JP2021519580A - キメラ貪食受容体のための発現ベクター、遺伝子改変宿主細胞およびそれらの使用 - Google Patents

キメラ貪食受容体のための発現ベクター、遺伝子改変宿主細胞およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、キメラ貪食受容体分子およびキメラ抗原受容体／またはＴ細胞受容体結合タンパク質をコードするタンデム発現カセット、タンデム発現カセットを含むように改変された宿主細胞、およびそのような受容体分子および改変細胞を製造および使用する方法に関する。

Description

配列リストについての申告
本出願に伴う配列リストを、用紙複写物の代わりにテキスト形式において提供し、これによって参照により本明細書に組み込む。配列リストを含有するテキストファイルの名称は、２００２６５＿４０６ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは５３９ＫＢであり、２０１９年３月２６日に創出され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
がん抗原に対してターゲティングした遺伝子操作した受容体により改変したＴ細胞の使用は、血液系腫瘍において臨床的成功を実証した（例えば白血病におけるＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体療法）。少数の例を挙げると、ＣＥＡ、ＧＤ２、メソテリン、ＩＬ１３Ｒα、ＨＥＲ２、ＦＡＰおよびＬ１ＣＡＭをターゲティングする、操作した受容体を使用する、固形腫瘍の治療における養子細胞免疫療法についてのいくつかの臨床治験が進行中である。操作した受容体には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）および高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が含まれる。しかしながら、固形腫瘍の治療は、腫瘍部位への輸送、腫瘍微小環境への物理的障壁、ストレス性代謝状勢および免疫抑制機構（例えば免疫チェックポイント分子の発現、阻害性サイトカインの産生）を含む独特な問題を提示する。養子免疫療法治療におけるＴ細胞の持続性および活性を増強する努力は現在進行中である。
図１Ａ〜Ｇは、例示的なタンデム発現カセットについてのベクターマップを示す。タンデム発現カセットは、腫瘍（例えば子宮頸部の腫瘍）特異的細胞溶解応答を誘導するためのヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）Ｅ７タンパク質特異的ＴＣＲ、および細胞溶解により誘導されたホスファチジルセリン曝露に際して腫瘍特異的食作用活性を誘発するためのホスファチジルセリン特異的キメラ貪食受容体（ＣＥＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の両方を宿す。図１Ａは、キメラ貪食受容体５（ＣＥＲ５）コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ５は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ５およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ５は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、ＴＬＲ４貪食シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｂは、ＣＥＲ１９コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ１９は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ１９およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ１９は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、ＴＬＲ５シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｃは、ＣＥＲ２１コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ２１は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ２１およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ２１は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、ＴＬＲ８シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｄは、ＣＥＲ２５コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ２５は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ２５およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ２５は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｅは、ＣＥＲ２７コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ２７は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ２７およびＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ２７は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、ＴＬＲ２シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｆは、ＣＥＲ２９コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ２９は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ２９およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ２９は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、Ｔｒａｆ６シグナル伝達ドメインとを含む。図１Ｇは、ＣＥＲ３１コンストラクトをコードするポリヌクレオチドとＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとを含む例示的なタンデム発現カセットを示す。ＣＥＲ３１は、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲの上流に位置する。ＣＥＲ３１およびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲをコードする配列は、ＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されており、Ｔ２Ａペプチドによって分離されている。ＣＥＲ３１は、Ｔｉｍ４結合ドメインと、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインと、Ｔｒａｆ３シグナル伝達ドメインとを含む。 図２は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲを含むタンデム発現コンストラクトにより改変したヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。画像は、様々な時点（２時間、４時間および６時間）において採取したＨＰＶ１６ Ｅ７＋頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ１５２）細胞から放射されたカスパーゼ３／７蛍光指示色素を示す。ＳＣＣ１５２細胞との定時共培養実験において、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞（上部の行）を、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞（下部の行）と比較した。タンデム発現コンストラクトは、ＣＤ８＋Ｔ細胞において細胞溶解活性および食作用活性の両方を与え、死滅させる能力を向上させる。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞：標的ＳＣＣ１５２細胞を、１：１の比においてインキュベートした。 図３は、Ｔ２Ａ配列により分離されたタンデムカセットＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲおよびキメラ貪食受容体２１（ＣＥＲ２１）を含むレンチウイルスベクターを形質導入したヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養に際しての、ＨＰＶ１６ Ｅ７＋ＳＣＣ１５２細胞における経時的なカスパーゼ３／７誘導を示す線グラフである。ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとＣＥＲ２１とをコードするタンデム発現コンストラクトは、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を含む宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞に高い標的細胞死滅能力を与える。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を、標的ＳＣＣ１５２細胞と１：１の比においてインキュベートした。全カスパーゼ３／７蛍光を経時的に定量した。 図４は、Ｔ２Ａ配列により分離されたタンデムカセットＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲおよびＣＥＲを含むレンチウイルスベクターを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養に際しての、ＨＰＶ１６ Ｅ７＋ＳＣＣ１５２細胞におけるカスパーゼ３／７誘導を示す棒グラフである。模擬形質導入細胞を、陰性対照として使用した。ＳＣＣ１５２細胞のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）カスパーゼ３／７赤色アポトーシス試薬による標識によって、アポトーシスを受ける細胞の検出（赤色蛍光）が可能になる。タンデムＣＥＲ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲカセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ対照を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞と比較する共培養実験から、経時的に測定を取った。 図５は、共培養の開始６時間後に採取したＨＰＶ＋頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ１５２）細胞から放射されたカスパーゼ３／７蛍光指示色素の画像を示す。ＣＥＲ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養を、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養（上から２番目）と比較した。ＣＥＲ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いカスパーゼ誘導を示す。 図６は、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセット、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットまたはＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養の６時間後の食作用の定量を示す棒グラフである。食作用の定量は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０画像化系においてハイブリッドキャプチャーソフトウェアによって行い、食作用％を、青色染色されたエフェクター細胞の内側の赤色蛍光標的（ＳＣＣ１５２細胞）数を特定することによって決定した（ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ標識したＣＥＲ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞−内部移行された赤色の数／青色の数）ｘ１００。 図７は、ＳＣＣ１５２標的細胞（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識）を貪食するＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞（ｖｉｏｌｅｔ着色）を示す蛍光顕微鏡写真である。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセット形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＳＣＣ１５２標的細胞の１：１混合物を、６時間共培養し、その後画像化した。矢印は、ｖｉｏｌｅｔ着色したＣＤ８＋Ｔ細胞エンドソーム区画内のＳＣＣ１５２細胞（赤色）の内部移行の代表的な画像を示す（左画像＝明視野オーバーレイ、右画像＝蛍光オーバーレイ）。タンデムカセットにより操作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＣＣ１５２腫瘍細胞株を明らかに貪食する。 図８は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｒａｃ１依存的様式において標的細胞を貪食したことを示す。小ＧＴＰアーゼＲａｃ１の活性化および膜動員は、食作用を誘発する。左画像は、青色標識したＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋細胞の内側のｐＨ ｒｏｄｏ ｒｅｄ標識標的細胞の貪食を示す。Ｒａｃ１阻害剤ＮＳＣ２３７６６（５０μＭ）を、共培養実験に添加し（右画像）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）食作用／貪食を定量した。蛍光顕微鏡写真は、小分子によるＲａｃ１の阻害が、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるインビトロ貪食を無効にすることを示す（右）。 図９は、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｒａｃ１依存的様式において標的細胞を貪食することを示す。小ＧＴＰアーゼＲａｃ１の活性化および膜動員は、食作用を誘発する。左画像は、青色標識したＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋細胞の内側のｐＨ ｒｏｄｏ ｒｅｄ標識標的細胞の貪食を示す。Ｒａｃ１阻害剤ＮＳＣ２３７６６（５０μＭ）を、共培養実験に添加し（右画像）、インビトロ食作用を定量した。蛍光顕微鏡写真は、小分子によるＲａｃ１の阻害が、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるインビトロ食作用を無効にすることを示す（右）。 図１０は、ＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｒａｃ１依存的様式において標的細胞を貪食することを示す。小ＧＴＰアーゼＲａｃ１の活性化および膜動員は、食作用を誘発する。左画像は、青色標識したＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋細胞の内側のｐＨ ｒｏｄｏ ｒｅｄ標識標的細胞の貪食を示す。Ｒａｃ１阻害剤ＮＳＣ２３７６６（５０μＭ）を、共培養実験に添加し（右）、インビトロ食作用を定量した。蛍光顕微鏡写真は、小分子阻害剤によるＲａｃ１の阻害が、ＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるインビトロ食作用／貪食を無効にすることを示す（右）。 図１１は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲを含むタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞溶解および食作用の二重の機能性を有することを示す。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロでホスファチジルセリンコーティングしたビーズの食作用取り込みを示す。ストレプトアビジンコーティングしたラテックスビーズをビオチン−ホスファチジルセリンと結合し、食作用アッセイに使用した。３０分間のインキュベーション後、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ホスファチジルセリンコーティングしたビーズの取り込みを示した（白色矢印は、貪食事象の代表的な画像を示す）。 図１２は、インビトロでのホスファチジルセリンコーティングしたビーズの食作用取り込みを示すＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の高拡大画像を示す。 図１３は、ホスファチジルセリンによりコーティングしたラテックスビーズと共培養したＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞のインキュベーション３０分後における光学顕微鏡写真を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ホスファチジルセリンによりコーティングしたラテックスビーズの取り込みを示さない。 図１４は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットまたはＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を形質導入し、かつＳＣＣ１５２標的細胞と共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン分泌パターンを示す３Ｄ棒グラフである。サイトカイン分泌パターンを決定するために、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＳＣＣ１５２標的細胞と共培養した。メソスケールマルチアレイサイトカインプレートを使用して、各共培養物からの細胞上清中のサイトカイン濃度を測定することによって抗原特異的サイトカイン分泌を決定した。アッセイにおいて以下のサイトカイン：ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−１０を測定した。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞は、サイトカイン分泌、例えばＩＦＮγによって示される通り、抗原特異的エフェクター機能を示す。 図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｔ細胞の食作用活性がＣＥＲによって特異的に誘導されることを示す。図１５Ａは、食作用アッセイのＦＡＣＳ分析を示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ−ｖｉｏｌｅｔ標識模擬形質導入Ｔ細胞、ＨＰＶ Ｅ７−ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞、およびＨＰＶ Ｅ７−ＴＣＲ／ＣＥＲ２９タンデム発現カセット形質導入Ｔ細胞を、ｐＨｒｏｄｏ−ｒｅｄ標識ＨＰＶ＋ＳＣＣ１５２頭頸部がん細胞と共培養した。図１５Ｂは、ＦＡＣＳデータの定量を示し、模擬形質導入Ｔ細胞とＥ７ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞との間に食作用における差がないことを示す。Ｔ細胞においてＥ７ ＴＣＲと共にＣＥＲ２９を共発現したＴ細胞は、食作用活性を示した。 図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｔ細胞の食作用活性がＣＥＲによって特異的に誘導されることを示す。図１５Ａは、食作用アッセイのＦＡＣＳ分析を示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ−ｖｉｏｌｅｔ標識模擬形質導入Ｔ細胞、ＨＰＶ Ｅ７−ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞、およびＨＰＶ Ｅ７−ＴＣＲ／ＣＥＲ２９タンデム発現カセット形質導入Ｔ細胞を、ｐＨｒｏｄｏ−ｒｅｄ標識ＨＰＶ＋ＳＣＣ１５２頭頸部がん細胞と共培養した。図１５Ｂは、ＦＡＣＳデータの定量を示し、模擬形質導入Ｔ細胞とＥ７ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞との間に食作用における差がないことを示す。Ｔ細胞においてＥ７ ＴＣＲと共にＣＥＲ２９を共発現したＴ細胞は、食作用活性を示した。
一態様においては、本開示は、同じ宿主細胞における、第１の養子免疫療法分子をコードする第１の導入遺伝子と第２の養子免疫療法分子をコードする第２の導入遺伝子との共発現のためのタンデム発現カセットを提供する。本明細書において説明するタンデム発現カセットの実施形態は、キメラ貪食受容体（ＣＥＲ）をコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドとを含む。本開示のタンデム発現カセットは、同じ宿主細胞においてタンデム細胞溶解性表現型および貪食表現型を与えるために使用され得る。ある特定の実施形態においては、第１の標的抗原に特異的なＣＡＲまたはＴＣＲの細胞傷害活性は、第１の標的抗原を発現する標的細胞のアポトーシスを誘導し、それによって、第２の標的抗原を曝露し；第２の標的抗原に特異的である共発現されたＣＥＲは、第２の標的抗原を発現する標的細胞または粒子の貪食を誘導する。この相互作用は、標的細胞の貪食と関連付けられる環境／ホスファチジルセリン発現を産生する遺伝子操作細胞を、規定の腫瘍または腫瘍細胞との様々な相互作用を有する同じ細胞から分離することに関連し得る。
加えて、本開示のタンデム発現カセットを発現するように改変された細胞、ならびにそのような改変細胞のそれを必要とする対象へのデリバリーのための方法および組成物が提供される。
本開示をより詳細に示す前に、本明細書において使用されるある特定の用語の定義を提供することは本開示の理解に役立ちうる。
本説明において、任意の濃度範囲、割合範囲、比の範囲または整数範囲は、別に示されない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（例として整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。また、任意の物理的特色、例としてポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関する本明細書において列挙される任意の数値範囲は、別に示されない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書において使用されるとき、「約」という用語は、別に示されない限り、示される範囲、値または構造の±２０％を意味する。「ａ」および「ａｎ」という用語は、本明細書において使用されるとき、列挙される成分のうちの「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方またはその任意の組合せを意味すると理解されるべきである。本明細書において使用されるとき、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を有する（ｈａｖｅ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義的に使用され、その用語およびその変形は、非限定的であると解釈されることが意図される。
抗体技術の分野における当業者によって理解される用語は各々、本明細書において明確に異なって定義されない限り、当該技術分野において得られる意味を与えられる。「抗体」という用語は、最も広範な意味において使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含むインタクトな抗体、および標的分子を結合する能力を有するか、または保持するインタクトな抗体の抗原結合性部分（または抗原結合性ドメイン）を指し得る。抗体は、免疫グロブリンの天然、組換え産生、遺伝子操作または改変形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、ＡＤＡＰＴＩＲ）であり得る。モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分、好ましくはヒト化またはヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分であり得る。免疫グロブリン構造および機能は、例えばHarlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)において概略されている。インタクトな抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性ドメイン」は、「抗体断片」を包含することを意味し、これは、インタクトな抗体の一部を示し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域または相補性決定領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、線形抗体、ｓｃＦｖ抗体、ＶＨならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、抗原に結合する抗体の一部であり、可変性領域と鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖のＣＨ１とを含む。抗体は、ＩｇＧおよびそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡならびにＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体であり得る。
抗体に関する「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般的に、同様の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む（例えばKindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義である「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および／または結合親和性を与える、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが当該技術分野において公知である。一般的に、各重鎖可変領域における３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域における３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。
本明細書において使用されるとき、「結合ドメイン」、「結合領域」および「結合部分」という用語は、標的分子（例えば腫瘍抗原）と特異的かつ非共有結合的に結合、会合、合体、認識または合同する能力を有する分子、例としてペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または他の標的についての任意の天然、合成、半合成または組換え産生結合パートナーを含む。一部の実施形態においては、結合ドメインは、抗原結合性ドメイン、例として抗体またはその機能的結合ドメインもしくは抗原結合性部分である。例示的な結合ドメインには、単鎖抗体可変領域（例えばドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、受容体外部ドメイン（例えばＴＮＦ−α）、リガンド（例えばサイトカイン、ケモカイン）または生体分子に結合する特異的能力について選択される合成ポリペプチドが含まれる。
