KR20220007592A - 흰가루병 저항성 고추류 식물 - Google Patents

Abstract

본 개시는 Leveillula taurica에 대한 저항성을 개선한 고추(Capsicum annuum) 작물을 제공한다. 해당 작물은 제6번 염색체 상의 질병 저항성과 연관된 신규 유전자 이입 게놈 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 질병 저항성 표현형이 증가한 작물 또는 생식질을 생산, 육종, 동정, 선발하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

흰가루병 저항성 고추류 식물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 4월 15일자로 출원한 미국 가출원 제62/834,208호에 대한 우선권을 주장하며, 해당 가출원의 내용은 본원에 원용되어 있다.

본 발명은 농업 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 고추 흰가루병을 유발하는 곰팡이 Leveillula taurica에 대한 저항성을 개선한 고추 작물을 생산하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

서열 목록

2020년 4월 6일 작성되어 서열 33개를 기록한 용량 12.2.0킬로바이트(MS-Windows®기준)의 파일명 "SEMB041WO_ST25.txt"를 포함하는 서열 목록을 본원에서 원용하였다.

질병 저항성은 농업에서, 특히 식용 작물의 생산에서 중요한 형질이다. 고추 작물에서도 질병 저항성 대립유전자를 찾아냈으나, 대립유전자와 연계한 특정 마커의 결여, 작물 품질을 손상시키는 연쇄불평형(linkage drag), 광범위한 저항성의 결여 등의 이유로 해당 대립유전자를 우량 계통(elite line)에 도입하려는 노력은 결실을 맺지 못하고 있다. 작물 육종 방법에서 마커 보조 선발(marker-assisted selection: MAS)을 도입하면 대상 형질과 연관된 유전자 마커(genetic marker)를 기초로 작물을 선발하는 것이 가능해진다. 그러나 형질과 연관이 있는 유전자의 특징을 분석했다 해도 작물에서 원하는 형질을 식별하거나 추적하기 위한 정밀 마커까지는 사용할 수 없는 경우가 종종 있다. 다유전자성 또는 양적 유전, 상위성, 원하는 표현형의 발현의 근간을 이루는 유전적 배경에 대하여 정확한 이해가 선행하지 않으면 문제는 더더욱 복잡해진다.

본 발명은 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물에 있어서, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 제6번 염색체 상에 마커 유전자좌 M1(서열번호 5), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15), 마커 유전자좌 M4(서열번호 20), 마커 유전자좌 M5(서열번호 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자좌를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 230,204,596 bp와 236,762,169 bp 사이에 위치한다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 염색체 분절은 본원에 기재된 바와 같고, 해당 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표 샘플은 ATTC 수탁번호 PTA-125810으로 기탁된 종자이다.

본 발명은 또한, 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물로, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물의 식물 부분을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물로서, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물을 생산하는 종자를 제공한다.

본 발명은 또한 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물에 있어서, 상기 재1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하며, 상기 작물은 또한 제4번 염색체 상에 제2 재조합 염색체 분절을 추가로 포함하고, 상기 제2 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 개선된 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 고추 흰 가루병균(Leveillula taurica)저항성 대립유전자는 제4번 염색체 상의 마커 유전자좌 NE0236790(서열번호 26번) 및 마커 유전자좌 NE0239147(서열번호 33번)이 플랭킹된 게놈 영역에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 제2 재조합 염색체 분절은 제4번 염색체 상의 마커 유전자좌 NE0238899(서열번호 27번), 마커 유전자좌 NE0238734(서열번호 28번), 마커 유전자좌 NE0240256(서열번호 29번), 마커 유전자좌 NE0237985(서열번호 30번), 마커 유전자좌 NE0239638(서열번호 31번), 마커 유전자좌 NCANN005704056(서열번호 32번)로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함한다. 본 발명은 또한 본원이 개시하는 작물을 생산하는 종자를 제공한다.

본 발명은 아울러 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물에 있어서, 상기 재1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하며, 상기 작물은 또한 제4번 염색체 상에 제2 재조합 염색체 분절을 추가로 포함하고, 상기 제2 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 개선된 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물의 식물 부분을 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분이다.

본 발명은 Leveillula taurica에 대한 저항성을 개선한 농경학적 우량고추(Capsicum annuum) 작물을 생산하는 방법에 있어서, 제6번 염색체 상의 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번) 및 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 재조합 염색체 분절 내의 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 상기 작물에 유전자 이입하는 단계를 포함하고, 유전자 이입된 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자는 해당 대립유전자가 없는 작물과 비교했을 때 상기 작물에 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이입 단계는 상기 재조합 염색체 분절을 포함하는 작물을 그 자체, 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추(Capsicum annuum) 작물과 교배하여 하나 이상의 자손 작물을 생산하는 단계와, 상기 재조합 염색체 분절을 포함하는 자손 작물을 선발하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자손 작물의 선발 단계는 마커 유전자좌 M1(서열번호 5번), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10번), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번), 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번), 마커 유전자좌 M5(서열번호 25번)를 포함하는 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자손 작물은 F₂~F₆ 자손 작물이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이입은 역교배, 마커 보조 선발 또는 Leveillula taurica 저항성 검정을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 역교배는 2~7세대의 역교배를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 작물은 제4번 염색체 상의 마커 유전자좌 NE0236790(서열번호 26번) 및 마커 유전자좌 NE0239147(서열번호 33번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 재조합 염색체 분절 내에 추가로 유전자 이입된 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 수득할 수 있는 고추(Capsicum annuum) 작물을 제공한다.

본 발명은 또한 Leveillula taurica에 저항성을 나타내는 고추(Capsicum annuum) 작물을 선발하는 방법에 있어서, 본원에 기재된 고추(Capsicum annuum) 작물을 그 자체 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추(Capsicum annuum) 작물과 교배하여 하나 이상의 자손 작물을 생산하는 단계와, 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 포함하는 자손 작물을 선발하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 자손 작물 선발 단계는 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자에 유전적으로 연계된 마커 유전자좌를 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자손 작물 선발 단계는 제6번 염색체 상의 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번) 및 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 염색체 분절 내에서, 또는 해당 분절과 유전적으로 연계된 마커 유전자좌를 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자손 식물은 F₂~F₆ 자손 식물이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자손 식물 생산 단계는 역교배를 포함한다.

도 1: Leveillula taurica 감염 수준과 관련 질병 활성도가 다양한 고추 작물의 화상. 질병 활성도는 1~9점으로 나타내며 구체적으로는 다음과 같다. 1: 건강한 식물, 3: 잎에 황색 또는 괴사성 반점이 있지만 눈에 뜨이는 포자는 없음, 5: 병변 내부에 포자가 있는 잎의 황색 또는 괴사성 반점, 7: 포자가 잎 아래쪽으로 퍼져 있으나 잎의 50% 미만을 덮음, 9: 포자가 잎 표면의 50% 이상을 덮음.
[0012]도 2: 질병이 만연한 상태에서 염색체 4에 Leveillula taurica 저항성 대립유전자의 0, 1(이형접합) 또는 2(동형접합) 카피를 포함하는 고추 작물의 질병 활성도. "A"와 "B"에 붙은 대쉬(') 기호는 저항성 대립유전자가 잡종 교배의 어미그루(parent plant)에 존재함을 의미한다. Hybrid A는 중간 정도의 L. taurica 저항성을 가지는 시판 피망 품종으로, 본 실험에서는 감수성 대조군으로 채택하였다. 도너 라인 PBC167은 저항성 대조군으로 채택하였다. 질병 활성도에 1~9점의 점수를 매겼다. 1은 100% 저항성, 9는 100% 감수성을 가리킨다.
도 3: Leveillula taurica가 확산한 상황에서 유전적 배경이 다양한 고추 작물의 질병 활성도를 도시한다. 본 실험에 쓰인 고추 개체군은 제4번 및 제 6번 염색체 상에 존재하는 Leveillula taurica 감수성 QTL을 다양하게 조합한 것이다. 도면의 문자는 각 군 사이의 유의한 차이이다. "+"는 저항성 대립유전자를, "-"는 감수성 대립유전자가 존재함을 가리킨다.
도 4: Leveillula taurica에 노출된 다양한 유전적 배경의 고추 작물의 예시이다. 좌측 화상은 제4번 및 제6번 염색체 상의 저항성 QTL에 대해 이형접합성인 작물이다. 해당 작물은 감염에 저항이 있으므로 질병 활성도 동급은 1~2이다. 중앙의 화상은 제4번 염색체 상의 저항성 QTL에 대해 이형접합성이고 제6번 염색체 상에 저항성 QTL이 없는 작물이다. 해당 작물은 병변 내부에 포자가 있으며 잎에 노란색 또는 괴사 반점이 보이므로 질병 활성도 등급은 5이다. 우측 화상은 중간 정도의 L. taurica 저항성이 있는 시판 피망 품종에 해당하는 Hybrid A의 작물이다. 해당 작물은 곰팡이균의 확산 상황에서 심각한 증상을 보여 질병 활성도 등급으로 9를 받았다.

고추 작물은 세계 전역에서 널리 재배되는 유실수이다. 다양한 기후대에서 잘 자라며, 야외는 물론 온실에서도 재배할 수 있다. 고추는 가지과(Solanaceae) 고추속(Capsicum)의 식물이다(예: Capsicum annuum). "고추"는 작물 자체와 그 열매를 모두 가리킨다. 고추는 일반적으로 벨 페퍼(bell pepper), 스위트 페퍼(bell pepper), 핫 페퍼(hot pepper)의 세 가지로 나뉘어진다. 일반적으로 널리 알려진 고추 품종은 상기 범주에 속하거나 이들의 교배종이다. 그러나 이런 구분은 절대적이지 않다. 핫 페퍼와 스위트 페퍼는 모두 다양한 종을 망라하기 때문이다. 종은 동일하지만 품종이 다를 수도 있다. 예를 들어 피망, 할라피뇨 고추, "Thai sweet"는 모두 Capsicum annuum종에 속한다. 고추는 일부 먹을 수 없는 품종을 포함하며, 식용 외에도 관상용 및 의약용으로 재배되기도 한다. Capsicum annuum는 매운(hot) 품종을 여럿 포함하지만 널리 알려진 핫 페퍼(hot pepper) 중에는 Capsicum annuum이 아닌 것도 상당수 있다. 예를 들어, 카이엔과 타바스코는 모두 Capsicum frutescens의 품종이고, 하바네로와 나가 등 현존하는 고추 중에서 가장 매운 고추는 Capsicum chinense에 속한다.

