US Pat. No. 4,683,195 US Pat. No. 4,683,202 U.S. Pat. No. 4,800,159 SDA method; Japanese Patent Publication No. 7-114718 Japanese Patent No. 2710159 Japanese Patent No. 2650159 International Publication No. 00/28082 International Publication No. 02/16639 International Publication No. 2004/040019 Japanese Patent Application No. 2005-516642 RT-PCR method; Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992 allele-specific PCR, Nucleic Acids Res17: p25031989, Genomics5: p535 1989 J. et al. Lab. Clin. Med114: p105 1989 S. Kwok et. al. , Nucleic Acids Res 18: p999 1990.

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子検出法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止し、より正確な検出方法を提供する。The present invention provides a more accurate detection method by reliably preventing synthesis of complementary strands from non-target nucleotide sequences in various nucleic acid sequences in a gene detection method using an isothermal amplification method.

本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。（１）等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該標的塩基配列上からの相補鎖合成の特異性を高めることを特徴とする遺伝子検出方法。（２）等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする（１）に記載の方法。（３）等温増幅法が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、（１）または（２）に記載の方法。（４）前記の等温増幅法がＳＭＡＰ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法のいずれかである、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。（５）前記のプライマーまたはオリゴヌクレオチドに含まれる人工的な変異核酸が非標的塩基配列における変異部位以外に１塩基から１０塩基のミスマッチを形成する（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。（６）前記のプライマーまたはオリゴヌクレオチドに含まれる人工的な変異核酸が、核酸またはペプチド核酸またはＬＮＡまたは非天然核酸、もしくは、それら２種類以上からなる混合されたものである、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。（７）検出すべき変異が１塩基多型または点変異または挿入または欠失または繰り返し配列である、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。The present invention provides the following (1) to (7). (1) In the gene detection method using the isothermal amplification method, a complementary strand from the target base sequence can be obtained by including an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to the target base sequence. A gene detection method characterized by increasing the specificity of synthesis. (2) In a gene mutation detection method using an isothermal amplification method, by including an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to a non-target nucleotide sequence, The method according to (1), wherein complementary strand synthesis is prevented. (3) The method according to (1) or (2), wherein the isothermal amplification method is performed in the presence of a mismatch binding protein. (4) Any one of (1) to (3), wherein the isothermal amplification method is any one of SMAP method, LAMP method, NASBA method, ICAN method, TRC method, SDA method, TMA method, and RCA method. The method described in 1. (5) In any one of (1) to (4), the artificial mutant nucleic acid contained in the primer or oligonucleotide forms a mismatch of 1 to 10 bases other than the mutation site in the non-target base sequence The method described. (6) The artificial mutant nucleic acid contained in the primer or oligonucleotide is a nucleic acid, peptide nucleic acid, LNA or non-natural nucleic acid, or a mixture of two or more thereof (1) to ( The method according to any one of 5). (7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the mutation to be detected is a single nucleotide polymorphism, a point mutation, an insertion or deletion, or a repeated sequence.

本発明者らは鋭意検討した結果、標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーやオリゴヌクレオチド中に、標的塩基配列とのアニールを阻害しない程度に、標的塩基配列とミスマッチを形成する塩基を含ませることにより非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する本発明を完成させた。As a result of intensive studies, the present inventors have included a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to the target base sequence to the extent that it does not inhibit annealing with the target base sequence, so as to form a mismatch with the target base sequence. Thus, the present invention for preventing complementary strand synthesis in a non-target base sequence was completed.

以下、本発明について詳細に説明する。ＳＭＡＰ法とは本発明者らが発明した等温核酸増幅法であり、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、標的核酸が増幅された場合にのみステム−ループ形成可能なプライマーを特定の条件を満たすように設計し、このプライマーと５’末端部分に折返し配列を有するプライマーとを組み合わせて用いることにより、特異的かつ効率的に標的核酸を増幅できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。ＳＭＡＰ法は、標的核酸を特異的かつ効率的に増幅しうるプライマーセット、およびこれを用いた核酸増幅法を提供することを目的とする。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The SMAP method is an isothermal nucleic acid amplification method invented by the present inventors. In a nucleic acid amplification method using a strand displacement reaction, a primer capable of forming a stem-loop only when a target nucleic acid is amplified is used under specific conditions. It was found that the target nucleic acid can be specifically and efficiently amplified by using this primer in combination with a primer having a folded sequence at the 5 ′ end. The present invention is based on such knowledge. The purpose of the SMAP method is to provide a primer set that can specifically and efficiently amplify a target nucleic acid, and a nucleic acid amplification method using the primer set.

ＳＭＡＰ法によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものであるプライマーセットである。  The primer set by the SMAP method is a primer set comprising at least two kinds of primers capable of amplifying a target nucleic acid sequence, wherein the first primer contained in the primer set is a 3 ′ end portion of the target nucleic acid sequence. Complementary sequence of sequence (B) comprising sequence (Ac ′) that hybridizes to sequence (A) at the 3 ′ end portion and present 5 ′ to sequence (A) in the target nucleic acid sequence ( A sequence (B ′) that hybridizes to Bc) is provided on the 5 ′ side of the sequence (Ac ′), and the second primer included in the primer set is a sequence complementary to the target nucleic acid sequence. Two nucleic acid sequences comprising a sequence (Cc ′) that hybridizes to the sequence (C) of the 3 ′ end portion at the 3 ′ end portion and hybridizing to each other are on the same strand. A primer set is those comprising folded sequence (D-Dc ') on the 5' side of the sequence (Cc '), including.

さらに、本発明による核酸増幅法は、鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットを用意する工程、および（ｃ）前記鋳型核酸の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなるものである。  Furthermore, the nucleic acid amplification method according to the present invention is a method for amplifying a target nucleic acid sequence in a template nucleic acid, comprising: (a) preparing a template nucleic acid containing the target nucleic acid sequence; and (b) preparing a primer set according to the present invention. And (c) performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set in the presence of the template nucleic acid.

本発明によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して標的核酸を合成することが可能となる。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれを用いた核酸増幅法は、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度調整に要する時間も必要ないため、短時間で増幅産物を得ることを可能とする。さらに、本発明によるプライマーセットは高度に特異的な核酸増幅を可能とするため、これを用いることにより、遺伝子中における変異、特に一塩基変異の有無、特定の核酸配列中における配列の欠失または挿入の有無などを、増幅産物の検出によって判定することが可能となる。  According to the present invention, it is possible to continuously synthesize target nucleic acids under isothermal conditions using DNA or RNA as a template. Therefore, the primer set according to the present invention and the nucleic acid amplification method using the primer set do not require a special device such as a thermal cycler, and do not require time for temperature adjustment. Make it possible. Furthermore, since the primer set according to the present invention enables highly specific nucleic acid amplification, by using it, mutations in the gene, especially the presence or absence of single nucleotide mutations, deletion of sequences in specific nucleic acid sequences or The presence or absence of insertion can be determined by detecting the amplification product.

さらに、本発明者らは、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬による等温での核酸増幅反応を利用した変異検出法において、該核酸増幅反応をミスマッチ識別能を有する物質の存在下で行なうことにより、より正確な変異の検出が可能となることを見出した。  Furthermore, the present inventors identify mismatches in nucleic acid amplification reactions in mutation detection methods using isothermal nucleic acid amplification reactions with nucleic acid reagents that cause mismatches with the templates either by the presence or absence of mutations in the templates. It was found that the mutation can be detected more accurately by carrying out in the presence of a substance having an ability.

従って、本発明の第二の態様によれば、ミスマッチ結合タンパク質などのミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬を用いた等温での核酸増幅反応を行なうことにより、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法が提供される。  Therefore, according to the second aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid reagent that generates a mismatch with a template by the presence or absence of a mutation in the template in the presence of a substance having mismatch discrimination ability such as a mismatch binding protein. By carrying out the isothermal nucleic acid amplification reaction used, a method for determining the presence or absence of a mutation in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample is provided.

ＳＭＡＰ法におけるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるものである。該プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものである。また、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ−Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものである。  The primer set in the SMAP method comprises at least two kinds of primers capable of amplifying a target nucleic acid sequence. The first primer included in the primer set comprises a sequence (Ac ′) that hybridizes to the sequence (A) at the 3 ′ end portion of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion, and The sequence (B ′) hybridizes to the complementary sequence (Bc) of the sequence (B) existing 5 ′ to the sequence (A) on the 5 ′ side of the sequence (Ac ′). . The second primer included in the primer set comprises a sequence (Cc ′) that hybridizes to the sequence (C) of the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion, In addition, a folded sequence (D-Dc ′) containing two nucleic acid sequences hybridizing to each other on the same strand is included on the 5 ′ side of the sequence (Cc ′).

本発明において「標的塩基配列」、「標的核酸」、「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸を意味し、さらに、検出すべき変異や多型が含まれる塩基配列をも意味する。言いかえれば、本発明におけるプライマーがアニールする領域に挟まれて存在する塩基配列が、本発明における標的塩基配列を構成する。それに対し、非標的塩基配列とは、検出対象ではない塩基配列を意味し、状況によっては、変異や多型が含まれる塩基配列を意味する。言いかえれば、検出対象ではない核酸試料における上記「標的塩基配列」に相当する部分の配列が、本発明の非標的塩基配列を構成すると言える。  In the present invention, “target base sequence”, “target nucleic acid”, and “target nucleic acid sequence” mean not only the nucleic acid to be amplified or the sequence itself, but also a complementary sequence or a nucleic acid having the sequence. Furthermore, it also means a base sequence containing a mutation or polymorphism to be detected. In other words, the base sequence that is sandwiched between the regions where the primer in the present invention anneals constitutes the target base sequence in the present invention. On the other hand, a non-target base sequence means a base sequence that is not a detection target and, depending on the situation, means a base sequence containing a mutation or polymorphism. In other words, it can be said that the sequence corresponding to the “target base sequence” in the nucleic acid sample that is not the detection target constitutes the non-target base sequence of the present invention.

本発明の検出対象が野性型である場合、野性型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「標的塩基配列」であり、変異型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「非標的塩基配列」となる。一方、検出対象が変異型である場合は、変異型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「標的塩基配列」であり、野性型の核酸試料中の変異部位を含む塩基配列は「非標的塩基配列」となる。本発明における（非）標的塩基配列とは、プライマーが増幅するべき配列でない部分、さらにはセンス鎖の塩基配列に加えて、その相補鎖、すなわちアンチセンス鎖の塩基配列も含む。変異、または変異部位とは、標的塩基配列および非標的塩基配列上において変異を生じうる部位の塩基配列で、該変異には多型、ＳＮＰｓが含まれる。また点変異とは、１塩基変異を生じることで、そこからコードされるアミノ酸が置換されるものや置換されないものも含み、さらに、１塩基の変異のみならず、数塩基の変異を伴う場合もある。When the detection target of the present invention is a wild type, the base sequence containing the mutation site in the wild type nucleic acid sample is the “target base sequence”, and the base sequence containing the mutation site in the mutant nucleic acid sample is “non- Target base sequence ". On the other hand, when the detection target is a mutant type, the base sequence including the mutation site in the mutant nucleic acid sample is the “target base sequence”, and the base sequence including the mutation site in the wild type nucleic acid sample is “non- Target base sequence ". The (non-) target base sequence in the present invention includes a portion which is not a sequence to be amplified by the primer, and also includes the complementary strand, that is, the base sequence of the antisense strand, in addition to the base sequence of the sense strand. The mutation or mutation site is a nucleotide sequence of a site that can cause mutation on the target nucleotide sequence and the non-target nucleotide sequence, and the mutation includes polymorphisms and SNPs. Point mutations also include those in which the amino acid encoded therefrom is substituted or non-substituted by causing a single base mutation. Furthermore, not only single base mutations but also several base mutations may be involved. is there.

本発明において「変異」とは、核酸配列中に対照核酸配列とは異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）が存在することを意味する。また、本発明において「対照核酸」とは、ある特定の塩基配列に関して、標準的な塩基配列、例えば標準的な遺伝子型、であるとされる野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ。正常型（ｎｏｒｍａｌ ｔｙｐｅ）とも称される。）の配列を有する核酸をいう。これに対し、「被検核酸」とは、本発明による変異検出法において、対照核酸と異なる塩基（変異）を有するか否かを調べる対象となる核酸を意味し、換言すれば、核酸試料中に存在する核酸であって、変異に係る塩基を除いて対照核酸と同一の配列を有するものを意味する。さらに、本発明において「変異に係る塩基」または「変異に係るヌクレオチド残基」とは、核酸中における変異の部位に存在する塩基またはヌクレオチド残基を意味し、従って、対照核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基および変異型の核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基のどちらをも意味する。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において、変異を有することが疑われる患者の遺伝子は被検核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。  In the present invention, “mutation” means that there is a base (base pair in the case of double-stranded nucleic acid) different from the control nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence. In the present invention, the “control nucleic acid” refers to a wild type (normal type) which is a standard base sequence, for example, a standard genotype, with respect to a specific base sequence. A nucleic acid having the sequence of On the other hand, the “test nucleic acid” means a nucleic acid to be examined whether or not it has a base (mutation) different from the reference nucleic acid in the mutation detection method according to the present invention, in other words, in a nucleic acid sample. Means a nucleic acid having the same sequence as that of the control nucleic acid except for the base related to the mutation. Further, in the present invention, “mutation base” or “mutation nucleotide residue” means a base or nucleotide residue present at the mutation site in the nucleic acid, and therefore included in the mutation site of the control nucleic acid. This means both a base or nucleotide residue and a base or nucleotide residue contained in the mutation site of a mutated nucleic acid. For example, when detecting a mutation in a gene of a patient suspected of having a genetic disease, the gene of the patient suspected of having the mutation is a test nucleic acid, and the gene of a healthy person corresponding to this gene is a control nucleic acid.

