JP2021526375A - 検出方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
Description
本発明は、便試料からの真核生物核酸の抽出ならびに腸疾患の診断および処置のための該核酸の使用に関する。
胃腸障害、例えば胃腸がんならびに他の消化器疾患、例えば潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群およびクローン病が蔓延している。米国では、胃腸障害は、毎年6000万〜7000万人が罹患していると推計されている。一部の障害では、早期のスクリーニングおよび診断により死亡率の減少および患者の生活の質の改善がもたらされている。しかしながら、標準的な診断方法、例えば結腸内視鏡検査は侵襲的で時間がかかり、比較的高額な費用を伴う。ヒトおよび動物の両方の胃腸障害を診断する非侵襲的な方法が継続的に必要とされている。
本明細書において、表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルを、対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルに対する、該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルの差は、該対象が結腸直腸新形成を有することを示す、該比較する工程を含む、対象において結腸直腸新形成を検出する方法を提供する。表3に列挙されたバイオマーカー遺伝子から選択される1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の、対象の由来便試料から抽出した真核生物核酸におけるバリアントアレル頻度を測定する工程;該便試料における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度を、対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度と比較する工程であって、該対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度に対する、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度の差は、該対象が結腸直腸がんを有するか、または結腸直腸がんのリスクがあることを示す、該比較する工程を含む、対象において結腸直腸新形成を検出する方法も提供する。表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子のうちの任意のものから選択される2つまたはそれより多くのバイオマーカー遺伝子の、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子に対する、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルとの、該生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルの差は、結腸直腸がんの該分子サブタイプを示す、該比較する工程を含む、対象において結腸直腸がんの分子サブタイプを検出する方法も提供する。
この好ましい態様の説明は、本発明の書面による説明全体の一部とみなされるべき添付の図面との関連において読まれることを意図している。図面の図は必ずしも均一の縮尺ではなく、本発明のある特定の特長を、明瞭性および簡潔性のために縮尺を誇張して、あるいはいくぶん模式的な形態で示している場合があり得る。本説明において、相対語、例えば「水平な」、「垂直な」、「上」、「下」、「上部」および「下部」ならびにその派生形(例えば、「水平に」、「下方に」、「上方に」など)は、論考している当該図面の図を説明しているときのそのとおりの向きまたは論考している当該図面の図に示されているとおりの向きを示していると解釈されたい。このような相対語は説明の都合上のものであり、通常、特定の向きを必要とすることを意図するものではない。例えば、「内側に」に対して「外側に」、「縦方向」に対して「横方向」などの用語は、適宜、互いに対するもの、あるいは長軸または回転軸もしくは回転中心に対するものと解釈されたい。結合に関するカップリングなどの用語、例えば「連結される」および「相互連結される」は、そうでないことを明白に記載していない限り、構造体が互いに直接または介在構造体を介して間接的にいずれかで固定または結合されている関係、ならびに可動性の結合もしくは関係または固定された結合もしくは関係の両方を示す。用語「機能的に連結される」は、直接関係のある構造体が、該関係のおかげで意図されたとおりに機能することが可能となるような結合、カップリングまたは連結である。1つの機械しか図示されていない場合、用語「機械」は、本明細書で論考している方法論の任意の1つまたは複数を実施するための一組(または複数の組)の指示を単独または共同で実行する任意の機械集合体も包含していると解釈されたい。特許請求の範囲において、ミーンズ・プラス・ファンクション節は、使用されている場合は、書面による説明または図面に記載された、提案された、あるいは自明となる記載の機能を果たすための構造、例えば、構造的均等物だけでなく等価構造も包含していることを意図する。
また、生物学的試料中、例えば便試料中の選択された便由来真核生物RNAバイオマーカーを検出および定量するためのキットを提供する。したがって、パッケージ製品(例えば、貯蔵、搬送または販売のための濃縮濃度または使用準備済濃度でパッケージングされた1種または複数種の本明細書に記載の組成物が内蔵された滅菌容器)およびキットもまた本発明の範囲内である。該製品は、1種または複数種の本発明の組成物が内蔵された容器(例えば、バイアル、ビン、ボトル、バッグ、マイクロプレート、マイクロチップまたはビーズ)を含み得る。また、該製造物品に、例えば包装材、使用のための使用説明書、シリンジ、送達デバイス、バッファーまたは他の対照試薬をさらに含めてもよい。