고추 육종은 흰가루병 등의 질병에 저항성이 있는 고추 식물의 재배에 부분적으로 초점을 맞추고 있다. Leveillula taurica 곰팡이가 원인인 흰가루병은 세계 전역에 퍼져 있으며, 온실 또는 밭에서 재배하는 고추를 감염시킨다.

Leveillula taurica 곰팡이가 일으키는 고추 흰가루병의 증상은 감염 초기 단계에는 잎의 윗면과 아랫면에 나타나는 밝은 녹색~밝은 노란색의 뚜렷한 반점과, 곰팡이의 포자로 인한 흰색 가루의 형성을 포함하기도 한다. 일부 환경 조건에서 흰색 가루로 뒤덮인 영역은 후에 괴사 상태가 되기도 한다. 감염된 잎은 위쪽으로 말려올라가고 아랫면에 흰색 가루 같은 포자가 폭발적으로 늘어난다. 병변이 많으면 합쳐지기도 한다. 증상이 심해지면 전반적인 백화 현상을 보이다 잎이 떨어진다. 질병은 일반적으로 오래된 잎에서 어린 잎으로 퍼져나간다. 감염된 작물이 잎을 다수 잃어 열매가 햇빛에 과도하게 노출되면 피소(sunscald)가 발생하고 결과적으로 생산량이 감소하게 된다.

감염된 작물 또는 잡초의 공기 중 분생포자(무성 진균 포자)는 바람을 타고 장거리 여행이 가능하며 초기 접종원으로 쓰이기도 한다. 곰팡이의 숙주로 삼을 수 있는 대상은 매우 다종다양하므로 질병을 무차별로 확산시키고 농가의 방제 능력을 약화시킨다. 일반적인 방제 방식은 감염 전, 또는 첫 증상이 관찰된 직후에 살균제를 도포하는 것이다. 그러나 살충제 살포에는 비용이 많이 들뿐만 아니라 환경에 악영향을 미치기 때문에 사회적으로도 지양하는 추세이다.

본 발명은 Leveillula taurica 곰팡이가 유발하는 흰가루병에 대한 저항성을 개선한 고추속 작물을 제공함으로써 해당업계에서 상당한 진보를 이룩하였다. 해당 작물은 흰가루병 저항성 고추 품종의 작물에 해당한다. 아울러 흰가루병 저항성 고추 작물, 계통 및 품종을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 또한 본원은 흰가루병 저항성에 기여하는 양적형질위치(QTL)에 연계된 분자 마커를 개시한다. 이와 같은 마커를 사용함으로써 당업자는 고추 작물의 흰가루병 저항성을 증가시키는 한편, 작물을 선발하여 흰가루병 저항성에 대한 유전적 소인을 확보할 수 있다. 특정한 실시양태에서 해당 방법은, 예를 들어 그 자손 또는 선조를 망라하는 고추 계통 PBC167에서 발견되는 흰가루병 저항성에 기여하는 QTL을 포함하는 고추 작물을 대상으로 한다.

이미 고추에서 Leveillula taurica 저항원을 발견한 바 있다. 예를 들어, Leveillula taurica 저항성 고추 계통 H3에 대한 연구는 제6번 염색체에서 주요 저항성 QTL을 발견하는 한편, 제5번, 제9번, 제10번, 제12번 염색체에서도 부수적 저항성 QTL을 찾아냈다(Lefebvre et al. 2003). 마찬가지로, Leveillula taurica 저항성 QTL은 C. fructescens에서 유래한 고추 작물 LG 1/8(고추 제8번 염색체)(미국공개특허 제2014/0272088호)에서도 동정하였다. 제4번 염색체 상의 주요 Leveillula taurica 저항성 QTL은 고추 품종 PBC167(미국특허 제9,689,045호)에서도 동정하였으며, 해당 개시 내용은 본원에 원용되어 있다. 그러나 제4번 염색체 상의 저항성 QTL은 경증~중등도의 질병의 경우 Leveillula taurica에 충분한 저항성을 부여하지만 질병의 심각성이 중등도 이상이면 적절한 수준의 저항성을 일관성 있게 부여하지 못한다.

본 발명은 한 실시양태에서, QTL을 포함하는 신규 재조합 염색체 분절은 물론 제6번 염색체 상의 신규 QTL로 고추 작물에서 Leveillula taurica 저항성을 부여한다는 점에서 상당한 진보성을 이룩하였다. 저항성 및 QTL은 당업계에 공지된 발명과 유의한 차이가 있으며, 이미 알려진 제4번 염색체 상의 저항성 유전자좌와 조합하여 배치하면 저항성이 상당히 개선할 수 있다. 이 특징은 질병의 심각성이 중등도~중증 질환일 때 특히 뚜렷하게 나타난다. 또한 새로운 유전자좌용으로 새로운 마커를 제공하여 신규 품종 개발 시 유전자좌를 정확하게 유전자 이입하고 추적할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 질병 저항성 유전자좌의 유전자 이입을 통해 필요로 하는 임의의 고추 유전자형을 획득한다.

특정 실시양태에서 제6번 염색체 상에 유전자 이입된 Leveillula taurica 저항성 유전자좌를 포함하는 작물을 제공하며, 상기 대립유전자는 유전자좌를 포함하지 않는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 강력한 저항성을 작물에 부여한다. 또 다른 실시형태에서는 제6번 및 제4번 염색체 상에 유전자 이입된 Leveillula taurica 저항성 유전자좌의 조합을 포함하는 작물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명이 제공하는 유전자 이입된 Leveillula taurica 저항성 유전자좌(대립유전자)는 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번) 및 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번)에 의해 플랭킹된 재조합 염색체 분절 내의 제6번 염색체 상에 위치하는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 해당 분절은 마커 유전자좌 M1(서열번호 5번), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10번), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 마커 유전자좌 M4는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 230,204,596 bp에서 A로부터 C로의 SNP 변화를 포함하고, 마커 유전자좌 M1은 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 233,270,768 bp에서 T로부터 C로의 SNP 변화를 포함하고, 마커 유전자좌 M2는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 233,426,022 bp에서 T로부터 C로의 SNP 변화를 포함하고, 마커 유전자좌 M3은 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 236,762,169 bp에서 6 bp 삽입(AAAGGA)가 있는 INDEL 마커를 포함하고, 마커 유전자좌 M5는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 235,546,118 bp에서 T로부터 C로의 SNP 변화를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대조군 작물, 예를 들어 동일한 조건 하에 성장하지만 유전자 이입이 없는 동일 품종의 작물에 비해 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는, 본원에 기재된 제6번 염색체 상의 재조합 유전자 이입을 포함하는 작물을 제공한다. 본원에 기재된 식물을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 표 1에 기재된 마커 등, 재조합 유전자 이입을 포함하는 작물 생산에 사용 가능한 신규 형질 연계 마커를 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 마커 M1(서열번호 5번), M2(서열번호 10번), M3(서열번호 15번), M4(서열번호 20번), M5(서열번호 25번)을 제공하며, 이들 마커는 작물의 Leveillula taurica 저항성과 유전적으로 연계된 것으로 밝혀졌다.

또 다른 실시형태에서 본 발명은 PBC167 계통에서 발견되는 제6번 염색체 상의 신규 재조합 유전자 이입과 제4번 염색체 상의 재조합 유전자 이입을 포함하는 작물을 제공한다. 이 조합은 중등도~중증의 질병에서 Leveillula taurica에 대한 강력한 내성을 제공한다. 본 발명은 아울러 강력한 저항성이 있는 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제4번 염색체 상의 재조합 유전자 이입은 마커 유전자좌 NE0236790(서열번호 26번) 및 마커 유전자좌 NE0239147(서열번호 33번)에 의해 플랭킹된다. 본 발명은 추가로 상기 작물의 생산에 쓰이는 신규 형질 연계 마커를 제공하며, 여기에는 표 2에 기재된 마커와 NE0238899(서열번호 27번), NE0238734(서열번호 28번), NE0240256(서열번호 29번), NE0237985(서열번호 30번), NE0239638(서열번호 31번), NCANN005704056(서열번호 32번)이 포함된다. 이들 마커는 작물의 Leveillula taurica 저항성과 유전적으로 연계되어 있다.

유전적으로 다양한 식물 계통은 교배가 쉽지 않고 질병 저항성 분석이 특히 곤란할 수 있다. 질병 유발 조건을 생성해야 하지만 재현이 쉽지 않기 때문이다. 때문에 기존 육종 방법을 사용하여 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 우량 계통(elite line)으로 유전자 이입을 하는 경우 거대한 모집단과 결과를 장담할 수 없는 자손 선발이 필수 사항이 되기도 한다. 따라서 마커 보조 선발(MAS)은 우량(elite) 재배종으로 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 효과적으로 유전자 이입하는 데 반드시 필요하다. 그러나 기존의 Leveillula taurica 저항성 마커는 질병 저항성을 부여하는 도너 DNA와 유해한 특성을 부여하는 도너 DNA를 구별하는 데 실패했다. 질병 저항성과 연관된 특이적 영역을 짚어낼 수단이 없었기 때문에 문제는 더욱 복잡해졌다. 본원의 발명은 최초로 효과적인 MAS를 실현하는 수단을 완성하였다. 표현형을 관찰하기 위해 작물의 대규모 개체군을 성숙할 때까지 성장시키지 않아도 질병 저항성과 연관된 유전자형을 검출할 수 있는, 검증을 완료한 개선 마커를 제공하는 것이다.