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とは、一般的に主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）分子に結合した抗原を認識することの原因である、Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも呼ばれる）の表面上に見られる分子を指す。ＴＣＲは一般的に、ほとんどのＴ細胞において高度に可変性のαおよびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド結合ヘテロ二量体からなる。Ｔ細胞の小サブセットにおいては、ＴＣＲは、γおよびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）のヘテロ二量体からなる。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域およびＣ末端の短い細胞質尾部を有する（Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照のこと）。本開示のＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種からのＴＣＲであり得る。ＴＣＲは、細胞結合性（すなわち、膜貫通領域またはドメインを有する）であっても、可溶性形態であってもよい。ＴＣＲには、例えばｓｃＴＣＲ、可溶性ＴＣＲ、ＴＣＲ融合コンストラクト［ＴＲｕＣ（商標）；米国特許出願公開第２０１７／０１６６６２２号を参照のこと］を含むＴＣＲの組換え産生、遺伝子操作、融合または改変形態が含まれる。
ＴＣＲ α鎖（Ｖα）およびβ鎖（Ｖβ）、またはγδＴＣＲのＶγおよびＶδの「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、ＴＣＲの抗原への結合に関与する。ネイティブＴＣＲのＶαおよびＶβは一般的に、同様の構造を有し、各可変ドメインは４つの保存されたＦＲおよび３つのＣＤＲを含む。Ｖαドメインは、２つの別々のＤＮＡセグメントである、可変遺伝子セグメント（Ｖ遺伝子）および接合遺伝子セグメント（Ｊ遺伝子）によってコードされ；Ｖβドメインは、３つの別々のＤＮＡセグメントである、可変遺伝子セグメント（Ｖ遺伝子）、多様性遺伝子セグメント（Ｄ遺伝子）および接合遺伝子セグメント（Ｊ遺伝子）によってコードされる。単一のＶαまたはＶβドメインは、抗原結合特異性を与えるために十分であり得る。
「主要組織適合抗原複合体分子（ＭＨＣ分子）」とは、ペプチド抗原を細胞表面へデリバリーする糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜貫通α鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合的に会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβからなり、その両方は膜を貫通している。各鎖は、２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質ゾルに起源を有するペプチドを細胞表面へデリバリーし、細胞表面においてペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に起源を有するペプチドを細胞表面へデリバリーし、細胞表面においてそれらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種からのＭＨＣ分子であり得る。
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）とは、２つまたはそれよりも多い別個のドメインを含むキメラタンパク質を指し、細胞表面上に発現した場合、受容体として機能し得る。ＣＡＲは一般的に、標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、適宜の細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ、および適宜、細胞内共刺激性ドメイン］からなる。ある特定の実施形態においては、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン（例えばＣＤ３ζ）および細胞内共刺激性ドメイン（例えばＣＤ２８）を有する。ある特定の実施形態においては、ＣＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成されるか、または単鎖ポリペプチドとして核酸分子によってコードされる。
特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを特定するため、および結合ドメイン親和性を決定するための様々なアッセイ、例としてウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心法、分光学、表面プラズモン共鳴［ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）］分析およびＭＨＣ四量体分析が公知である（また、例えばScatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949；Wilson, Science 295:2103, 2002；Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993；Altman et al., Science 274:94-96, 1996；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号またはその均等物を参照のこと）。本明細書において使用されるとき、「特異的に結合する」とは、結合ドメインまたはその融合タンパク質の、標的分子への、１０５Ｍ−１に等しいか、またはそれよりも大きい親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡会合定数）による会合または合体であって、一方で、試料中の他の任意の分子または成分とは顕著に会合または合体しないことを指す。
「抗原」および「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘導することができる分子を指す。誘導される免疫応答は、抗体産生、特異的免疫学的コンピテント細胞の活性化またはこの両方を含み得る。タンパク質、糖タンパク質および糖脂質を含む高分子は、抗原として働き得る。抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。本明細書において企図されるとき、抗原は、（ｉ）遺伝子の全長ヌクレオチド配列によって単独で、または（ｉｉ）「遺伝子」によって、コードされる必要は全くない。抗原は生成されても、合成されてもよく、または抗原は生体試料に由来してもよい。そのような生体試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体体液を含み得るが、これらに限定されない。
「エピトープ」または「抗原性エピトープ」という用語には、同族免疫結合分子、例として抗体もしくはその断片（例えばｓｃＦｖ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＡＲ、キメラ貪食受容体または他の結合分子、ドメインもしくはタンパク質が特異的に結合する任意の分子、構造、アミノ酸配列または抗原内のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は一般的に、分子の化学的活性表面群、例としてアミノ酸または糖側鎖を含有し、特異的三次元構造特徴および特異的電荷特徴を有し得る。エピトープは、線形エピトープまたはコンフォメーションエピトープであり得る。
本明細書において使用されるとき、「エフェクタードメイン」は、適切なシグナルを受容した場合エフェクタードメインを発現する細胞内の生物応答または生理応答を直接的または間接的に促進し得る融合タンパク質またはキメラ受容体の細胞内部分である。ある特定の実施形態においては、エフェクタードメインは、結合した場合シグナルを受容するタンパク質またはタンパク質複合体の部分である。他の実施形態においては、エフェクタードメインは、エフェクタードメインからのシグナルを誘発する標的分子に直接的に結合するタンパク質またはタンパク質複合体の部分である。例えば、ＣＥＲの標的分子への結合に応答して、エフェクタードメインは、シグナルを宿主細胞の内部へ伝達し、エフェクター機能、例えば貪食、ファゴリソソーム成熟または抗炎症性サイトカインおよび／または免疫抑制性サイトカインの分泌を誘発し得る。エフェクタードメインは、それが１つまたは複数のシグナル伝達ドメインまたはモチーフを含有する場合、細胞応答を直接的に促進し得る。他の実施形態においては、エフェクタードメインは、細胞応答を直接的に促進する１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進する。
「貪食シグナル伝達ドメイン」とは、宿主細胞が発現するＣＥＲの細胞外ドメインによってターゲティングされる標的分子（例えばホスファチジルセリン）の結合に際して、宿主細胞において１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化し、特定の実施形態においては、宿主細胞の細胞骨格再配置、および標的細胞または標的抗原と会合する粒子の内部移行を含む貪食をもたらす細胞内エフェクタードメインを指す。ある特定の実施形態においては、貪食シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化し、標的細胞または粒子の食作用をもたらす。さらなる実施形態においては、貪食シグナル伝達ドメインは、一次貪食シグナル伝達ドメインおよび二次貪食シグナル伝達ドメインを含む。
「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの２つの隣接モチーフ、領域またはドメイン間の１つまたは複数の（例えば約２〜２０個の）アミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、キメラタンパク質のコンストラクト設計から生じ得る（例えば融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用から生じるアミノ酸残基）。
「疾患」は、対象が恒常性を維持することができない、かつ疾患が改善しない場合その後、対象の健康が悪化し続ける、対象の健康状態である。対照的に、対象における「障害」または「望ましくない状態」は、対象が恒常性を維持することができるが、対象の健康状態が、それが障害または望ましくない状態の非存在下にある場合よりも好ましくない、健康状態である。処置されないままの場合、障害または望ましくない状態は、対象の健康状態のさらなる減少を必ずしももたらさない。
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例としてデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然ヌクレオチドのアナログ（例えば天然ヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）またはその両方の組合せからなり得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分、またはピリミジンもしくはプリン塩基部分における修飾またはこれらの部分の置換を有し得る。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）等が含まれる。核酸分子は、二本鎖であっても、一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖であっても、非コード（アンチセンス鎖）であってもよい。コード分子は、当該技術分野において公知のコード配列と同一のコード配列を有してもよく、または遺伝子コードの重複または縮重の結果として、またはスプライシングによって、同じポリペプチドをコードし得る異なるコード配列を有してもよい。
「コードする」とは、特定のポリヌクレオチド配列、例としてＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列の、生物学的プロセスにおいて規定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定のアミノ酸配列のいずれかを有する他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ポリヌクレオチドは、細胞または他の生体系においてそのポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの転写および翻訳がタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。コード鎖および非コード鎖の両方は、タンパク質またはポリヌクレオチドの他の生成物をコードすると言及され得る。別に指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書において使用されるとき、「内因性」または「ネイティブ」という用語は、遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性の天然変異型を含む、宿主または宿主細胞に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性を指す。
本明細書において使用されるとき、「同種の」または「ホモログ」とは、宿主細胞からの、例えば同じ宿主細胞からの、異なる宿主細胞からの、異なる生物からの、異なる系統からの、異なる種からの、第２の遺伝子または活性に祖先によって関連する分子または活性を指す。例えば、異種の分子、または分子をコードする異種の遺伝子は、それぞれ、ネイティブ宿主細胞分子または分子をコードする遺伝子と同種である場合があり、変更された構造、配列、発現レベルまたはその任意の組合せを有してもよい。
本明細書において使用されるとき、「異種の」核酸分子、コンストラクトまたは配列とは、宿主細胞にとってネイティブではないが、宿主細胞からの核酸分子または核酸分子の部分にとって同種であり得る核酸分子または核酸分子の部分を指す。異種の核酸分子、コンストラクトまたは配列の供給源は、異なる属または種からの供給源であり得る。一部の実施形態においては、異種の核酸分子は、天然ではない。ある特定の実施形態においては、異種の核酸分子は、例えばコンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションその他によって、宿主細胞または宿主ゲノムに添加され（すなわち、内因性またはネイティブではなく）、添加された分子は、宿主細胞ゲノムに統合されても、染色体外遺伝子材料として（例えばプラスミドまたは自己複製ベクターの他の形態として）存在してもよく、多数のコピーにおいて存在してもよい。加えて、「異種の」とは、宿主細胞が同種のタンパク質または活性をコードするとしても、宿主細胞に導入された非内因性核酸分子によってコードされる非ネイティブ酵素、タンパク質または他の活性を指す。
本明細書において使用されるとき、「操作した」、「組換え」、「改変」または「非天然」という用語は、異種の核酸分子の導入によって改変された生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを指すか、またはヒトの介入によって遺伝子操作された、すなわち、異種の核酸分子の導入によって改変された細胞または微生物を指すか、または内因性核酸分子または遺伝子の発現が制御されるか、調節解除されるか、または構成的であるように変更され、そのような変更または改変が遺伝子操作によって導入され得る細胞または微生物を指す。ヒトが生成した遺伝子変更は、例えば、１つまたは複数のタンパク質、キメラ受容体または酵素をコードする核酸分子（プロモーター等の発現制御エレメントを含み得る）を導入する改変；または他の核酸分子の付加、欠失、置換；または細胞の遺伝子材料の他の機能的破壊もしくは細胞の遺伝子材料への付加を含み得る。例示的な改変は、コード領域またはその機能的断片における改変、参照分子または親分子とは異種の、または同種のポリペプチドを含む。追加の例示的な改変には、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変更する、非コード調節領域における改変が含まれる。
ここで使用されるとき、「導入遺伝子」という用語は、発現が宿主細胞において所望され、遺伝子操作技術によって細胞に移行された、目的のタンパク質（例えばＣＥＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ）をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。導入遺伝子は、治療目的のタンパク質、およびレポーター、タグ、マーカー、自殺タンパク質等であるタンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、天然供給源からの導入遺伝子、天然遺伝子の改変であってもよく、組換えまたは合成分子であってもよい。ある特定の実施形態においては、導入遺伝子は、ベクターの成分である。
「過剰発現した」抗原または抗原の「過剰発現」という用語は、細胞における異常に高レベルの抗原を指す。過剰発現した抗原または抗原の過剰発現は多くの場合、血液系腫瘍、および対象の特定の組織または器官内の固形腫瘍を形成する細胞における疾患状態等の、疾患状態と関連付けられる。腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる固形腫瘍または血液系腫瘍は、当該技術分野において公知の標準のアッセイによって決定することができる。
本明細書において使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数について限定はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに接合された２つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において使用されるとき、この用語は、当該技術分野において例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも通常呼ばれる短鎖、および一般的に当該技術分野においてタンパク質と呼ばれ、多くの種類がある長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、中でも、例えば生物活性断片、実質的同種ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異型、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチドまたはそれらの組合せが含まれる。
本明細書において使用されるとき、「成熟ポリペプチド」または「成熟タンパク質」という用語は、分泌されるか、または細胞膜に、またはある特定の細胞小器官（例えば小胞体、ゴルジ体またはエンドソーム）内に局在化し、かつＮ末端シグナルペプチドを含まないタンパク質またはポリペプチドを指す。
「シグナルペプチド」は、「シグナル配列」、「リーダー配列」、「リーダーペプチド」、「局在化シグナル」または「局在化配列」とも呼ばれ、分泌経路に運命付けられた新規合成タンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（長さが通常１５〜３０個のアミノ酸）である。シグナルペプチドは典型的に、Ｎ末端における短い範囲の親水性正電荷アミノ酸、５〜１５個の残基の中心疎水性ドメインおよびシグナルペプチダーゼのための切断部位を有するＣ末端領域を含む。真核生物においては、シグナルペプチドは、新規合成タンパク質の小胞体への移行を誘発し、小胞体においてそれはシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質を創出し、その後成熟タンパク質はその適切な目的地へ進行する。
２つまたはそれよりも多い核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセント」は、２つまたはそれよりも多い配列の整列を最適化するために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数ｘ１００）。２つまたはそれよりも多い配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラム等の数学的アルゴリズムをそれらのデフォルトパラメータを用いて使用して達成することができる（例えばAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990；また、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのＢＬＡＳＴＮを参照のこと）。
「保存的置換」は、当該技術分野において、１つのアミノ酸の、同様の特性を有する別のアミノ酸への置換として認識されている。例示的な保存的置換は、当該技術分野において周知である（例えば１９９７年３月１３日公開のＷＯ９７／０９４３３、１０ページ；Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77；Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8を参照のこと）。
「キメラ」という用語は、内因性ではなく、かつ天然に見られない本質的に共に接合または連結された、共に接合または連結された配列の組合せを含む任意の核酸分子またはタンパク質を指す。例えば、キメラ核酸分子は、多数の異なる遺伝子からの様々なドメインをコードする核酸を含み得る。別の例においては、キメラ核酸分子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見られる様式とは異なる様式において配置されている調節配列およびコード配列を含み得る。
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるとき、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入される、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされるＤＮＡ配列として定義される。
本明細書において使用されるとき、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。一部の場合、この配列は、コアプロモーター配列であってもよく、他の場合、また、この配列は、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的様式において遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下において遺伝子産物が細胞内で産生されることをもたらすヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合のみ、遺伝子産物が細胞内で産生されることをもたらすヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか、または遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合のみ、遺伝子産物が細胞内で産生されることをもたらすヌクレオチド配列である。
「転写制御下」または「作動可能に連結された」という句は、本明細書において使用されるとき、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにポリヌクレオチドに関して正しい場所および方向において存在することを意味する。
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージであり得る。また、この用語は、核酸の細胞への移行を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。「発現ベクター」は、ベクターが適切な環境に存在する場合、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を方向付けることができるベクターである。
ある特定の実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科ファミリーの属を指す。ガンマレトロウイルスの例には、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルスおよび鳥類細網内皮症ウイルスが含まれる。「レンチウイルス」とは、***細胞および非***細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ：ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ：ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態においては、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例には、脂質ベースのＤＮＡベクター、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ、閉鎖末端直鎖状二本鎖（ＣＥＬｉＤ：ｃｌｏｓｅｄ−ｅｎｄｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｕｐｌｅｘ）ＤＮＡおよびトランスポゾン媒介遺伝子移行（ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）が含まれる。非ウイルスデリバリー系が使用される場合、デリバリー媒体は、リポソームであり得る。脂質製剤は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を宿主細胞に導入するために使用され得る。核酸は、リポソームの内部に封入されていてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在していてもよく、リポソームおよび核酸の両方と会合する連結分子を介してリポソームに結合していてもよく、ミセルに含有されるか、もしくはミセルと複合体形成していてもよく、別の方法で脂質と会合していてもよい。
本明細書において使用されるとき、「発現カセット」という用語は、少なくとも１つの導入遺伝子と宿主細胞においてその発現を制御する調節配列（例えばプロモーター、３’ＵＴＲ）とを含むベクター核酸の特徴的な成分を指す。タンデム発現カセットとは、少なくとも２つの導入遺伝子のタンデム発現のための同じ組の調節配列の制御下の少なくとも２つの導入遺伝子を含むベクター核酸の成分を指す。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、同じプロモーターの制御下の少なくとも２つの導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態においては、第１の導入遺伝子および第２の導入遺伝子は、単一のｍＲＮＡからの２つのタンパク質の共発現を可能にするために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）、フューリン切断部位または自己切断ウイルス２Ａペプチドによって分離されている。
「粒子」とは、直径が少なくとも１０ｎｍ〜最大で５０μｍの細胞の断片または小物体を指す。粒子は、生細胞または生物、環境に由来してもよく、合成であってもよい。粒子は、ウイルス粒子、プリオン粒子、タンパク質粒子、合成粒子、小鉱物粒子または細胞片であり得る。
本明細書において使用されるとき、「貪食」という用語は、直径が１０ｎｍを超える内因性または外因性細胞または粒子が、本開示の食細胞または宿主細胞によって内部移行される、受容体媒介プロセスを指す。貪食は典型的に、多ステップ：（１）貪食受容体の、標的細胞または粒子上のプロ貪食マーカーまたは抗原性マーカーへの直接的または間接的（架橋分子を介する）結合を介する標的細胞または粒子の繋留；および（２）標的細胞全体もしくは粒子全体またはそれらの部分の内部移行または貪食からなる。ある特定の実施形態においては、内部移行は、食細胞または宿主細胞の細胞骨格再配置を介して起こり、内部移行された標的を含有する膜結合区画であるファゴソームを形成し得る。貪食は、ファゴソームがますます酸性になり、リソソームと融合する（ファゴリソソームを形成する）ファゴソームの成熟をさらに含む場合があり、これに際して、貪食された標的は分解される（例えば「食作用」）。あるいは、ファゴソーム−リソソーム融合は、貪食において観察されない場合がある。また別の実施形態においては、ファゴソームは、その内容物を、完全な分解前に細胞外環境へ吐き戻すか、または排出し得る。一部の実施形態においては、貪食とは、食作用を指す。一部の実施形態においては、貪食は、本開示の宿主細胞の食細胞による標的細胞または粒子の繋留を含むが、内部移行は含まない。一部の実施形態においては、貪食は、本開示の宿主細胞の食細胞による標的細胞または粒子の繋留、および標的細胞または粒子の部分の内部移行を含む。
本明細書において使用されるとき、「食作用」という用語は、標的細胞または粒子の繋留、標的細胞または粒子の貪食および内部移行された標的細胞または粒子の分解が起こる、細胞または大粒子（０．５μｍ以上）の貪食プロセスを指す。ある特定の実施形態においては、食作用は、内部移行された標的細胞または粒子を包含するファゴソームの形成、および中の内容物が分解されるファゴリソソームを形成するリソソームとのファゴソーム融合を含む。ある特定の実施形態においては、本開示の宿主細胞上に発現するＣＥＲの、標的細胞または粒子によって発現される標的抗原への結合後、食作用シナプスが形成され；食作用シナプスにおいてアクチンリッチ食作用カップが生成し；細胞骨格再配置を通して食作用アームが標的細胞または粒子の周囲に伸長し；最終的に、モータータンパク質によって生成した力を通して標的細胞または粒子が食細胞または宿主細胞に引き込まれる。本明細書において使用されるとき、「食作用」には、非炎症様式におけるアポトーシス細胞または壊死細胞の食作用を特に指す「エフェロサイトーシス」のプロセスが含まれる。