ヒトの便の収集:患者に、便座に取り付けたバケツ内に排便するように依頼し、得られた試料をフリーザー内に、ハリコフ(Kharkiv)国立医科大学(ハリコフ,ウクライナ)に輸送されるまで保存した。便を50 mL容コニカルチューブ内にアリコートに分け、-80℃で保存した。この試料をハリコフ国立医科大学からドライアイス下でCapital Biosciences(ゲーサーズバーグ,MD)に搬送し、即座に-80℃のフリーザーに移した。そこから、試料をドライアイス下でBioGenerator Labs(セントルイス,MO)に搬送し、ここで、試料を、抽出まで-80℃のフリーザー内に保存した。
全核酸の抽出:各便試料を50 mL容コニカルチューブ内に入れた。およそ1,000〜25,000 mgの便を各チューブに添加した。さらに20〜40 mLの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Sigma-Aldrich)と0.05%のTween-20(Sigma-Aldrich)および0.0002%のRNAse Inhibitor(Sigma-Aldrich)との混合物を含有するものであった。便を溶液中に懸濁させ、およそ0〜10℃で0〜10分間回転させた。この溶液を1000 rpmで4℃にて10分間遠心分離し、上清みを廃棄した。およそ4〜10 mLのEasyMag(登録商標)Lysis Buffer(bioMerieux)をペレットに添加し、このペレットを溶液中に再懸濁させた。この溶液を2500〜3500 rpmで20〜25℃にて10〜15分間遠心分離した。分画遠心分離中、溶液は3層に分離した。底層には固形細胞内デブリが含まれており、中間層はヒト核酸が濃縮された親水性層であり、上層は疎水性の脂質層であった。上部の2つの層を新たな15 mL容コニカルチューブに移し、この溶液を2500 rpmで20〜25℃にて10分間、再度遠心分離した。この遠心分離工程の結果、3層への分離がみられた:底層は固形細胞内デブリであり、中間層はヒト核酸が濃縮された親水性層であり、上層は疎水性の脂質層であった。この溶液からの大型デブリをスクリーニングするため、20uL容ピペットチップを1mL容ピペットチップ上に配置し、2mLの親水性層を15mL容チューブからピペッティングし、EasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に移した。さらに、60 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を1.5mL容チューブ内にピペッティングし、氷上に置いた。次いで、先の工程で使用したものと同じEasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に、先で使用した15mL容チューブ内の同じ溶液のさらに2mLの親水性層を同じ手法を用いて再ロードし、大型デブリをスクリーニングして取り出した。さらに20 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。上記のとおり、ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を、既に最初の70 uLの溶出液が入っている元の1.5mL容チューブ内にピペッティングし、合わせた溶液を氷上に置いた。
抽出結果:1〜2 uLの上記で抽出した各試料を、全核酸およびRNA完全性について、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて評価した。この試料を定性的および定量的に解析した。電気泳動解析を用いて、抽出されたRNAの品質を確認した。電気泳動ファイルを、各試料のバンドをRNAラダーのサイズマーカーによって示されたバンドと比較し、18Sおよび28SのリボソームRNA(rRNA)バンドを確認することにより読み取った。このrRNAバンドは、標準化ラダーにおける2,000ヌクレオチドマーカー付近の2つの太い顕著なバンドである。定性的には、充分なバンディングおよび濃いバンド強度により、さらなる解析、例えばマイクロアレイシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸シーケンシング、分子バーコーディングまたはプローブ-キャプチャーに充分なインタクトな核酸が入手可能であることが示された。電気泳動分離図は、RNA完全性数値(RIN)、全RNA質量および全rRNA質量の定量を有する各電気泳動ファイルのグラフ表示である。定量的には、RINが大きいほど、全RNA質量が多く、かつ、全rRNA質量が多いほど、試料が、さらなる解析、例えばマイクロアレイシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸シーケンシング、分子バーコーディングまたはプローブ-キャプチャーに有用であろう可能性が高い。
11例の試料を、安定化バッファーを用いた試験の実施に選択した。これらの試料を5グラムのアリコートに分割し、3つのコホート:コホート1(n=11)、コホート2(n=11)およびコホート3(n=8)にした。コホート1の試料は、上記の方法を用いて即座に抽出した(図2A)。コホート2の試料は安定化バッファー中でインキュベートし、室温で24時間保存した後、上記の方法を用いて抽出した(図2B)。コホート3の試料は安定化バッファー中でインキュベートし、室温で48時間保存した後、上記の方法を用いて抽出した(図2C)。