I. Leveillula taurica 저항성의 향상과 연관이 있는 게놈 영역, 대립유전자 및 다형성

제6번 염색체 상에서 새롭게 동정한 QTL은 solgenomics.net에서 열람 가능한 고추 CM334v.1.55 게놈 지도의 230,204,596bp에서 A로부터 G로의 SNP 변화에 해당하는 마커 M4(서열번호 20번)와, 고추 CM334v.1.55 게놈 지도의 236,762,169 bp에서 6 bp 삽입(AAAGGA)이 있는 INDEL 마커에 해당하는 마커 M3(서열번호 15번)으로 플랭킹되어 있는 것으로 확인하였다. 플랭킹 마커 외에도 간질 마커 M1(서열번호 5번)(고추 CM334v.1.55 게놈 지도의 233,270,768 bp에 위치한 T로부터 C로의 SNP 변화), M2(서열번호 10번)(고추 CM334v.1.55 게놈 지도의 233,426,022 bp에 위치한 T로부터 C로의 SNP 변화), M5(서열번호 25번)(고추 CM334v.1.55 게놈 지도의 235,546,118 bp에 위치한 T로부터 C로의 SNP 변화)를 사용하여 제6번 염색체 상의 저항성 QTL을 선택하는 것이 가능하다. 한 실시형태에서, 저항성 QTL은 핫 페퍼 품종에서 찾을 수 있다. 특정 실시양태에서 M1, M2 또는 M5와 같이 M4와 M3 사이에 삽입된 마커가 사용된다.

II. 질병 저항성과 관련된 게놈 영역의 유전자 이입

마커 보조 유전자 이입은 하나 이상의 마커가 규정하는 염색체 영역을 첫 번째에서 두 번째 유전적 배경으로 전달하는 것을 말한다. 유전자 이입 게놈 영역을 내포하는 교배에서 얻은 자손은 첫 번째 유전적 배경의 유전자 이입 게놈 영역 고유의 마커와, 두 번째 유전적 배경의 연계 마커 및 미연계 마커를 조합하여 동정할 수 있다.

본 발명은 저항성 공급원에서 얻은 게놈 영역 중 하나 이상의 유전자 이입을 동정하고 추적하기 위한 신규 마커를 제공하며, 상기 공급원은 본원에서 개시한 질병 저항성 제공 유전자좌를 포함하는 임의의 고추 작물일 수 있다. 미국 농무부(USDA) 생식질 목록 수탁 번호 PI640507에 해당하는고추 품종 PBC167을 예로 들 수 있다. 본원 발명은 작물 육종 시 본원에서 개시하는 신규 유전자 이입을 확인하고 추적하기 위한 마커를 추가로 제공한다.

특정 실시형태에 있어서, 본원 발명의 게놈 범위 내에 존재하거나 이와 연계된 마커는, 질병 저항성과 연관된 게놈 영역의 대상 유전적 배경으로의 유전자 이입을 비롯한 다양한 육종 기술에서 응용이 가능하다. 예를 들어, 30cM, 25cM, 20cM, 16cM, 15cM, 10cM, 5cM, 2cM, 또는 1cM 이하의 마커, 또는 본원에 기재된 질병 저항성 부여 유전자좌 내의 마커는 질병 저항성 표현형과 연관된 게놈 영역의 마커 보조 유전자 이입에 쓰이기도 한다.

본 발명은, 나머지 게놈 서열 중 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 또는 99%가 생식질 고유의 마커를 보유하는 필요 표현형과 연관된 하나 이상의 유전자 이입 영역을 포함하는 고추 작물을 제공한다. 본 명세서에 제공된 게놈 영역 및 마커와 밀접하게 연계되거나 이에 인접하고 Leveillula taurica 저항성과 연관이 있는 영역을 포함하는 유전자 이입 영역이 있는 고추 작물 또한 제공한다.

III. 질병 저항성 고추(Capsicum annuum) 품종의 개발

육종자는 육종 시 대개 "재배형(cultivated type)" 또는 "우량(elite)" 생식질(germplasm)로 작업한다. 본 명세서에서 "우량(elite)" 또는 "재배형" 품종은 농업 분야에서 뛰어난 작물학적 성과를 얻기 위한 목적으로 육종 및 선발로 얻은 품종을 가리킨다. 해당 생식질은 일반적으로 작물학적 성과에 대한 평가가 높으며 육종하기도 더 쉽다. 상업적 재배에 적합한 농경학적 우량 재배형 고추는 이미 다수 개발되어 있다. 그러나 재배형 생식질의 이점은 대립유전자 다양성의 결여로 상쇄되기 일쑤이다. 일반적으로 육종자는 이러한 단점을 감수하는데, 다양한 유전자원보다 단일 재배형 작물로 작업하는 편이 훨씬 빠르게 성과를 낼 수 있기 때문이다.

한편 재배형 생식질을 비재배형 생식질과 교배함으로써 육종자는 비재배형에서 신규 대립유전자를 얻을 수 있다. 그러나 이러한 접근법(approach)은 다양한 계통 간의 교배에 따른 생식력 문제와 비재배형 어미그루에서의 부정적인 연쇄불평형, 즉 열악형질 계승을 수반한다는 단점이 있다. 예를 들어 비재배형 고추 계통에서 질병 저항성과 연관된 대립유전자를 도입하는 것이 가능하다. 그 대신 괴사에 취약하고 열매 생산량이 떨어지는 등 열악한 작물적 특성을 비재배형에게 물려받게 될 수도 있다.

연쇄불평형 또는 낮은 형질 유전력의 문제점을 극복하고 비재배 계통에서 원하는 저항성 대립유전자만을 우량 재배 계통에 유전자 이입하는 것은 쉬운 일이 아니다. 이와 같은 이유에서, 야생의 동종식물에서 유래한 대립유전자를 성공적으로 배치하려면 유해 효과를 수반하지 않는 최소/절단 유전자 이입과, 표현형 스크리닝을 대체하는 신뢰성 높은 마커 검정이 절대적으로 필요하다. 핵심 속성의 유전적 특징을 간략화하여 양적 형질, 예를 들어 질병 저항성의 유전적 획득에만 집중하는 것으로 성공 확률을 비약적으로 높이게 된다. 또한, 비재배 계통에서 게놈 영역을 유전자 이입하는 공정은 참조 마커의 이용가능성에도 달려 있다.

따라서 당업자는 본원 발명이 제공하는 대립유전자, 다형성 및 마커가 본원에서 동정한 게놈 영역을 추적하고 임의의 유전적 배경 내로 도입하는 것을 지원할 수 있음을 이해할 것이다. 아울러 본원에서 개시한 질병 저항성과 연관된 게놈 영역은 한 유전자형으로부터 다른 유전자형으로 유전자 이입되며, 표현형 또는 유전으로 추적할 수 있다. 따라서, 출원인은 질병 저항성과 관련된 정확한 마커를 발견함으로써 유익한 표현형을 가지는 고추 작물의 개발을 촉진하게 된다. 예를 들어, 작물 및 종자는 필요한 질병 저항성을 포함하는 품종 개발을 위해 본 발명의 마커로 유전자형을 결정할 수 있다. 아울러 마커 보조 선발(MAS)로 필요한 유전자 이입에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성인 식물을 동정할 수 있다.

감수분열 재조합(meiotic recombination)은 유전적 배경 전체에 걸친 유리한 대립유전자의 전이, 유해한 게놈 분절 제거, 유전적으로 밀접하게 연계한 피라미드형 형질(pyramiding trait)을 가능하게 하므로 식물 육종에 필수적이다. 재조합은 제한적이므로 육종자는 자손 선별을 위해 분리 개체군(segregating population)을 확장해야 한다. 마커가 없으면 육종자는 표현형 평가에 의존할 수밖에 없다. 그러나 이 평가는 시간과 자원을 많이 소모할 뿐만 아니라 질병 저항성 등 특정한 형질의 경우 환경에 따라서는 재현이 불가능하다. 반대로 마커를 이용하면 육종자는 전체 개체군을 대상으로 표현형 평가를 실시하지 않아도 해당 개체를 선발할 수 있다. 본 발명이 제공하는 마커는 효과적인 대안을 제공하므로 당해 분야에서 상당한 진보성을 실현한다.

대규모 개체군의 표현형 평가는 시간과 자원이 지나치게 많이 필요하며 적용 가능한 환경도 제한적이다. 마커 보조 선발로 이를 대체하는 것이 가능하다. 고유한 다형성, 예컨대 SNP를 검출하도록 설계한 분자 검정은 다방면에 쓰일 수 있다. 그러나 분자검정은 단회로는 고추종의 대립유전자 구별에 실패할 수 있으므로 마커 검정, 예를 들어 일배체형 검정과 조합하여 작업하는 것이 바람직하다. 염색체의 구조적 재배열, 예컨대 결실은 합성 표지된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 및 확장을 손상시킨다. 중복 이벤트의 경우, 여러 개의 카피가 구별 없이 단일 반응으로 증폭된다. 따라서 정확하고 고도의 예측이 가능한 마커의 개발 및 검증은 성공적인 MAS 육종 프로그램에 필수적이다.