「免疫系細胞」または「免疫細胞」という用語は、骨髄の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。造血幹細胞は、２つの主要な系統：骨髄系前駆細胞（骨髄細胞、例として単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球を生じる）およびリンパ球前駆細胞［リンパ球細胞、例としてＴ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生じる］を生じる。例示的な免疫系細胞には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二種陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞が含まれる。マクロファージおよび樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」とも呼ばれる場合があり、これらは、ペプチドと複合体形成したＡＰＣの表面上の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）受容体が、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲと相互作用するとき、Ｔ細胞を活性化し得る特殊化細胞である。
「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞系統の細胞を指す。「Ｔ細胞系統の細胞」とは、細胞を他のリンパ球および赤血球系統または骨髄系統の細胞から区別する、Ｔ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞を指す。そのような表現型特徴は、Ｔ細胞に特異的な１つまたは複数のタンパク質（例えばＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の発現、またはＴ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的または免疫学的特色を含み得る。例えば、Ｔ細胞系統の細胞は、Ｔ細胞系統にコミットされた前駆細胞もしくは前駆体細胞；ＣＤ２５＋未成熟かつ不活性化Ｔ細胞；ＣＤ４またはＣＤ８系統コミットメントを受けた細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋二種陽性である胸腺前駆細胞；単一陽性ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋；ＴＣＲαβもしくはＴＣＲγδ；または成熟かつ機能的もしくは活性化Ｔ細胞であり得る。「Ｔ細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、Ｔｒｅｇ、ナチュラルキラーＴ細胞および組織レジデントＴ細胞を包含する。
「Ｂ細胞」という用語は、Ｂ細胞系統の細胞を指す。「Ｂ細胞系統の細胞」とは、細胞を他のリンパ球および赤血球系統または骨髄系統の細胞から区別する、Ｂ細胞またはその前駆体もしくは前駆細胞の少なくとも１つの表現型特徴を示す細胞を指す。そのような表現型特徴は、Ｂ細胞に特異的な１つまたは複数のタンパク質（例えばＣＤ１９＋、ＣＤ７２＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ２０＋）の発現、またはＢ細胞に特異的な生理学的、形態学的、機能的または免疫学的特色を含み得る。例えば、Ｂ細胞系統の細胞は、Ｂ細胞系統にコミットされた前駆細胞もしくは前駆体細胞（例えばプレプロＢ細胞、プロＢ細胞およびプレＢ細胞）；未成熟かつ不活性化Ｂ細胞；または成熟かつ機能的もしくは活性化Ｂ細胞であり得る。したがって、「Ｂ細胞」は、ナイーブＢ細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、リンパ形質細胞性細胞、形質芽細胞およびメモリーＢ細胞（例えばＣＤ２７＋、ＩｇＤ−）を包含する。
表面上に免疫受容体（例えばＴＣＲ）を発現する細胞（例えばＴ細胞）についての「細胞傷害活性」という用語は、「細胞溶解活性」とも呼ばれ、細胞が、抗原特異的シグナル伝達に際して（例えばＴＣＲを介して）、標的細胞がアポトーシスを受けるように誘導することを意味する。一部の実施形態においては、細胞傷害性細胞は、顆粒からの細胞毒、例としてパーフォリン、グランザイムおよびグラニュライシンの放出を介して標的細胞においてアポトーシスを誘導し得る。パーフォリンは、標的細胞膜に挿入し、水および塩が標的細胞に迅速に入ることを可能にする孔を形成する。グランザイムは、標的細胞においてアポトーシスを誘導するセリンプロテアーゼである。また、グラニュライシンは、標的細胞膜において孔を形成することができ、炎症促進性分子である。一部の実施形態においては、細胞傷害性細胞は、抗原特異的シグナル伝達後にＴ細胞上でアップレギュレートされるＦａｓリガンドと、標的細胞上に発現されるＦａｓ分子との相互作用を介して、標的細胞においてアポトーシスを誘導し得る。Ｆａｓは、いくつかの異なる細胞の表面上のアポトーシスシグナル伝達受容体分子である。
「疾患」は、対象が恒常性を維持することができない、かつ疾患が改善しない場合その後、対象の健康が悪化し続ける、対象の健康状態である。対照的に、対象における「障害」または「望ましくない状態」は、対象が恒常性を維持することができるが、対象の健康状態が、それが障害または望ましくない状態の非存在下にある場合よりも好ましくない、健康状態である。処置されないままの場合、障害または望ましくない状態は、対象の健康状態のさらなる減少を必ずしももたらさない。
「がん」という用語は、本明細書において使用されるとき、異常な細胞の迅速かつ制御されていない増殖によって特徴付けられる疾患として定義される。異常な細胞は、固形腫瘍を形成するか、または血液系腫瘍を構成し得る。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通して身体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例には、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん等が含まれるが、これらに限定されない。
「対象」、「患者」および「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、免疫応答が誘発され得る生存生物（例えば哺乳動物）を含むと意図される。対象の例には、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタおよびそのトランスジェニック種が含まれる。
「養子細胞免疫療法」または「養子免疫療法」は、天然の、または遺伝子操作した、疾患抗原特異的免疫細胞（例えばＴ細胞）の投与を指す。養子細胞免疫療法は、自家（免疫細胞が受容者からの細胞である）、同種異系（免疫細胞が同じ種のドナーからの細胞である）または同系（免疫細胞が受容者と遺伝的に同一のドナーからの細胞である）であり得る。
「自家」とは、グラフトが後に再導入される同じ対象に由来するグラフト（例えば器官、組織、細胞）を指す。
「同種異系」とは、同じ種の異なる対象に由来するグラフトを指す。
本開示のキメラタンパク質またはキメラタンパク質を発現する細胞（例えばタンデム発現カセットまたはタンデム発現カセットを発現する細胞）の「治療有効量」または「有効量」とは、治療される疾患、障害または望ましくない状態の１つまたは複数の症状の改善をもたらすために十分なタンパク質または細胞の量を指す。単独で投与される、個々の活性成分、または単一の活性成分を発現する細胞について言及する場合、治療有効用量とは、その成分またはその成分を発現する細胞の単独の効果を指す。組合せについて言及する場合、治療有効用量とは、連続投与されるか、同時投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、活性成分または組み合わせた付属の活性成分の、活性成分を発現する細胞と組み合わせた量を指す。
「治療する」または「治療」または「改善する」とは、対象の疾患、障害または望ましくない状態の医療管理を指す。一般的に、本開示のキメラタンパク質を発現する宿主細胞を含む適切な用量または治療レジメンは、治療利益または予防利益を誘発するために十分な量において投与される。治療利益または予防／防止利益には、臨床アウトカムの改善；疾患、障害または望ましくない状態と関連付けられる症状の減少または軽減；症状の発生の減少；クオリティ・オブ・ライフの改善；より長い無疾患状態；疾患、障害または望ましくない状態の程度の縮減；疾患状態の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；生存延長；またはそれらの任意の組合せが含まれる。
「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍容量における減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加またはがん性状態と関連付けられる様々な生理学的症状の改善によって証明され得る生物学的効果を指す。また、「抗腫瘍効果」は、血液系腫瘍または腫瘍形成の予防によって証明され得る。
追加の定義は、本開示全体を通して提供される。
導入遺伝子
本開示のタンデム発現カセットは、キメラ貪食受容体（ＣＥＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含む。本明細書において提供されるタンデム発現カセットのある特定の実施形態は、（ａ）標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；および（ｂ）標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインとを含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書において提供されるタンデム発現カセットの他の実施形態は、（ａ）標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；および（ｂ）組換えＴＣＲ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態においては、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに対して５’に位置する。他の実施形態においては、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに対して３’に位置する。
導入遺伝子およびそれらのコードされる細胞免疫療法分子のさらなる態様は、以下の通りに提供される。
Ｉ．キメラ貪食受容体（ＣＥＲ）
本開示のタンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。キメラ貪食受容体は一般的に、（ａ）標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）貪食シグナル伝達ドメイン、および（ｃ）細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態においては、本明細書において説明するキメラ貪食受容体の細胞外ドメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する細胞外スペーサードメインを含んでもよい。
本明細書において説明するキメラ貪食受容体は、前記キメラ貪食受容体を発現するように改変された宿主細胞に、標的抗原に特異的な貪食表現型を与えることができる。ある特定の実施形態においては、本明細書において説明するＣＥＲの発現は、天然には貪食表現型を示さない宿主細胞に、貪食表現型を与える。ある特定の実施形態においては、貪食活性は、食作用活性である。本開示のＣＥＲは、貪食特異性を、ターゲティングされた抗原を発現する標的細胞に再方向付けするために使用され得る。
細胞外ドメイン
本明細書において説明する通り、ＣＥＲは、標的抗原に特異的な細胞外ドメインを含む。ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、標的抗原（例えばホスファチジルセリン）に特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインによる標的分子の結合は、標的分子（例えば受容体またはリガンド）と別の分子との間の相互作用を遮断し、かつ例えば、標的分子のある特定の機能（例えばシグナル伝達）を妨害、低減または除去し得る。一部の実施形態においては、標的分子の結合は、除去のために、ある特定の生物学的経路を誘導するか、または標的分子または標的分子を発現する細胞を特定し得る。
本開示のＣＥＲにおける使用のために好適な結合ドメインは、目的の標的分子、例えばホスファチジルセリンに特異的に結合する任意のポリペプチドまたはペプチドであり得る。結合ドメインの供給源には、様々な種からの受容体の細胞外ドメイン、細胞表面受容体または分子のリガンド、および抗体または抗原結合部分、例として抗体可変領域が含まれる。例えば、結合ドメインは、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖベースのｇｒａｂａｂｏｄｙ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、単一ドメインラクダ抗体（ＶＨＨ）またはドメイン抗体を含み得る。結合ドメインは、ヒト、霊長類、げっ歯類、鳥類またはヒツジに由来し得る。結合ドメインの追加の供給源には、他の種、例としてラクダ（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマから；Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997；Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009；Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993およびNguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998）、コモリザメ（Roux et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998）、スポッティドラットフィッシュ（Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002）またはヤツメウナギ（Herrin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008およびAlder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008）からの抗体の可変領域が含まれる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用する抗原結合領域を形成し得る、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモ二量体（「重鎖抗体」と呼ばれる）である（Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004；Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004；Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006；およびBarthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008）。ある特定の実施形態においては、結合ドメインは、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化結合ドメインである。
ある特定の実施形態においては、ＣＥＲ結合ドメインは、標的疾患抗原に特異的な抗体またはその抗原結合性断片、例として、ＶＨおよびＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む。ある特定の実施形態においては、抗体または抗原結合性断片は、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体または抗原結合性断片である。さらなる実施形態においては、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒトまたはヒト化ＶＨおよびＶＬ領域である。
本開示のＣＥＲの細胞外ドメインが結合する標的分子は、目的の細胞（「標的細胞」）において見られるか、または目的の細胞と関連付けられ得る。例示的な標的細胞には、がん細胞；自己免疫疾患もしくは障害と、または炎症性疾患もしくは障害と関連付けられる細胞；感染性微生物（例えば細菌、ウイルスまたは真菌）；および感染した細胞（例えばウイルス感染細胞）が含まれる。感染性生物、例として哺乳動物寄生生物の細胞もまた、標的細胞として企図される。
ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、プロ貪食マーカーに結合する。本明細書において使用されるとき、プロ貪食マーカーは、アポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシス細胞または感染細胞がその表面上に示し、それぞれ、その細胞を非アポトーシス細胞、非壊死細胞、非ピロトーシス細胞、腫張（ｏｎｃｏｔｉｃ）細胞または非感染細胞から区別する部分（例えばタンパク質、脂質または多糖）である。プロ貪食マーカーは、アポトーシス細胞または壊死細胞上に表面曝露される細胞内部分、アポトーシス細胞または壊死細胞上の糖鎖付加の変更または表面電荷の変更を有する部分、またはアポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシス細胞または腫張細胞に結合した血清部分であり得る。アポトーシス細胞についてのプロ貪食マーカーの例には、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化型低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑおよびトロンボスポンジンが含まれる。また、壊死細胞、腫張細胞およびピロトーシス細胞は、細胞表面上にＰｔｄＳｅｒプロ貪食マーカーを曝露する。貪食受容体は、直接的に、またはプロ貪食マーカーに結合する中間体として可溶性架橋分子を使用して間接的に標的細胞（例えば損傷細胞、感染細胞、アポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシス細胞または腫張細胞）上のプロ貪食マーカーを検出（または結合）し得る。ある特定のそのような実施形態においては、細胞外ドメインによってターゲティングされるプロ貪食マーカーは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化型低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑまたはトロンボスポンジンである。ホスファチジルセリンに結合する例示的なＴｉｍ４結合ドメインは、配列番号９１、配列番号９６、配列番号９１のアミノ酸２３〜２７９または配列番号９６のアミノ酸２５〜３１４を含むアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合する。例示的な腫瘍抗原には、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイス式Ａ抗原、ルイス式Ｙ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｏ−アセチル−ＧＤ２およびＧＤ２が含まれる。
ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原または寄生生物抗原に結合する。
ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、細胞外非シグナル伝達スペーサーまたはリンカードメインを含んでもよい。含まれる場合、そのようなスペーサーまたはリンカードメインは、結合ドメインを宿主細胞表面から離れるように位置させて、適切な細胞−細胞接触、結合および活性化をさらに可能にし得る。細胞外スペーサードメインは一般的に、ＣＥＲの細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。細胞外スペーサーの長さは、選択された標的分子、選択された結合エピトープ、結合ドメインサイズおよび親和性に基づいて、標的分子結合を最適化するために変動し得る（例えばGuest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照のこと）。ある特定の実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ）である。免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域、または変更された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。変更されたＩｇＧ４ヒンジ領域は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号において説明されており、当該ヒンジ領域は、その全体を参照により本明細書に組み込む。特定の実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を有する改変ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
本明細書において説明するＣＥＲにおいて使用され得るヒンジ領域の他の例には、野生型またはその変異型であり得る１型膜タンパク質、例としてＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７の細胞外領域からのヒンジ領域が含まれる。さらなる実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらの組合せから選択される免疫グロブリンＦｃドメインの全てまたは一部を含む（例えばＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照されたく、当該スペーサーは、その全体を参照により本明細書に組み込む）。またさらなる実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＩＩ型Ｃレクチンの柄領域（Ｃ型レクチンドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外ドメイン）を含み得る。ＩＩ型Ｃレクチンには、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄが含まれる。またさらなる実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ：ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）膜近傍ドメインに由来し得る。ＴＬＲ膜近傍ドメインは、ＴＬＲのロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ：ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ）と膜貫通ドメインとの間にある酸性アミノ酸を含む。ある特定の実施形態においては、ＴＬＲ膜近傍ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９膜近傍ドメインである。例示的なＴＬＲ膜近傍ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＴＬＲ４膜近傍ドメインである。
細胞外ドメインは、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタおよびそれらのトランスジェニック種を含む任意の哺乳動物種に由来し得る。ある特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化細胞外ドメインである。
貪食シグナル伝達ドメイン
ＣＥＲの貪食シグナル伝達ドメインは、細胞内エフェクタードメインであり、ＣＥＲの細胞外ドメインの標的分子への結合に応答して、機能的シグナルを細胞に伝達することができる。貪食シグナル伝達ドメインは、十分なシグナル伝達活性を保持する貪食シグナル伝達分子の任意の部分であり得る。一部の実施形態においては、貪食シグナル伝達分子の全長または全長細胞内成分が使用される。一部の実施形態においては、貪食シグナル伝達分子または貪食シグナル伝達分子の細胞内成分の切断部分が使用され、但し、その切断部分は十分なシグナル伝達活性を保持する。さらなる実施形態においては、貪食シグナル伝達ドメインは、貪食シグナル伝達分子の全部分または切断部分の変異型であり、但し、その変異型は十分なシグナル伝達活性を保持する（すなわち、機能的変異型である）。
ＣＥＲにおいて使用され得る例示的な貪食シグナル伝達ドメインには、ＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、Ｔｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメイン、ＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、Ｔｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、Ｓｙｋシグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、ＰＩ３Ｋシグナル伝達ドメイン、ＦｃＲシグナル伝達ドメイン（例えばＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１シグナル伝達ドメイン）、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２［ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ：ＴＹＲＯ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれる］シグナル伝達ドメイン、ＩＴＡＭモチーフ１を伴うＮＦＡＴ活性化タンパク質（ＮＦＡＭ１：ＮＦＡＴ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｉｔｈ ＩＴＡＭ Ｍｏｔｉｆ １）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン、ＴＬＲシグナル伝達ドメイン（例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９シグナル伝達ドメイン）、Ｔｒａｆ２シグナル伝達ドメインまたはＴｒａｆ３シグナル伝達ドメインが含まれる。