330例の試料を、Affymetrix GeneChip(商標)Human Transcriptome Array 2.0(Santa Clara,CA)を用いた解析に選出した。およそ100 ngのDNaseフリー糞便中RNAを、Affymetrix GeneChip(商標)Human Transcriptome Array 2.0との後続ハイブリダイゼーションを伴うAmbio WT-picoキットを製造業者のプロトコルのとおりに用いて増幅した。すべての試料を、Signal Space Transformation-Robust Multiarray Analysis(SST-RMA)を用いてAffymetrix Expression Console(商標)で正規化した。
Affymetrix Microarray内の70,523の転写物クラスターのうち、274個の遺伝子に対応する転写物クラスターのサブセットを選択し、結腸直腸がんを有すると診断された個体由来の患者試料を、大腸癌サブタイピングコンソーシアム(CRCSC)によって規定されたCRCのコンセンサス分子サブタイプ(CMS)を用いてアノテーションした(図4A)。CRCSC分類器は、分子サブタイプクラス分類の精度を向上させる能力に関する各遺伝子の重要度に基づいて組織化されている。転写物クラスターの発現を遺伝子レベルで、各遺伝子と関連している転写物クラスターの発光量の中央値を用いてまとめた。遺伝子発現データを遺伝子レベルおよび全コホート間で、発現レベルの中央値を用いて正規化した。正規化データを、R Package CMS Classifierにおいて規定されたランダムフォレスト分類器への入力として使用し、コンセンサス分子サブタイプをラベリングした。
ヒトの便の収集:患者に、便座に取り付けたバケツ内に排便するように依頼し、得られた試料をクーリエ便に引き渡し、ワシントン大学医学部の消化器疾患研究コアセンター(Digestive Diseases Research Core Center)(セントルイス,ミズーリ州)に輸送した。便を50 mL容コニカルチューブ内にアリコートに分け、-80℃で保存した。そこから、試料をドライアイス下でBioGenerator Labs(セントルイス,MO)に輸送し、ここで、試料を、抽出まで-80℃のフリーザー内に保存した。この収集に用いられた患者はワシントン大学医学部による同意を承諾した。また、ワシントン大学医学部の内部審査委員会がこの収集に関する倫理面の監視を提供した。
ライブラリーの調製:seRNAのライブラリーを、398種のカスタムアンプリコンからなるIllumina Targeted RNA Custom Panelを用いて作製した。ライブラリーの調製は、ProtoScript II Reverse Transcriptase(Illumina)を用いた最初のcDNA合成工程、オリゴプールの標的化対象seRNAとのハイブリダイゼーション工程、Illumina試薬(AM1、ELM4、RSB、UB1)を用いたオリゴ体の伸長工程、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅工程に依存した。全質量入力は200〜400ngの範囲であり、使用したPCRサイクルの回数は26〜28回の範囲であった。ライブラリーの増幅後、cDNA捕捉物を、Illumina試薬(RSB,AMPure,XPビーズ EtOh)を用いて洗浄した。ライブラリー調製物を量および品質について、Agilent BioAnalyzerおよびQubit Fluorometric Quantitation(Thermo Fisher)を用いて解析した。この解析で記載した試料はすべて、初期品質チェックに合格し、次世代シーケンシングの候補であった。
4つの試料をマイクロアレイおよびシーケンシングの両方において評価した。複数のプラットフォームでの398種の転写物の線形回帰により、中程度の再現性(ピアソンのrの範囲=0.48〜0.63)が示された。シーケンシングでは、低発光の転写物のシグナル範囲によって明示されるように、マイクロアレイと比べて増加した分解度が示された(図6)。
教師なし主成分分析(PCA)を、13例すべてのユニーク試料のRNAシーケンシングデータに対して行なった。クラスタリングは、CRCを有する患者、腺腫を有する患者および新生物所見のない患者の間で観察された。がんを有する患者由来の試料で、最も大きな偏差および他の患者集団との分離が示され、一方、新生物所見のない患者由来の試料で、より狭いクラスタリングが示された(図7)。
バリアントコーリングおよびアノテーション:Integrative Genomics Viewerを使用し、CRC腫瘍形成に関与するバリアントを同定した。アンプリコンパネルは、398個の捕捉遺伝子のゲノム空間の約3%をカバーした。例示的なドライバー突然変異を図9に示す。図8に示すように、本発明者らは、いくつかの潜在的ドライバー突然変異を同定した。このような突然変異には、高リスク腺腫を有する患者でのAPCにおけるミスセンス突然変異(13%のバリアントアレル頻度(VAF))、高リスク腺腫を有する患者でのSMAD4におけるミスセンス突然変異(17%のVAF)、ステージIのCRCを有する患者でのMAPK3の調節領域における3'欠失(7%のVAF)、結腸内視鏡検査で所見なしの患者でのPIK3CAにおけるミスセンス突然変異(12%のVAF)、高リスク腺腫を有する患者でのKRASにおけるミスセンス突然変異(3%のVAF)、および高リスク腺腫を有する患者でのCDH1におけるミスセンス突然変異(2%のVAF)が含まれた(図8)。