IV. 분자 보조 육종 기술

본 발명의 실시에서 사용 가능한 유전자 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 삽입/결실 다형성(Indel), 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 증폭 단편 길이 다형성(AFLP), 단순 서열 반복(SSR), 단순 서열 길이 다형성(SSLPs), 가변 수 일렬 반복(VNTR), 무작위 증폭 다형성 DNA(RAPD), 동종효소, 당업자 주지의 그 외 마커를 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 작물 육종자는 분자 마커를 이용하여 작물의 게놈을 조사하고 표현형이 아닌 유전적 차이를 기반으로 이들을 분류한다. 고급 마커 기술은 동일한 종에서도 서로 다른 다형성 유전자형의 뉴클레오티드 순서인 게놈 서열을 기반으로 한다. 상기 플랫폼으로 게놈 전체에 무작위로 분포된 마커를 이용하여 생식질을 구성하는 것은 물론 유리한 대립유전자에 연계된 마커로 작물학적 특성을 선택하는 것이 가능하다. 현재는 주요 채소 작물의 염기서열에 성공했지만 과거에는 이들의 게놈에 대한 사전 지식이 부족했다. 과학자들은 마커 플랫폼을 개발하기 위해 알려진 기존의 다형성 대신 서열 상동성을 이용했다. 인공 DNA 분자는 DNA 폴리머라제 효소의 존재 하에 쌍으로 혼성화될 때 게놈 단편의 복제를 프라이밍하는 데 쓰인다. 해당 합성 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 DNA 가닥의 혼성화 및 복제를 통제하는 열 순환 조건에 따라 조절이 되며, 각 프라이머 쌍 사이의 거리에 좌우되는 길이의 DNA 단편을 증폭시킨다. 이후 이들 단편은 마커로 검출되며, 일반적으로 알려진 예로는 AFLP 및 RAPD를 들 수 있다. 세 번째 기술로 꼽히는 RFLP는 DNA 증폭 단계를 포함하지 않는다. 증폭 단편 길이 다형성(AFLP) 기술은 게놈의 복잡성을 줄인다. 첫째, 소화 효소를 통해 DNA 가닥을 서열 특이적 방식으로 절단한다. 그런 다음 크기에 따라 단편을 선택하고, 각각 게놈 단편의 하위 집합에 상동인 선택적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 최종적으로 복제한다. 다시 말해 AFLP 기술은 유전자형, 실험 및 실험실 전반에 걸쳐 DNA 단편을 일관되게 증폭시킨다.

적어도 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하는 다형성은 여러 가지 방식으로 분석할 수 있다. 예를 들어 검출은 단일 가닥 형태적 다형성(Orita, et al., Genomics 8:271-278, 1989), 변성 구배 겔 전기영동(Myers, EP 0273085), 또는 개열 단편 길이 다형성(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 등을 포함하는 전기영동 기술로 검출할 수 있으나, DNA 시퀀싱의 광범위한 가용성 때문에 증폭된 산물을 직접 시퀀싱하는 것이 훨씬 더 쉽다. 다형성 서열 차이를 파악하면 자손 검사를 목적으로 신속한 검정을 설계할 수 있다. 여기에는 보통 특이적 대립유전자의 PCR 증폭(PASA; Sommer, et al., Biotechniques 12:82-87, 1992), 또는 복수의 특이적 대립유전자의 PCR 증폭(PAMSA; Dutton and Sommer, Biotechniques, 11:700-702, 1991)의 일부 버전이 포함된다.

다형성 마커는 계통 또는 품종의 동일성 정도를 결정하기 위해 식물을 검정하는 유용한 도구의 역할을 한다(미국특허 제6,207,367호). 이들 마커는 표현형과의 연관성을 결정하는 기초가 되며, 아울러 유전적 획득을 유도하는 데 쓰일 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 실시형태에서, 다형성 핵산은 고추(Capsicum annuum) 작물에서 질병 저항성과 연관된 유전자형을 검출하고, 질병 저항성과 연관된 유전자형을 가지는 고추 작물을 동정하고, 질병 저항성과 연관된 유전자형을 가진 고추 작물을 선발하는 데 쓰일 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 실시형태에서, 다형성 핵산을 이용하여 질병 저항성과 연관된 유전자좌를 게놈에 유전자 이입한 고추 작물을 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 특정한 실시형태에서, 다형성 핵산을 이용하여 질병 저항성과 연관된 유전자좌를 포함하는 자손 고추 작물을 육종할 수 있다.

유전자 마커는 "현성(dominant)" 또는 "공동현성(codominant)" 마커를 포함해도 좋다. "공동현성" 마커는 2개 이상의 대립유전자(두배수체 개체당 2개)를 찾아내는 마커를 말한다. "현성" 마커는 단일 대립유전자만을 검출한다. 마커는 두배수체 유전자좌에서 대립유전자 2개를 또는 세배수체 또는 네배수체 유전자좌에서 복수의 대립유전자를 쉽게 검출할 수 있도록 공동현성적으로 유전되는 것이 바람직하며, 또한 이들은 환경 변화와 무관하다. 다시 말해 유전성이 1이다. 마커 유전자형은 일반적으로 두배수체 유기체의 각 유전자좌에 마커 대립유전자 2개를 포함한다. 각 유전자좌의 마커 대립유전자 조성은 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 동형접합성은 유전자좌의 대립유전자 2개가 동일한 뉴클레오티드 서열을 나타내는 상태를 말한다. 이형접합성은 하나의 유전자좌에서 대립유전자의 조건이 상이한 것을 가리킨다.

유전적 다형성의 존재 여부를 결정하기 위한 핵산 기반 분석(즉 유전형 분석)은 동정, 선발, 유전자 이입 등을 위한 육종 프로그램에서 활용하는 것이 가능하다. 유전적 다형성의 분석에 이용 가능한 다양한 유전자 마커는 당업자에게 주지의 사실이다. 해당 분석은 고추(Capsicum annuum) 작물의 질병 저항성에 연계 또는 연관된 유전자 마커를 포함하거나 이에 연계되는 유전자, 유전자 부분, QTL, 대립유전자, 또는 게놈 영역의 선별에 쓰이기도 한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 핵산 분석 방법은 PCR 기반 검출법(예: TaqMan 검정), 마이크로어레이법, 질량 분석 기반법 및/또는 전체 게놈 시퀀싱을 비롯한 핵산 시퀀싱법을 포함하되 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시형태에서 핵산 증폭법을 이용하면 DNA, RNA 또는 cDNA의 샘플에서 다형성 부위를 용이하게 검출할 수 있다. 해당 방법은 다형성 부위에 걸쳐 있거나, 원위 또는 근위에 위치한 부위 및 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 농도를 특이적으로 증가시킨다. 이와 같이 증폭된 분자는 겔 전기영동, 형광 검출법, 혹은 그 외 수단에 의해 쉽게 검출이 가능하다.

증폭법을 달성하는 수단으로는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 꼽을 수 있다(Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, 1986; 유럽특허 제50,424호;유럽특허 제84,796호; 유럽특허 제258,017호; 유럽특허 제237,362호; 유럽특허 제201,184호; 유럽특허 제4,683,202호; 유럽특허 제4,582,788호; 유럽특허 제4,683,194호). 이 경우, 이중 가닥 형태에서의 다양성을 정의하는 근위 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍을 이용한다. 질량 분석을 기초로 하여 DNA의 형결정을 실시하는 방법도 쓰일 수 있다. 상기 방법에 관해서는 미국특허 제6,613,509호 및 제6,503,710호, 본 명세서에 기재한 참고문헌을 참조할 수 있다.

DNA 서열의 다형성은 미국특허 제5,468,613호, 제5,217,863호, 제5,210,015호, 제5,876,930호, 제6,030,787호, 제6,004,744호, 제6,013,431호, 제5,595,890호, 제5,762,876호, 제5,945,283호, 제5,468,613호, 제6,090,558호, 제5,800,944호, 제5,616,464호, 제7,312,039호, 제7,238,476호, 제7,297,485호, 제7,282,355호, 제7,270,981호, 제7,250,252호에서 개시하는 방법 등(이에 한정되지는 않는다) 해당 분야에서 주지의 각종 방법으로 검출하거나 형결정을 실시할 수 있다. 상기 특허는 모두 본원에서 원용된다. 그러나 본 발명의 조성물 및 방법은 게놈 DNA 샘플에서 다형성의 형결정을 위한 임의의 다형성 형결정 방법과 함께 이용해도 좋다. 상기 게놈 DNA 샘플은 식물로부터 직접적으로 단리한 게놈 DNA, 클로닝한 게놈 DNA, 또는 증폭된 게놈 DNA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

예를 들어 DNA 서열의 다형성은 미국특허 제5,468,613호 및 제5,217,863호에서 개시하는 바와 같이 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO) 프로브와의 혼성화를 통해 검출할 수 있다. 미국특허 제 5,468,613호는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 관한다. 이 경우 핵산 서열에서 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 변이는, 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 시퀀스를 증폭하고 막에 스폿팅한 후 표지 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드로 처리되는 과정을 통해 핵산에서 검출된다.

표적 핵산 서열은, 이를테면 미국특허 제5,800,944호에 개시되어 있듯이 프로브 결찰 방법에 의해 검출이 가능하다. 해당 방법에서는 관심 서열을 증폭하여 프로브와 혼성화하고 이어서 프로브의 표지 부분을 검출한다.

마이크로어레이 또한 다형성 검출에 쓰일 수 있는데, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 단일 서열을 나타내기 위해 중첩 방식으로 조립되므로, 한 지점에서 표적 서열의 차이가 부분은 프로브 혼성화를 초래하기도 한다(Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523, 2003; Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858, 2005). 임의의 마이크로어레이 상에 유전자 및/또는 비코딩 영역을 나타낼 수 있는 복수의 표적 서열이 있을 가능성이 높은데, 여기에서 각 표적 서열은 단일 프로브가 아닌 일련의 중첩 올리고뉴클레오타이드로 표시된다. 해당 플랫폼은 다양한 다형성을 높은 처리량으로 스크리닝할 수 있다. 마이크로어레이 기반 방법을 이용한 표적 서열의 형결정은 미국특허 제6,799,122호, 제6,913,879호, 제6,996,476호를 참조할 수 있다.

SNP 및 Indel 검출에 쓰이는 또 다른 방법으로는 단일 염기 연장(SBE)법이 꼽힌다. SBE법의 사례는 미국특허 제6,004,744호, 제6,013,431호, 제5,595,890호, 제5,762,876호, 제 5,945,283호가 개시하는 발명을 포함하되 이들에 한정되지는 않는다.