鋳型とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。また、核酸の合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して増幅という。The template means a nucleic acid on the side serving as a template for complementary strand synthesis. A “complementary strand” having a base sequence complementary to the template has a meaning as a strand corresponding to the template, but the relationship between them is merely relative. That is, the strand synthesized as a complementary strand can function as a template again. That is, the complementary strand can be a template. The synthesis of nucleic acid means the extension of nucleic acid from the oligonucleotide that is the origin of synthesis. In addition to synthesis, when the production of other nucleic acids and the elongation reaction of the produced nucleic acids occur continuously, the series of reactions are collectively referred to as amplification.

本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。さらに、アニールとハイブリダイズは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく塩基対結合によって２重らせん構造（ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｌｉｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が１本鎖であっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、アニール、あるいはハイブリダイズである。本発明において、アニールとハイブリダイズは、核酸が塩基対結合による２重らせん構造を構成する点で同義である。塩基対結合した３’末端が相補鎖合成の起点となるときに、特にアニールという場合がある。ただし、ハイブリダイズが相補鎖合成の起点となることを否定するものではない。  In the present invention, “hybridize” means that a part of the primer according to the present invention hybridizes to a target nucleic acid under stringent conditions and does not hybridize to a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex of the primer according to the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, and the like. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the primer to be used, the primer can be specifically hybridized to the target nucleic acid. Such a primer can be designed using commercially available primer construction software such as Primer 3 (manufactured by Whitehead Institute for Biomedical Research). According to a preferred embodiment of the present invention, a primer that hybridizes to a target nucleic acid comprises a sequence of all or part of a nucleic acid molecule complementary to the target nucleic acid. Furthermore, annealing and hybridizing means that the nucleic acid forms a double helix structure by base pairing based on the Watson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strand constituting the base pair bond is a single strand, if the complementary base sequence in the molecule forms a base pair bond, it is annealed or hybridized. In the present invention, annealing and hybridization are synonymous in that a nucleic acid forms a double helix structure by base pairing. When the 3 'end bonded to the base pair is the starting point for complementary strand synthesis, it may be called annealing. However, it does not deny that hybridization is the starting point for complementary strand synthesis.

核酸、或いは、核酸試料はＤＮＡ、またはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ分子であってもよく、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。また部分的に、あるいは全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体でも、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、あるいは相補鎖合成のための鋳型として機能する限り、本発明の核酸に含まれる。人工塩基として、例えば、２−ａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｕｒｉｎｅ ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ、５−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−６−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ、ｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ、９−Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［（４，５）−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ、５−ｉｏｄｏ−２−ｏｘｏ（１Ｈ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ ２−ｏｘｏ−（１Ｈ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−６−（２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ、７−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅなどがあげられるが、これに限定するものではない。本発明において用いられる「核酸」という用語は、任意の未修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。被検核酸および対照核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、合成ＲＮＡなどのＲＮＡである。本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。核酸は、用語ポリヌクレオチドと同義であり、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの中でも特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には２〜１００塩基長、より一般的には２〜５０塩基長程度のポリヌクレオチドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、便宜的に、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。被検核酸および対照核酸は、試験実施者が自由に選択することができる。さらに、検出を行う際には、これらの核酸が混在していてもよい。The nucleic acid or nucleic acid sample may be DNA, RNA, or a chimeric molecule thereof, and may be natural or artificially synthesized. In addition, a nucleotide derivative having a partially or completely artificial structure can be used as long as it can form a base pair bond or functions as a template for complementary strand synthesis. Included in nucleic acids. Examples of the artificial base include 2-amino-6- (N, N-dimethylamino) purine pyridin-2-one, 5-methylpyridin-2-one, 2-amino-6- (2-thienyl) purine, and pyrolele-2. -Carbaldehyde, 9-Methylimidazo [(4,5) -b] pyridine, 5-iodo-2-oxo (1H) pyridine 2-oxo- (1H) pyridine, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purine, 7- (2-thienyl) -imidazo [4,5-b] pyridine and the like are exemplified, but not limited thereto. The term “nucleic acid” as used in the present invention means a polynucleotide comprising any unmodified nucleotide and / or modified nucleotide. The test nucleic acid and the control nucleic acid are typically DNA such as cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA, or RNA such as mRNA, total RNA, hnRNA, siRNA, and synthetic RNA. The number of bases constituting the nucleic acid in the present invention is not limited. Nucleic acid is synonymous with the term polynucleotide, and oligonucleotide is used as a term indicating a polynucleotide having a particularly small number of bases. In general, a polynucleotide having a length of 2 to 100 bases, more generally about 2 to 50 bases is referred to as an oligonucleotide, but is not limited to these numerical values. The term polynucleotide is used for convenience to include polynucleotides and oligonucleotides as well as artificially synthesized nucleic acids such as peptide nucleic acids, morpholino nucleic acids, methyl phosphonate nucleic acids, S-oligonucleic acids. The test nucleic acid can be freely selected by the tester. Furthermore, when performing detection, these nucleic acids may be mixed.

プライマーセットに含まれるプライマーやプローブは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。  Primers and probes included in the primer set are composed of deoxynucleotides and / or ribonucleotides. In the present invention, “ribonucleotide” (sometimes simply referred to as “N”) refers to ribonucleotide triphosphate such as ATP, UTP, CTP, GTP and the like. Furthermore, these derivatives are included in ribonucleotides, such as ribonucleotides (α-thio-ribonucleotides) in which the oxygen atom of the phosphate group at the α-position is replaced with a sulfur atom.

また、プライマーやプローブには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブ、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーや、そのプローブ等も含まれる。  Primers and probes include oligonucleotide primers composed of unmodified deoxynucleotides and / or modified deoxynucleotides, oligonucleotide primers or probes composed of unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides, and unmodified deoxynucleotides. Chimeric oligonucleotide primers containing nucleotides and / or modified deoxynucleotides and unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides, probes thereof, and the like are also included.

プライマーセットに含まれるプライマーやプローブは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。  Primers and probes included in the primer set can be synthesized by any method that can be used for the synthesis of oligonucleotides, such as the phosphate triester method, the H-phosphonate method, the thiophosphonate method, and the like. The primer can be easily obtained by, for example, synthesizing by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 of ABI (Applied Biosystem Inc.).

本発明の人工ミスマッチの導入は、等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該標的塩基配列上からの相補鎖合成の特異性を高める。さらに具体的には、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする。導入する人工ミスマッチは前記のプライマーに含まれる人工的な変異核酸が非標的塩基配列における変異部位以外に１塩基から１０塩基のミスマッチを形成するように設計するのが望ましい。より望ましくは、１塩基から３塩基のミスマッチを形成するように設計するのが望ましい。The introduction of the artificial mismatch of the present invention is achieved by including an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to a target base sequence in a gene detection method using an isothermal amplification method. Increase the specificity of complementary strand synthesis from above the sequence. More specifically, in the gene mutation detection method using the isothermal amplification method, an artificially mutated nucleic acid is included in a primer or oligonucleotide that can be annealed specifically to the non-target nucleotide sequence. It is characterized by preventing complementary strand synthesis from above. The artificial mismatch to be introduced is preferably designed so that the artificial mutant nucleic acid contained in the primer forms a mismatch of 1 to 10 bases other than the mutation site in the non-target base sequence. More preferably, it is designed to form a mismatch of 1 to 3 bases.

本発明の人工ミスマッチの導入は、オリゴヌクレオチドに導入してもよく、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドに人工的なミスマッチを導入することにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止する。さらに、遺伝子の変異検出方法においては、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドに人工ミスマッチを導入することにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止する。より詳細には、非標的塩基配列における変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチド（競合オリゴヌクレオチド）に人工ミスマッチを導入したものを用いることにより、標的塩基配列にアニールしうるプライマーまたは増幅産物の３’末端が、非標的塩基配列にアニーリングすることを防止する。これらのオリゴヌクレオチドは特異的アニールのために、非標的塩基配列上の特定部位を含む５〜１００塩基長の領域、特に１０〜３０塩基長の領域に対し、これと相補的配列を含むことが好ましい。さらに導入する人工ミスマッチは前記のプライマーまたは競合オリゴヌクレオチドに含まれる人工的な変異核酸が非標的塩基配列における変異部位以外に１塩基から１０塩基のミスマッチを形成するように設計するのが望ましい。より望ましくは、１塩基から３塩基のミスマッチを形成するように設計するのが望ましい。The introduction of the artificial mismatch of the present invention may be introduced into an oligonucleotide. By introducing an artificial mismatch into an oligonucleotide that can specifically anneal to a non-target base sequence, complementation from the non-target base sequence is performed. Prevents chain synthesis. Furthermore, in the gene mutation detection method, an artificial mismatch is introduced into an oligonucleotide that can specifically anneal to a mutation site in a non-target base sequence, thereby preventing complementary strand synthesis from the non-target base sequence. More specifically, by using an oligonucleotide that can specifically anneal to a mutation site in a non-target base sequence (competitive oligonucleotide) with an artificial mismatch introduced, a primer or amplification product that can anneal to the target base sequence The 3 ′ end is prevented from annealing to a non-target base sequence. These oligonucleotides may contain a complementary sequence for a region of 5 to 100 bases including a specific site on the non-target base sequence, particularly a region of 10 to 30 bases for specific annealing. preferable. Further, the artificial mismatch to be introduced is preferably designed so that the artificially mutated nucleic acid contained in the primer or competing oligonucleotide forms a mismatch of 1 to 10 bases other than the mutated site in the non-target base sequence. More preferably, it is designed to form a mismatch of 1 to 3 bases.

前記の競合オリゴヌクレオチドは、３’末端より伸長反応が起こらないように設計されたオリゴヌクレオチドである。より詳細には、前記オリゴヌクレオチドがその３’末端より伸長反応が起こらないように修飾された、または、オリゴヌクレオチドの３’末端より伸長反応が起こらないように標的塩基配列と非相同的な配列をもたせたものである。該修飾塩基の部位は特に限定されないが、３’末端の塩基であることが好ましい。また、塩基の修飾方法は特に限定されず、アミノ化またはリン酸化であることが好ましいが、これに限定するものではない。例えば、ビオチン化、蛍光色素、リン酸化、チオール化、アミノ化、ホスホロチオエート化、ハロゲン化などによる塩基の修飾でもかまはない。The competing oligonucleotide is an oligonucleotide designed so that no extension reaction occurs from the 3 'end. More specifically, the oligonucleotide is modified so that extension reaction does not occur from its 3 ′ end, or is non-homologous to the target base sequence so that extension reaction does not occur from the 3 ′ end of the oligonucleotide. It is a thing with. The site of the modified base is not particularly limited, but is preferably a 3 'terminal base. Moreover, the modification method of a base is not specifically limited, Although it is preferable that it is amination or phosphorylation, it is not limited to this. For example, the base may be modified by biotinylation, fluorescent dye, phosphorylation, thiolation, amination, phosphorothioate, halogenation, or the like.

前記オリゴヌクレオチドの３’末端を修飾する場合、変異部位は競合オリゴヌクレオチドの中央付近に存在することが好ましいが、これに限定されるものではない。When modifying the 3 'end of the oligonucleotide, the mutation site is preferably present near the center of the competing oligonucleotide, but is not limited thereto.

本発明は、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を様々な核酸配列においても確実に防止する。より詳細には、非標的塩基配列に特異的にアニールしうる競合オリゴヌクレオチドに人工ミスマッチを導入したものを用いて、該非標的塩基配列における相補鎖合成を防止する。さらに詳細には、非標的塩基配列に特異的にアニールしうる競合オリゴヌクレオチドに人工ミスマッチを導入したものを用いて、該非標的塩基配列に特異的でないプライマーがアニーリングし、非特異的な相補鎖合成することを防止する。The present invention reliably prevents complementary strand synthesis from a non-target nucleotide sequence even in various nucleic acid sequences in a gene mutation detection method using an isothermal amplification method. More specifically, complementary oligonucleotide synthesis in the non-target base sequence is prevented by using an artificial mismatch introduced into a competing oligonucleotide that can specifically anneal to the non-target base sequence. More specifically, a non-specific complementary strand synthesis is performed by annealing a primer that is not specific to the non-target base sequence by using an artificial mismatch introduced into a competitive oligonucleotide that can specifically anneal to the non-target base sequence. To prevent.