ヒトの便の収集:便試料を、ワシントン大学医学部の消化器疾患研究コアセンター(DDRCC)(St.Louis,MO)で入手した。すべての患者に便試料収集キットが郵便で送付され、キットはクーリエ便によってDDRCCに送り返された。臨床データ(例えば、個体群統計情報、結腸内視鏡検査結果など)はDDRCCによって収集された。各試料を便中血液について市販の免疫化学的便検査(FIT)(Polymedco,OC-Light S FIT)を用いて試験した後、-80℃で凍結させた。この試験のために集められた各患者には結腸内視鏡検査が行なわれ、陽性所見を有した患者には生検およびその後、新生物のクラス分類を決定するための組織病理学的審査が行なわれた。腺腫のクラス分類は、組織病理学検査(良性に対して前がん性)、ポリープの数、ポリープのサイズおよび分化度に基づいて階層化した。がんのクラス分類は、American Joint Committee on Cancer(AJCC)7 TNMシステムに基づいて階層化した。患者が結腸内視鏡検査において所見なしであった場合は健常とラベリングした。
パネル転写物:639種のアンプリコンのカスタムキャプチャーパネルをライブラリー調製のためにIllumina DesignStudioにおいて開発した。カスタムキャプチャープローブは、以前に実施された研究および文献を用いて選択した408種の転写物と関連していた。
全核酸の抽出:各便試料を50 mL容コニカルチューブ内に入れた。およそ6,000〜25,000 mgの便を各チューブに添加した。さらに20〜40 mLの溶液を各チューブに添加した。この溶液は、10mMのトリズマ塩基(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、0.05%のTween-20(Sigma-Aldrich)を含む1mM EDTA(Sigma Aldrich)および0.0002%のRNase Inhibitor(Sigma-Aldrich)の混合物を含有するpH7.5のものであった。この溶液を1000 rpmで4℃にて10分間遠心分離し、上清みを廃棄した。およそ4〜10 mLのEasyMag(登録商標)Lysis Buffer(bioMerieux,Durham,NC)をペレットに添加し、このペレットを溶液中に再懸濁させた。この溶液を2500〜3500 rpmで20〜25℃にて10〜15分間遠心分離した。分画遠心分離中、溶液は3層に分離した。底層には固形細胞内デブリが含まれており、中間層はヒト核酸が濃縮された親水性層であり、上層は疎水性の脂質層であった。上部の2つの層を新たな15 mL容コニカルチューブに移し、この溶液を2500 rpmで20〜25℃にて15分間、再度遠心分離した。この遠心分離工程の結果、3層への分離がみられた:底層は固形細胞内デブリであり、中間層はヒト核酸が濃縮された親水性層であり、上層は疎水性の脂質層であった。この溶液からの大型デブリをスクリーニングするため、10 uL容ピペットチップを1 mL容ピペットチップ上に配置し、2 mLの親水性層を15 mL容チューブからピペッティングし、EasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に移した。さらに、50 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を1.5 mL容チューブ内にピペッティングし、氷上に置いた。次いで、先の工程で使用したものと同じEasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に、先で使用した15 mL容チューブ内の同じ溶液のさらに2 mLの親水性層を同じ手法を用いて再ロードし、大型デブリをスクリーニングして取り出した。さらに20 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。上記のとおり、ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を、既に最初の70 uLの溶出液が入っている元の1.5 mL容チューブ内にピペッティングし、合わせた溶液を氷上に置いた。先で使用した同じ15 mLの溶液からのさらに2 mLの親水性層を、新たなEasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に同じ手法を用いて添加し、大型デブリをスクリーニングして取り出した。さらに、20 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を、最初の2回の溶出液が入っている1.5 mL容チューブ内にピペッティングし、合わせた溶液を氷上に置いた。次いで、先の工程で使用したものと同じEasyMag(登録商標)Disposableカートリッジ(bioMerieux)に、先で使用した15 mL容チューブ内の同じ溶液のさらに2 mLの親水性層を同じ手法を用いて再ロードし、大型デブリをスクリーニングして取り出した。さらに20 uLのEasyMag(登録商標)Magnetic Silica(bioMerieux)をカートリッジに添加した。ビーズを溶液中に0.5〜1分間、ピペットを用いて混合した。上記のとおり、ビーズに結合された核酸をバッファー溶液中に、Specific A Protocolを製造業者の指示書に従って用いて溶出させた。溶出された核酸の容量は70 uLであった。この核酸溶液を、既に最初の3回の70 uLの溶出液が入っている元の1.5 mL容チューブ内にピペッティングし、合わせた溶液を氷上に置いた。