그 외에도 SNP 및 Indel는 미국특허 제5,210,015호, 제5,876,930호, 제6,030,787호가 개시하는 방법으로 검출할 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 프로브는 해당 프로브의 5' 말단 및 3' 말단에 공유결합된 5' 형광 리포터 염료와 3' 소광제 염료를 가진다. 프로브가 손상을 입지 않으면, 소광제 염료에 리포터 염료가 근접해 있기 때문에 포스터 에너지 전이에 의해 리포터 염료의 형광이 억제된다. PCR를 실시하는 동안, 정방향 및 역방향 프라이머는 다형성을 플랭킹하는 표적 DNA의 특정한 서열에 혼성화하는 반면, 혼성화 프로브는 증폭된 PCR 생성물 내의 다형성 함유 서열에 혼성화한다. 후속 PCR 주기에서, 5' 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제가 프로브를 절단하고 소광제 염료로부터 리포터 염료를 분리시켜 리포터의 형광을 증가시킨다.

또 다른 실시형태에서 대상 유전자좌에 핵산 시퀀싱 기술을 이용하여 직접적으로 시퀀싱하는 것이 가능하다. 핵산 시퀀싱법은 당업계에서 이미 주지의 사항이며, 454 Life Sciences(Branford, CT), Agencourt Bioscience(Beverly, MA), Applied Biosystems(Foster City, CA), LI-COR Biosciences(Lincoln, NE), NimbleGen Systems(Madison, WI), Illumina(San Diego, CA), VisiGen Biotechnologies(Houston, TX)가 제공하는 기술을 포함한다. 해당 핵산 시퀀싱 기술은 병렬 비드 어레이, 결찰에 의한 시퀀싱, 모세관 전기영동, 전자 마이크로칩, “바이오칩,” 마이크로어레이, 병렬 마이크로칩, 단일-분자 어레이 등의 형식을 포함한다.

V. 정의

하기의 정의는 본 발명을 보다 정확하게 정의하고 당업자가 본 발명의 실시형태를 실현할 수 있도록 당업자에게 충분한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다. 별도의 언급이 없으면 해당 용어는 유관 분야에서 당업자가 통상적으로 사용하는 바를 따라 이해하도록 한다.

본 명세서에서 "작물" 또는 "식물"은 식물 세포, 식물 원형질체(protoplast), 고추(Capsicum annuum) 작물을 재생할 수 있는 조직 배양물의 식물 세포, 식물 캘러스, 식물 무리(clump), 그 밖에 작물 또는 꽃가루, 꽃, 종자, 잎, 줄기 등 작물의 일부에서 온전하게 채취한 식물 세포를 가리킨다.

본 명세서에서 "개체군"은 동일 어미그루를 기원으로 공유하되 유전적으로 이질적인 식물의 집합체를 의미한다.

본 명세서에서 "품종" 및 "재배종"은 유전 계보 및 성과로 동일한 종 내에 다른 품종과 구별할 수 있는 유사한 식물군을 의미한다.

본 명세서에서 "대립유전자"는 염색체 상의 소정의 유잔자좌에서 게놈 서열의 둘 이상의 대안적 형태 중에서 하나를 지칭한다.

"양적형질위치"(QTL)는 표현형의 표현도에 영향을 주는 대립형질 중 적어도 첫 번째 형질을 코딩하는 염색체 위치이다.

본 명세서에서 "마커"는 생물체의 구별에 쓰일 수 있는 검출 가능한 특징을 의미한다. 상기 특징의 예로는 유전자 마커, 생화학적 마커, 대사산물, 형태학적 특징 및 작물학적 특징을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 "표현형"은 유전자 발현에 영향을 받을 수 있는 세포 또는 생물체의 검출가능한 특징을 의미한다.

본 명세서에서 "유전자형"은 식물의 특이적 대립유전자 구성을 의미한다.

본 명세서의 "우량(elite) 계통" 또는 "재배(cultivated) 계통"은 우수한 농경학적 성능을 위해 육종 및 선발로 추려낸 임의의 계통을 말한다. "우량 식물"은 우량 계통에 속하는 식물을 말한다. 현재 다양한 우량 계통을 이용할 수 있으며 고추(Capsicum annuum) 육종 분야에서 당업자에게는 주지의 사실이다. "우량 개체군"은 Capsicum annuum 계통과 같은 소정의 작물종의 농경학적으로 우수한 유전자형의 관점에서 최신 기술을 대표할 수 있는 우량 개체 또는 계통의 모임을 말한다. 이와 마찬가지로 "우량 생식질" 또는 생식질의 우량 계통은 농경학적으로 우수한 생식질이다.

본 명세서의 "유전자 이입"은 유전자좌와 관련하여 쓰이는 경우 예컨대 역교배를 통해 새로운 유전적 배경 내로 도입된 유전자좌를 지칭한다. 유전자좌의 유전자 이입은 식물 육종 방법 및/또는 분자 유전적 방법으로 달성할 수 있다. 상기 분자 유전적 방법은 마커 보조 선발, 상동성 재조합, 비상동성 재조합, 부위 특이적 재조합 및/또는 유전자좌 치환 또는 유전자좌 전환을 유도하는 게놈 변형을 제공하는 다양한 식물 형질전환 기술 및/또는 방법을 포함하되 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서의 "연계(linked)"는 핵산 마커 및/또는 게놈 영역의 관련하여 쓰이는 경우, 마커 및/또는 게놈 영역이 감수분열에서 함께 분리되는 경향이 있도록 동일한 연계군 또는 염색체 상에 위치함을 의미한다.

본 명세서의 "저항성 유전자좌"는 질병에 대한 저항성 또는 내성과 연관된 유전자좌를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 저항성 유전자좌는 한 실시형태에서 Leveillula taurica에 대한 저항성 또는 감수성을 조절할 수 있다.

본 명세서의 "저항성 대립유전자"는 질병에 대한 저항성 또는 내성과 연관된 핵산 서열을 의미한다.

본 명세서에 있어서, 질병 상태에 대한 작물의 "저항성" 또는 "향상된 저항성"은 저항성이 떨어지고 보다 "감수성"이 높은 작물과 비교했을 때 수확량, 생존율 및/또는 기타 농경학적 지표에 관련하여 질병 상태에 영향을 적게 받음을 의미한다. "저항성"은 상대적 용어로, "저항성" 작물이 유사한 질병 상태에서 성장한 또 다른(저항이 낮은) 작물과 비교했을 때 질병 상태 하에서 생존율 및/또는 수확량이 훨씬 우수함을 의미한다. 당업계에서 질병 "내성"은 때로 질병 "저항성"을 대체할 수 있으며, 반대도 마찬가지이다. 당업자는 질병 상태에 대한 식물의 저항성의 범주가 넓어질 수 있으며, 저항성이 높거나 저항성이 낮은 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 다만 당업자는 일반적으로 단순한 관찰로 질병 상태 하에서 상이한 작물, 작물 계통, 또는 작물 계열의 상대적 저항성 또는 감수성을 판단할 수 있으며, "저항성"의 표현형을 단계별로 인지할 것이다.

본 명세서의 "약(about)"은 문제의 값이 해당 값을 결정할 때 쓰이는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타낸다. 청구항에서 "또는(or)"을 이용하는 경우, 오로지 대안만을 지칭하도록 명시하거나 대안이 상호간에 배타적임을 명시하지 않는 한, "및/또는(and/or)"을 의미한다. 다만 본 개시는 대안만을 지칭하거나 "및/또는"을 지칭하는 정의 역시 포함하고 있다. 청구항에서 부정관사 "a" 및 "an"을 "포함하는(comprising)" 또는 그 외 개방형 표현과 함께 사용하는 경우, 별도로 정의하지 않는 한 "하나 이상(one or more)"을 의미한다. "포함하다(comprise/include)" 또는 "가지다(have)"는 개방형 연결 동사이다. "포함하는", "가지는" 등 이들 동사의 변형 또는 시제 역시 개방형 언어에 해당한다. 예를 들어 하나 이상의 단계를 포함하거나 가지는 임의의 방법은 하나 이상의 단계만을 가지는 방법에 한정되지 않으며, 나열되지 않은 그 외의 단계를 망라할 수 있다. 마찬 가지로 한 가지 이상의 형질을 포함하거나 가지는 임의의 식물은 해당 한 가지 이상의 형질만을 가지는 대신 열거하지 않은 그 외의 형질을 망라할 수 있다.

VI. 기탁 정보

본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이 제6번 염색체 상의 유전자 이입을 포함하는 고추 계통 SBR-BW19-1046의 최소 625개의 종자를 기탁하였다. 종자는 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA에 기탁하였다. 상기 기탁물에는 ATCC 수탁 번호 PTA-125810이 배정되었으며 기탁 일자는 2019년 3월 12일이었다. 기탁물에는 출원 계속 기간 중에 권리자가 요청하는 경우 접근할 수 있다. 기탁물은 30년 동안, 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안, 혹은 특허권 시행 가능 기간 중 가장 긴 기간 동안 공공 보관소인 ATCC 보관소에 예치하며, 상기 기간 동안 생존이 불가능한 경우에는 중도 교체를 허용한다. 출원인은 특허리 또는 식물 품종 보호법(7 U.S.C. 2321 et seq.)을 비롯한 그 외 품종 보호 체제 하에 취득한 권리에 대한 침해를 일절 허용하지 않으며, 그에 대한 권리를 행사를 포기하지 않는다.

실시예 1

제6번 염색체 상의 Leveillula taurica 저항성 표현형 분석

Leveillula taurica에 대한 저항성은 묘목 성체 검증 또는 묘목 검증에서 표현형으로 결정할 수 있다. 접종물은 감수성 고추 작물의 Leveillula taurica에 감염된 잎에서 포자를 수확하여 제조하였다. 감염 후 4~8주가 경과한 잎이 가장 바람직하다. 흰가루병 증상이 있는 잎을 세척하여 포자 현탁액을 채취하고 그 즉시 Tween(100mL당 1방울)으로 희석하는 방식으로 흰가루병 포자가 대량 발생한 잎에서 분생포자를 얻었다. 중증 수준의 심각한 질병 상태를 모방하고자 분생포자 현탁액을 4 ×10⁴개/㎖(통상 접종 농도의 4배)로 희석하였다.