ペプチド核酸からなる人工ミスマッチを導入したプライマーもしくは競合オリゴヌクレオチドは、本発明において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を競合オリゴヌクレオチドの全部、もしくは、その一部として用いることができる。ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。ペプチド主鎖としては、アミド結合によって結合したＮ−（２−アミノエチル）グリシンの反復単位が挙げられる。ＰＮＡのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシン、チオウラシルおよび２，６−ジアミノプリンなどの天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニンなどの人工塩基が挙げられるが、これのみに限定するものではない。In the present invention, a primer or a competitive oligonucleotide into which an artificial mismatch consisting of a peptide nucleic acid is introduced can use a peptide nucleic acid (PNA) as all or part of the competing oligonucleotide. PNA has a structure in which the deoxyribose backbone of an oligonucleotide is replaced with a peptide backbone. Examples of the peptide main chain include repeating units of N- (2-aminoethyl) glycine linked by an amide bond. Bases to be bound to the peptide backbone of PNA include naturally occurring bases such as thymine, cytosine, adenine, guanine, inosine, uracil, 5-methylcytosine, thiouracil and 2,6-diaminopurine, bromothymine, azaadenine and azaguanine Examples thereof include, but are not limited to, artificial bases such as

前記ＰＮＡは、公知の製造法によって、各核酸塩基を結合させたモノマーを製造後、得られたモノマーを、公知の一般的ペプチド合成方法に従い反応させることができる。固相合成法に従い、自動シンセサイザーを用いて、所望の塩基配列となるように合成させればよい。上記方法は、市販の試薬および原料を用いることが可能であり、市販の試薬を常法に従い適当に誘導体化して、例えば原料とするアミノ酸の反応に関与しないＮ末端、Ｃ末端、側鎖官能基等の保護反応を行なって使用することができる。得られた核酸塩基結合ＰＮＡは、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動クロマトグラフィー、溶媒抽出、塩析等の通常の分離手段により容易に単離精製することができる。The PNA can be reacted according to a known general peptide synthesis method after producing a monomer having each nucleobase bonded thereto by a known production method. According to the solid phase synthesis method, an automatic synthesizer may be used to synthesize the desired base sequence. In the above method, commercially available reagents and raw materials can be used. Commercially available reagents are appropriately derivatized according to conventional methods, for example, N-terminal, C-terminal, and side-chain functional groups that are not involved in the reaction of the starting amino acid. Etc. can be used after carrying out a protective reaction. The obtained nucleobase-bound PNA can be easily isolated and purified by ordinary separation means such as high performance liquid chromatography, electrophoresis chromatography, solvent extraction, salting out and the like.

ＰＮＡは通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、オリゴの設計条件によっては、より確実な変異部位の増幅抑制が可能となる。ＰＮＡを人工ミスマッチ導入のためにプライマーもしくは競合オリゴヌクレオチドとして用いる場合、非標的塩基配列上の変異部位に相補的な配列はその３’末端でも５’末端でも中央付近であってもよい。また、該ＰＮＡからなる競合オリゴヌクレオチドの長さは、５〜５０塩基、より望ましくは７〜２５塩基長であることが好ましいが、これに限定されるものではない。Since PNA has a stronger binding force to nucleic acids than ordinary oligonucleotides, amplification of mutation sites can be more reliably suppressed depending on the design conditions of the oligos. When PNA is used as a primer or a competing oligonucleotide for introducing an artificial mismatch, the sequence complementary to the mutation site on the non-target base sequence may be at the 3 'end, 5' end or near the center. The length of the competing oligonucleotide consisting of the PNA is preferably 5 to 50 bases, more preferably 7 to 25 bases, but is not limited thereto.

ＬＮＡは、糖−リン酸骨格においてリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間がメチレン架橋で結合された、２つの環状構造を持つ核酸である。ＬＮＡを含むオリゴがＤＮＡとアニールすると二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。ＬＮＡは通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、オリゴの設計条件によっては、より確実な変異部位のブロックが可能となる。ＬＮＡを人工ミスマッチを導入したプライマーもしくは競合オリゴヌクレオチドの人工ミスマッチ部分に用いる場合、非標的塩基配列上の変異部位に相補的な配列はその３’末端でも５’末端でも中央付近であってもよい。また、該ＬＮＡからなるブロックオリゴの長さは、５〜５０塩基、より望ましくは７〜２５塩基長であることが好ましいが、これに限定されるものではない。ＬＮＡのみで合成されたオリゴヌクレオチドでも、ＬＮＡを一部に含むオリゴヌクレオチド、さらには、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、人工的な核酸などを複数組み合わせたオリゴヌクレオチドを本発明の競合オリゴヌクレオチドとして用いてもかまわない。LNA is a nucleic acid having two circular structures in which the 2'-position oxygen atom and the 4'-position carbon atom of ribose are linked by a methylene bridge in the sugar-phosphate skeleton. When an oligo containing LNA anneals to DNA, the double-stranded conformation changes and the thermal stability increases. Since LNA has a stronger binding force to nucleic acids than ordinary oligonucleotides, depending on the design conditions of the oligo, it is possible to block mutation sites more reliably. When LNA is used as an artificial mismatch part of a primer or a competitive oligonucleotide into which an artificial mismatch is introduced, the sequence complementary to the mutation site on the non-target base sequence may be at the 3 'end, 5' end or near the center. . The length of the block oligo composed of LNA is preferably 5 to 50 bases, more preferably 7 to 25 bases, but is not limited thereto. Competitive oligonucleotides of the present invention include oligonucleotides synthesized only with LNA, oligonucleotides containing LNA in part, and oligonucleotides that combine multiple combinations of LNA, PNA, DNA, RNA, and other artificial nucleic acids. It can be used as

本発明の変異検出方法において、前記検出は内部標準と比較して行うことも可能である。内部標準は、たとえば同一の核酸試料に由来し変異や多型が存在しないことが明らかな核酸を用いることができる。ゲノムの塩基配列の解析を目的とする場合には、ゲノムにおいて変異や多型が知られていない塩基配列を内部標準として利用することが望ましい。あるいはｍＲＮＡを鋳型として本発明の検出方法を行う場合には、たとえばいずれの細胞でも一定の発現量が観察される遺伝子を内部標準とすることが望ましい。これら内部標準に対しても、その塩基配列を標的塩基配列として本発明と同じ条件で相補鎖合成反応を行い、その生成物の量を対照として変異を検出すべき塩基配列から得られた結果と比較することが可能である。In the mutation detection method of the present invention, the detection can be performed by comparison with an internal standard. As the internal standard, for example, a nucleic acid which is derived from the same nucleic acid sample and clearly has no mutation or polymorphism can be used. For the purpose of analyzing the base sequence of the genome, it is desirable to use a base sequence whose mutation or polymorphism is not known in the genome as an internal standard. Alternatively, when the detection method of the present invention is performed using mRNA as a template, for example, it is desirable to use a gene whose constant expression level is observed in any cell as an internal standard. Also for these internal standards, a complementary strand synthesis reaction was carried out under the same conditions as in the present invention using the base sequence as the target base sequence, and the results obtained from the base sequence to be detected for mutation with the amount of the product as a control It is possible to compare.

本発明の変異検出方法の利用本発明の検出方法は、あらゆる核酸に対して応用することが可能である。たとえば原核細胞や真核細胞のゲノム、ウイルスのゲノムＤＮＡやゲノムＲＮＡ、マイコプラズマやリケッチアのような細胞内寄生体のゲノム、これらの生物種のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、更にこれらの遺伝子ソースから誘導されたライブラリーや、ライブラリーから単離されたクローンなどを示すことが可能である。変異や多型を検出すべき遺伝子がＲＮＡであれば、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼの作用によってｃＤＮＡとすることが可能である。本発明の試料とする核酸は、一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物、あるいは微生物の組織、細胞、培養物、***物あるいはそれらの抽出物を示すことが可能である。本発明は、これらの生物学的試料に含まれる、その生物に由来する核酸、あるいはその生物を宿主としている感染性の寄生生物、微生物、並びにウイルスに由来する核酸等を検出対象とすることが可能である。また本発明における核酸は、前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、ｍＲＮＡをもとに合成されたｃＤＮＡや、生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅された核酸等を本発明による検出方法の試料とすることが可能である。これらの遺伝子は、変性によって１本鎖とすることにより、あるいは後で述べるように２本鎖のまま、本発明による検出方法の試料とすることが可能である。Use of the Mutation Detection Method of the Present Invention The detection method of the present invention can be applied to any nucleic acid. For example, prokaryotic and eukaryotic genomes, viral genomic DNA and RNA, intracellular parasite genomes such as mycoplasma and rickettsia, cDNA derived from mRNAs of these species, and derived from these gene sources Or a clone isolated from the library can be shown. If the gene whose mutation or polymorphism is to be detected is RNA, it can be converted to cDNA by the action of a DNA polymerase having reverse transcriptase activity. The nucleic acid used as the sample of the present invention is generally contained in a biological sample. Biological samples can refer to animal, plant, or microbial tissue, cells, cultures, excreta or extracts thereof. The present invention is intended to detect nucleic acids derived from these organisms or infectious parasites, microorganisms, and viruses derived from these organisms contained in these biological samples. Is possible. The nucleic acid in the present invention may be derived from a nucleic acid contained in the biological sample. For example, a cDNA synthesized based on mRNA, a nucleic acid amplified based on a nucleic acid derived from a biological sample, or the like can be used as a sample for the detection method according to the present invention. These genes can be used as a sample for the detection method according to the present invention by making them into single strands by denaturation or in the form of double strands as described later.

核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から調製することができる。  The template nucleic acid or nucleic acid sample containing the target nucleic acid sequence used in the nucleic acid amplification reaction may be either DNA or RNA. DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. RNA includes all RNA, mRNA, rRNA, siRNA, hnRNA, and synthetic RNA. These nucleic acids can be prepared, for example, from blood, tissues, cells, biological samples such as animals and plants, or microorganism-derived samples separated from biological samples, food, soil, waste water, and the like.

逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼ等も挙げられる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。  The enzyme used for the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), rous-related virus 2 reverse Examples include reverse transcriptase of various origins such as a transcriptase (RAV-2 RTase) and a Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTase). In addition, a DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used. For the purpose of the present invention, an enzyme having reverse transcription activity at high temperature is optimal, and for example, DNA polymerase derived from Thermus bacteria (such as Tth DNA polymerase) or DNA polymerase derived from Bacillus bacteria can be used. As a particularly preferable enzyme, for example, as a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium, B. st-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase); Ca-derived DNA polymerase (Bca DNA polymerase), for example, BcaBEST DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, and the like can be mentioned. Examples also include Bsm DNA polymerase and Aac DNA polymerase. For example, Bca DNA polymerase does not require manganese ions for reaction, and can synthesize cDNA while suppressing secondary structure formation of template RNA under high temperature conditions.

核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。  In the nucleic acid amplification reaction, even when the template nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, it can be used as it is in the reaction. However, if necessary, the primer nucleic acid can be denatured into a single strand to obtain a primer for the template nucleic acid. Annealing can also be performed efficiently. Increasing the temperature to about 95 ° C is a preferred nucleic acid denaturation method. As another method, it is possible to denature by raising the pH, but in this case, it is necessary to lower the pH in order to hybridize the primer to the target nucleic acid.

核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。  The polymerase used in the nucleic acid amplification reaction only needs to have strand displacement activity (strand displacement ability), and any of normal temperature, intermediate temperature, and heat resistance can be suitably used. Further, this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutation. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Furthermore, it is preferable that the DNA polymerase has substantially no 5 '→ 3' exonuclease activity. Examples of such DNA polymerase include thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B. st”), Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B. ca”), and the like. Examples include mutants lacking 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity of the derived DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli derived DNA polymerase I, and the like. Examples of the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification reaction include Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, Deep Vent (Exo-) DNA polymerase, Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z -Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, Terminator DNA polymerase, Bsm DNA polymerase, Aac DNA polymerase and the like.

核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。  Other reagents used in the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, etc. Can be used. Further, additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, and cation complexes may be used.

核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。  In the nucleic acid amplification reaction, a melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in order to increase the amplification efficiency of the nucleic acid. The melting temperature (Tm) of a nucleic acid is generally determined by the specific nucleotide sequence of the double stranded portion in the nucleic acid. By adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution, this melting temperature can be changed. Therefore, under a certain temperature, the intensity of double strand formation in the nucleic acid can be adjusted. A general melting temperature adjusting agent has an effect of lowering the melting temperature. By adding such a melting temperature adjusting agent, the melting temperature of the duplex forming part between two nucleic acids can be lowered, in other words, the strength of the duplex formation can be lowered. It becomes. Therefore, when such a melting temperature adjusting agent is added to the reaction solution in the nucleic acid amplification reaction, it is efficiently used in a GC-rich nucleic acid region that forms a strong double strand or a region that forms a complex secondary structure. The double-stranded portion can be made into a single strand, and this makes it easy for the next primer to hybridize to the target region after the extension reaction with the primer is completed, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased. The melting temperature adjusting agent used in the present invention and its concentration in the reaction solution are appropriately selected by those skilled in the art in consideration of other reaction conditions that affect the hybridization conditions, such as salt concentration, reaction temperature, etc. The Therefore, the melting temperature adjusting agent is not particularly limited, but is preferably dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide or glycerol, or any combination thereof, more preferably dimethyl sulfoxide (DMSO). .

さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。  Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, an enzyme stabilizer can be added to the reaction solution. Thereby, since the enzyme in the reaction solution is stabilized, the amplification efficiency of the nucleic acid can be increased. The enzyme stabilizer used in the present invention may be any known in the art, such as glycerol, bovine serum albumin, saccharides, etc., and is not particularly limited.

さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。  Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, a reagent for enhancing the heat resistance of an enzyme such as DNA polymerase or reverse transcriptase can be added to the reaction solution as an enzyme stabilizer. As a result, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid synthesis efficiency and amplification efficiency can be increased. Such a reagent may be any known in the art and is not particularly limited, but is preferably a saccharide, more preferably a mono- or oligosaccharide, more preferably trehalose, sorbitol or mannitol, or these It is set as the mixture of 2 or more types.