ある特定の実施形態においては、貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、配列番号８のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＰＩ３Ｋシグナル伝達ドメイン、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＴＬＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＴＬＲ２シグナル伝達ドメイン、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＴＬＲ３シグナル伝達ドメイン、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＴＬＲ４シグナル伝達ドメイン、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＴＬＲ５シグナル伝達ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＴＬＲ６シグナル伝達ドメイン、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＴＬＲ７シグナル伝達ドメイン、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＴＬＲ８シグナル伝達ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＴＬＲ９シグナル伝達ドメイン、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ２シグナル伝達ドメイン、または配列番号３２のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ３シグナル伝達ドメインについて少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態においては、貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＡｘｌシグナル伝達ドメインまたは配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＰＩ３Ｋシグナル伝達ドメイン、配列番号１２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号１３のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１４のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号１６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号１７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＤＡＰ−１２シグナル伝達ドメイン、配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、配列番号２１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン、配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ２シグナル伝達ドメイン、配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ３シグナル伝達ドメイン、配列番号２５のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ４シグナル伝達ドメイン、配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ５シグナル伝達ドメイン、配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ６シグナル伝達ドメイン、配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ７シグナル伝達ドメイン、配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ８シグナル伝達ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ９シグナル伝達ドメイン、配列番号３１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｒａｆ２シグナル伝達ドメイン、または配列番号３２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｒａｆ３シグナル伝達ドメインである。
切断型貪食シグナル伝達ドメインは、そのＮ末端、そのＣ末端において、Ｎ末端およびＣ末端の両方において切断され得る。ある特定の実施形態においては、ＭＲＣ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＭＥＲＴＫ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｙｒｏ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ａｘｌ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＥＬＭＯ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｒａｆ６貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｓｙｋ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＰＩ３Ｋ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃεＲＩγ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ２Ａ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ２Ｃ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ３Ａ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＢＡＦＦ−Ｒ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＤＡＰ−１２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＮＦＡＭ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＣＤ７９ｂ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ４貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ５貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ６貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ７貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ８貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ９貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｒａｆ２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；またはＴｒａｆ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対応するそのＮ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されている。
ある特定の実施形態においては、ＭＲＣ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＭＥＲＴＫ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｙｒｏ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ａｘｌ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＥＬＭＯ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｒａｆ６貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｓｙｋ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＰＩ３Ｋ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃεＲＩγ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ２Ａ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ２Ｃ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＦｃγＲ３Ａ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＢＡＦＦ−Ｒ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＤＡＰ−１２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＮＦＡＭ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＣＤ７９ｂ貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ１貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ４貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ５貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ６貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ７貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ８貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；ＴＬＲ９貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；Ｔｒａｆ２貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されており；またはＴｒａｆ３貪食シグナル伝達ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対応するそのＣ末端において１、２、３、４、５つまたはそれよりも多いアミノ酸切断されている。
ある特定の実施形態においては、切断型ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインは、デスドメインを含むが、Ｔｏｌｌ／インターロイキン１受容体（ＴＩＲ：Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ホモロジードメインを欠く。そのような切断型ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインの例は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、切断型ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインは、ＴＩＲドメインを含む。ＴＩＲドメインを含む切断型ＭｙＤ８８貪食シグナル伝達ドメインの例は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。例示的な切断型Ｔｒａｆ６シグナル伝達ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。例示的な切断型ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。例示的な切断型ＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態においては、ＣＥＲは、第１の貪食シグナル伝達ドメインおよび第２の貪食シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態においては、ＣＥＲは、同じ分子からの第１の貪食シグナル伝達ドメインおよび第２の貪食シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態においては、第１の貪食シグナル伝達ドメインおよび第２の貪食シグナル伝達ドメインは、異なる分子からのドメインである。
貪食シグナル伝達ドメインは、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタおよびそれらのトランスジェニック種を含む哺乳動物種に由来し得る。
膜貫通ドメイン
本開示のＣＥＲは、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとを接続し、かつこれらの間に位置する膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、宿主細胞膜を横断し、かつ宿主細胞膜においてＣＥＲを固定する疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、結合ドメインに、または存在する場合細胞外スペーサードメインに直接的に融合され得る。ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、膜内在性タンパク質［例えば受容体、表面抗原分類（ＣＤ：ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分子、酵素、トランスポーター、細胞接着分子その他］に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインまたは貪食シグナル伝達ドメインと同じ分子から選択され得る（例えばＴＬＲ４貪食シグナル伝達ドメインおよびＴＬＲ４膜貫通ドメインを含むＣＥＲ、またはＴｉｍ４結合ドメインおよびＴｉｍ４膜貫通ドメインを含むＣＥＲ）。ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインは各々、異なる分子から選択される。他の実施形態においては、膜貫通ドメインおよび貪食シグナル伝達ドメインは各々、異なる分子から選択される。また他の実施形態においては、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインおよび貪食シグナル伝達ドメインは各々、異なる分子から選択される。
ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ（例えばＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１）、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＣＤ４、ＤＡＰ１２、ＭＲＣ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９膜貫通ドメインを含む。
ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＴｉｍ３膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａ膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｂ２膜貫通ドメイン、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃ膜貫通ドメイン、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａ膜貫通ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＦｃεＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦｃαＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴＬＲ１膜貫通ドメイン、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＴＬＲ２膜貫通ドメイン、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＴＬＲ３膜貫通ドメイン、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＴＬＲ４膜貫通ドメイン、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＴＬＲ５膜貫通ドメイン、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＴＬＲ６膜貫通ドメイン、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＴＬＲ７膜貫通ドメイン、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＴＬＲ８膜貫通ドメイン、または配列番号６２のアミノ酸配列を含むＴＬＲ９膜貫通ドメインについて少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％の同一性を有する配列を含む。
ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｉｍ３膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ２Ａ膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ２Ｂ２膜貫通ドメイン、配列番号４３のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ２Ｃ膜貫通ドメイン、配列番号４４のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃγＲ３Ａ膜貫通ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃεＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＦｃαＲ１膜貫通ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号５２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＭＲＣ１膜貫通ドメイン、配列番号５４のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ１膜貫通ドメイン、配列番号５５のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ２膜貫通ドメイン、配列番号５６のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ３膜貫通ドメイン、配列番号５７のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ４膜貫通ドメイン、配列番号５８のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ５膜貫通ドメイン、配列番号５９のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ６膜貫通ドメイン、配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ７膜貫通ドメイン、配列番号６１のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ８膜貫通ドメイン、または配列番号６２のアミノ酸配列を含むかまたはからなるＴＬＲ９膜貫通ドメインである。
膜貫通ドメインは、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタおよびそれらのトランスジェニック種を含む任意の哺乳動物種に由来し得る。
ある特定の実施形態においては、キメラ貪食受容体は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、それらのトランスジェニック種またはそれらの任意の組合せを含む任意の哺乳動物種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、キメラ貪食受容体は、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化貪食受容体である。
本明細書において説明するＣＥＲの１つのドメインの別のドメインへの直接的融合は、介在性接合部アミノ酸の存在を排除しないと理解される。接合部アミノ酸は、天然または非天然（例えばキメラタンパク質のコンストラクト設計から生じる）であり得る。
本開示のタンデム発現カセットにおける使用のためのＣＥＲの実施形態は、表１において提供され、また、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０５３５５３号および同ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／５２２９７号において説明されており、当該出願の各々は、その全体を参照により組み込む。
Figure 2021519580
Figure 2021519580
ＩＩ．キメラ抗原受容体
ある特定の実施形態においては、本開示のタンデム発現カセットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子を含む。キメラ抗原受容体は、一般的に：標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；細胞内シグナル伝達ドメイン；および細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインを含む組換え受容体である。
本開示のＣＡＲにおける使用のために好適な結合ドメインには、任意の抗原結合性ポリペプチドが含まれる。結合ドメインは、例えば全長重鎖、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ＣＤＲおよびｓｃＦｖを含む抗体またはその抗原結合性断片を含み得る。ある特定の実施形態においては、ＣＡＲ結合ドメインは、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化ＣＡＲ結合ドメインである。
ある特定の実施形態においては、本開示において提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、細胞外非シグナル伝達スペーサーまたはリンカードメインを含んでもよい。含まれる場合、そのようなスペーサーまたはリンカードメインは、結合ドメインを、宿主細胞表面から離れるように位置させて、適切な細胞−細胞接触、結合および活性化をさらに可能にし得る。細胞外スペーサードメインは一般的に、ＣＡＲの細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。細胞外スペーサーの長さは、選択された標的分子、選択された結合エピトープ、結合ドメインサイズおよび親和性に基づいて、標的分子結合を最適化するために変動し得る（例えばGuest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照のこと）。ある特定の実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ）である。免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域または変更された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。変更されたＩｇＧ４ヒンジ領域は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号において説明されており、当該ヒンジ領域は、その全体を参照により本明細書に組み込む。特定の実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を有する改変ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
本明細書において説明するＣＡＲにおいて使用され得るヒンジ領域の他の例には、野生型またはその変異型であり得る１型膜タンパク質、例としてＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７の細胞外領域からのヒンジ領域が含まれる。さらなる実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらの組合せから選択される免疫グロブリンＦｃドメインの全てまたは一部を含む（例えばＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照されたく、当該スペーサーは、その全体を参照により本明細書に組み込む）。またさらなる実施形態においては、細胞外スペーサードメインは、ＩＩ型Ｃレクチンの柄領域（Ｃ型レクチンドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外ドメイン）を含み得る。ＩＩ型Ｃレクチンには、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄが含まれる。
本開示のＣＡＲは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを接続し、かつこれらの間に位置する膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、宿主細胞膜を横断し、かつ宿主細胞膜においてＣＡＲを固定する疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、結合ドメインに、または存在する場合細胞外スペーサードメインに直接的に融合され得る。ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインは、膜内在性タンパク質［例えば受容体、表面抗原分類（ＣＤ）分子、酵素、トランスポーター、細胞接着分子その他］に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインと同じ分子から選択され得る（例えば、ＣＡＲはＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む）。ある特定の実施形態においては、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインは各々、異なる分子から選択される。他の実施形態においては、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは各々、異なる分子から選択される。また他の実施形態においては、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは各々、異なる分子から選択される。
本開示のＣＡＲにおける使用のための例示的な膜貫通ドメインには、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５およびＺａｐ７０が含まれる。例示的なＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内エフェクタードメインであり、ＣＡＲの細胞外ドメインの標的分子への結合に応答して、機能的シグナルを細胞に伝達することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、十分なシグナル伝達活性を保持する細胞内シグナル伝達分子の任意の部分であり得る。一部の実施形態においては、細胞内シグナル伝達分子の全長または全長細胞内成分が使用される。一部の実施形態においては、細胞内シグナル伝達分子または細胞内シグナル伝達分子の細胞内成分の切断部分が使用され、但し、その切断部分は十分なシグナル伝達活性を保持する。さらなる実施形態においては、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達分子の全部分または切断部分の変異型であり、但し、その変異型は十分なシグナル伝達活性を保持する（すなわち、機能的変異型である）。
ある特定の実施形態においては、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有シグナル伝達ドメインを含む。ＩＴＡＭ含有シグナル伝達ドメインは一般的に、少なくとも１つの（１、２、３、４つまたはそれよりも多い）ＩＴＡＭを含有し、これは、ＹＸＸＬ／Ｉ−Ｘ６−８−ＹＸＸＬ／Ｉの保存されたモチーフを指す。ＩＴＡＭ含有シグナル伝達ドメインは、抗原結合またはリガンド係合後、Ｔ細胞活性化シグナル伝達を開始し得る。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインには、例えばＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。本開示のＣＡＲにおいて使用され得る例示的なＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１６６または１６７のアミノ酸配列を含む。
ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、主要な、または古典的な（例えばＩＴＡＭ駆動）活性化シグナルと共に活性化された場合、Ｔ細胞応答、例としてＴ細胞活性化、サイトカイン産生、増殖、分化、生存、エフェクター機能またはそれらの組合せを促進する、または向上させる共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでもよい。ＣＡＲにおける使用のための共刺激性シグナル伝達ドメインには、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＡＲＤ１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２２６、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０またはそれらの任意の組合せが含まれる。特定の実施形態においては、共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメインを含む。本開示のＣＡＲにおいて使用され得る例示的なＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１６９または１７０のアミノ酸配列を含む。例示的な４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、ＣＡＲは、１、２つまたはそれよりも多い共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態においては、キメラ抗原受容体は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、それらのトランスジェニック種またはそれらの任意の組合せを含む任意の哺乳動物種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、キメラ抗原受容体は、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化抗原受容体である。
