JP2022046306A - キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;
(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;
をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法である。
(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;
(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;
である、分子マーカーである。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、キク属植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーであって、下記(a)又は(b)の塩基自体(SNP)か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド:(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、SNPマーカーであり得る。SNPは、DNAの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるDNA多型を意味している。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、SNP(a)を含む連続したポリヌクレオチド(以下、ポリヌクレオチド(a)ともいう)であってもよい。ポリヌクレオチド(a)は、(a1)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、(a2)配列番号1の塩基配列において、63番目の塩基以外の塩基配列に対して、1又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、(a3)配列番号1の塩基配列において、63番目の塩基以外の塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド(a)におけるSNP(a)に相当する塩基がAであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、SNP(a)とSNP(b)との2つのSNP間の領域の連続したポリヌクレオチド(以下、ポリヌクレオチド(c)ともいう)であってもよい。ポリヌクレオチド(c)は、SNP(a)及びSNP(b)のいずれかの部位を含んでいることが好ましい。ポリヌクレオチド(c)は、例えば、抵抗性植物における対応するSNP(a)及びSNP(b)のSNP間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド(c)の塩基配列は、抵抗性植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性関連遺伝子は、上述したいずれかの分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が2cM以内に位置している。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述のキク白さび病抵抗性関連遺伝子を有し、後述する製造方法によって得られる植物である。キク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したキク白さび病抵抗性関連遺伝子領域を有し、キク白さび病に対して抵抗性を示す植物である。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、キク属(Chrysanthemum属)の植物において、下記(a)又は(b)の塩基自体(SNP)か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド:(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む。
本発明の一形態に係る製造方法は、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する方法であって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、上述したキク白さび病抵抗性を判定する方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程とを含む。
(植物材料及びDNA抽出)
F1母集団を、感受性“NARO_cgs0302033”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種由来とした。合計128個のF1苗を、市販の園芸用の土(クレハ園芸培土、クレハ化学製)を含むプラスチックポット(内径12cm、ポット1個あたり1苗)に植え、18℃~25℃、自然日長+6時間の暗期中断条件の温室内で、採穂用株として維持した。DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen製)を用いて、茎頂(生重量30mg)からゲノムDNAを抽出した。
キク白さび病菌(Puccinia horiana)を含む罹病葉を、2017年に農研機構において育成した“フローラル優香”植物から回収し、接種材料源として用いた。単一の冬胞子堆を用いて、無病の“秀芳の力”植物体に接種し、その後継代維持した。
dd-RAD-Seqライブラリーを生成するために、PstI及びMspIの2つの制限酵素により、F1集団及びその親系統からのゲノムDNAを消化した。ライブラリーのヌクレオチド配列を、HiSeq4000 (Illumina)プラットフォームにおいて決定した。
リード及びシンプレックスSNP決定のデータ処理を、以下に要約するように行ったdd-RAD-Seq分析から得たリードを、参照として用いたC. seticuspeのゲノム配列(CSE_r1.0)上にマッピングした。SNP候補を抽出し、得られた配列アライメントからSNPを決定した。
遺伝子型と表現型との間の関連性を、TASSELプログラムを用いて、一般線形モデルにより分析した。
連鎖解析をJoinMap 4.1 software (Kyazma B.V.製)により行った。キク白さび病抵抗性に有意に関連するSNPマーカーのdd-RAD-seq遺伝子型データ及びキク白さび病抵抗性の表現型データをJoinMap 4.1 softwareにインポートし、初期回帰マッピングパラメータを用いてマップを構築した。
“サザンペガサス”におけるキク白さび病抵抗性に関連する2つのSNPに対応する対立遺伝子特異的プライマーを設計した(表1)。
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”との交配種由来の63のF1植物の母集団を準備し、SNPマーカーが他の独立集団においても有効か否かを調査した。抵抗性連鎖SNPマーカーであるSCSE_SC023417.1_15736を用いて、当該独立集団のキク白さび病に対する抵抗性及び遺伝子型を評価した。
(表現型データ)
接種開始後28日目に病徴の評価を行った。キク白さび病感受性“NARO_cgs0302033”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種の128のF1個体は、抵抗性:感受性が73:55(おおむね1:1)に分離した。このことは、“サザンペガサス”がキク白さび病抵抗性に対して、単一の顕性遺伝子を有することを示している。