성체 작물 검정을 위해 비슷한 크기의 잎이 4~5개 달려 있는 묘목을 선택하여 온실로 이식하였다. 실험 작물과 대조 작물에 첫 열매가 맺히기 시작할 무렵 분생포자 현탁액을 접종하고, 2주 후에 두 번째 접종을 실시하였다. 질병을 더욱 확산시킬 수 있도록 실험 작물을 취약한 작물로 둘러쌌다. 온도와 습도가 조절되는 온실에 작물을 두고 증상이 발현하도록 하였다. 접종 8주 후에 포자 밀도 및 잎당 반점의 수에 1~9점의 점수를 매겼으며, 구체적으로는 다음과 같다. 1: 건강한 식물, 3: 잎에 황색 또는 괴사성 반점이 있지만 눈에 뜨이는 포자는 없음, 5: 병변 내부에 포자가 있는 잎의 황색 또는 괴사성 반점, 7: 포자가 잎 아래쪽으로 퍼져 있으나 잎의 50% 미만을 덮음, 9: 포자가 잎 표면의 50% 이상을 덮음(도 1).

묘목 검정을 위해 칸 40개자리 종자 트레이에 질석 함유 이탄을 넣고 종자를 발아시켰다. 모종이 3엽기(leaf stage)에 이르렀을 때 묘목상에서 온실로 옮겼다. 세 번째 잎이 완전히 확장한 묘목에만 접종물을 뿌렸다. 잎이 3개 이상인 묘목은 접종하기 전에 나머지 잎을 잘라냈다. 접종을 받은 묘목은 28℃(주간) 및 16℃(야간)의 다습한 온실에 48시간 동안 두었다. 이후로는 밤에만 다습한 환경을 유지했다. 실험이 진행되는 동안 토양의 습도를 유지하기 위해 묘목에 매일 물을 주고 직사광선을 피하였다. 묘목은 파종 후 약 14~21일 이후부터 매주 수정되었고, 접종한 본래의 잎 석 장 이외에 새로 자라나는 잎은 모두 제거하였다. 감수성 대조군이 완전히 감염되었을 때(접종 4~5주 후) 포자 밀도 및 잎당 반점의 수에 1~9점의 점수를 매겼으며, 구체적으로는 다음과 같다. 1: 건강한 식물, 3: 잎에 황색 또는 괴사성 반점이 있지만 눈에 뜨이는 포자는 없음, 5: 병변 내부에 포자가 있는 잎의 황색 또는 괴사성 반점, 7: 포자가 잎 아래쪽으로 퍼져 있으나 잎의 50% 미만을 덮음, 9: 포자가 잎 표면의 50% 이상을 덮음 (도1).

실시예 2

제6번 염색체 상의 Leveillula taurica 저항성 유전자좌의 QTL 매핑

PBC167의 제4번 염색체 상의 QTL이 부여하는 Leveillula taurica 저항성은 우량 계통이 중증의 Leveillula taurica 감염을 일으킨 경우에는 적절한 대처법이 되지 못한다(도 2). PBC167의 추가 유전자좌가 Leveillula taurica 저항성에 기여하는지의 여부를 결정하기 위해 PBC167 저항성 도너와 우량 감수성 어미그루 간의 초기 교배에서 BC1F2:F3 매핑 개체군을 얻었다. 이 매핑 개체군을 구성하는 265개 과에 대해 플롯당 복제 3개와 작물 5개를 이용하는 완전난괴법 시험에서 Leveillula taurica 저항성을 시험하였다. 해당 과는 또한 게놈 전체에 위치한 143개의 마커를 사용하여 유전자형을 지정했다. 후속 QTL 분석은 제4번 염색체에서 알려져 있는 주요 저항성 유전자좌를 확인하는 한편, 제6번 염색체의 마커 M4와 M5 사이에 위치한 8.2cM 영역에 매핑된 부수적 내성 QTL도 동정하였다. M4는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 230,204,596bp에서 [A/C] 변화를 일으키는 SNP 마커이다. M5는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 235,546,118 bp에서 [T/C] 변화를 일으키는 SNP 마커이다(표 1).

제6번 염색체에서 새로이 동정한 영역을 추가적으로 매핑하기 위해 제4번 염색체 상의 저항성 QTL에 동형접항성이고 제6번 염색체의 마커 M4 및 M5 사이에서 재조합 이벤트가 있는 20개 과를 포함하는 하위집단을 BC1F2:F3 개체군에서 선발하였다. 각 과에서 재조합 이벤트의 양쪽에 존재하는 반복 어미그루 및 도너 어미그루 대립유전자에 대해 동형접합성인 작물을 선발하였다. 표현형 시험은 성체 작물 검정과 4개 복제 완전난괴법을 이용하여 온실에서 설계하였다. 감수성 우량 어미그루, 저항성 도너 PBC167, 감수성 계통 Yolo Wonder B, H3 유래 계통(저항성)을 대조군으로 설정하였다. 모든 작물이 Leveillula taurica 포자에 동등하게 노출되도록 350개의 감수성 작물을 시험 기간 동안 일렬로 배치하였다. 작물의 Leveillula taurica 저항성을 평가하였으며, 제6번 염색체 상의 대략적으로 매핑한 QTL 영역 내에 위치한 마커에 대한 유전자형을 지정하였다. 후속 QTL 분석은 제6번 염색체상의 6.5cM 영역에 대한 저항성 QTL을 추가로 정의하였다. M1 및 M3을 포함하는 추가 마커는 해당 영역의 해상도를 높이기 위해 개발한 것이다. M1는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 233,270,768 bp에서 [T/C] 변화를 일으키는 SNP 마커이다. M3는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 236,762,169 bp에 6 bp 삽입(AAAGGA)이 있는 INDEL 마커이다. M2 마커는 제 6번 염색체 상의 Leveillula taurica 저항성 유전자 이입을 선택에 사용하는 것도 가능하다 . M2는 고추 CM334 v1.55 지도에서 제6번 염색체 상의 233,426,022bp에서 [T/C] 변화를 일으키는 SNP 마커이다(표 1).

제6번 염색체에서 새로이 동정한 QTL은 정상적인 시험 조건에서 항상 검출되지는 않았으므로 저항성에는 그다지 영향을 미치지 않는 것으로 여겨진다. 아울러 제6번 염색체 상의 QTL과 이미 알려진 제4번 염색체 상의 QTL이 양쪽 모두 최적의 적용 대상이 아닌 질병 상태에 존재할 경우 전자의 효과는 후자의 효과에 가려져 보이지 않을 수 있다. 따라서 제6번 염색체 상의 QTL에 대한 2차 정밀 매핑은 제4번 염색체 상의 QTL이 없는 상태에서 실시하였다. 이전 매핑 개체군을 생성한 동일한 교배에서 파생된 BC3F2 재조합 계통을 20개 선택하였다. 선택된 BC3F2 재조합 계통 각각은 제4번 염색체 상에 저항성 QTL이 없었고 제6번 염색체 상의 마커 M4와 M5 사이에 서로 다른 재조합 중단점이 존재하였다. 표현형 시험은 묘목 검정과 4개 복제 완전난괴법을 적용하여 온실에서 실시하였다. 유전자형 분석을 위한 조직 샘플은 파종 19일 후에 채취하였다. 파종 약 25일 후에 Leveillula taurica에서 얻은 포자 10000개/ mL의 현탁액을 접종하였다. 접종 22일 후에 포자 밀도 및 잎당 반점의 수에 1~9점의 점수를 매겼으며, 구체적으로는 다음과 같다. 1: 건강한 식물, 3: 잎에 황색 또는 괴사성 반점이 있지만 눈에 뜨이는 포자는 없음, 5: 병변 내부에 포자가 있는 잎의 황색 또는 괴사성 반점, 7: 포자가 잎 아래쪽으로 퍼져 있으나 잎의 50% 미만을 덮음, 9: 포자가 잎 표면의 50% 이상을 덮음. 후속 QTL 분석은 제6번 염색체의 마커 M1과 M3 사이에 저항성 QTL을 배치했다.

표 1. 제6번 염색체 상의 PBC167 유래 Leveillula taurica 저항성을 추적하는 마커.

정방향 프라이머 TGACCCATCGCAAGCCATTT(서열번호 1번), 역방향 프라이머 TGACCCATCGCAAGCCATTT(서열번호 2번), 프로브 1 CCTGCACAATTTTA(서열번호 3번), 프로브 2 CCTGCACGATTTTA(서열번호 4번)를 M1과 함께 사용하였다. M1의 경우, 마커 서열은 서열번호 5번에 해당한다. 정방향 프라이머 CCACACATTGGAGGAGCTAGAATTT(서열번호 6번), 역방향 프라이머 TCCGCCGAGGTTAAAATTACTTCTT(서열번호 7번), 프로브 1 AGGTTGAACATTTAGTATATATACG(서열번호 8번), 프로브 2 TTGAACATTTAGTACATATACG(서열 번호: 9번)는 M2와 함께 사용하였다. M2의 경우, 마커 서열은 서열번호 10번에 해당한다. 정방향 프라이머 GCAAGTTGAGCGTACTGATTACTGA(서열번호 11번), 역방향 프라이머 CCGACAACAGTCGCAGAAGTTATT(서열번호 12번), 프로브 1 ACGCTTCCTTTTCCTTTG(서열번호 13번), 프로브 2 ACGCTTCCTTTGCTACTA(서열번호 14번)는 M3과 함께 사용하였다. M3의 경우, 마커 서열은 서열번호 15번에 해당한다. 정방향 프라이머 GTTATCTTTTATGCGACTTGTGATACTGTAGA(서열번호 16번), 역방향 프라이머 TGTTGCTGTTTAAAGTCTAGGAGCTT(서열번호 17번), 프로브 1 AGAACTTTAGATTAAAAGTCG(서열번호 18번), 프로브 2 ACTTTAGATTCAAAGTCG(서열번호 49번)는 M4와 함께 사용하였다. M4의 경우, 마커 서열은 서열번호 20번에 해당한다. 정방향 프라이머 TGCAGAGTCCTTAAACAAAAAGTAACCT(서열번호 21번), 역방향 프라이머 AGGCCTCCTGAAACAACAGAAAA(서열번호 22번), 프로브 1 AAAATGCAGACATTCTGAAC(서열번호 23번), 프로브 2 ATGCAGACACTCTGAAC(서열번호 24번)는 M5와 함께 사용하였다. M5의 경우, 마커 서열은 서열번호 25번에 해당한다.