ある特定の実施形態においては、ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲまたは第３世代ＣＡＲである。第１世代ＣＡＲは一般的に、ＣＤ３ζ、ＦｃγＲＩの細胞内シグナル伝達ドメインまたは他のＩＴＡＭ含有活性化ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを有して、Ｔ細胞活性化シグナルを提供する。第２世代ＣＡＲは、共刺激性シグナル伝達ドメイン（例えば内因性Ｔ細胞共刺激性受容体、例としてＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＩＣＯＳからの共刺激性シグナル伝達ドメイン）をさらに含む。第３世代ＣＡＲは、ＩＴＡＭ含有活性化ドメイン、第１の共刺激性シグナル伝達ドメインおよび第２の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態においては、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体ベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＲ−ＣＡＲ）である。ＴＣＲ−ＣＡＲは、可溶性ＴＣＲを一般的に含むヘテロ二量体融合タンパク質であり（ＶαドメインおよびＣαドメインを含むポリペプチド鎖、およびＶβドメインおよびＣβドメインを含むポリペプチド鎖）、ＶβＣβポリペプチド鎖は、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達成分（例えばＩＴＡＭ含有活性化ドメインおよび適宜、共刺激性シグナル伝達ドメイン）に連結されている（例えばWalseng et al., 2017 Scientific Reports 7:10713を参照のこと）。
本開示のＣＡＲは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患抗原を含む様々な抗原をターゲティングし得る。ＣＡＲがターゲティングし得る例示的な腫瘍抗原には、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイス式Ａ抗原、ルイス式Ｙ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｏ−アセチル−ＧＤ２およびＧＤ２が含まれる。
ＩＩＩ．Ｔ細胞受容体結合タンパク質
ある特定の実施形態においては、本開示のタンデム発現カセットは、組換えＴＣＲ結合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。組換えＴＣＲ結合タンパク質には、α鎖ポリペプチドとβ鎖ポリペプチドとのヘテロ二量体またはγ鎖ポリペプチドとδ鎖ポリペプチドとのヘテロ二量体からなる「伝統的な」ＴＣＲ；例えば単鎖ＴＣＲ、単一ドメインＴＣＲ、可溶性ＴＣＲ融合ＴＣＲタンパク質およびＴＣＲ融合コンストラクト［ＴＲｕＣ（商標）］を含む、その結合性断片および融合タンパク質が含まれる。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＴＣＲベータ可変領域およびＴＣＲベータ定常領域を含む組換えＴＣＲベータ鎖をコードするポリヌクレオチドと、ＴＣＲアルファ可変領域およびＴＣＲアルファ定常領域を含む組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。ある特定の実施形態においては、組換えＴＣＲは、高親和性ＴＣＲである。
ある特定の実施形態においては、組換えＴＣＲ結合タンパク質は、フレキシブルリンカーによってＶβに接合されたＶαを含む単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ＴＣＲ）である。一部の実施形態においては、ｓｃＴＣＲは、Ｖα−リンカー−Ｖβポリペプチドを含む。他の実施形態においては、ｓｃＴＣＲは、Ｖβ−リンカー−Ｖαポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態においては、組換えＴＣＲ結合タンパク質は、単一ドメインＴＣＲ（例えばＶβ）である。
ある特定の実施形態においては、組換えＴＣＲ結合タンパク質は、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）融合タンパク質である。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｓｃＴＣＲを含む結合ドメイン（ＴＣＲ Ｖβドメインに連結したＴＣＲ Ｖαドメイン）と、適宜の細胞外スペーサーと、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζ ＩＴＡＭ含有活性化ドメインおよび適宜の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む（Aggen et al., 2012, Gene Ther. 19:365-374；Stone et al., Cancer Immunol. Immunother. 2014, 63:1163-76を参照のこと）。
ある特定の実施形態においては、組換えＴＣＲ結合タンパク質は、ＴＣＲ融合コンストラクト［ＴＲｕＣ（商標）コンストラクト］である（米国特許公開公報第２０１７／０１６６６２２号を参照のこと）。ＴＲｕＣ（商標）コンストラクトは、ＴＣＲ複合体の少なくとも１つの成分（ＣＤ３γ、ＣＤ３εまたはＣＤ３δ）に融合した抗原特異的結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）を含み、ＴＣＲ複合体成分融合タンパク質を形成する。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３εポリペプチド、ＣＤ３γポリペプチド、ＣＤ３δポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＴＣＲ α鎖ポリペプチドおよびＴＣＲ β鎖ポリペプチドを含有する。ＴＣＲ複合体成分融合タンパク質は、ＴＣＲ複合体の他の成分と会合して機能的完全ＴＣＲ融合複合体を形成することができる。ＴＣＲとは異なって、ＴＲｕＣ（商標）コンストラクトは、ＭＨＣ独立様式において標的抗原に結合することができる。
ある特定の実施形態においては、ＴＣＲ結合タンパク質は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、それらのトランスジェニック種またはそれらの任意の組合せを含む任意の哺乳動物種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、ＴＣＲ結合タンパク質は、マウス、キメラ、ヒトまたはヒト化ＴＣＲ結合タンパク質である。
本開示のＴＣＲ結合タンパク質は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原および自己免疫疾患抗原を含む様々な抗原に結合し得る。組換えＴＣＲ結合タンパク質がターゲティングし得る例示的な腫瘍抗原には、ＷＴ−１、メソテリン、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＨＰＶ Ｅ７、サバイビン、α−フェトプロテインおよび腫瘍特異的新生抗原が含まれる。本開示のタンデム発現カセットにおいて使用され得る例示的なＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲは、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１５／１８４２２８号（その全体を参照により組み込む）において提供される。ある特定の実施形態においては、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。配列番号９０のアミノ酸配列は、ＴＣＲβ鎖配列とＴＣＲα鎖配列との間にＰ２Ａ自己切断ペプチドを含有し、これは、宿主細胞において切断されて、２つのポリペプチド鎖を形成し得る。したがって、ある特定の実施形態においては、配列番号９０によって表されるＴＣＲは、二量体化してαβＴＣＲを形成することができる別々のＴＣＲβおよびＴＣＲαポリペプチド鎖を含む。ある特定の実施形態においては、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲは、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＶβを含む。ある特定の実施形態においては、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲは、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶαを含む。さらなる実施形態においては、ＨＰＶ１６特異的Ｅ７ ＴＣＲは、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＶβと、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶαとを含む。
ある特定の実施形態においては、ＴＣＲ Ｃαドメイン、Ｃβドメインまたはこれらの両方は、非改変ＴＣＲには存在しない、２つの定常ドメインシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合を創出するシステイン置換を含む。そのような改変ＴＣＲは、より安定なヘテロ二量体を形成し得る。特定の実施形態においては、Ｃαドメインは、野生型タンパク質配列の４８位におけるＴｈｒ→Ｃｙｓ置換を含み、Ｃβドメインは、野生型タンパク質配列の５６位におけるＳｅｒ→Ｃｙｓ置換を含む（ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５／１８４２２８号を参照のこと）。例示的なシステイン改変ＴＣＲ Ｃβ定常領域は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態においては、ＴＣＲは、膜貫通ドメインの疎水性を増大させるための、αおよびβ鎖のうちの１つまたは両方の定常領域の膜貫通ドメインにおける１、２または３つのアミノ酸の、疎水性アミノ酸による置換を含む。ある特定の実施形態においては、ＴＣＲα鎖のＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４およびＧｌｙ１１５から選択される残基のうちの１、２または３つは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＴｒｐにより置換される。例示的なシステイン改変「ＬＶＬ」置換ＴＣＲ Ｃα領域は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットによってコードされるＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質は、同じ抗原をターゲティングする。他の実施形態においては、タンデム発現カセットによってコードされるＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質は各々、異なる抗原をターゲティングする。
ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクターおよび改変宿主細胞
ある特定の態様においては、本開示は、本明細書において説明する受容体（例えばＣＥＲ、ＣＡＲおよびＴＣＲ結合タンパク質）のうちの任意の１つまたは複数をコードする核酸分子を提供する。核酸とは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを指す場合があり、アンチセンスＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含む互いに相補する核酸の正の鎖および負の鎖を含み得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの天然形態または合成形態であり得る。所望の受容体をコードする核酸配列は、例えばSambrook et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)およびAusubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 2003)において説明される通り、標準技術を使用する当該技術分野において公知の組換え法を使用して、例として所望の配列またはその一部を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の配列またはその一部を含むことが公知のベクターからの配列を派生させることによって、または所望の配列またはその一部を含有する細胞または組織から直接的に配列またはその一部を単離することによって、取得または産生することができる。あるいは、目的の配列は、クローニングするのではなく、合成産生することができる。
本明細書において提供される受容体組成をコードするポリヌクレオチドは、任意の動物、例としてヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタまたはそれらの組合せに由来し得る。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットに含有される少なくとも１つの受容体または両方の受容体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが挿入される宿主細胞と同じ動物種からのポリヌクレオチドである。
ある特定の実施形態においては、受容体をコードするポリヌクレオチドは、前駆体タンパク質の分泌経路へのターゲティングのための５’末端におけるシグナルペプチド（リーダーペプチドまたはシグナル配列とも呼ばれる）をコードする配列を含む。シグナルペプチドは、細胞プロセシングおよび受容体の宿主細胞膜への局在化中に細胞外ドメインのＮ末端から切断されてもよい。シグナルペプチド配列が切断または除去されたポリペプチドは、成熟ポリペプチドとも呼ばれ得る。本開示の受容体において使用され得るシグナルペプチドの例には、例えばＧＭ−ＣＳＦ（配列番号６４のアミノ酸配列）またはＴｉｍ４（配列番号６５のアミノ酸配列）を含む、内因性分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが含まれる。本明細書において使用されるとき、本明細書において提供される受容体、例えばＣＥＲ、ＣＡＲまたはＴＣＲ結合タンパク質のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列についての言及は、シグナル配列を含んでもよく、除外してもよい。シグナルペプチド配列を含む本明細書において開示される配列について、シグナルペプチド配列は、コードされるタンパク質を細胞外膜へ輸送することができる別のシグナルペプチドで置き換えてもよいことが当業者によって理解される。
ある特定の実施形態においては、本開示のポリヌクレオチドをコードする受容体は、ポリヌクレオチドを含む標的宿主細胞における効率的な発現のためにコドン最適化される（例えばScholten et al., Clin. Immunol. 119:135-145 (2006)を参照のこと）。本明細書において使用されるとき、「コドン最適化した」ポリヌクレオチドは、目的の宿主細胞におけるｔＲＮＡの存在量に対応するサイレント変異により改変したコドンを有する異種のポリヌクレオチドを含む。
本開示において提供される少なくとも２つの導入遺伝子（例えばＣＥＲおよびＣＡＲ、ＣＥＲおよびＴＣＲ結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、タンデム発現カセットを構成するために使用され得る。タンデム発現カセットとは、少なくとも２つの導入遺伝子のタンデム発現または共発現のための、同じ組の調節配列の制御下の、または同じ組の調節配列に作動可能に連結された少なくとも２つの導入遺伝子を含むベクター核酸の成分を指す。本開示のタンデム発現カセットにおいて使用され得る調節配列には、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例としてスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；タンパク質分泌を向上させる配列；またはそれらの任意の組合せが含まれる。
ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、空間的制御および時間的制御を最適化するように構築され得る。例えば、タンデム発現カセットは、空間的制御および時間的制御を最適化するプロモーターエレメントを含み得る。一部の実施形態においては、タンデム発現カセットは、タンデム発現カセットの器官、細胞種（例えば免疫細胞）または病理学的微小環境、例として腫瘍または感染組織への特異的誘導を可能にする組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを含む。「エンハンサー」は、協同的に、または独立して機能して転写を活性化し得る追加のプロモーターエレメントである。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、構成的プロモーターを含む。本開示のタンデム発現カセットにおける使用のための例示的な構成的プロモーターは、ＥＦ−１αプロモーターである。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、誘導性プロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、組織特異的プロモーターを含む。
タンデム発現カセット内に含有される少なくとも２つの導入遺伝子は、任意の順序で存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドＣＥＲおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むタンデム発現カセットは、５’〜３’へ：ＣＥＲ−ＣＡＲまたはＣＡＲ−ＣＥＲのように配置され得る。別の例においては、ポリヌクレオチドＣＥＲおよびＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むタンデム発現カセットは、５’〜３’へ：ＣＥＲ−ＴＣＲまたはＴＣＲ−ＣＥＲのように配置され得る。
ある特定の実施形態においては、会合して多量体または複合体を形成する２つまたはそれよりも多いポリペプチド鎖を含む受容体は、タンデム発現コンストラクト内の２つまたはそれよりも多いポリヌクレオチド分子によってコードされ得る。本開示のタンデム発現コンストラクトにおいて発現のために企図される例示的な多量体受容体には、多重鎖ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＴＣＲ−ＣＡＲおよびＴＲｕＣ（商標）コンストラクトが含まれる。したがって、ＣＥＲおよびＴＣＲをコードする例示的なタンデム発現カセット実施形態は、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
ある特定の実施形態においては、本開示のタンデム発現カセットは、単一のｍＲＮＡからの多数のタンパク質の共発現を可能にするために、タンデム発現カセット内に含有される各ポリヌクレオチド間に配置される配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはペプチド切断部位、例としてフューリン切断部位またはウイルス２Ａペプチドを含み得る。例えば、ＩＲＥＳ、フューリン切断部位またはウイルス２Ａペプチドは、タンデム発現カセット内のＣＥＲをコードするポリヌクレオチドとＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとの間に配置され得る。別の例においては、ＩＲＥＳ、フューリン切断部位またはウイルス２Ａペプチドは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各々の間に配置され得る。ある特定の実施形態においては、ウイルス２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、***ウイルス（Ｆ２Ａ）またはそれらの変異型である。例示的なＴ２Ａペプチドは、配列番号６７、６８、６９および７５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。例示的なＰ２Ａペプチドは、配列番号７０または７１のアミノ酸配列を含む。例示的なＥ２Ａペプチド配列は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。例示的なＦ２Ａペプチド配列は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
本開示のタンデム発現カセットのある特定の実施形態は、標的抗原（例えば腫瘍抗原）に特異的なＣＡＲ／またはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドと、プロ貪食マーカー（例えばアポトーシスマーカー、例としてホスファチジルセリン）に結合するＣＥＲをコードするポリヌクレオチドとを含む。ＣＡＲ／またはＴＣＲによる標的抗原を発現する標的細胞の結合に際して、そのようなタンデム発現カセットを発現するように改変した細胞は、標的細胞のアポトーシスを誘導する。アポトーシスは、標的細胞上のプロ貪食マーカー、例としてホスファチジルセリンの曝露を誘導し、その後、ホスファチジルセリンは、損傷細胞またはアポトーシス細胞をＣＥＲによる貪食にターゲティングし得る。
本開示の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＴＬＲ４貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ａを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ５−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＥＲ５と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示の別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＴＬＲ５貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｂを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ１９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＥＲ１９と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示の別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）Ｔｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＴＬＲ８貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｃを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＥＲ２１と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示の別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＮＦＡＭ１貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｄを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ２５−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＥＲ２５と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示の別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＴＬＲ２貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｅを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ２７−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＥＲ２７と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示の別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、Ｔｒａｆ６貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｆを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＥＲ２９と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
本開示のまた別の例示的なタンデム発現カセットは、（ａ）ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む細胞外ドメインと、Ｔｒａｆ３貪食シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続するＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むＣＥＲをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＴＣＲベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド；および（ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含むＨＰＶ−Ｅ７特異的組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む（図１Ｇを参照のこと）。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチドの間に散在する２Ａペプチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットは、ＣＥＲおよびＴＣＲポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥＦ−１αプロモーターを含む。ある特定の実施形態においては、そのような例示的なタンデム発現カセット（「ＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ」）は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＥＲ３１と、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲとを含む。
所望のタンデム発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、目的の宿主細胞（例えば免疫細胞）への導入のために、適切なベクター、例えばウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクターおよび非ウイルスベクター、例として脂質ベースのＤＮＡベクター、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ、ＣＥＬｉＤおよびトランスポゾン媒介遺伝子移行（ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）に挿入され得る。本開示のタンデム発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、任意の好適なベクター、例として発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターまたはシークエンシングベクターにクローニングされ得る。ある特定の実施形態においては、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲまたはＴＣＲ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、共に接合されて単一のポリヌクレオチドになり、その後、ベクターに挿入される。他の実施形態においては、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲまたはＴＣＲ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現されるアミノ酸配列が機能的ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲを産生するように、ベクターに別々に挿入され得る。タンデム発現カセットをコードするベクターは、「タンデム発現ベクター」と本明細書において呼ばれる。