抽出結果:1〜2 uLの上記で抽出した各試料を、全核酸およびRNA完全性について、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて評価した。この試料を定性的および定量的に解析した。電気泳動解析を用いて、抽出されたRNAの品質を確認した。電気泳動ファイルを、各試料のバンドをRNAラダーのサイズマーカーによって示されたバンドと比較し、18Sおよび28SのリボソームRNA(rRNA)バンドを確認することにより読み取った。このrRNAバンドは、標準化ラダーにおける2,000ヌクレオチドマーカー付近の2つの太い顕著なバンドである。定性的には、充分なバンディングおよび濃いバンド強度により、さらなる解析、例えばマイクロアレイシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸シーケンシング、分子バーコーディング、アンプリコンシーケンシングまたはプローブ-キャプチャーに充分なインタクトな核酸が入手可能であることが示された。電気泳動分離図は、RNA完全性数値(RIN)、全RNA質量および全rRNA質量の定量を有する各電気泳動ファイルのグラフ表示である。定量的には、RINが大きいほど、全RNA質量が多く、かつ、全rRNA質量が多いほど、試料が、さらなる解析、例えばマイクロアレイシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸シーケンシング、分子バーコーディング、アンプリコンシーケンシングまたはプローブ-キャプチャーに有用であろう可能性が高い。また、試料をRNA濃度についてもQubit 4.0 Fluorometerを用いて評価した。RNA濃度は、溶出液中に存在するRNA選択的に結合するQubitアッセイ内の構成要素によって生成される蛍光の定量によって求められる。定量的には、RNA濃度が高いほど、試料が、さらなる解析、例えばマイクロアレイシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸シーケンシング、分子バーコーディング、アンプリコンシーケンシングまたはプローブ-キャプチャーに有用であろう可能性が高い。
ライブラリーの調製:seRNAのライブラリーを、639種のカスタムアンプリコンからなるIllumina Targeted RNA Custom Panelを用いて作製した。ライブラリーの調製は、ProtoScript II Reverse Transcriptase(Illumina,San Diego,CA)を用いた最初のcDNA合成工程、オリゴプールの標的化対象seRNAとのハイブリダイゼーション工程、Illumina試薬(AM1、ELM4、RSB、UB1)を用いたオリゴ体の伸長工程、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅工程に依存した。全質量入力は200〜400 ngの範囲であり、使用したPCRサイクルの回数は28回〜30回の範囲であった。ライブラリーの増幅後、cDNA捕捉物を、Illumina試薬(RSB,AMPure,XPビーズ EtOH)を用いて洗浄した。ライブラリー調製物を量および品質について、Agilent 2100 BioAnalyzerおよびQubit 4.0 Fluorometer(Thermo Fisher)を用いて解析した。この解析で記載した試料はすべて、初期品質チェックに合格し、下流解析の候補であった。
ランダムフォレストモデルを、154人の患者のトレーニングセットと13個の全候補フィーチャーを用いて構築した。5,000の決定木をブートストラップトレーニング試料から構築し;各ノードスプリットをGini重要度によって最適化し;各ツリーは最大深さに到達するまで構築した。具体的な態様を本明細書で論考しているが、より多くの数および/またはより少ない数の決定木、より多くの数および/またはより少ない数の候補フィーチャーなどを用いる任意の適当なモデル、例えばランダムフォレストモデルが作成され得ることは認識されよう。さらに、他の型のモデル、例えばディープラーニングモデルまたはサポートベクターモデルも、多様なパラメータを用いて使用され得よう。このランダムフォレストモデルでは差次的発現転写物、未加工GAPDH値、年齢および喫煙状態などの候補フィーチャーを使用した。具体的な態様を本明細書で論考しているが、すべての情報提供的フィーチャーおよび/または情報提供的フィーチャーの選択されたサブセットを用いる任意の適当なモデル、例えばランダムフォレストモデルが作成され得ることは認識されよう。
Claims (50)
- a)表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルを、対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルに対する、該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルの差は、該対象が結腸直腸新形成を有することを示す、該比較する工程
を含む、対象において結腸直腸新形成を検出する方法。 - 対象がヒトである、請求項1記載の方法。
- 結腸直腸新形成が、結腸直腸がん、高リスク腺腫、中リスク腺腫および低リスク腺腫からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 便由来真核生物RNAバイオマーカーが、ACY1、TNFRSF10B、DST、EGLN2、PER3、CTNNB1、ACHE、SMAD4、EDN1、ERBB2およびGAPDHからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記核酸が、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsnoRNA、またはRNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsnoRNAのうちの任意のものの組合せを含む、請求項1記載の方法。
- 前記発現レベルが、核酸シーケンシング、マイクロアレイシーケンシング、分子バーコーディング、アンプリコンシーケンシング、プローブキャプチャー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ddPCR、dPCR、RT-PCRまたはRT-qPCRによって測定される、請求項1記載の方法。