本発明による人工ミスマッチを導入したオリゴヌクレオチド、プローブならびにプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、この核酸増幅反応は、鋳型核酸または核酸試料と本発明によるプローブならびにプライマーセットとを含んでなる核酸増幅用溶液を用意する工程、およびこの核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。  The nucleic acid amplification reaction using the oligonucleotide, probe and primer set introduced with the artificial mismatch according to the present invention can be performed isothermally. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification reaction comprises a step of preparing a nucleic acid amplification solution comprising a template nucleic acid or nucleic acid sample, the probe according to the present invention and a primer set, and the nucleic acid amplification step. Incubating the solution isothermally. Here, “isothermal” refers to maintaining an approximately constant temperature condition such that the enzyme and the primer can substantially function. Furthermore, the “substantially constant temperature condition” means that not only the set temperature is accurately maintained but also a temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is allowed. To do.

一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プローブまたはプライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプローブまたはプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プローブまたはプライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。  The nucleic acid amplification reaction under a certain temperature condition can be carried out by keeping the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained. In this nucleic acid amplification reaction, in order for the probe or primer to anneal to the target nucleic acid, for example, the reaction temperature is preferably set to a temperature close to or below the melting temperature (Tm) of the probe or primer. Furthermore, it is preferable to set the stringency level in consideration of the melting temperature (Tm) of the probe or primer. Therefore, this temperature is preferably about 20 ° C to about 75 ° C, more preferably about 35 ° C to about 65 ° C.

上記の核酸増幅反応においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ，ｉｓｏＣ等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、上記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Ｙ１８８Ｌ／Ｅ４７８Ｑ変異型ＨＩＶＩ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＴｕｂ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適である。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。  In the nucleic acid amplification reaction, a nucleic acid containing an unnatural nucleotide can be used as a template nucleic acid. As used herein, “non-natural nucleotide” means a nucleotide that contains a base other than the base (adenine, guanine, cytosine, and thymine or uracil) contained in a natural nucleotide, and that can be incorporated into a nucleic acid sequence. Examples thereof include xanthosines, diaminopyrimidines, isoG, isoC and the like. In general, a nucleic acid amplification enzyme having no heat resistance is used for amplification of a target nucleic acid containing an unnatural nucleotide. On the other hand, since the nucleic acid amplification reaction can be performed at an isothermal temperature of, for example, about 50 ° C., the nucleic acid amplification enzyme (such as DNA polymerase) is less likely to be inactivated as compared with the conventional PCR method. Therefore, the nucleic acid amplification reaction using the primer set according to the present invention is also effective for amplifying a target nucleic acid containing a non-natural nucleotide in which a nucleic acid amplification enzyme having no heat resistance is used. The enzyme used for the amplification of the nucleic acid containing the non-natural nucleotide is not particularly limited as long as it can amplify such a target nucleic acid, but Y188L / E478Q mutant HIV I reverse transcriptase is particularly preferred from the viewpoint of uptake efficiency. AMV reverse transcriptase, Klenow fragment of DNA polymerase, 9 ° N DNA polymerase, HotTub DNA polymerase and the like are preferable. Furthermore, a substance that improves the heat resistance of the nucleic acid amplification enzyme, such as trehalose, can also be added to the reaction solution, whereby the target nucleic acid containing unnatural nucleotides can be more efficiently amplified.

本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明による核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌａｃｋ Ｔ、Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｎａｐｈｔｈｏｌ Ｂｌｕｅ等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Ｃａｌｃｅｉｎなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。  The presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method according to the present invention can be detected by many different methods. One method is the detection of amplification products of a specific size by general gel electrophoresis. In this method, for example, it can be detected by a fluorescent substance such as ethidium bromide or cyber green. As another method, it is also possible to detect by using a labeled probe having a label such as biotin and hybridizing it to the amplification product. Biotin can be detected by binding to fluorescently labeled avidin, avidin bound to an enzyme such as peroxidase, and the like. As yet another method, there is a method using an immunochromatograph. In this method, it has been devised to use a chromatographic medium utilizing a label detectable with the naked eye (immunochromatography method). If the amplified fragment and the labeled probe are hybridized, and a capture probe capable of hybridizing with a further different sequence of the amplified fragment is fixed to the chromatographic medium, the trapped portion can be trapped. Detection with is possible. As a result, it is possible to perform simple detection with the naked eye. Furthermore, in the nucleic acid amplification method according to the present invention, since amplification efficiency in the nucleic acid amplification reaction is very high, it is possible to indirectly detect an amplification product by utilizing pyrophosphate as a byproduct of amplification. As such a method, for example, there is a method of visually observing the white turbidity of the reaction solution by utilizing the fact that pyrophosphoric acid is bonded to magnesium in the reaction solution to cause white precipitation of magnesium pyrophosphate. As another method, there is a method utilizing the fact that the concentration of magnesium ions in the reaction solution is remarkably reduced by forming an insoluble salt by strongly binding pyrophosphate to metal ions such as magnesium. In this method, a change in the color of the reaction solution is visually observed by adding a metal indicator (for example, Eriochrome Black T, Hydroxy Naphthol Blue, etc.) whose color tone changes according to the magnesium ion concentration to the reaction solution. This makes it possible to detect the presence or absence of amplification. Furthermore, by using Calcein or the like, the increase in fluorescence accompanying the amplification reaction can be visually observed, and thus the amplification product can be detected in real time.

本発明による核酸増幅法ならびに検出においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を基質として使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。さらには、それらビオチンや標識物質などの何らかの構造を介して増幅産物の有無を確認することも可能である。  In the nucleic acid amplification method and detection according to the present invention, a base labeled with biotin or a fluorescent substance can be used as a substrate instead of ordinary dNTP. It is also possible to prepare. Furthermore, the presence or absence of an amplification product can be confirmed through some structure such as biotin or a labeling substance.

さらに、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法またはＳＤＡ法において利用される「アウタープライマー」を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。アウタープライマーとしては、鋳型核酸上において標的核酸配列の外側に位置する部分に相補鎖合成起点を提供しうるプライマーを用いることができる。  Furthermore, the primer set according to the present invention can include an “outer primer” used in the LAMP method or the SDA method, thereby improving the efficiency of nucleic acid amplification. As the outer primer, a primer capable of providing a complementary strand synthesis origin at a portion located outside the target nucleic acid sequence on the template nucleic acid can be used.

本発明による核酸増幅法により、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマー等を簡便かつ迅速に作製することができる。また、本発明による核酸増幅法により、目的に応じて、標的核酸のセンス配列のみまたはアンチセンス配列のみを選択的に増幅することも可能である。  By the nucleic acid amplification method according to the present invention, a single-stranded nucleic acid to be immobilized on a DNA chip, a single-stranded DNA probe for determining a base sequence, a megaprimer for a long-chain PCR method, etc. can be easily and rapidly prepared. Can do. Further, according to the nucleic acid amplification method of the present invention, it is possible to selectively amplify only the sense sequence or the antisense sequence of the target nucleic acid depending on the purpose.

本発明による本発明による人工ミスマッチを導入したオリゴヌクレオチド、プライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定することが可能である。この目的のためには、変異部位が前記配列（Ａ）、前記配列（Ｂ）または前記配列（Ｃ）に含まれるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となる。従って、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットであって、前記変異を有するか、または該変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、該変異に係るヌクレオチド残基が配列（Ａ）、配列（Ｂ）または配列（Ｃ）に含まれるように設計されたプライマーセットを用意する工程、および（ｃ）前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。  It is possible to determine the presence or absence of a mutation in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample using a nucleic acid amplification reaction using an oligonucleotide and primer set into which an artificial mismatch according to the present invention is introduced. For this purpose, a primer set can be designed so that the mutation site is included in the sequence (A), the sequence (B) or the sequence (C), thereby confirming the presence or absence of the amplification product. This makes it possible to determine the presence or absence of the mutation. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for determining the presence or absence of a mutation in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample, comprising: (a) a step of preparing a nucleic acid sample; (b) a primer set according to the present invention, wherein the mutation A primer designed so that a nucleic acid sequence having or having no mutation is a target nucleic acid sequence, and nucleotide residues related to the mutation are included in the sequence (A), the sequence (B), or the sequence (C) There is provided a method comprising: preparing a set; and (c) performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set in the presence of the nucleic acid sample.

本発明による変異検出法では、目的とする変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットに、人工ミスマッチを導入したオリゴヌクレオチド、またはプライマーを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が該変異の存在を示し、増幅産物の不在または減少が該変異の不在を示す。一方で、目的とする変異を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が該変異の不在を示し、増幅産物の不在または減少が該変異の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。  In the mutation detection method according to the present invention, when an oligonucleotide or primer into which an artificial mismatch is introduced into a primer set designed using a nucleic acid sequence having a target mutation as a target nucleic acid sequence, amplification after the nucleic acid amplification reaction is performed. The presence of the product indicates the presence of the mutation and the absence or reduction of the amplification product indicates the absence of the mutation. On the other hand, when using a primer set designed with the target nucleic acid sequence having no target mutation, the presence of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction indicates the absence of the mutation. Or a decrease indicates the presence of the mutation. Here, “decrease in amplification product” means that the amount of amplification product obtained is reduced compared to the amount of amplification product obtained when the target nucleic acid sequence is present in the nucleic acid sample. To do.

本発明の一つの実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ａ）に含まれるように設計された人工ミスマッチを一部、もしくは全てのプライマーに導入したプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（Ａ）の５’末端（第一のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）は、前記配列（Ａ）に相補的な配列とすることが好ましい。  According to one embodiment of the present invention, in step (b) of the mutation detection method according to the present invention, a part of the artificial mismatch designed so that the nucleotide residue related to the mutation is included in the sequence (A), Alternatively, primer sets introduced to all primers are prepared. In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the first primer anneals to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. If the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, it will be difficult for the first primer to anneal to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction. Is not obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The nucleotide residue involved in the mutation is preferably contained in the 5 'end of the sequence (A) (corresponding to the 3' end in the first primer). The sequence (Ac ′) contained in the first primer is preferably a sequence complementary to the sequence (A).

本発明の他の実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ｃ）に含まれるように設計された人工ミスマッチを導入したプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（Ｃ）の５’末端（第二のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）は、前記配列（Ｃ）に相補的な配列とすることが好ましい。  According to another embodiment of the present invention, in the step (b) of the mutation detection method according to the present invention, a primer into which an artificial mismatch designed so that the nucleotide residue related to the mutation is included in the sequence (C) is introduced. A set is prepared. In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the second primer anneals to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. When the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, it is difficult for the second primer to anneal to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction. Or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The nucleotide residue involved in the mutation is preferably included in the 5 'end of the sequence (C) (corresponding to the 3' end in the second primer). The sequence (Cc ′) contained in the second primer is preferably a sequence complementary to the sequence (C).

本発明の他の実施態様によれば、本発明による変異検出法の工程（ｂ）において、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（Ｂ）に含まれるように設計された人工ミスマッチを導入したプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）は、前記配列（Ｂ）と同一の配列とすることが好ましい。  According to another embodiment of the present invention, in the step (b) of the mutation detection method according to the present invention, a primer into which an artificial mismatch designed so that the nucleotide residue related to the mutation is included in the sequence (B) is introduced. A set is prepared. In this embodiment, when a nucleic acid sample contains a target nucleic acid sequence, it is included in the primer after the first primer is annealed to the sequence (A) and the extension reaction is performed in the nucleic acid amplification reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence that is different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, the formation of the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction becomes difficult, which is shown in FIG. The mechanism of action is disturbed and no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (B ′) contained in the first primer is preferably the same sequence as the sequence (B).

上述の配列（Ｂ）における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図１に示す作用機序において、配列（Ｂ’）が配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。しかし、このステム−ループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（Ｂ’）と配列（Ｂｃ）部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、鋳型上の配列（Ａ）とプライマー中の配列（Ａｃ’）とのハイブリダイゼーションの方が優位となり、配列（Ａ）の部分が一本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのため、図１に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。  The detection of the mutation in the above-mentioned sequence (B) will be described in more detail. In the mechanism of action shown in FIG. 1, the phenomenon that the sequence (B ′) hybridizes to the sequence (Bc) occurs due to the presence of complementary regions on the same strand. In general, when a double-stranded nucleic acid is dissociated into a single strand, partial dissociation starts from its terminal or other relatively unstable part. In the double-stranded nucleic acid produced by the extension reaction with the first primer, the base pair of the terminal portion is in an equilibrium state of dissociation and binding at a relatively high temperature, and the double-stranded nucleic acid is maintained as a whole. In such a state, when a sequence complementary to the dissociated portion of the terminal is present on the same strand, a stem-loop structure can be formed as a metastable state. However, this stem-loop structure does not exist stably, especially when there are non-complementary nucleotides between the sequence (B ′) and the sequence (Bc) part forming the stem. Or the stem is not formed at all. In this case, hybridization between the sequence (A) on the template and the sequence (Ac ′) in the primer is superior, and the portion of the sequence (A) does not become a single strand. Primer cannot be annealed. Therefore, it is extremely difficult to cause the continuous reaction shown in FIG.