ある特定の実施形態においては、ベクターは、タンデム発現カセットをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態においては、ベクターは、ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質をコードするタンデム発現カセットを含む。
ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセットの長期統合および娘細胞への伝播を可能にするベクターが利用される。例には、ウイルスベクター、例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ポックスウイルスまたはレトロウイルス、例としてレンチウイルスベクターが含まれる。レンチウイルスに由来するベクターは、長期遺伝子移行を達成するために使用され、非増殖細胞、例として肝細胞に形質導入する能力、および低免疫原性を含む、ベクターに優る付加利益を有し得る。
ある特定の実施形態においては、エピソーム性を保持する非統合ベクターは、本開示のタンデム発現カセットのために使用される。非統合ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、および非統合性になるように変異させた統合ウイルスベクター、例として非統合レンチウイルスベクターおよび非統合フォーミーウイルスベクターが含まれる。
コアウイルスをコードするベクターは、「ウイルスベクター」と本明細書において呼ばれる。ヒト遺伝子療法適用のために特定されたウイルスベクターを含む、本開示の組成物との使用のために好適な多数の使用可能なウイルスベクターがある（Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001を参照のこと）。好適なウイルスベクターには、ＲＮＡウイルスに基づくベクター、例としてレトロウイルス由来ベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）由来ベクターが含まれ、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えばレンチウイルス由来ベクターが含まれる。ＨＩＶ−１由来ベクターは、このカテゴリーに属する。他の例には、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶおよびマエディビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターが含まれる。レトロウイルス性およびレンチウイルス性ウイルスベクターを使用する方法、および哺乳動物宿主細胞にキメラ受容体導入遺伝子を含有するウイルス粒子を形質導入するための細胞をパッケージングする方法は、当該技術分野において公知であり、例えば米国特許第８，１１９，７７２号；Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011；Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005；Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003；Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010；Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009において以前に説明されている。また、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターのコンストラクトおよび発現系は、市販されている。
ある特定の実施形態においては、ウイルスベクターは、タンデム発現カセットをコードする非内因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために使用される。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。また、ウイルスベクターは、形質導入についてのマーカーをコードする核酸配列を含み得る。ウイルスベクターのための形質導入マーカーは、当該技術分野において公知であり、薬物抵抗性を与え得る選択マーカー、または検出可能なマーカー、例として蛍光マーカー、もしくはフローサイトメトリー等の方法によって検出され得る細胞表面タンパク質を含む。特定の実施形態においては、ウイルスベクターは、蛍光タンパク質（例えば緑色、黄色）を含む形質導入についての遺伝子マーカー、ヒトＣＤ２の細胞外ドメインまたは切断型ヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔまたはｔＥＧＦＲ；Wang et al., Blood 118:1255, 2011を参照のこと）をさらに含む。例示的なｔＥＧＦＲ配列は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
また、ポリヌクレオチドデリバリーのために、例えばアデノウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベースのベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）由来のベクターを含むＤＮＡウイルスベクターを含む他のウイルスベクターを使用することができる（Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998）。
また、遺伝子療法のために最近開発された他のウイルスベクターは、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。そのようなベクターには、バキュロウイルスおよびα−ウイルス由来のベクター（Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40, Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab）またはプラスミドベクター（例としてｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙまたは他のトランスポゾンベクター）が含まれる。
時間的な制御が所望される場合、タンデム発現カセットベクターは、形質導入された細胞の誘導性枯渇を可能にするエレメントを含み得る。例えば、そのようなベクターは、誘導性自殺遺伝子を含み得る。自殺遺伝子は、アポトーシス遺伝子または剤（例えば薬物）への感受性を与える遺伝子であり得る。例示的な自殺遺伝子には、化学誘導性カスパーゼ９（ｉＣＡＳＰ９）（米国特許公開公報第２０１３／００７１４１４号）、化学誘導性Ｆａｓ、またはガンシクロビルへの感受性を与える単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が含まれる。さらなる実施形態においては、タンデム発現カセットベクターは、関連抗体の注入に際して、形質導入された細胞の枯渇を可能にする公知の細胞表面抗原を発現するように設計され得る。形質導入された細胞の枯渇のために使用され得る細胞表面抗原およびそれらの関連抗体の例には、ＣＤ２０およびリツキシマブ、ＲＱＲ８（ＣＤ３４選択および抗ＣＤ２０枯渇を可能にする混合ＣＤ３４およびＣＤ２０エピトープ）およびリツキシマブ、ならびにＥＧＦＲおよびセツキシマブが含まれる。
また、誘導性ベクター系、例として、ドキシサイクリンにより導入遺伝子発現を活性化するテトラサイクリン（Ｔｅｔ）−Ｏｎベクター系（Heinz et al., Hum. Gene Ther. 2011, 22:166-76）は、タンデム発現カセットの誘導性発現のために使用され得る。また、小分子応答転写因子は、発現を調節するために使用され得る。また、タンデム発現カセットの誘導性発現は、ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ構造に導入したフックおよびストレプトアビジン結合タンパク質を通して小胞体膜に固定したストレプトアビジンに基づく選択フック（ＲＵＳＨ）系を使用する保持を介して達成することができ、ここでは、ビオチンの系への添加は、小胞体からのＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲの放出をもたらす（Agaugue et al., 2015, Mol. Ther. 23(Suppl. 1):S88）。
ある特定の実施形態においては、また、タンデム発現カセット改変宿主細胞は、１つまたは複数の小ＧＴＰアーゼを共発現するように改変され得る。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ、小（約２１ｋＤａ）シグナル伝達Ｇタンパク質のファミリーおよびまた、Ｒａｓスーパーファミリーのサブファミリーは、様々な細胞種におけるアクチン細胞骨格組織化を調節し、食作用中の偽足伸長およびファゴソーム閉鎖を促進する（例えばCastellano et al., 2000, J. Cell Sci. 113:2955-2961を参照のこと）。貪食は、繋ぎ止められた細胞または粒子の下のＦ−アクチン動員、および細胞または粒子内部移行をもたらす膜伸長を可能にするＦ−アクチン再配置を必要とする。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼには、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、ＲｈｏＧおよびＣＤＣ４２が含まれる。他の小ＧＴＰアーゼ、例としてＲａｐ１は、補体媒介食作用の調節に関与する。小ＧＴＰアーゼとＣＥＲをコードするタンデム発現カセットとの共発現は、宿主細胞による標的細胞または粒子内部移行および／またはファゴソーム形成を促進し、または向上させ得る。一部の実施形態においては、ＧＴＰアーゼをコードする組換え核酸分子は、タンデム発現カセット含有ベクターとは別々のベクターにコードされる。他の実施形態においては、ＧＴＰアーゼをコードする組換え核酸分子は、タンデム発現カセットと同じベクターにコードされる。ＧＴＰアーゼおよびタンデム発現は、同じベクターの異なるプロモーターの調節下で（例えば異なるマルチクローニング部位において）発現され得る。あるいは、タンデム発現カセットおよびＧＴＰアーゼは、マルチシストロン性ベクターにおいて１つのプロモーターの調節下で発現され得る。
タンデム発現カセットと共に共発現され得るＧＴＰアーゼの例には、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｂ５（Ｒａｂ５ａとも呼ばれる）、Ｒａｂ７、Ｒａｐ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＧ、ＣＤＣ４２またはそれらの任意の組合せが含まれる。特定の実施形態においては、ＧＴＰアーゼは、配列番号８３のＲａｃ１アミノ酸配列、配列番号８４のＲａｂ５アミノ酸配列、配列番号８５のＲａｂ７アミノ酸配列、配列番号８６のＲａｐ１アミノ酸配列、配列番号８７のＲｈｏＡアミノ酸配列、配列番号１０８のＣＤＣ４２アミノ酸配列またはそれらの任意の組合せと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一である配列を含むか、またはその配列である。ある特定の実施形態においては、ＧＴＰアーゼの発現は、タンデム発現カセットによってコードされるＣＥＲがその標的抗原に結合するために十分な時間後、ＧＴＰアーゼの発現が作動されるように、宿主細胞において誘導または調節される。さらなる実施形態においては、ＧＴＰアーゼの発現は、標的抗原を発現する細胞のＣＥＲ媒介貪食に十分な時間後、作動解除され得る。
ある特定の実施形態においては、対象から得られた免疫細胞等の細胞は、本明細書において説明するタンデム発現カセットを導入することによって、非天然または組換え細胞（例えば非天然または組換え免疫細胞）に遺伝子改変される場合があり、それによって、細胞は、細胞表面局在化ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲを発現する。ある特定の実施形態においては、宿主細胞は、免疫細胞、例として骨髄系前駆細胞またはリンパ球前駆細胞である。タンデム発現カセットまたはタンデム発現カセットを含むベクターを含むように改変され得る例示的な免疫細胞には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、リンパ球前駆体細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆体細胞、成熟骨髄細胞、単球またはマクロファージが含まれる。
ある特定の実施形態においては、Ｂ細胞は、本開示のタンデム発現カセットを発現するように遺伝子改変される。Ｂ細胞は、炎症部位への輸送、抗原を内部移行および提示することができること、Ｔ細胞を共刺激することができること、高増殖性および自己再生性（生涯持続する）を含む宿主細胞として有益であり得るある特定の特性を有する。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変Ｂ細胞は、貪食された標的細胞または貪食された標的粒子をより小さいペプチドに消化し、それらを、ＭＨＣ分子を介してＴ細胞に提示することができる。タンデム発現カセット改変Ｂ細胞による抗原提示は、免疫応答の非ターゲティング抗原への抗原拡張に寄与し得る。Ｂ細胞は、Ｂ細胞系統にコミットされた前駆細胞もしくは前駆体細胞（例えばプレプロＢ細胞、プロＢ細胞およびプレＢ細胞）；未成熟かつ不活性化Ｂ細胞；または成熟かつ機能的もしくは活性化Ｂ細胞を含む。ある特定の実施形態においては、Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、リンパ形質細胞性細胞、形質芽細胞、メモリーＢ細胞またはそれらの任意の組合せであり得る。メモリーＢ細胞は、ナイーブＢ細胞においては非存在であるＣＤ２７の発現によってナイーブＢ細胞から区別され得る。ある特定の実施形態においては、Ｂ細胞は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物由来の初代細胞または細胞系であり得る。Ｂ細胞系は、当該技術分野において周知である。哺乳動物から得られる場合、Ｂ細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節または他の組織もしくは体液を含む多くの供給源から得ることができる。Ｂ細胞組成物は、富化または精製され得る。
ある特定の実施形態においては、Ｔ細胞は、本開示のタンデム発現カセットを発現するように遺伝子改変される。例示的なＴ細胞には、ＣＤ４＋ヘルパー、ＣＤ８＋エフェクター（細胞傷害性）、ナイーブ（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）、Ｔメモリー幹、制御性、粘膜関連インバリアント（ＭＡＩＴ）、γδ（ｇｄ）、組織レジデントＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞またはそれらの任意の組合せが含まれる。ある特定の実施形態においては、Ｔ細胞は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物由来の初代細胞または細胞系であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含む多くの供給源から得ることができる。Ｔ細胞組成物は、富化または精製され得る。Ｔ細胞系は、当該技術分野において周知であり、それらのうちの一部は、Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000において説明されている。ある特定の実施形態においては、Ｔ細胞は、ＴＣＲα遺伝子、ＴＣＲβ遺伝子またはそれらの両方の内因性発現を欠く。そのようなＴ細胞は、ＴＣＲαおよびβ鎖の内因性発現を天然に欠いていてもよく、発現を遮断するように（例えば、ＴＣＲαおよびβ鎖を発現しないトランスジェニックマウスからのＴ細胞、またはＴＣＲαおよびβ鎖の発現を阻害するように操作された細胞）、またはＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖またはそれらの両方の遺伝子をノックアウトするように改変されていてもよい。
ある特定の実施形態においては、本開示のタンデム発現カセットを発現する宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞系統の細胞ではないが、細胞表面抗ＣＤ３を発現するように改変された前駆細胞、幹細胞または細胞である、細胞である。
ある特定の実施形態においては、宿主細胞ゲノムを本開示のタンデム発現カセットを含むように改変するために、遺伝子編集法が使用される。遺伝子編集またはゲノム編集は、遺伝子操作エンドヌクレアーゼを使用してＤＮＡが挿入されるか、置き換えられるか、または宿主細胞のゲノムから除去される遺伝子操作法である。ヌクレアーゼは、ゲノムにおけるターゲティングされた遺伝子座において特異的二本鎖切断を創出する。その後、宿主細胞の内因性ＤＮＡ修復経路は、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄｉｎｇ ｊｏｉｎｉｎｇ）および相同組換えによって、誘導された切断（複数可）を修復する。遺伝子編集に有用な例示的なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ：クラスター化規則的配置短回文反復配列）／Ｃａｓヌクレアーゼ系（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）、メガヌクレアーゼまたはそれらの組合せが含まれる。遺伝子編集エンドヌクレアーゼを使用して、Ｂ細胞およびＴ細胞を含む免疫細胞において遺伝子または遺伝子発現を破壊する方法は、当該技術分野において公知であり、例えばＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５／０６６２６２号；ＷＯ２０１３／０７４９１６号；ＷＯ２０１４／０５９１７３号；Cheong et al., Nat. Comm. 2016 7:10934；Chu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016 113:12514-12519において説明されており、そのうちの各々からの方法は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
ある特定の実施形態においては、宿主細胞の内因性遺伝子の発現は、阻害、ノックダウンまたはノックアウトされる。Ｂ細胞において阻害、ノックダウンまたはノックアウトされ得る内因性遺伝子の例には、ＩＧＨ、ＩＧκ、ＩＧλまたはそれらの任意の組合せが含まれる。Ｔ細胞において阻害、ノックダウンまたはノックアウトされ得る内因性遺伝子の例には、ＴＣＲ遺伝子（ＴＲＡまたはＴＲＢ）、ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡクラスＩ遺伝子またはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子）、免疫チェックポイント分子（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１またはＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ）またはそれらの任意の組合せが含まれる。内因性遺伝子の発現は、遺伝子レベル、転写レベル、翻訳レベルまたはそれらの組合せにおいて阻害、ノックダウンまたはノックアウトされ得る。内因性遺伝子を阻害、ノックダウンまたはノックアウトする方法は、例えばＲＮＡ干渉剤（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）もしくは操作されたエンドヌクレアーゼ［例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ］またはそれらの任意の組合せによって達成され得る。ある特定の実施形態においては、内因性Ｂ細胞遺伝子（例えばＩＧＨ、ＩＧκまたはＩＧλ）は、操作されたエンドヌクレアーゼを介する等の、本開示のタンデム発現カセットの内因性Ｂ細胞遺伝子の遺伝子座への挿入によってノックアウトされる。ある特定の実施形態においては、内因性Ｔ細胞遺伝子（例えばＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子または免疫チェックポイント分子遺伝子）は、操作されたエンドヌクレアーゼを介する等の、本開示のタンデム発現カセットをコードするポリヌクレオチドの内因性Ｔ細胞遺伝子の遺伝子座への挿入によってノックアウトされる。
また、本開示は、タンデム発現カセット改変宿主細胞の集団を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変宿主細胞の集団は、Ｂ細胞集団、Ｔ細胞集団、ナチュラルキラー細胞集団、リンパ球前駆体細胞集団、抗原提示細胞集団、樹状細胞集団、ランゲルハンス細胞集団、骨髄前駆体細胞集団、成熟骨髄細胞集団またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、特定の細胞種のタンデム発現カセット改変宿主細胞の集団は、１つまたは複数のサブタイプからなり得る。例えば、Ｂ細胞集団は、タンデム発現カセット改変ナイーブＢ細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、リンパ形質細胞性細胞、形質芽細胞、メモリーＢ細胞またはそれらの任意の組合せからなり得る。別の例においては、Ｔ細胞集団は、タンデム発現カセット改変ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクター（細胞傷害性）Ｔ細胞、ナイーブ（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）Ｔ細胞、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）Ｔ細胞、Ｔメモリー幹細胞、制御性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、γδ（ｇｄ）、組織レジデントＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞またはそれらの任意の組合せからなり得る。
ある特定の実施形態においては、宿主細胞集団は、各々が同じタンデム発現カセットを発現する細胞からなる。他の実施形態においては、宿主細胞集団は、宿主細胞の２つまたはそれよりも多いサブ集団の混合物からなり、各サブ集団は、異なるタンデム発現カセットを発現する。
ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変宿主細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞を調製する場合、宿主細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞の増殖を促進する１つまたは複数の増殖因子サイトカインが、細胞培養物に添加され得る。サイトカインは、ヒトまたは非ヒトサイトカインであり得る。Ｔ細胞増殖を促進するために使用され得る例示的な増殖因子サイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−１５その他が含まれる。Ｂ細胞増殖を促進するために使用され得る例示的な増殖因子サイトカインには、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＢＡＦＦその他が含まれる。
宿主細胞のタンデム発現カセットベクターによる遺伝子改変の前に、宿主細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞等）の供給源は、対象から得られ（例えば全血、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織）、これらから宿主細胞が、当該技術分野において公知の方法を使用して単離される。特定の宿主細胞サブセットは、抗体への親和性結合、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択等の公知の技術に従って収集され、公知の技術によって富化または枯渇され得る。富化および／または枯渇工程ならびにタンデム発現カセットの導入後、公知の技術または当業者に明らかであるその変形に従って、所望の改変宿主細胞のインビトロ拡大増殖を行ってもよい。
宿主細胞におけるタンデム発現カセットによってコードされる受容体の発現は、Ｔ細胞結合、活性化または誘導の決定を含む、およびまた、抗原特異的であるＴ細胞応答の決定を含む、宿主細胞（例えばＴ細胞）活性をアッセイするための多数の当該技術分野において許容される方法のいずれかに従って機能的に特徴付けてもよい。例は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞サイトカイン放出、抗原特異的Ｔ細胞刺激、ＣＴＬ活性（例えば、事前にロードした標的細胞からの５１Ｃｒまたはユーロピウム放出、標的細胞におけるカスパーゼ活性の誘導、標的細胞による乳酸デヒドロゲナーゼの細胞外放出を検出することによって）、Ｔ細胞表現型マーカー発現の変化およびＴ細胞機能の他の測定値の決定を含む。これらおよび同様のアッセイを行うための手技は、例えばLefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)において見出すことができる。また、Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986)；Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979)；Green and Reed, Science 281:1309 (1998)およびそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。サイトカインレベルは、例えばＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色、フローサイトメトリーおよびそれらの任意の組合せ（例えば細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）を含む当該技術分野において公知の方法に従って決定され得る。免疫応答の抗原特異的誘発または刺激から生ずる免疫細胞増殖およびクローン拡大増殖は、末梢血細胞またはリンパ節からの細胞の試料中の循環リンパ球等のリンパ球を単離し、細胞を抗原により刺激し、トリチウム化チミジンの組込みまたはＭＴＴアッセイ等の非放射性アッセイ等による等、サイトカイン産生、細胞増殖および／または細胞生存率を測定することによって決定され得る。
ある特定の実施形態においては、ＣＥＲを含むタンデム発現カセット改変宿主細胞は、標的細胞について約２０〜約１，５００の食作用指数を有する。「食作用指数」は、培地中の標的細胞または粒子とタンデム発現カセット改変宿主細胞との懸濁液のインキュベーションの設定期間中の、タンデム発現カセット改変宿主細胞当たりの摂取された標的細胞または粒子の数をカウントすることによって決定される、形質導入された宿主細胞の食作用活性の測定値である。食作用指数は、［貪食された標的細胞の総数／カウントされたタンデム発現カセット改変細胞の総数（例えば食作用頻度）］ｘ［タンデム発現カセット＋宿主細胞当たりの標的細胞または粒子染色の平均面積ｘ１００（例えばハイブリッドキャプチャー）］または［貪食された粒子の総数／カウントされたタンデム発現カセット改変宿主細胞の総数］ｘ［貪食された粒子を含有するタンデム発現カセット改変宿主細胞数／カウントされたタンデム発現カセット＋細胞の総数］ｘ１００を掛けることによって計算され得る。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、約３０〜約１，５００；約４０〜約１，５００；約５０〜約１，５００；約７５〜約１，５００；約１００〜約１，５００；約２００〜約１，５００；約３００〜約１，５００；約４００〜約１，５００；約５００〜約１，５００；約２０〜約１，４００；約３０〜約１，４００；約４０〜約１，４００；約５０〜約１，４００；約１００〜約１，４００；約２００〜約１，４００；約３００〜約１，４００；約４００〜約１，４００；約５００〜約１，４００；約２０〜約１，３００；約３０〜約１，３００；約４０〜約１，３００；約５０〜約１，３００；約１００〜約１，３００；約２００〜約１，３００；約３００〜約１，３００；約４００〜約１，３００；約５００〜約１，３００；約２０〜約１，２００；約３０〜約１，２００；約４０〜約１，２００；約５０〜約１，２００；約１００〜約１，２００；約２００〜約１，２００；約３００〜約１，２００；約４００〜約１，２００；約５００〜約１，２００；約２０〜約１，１００；約３０〜約１，１００；約４０〜約１，１００；約５０〜約１，１００；約１００〜約１，１００；約２００〜約１，１００；約３００〜約１，１００；約４００〜約１，１００；または約５００〜約１，１００；約２０〜約１，０００；約３０〜約１，０００；約４０〜約１，０００；約５０〜約１，０００；約１００〜約１，０００；約２００〜約１，０００；約３００〜約１，０００；約４００〜約１，０００；または約５００〜約１，０００；約２０〜約７５０；約３０〜約７５０；約４０〜約７５０；約５０〜約７５０；約１００〜約７５０；約２００〜約７５０；約３００〜約７５０；約４００〜約７５０；または約５００〜約７５０；約２０〜約５００；約３０〜約５００；約４０〜約５００；約５０〜約５００；約１００〜約５００；約２００〜約５００；または約３００〜約５００の食作用指数を有する。さらなる実施形態においては、インキュベーション時間は、約２時間〜約４時間、例えば約２時間、約３時間または約４時間である。またさらなる実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照細胞よりも統計的に有意に高い食作用指数を示す。食作用指数は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡による定量を含む、当該技術分野において公知の、かつ実施例およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５３５５３号（その全体を参照により本明細書に組み込む）においてさらに説明される方法を使用して計算され得る。