1サンプルあたり約2.9Mの高品質リードを、F1母集団(n=128)及び親品種から得た。配列リードの80.1%を参照ゲノムであるC.seticuspeのゲノム(CSE_r1.0)にマッピングできた。合計73,338のSNP候補を同定した。対立遺伝子頻度値及びカイ2乗検定(P>0.01)によりシンプレックスおよびダブルシンプレックスSNPを選択した。
“サザンペガサス”においてキク白さび病抵抗性に関連する21のシンプレックスSNPは、連鎖解析によって1つの連鎖群を形成し、これらのSNPマーカーが遺伝的に連鎖することが明らかとなった。“サザンペガサス”のキク白さび病抵抗性遺伝子の遺伝子座は、SCSE_SC003182.1_58579とSCSE_SC023417.1_15736との間に位置し、前者から1.9cM、後者から0.8cMの位置であった。dd-RAD-seqデータを用いたGWASによると、これらのSNPマーカーは、形質に有意に関連している(それぞれp=2.18×10-23及び2.85×10-31)。
PCR分析の結果(図2)、SCSE_SC023417.1_15736の遺伝子型を決定した。128のF1植物において、SCSE_SC023417.1_15736におけるホモ接合(GGGGGG):ヘテロ接合(GGGGGA)の分離は、52:76であり、1:1に概ね一致していた。抵抗性の親由来のA対立遺伝子を有する76個体のうち、72のF1植物はキク白さび病抵抗性を表し、4のF1植物は感受性であった。感受性の親のG対立遺伝子を有する52のF1植物のうち51は感受性であったが、1のF1植物が抵抗性を示した。これらの結果は、5のF1植物においてSCSE_SC023417.1_15736のA対立遺伝子とPhr1との間に組換えがあったことを示している。
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”とを交配して得られた集団において、キク白さび病抵抗性に対するSNPマーカーSCSE_SC023417.1_15736の連鎖を検証した。この集団におけるキク白さび病抵抗性の分離は、R:Sが32:31の比率であった。これは1:1の分離に一致する。抵抗性“サザンペガサス”由来の多型を有するF1植物は全て、キク白さび病抵抗性を示した。“サザンペガサス”由来の多型を有さない32のF1植物の内、31のF1植物はキク白さび病感受性であり、1のF1植物はキク白さび病抵抗性であった。SCSE_SC023417.1_15736は、独立した集団においても有用なSNPマーカーであることが示された。
Claims (12)
- キク白さび病抵抗性を判定する方法であって、
キク属(Chrysanthemum属)の植物において、下記(a)又は(b)の塩基自体(SNP)か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド:
(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;
(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;
をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法。 - 上記キク属の植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である、請求項1に記載の方法。
- (a’)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基がAであるとき、又は、
(b’)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基がCであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定する、請求項1又は2に記載の方法。 - 配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基がAであり、かつ、配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基がCであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記検査する工程において、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記植物のDNAにおける前記領域を増幅する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーセットは、配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基、及び、配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基に相当する塩基を含む領域を増幅するプライマーセットである、請求項5に記載の方法。
- 上記キク属の植物が、イエギク種(Chrysanthemum morifolium)に属する植物である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する製造方法であって、
キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、
前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、請求項1から7のいずれか1項に記載された方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程と
を含む、製造方法。 - 前記交雑工程の前に、請求項1から7のいずれか1項に記載された方法により、被験キク属植物からキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程をさらに含む、請求項8に記載の製造方法。
- キク属の植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーであって、
下記(a)又は(b)の塩基自体(SNP)か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド:
(a)配列番号1に示す63番目の塩基に相当する塩基;
(b)配列番号2に示す21番目の塩基に相当する塩基;
である、分子マーカー。 - 請求項10に記載の分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が2cM以内に位置している、キク白さび病抵抗性関連遺伝子。
- 請求項11に記載のキク白さび病抵抗性関連遺伝子を有する、請求項8又は9に記載の製造方法によって得られる、キク白さび病抵抗性のキク属植物。
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JP2020152274A JP2022046306A (ja) | 2020-09-10 | 2020-09-10 | キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物 |
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- 2020-09-10 JP JP2020152274A patent/JP2022046306A/ja active Pending
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