被検核酸を含む核酸試料は、被検体、例えばヒトまたは非ヒト動物から取得することができる。その場合には、該被検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。  A nucleic acid sample containing a test nucleic acid can be obtained from a subject, such as a human or non-human animal. In that case, the nucleic acid can be extracted from a sample such as a desired tissue, organ and cell from the subject by a method known in the art, and if necessary, the size of the nucleic acid fragment can be extracted after the extraction. In addition, conditions such as purification purity can be adjusted to an appropriate state. Thereafter, the test nucleic acid in the nucleic acid sample may be further amplified by performing an amplification reaction by a general polymerase chain reaction (PCR) or the like.

被検核酸および対照核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明において用いられる「二本鎖核酸」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージまたはプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。  The test nucleic acid and the control nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. The term “double-stranded nucleic acid” used in the present invention means any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, and DNA / RNA. The double-stranded nucleic acid may be used as a nucleic acid sample as it is, or may be amplified with a vector such as a phage or a plasmid.

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による変異検出法における核酸増幅反応は、競合オリゴヌクレオチドやミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。人工ミスマッチを一部、もしくは全てのプライマーに導入したものから、本来目的としない増幅が生じた場合に、１塩基もしくは２塩基以上のミスマッチ塩基部分が形成され、特に１塩基より２塩基以上のミスマッチ塩基部分にミスマッチ結合タンパクが強固に結合することにより、変異をより正確に検出することが可能になる。  According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification reaction in the mutation detection method according to the present invention is carried out in the presence of a competitive oligonucleotide or a mismatch recognition protein, which makes it possible to detect mutations more accurately. Become. When an unintended amplification occurs from the introduction of an artificial mismatch into a part or all of the primers, a mismatch base part of 1 base or 2 bases or more is formed, especially a mismatch of 2 bases or more from 1 base. Mutation can be detected more accurately by strongly binding the mismatch binding protein to the base moiety.

ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質、ＭｕｔＭタンパク質、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合したＭｕｔＳタンパク質などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。  It is already known that bacteria, yeast, and the like have a mechanism for repairing a base pair that cannot be partially matched (mismatched) in a double strand of DNA. This repair is performed by a protein called “mismatch binding protein” (also referred to as “mismatch recognition protein”). Various repairs such as MutS protein, MutM protein, MutS protein bound to GFP (Green Fluorescence Protein), etc. The use of mismatch binding proteins has been reported. Furthermore, in recent years, genetic diagnostic methods for detecting mismatches using mismatch binding proteins have been developed. As a method for detecting polymorphisms and mutations at specific nucleotides in nucleic acids, for example, a control nucleic acid having no mutation is hybridized with a test nucleic acid suspected of having the mutation, and a mismatch recognition protein is added thereto. A method of detecting a mismatch by introducing it is known.

本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。  In the present invention, “mismatch” means that a pair of base pairs selected from adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T) (uracil (U) in the case of RNA) is normal. It means that it is not a correct base pair (a combination of A and T, or a combination of G and C). Mismatches include not only one mismatch, but also multiple consecutive mismatches, mismatches caused by insertion and / or deletion of one or more bases, and combinations thereof.

本発明による変異検出法においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。本発明による変異検出法では、核酸試料に含まれる被検核酸が、変異部位において標的核酸配列と異なるヌクレオチドを有する場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）もしくは第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）の被検核酸へのハイブリダイゼーションが妨げられるか、または第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）によるステム−ループ構造の形成が妨げられるため、増幅産物が得られないか、または増幅産物の量が減少することとなる。しかしながら、これらのハイブリダイゼーションまたはステム−ループ構造の形成が完全には妨げられない場合もあり、その場合には、これらの配列において少量のヘテロ二本鎖構造が生ずる。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。  Also in the mutation detection method according to the present invention, the specificity (accuracy) can be improved by using these mismatch binding proteins. In the mutation detection method according to the present invention, when the test nucleic acid contained in the nucleic acid sample has a nucleotide different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, the sequence (Ac ′) contained in the first primer or the second primer Since the hybridization of the sequence (Cc ′) contained in the nucleic acid to the test nucleic acid is prevented or the formation of the stem-loop structure by the sequence (B ′) contained in the first primer is prevented, an amplification product is obtained. Or the amount of amplification product will be reduced. However, the formation of these hybridizations or stem-loop structures may not be completely prevented, in which case a small amount of heteroduplex structure results in these sequences. In the present invention, the “heteroduplex structure” means a duplex structure that is substantially a complementary duplex structure but includes a non-complementary region by having one or more mismatches. To do. Such a heteroduplex structure results in a false amplification product that would not otherwise be produced. Therefore, if a mismatch binding protein is added to the reaction solution used for the nucleic acid amplification reaction, the mismatch binding protein binds to the heteroduplex structure as described above, and the subsequent amplification reaction is hindered. Therefore, by using a mismatch binding protein, it is possible to prevent generation of an erroneous amplification product.

本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、Ｗ．Ｐ．ＤｅｎｇとＪ．Ａ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆの方法、Ｋ．Ｌ．ＭａｋａｍａｙｅとＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎの方法などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌ＸＬ１−Ｒｅｄ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。  The mismatch binding protein used in the present invention may be any protein that recognizes a mismatch in a double-stranded nucleic acid and can bind to the mismatch site, such as any known to those skilled in the art. Also good. In addition, in the mismatch binding protein used in the present invention, one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of the wild-type protein as long as the mismatch in the double-stranded nucleic acid can be recognized. Alternatively, it may be a protein (variant) having an amino acid sequence. Such mutants may occur in nature but can also be made artificially. Many methods are known for introducing amino acid mutations into proteins. For example, W. P. Deng and J.A. A. Nickoloff's method, K.M. L. Makamaye and F.M. The Eckstein method is known, and random mutagenesis methods include a method using Escherichia coli XL1-Red strain (Stratagene) deficient in the basic repair system, and a chemical base using sodium nitrite or the like. Methods for modification are known. Many such mismatch binding proteins are known, such as MutM, MutS and their analogs. The mismatch binding protein used in the present invention is preferably derived from MutS, MutH, MutL, or yeast, more preferably MutS, MutH, or MutL.

ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。  It is known that mismatch binding proteins may also bind to single-stranded nucleic acids, and binding of such mismatch binding proteins to single-stranded nucleic acids is inhibited by single-stranded binding proteins. Therefore, when a mismatch binding protein is used in the mutation detection method according to the present invention, it is preferable to use a single chain binding protein in combination. Mismatch binding proteins may also bind to double-stranded nucleic acids that do not contain mismatches. Such misbinding of mismatch binding proteins must be activated using an activator in advance. It is known to be inhibited by Therefore, when using a mismatch binding protein in the mutation detection method according to the present invention, it is preferable to use one activated in advance by an activator.

一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。  The single stranded binding protein (SSB) used to inhibit the binding of the mismatch binding protein to the single stranded nucleic acid can be any SSB known in the art. Preferred SSBs include single chain binding proteins from Escherichia coli, Drosophila, and Xenopus, and the gene 32 protein from T4 bacteriophage, and their equivalents from other species. Examples of mismatch binding proteins used in this case include MutS, MutH, MutL, HexA, MSH1-6, Rep3, RNaseA, uracil-DNA glycosidase, T4 endonuclease VII, resolvase, etc., preferably MutS, MSH2 or MSH6, or a mixture of two or more of these, more preferably MutS.

ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン５’−二リン酸）、ＡＴＰ−γ−Ｓ（アデノシン５’−Ｏ−（３−チオ三リン酸））、ＡＭＰ−ＰＮＰ（アデノシン５’−［β，γ−イミド］三リン酸）などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。  The activator for activating the mismatch binding protein can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited. However, preferably, ATP (adenosine 5′-triphosphate), ADP (adenosine 5 ′) -Diphosphate), ATP-γ-S (adenosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)), AMP-PNP (adenosine 5 ′-[β, γ-imido] triphosphate), etc. Or one of the nucleotides that can bind to the mismatch binding protein. Activation of the mismatch binding protein can be performed by incubating the mismatch binding protein and the active agent at room temperature for several seconds to several minutes.

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による変異検出法は、遺伝子病の罹病が疑われる被検体において特定の遺伝子が変異を有するか否かを調べるため、患者由来の遺伝子と健常者の遺伝子が同一の塩基配列を有するか否かを調べるために利用することができる。本発明による変異検出法においては、被検遺伝子のいかなる位置に存在する変異をも検出することが可能である。  According to a preferred embodiment of the present invention, the mutation detection method according to the present invention examines whether a specific gene has a mutation in a subject suspected of having a genetic disease. It can be used to examine whether a gene has the same base sequence. In the mutation detection method according to the present invention, it is possible to detect a mutation present at any position of a test gene.

さらに、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応によれば、核酸試料中の核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能である。この目的のためには、欠失または挿入に係る部位が、配列（Ａ）、配列（Ｂ）もしくは配列（Ｃ）に含まれるか、または配列（Ａ）と配列（Ｂ）との間もしくは配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間に配置されるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能となる。従って、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）本発明によるプライマーセットであって、欠失または挿入に係る配列を含むか、または該配列を含まない核酸配列を標的核酸配列とし、欠失または挿入に係る部位が、配列（Ａ）、配列（Ｂ）もしくは配列（Ｃ）に含まれるか、または配列（Ａ）と配列（Ｂ）との間もしくは配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットと競合オリゴヌクレオチドを用意する工程、および（ｃ）前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットに人工ミスマッチを含むものによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。  Furthermore, according to the nucleic acid amplification reaction using the primer set according to the present invention, it is possible to determine the presence or absence of sequence deletion or insertion in the nucleic acid sequence in the nucleic acid sample. For this purpose, the site for deletion or insertion is included in sequence (A), sequence (B) or sequence (C), or between or between sequence (A) and sequence (B). Primer set can be designed to be placed between (A) and sequence (C), thereby determining the presence or absence of sequence deletion or insertion by confirming the presence or absence of amplification products Is possible. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for determining the presence or absence of sequence deletion or insertion in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample, comprising: (a) a step of preparing a nucleic acid sample; and (b) a primer set according to the present invention. A nucleic acid sequence containing a sequence related to deletion or insertion, or a nucleic acid sequence not containing the sequence as a target nucleic acid sequence, and the site related to deletion or insertion is sequence (A), sequence (B) or sequence (C A primer set and a competing oligonucleotide designed to be contained between or between sequence (A) and sequence (B) or between sequence (A) and sequence (C) And (c) performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set containing an artificial mismatch in the presence of the nucleic acid sample.

本発明による欠失／挿入判定法では、目的とする欠失または挿入に係る配列を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットの中に、人工ミスマッチを導入したプライマーを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が欠失または挿入に係る配列の存在を示し、増幅産物の不在または減少が欠失または挿入に係る配列の不在を示す。一方で、目的とする欠失または挿入に係る配列を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が欠失または挿入に係る配列の不在を示し、増幅産物の不在または減少が欠失または挿入に係る配列の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。  In the deletion / insertion determination method according to the present invention, when a primer having an artificial mismatch is used in a primer set designed with a nucleic acid sequence having a target deletion or insertion sequence as a target nucleic acid sequence, The presence of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction indicates the presence of the sequence related to the deletion or insertion, and the absence or reduction of the amplification product indicates the absence of the sequence related to the deletion or insertion. On the other hand, when using a primer set designed with a target nucleic acid sequence that does not have a sequence related to the desired deletion or insertion, the presence of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction is considered a deletion or insertion. The absence of such sequences is indicated, and the absence or reduction of the amplification product indicates the presence of the sequence associated with the deletion or insertion. Here, “decrease in amplification product” means that the amount of amplification product obtained is reduced compared to the amount of amplification product obtained when the target nucleic acid sequence is present in the nucleic acid sample. To do.

本発明の一つの実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ａｃ’）は、前記配列（Ａ）に相補的な配列とすることが好ましい。  According to one embodiment of the present invention, in the step (b) of the deletion / insertion determination method according to the present invention, a primer set designed so that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (A). Is prepared. In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the first primer anneals to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. When the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, it becomes difficult for the first primer to anneal to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction. No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (Ac ′) contained in the first primer is preferably a sequence complementary to the sequence (A).

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ｃ）に含まれるように設計されたプライマーセットに一部に人工ミスマッチが導入されたものが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（Ｃ）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Ｃｃ’）は、前記配列（Ｃ）に相補的な配列とすることが好ましい。  According to another embodiment of the present invention, in the step (b) of the deletion / insertion determination method according to the present invention, a primer set designed so that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (C). Are prepared with some artificial mismatches introduced. In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the second primer anneals to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. When the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, it becomes difficult for the second primer to anneal to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction. No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (Cc ′) contained in the second primer is preferably a sequence complementary to the sequence (C).

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。その詳細は、本発明による変異検出法について上述したとおりである。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）は、前記配列（Ｂ）と同一の配列とすることが好ましい。  According to another embodiment of the present invention, in the step (b) of the deletion / insertion determination method according to the present invention, a primer set designed so that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (B). Is prepared. In this embodiment, when a nucleic acid sample contains a target nucleic acid sequence, it is included in the primer after the first primer is annealed to the sequence (A) and the extension reaction is performed in the nucleic acid amplification reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, the formation of the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction becomes difficult. The indicated mechanism of action is hindered and no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The details are as described above for the mutation detection method according to the present invention. The sequence (B ′) contained in the first primer is preferably the same sequence as the sequence (B).