宿主細胞は、動物、例としてヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタまたはそれらの組合せからの宿主細胞であり得る。好ましい実施形態においては、動物は、ヒトである。宿主細胞は、健康な対象、または抗原の発現または過剰発現と関連付けられる疾患を有する対象から得てもよい。
使用方法
一態様においては、本開示は、本明細書において説明する実施形態のいずれかに記載のタンデム発現カセットを宿主細胞に導入することと、宿主細胞においてＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質を発現することとを含む抗原特異的細胞溶解活性および貪食活性を細胞に与えるための方法を提供する。ある特定の実施形態においては、ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質は、同じ標的抗原に結合する。一部の実施形態においては、ＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲは、異なる標的抗原に結合する。ある特定の実施形態においては、本開示のタンデム発現カセットにより改変した宿主細胞は、標的細胞または標的細胞の部分を貪食することができる。したがって、本開示のタンデム発現カセットにより改変した細胞は、多数の様式：標的細胞の細胞溶解、標的細胞全体の貪食、標的細胞の部分の貪食またはそれらの任意の組合せを介するターゲティング細胞死滅能力を有し得る。
別の態様においては、本開示は、本明細書において説明する実施形態のいずれかに記載のタンデム発現カセットを宿主細胞に導入することと、宿主細胞においてＣＥＲおよびＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質を発現することとを含む細胞の抗原特異的細胞傷害活性を向上させるための方法であって、タンデム発現カセットの発現が、ＣＡＲ／またはＴＣＲ結合タンパク質単独を発現する宿主細胞と比較して宿主細胞の細胞傷害活性を向上させる、方法を提供する。ある特定の実施形態においては、宿主細胞の細胞傷害活性は、ＣＡＲ／またはＴＣＲ単独を発現する宿主細胞と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれよりも多く増大する。さらなる実施形態においては、タンデム発現カセットは、相乗的細胞傷害応答を与える。一部の実施形態においては、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。宿主細胞、特にＴ細胞およびＮＫ細胞等の免疫細胞の細胞傷害活性を測定する方法には、標的細胞死およびエフェクター細胞活性を測定する、クロミウム（５１Ｃｒ）放出アッセイ、β−ｇａｌまたはホタルルシフェラーゼ放出アッセイ、フローサイトメトリー法が含まれる（例えばExpert Rev. Vaccines, 2010, 9:601-616を参照のこと）。ある特定の実施形態においては、宿主細胞の細胞傷害活性は、宿主細胞への曝露後の標的細胞アポトーシス、例えばカスパーゼ３／７活性、乳酸デヒドロゲナーゼ放出を検出することによって測定され得る。
別の態様においては、本明細書において提供される実施形態のいずれかに記載のタンデム発現カセットは、疾患、障害または望ましくない状態を患う対象を治療する方法において使用され得る。これらの方法の実施形態は、治療有効量の、本説明に記載の１つまたは複数のタンデム発現カセットを含む医薬組成物、１つまたは複数のタンデム発現カセットをコードするポリヌクレオチド、１つまたは複数のタンデム発現カセットを含むベクターまたは１つまたは複数のタンデム発現カセットを発現するように遺伝子改変された宿主細胞集団を対象に投与することを含む。
本開示において提供されるタンデム発現カセットを発現する細胞により治療され得る疾患は、がん、自己免疫疾患および感染性疾患（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、原生動物感染）を含む。養子免疫療法および遺伝子療法は、様々な種類のがん（Morgan et al., Science 314:126, 2006；Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009；June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007）および感染性疾患（Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009；Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007；Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010；Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011）のための有望な治療である。
固形腫瘍および白血病を含む多種多様ながんは、本明細書において提供されるタンデム発現カセット組成物を使用する治療に適している。本明細書において説明する受容体、改変宿主細胞および組成物を使用して治療され得る例示的ながんには、***、前立腺および結腸の腺癌；全ての形態の気管支原性肺癌；骨髄性白血病；黒色腫；肝細胞腫；神経芽細胞腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌、基底扁平細胞癌、ブラウン・ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ癌、クレブス２癌、メルケル細胞癌、粘液性癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、扁平上皮癌および移行上皮癌）が含まれる。本明細書において説明する受容体、改変宿主細胞および組成物を使用して治療され得る追加のがんの種類は、組織球性障害；悪性組織球症；白血病；ホジキン病；免疫増殖性小（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ）；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；多発性骨髄腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛性腫瘍を含む。さらに、また、以下の種類のがん：腺腫；胆管腫；真珠腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；男性胚腫；肝細胞腫；汗腺腫；膵島腫瘍；ライディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；莢膜細胞腫；平滑筋腫（ｌｅｉｍｙｏｍａ）；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫（ｍｙｏｍｍａ）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クローム親和性傍神経節腫は、本明細書において説明する受容体、改変宿主細胞および組成物を使用する治療に適することが企図される。また、治療され得るがんの種類は、被角血管腫；好酸球増加症を伴う血管リンパ様過形成；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢胞肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）；および子宮頸部異形成を含む。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物を使用する治療に適する高増殖性障害の例には、Ｂ細胞リンパ腫［例として様々な形態のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ：ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）または中枢神経系リンパ腫］を含むＢ細胞がん、白血病［例として急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞芽細胞化］および骨髄腫（例として多発性骨髄腫）が含まれる。本明細書において説明する受容体、改変宿主細胞および組成物を使用して治療され得る追加のＢ細胞がんには、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ：ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性化の可能性をもつＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症および移植後リンパ増殖性障害が含まれる。
感染性疾患は、感染病原体と関連付けられる感染性疾患を含み、様々な細菌［例えば病原性大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、炭疽菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフィシル菌（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）、コレラ菌（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）等］、マイコバクテリアおよび寄生生物（公知の任意の原生動物寄生性メンバーを含む）のいずれかを含む。感染性ウイルスには、真核細胞ウイルス、例としてアデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、パピローマウイルス（例えばＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ポックスウイルス（例えばワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えばＨＩＶ）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ、ＨＢＶ）その他が含まれる。ある特定の実施形態においては、本開示に記載のタンデム発現カセットを含む組成物は、対象において持続的感染を確立することができる微生物による感染を治療するために使用される。
対象を治療する方法は、有効量のタンデム発現カセット改変細胞（すなわち、タンデム発現カセットを発現する組換え細胞）を投与することを含む。タンデム発現カセット改変細胞は、対象にとって異種、同系、同種異系または自家であり得る。
タンデム発現カセット改変細胞を含む医薬組成物は、医療分野の熟練者によって決定される通り、治療（または予防）されるべき疾患または状態に適切な様式において投与され得る。組成物の適切な用量、好適な持続期間および投与頻度は、患者の状態、サイズ、体重、体表面積、年齢、性別、疾患の種類および重症度、投与される特定の治療、活性成分の特定の形態、投与時間および方法ならびに同時に投与される他の薬物等の因子によって決定される。本開示は、タンデム発現カセット改変細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。好適な賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールその他およびそれらの組合せが含まれる。他の好適な点滴媒体は、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中の５％デキストロースまたは乳酸リンゲル液を含む任意の等張媒体製剤であり得る。
医薬組成物中の治療有効量の細胞は、少なくとも１つの細胞（例えば１つのタンデム発現カセット改変Ｔ細胞）であるか、またはより典型的には１０２個の細胞よりも多く、例えば最高で１０６個、最高で１０７個、最高で１０８個の細胞、最高で１０９個の細胞、最高で１０１０個の細胞もしくは最高で１０１１個の細胞またはそれよりも多い。ある特定の実施形態においては、細胞は、約１０６個〜約１０１０個の細胞／ｍ２の範囲内、好ましくは約１０７個〜約１０９個の細胞／ｍ２の範囲内で投与される。特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、少なくとも約１ｘ１０６個の細胞、２ｘ１０６個の細胞、３ｘ１０６個の細胞、４ｘ１０６個の細胞、５ｘ１０６個の細胞、６ｘ１０６個の細胞、７ｘ１０６個の細胞、８ｘ１０６個の細胞、９ｘ１０６個の細胞、１ｘ１０７個の細胞、２ｘ１０７個の細胞、３ｘ１０７個の細胞、４ｘ１０７個の細胞、５ｘ１０７個の細胞、６ｘ１０７個の細胞、７ｘ１０７個の細胞、８ｘ１０７個の細胞、９ｘ１０７個の細胞、１ｘ１０８個の細胞、２ｘ１０８個の細胞、３ｘ１０８個の細胞、４ｘ１０８個の細胞、５ｘ１０８個の細胞、６ｘ１０８個の細胞、７ｘ１０８個の細胞、８ｘ１０８個の細胞、９ｘ１０８個の細胞、１ｘ１０９個の細胞、２ｘ１０９個の細胞、３ｘ１０９個の細胞、４ｘ１０９個の細胞、５ｘ１０９個の細胞、６ｘ１０９個の細胞、７ｘ１０９個の細胞、８ｘ１０９個の細胞、９ｘ１０９個の細胞、１ｘ１０１０個の細胞、２ｘ１０１０個の細胞、３ｘ１０１０個の細胞、４ｘ１０１０個の細胞、５ｘ１０１０個の細胞、６ｘ１０１０個の細胞、７ｘ１０１０個の細胞、８ｘ１０１０個の細胞、９ｘ１０１０個の細胞、１ｘ１０１１個の細胞、２ｘ１０１１個の細胞、３ｘ１０１１個の細胞、４ｘ１０１１個の細胞、５ｘ１０１１個の細胞、６ｘ１０１１個の細胞、７ｘ１０１１個の細胞、８ｘ１０１１個の細胞または９ｘ１０１１個の細胞の量において投与される。細胞数は、組成物に含まれる細胞種はもちろん、組成物が意図される最終使用に依存する。例えば、タンデム発現カセットを含有するように改変された細胞を含む組成物は、約５％〜約９５％またはそれよりも多くのそのような細胞を含有する細胞集団を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞を含む組成物は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くのそのような細胞を含む細胞集団を含む。本明細書において提供される使用のために、細胞は一般的に、１リットルもしくはそれ未満、５００ｍｌもしくはそれ未満、２５０ｍｌもしくはそれ未満、または１００ｍｌもしくはそれ未満の容量において存在する。それゆえ、所望の細胞の密度は典型的に、１０４個の細胞／ｍｌよりも高く、一般的には１０７個の細胞／ｍｌよりも高く、一般的に１０８個の細胞／ｍｌまたはそれよりも高い。細胞は、１回の点滴として、またはある時間範囲にわたる多数回の点滴において投与され得る。タンデム発現カセット改変細胞の反復点滴は、日、週、月またはさらには疾患または疾患活性の再発が存在する場合には年単位で分離され得る。臨床関連免疫細胞数は、累積的に１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０または１０１１個の細胞に等しいか、またはこれを超える多数回点滴に配分され得る。本明細書において説明する組換え発現ベクターを含む宿主細胞の投与のために好ましい用量は、約１０７個の細胞／ｍ２、約５ｘ１０７個の細胞／ｍ２、約１０８個の細胞／ｍ２、約５ｘ１０８個の細胞／ｍ２、約１０９個の細胞／ｍ２、約５ｘ１０９個の細胞／ｍ２、約１０１０個の細胞／ｍ２、約５ｘ１０１０個の細胞／ｍ２または約１０１１個の細胞／ｍ２である。
本明細書において説明するタンデム発現カセットを含む組成物、タンデム発現カセットを含むベクターまたはタンデム発現カセット改変細胞は、静脈内に、腹腔内に、鼻内に、腫瘍内に、骨髄中に、リンパ節中に、および／または脳脊髄液中に投与され得る。
タンデム発現カセット組成物は、１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて対象に投与され得る。本説明に記載のタンデム発現カセット組成物と組み合わせて投与され得る治療剤の例には、放射線療法、遺伝子操作細胞免疫療法（例えばＴ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、キメラ抗原受容体療法）、抗体療法、免疫チェックポイント分子阻害剤療法、ＵＶ光療法、電気パルス療法、高密度焦点式超音波療法、腫瘍溶解性ウイルス療法または医薬療法、例として化学療法剤、治療用ペプチド、ホルモン、アプタマー、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗炎症剤、小分子療法が含まれる。
放射線療法には、体外照射療法（例えば従来型体外照射療法、定位放射線、３次元原体照射療法、強度変調放射線療法、強度変調振子照射療法、粒子線療法、陽子線療法およびオーガー療法）、近接照射療法、体系的放射性同位体療法、手術中の放射線療法またはそれらの任意の組合せが含まれる。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的な抗体には、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｍａｂ）、ペルツズマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、ベバシズマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレファセプト、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、オララツマブ、パリビズマブ、パニツムマブおよびトシリズマブが含まれる。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のためであり得る例示的な免疫チェックポイント分子の阻害剤には、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒまたはそれらの任意の組合せをターゲティングするチェックポイント阻害剤が含まれる。ある特定の実施形態においては、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、ペプチド、ＲＮＡｉ剤または小分子であり得る。ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブであり得る。ＰＤ−１に特異的な抗体は、ピディリズマブ、ニボルマブまたはペンブロリズマブであり得る。ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体は、デュルバルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブであり得る。
化学療法剤には、有糸***または細胞***を阻害する非特異的細胞傷害剤、および腫瘍増殖、進行および転移に関与する特定の分子（例えば癌遺伝子）をターゲティングすることによってがん細胞の増殖および広がりを遮断する分子ターゲティング療法が含まれる。本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的な非特異的化学療法剤は、アルキル化剤、プラチナベースの剤、細胞傷害剤、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬（例として葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよび糖修飾アナログ）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（例として挿入剤）およびＤＮＡ修復阻害剤を含み得る。
本明細書において企図される組合せ療法における使用のために考えられる化学療法剤の例には、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、コビメチニブ、アナストロゾール［アリミデックス（登録商標）］、ビカルタミド［カソデックス（登録商標）］、硫酸ブレオマイシン［ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）（登録商標）］、ブスルファン［ミレラン（登録商標）］、ブスルファン注射［ブスルフェクス（登録商標）］、カペシタビン［ゼローダ（登録商標）］、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン［パラプラチン（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、クロラムブシル［ロイケラン（登録商標）］、シスプラチン［プラチノール（登録商標）］、クラドリビン［ロイスタチン（登録商標）］、シクロホスファミド［シトキサン（登録商標）またはネオサル（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標）］、シタラビン、シトシンアラビノシド［シトサル（Ｃｙｔｏｓａｒ）−Ｕ（登録商標）］、シタラビンリポソーム注射［デポサイト（登録商標）］、ダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］、ダクチノマイシン［アクチノマイシンＤ、コスメゲン（Ｃｏｓｍｅｇａｎ）］、ダウノルビシン塩酸塩［セルビジン（登録商標）］、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射［ダウノゾーム（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）（登録商標）］、デキサメタゾン、ドセタキセル［タキソテール（登録商標）］、ドキソルビシン塩酸塩［アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（Ｒｕｂｅｘ）（登録商標）］、エトポシド［ベプシド（登録商標）］、リン酸フルダラビン［フルダラ（登録商標）］、５−フルオロウラシル［アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）（登録商標）、エフデックス（Ｅｆｕｄｅｘ）（登録商標）］、フルタミド［ユーレキシン（Ｅｕｌｅｘｉｎ）（登録商標）］、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素［ハイドレア（登録商標）］、イダルビシン［イダマイシン（登録商標）］、イホスファミド［ＩＦＥＸ（登録商標）］、イリノテカン［カンプト（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（登録商標）］、Ｌ−アスパラギナーゼ［ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）］、ロイコボリンカルシウム、メルファラン［アルケラン（登録商標）］、６−メルカプトプリン［ピュリネソール（登録商標）］、メトトレキセート［フォレックス（Ｆｏｌｅｘ）（登録商標）］、ミトキサントロン［ノバントロン（登録商標）］、マイロターグ、パクリタキセル［タキソール（登録商標）］、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０カルムスチンインプラント［ギリアデル（登録商標）］、ｆｄａｂｒａクエン酸タモキシフェン［ノルバデックス（登録商標）］、テニポシド［ブモン（Ｖｕｍｏｎ）（登録商標）］、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン［チラゾン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ）登録商標）］、トポテカン塩酸塩注射［ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）（登録商標）］、ビンブラスチン［ベルバン（登録商標）］、ビンクリスチン［オンコビン（登録商標）］、イブルチニブ、ベネトクラクス、クリゾチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、セリチニブおよびビノレルビン［ナベルビン（登録商標）］が含まれる。