- 対象の個体群統計情報を明らかにする工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 対象に対して免疫化学的便検査(FIT)を施行する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 結腸直腸新形成を有するか、または結腸直腸新形成のリスクがある対象のための臨床計画を選択する方法であって、
a)表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの、該対象由来の便試料中に存在する真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルを、対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルに対する、該便試料における、該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの測定された発現レベルの差は、該対象が結腸直腸新形成を有するか、または結腸直腸新形成のリスクがあることを示す、該比較する工程;
c)診断手順もしくは処置または診断手順と処置の組合せを施行する工程
を含む、前記方法。 - 対象がヒトである、請求項9記載の方法。
- 結腸直腸新形成が、結腸直腸がん、高リスク腺腫、中リスク腺腫および低リスク腺腫からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 便由来真核生物RNAバイオマーカーが、ACY1、TNFRSF10B、DST、EGLN2、PER3、CTNNB1、ACHE、SMAD4、EDN1、ERBB2およびGAPDHからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 前記核酸が、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsnoRNA、またはRNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsnoRNAのうちの任意のものの組合せを含む、請求項9記載の方法。
- 前記発現レベルが、核酸シーケンシング、マイクロアレイシーケンシング、分子バーコーディング、アンプリコンシーケンシング、プローブキャプチャー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ddPCR、dPCR、RT-PCRまたはRT-qPCRによって測定される、請求項9記載の方法。
- 対象の個体群統計情報を明らかにする工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 対象に対して免疫化学的便検査(FIT)を施行する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 臨床計画が診断手順または処置を含む、請求項9記載の方法。
- 診断手順が結腸内視鏡検査を含む、請求項9記載の方法。
- 処置が、手術、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法を含む、請求項9記載の方法。
- 化学療法が、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカンまたはそれらの組合せの投与を含む、請求項19記載の方法。
- 標的療法が、ベバシズマブ(抗VEGF)、ラムシラマブ(抗VEGFR2)、アフリベルセプト、レゴラフェニブ、セツキシマブ(抗EGFR)、パニツムマブ、トリプフルリジン-チピラシルまたはそれらの組合せの投与を含む、請求項19記載の方法。
- a)表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの発現レベルを含むフィーチャーの所定のセットに基づいて結腸直腸新形成の存在を判定するように構成されるランダムフォレストモデルを作成する工程;
b)表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの、対象における発現レベルを測定する工程;および
c)表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される該2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの、対象における発現レベルに基づいて、結腸直腸新形成の存在を、該ランダムフォレストモデルによって判定する工程
を含む、対象において結腸直腸新形成を検出する方法。 - フィーチャーの所定のセットが個体群統計情報を含む、請求項22記載の方法。
- ランダムフォレストモデルによって陽性免疫化学的便検査(FIT)強制モデルを適用する工程を含む、請求項22記載の方法。
- 前記2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーが、ACY1、TNFRSF10B、DST、EGLN2、PER3、CTNNB1、ACHE、SMAD4、EDN1、ERBB2およびGAPDHからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- a)患者由来の便試料が、対象由来の便試料中に存在する真核生物核酸において、表1もしくは表2または表1と表2の組合せに列挙されたバイオマーカーから選択される2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29種の便由来真核生物RNAバイオマーカーの増加したレベルを発現していると判定する工程;および
b)該対象に対して結腸内視鏡検査、手術、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法を施行する工程