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）と伸長鎖上の配列（Ｂｃ）とが適切な距離を維持していないため、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となる。従って、この場合には、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。  According to a preferred embodiment of the present invention, in the step (b) of the deletion / insertion determination method according to the present invention, a site related to deletion or insertion is arranged between the sequence (A) and the sequence (B). A primer set designed to be prepared is prepared. In this embodiment, when a nucleic acid sample contains a target nucleic acid sequence, it is included in the primer after the first primer is annealed to the sequence (A) and the extension reaction is performed in the nucleic acid amplification reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, the sequence (B ′) contained in the first primer and the sequence on the extended strand (Bc) ) Does not maintain an appropriate distance, it becomes difficult to form the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction. Therefore, in this case, the mechanism of action shown in FIG. 1 is hindered, and no amplification product is obtained, or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.

本発明の他の実施態様によれば、本発明による欠失／挿入判定法の工程（ｂ）において、欠失または挿入に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｃ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが用意される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（Ａ）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における長い配列の挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれている場合には、核酸増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失により配列（Ｂ）の一部または全部が失われている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（Ｂ’）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（Ａ）と配列（Ｃ）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失による配列（Ｂ）の部分的欠失が生じない場合にも、核酸増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。  According to another embodiment of the present invention, in the step (b) of the deletion / insertion determination method according to the present invention, a site related to deletion or insertion is between the sequence (A) and the sequence (C). Primer sets designed to be placed are provided. In this embodiment, when a nucleic acid sample contains a target nucleic acid sequence, it is included in the primer after the first primer is annealed to the sequence (A) and the extension reaction is performed in the nucleic acid amplification reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, an amplification product is not obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. For example, when a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to insertion of a long sequence between the sequence (A) and the sequence (C), the speed (efficiency) of nucleic acid amplification is remarkably high. As a result, no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. Further, a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to the deletion of the sequence between the sequence (A) and the sequence (C), and a part of the sequence (B) is caused by this deletion. Alternatively, when all of them are lost, since the sequence (B ′) contained in the first primer cannot hybridize on the extended strand, it becomes impossible or difficult to form a stem-loop structure. Therefore, the mechanism of action shown in FIG. 1 is hindered, and no amplification product is obtained, or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. Furthermore, a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to the deletion of the sequence between the sequence (A) and the sequence (C), and a partial sequence (B) is caused by this deletion. Even when no deletion occurs, the speed (efficiency) of nucleic acid amplification is reduced, so that no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.

本発明による欠失／挿入判定法では、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれをも標的核酸配列とすることができる。ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、スプライスドＲＮＡ、アンスプライスドＲＮＡ等が挙げられ、また、核、細胞質などに存在するＲＮＡ、感染したウイルス、細菌などに由来するＲＮＡ等、生体から取得することのできる全ての種類のＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡとしては、天然に存在するＤＮＡのみならず、人工的に組み換えられたＤＮＡ配列を挙げることもできる。現在、様々な遺伝子または核酸断片の配列を組み換えることが可能となっており、本発明による欠失／挿入判定法によれば、天然には存在しない組換え配列を検出することも可能である。  In the deletion / insertion determination method according to the present invention, either DNA or RNA can be used as a target nucleic acid sequence. Examples of RNA include mRNA, spliced RNA, unspliced RNA and the like, and RNA obtained from the living body such as RNA present in the nucleus, cytoplasm, etc., RNA derived from infected virus, bacteria, etc. All types of RNA that can be mentioned. Examples of DNA include not only naturally-occurring DNA but also artificially recombined DNA sequences. At present, it is possible to recombine sequences of various genes or nucleic acid fragments, and the deletion / insertion determination method according to the present invention can also detect a non-naturally occurring recombinant sequence. .

本発明の好ましい実施態様によれば、上記の欠失または挿入に係る配列は、真核生物のゲノム上の遺伝子に含まれるイントロン配列とされる。これにより、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡをともに含む核酸試料を用いた場合に、標的とする遺伝子の配列中にイントロンが存在するか否かを判定することができ、その結果、イントロンが存在しないと判定された場合には、標的とする遺伝子のｍＲＮＡが存在するものと、すなわち、標的とする遺伝子が発現しているものと判定することができる。本発明のさらに好ましい実施態様によれば、前記標的核酸配列はｍＲＮＡとされる。  According to a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned deletion or insertion sequence is an intron sequence contained in a gene on the eukaryotic genome. As a result, when a nucleic acid sample containing both mRNA and genomic DNA is used, it can be determined whether or not an intron is present in the sequence of the target gene. As a result, it is determined that there is no intron. If the target gene is present, it can be determined that the mRNA of the target gene exists, that is, the target gene is expressed. According to a further preferred embodiment of the present invention, the target nucleic acid sequence is mRNA.

標的とする遺伝子のｍＲＮＡ（イントロンの欠失を有する）を標的核酸配列とし、イントロン配列の欠失に係る部位が前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）との間に配置されるように設計されたプライマーセットを用いる実施態様について詳述する。この実施態様では、まず、第一のプライマーの３’末端に存在する配列（Ａｃ’）が鋳型にアニールして伸長反応が起こり、さらに、該プライマーからの伸長反応産物が目的の領域を合成していた場合にのみ、該プライマーの５’末端に存在する配列（Ｂ’）が自己伸長産物上の隣のエクソンに対応する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズすることが可能となる。すなわち、伸長反応産物が二つのエクソンを順番通りに連結させた配列を有するｍＲＮＡの目的領域を合成したときにはじめて図１に示されるステム−ループ構造が形成され、一本鎖となった鋳型上の配列（Ａ）に新たな第一のプライマーがアニーリングすることが可能となる。この第一のプライマーの５’末端部分によるステム−ループ構造の形成は、上述のように、鋳型上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）が適切な間隔で存在するときに効率良く繰り返されるため、イントロン配列を含まないｍＲＮＡを鋳型にする時のみ増幅が起き、イントロン配列を含むようなゲノムＤＮＡでは増幅は起きないこととなる。この反応を等温で繰り返すことによって正確に目的核酸の増幅を行うことができ、また、このステム−ループ構造の形成がサイクルごとに正確に繰り返されるため、目的核酸のみを正確に増幅することが可能となる。また、ＰＣＲ法などでは、多くの場合、非特異的な増幅が起こり、目的とするｍＲＮＡのみを増幅し、これを定量することは非常に困難であったが、本発明による欠失／挿入判定法は非常に特異性が高いために、非特異増幅を起こすことなく、標的とするｍＲＮＡのみを特異的に増幅することができるので、その定量性も向上する。また、この原理により、煩雑で時間のかかるＤＮａＳｅ処理などを行い、検体中のＤＮＡを壊してＲＮＡを獲得する工程を省略することが可能となり、ｍＲＮＡの自然崩壊を減らすことができ、より迅速な定性または定量の診断が行えるようになる。  The target gene mRNA (having an intron deletion) is used as a target nucleic acid sequence, and the site related to the deletion of the intron sequence is arranged between the sequence (A) and the sequence (B). An embodiment using the prepared primer set will be described in detail. In this embodiment, first, the sequence (Ac ′) present at the 3 ′ end of the first primer anneals to the template to cause an extension reaction, and the extension reaction product from the primer synthesizes the target region. Only in the case where the sequence is present, the sequence (B ′) present at the 5 ′ end of the primer can hybridize to the sequence (Bc) corresponding to the adjacent exon on the self-extension product. That is, the stem-loop structure shown in FIG. 1 is formed for the first time when an extension reaction product synthesizes a target region of mRNA having a sequence in which two exons are linked in order. A new first primer can be annealed to the sequence (A). As described above, the formation of the stem-loop structure by the 5 ′ end portion of the first primer is efficiently repeated when the sequences (A) and (B) on the template are present at appropriate intervals. Amplification occurs only when mRNA containing no intron sequence is used as a template, and no amplification occurs with genomic DNA containing an intron sequence. By repeating this reaction isothermally, the target nucleic acid can be accurately amplified, and since the formation of the stem-loop structure is repeated accurately every cycle, only the target nucleic acid can be accurately amplified. It becomes. In addition, in the PCR method and the like, in many cases, non-specific amplification occurs, and it is very difficult to amplify only the target mRNA and quantify this, but the deletion / insertion determination according to the present invention Since the method is very specific, only the target mRNA can be specifically amplified without causing non-specific amplification, and the quantitativeness thereof is also improved. In addition, this principle makes it possible to perform complicated and time-consuming DNaSe treatment and the like, thereby eliminating the step of acquiring RNA by breaking DNA in the specimen, reducing the natural decay of mRNA, and more quickly. Qualitative or quantitative diagnosis can be performed.

本発明による核酸増幅法、変異検出法、または欠失／挿入判定法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による、人工ミスマッチを導入した競合オリゴヌクレオチド、もしくは、人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットを含んでなる。また、本発明による核酸増幅法、変異検出法、または欠失／挿入判定法は、本発明によるプライマーセット以外のプライマーを必要としないという利点を有する。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるキットは、本発明によるプライマーセット以外のプライマー成分を含まないものとされる。さらに、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが固相担体と結合可能な部位を含む場合には、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでなることが好ましい。また、核酸増幅反応に用いられる基質が固相担体と結合可能な部位を含む場合にも、本発明によるキットは該固相担体をさらに含んでなることが好ましい。本発明によるキットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。  In order to carry out the nucleic acid amplification method, mutation detection method, or deletion / insertion determination method according to the present invention, necessary reagents can be put together into a kit. Therefore, the kit according to the present invention comprises a competitive oligonucleotide into which an artificial mismatch is introduced or a primer set into which an artificial mismatch is partially introduced according to the present invention. In addition, the nucleic acid amplification method, mutation detection method, or deletion / insertion determination method according to the present invention has an advantage that a primer other than the primer set according to the present invention is not required. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the kit according to the present invention does not contain primer components other than the primer set according to the present invention. Furthermore, when at least one primer contained in the primer set according to the present invention includes a site capable of binding to a solid phase carrier, the kit according to the present invention preferably further comprises the solid phase carrier. In addition, when the substrate used in the nucleic acid amplification reaction includes a site capable of binding to the solid phase carrier, the kit according to the present invention preferably further includes the solid phase carrier. The kit according to the present invention may further contain the above-mentioned reagents such as DNA polymerase, dNTP, buffer, reaction vessel, instructions and the like.

本発明の好ましい実施態様によれば、前記キットは、本発明による競合オリゴヌクレオチドと人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットおよび核酸増幅反応に必要とされる他の試薬類を含有する反応容器を含んでなるものとされる。他の試薬類としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類が挙げられる。このようなキットを用いることにより、前記反応容器に鋳型核酸または核酸試料を添加し、該反応容器を一定の温度に保つだけで核酸増幅反応を行なうことが可能となる。さらには、プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが固相担体を含んでいる場合には、増幅産物が生成すると同時に該固相担体が凝集するため、透明または半透明の反応容器を用いることによりこの凝集を反応容器の外部から観察することが可能である。従って、この場合には、反応容器の開封をすることなく増幅産物を検出することができるため、操作が簡便であり、さらには他のサンプルとの間での核酸増幅物のコンタミネーションを防止することもできる。  According to a preferred embodiment of the present invention, the kit comprises a reaction vessel containing a competitive oligonucleotide according to the present invention and a primer set partially introduced with an artificial mismatch and other reagents required for nucleic acid amplification reaction. It is supposed to comprise. Examples of other reagents include the above-described reagents such as DNA polymerase, dNTP, and buffer solution. By using such a kit, a nucleic acid amplification reaction can be carried out simply by adding a template nucleic acid or a nucleic acid sample to the reaction vessel and keeping the reaction vessel at a constant temperature. Furthermore, when at least one kind of primer included in the primer set contains a solid phase carrier, an amplification product is generated and the solid phase carrier aggregates at the same time, so use a transparent or translucent reaction vessel. Thus, this aggregation can be observed from the outside of the reaction vessel. Therefore, in this case, since the amplification product can be detected without opening the reaction container, the operation is simple, and further, contamination of the nucleic acid amplification product with other samples is prevented. You can also

本発明の第二の態様によれば、競合オリゴヌクレオチドもしくは人工ミスマッチを一部に導入したプライマーとミスマッチ結合タンパク質などのミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、鋳型における変異の存在または不存在のいずれかによって鋳型とのミスマッチを生じる核酸試薬を用いた核酸増幅反応を行なうことにより、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法が提供される。この態様において用いられる「変異」という用語は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および挿入のいずれをも包含する。  According to the second aspect of the present invention, the presence or absence of a mutation in the template is present in the presence of a competitive oligonucleotide or a primer partially introduced with an artificial mismatch and a substance having mismatch discrimination ability such as a mismatch binding protein. There is provided a method for determining the presence or absence of a mutation in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample by performing a nucleic acid amplification reaction using a nucleic acid reagent that causes a mismatch with a template. The term “mutation” as used in this embodiment encompasses any one or more nucleotide substitutions, deletions and insertions.