실시예 3

제4번 염색체 유전자좌와 조합한 제6번 염색체 유전자좌의 배치

제4번 염색체 상의 QTL이 부여하는 저항성은 우량 계통이 중증의 Leveillula taurica 감염을 일으킨 경우에는 반드시 적절한 대처법이 되지 못한다(도 2). 제6번 염색체 상에 저항성 QTL을 추가하는 것은 중증도의 질병에서는 큰 이점이 되지 않았지만, 놀랍게도 질병의 심각도가 중증인 경우에는 추가적인 저항성을 부여하였다(도 3). 감수성 반복 어미그루 및 저항성 도너 PBC167을 대조군으로 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 온실에서 표현형 시험을 실시하였다. 이 연구에서 반복 어미그루는 질병 등급 9를 기록했고 저항성 도너 PBC167은 질병 등급 1을 기록했다.

제6번 염색체 상의 유전자좌는 다양한 유전적 배경에서 새로운 잡종 조합을 평가하기 위해 다양한 우량 계통으로 유전자 이입되었다. 감수성 반복 어미그루 및 저항성 도너 PBC167을 대조군으로 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 온실에서 표현형 시험을 실시하였다. 해당 연구는 제6번 염색체 상의 저항성 QTL을 제4번 염색체의 저항성 QTL에 추가하면 각종 유전적 배경에서 심각한 수준의 Leveillula taurica 감염증에 대하여 지속적으로 추가적 내성을 의 내성을 부여한다는 것을 확인하였다(도 4).

따라서 제6번 염색체에서 동정한 신규 유전자좌가 부여하는 Leveillula taurica 저항성을 제4번 염색체 상의 저항성 유전자좌와 조합하면 질병 활성도에 상관없이 일관적인 Leveillula taurica 저항성을 향상한 우량 계통을 생산할 수 있다. 표 2는 제4번 염색체 상의 PBC167 유래 Leveillula taurica 저항성 QTL과 연관된 마커로서 유전자좌 선택에 쓰일 수 있는 마커를 제시한다. 제4번 염색체 상의 Leveillula taurica 저항성 QTL의 동정과 해당 유전자좌에 연관된 마커는 미국특허 제9,689,045호에 개시되어 있으며 해당 내용은 본원에 원용되었다.

표 2. 제4번 염색체 상의 PBC167 유래 Leveillula taurica 저항성을 추적하는 마커.

실시예 4

H3 및 PBC167의 Leveillula taurica 저항성 유전자좌의 비교

이미 고추에서 Leveillula taurica 저항원을 발견한 바 있다. 주요 Leveillula taurica 저항성 QTL을 H3 계통의 제6번 염색체에서 동정하였다(Lefebvre et al. 2003). PBC167 계통의 제6번 염색체 상에 존재하는 QTL이 H3 계통의 QTL과 동일한지의 여부를 결정하기 위해, H3과 "Vania"의 교배로 얻은 F1 세대에서 유래한 이중 반수체 계통에 해당하는 Leveillula taurica 감수성 계통 HV-12를 사용하여 Lefebvre에 설명된 대로 매핑 개체군을 개발했다. 후속 QTL 분석으로 Lefebvre에 기재된 제6번 염색체 상의 QTL을 포함하여 3개의 저항성 QTL을 동정하였다. 후속 연구에서 H3에서 유래한 제6번 염색체 상의 저항성 QTL이 주요 저항성 QTL이며 표현형 변이의 최대 26%에 기여한다는 사실을 확인하였다. 그와는 반대로 PBC167의 주요 Leveillula taurica 저항성 QTL은 제4번 염색체 상에 존재한다. PBC167의 제6번 염색체에 있는 부수적 QTL은 질병 수준이 심각한 상황에서 Leveillula taurica 저항성에 가시적인 수준의 영향만을 미친다.

H3의 제6번 염색체와 PBC167의 유전자좌가 유사한 염색체 영역에 위치하고 있으므로, 해당 영역에 대한 핑거프린팅 분석을 실시하였다. 마커 46개를 기반으로 한 후속 비교 분석에서는 H3와 PBC167이 해당 영역에서 65.7%의 유사성을 보이므로, H3 및 PBC167 계통에서 파생된 제6번 염색체 상의 저항성 유전자좌가 구별된다는 결론을 얻을 수 있었다.

본 명세서가 개시하고 청구한 조성물 및/또는 방법은 모두 본 개시에 비추어 보아 과도한 실험 없이도 성립할 수 있다. 바람직한 실시형태를 예로 들어 본 발명의 조성물 및 방법을 설명하였으나, 당업자는 본 발명의 개념, 사상, 범주를 벗어나지 않는 한도 내에서 조성물 및/또는 방법, 또는 해당 방법의 각 단계 혹은 순서를 변형할 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로는, 동일 또는 유사한 결과를 얻는 한 본 명세서에 기재된 제제를 화학적 및 물리학적으로 관련 있는 특정한 제제로 대체할 수 있다. 당업자에게 자명한 대체물 및 변형 일체는 하기 청구범위가 규정하는 본 발명의 취지, 범위 및 개념의 범주에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> Seminis Vegetable Seeds, Inc. <120> POWDERY MILDEW RESISTANT PEPPER PLANTS <130> SEMB:041WO <150> US 62/834,208 <151> 2019-04-15 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tgacccatcg caagccattt 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cgacaatgct ttccttttca tcact 25 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 cctgcacaat ttta 14 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 4 cctgcacgat ttta 14 <210> 5 <211> 601 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (88)..(89) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (205)..(205) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (392)..(392) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (568)..(568) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (573)..(575) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 aaaaaaaggg tgggagtgga gagatgacta agggaagttt gaggaggtag ggaaaagaaa 60 gacaattgtt ttatttcttt cttctgtnnc ccaagaaacc catttttcgt ancccccccc 120 cnccggaccn aaacatggac agttttatta ttggatttca tgaggattaa agtgccacag 180 aaatagtcaa aggcttattc ntagnacctc aaaatgtttc aatgagattc aattgatata 240 gggtattagg agtattttct tgagatccac gtcatgaccc atcgcaagcc attttaaaat 300 tgtgcaggca cacactgatc tcctgagtga tgaaaaggaa agcattgtcg aggatgcgga 360 tggtgagatg ttcgattttc agctttgttg antttaattg tggttatact tgagataata 420 acctgctctg ttcttataga tcaccctgaa gaagatgaag aagctggaga aattgtcctg 480 cagcagttac cttgggaggg aactgatcga gattatgaat atgaggaggt actttcttaa 540 ttgttcgtat tttctgcata tacctgcnaa gannnacttt tagaatgcac tagattgtcc 600 a 601 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ccacacattg gaggagctag aattt 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tccgccgagg ttaaaattac ttctt 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 8 aggttgaaca tttagtatat atacg 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 9 ttgaacattt agtacatata cg 22 <210> 10 <211> 601 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (166)..(166) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (541)..(541) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (547)..(547) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 gcaactgcag attctccggc aggttcaaag ccgacggtaa tcgaaccgga gaaagtcgat 60 tacttcaact tgccttgtcc tgttccttan gaagaaatta atcgtgaagt tataagttag 120 tattttactt catctctcta tttcattgcc tgtttttata attttnataa ccatgttgtc 180 agggtcagct tgcatgcatt ctcccacaca ttggaggagc tagaattttc attcattaaa 240 ggggtttgaa aaataaaaaa cnaaacacac gaagcatcga gggaggttga acatttagta 300 tatatacgtt aaataaagaa gaagtaattt taacctcggc ggagctagaa ttttcacttg 360 ttaagggggt tcaaaaaata ggctcattgt tatgaatcaa ttgattatta gcctgtttgg 420 acaaataatt tgttaatcca atcgattatt gacctgtttg gccaagcttt tgggaggtga 480 aaagtgttta ttttaaaaaa gttattatgt taagaacttt ggctaagctt ttgaagaaaa 540 ntaagtnctt atgagggtag tataagttgt ttttcaatag ccaaaaaagt ggaaaagcta 600 c 601 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gcaagttgag cgtactgatt actga 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ccgacaacag tcgcagaagt tatt 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 13 acgcttcctt ttcctttg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 14 acgcttcctt tgctacta 18 <210> 15 <211> 307 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (133)..(134) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (231)..(231) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (304)..(304) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 cggagnaagt agggtaaaga gtntcgcgtc tcatgttgta gtgtattgtc atcataaatt 60 tcgatttttc tgcttcttag tcacattaga gtttggtttg cttaaagcaa gttgagcgta 120 ctgattactg agnnaatggt tcgatagtag caaaggaaaa ggaagcgtaa taacttctgc 180 gactgttgtc ggtgattaat aacataataa tgacaggata gaaggtttca ncttatttca 240 gccatacggc aatccattgc cttttaagac tatcctaagg agaccgattt cgagctctac 300 gtantca 307 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gttatctttt atgcgacttg tgatactgta ga 32 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 tgttgctgtt taaagtctag gagctt 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 18 agaactttag attaaaagtc g 21 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 19 actttagatt caaagtcg 18 <210> 20 <211> 433 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 20 tgtctgtctc attctgccca agcagaaact taacaatctg catatgtcaa aggaaacagt 60 taatgacagg taaccagctg ccttattttt cggcttacta gtctcacttt ttgggaacta 120 ttatcagtag ttatctttta tgcgacttgt gatactgtag aagaacttta gattaaaagt 180 cgatgaaaaa gctcctagac tttaaacagc aacaaaacct acatatatgc cagaaaacag 240 catacctgag ctcttccttt ccgagctgca atgtgcaatg ctgtattgcc ctttgtgtca 300 acgctattta tcaacttagc gtctgctcta gtcagctcct ccacaacctc aaggttttgt 360 cccttgacag ccatgtgaag tgcagtctgc ccctttttat ccatccggct cgctatcact 420 gcctccttta ttc 433 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tgcagagtcc ttaaacaaaa agtaacct 28 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 aggcctcctg aaacaacaga aaa 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 23 aaaatgcaga cattctgaac 20 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 24 atgcagacac tctgaac 17 <210> 25 <211> 541 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (195)..(195) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 tctgccccga gatgggaatg attcttgcaa atgcttctgc tgtgggcatg cagccaaagt 60 ctgatcaaac tcctgtctcc aaggtgtctt ttttgcagag tccttnaaca aaaagtaacc 120 tgttatcctt ttgcatgaga aaatgcagac actctgaact tttctgcaat ttttctgttg 180 tttcaggagg ccttnagatc atacgaacta gtatttgatg cagtttacac ccctagaaac 240 acacggttat tgcaggaggc tgcagaggtt ggagctacag ttgtgagtgg ggttgagatg 300 ttcgtcaggc aagcactcgg tcagtttaaa ttgttcaccg acggattagg tagctattct 360 ctcctctcta taatttattt acaagaaatt caaagaacct tctgtccctt agccccatat 420 attttgggtt gggggcaata tatttaagca gtgaacataa ctgaagctct attatggaag 480 taaatagtga agcttatacg caaaacttag ctgaacttga cttggttgat tcttaatctc 540 t 541 <210> 26 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 cgatacatgc gcaccactcg acatcttttg tggttctcaa gataacaatc gcaggtaaca 60 kcatctgtaa atccaataga acaacttggn ggtaataata ttccctnaga acacccaagc 120 a 121 <210> 27 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 27 aaaattgcct tagtacgaat taatactctt atatattctc aaaagacata tacccagacc 60 rtacttgtgg gattacaccg gctatgttgt ggttgttttg tgaagacata tttaagtact 120 c 121 <210> 28 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 gttaagcttc tgtgaagcca aaagtntttt tttnncgaag tgtttagtta aaaaagttgc 60 rttgtttggc caagctttta ggaaaaagat aagtatttcg agtcgttgta gaaactgcac 120 t 121 <210> 29 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 29 ctgttcaaga gcaattcagt catttgttct tcaggtaatc ttgtttattc ccaaattgtg 60 scaatcaatt tggttctcat cattggtatc agagacctaa tcatctgacc tgtgcgatgg 120 g 121 <210> 30 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (108)..(108) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 tacacnggta aaactgacaa ggcatcagcg ttagccaata atgaactttt agcgcggaac 60 ytcaagtgac caagtgcatg aaaccaaatc aagaaggtaa agatatgntg atcacctgaa 120 t 121 <210> 31 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 31 tggatatagg aaagatcact tagaaattca acaatctttt tcgtctttaa gagcctgtag 60 rcttctttag catctacaca tcaaaattct ccagacattt caaattatat acagtccacg 120 a 121 <210> 32 <211> 218 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 atgcatgagg gcaatacaag cnttgaatcg aaatgactgt ttaatctcgt ggactgtata 60 taatttgaaa tgtctggaga attttgatgt gtagatgcta aagaagncta caggctcyta 120 aagacgaaaa agattgttga atttctaagt gatctttcct atatccaccc ctaagctgcc 180 agcgctgggg gttcctttct cttggttggc cttcctag 218 <210> 33 <211> 121 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 33 actcttttat tcgtaatgtt catagacgaa agagacgatc cttcgctcct gtgagcagga 60 yggtgttcca atgtgcaagg ccctttcctg aagaggtcga aaattcacga cccattcata 120 g 121