を含む、対象の結腸直腸新形成を処置する方法。 - a)表3に列挙されたバイオマーカー遺伝子から選択される1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸におけるバリアントアレル頻度を測定する工程;
b)該便試料における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度を、対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度と比較する工程であって、該対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度に対する、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度の差は、該対象が結腸直腸がんを有するか、または結腸直腸がんのリスクがあることを示す、該比較する工程
を含む、対象において結腸直腸新形成を検出する方法。 - a)表3に列挙されたバイオマーカー遺伝子から選択される1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸におけるバリアントアレル頻度を測定する工程;
b)該便試料における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度を、対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子の測定されたバリアントアレル頻度と比較する工程であって、該対照における、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度に対する、該1つまたは複数のバリアントバイオマーカー遺伝子のバリアントアレル頻度の差は、該対象が結腸直腸がんを有するか、または結腸直腸がんのリスクがあることを示す、該比較する工程
を含む、対象が結腸直腸がんを有するかどうか、または結腸直腸がんのリスクがあるかどうかを判定する方法。 - 結腸直腸がんを有するか、または結腸直腸がんのリスクがある対象のための臨床計画を選択する方法であって、
a)該対象由来の生物学的試料中の真核生物核酸における、表3に列挙されたバイオマーカー遺伝子から選択されるバイオマーカー遺伝子の1つまたは複数のバリアントアレルを検出する工程であって、該バリアントが結腸直腸がんの腫瘍形成と関連している、該検出する工程;
b)診断手順もしくは処置または診断手順と処置の組合せを施行する工程
を含む、前記方法。 - a)対象由来の便試料中に存在する真核生物核酸における、表3に列挙されたバイオマーカー遺伝子から選択されるバイオマーカー遺伝子の1つまたは複数のバリアントアレルを検出する工程であって、該バリアントが結腸直腸がんの腫瘍形成と関連している、該検出する工程;および
b)該対象に対して結腸内視鏡検査、手術、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法を施行する工程
を含む、対象の結腸直腸がんを処置する方法。 - バリアントアレルが、サイレント突然変異、ミスセンス突然変異、挿入、欠失、フレームシフト突然変異および/またはナンセンス突然変異を含む、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的試料が便試料である、請求項27〜31のいずれか一項記載の方法。
- 便試料がヒトの便試料である、請求項27〜32のいずれか一項記載の方法。
- 前記核酸が、cDNA、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsno RNA、またはcDNA、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsno RNAのうちの任意のものの組合せを含む、請求項27〜33のいずれか一項記載の方法。
- 前記発現レベルが、核酸シーケンシング、マイクロアレイシーケンシング、分子バーコーディング、プローブキャプチャー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ddPCR、RT-PCRまたはRT-qPCRによって測定される、請求項27〜34のいずれか一項記載の方法。
- 前記臨床計画が、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法および標的療法のうちの1つまたは複数を含む、請求項27〜35のいずれか一項記載の方法。
- a)表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子のうちの任意のものから選択される2つまたはそれより多くのバイオマーカー遺伝子の、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子に対する、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルとの、該生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルの差は、結腸直腸がんの該分子サブタイプを示す、該比較する工程
を含む、対象において結腸直腸がんの分子サブタイプを検出する方法。 - a)表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子のうちの任意のものから選択される2つまたはそれより多くのバイオマーカー遺伝子の、対象由来の便試料から抽出した真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、該対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子に対する、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルとの、該生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルの差は、該対象が結腸直腸がんの分子サブタイプを有するか、または結腸直腸がんの分子サブタイプのリスクがあることを示す、該比較する工程