本明細書において「ミスマッチ識別能を有する物質」とは、二本鎖核酸中にミスマッチが含まれている場合に、そのミスマッチ部位に結合するか、またはこの部位を切断する物質をいう。プライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅反応において、鋳型における標的核酸配列上にミスマッチ識別能を有する物質が結合した二本鎖部分が存在すると、プライマーからの伸長鎖がその部分に到達してもその二本鎖構造が解消されないため、プライマー伸長反応がそこで停止し、従って、増幅産物が得られない。また、核酸増幅反応において、鋳型における標的核酸配列が切断された場合にも、増幅産物が得られない。ミスマッチ識別能を有する物質は、好ましくはミスマッチ部分に結合する物質とされ、これは有機化合物、無機化合物もしくはタンパク質、またはこれらの複合体であってもよいが、特に好ましくは、ミスマッチ部分に結合するミスマッチ結合タンパク質とされる。ミスマッチ結合タンパク質の詳細については上述したとおりであるが、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。また、ミスマッチ結合タンパク質は、その起源生物によって耐熱性に差が見られる。当業者であれば、核酸増幅反応において設定される温度に応じて適切なミスマッチ結合タンパク質を選択することができる。例えば、好温菌由来のＭｕｔＳは、本発明において好適に用いることができる。  In the present specification, the “substance having mismatch discrimination ability” refers to a substance that binds to or cleaves a mismatch site when a mismatch is included in a double-stranded nucleic acid. In a nucleic acid amplification reaction using a primer and a DNA polymerase, if there is a double-stranded part to which a substance having mismatch discrimination ability is bound on the target nucleic acid sequence in the template, even if the extended strand from the primer reaches that part, Since the strand structure is not resolved, the primer extension reaction stops there and therefore no amplification product is obtained. Further, in the nucleic acid amplification reaction, even when the target nucleic acid sequence in the template is cleaved, an amplification product cannot be obtained. The substance having mismatch discriminating ability is preferably a substance that binds to the mismatch moiety, which may be an organic compound, an inorganic compound or a protein, or a complex thereof, but particularly preferably binds to the mismatch moiety. Mismatch binding protein. The details of the mismatch binding protein are as described above, but preferably MutS, MSH2 or MSH6, or a mixture of two or more thereof, more preferably MutS. In addition, mismatch-binding proteins have a difference in heat resistance depending on their origin. A person skilled in the art can select an appropriate mismatch binding protein according to the temperature set in the nucleic acid amplification reaction. For example, MutS derived from thermophilic bacteria can be suitably used in the present invention.

上記の核酸増幅反応は、当技術分野において公知のいずれの方法によるものであってもよく、また、本発明による核酸増幅法によるものであってもよい。特に、等温で行なわれる核酸増幅反応が好適に用いられ、このような核酸増幅反応は、上述の本発明による核酸増幅法のみならず、等温下での核酸増幅法として知られる方法、例えば、ＳＤＡ法、改良ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などに従って行なうことができる。  The nucleic acid amplification reaction may be performed by any method known in the art, or may be performed by the nucleic acid amplification method according to the present invention. In particular, a nucleic acid amplification reaction performed isothermally is preferably used. Such a nucleic acid amplification reaction is not limited to the nucleic acid amplification method according to the present invention described above, but also a method known as an isothermal nucleic acid amplification method, for example, SDA. It can be carried out according to the method, modified SDA method, NASBA method, LAMP method, ICAN method and the like.

一つの実施態様によれば、本発明の第二の態様による変異検出法は、以下の工程：
（ａ）核酸試料を用意する工程；
（ｂ）変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものであり、さらに人工ミスマッチを一部に導入した競合オリゴヌクレオチドまたは、人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットを用意する工程；および
（ｃ）ミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。According to one embodiment, the mutation detection method according to the second aspect of the present invention comprises the following steps:
(A) preparing a nucleic acid sample;
(B) A primer set capable of amplifying a target nucleic acid sequence including a site related to mutation, wherein at least one primer contained in the primer set is hybridized to a nucleic acid sequence in the nucleic acid sample or a complementary sequence thereof Sometimes a competing oligonucleotide designed to cause one or more mismatches with the nucleic acid sequence or its complementary sequence due to the presence or absence of the mutation, and further introducing an artificial mismatch in part Preparing a primer set in which an artificial mismatch is partially introduced; and (c) performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set using the nucleic acid sample as a template in the presence of a substance having mismatch discrimination ability. It is what.

標的核酸配列を増幅しうる上記の人工ミスマッチを一部に導入した競合オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットは、利用する核酸増幅法に応じて適宜設計することができる。特に、人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットは標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであることが好ましく、その場合には、核酸増幅反応は等温で行なうことができる。  A primer set including a competitive oligonucleotide into which the above-described artificial mismatch that can amplify a target nucleic acid sequence is introduced can be appropriately designed according to the nucleic acid amplification method to be used. In particular, the primer set in which an artificial mismatch is partially introduced is preferably capable of amplifying the target nucleic acid sequence under isothermal conditions, and in that case, the nucleic acid amplification reaction can be performed isothermally.

上記の１以上のミスマッチは、１塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。また、該ミスマッチの数の上限は、ハイブリダイズすべき２本の核酸が二本鎖の状態を維持しうる程度の数であればよく、従って、ハイブリダイゼーションにより対合するヌクレオチドの数によって異なるが、好ましくは５塩基、より好ましくは３塩基、さらに好ましくは２塩基とされる。  The one or more mismatches can be a single base mismatch, a plurality of consecutive mismatches, or a plurality of non-consecutive mismatches. In addition, the upper limit of the number of mismatches may be any number that allows the two nucleic acids to be hybridized to maintain a double-stranded state, and thus varies depending on the number of nucleotides paired by hybridization. , Preferably 5 bases, more preferably 3 bases, still more preferably 2 bases.

変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記の競合オリゴヌクレオチドや人工ミスマッチを一部に導入したプライマーは、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記プライマーを設計すればよい。その際、前記プライマーは、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。  The above-mentioned competing oligonucleotides that cause mismatches due to the presence or absence of mutations or primers introduced with artificial mismatches in part include a target nucleic acid sequence having a mutation to be detected and a target nucleic acid sequence not having the mutation. By comparing, those skilled in the art can design appropriately. That is, the primer may be designed so as to hybridize to a region containing nucleotides different between these two target nucleic acid sequences. In this case, if the primer is designed to include a sequence complementary to the target nucleic acid sequence having a mutation, it will cause a mismatch due to the absence of the mutation, while complementary to the target nucleic acid sequence having no mutation. If it is designed to contain typical sequences, mismatches will be caused by the presence of mutations.

好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーとされる。この第一のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ａ）と前記配列（Ａｃ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。あるいは、この第一のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ｂｃ）と前記配列（Ｂ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することもできる。  According to a preferred embodiment, the first primer included in the primer set is the first primer included in the primer set according to the present invention described above. This first primer can be designed to produce one or more mismatches between the sequence (A) and the sequence (Ac ') depending on the presence or absence of the mutation. Alternatively, the first primer can also be designed to cause one or more mismatches between the sequence (Bc) and the sequence (B ′) due to the presence or absence of the mutation.

他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマーとされる。この第二のプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Ｃ）と前記配列（Ｃｃ’）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。  According to another preferred embodiment, the second primer included in the primer set is the second primer included in the primer set according to the present invention described above. This second primer can be designed to produce one or more mismatches between the sequence (C) and the sequence (Cc ′) depending on the presence or absence of the mutation.

他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれてもよい第三のプライマーをさらに含んでなるものとされる。この第三のプライマーは、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。  According to another preferred embodiment, the primer set further comprises a third primer that may be included in the primer set according to the present invention described above. This third primer, when hybridized to a nucleic acid sequence in the nucleic acid sample or a complementary sequence thereof, causes one or more mismatches with the nucleic acid sequence or the complementary sequence due to the presence or absence of the mutation. Can be designed as

上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。  Other conditions for the nucleic acid amplification reaction can be set in the same manner as in the nucleic acid amplification method according to the present invention. For example, in the nucleic acid amplification reaction, a polymerase having the above-described strand displacement ability is preferably used. Moreover, you may use the above-mentioned melting temperature adjusting agent, the above-mentioned enzyme stabilizer, etc. as needed.

この実施態様による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じる競合オリゴヌクレオチドや人工ミスマッチを一部に導入したプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。  As a result of the mutation detection method according to this embodiment, when an amplification product is obtained using a competing oligonucleotide that causes a mismatch due to the presence of a mutation or a primer into which an artificial mismatch is partially introduced, the mutation is contained in a nucleic acid sample. Can be determined to be absent, and conversely, if an amplification product is not obtained, it can be determined that the mutation is present. On the other hand, if an amplification product is obtained using a primer that causes a mismatch due to the absence of mutation, it can be determined that the mutation is present in the nucleic acid sample. Conversely, no amplification product is obtained. If it is, it can be determined that the mutation does not exist.

この実施態様に従って本発明の第二の態様による変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、該キットは、前記ミスマッチ識別能を有する物質、および前記の競合オリゴヌクレオチドまたは人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットを含んでなる。また、該キットは、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなるものとされる。さらに、該キットは、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。  In order to carry out the mutation detection method according to the second aspect of the present invention according to this embodiment, necessary reagents can be put together into a kit. Therefore, the kit comprises the substance having mismatch discrimination ability and a primer set into which the competitive oligonucleotide or artificial mismatch is partially introduced. The kit preferably further comprises a polymerase having the above-described strand displacement ability. Furthermore, the kit may contain the above-mentioned reagents such as the above-mentioned melting temperature adjusting agent, the above-mentioned enzyme stabilizer, dNTP, buffer, and the like, a reaction vessel, instructions and the like.

他の一つの実施態様によれば、本発明の第二の態様による変異検出法は、以下の工程：
（ａ）核酸試料を用意する工程；
（ｂ）変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットを用意する工程；
（ｃ）標的核酸配列にハイブリダイズする核酸断片であって、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されてなる、核酸断片を用意する工程；および
（ｄ）ミスマッチ識別能を有する物質および前記核酸断片の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。According to another embodiment, the mutation detection method according to the second aspect of the present invention comprises the following steps:
(A) preparing a nucleic acid sample;
(B) preparing a primer set into which an artificial mismatch capable of amplifying a target nucleic acid sequence including a site related to a mutation is partially introduced;
(C) a nucleic acid fragment that hybridizes to a target nucleic acid sequence, and when hybridized to a nucleic acid sequence in the nucleic acid sample or a complementary sequence thereof, the nucleic acid sequence or a complementary sequence thereof, depending on the presence or absence of the mutation Providing a nucleic acid fragment designed to produce one or more mismatches between, and (d) the nucleic acid sample as a template in the presence of a substance having mismatch discrimination ability and the nucleic acid fragment The method includes a step of performing a nucleic acid amplification reaction using a primer set.

上記の１以上のミスマッチは、１塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。また、該ミスマッチの数の上限は、ハイブリダイズすべき２本の核酸が二本鎖の状態を維持しうる程度の数であればよく、従って、ハイブリダイゼーションにより対合するヌクレオチドの数によって異なるが、好ましくは５塩基、より好ましくは３塩基、さらに好ましくは２塩基とされる。  The one or more mismatches can be a single base mismatch, a plurality of consecutive mismatches, or a plurality of non-consecutive mismatches. In addition, the upper limit of the number of mismatches may be any number that allows the two nucleic acids to be hybridized to maintain a double-stranded state, and thus varies depending on the number of nucleotides paired by hybridization. , Preferably 5 bases, more preferably 3 bases, still more preferably 2 bases.

変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記核酸断片は、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記核酸断片を設計すればよい。その際、前記核酸断片は、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。  Those nucleic acid fragments that cause mismatches due to the presence or absence of mutations can be appropriately designed by those skilled in the art by comparing a target nucleic acid sequence having a mutation to be detected with a target nucleic acid sequence not having the mutation. can do. That is, the nucleic acid fragment may be designed so as to hybridize to a region containing nucleotides different between these two target nucleic acid sequences. At this time, if the nucleic acid fragment is designed to include a sequence complementary to the target nucleic acid sequence having a mutation, a mismatch occurs due to the absence of the mutation, while the target nucleic acid sequence having no mutation If it is designed to include a complementary sequence, a mismatch is caused by the presence of the mutation.

また、上記核酸断片は、核酸増幅反応において用いられる温度、例えば、２０℃〜８０℃の範囲の温度において、標的核酸配列にハイブリダイズするものであればよい。該核酸断片の鎖長は特に制限されるものではないが、好ましくは５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドとされる。該核酸断片は、必要に応じて、修飾塩基（天然では存在しない塩基）を含むこともできる。また、該核酸断片は、その一方または両方の末端部において、標識、またはアミノ基などの活性基を含んでいてもよい。  The nucleic acid fragment may be any one that hybridizes to the target nucleic acid sequence at the temperature used in the nucleic acid amplification reaction, for example, at a temperature in the range of 20 ° C to 80 ° C. The chain length of the nucleic acid fragment is not particularly limited, but is preferably 5 to 40 nucleotides, more preferably 15 to 25 nucleotides. The nucleic acid fragment may contain a modified base (a base that does not exist in nature) as necessary. In addition, the nucleic acid fragment may contain a label or an active group such as an amino group at one or both ends.

標的核酸配列を増幅しうる上記の人工ミスマッチを一部に導入したプライマーセットや競合オリゴヌクレオチドは、利用する核酸増幅法に応じて適宜設計することができる。特に、該プライマーセットは標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであることが好ましく、その場合には、核酸増幅反応は等温で行なうことができる。  The primer set and competitive oligonucleotide into which the above-mentioned artificial mismatch capable of amplifying the target nucleic acid sequence is introduced can be appropriately designed according to the nucleic acid amplification method to be used. In particular, the primer set is preferably one that can amplify the target nucleic acid sequence under isothermal conditions. In this case, the nucleic acid amplification reaction can be performed isothermally.