Claims (23)

1. 제6번 염색체 상에 적어도 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 농경학적 우량 고추(Capsicum annuum) 작물에 있어서, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 재조합 염색체 분절은 제6번 염색체 상에 마커 유전자좌 M1(서열번호 5), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15), 마커 유전자좌 M4(서열번호 20), 마커 유전자좌 M5(서열번호 25)로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자좌를 포함하는 작물.
3. 제1항에 있어서, 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자는 고추 CM334 v1.55 지도의 제6번 염색체 상의 230,204,596 bp와 236,762,169 bp 사이에 위치하는 작물.
4. 제1항에 따른 작물의 식물 부분에 있어서, 상기 제1 재조합 염색체 분절을 포함하는 식물 부분.
5. 제4항에 있어서, 상기 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분인 식물 부분.
6. 제1항의 고추(Capsicum annuum) 작물에 있어서, 상기 염색체 분절을 포함하는 종자의 대표 샘플이 ATCC 수탁번호 PTA-125810으로 기탁된 종자인 고추 작물.
7. 제1항에 따른 작물을 생산하는 종자.
8. 제1항에 있어서, 상기 작물이 제4번 염색체 상에 제2 재조합 염색체 분절을 추가로 포함하고, 상기 제2 재조합 염색체 분절은 해당 재조합 염색체 분절이 없는 작물과 비교했을 때 Leveillula taurica에 대한 개선된 저항성을 부여하는 대립유전자를 포함하는 작물.
9. 제8항에 있어서,
   a) 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자는 제4번 염색체 상의마커 유전자좌 NE0236790(서열번호 26번) 및 마커 유전자좌 NE0239147(서열번호 33번)이 플랭킹된 게놈 영역에 존재하거나,
   b) 상기 제2 재조합 염색체 분절은 제4번 염색체 상의 마커 유전자좌 NE0238899(서열번호 27번), 마커 유전자좌 NE0238734(서열번호 28번), 마커 유전자좌 NE0240256(서열번호 29번), 마커 유전자좌 NE0237985(서열번호 30번), 마커 유전자좌 NE0239638(서열번호 31번), 마커 유전자좌 NCANN005704056(서열번호 32번)로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 포함하는 작물.
10. 제8항에 따른 작물의 식물 부분에 있어서, 상기 제2 재조합 염색체 분절을 포함하는 식물 부분.
11. 제10항에 있어서, 상기 식물 부분은 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃, 또는 화분인 식물 부분.
12. 제8항에 따른 작물을 생산하는 종자.
13. Leveillula taurica에 대한 저항성을 개선한 농경학적 우량고추(Capsicum annuum) 작물을 생산하는 방법에 있어서, 제6번 염색체 상의 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번) 및 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 재조합 염색체 분절 내의 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 상기 작물에 유전자 이입하는 단계를 포함하고, 유전자 이입된 상기Leveillula taurica 저항성 대립유전자는 해당 대립유전자가 없는 작물과 비교했을 때 상기 작물에 Leveillula taurica에 대한 저항성을 부여하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 유전자 이입 단계는
    a) 상기 재조합 염색체 분절을 포함하는 작물을 그 자체, 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추(Capsicum annuum) 작물과 교배하여 하나 이상의 자손 작물을 생산하는 단계;
    b) 상기 재조합 염색체 분절을 포함하는 자손 작물을 선발하는 단계를 포함하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 자손 작물의 선발 단계는 마커 유전자좌 M1(서열번호 5번), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10번), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번), 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번), 마커 유전자좌 M5(서열번호 25번)를 포함하는 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
16. 제13항에 있어서, 상기 유전자 이입이 역교배, 마커 보조 선발 또는 Leveillula taurica 저항성 검정을 포함하는 방법.
17. 제13항에 있어서, 상기 자손 작물이 F₂~F₆ 자손 작물이거나, 상기 역교배가 2~7세대의 역교배를 포함하는 방법.
18. 제13항의 방법에 의해 수득할 수 있는 고추(Capsicum annuum) 작물.
19. 제 13항에 있어서, 상기 작물은 제4번 염색체 상의 마커 유전자좌 NE0236790(서열번호 26번) 및 마커 유전자좌 NE0239147(서열번호 33번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 재조합 염색체 분절 내에 추가로 유전자 이입된 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 추가로 포함하는 방법.
20. Leveillula taurica에 저항성을 나타내는 고추(Capsicum annuum) 작물을 선발하는 방법에 있어서,
    a) 제1항에 따른 고추(Capsicum annuum) 작물을 그 자체 또는 상이한 유전자형의 두 번째 고추(Capsicum annuum) 작물과 교배하여 하나 이상의 자손 작물을 생산하는 단계;
    b) 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자를 포함하는 자손 작물을 선발하는 단계를 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 자손 작물 선발 단계는 상기 Leveillula taurica 저항성 대립유전자에 유전적으로 연계된 마커 유전자좌를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 자손 작물 선발 단계는
    a) 제6번 염색체 상의 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번) 및 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번)에 의해 상기 작물의 게놈에 플랭킹된 염색체 분절 내에서, 또는 해당 분절과 유전적으로 연계된 마커 유전자좌를 검출하는 단계, 또는
    b) 마커 유전자좌 M1(서열번호 5번), 마커 유전자좌 M2(서열번호 10번), 마커 유전자좌 M3(서열번호 15번), 마커 유전자좌 M4(서열번호 20번), 마커 유전자좌 M5(서열번호 25번)를 포함하는 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 자손 식물은 F₂~F₆ 자손 식물이거나, 상기 자손 식물 생산 단계는 역교배를 포함하는 방법.

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