を含む、対象が結腸直腸がんの分子サブタイプを有するかどうか、または結腸直腸がんの分子サブタイプのリスクがあるかどうかを判定する方法。 - a)ゲノム不安定性、マイクロサテライト不安定性または免疫浸潤に関係している表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の任意のものから選択される2つまたはそれより多くのバイオマーカー遺伝子の、患者由来の便試料中の真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較する工程であって、対照における、該2つまたはそれより多くの遺伝子の測定されたレベルに対する、マイクロサテライト不安定性または免疫浸潤に関係している該結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の変化したレベルは、該患者が免疫療法の候補であることを示す、該比較する工程;および
c)免疫療法を施行する工程
を含む、患者の結腸直腸がんを処置する方法。 - 免疫療法が阻害性チェックポイント分子または免疫チェックポイント阻害薬である、請求項39記載の方法。
- 結腸直腸がんを有するか、または結腸直腸がんのリスクがある対象のための臨床計画を選択する方法であって、
a)表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の任意のものから選択される2つまたはそれより多くのバイオマーカー遺伝子の、該対象由来の生物学的試料中の真核生物核酸における発現のレベルを測定する工程;
b)該生物学的試料における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルを、対照における、該2つまたはそれより多くの結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子の測定された発現レベルと比較し、それにより結腸直腸がんの該分子サブタイプを同定する工程;
c)診断手順もしくは処置または診断手順と処置の組合せを施行する工程
を含む、前記方法。 - a)患者由来の便試料が、対象由来の便試料中に存在する真核生物核酸において、表4に列挙された結腸直腸新生物分子サブタイプバイオマーカー遺伝子のうちの任意のものの増加したレベルを発現していると判定する工程;および
b)該患者に対して結腸内視鏡検査、手術、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法を施行する工程
を含む、結腸直腸新形成を処置する方法。 - 結腸直腸新生物分子サブタイプが、CMS1、CMS2、CMS3およびCMS4からなる群より選択される、請求項37〜42のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的試料が便試料である、請求項37〜43のいずれか一項記載の方法。
- 便試料がヒトの便試料である、請求項37〜44のいずれか一項記載の方法。
- 前記核酸が、cDNA、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsno RNA、またはcDNA、RNA、全RNA、mRNA、seRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNAもしくはsnoRNAのうちの任意のものの組合せを含む、請求項37〜45のいずれか一項記載の方法。
- 前記発現レベルが、核酸シーケンシング、マイクロアレイシーケンシング、分子バーコーディング、プローブキャプチャー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ddPCR、RT-PCRまたはRT-qPCRによって測定される、請求項37〜46のいずれか一項記載の方法。
- 前記臨床計画が、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法および標的療法のうちの1つまたは複数を含む、請求項37〜47のいずれか一項記載の方法。
- a)対照に対して、患者由来の便試料が、対象由来の便試料中に存在する真核生物核酸において、表1もしくは表2または表1と表2の組合せまたは表3または表4に列挙されたバイオマーカーから選択される2つまたはそれより多くの便由来真核生物バイオマーカーの増加したレベルを含むと判定する工程;
b)該判定に基づいて、該患者は結腸直腸新形成のリスクがあると判定する工程;および
c)該患者に対して結腸内視鏡検査を施行する工程
を含む方法。 - 便試料を準備する工程をさらに含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
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"A Stool Multitarget mRNA Assay for the Detection of Colorectal Neoplasms", COLORECTAL CANCER: METHODS AND PROTOCOLS, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 1765, JPN6023019633, January 2018 (2018-01-01), pages 14 - 217, ISSN: 0005060799 * |
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