好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーとされる。他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマーとされる。さらに他の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、上述の本発明によるプライマーセットに含まれてもよい第三のプライマーをさらに含んでなるものとされる。  According to a preferred embodiment, the first primer included in the primer set is the first primer included in the primer set according to the present invention described above. According to another preferred embodiment, the second primer included in the primer set is the second primer included in the primer set according to the present invention described above. According to still another preferred embodiment, the primer set further comprises a third primer that may be included in the primer set according to the present invention described above.

上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。  Other conditions for the nucleic acid amplification reaction can be set in the same manner as in the nucleic acid amplification method according to the present invention. For example, in the nucleic acid amplification reaction, a polymerase having the above-described strand displacement ability is preferably used. Moreover, you may use the above-mentioned melting temperature adjusting agent, the above-mentioned enzyme stabilizer, etc. as needed.

この実施態様による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じる核酸断片を用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じる核酸断片を用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。  As a result of performing the mutation detection method according to this embodiment, when an amplification product is obtained using a nucleic acid fragment that causes a mismatch due to the presence of the mutation, it can be determined that the mutation does not exist in the nucleic acid sample, Conversely, if no amplification product is obtained, it can be determined that the mutation is present. On the other hand, when an amplification product is obtained using a nucleic acid fragment that causes a mismatch due to the absence of mutation, it can be determined that the mutation exists in the nucleic acid sample. Conversely, an amplification product is obtained. If not, it can be determined that the mutation does not exist.

この実施態様に従って本発明の第二の態様による変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、該キットは、前記ミスマッチ識別能を有する物質、前記プライマーセット、および前記核酸断片を含んでなる。また、該キットは、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなるものとされる。さらに、該キットは、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。  In order to carry out the mutation detection method according to the second aspect of the present invention according to this embodiment, necessary reagents can be put together into a kit. Accordingly, the kit comprises the substance having mismatch discrimination ability, the primer set, and the nucleic acid fragment. The kit preferably further comprises a polymerase having the above-described strand displacement ability. Furthermore, the kit may contain the above-mentioned reagents such as the above-mentioned melting temperature adjusting agent, the above-mentioned enzyme stabilizer, dNTP, buffer, and the like, a reaction vessel, instructions and the like.

以下に実験実施例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。
Ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ２ ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ（ＤＩ０２）遺伝子のＳＮＰ（２７４Ｔ＞Ｃ）検出における人工ミスマッチの効果
ヒトＤＩ０２の変異型（２７４Ｃ）を増幅するプライマーセットにおいて、人工ミスマッチを含むプライマーと含まないプライマーを用いて増幅反応を行った。ヒトＤＩ０２変異型（２７４Ｃ）を検出するプライマーセットとして、以下のものを用いた。

Figure 2008161164
Experimental examples are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
Effect of artificial mismatch on detection of SNP (274T> C) of human type2 deiodinase (DI02) gene In primer set for amplifying mutant form (274C) of human DI02, primers containing artificial mismatch and primers not containing An amplification reaction was performed. The following were used as a primer set for detecting human DI02 mutant (274C).
Figure 2008161164

核酸試料の調製は以下のように行なった。ヒトＤＩ０２の野生型配列（２７４Ｔ）を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）及びヒトＤＩ０２の変異型配列（２７４Ｃ）を含むプラスミド（濃度６０００コピー／μＬ）を９８℃、３分熱処理後、氷冷したものを核酸試料とした。The nucleic acid sample was prepared as follows. A plasmid containing the wild type sequence (274T) of human DI02 (concentration 6000 copies / μL) and a plasmid containing the mutant sequence of human DI02 (274C) (concentration 6000 copies / μL) were heat-treated at 98 ° C. for 3 minutes, and then cooled on ice. This was used as a nucleic acid sample.

ＳＭＡＰ法による増幅反応は以下のように行なった。反応系の組成（２５μＬ）は以下の通りである。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．６Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ、１０ｍＭ ＫＣ１、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１／１００，０００ｄｉｌｕｔｅｄ ＳＹＢＲＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、２０Ｕ Ａａｃポリメラーゼ、１μＬ核酸試料（反応系あたり６０００コピーとなるように添加）、２．４μＭ ＦＰ−ｍｔ−１もしくは、２．４μＭＦＰ−ｍｔ−２、２．４μＭＴＰ、１．２μＭＢＰを用いて反応を行った。上記の反応組成で６０℃、６０分間反応を行った。反応はＭＸ−３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用い、経時的に蛍光強度を測定しながら行った。The amplification reaction by the SMAP method was performed as follows. The composition of the reaction system (25 μL) is as follows. 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 mM dNTPs, 0.6 M Betaine, 10 mM KC1, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 8 mM MgSO 4 , 0.1% Tween 20, 1 / 100,000 diluted SYBR R Green I, 20U Aac polymerase, 1 μL nucleic acid sample (added to make 6000 copies per reaction system), 2.4 μM FP-mt-1, or 2.4 μMFP-mt-2, 2.4 μMTP, 1.2 μMBP Reaction was performed. The reaction was performed at 60 ° C. for 60 minutes with the above reaction composition. The reaction was performed using MX-3000P (STRATAGENE) while measuring the fluorescence intensity over time.

結果は図６に示した。ヒトＤＩ０２変異型増幅プライマーセットにおいて、人工ミスマッチがないＦＰ−ｍｔ−１を用いた場合、野生型プラスミドと変異型プラスミドで増幅開始時間に差がなく、ＳＮＰの認識が不可能であった（ａ）。一方、人工ミスマッチを導入したＦＰ−ｍｔ−２を用いた場合、野生型プラスミドの増幅開始時間を著しく遅延させ、ＳＮＰの認識が可能であった（ｂ）。The results are shown in FIG. In the human DI02 mutant amplification primer set, when FP-mt-1 having no artificial mismatch was used, there was no difference in amplification start time between the wild type plasmid and the mutant plasmid, and SNP recognition was impossible (a ). On the other hand, when FP-mt-2 into which an artificial mismatch was introduced was used, the amplification start time of the wild-type plasmid was significantly delayed, and SNP recognition was possible (b).

本発明の変異検出方法は、複数の領域における塩基配列が予測されたとおりでなければ一定レベルの増幅生成物を生じることができず、非特異的相補鎖合成を防止することができるため正確かつ感度のよい検出が可能となる。本発明の変異検出方法は、類似した塩基配列の厳密な識別を可能とする。たとえば、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のように相互に類似する塩基配列を含む遺伝子の間で、類似する塩基配列の中に存在するＳＮＰｓを正確に検出できる。本発明は、テーラーメード医療を支える薬剤代謝遺伝子の解析技術としても有用である。薬剤代謝遺伝子は、薬剤に対する感受性を左右する重要な遺伝子で、その活性の違いは薬剤の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子に見出されるわずかな塩基配列の相違に起因しており、ヒトゲノムプロジェクトの成果がもたらす薬剤代謝遺伝子の解析に本発明はかかる高い利用価値を有する。また、ＨＬＡや血小板同種抗原、あるいは病原微生物のタイピングのような、類似する塩基配列を含む複数の遺伝子間の微細な塩基配列の相違の検出にも有用である。さらに、ガン特異的な変異の検出にも応用可能であり、さらには、ガン特有の微量の変異検出においても、本法を用いることで、感度よく、正確に、微量変異を検出できるものと考えられる。Since the mutation detection method of the present invention cannot produce a certain level of amplification product unless the nucleotide sequences in a plurality of regions are predicted, it can prevent synthesis of non-specific complementary strands accurately and accurately. Sensitive detection is possible. The mutation detection method of the present invention enables strict discrimination of similar base sequences. For example, SNPs existing in similar base sequences can be accurately detected between genes containing base sequences similar to each other like human CYP2C9. The present invention is also useful as a technique for analyzing drug metabolism genes that support tailor-made medicine. The drug metabolism gene is an important gene that affects the sensitivity to drugs, and the difference in its activity is due to slight differences in the base sequences found in genes encoding enzymes involved in drug metabolism. The present invention has such a high utility value in the analysis of drug metabolism genes resulting from the results. It is also useful for detecting minute base sequence differences between a plurality of genes containing similar base sequences, such as HLA, platelet alloantigens, or pathogenic microorganism typing. Furthermore, it can be applied to detection of cancer-specific mutations. Furthermore, it is considered that this method can be used to detect minute mutations with high sensitivity and accuracy, even in the detection of minute mutations peculiar to cancer. It is done.

図１は、ＳＭＡＰ法に用いられるプライマーセットを模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数は、これに限定されるものではない。さらに図１はＳＭＡＰ法の核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数ならびに増幅順序などは、これに限定されるものではない。  FIG. 1 is a diagram schematically showing a primer set used in the SMAP method, but the number of primers used is not limited to this. Further, FIG. 1 is a diagram schematically showing the action mechanism of the nucleic acid amplification reaction of the SMAP method, but the number of primers used and the amplification order are not limited thereto. 図２は、ＳＭＡＰ法の核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図であるが、用いるプライマーの本数ならびに増幅順序などは、これに限定されるものではない。  FIG. 2 is a diagram schematically showing the action mechanism of the nucleic acid amplification reaction of the SMAP method, but the number of primers used and the amplification order are not limited thereto. 図３は、等温での核酸増幅反応を利用して行なった時に、遺伝子の一塩基変異の検出におけるミスマッチ結合タンパク質の効果を示す図であるが、１塩基変異のみの検出に限定されるものではない。  FIG. 3 is a diagram showing the effect of mismatch-binding protein in the detection of a single nucleotide mutation in a gene when performed using an isothermal nucleic acid amplification reaction, but is not limited to the detection of only a single nucleotide mutation. Absent. 図４は、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーに人工的な変異核酸を含ませることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止すること示す図であるが、これに限定されるものではない。  FIG. 4 shows a method for detecting a mutation in a gene using an isothermal amplification method. By including an artificially mutated nucleic acid in a primer that can specifically anneal to a non-target base sequence, a complementary strand from the non-target base sequence is shown. Although it is a figure which shows preventing a synthesis | combination, it is not limited to this. 図５は、等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーに人工的な変異核酸を含ませることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止し、もし、さらに誤って増幅した場合に、本法がミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われるため、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止すること示す図であるが、これに限定されるものではない。  FIG. 5 shows a method for detecting a mutation in a gene using an isothermal amplification method. By including an artificially mutated nucleic acid in a primer that can specifically anneal to a non-target base sequence, a complementary strand from the non-target base sequence is shown. This is a diagram showing that the synthesis is prevented in the presence of a mismatch binding protein in the case of further amplification by mistake, so that the synthesis of complementary strands from the non-target base sequence is prevented. It is not limited to.

Claims (7)

等温増幅法を用いた遺伝子の検出方法において、標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該標的塩基配列上からの相補鎖合成の特異性を高めることを特徴とする遺伝子検出方法。  In a method for detecting a gene using an isothermal amplification method, by including an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to a target base sequence, the specificity of complementary strand synthesis from the target base sequence A gene detection method characterized by enhancing sex. 等温増幅法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列に特異的にアニールしうるプライマーまたはオリゴヌクレオチドに人工的な変異核酸を含ませることにより、該非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止することを特徴とする請求項１に記載の方法。  In a method for detecting mutations in a gene using isothermal amplification, complementary strand synthesis from the non-target nucleotide sequence is performed by including an artificially mutated nucleic acid in a primer or oligonucleotide that can specifically anneal to the non-target nucleotide sequence. The method according to claim 1, wherein: 等温増幅法が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。  The method according to claim 1 or 2, wherein the isothermal amplification method is performed in the presence of a mismatch binding protein. 前記の等温増幅法がＳＭＡＰ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the isothermal amplification method is any one of a SMAP method, a LAMP method, a NASBA method, an ICAN method, a TRC method, an SDA method, a TMA method, and an RCA method. 前記のプライマーまたはオリゴヌクレオチドに含まれる人工的な変異核酸が非標的塩基配列における変異部位以外に１塩基から１０塩基のミスマッチを形成する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the artificially mutated nucleic acid contained in the primer or oligonucleotide forms a mismatch of 1 to 10 bases other than the mutation site in the non-target base sequence. 前記のプライマーまたはオリゴヌクレオチドに含まれる人工的な変異核酸が、核酸またはペプチド核酸またはＬＮＡまたは非天然核酸、もしくは、それら２種類以上からなる混合されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。  The artificial mutant nucleic acid contained in the primer or oligonucleotide is a nucleic acid, peptide nucleic acid, LNA or non-natural nucleic acid, or a mixture of two or more of them. 2. The method according to item 1. 検出すべき変異が１塩基多型または点変異または挿入または欠失または繰り返し配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。  The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the mutation to be detected is a single nucleotide polymorphism or a point mutation or an insertion or deletion or a repetitive sequence.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2012503472A (en) * 2008-09-24 2012-02-09 ビオメリュー Method for reducing the dependence of nucleic acid targets on sequence variations in diagnostic hybridization assays
JP2015100332A (en) * 2013-11-27 2015-06-04 東ソー株式会社 Method for detecting nucleic acid

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