本明細書において企図される組合せ療法における使用のための例示的なアルキル化剤には、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼン：ウラシルマスタード［アミノウラシルマスタード（登録商標）、クロレタミナシル（Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ）（登録商標）、デメチルドパン（Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ）（登録商標）、デスメチルドパン（Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ）（登録商標）、ヘマンタミン（Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ）（登録商標）、ノルドパン（Ｎｏｒｄｏｐａｎ）（登録商標）、ウラシルナイトロジェンマスタード（登録商標）、ウラシロスト（Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ）（登録商標）、ウラシルモスタザ（Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ）（登録商標）、ウラムスチン（Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ）（登録商標）、ウラムスチン（Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）（登録商標）］、クロルメチン［マスタージェン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（登録商標）］、シクロホスファミド［シトキサン（登録商標）、ネオサル（登録商標）、クラフェン（Ｃｌａｆｅｎ）（登録商標）、エンドキサン（登録商標）、プロサイトクス（Ｐｒｏｃｙｔｏｘ）（登録商標）、レビミューン（Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ）（商標）］、イホスファミド［ミトキサナ（Ｍｉｔｏｘａｎａ）（登録商標）］、メルファラン［アルケラン（登録商標）］、クロラムブシル［ロイケラン（登録商標）］、ピポブロマン［アメデール（登録商標）、バーサイト（Ｖｅｒｃｙｔｅ）（登録商標）］、トリエチレンメラミン［ヘメル（登録商標）、ヘキサレン（Ｈｅｘａｌｅｎ）（登録商標）、ヘキサスタット（Ｈｅｘａｓｔａｔ）（登録商標）］、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド［テモダール（登録商標）］、チオテパ［チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標）］、ブスルファン［ブシルベックス（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ）（登録商標）、ミレラン（登録商標）］、カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］、ロムスチン［ＣｅｅＮＵ（登録商標）］、ストレプトゾシン［ザノサー（Ｚａｎｏｓａｒ）（登録商標）］およびダカルバジン［ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］が含まれる。本明細書において企図される組合せ療法における使用のための追加の例示的なアルキル化剤には、オキサリプラチン［エロキサチン（登録商標）］；テモゾロミド［テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（登録商標）およびテモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）（登録商標）］；ダクチノマイシン［アクチノマイシン−Ｄとしても公知、コスメゲン（登録商標）］；メルファラン［Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタードとしても公知、アルケラン（登録商標）］；アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ：ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）としても公知、ヘキサレン（登録商標）］；カルムスチン［ＢｉＣＮＵ（登録商標）］；ベンダムスチン［トレアンダ（登録商標）］；ブスルファン［ブスルフェクス（登録商標）およびミレラン（登録商標）］；カルボプラチン［パラプラチン（登録商標）］；ロムスチン［ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ（登録商標）］；シスプラチン［ＣＤＤＰとしても公知、プラチノール（登録商標）およびプラチノール（登録商標）−ＡＱ］；クロラムブシル［ロイケラン（登録商標）］；シクロホスファミド［シトキサン（登録商標）およびネオサル（登録商標）］；ダカルバジン［ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）］；アルトレタミン［ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、ヘキサレン（登録商標）］；イホスファミド［イフェクス（Ｉｆｅｘ）（登録商標）］；プレドニムスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン［マチュレーン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（登録商標）］；メクロレタミン［ナイトロジェンマスタード、ムスチンおよびメクロレタミン塩酸塩としても公知、マスタージェン（登録商標）］；ストレプトゾシン［ザノサー（登録商標）］；チオテパ［チオホスホアミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標）］；シクロホスファミド［エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、ネオサル（登録商標）、プロシトクス（登録商標）、レビミューン（登録商標）］；およびベンダムスチンＨＣｌ［トレアンダ（登録商標）］が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において企図される組合せ療法における使用のための例示的なプラチナベースの剤には、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、フェナントリプラチン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｐｌａｔｉｎ）およびトリプラチン四硝酸塩（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）が含まれる。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的な分子ターゲティング阻害剤には、例えばホルモンアンタゴニスト、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現阻害剤（例えば翻訳阻害剤）、アポトーシスインデューサー、血管新生阻害剤（例えばＶＥＧＦ経路阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばＥＧＦ／ＥＧＦＲ経路阻害剤）、増殖因子阻害剤、ＧＴＰアーゼ阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、がんと関連付けられるドライバー変異の阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、アデノシン経路阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＴ阻害剤、ＭＹＣ阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、Ｈ−ＲＡＳ阻害剤、Ｋ−ＲＡＳ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＳ１阻害剤およびＢＴＫ阻害剤を含むがん細胞増殖および生存に関与する分子をターゲティングする小分子が含まれる。ある特定の実施形態においては、分子ターゲティング療法の使用は、分子標的に特異的な分子ターゲティング療法を、分子標的（例えばドライバー癌遺伝子）を有する腫瘍を有すると特定された対象に投与することを含む。ある特定の実施形態においては、分子標的は、活性化変異を有する。ある特定の実施形態においては、分子ターゲティング阻害剤と組み合わせたタンデム発現カセット改変細胞の使用は、抗腫瘍応答の大きさ、抗腫瘍応答の持続力またはこれらの両方を増大する。ある特定の実施形態においては、典型的な用量よりも低い分子ターゲティング療法が、タンデム発現カセット改変細胞と組み合わせて使用される。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的な血管新生阻害剤は、Ａ６（Ａｎｇｓｔｒｏｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＢＴ−５１０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＡＢＴ−６２７（アトラセンタン）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｘｉｎｌａｙ）、ＡＢＴ−８６９（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アクチミド（Ａｃｔｉｍｉｄ）（ＣＣ４０４７、ポマリドマイド）（Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡｄＧＶＰＥＤＦ．１１Ｄ（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡＤＨ−１［エキセリン（Ｅｘｈｅｒｉｎ）］（Ａｄｈｅｒｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＧ−０１３７３６（アキシチニブ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＧ３３４０（プリノマスタット）（Ａｇｏｕｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＧＸ１０５３（ＡｎｇｉｏＧｅｎｅｘ）、ＡＧＸ５１（ＡｎｇｉｏＧｅｎｅｘ）、ＡＬＮ−ＶＳＰ（ＡＬＮ−ＶＳＰ Ｏ２）（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＭＧ３８６（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７０６（Ａｍｇｅｎ）、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）（ＹＮ９６８Ｄ１）（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ＡＰ２３５７３（リダフォロリムス／ＭＫ８６６９）（Ａｒｉａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＱ４Ｎ（Ｎｏｖａｖｅａ）、ＡＲＱ１９７（ＡｒＱｕｌｅ）、ＡＳＡ４０４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ａｎｔｉｓｏｍａ）、アチプリモド（Ｃａｌｌｉｓｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＴＮ−１６１（Ａｔｔｅｎｕｏｎ）、ＡＶ−４１２（Ａｖｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＶ−９５１（Ａｖｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、アバスチン（ベバシズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＺＤ２１７１［セディラニブ／レセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ）］（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＡＹ ５７−９３５２［テラチニブ（Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ）］（Ｂａｙｅｒ）、ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＩＢＦ１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＢＷ２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＢＭＳ−５８２６６４（ブリバニブ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＢＭＳ−６９０５１４（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、カルシトリオール、ＣＣＩ−７７９（トーリセル）（Ｗｙｅｔｈ）、ＣＤＰ−７９１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、セフラトニン（Ｃｅｆｌａｔｏｎｉｎ）（ホモハリントニン／ＨＨＴ）（ＣｈｅｍＧｅｎｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、セレブレックス（セレコキシブ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＣＨＩＲ−２６５（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮＧＲ−ＴＮＦ、ＣＯＬ−３［メタスタット（Ｍｅｔａｓｔａｔ）］（Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘ Ｐｈａｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、コンブレタスタチン（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−５４７，６３２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＳ−７０１７（第一三共）、ＣＴ−３２２［アンジオセプト（Ａｎｇｉｏｃｅｐｔ）］（Ａｄｎｅｘｕｓ）、クルクミン、ダルテパリン（フラグミン）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ジスルフィラム（Ａｎｔａｂｕｓｅ）、Ｅ７８２０（エーザイ株式会社）、Ｅ７０８０（エーザイ株式会社）、ＥＭＤ １２１９７４（シレンジタイド）（ＥＭＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＥＮＭＤ−１１９８（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、ＥＮＭＤ−２０７６（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、エンドスター（Ｅｎｄｏｓｔａｒ）（Ｓｉｍｃｅｒｅ）、アービタックス（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＥＺＮ−２２０８（Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＥＺＮ−２９６８（Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＧＣ１００８（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ゲニステイン、ＧＳＫ１３６３０８９［フォレチニブ（Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）］（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ７８６０３４（パゾパニブ）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＴ−１１１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｇｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ラムシルマブ）（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＭＣ−１８Ｆ１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＭＣ−３Ｇ３（ＩｍＣｌｏｎｅ ＬＬＣ）、ＩＮＣＢ００７８３９（Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＩＮＧＮ ２４１（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イレッサ（ＺＤ１８３９／ゲフィチニブ）、ＬＢＨ５８９［ファリダク（Ｆａｒｉｄａｋ）／パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔｓｔ）］（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ルセンティス（ラニビズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＹ３１７６１５（エンザスタウリン）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、マクジェン（ペガプタニブ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＭＥＤＩ５２２［アベグリン（Ａｂｅｇｒｉｎ）］（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＬＮ５１８（タンデュチニブ）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、ネオバスタット（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ）（ＡＥ９４１／ベネフィン）（Ａｅｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、ネクサバール（Ｂａｙｅｒ／Ｏｎｙｘ）、ＮＭ−３（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ノスカピン（Ｃｏｕｇａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＮＰＩ−２３５８（Ｎｅｒｅｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ）、パロミド（Ｐａｌｏｍｉｄ）５２９（Ｐａｌｏｍａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、パンゼム（Ｐａｎｚｅｍ）カプセル（２ＭＥ２）（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、パンゼムＮＣＤ（２ＭＥ２）（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、ＰＦ−０２３４１０６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０４５５４８７８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＩ−８８（Ｐｒｏｇｅｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ／Ｍｅｄｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＫＣ４１２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ポリフェノンＥ（緑茶抽出物）（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏ Ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、ＰＰＩ−２４５８（Ｐｒａｅｃｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＴＣ２９９（ＰＴＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＸＤ１０１（ベリノスタット）（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＲＡＤ００１（エベロリムス）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）（Ｂａｙｅｒ）、レブリミド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、レタアネ（Ｒｅｔａａｎｅ）（Ａｌｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＳＮ３８（リポソーム製剤）（Ｎｅｏｐｈａｒｍ）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）（Ｓｕｎｅｓｉｓ）、ＳＯＭ２３０（パシレオチド）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、スクアラミン（Ｇｅｎａｅｒａ）、スラミン、スーテント（Ｐｆｉｚｅｒ）、タルセバ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＴＢ−４０３（Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｓ）、テムポスタチン（Ｔｅｍｐｏｓｔａｔｉｎ）（Ｃｏｌｌａｒｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、テトラチオモリブデート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＴＧ１００８０１（ＴａｒｇｅＧｅｎ）、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、チンザパリンナトリウム、ＴＫＩ２５８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＴＲＣ０９３（Ｔｒａｃｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（アフリバーセプト）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベグリン（Ｖｅｇｌｉｎ）（ＶａｓＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、ＸＬ１８４（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ６４７（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ７８４（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ８２０（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ボリノスタット（Ｍｅｒｃｋ）およびＺＳＴＫ４７４を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的な血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）受容体阻害剤は、ベバシズマブ［アバスチン（登録商標）］、アキシチニブ［インライタ（登録商標）］；ブリバニブアラニネート［ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート］；ソラフェニブ［ネクサバール（登録商標）］；パゾパニブ［ヴォトリエント（登録商標）］；リンゴ酸スニチニブ［スーテント（登録商標）］；セディラニブ（ＡＺＤ２１７１、ＣＡＳ ２８８３８３−２０−１）；バラガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ）（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ ９２８３２６−８３−４）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）；テラチニブ（ＢＡＹ５７−９３５２、ＣＡＳ ３３２０１２−４０−５）；アパチニブ（ＹＮ９６８Ｄ１、ＣＡＳ ８１１８０３−０５−１）；イマチニブ［グリベック（登録商標）］；ポナチニブ（ＡＰ２４５３４、ＣＡＳ ９４３３１９−７０−８）；チボザニブ（ＡＶ９５１、ＣＡＳ ４７５１０８−１８−０）；レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６、ＣＡＳ ７５５０３７−０３−７）；バタラニブ二塩酸塩（ＰＴＫ７８７、ＣＡＳ ２１２１４１−５１−０）；ブリバニブ（ＢＭＳ−５４０２１５、ＣＡＳ ６４９７３５−４６−６）；バンデタニブ［カプレルサ（登録商標）またはＡＺＤ６４７４］；モテサニブ二リン酸塩［ＡＭＧ７０６、ＣＡＳ ８５７８７６−３０−３、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／０６６４７０号において説明されているＮ−（２，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−１Ｈ−インドール−６−イル）−２−［（４−ピリジニルメチル）アミノ］−３−ピリジンカルボキサミド］；ドビチニブ二乳酸（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ ｄｉｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ ８５２４３３−８４−２）；リンファニブ（Ｌｉｎｆａｎｉｂ）（ＡＢＴ８６９、ＣＡＳ ７９６９６７−１６−３）；カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ ８４９２１７−６８−１）；レスタウルチニブ（ＣＡＳ １１１３５８−８８−４）；Ｎ−［５−［［［５−（１，１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル］−４−ピペリジンカルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３、ＣＡＳ ３４５６２７−８０−７）；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ ７８１６１３−２３−８）；４−メチル−３−［［１−メチル−６−（３−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル］アミノ］−Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−ベンザミド（ＢＨＧ７１２、ＣＡＳ ９４０３１０−８５−０）；およびアフリバーセプト［アイリーア（登録商標）］を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的なＥＧＦ経路阻害剤は、チルホスチン４６、ＥＫＢ−５６９、エルロチニブ［タルセバ（登録商標）］、ゲフィチニブ［イレッサ（登録商標）］、アービタックス、ニモツズマブ、ラパチニブ［タイケルブ（登録商標）］、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ）、１８８Ｒｅ−標識ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ）およびＷＯ９７／０２２６６、ＥＰ０５６４４０９、ＷＯ９９／０３８５４、ＥＰ０５２０７２２、ＥＰ０５６６２２６、ＥＰ０７８７７２２、ＥＰ０８３７０６３、米国特許第５，７４７，４９８号、ＷＯ９８／１０７６７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９７／３８９８３およびＷＯ９６／３３９８０において一般的かつ特異的に開示されている化合物を含み得るが、これらに限定されない。例示的なＥＧＦＲ抗体には、セツキシマブ［アービタックス（登録商標）］；パニツムマブ［ベクチビックス（登録商標）］；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；トラスツズマブ［ハーセプチン（登録商標）］；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ ９４６４１４−０９−１）が含まれるが、これらに限定されない。例示的な上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤には、オシメルチニブ［タグリッソ（登録商標）］、エルロチニブ塩酸塩［タルセバ（登録商標）］、ゲフィチニブ［イレッサ（登録商標）］；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ’’）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド、トボック（Ｔｏｖｏｋ）（登録商標）；バンデタニブ［カプレルサ（登録商標）］；ラパチニブ［タイケルブ（登録商標）］；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（Ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ）（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ １８７７２４−６１−４）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン［ラパミューン（登録商標）］ならびにそのアナログおよび誘導体；ＳＤＺ−ＲＡＤ；テムシロリムス［トーリセル（登録商標）；ＣＣＩ−７７９としても公知］；リダフォロリムス［デフォロリムス（ｄｅｆｅｒｏｌｉｍｕｓ）として以前に公知、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知であり、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０６４３８３号において説明されている］；エベロリムス［アフィニトール（登録商標）またはＲＡＤ００１］；ラパマイシン［ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標）］；シマピモド（Ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ １６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１−３６−４）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−，分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７−６７−１）を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物と組み合わせた使用のための例示的なホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ：Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）阻害剤は、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ ０９４１としても公知であり、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０９／０３６０８２号およびＷＯ０９／０５５７３０号において説明されている）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ ２３５としても公知であり、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０６／１２２８０６号において説明されている）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても公知であり、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／０８４７８６号において説明されている）；トザセルチブ（Ｔｏｚａｓｅｒｔｉｂ）（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ ５０２６３２−６６−８）；および８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ １５４４４７−３６−６）を含み得るが、これらに限定されない。例示的なタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｂ）またはＡＫＴ阻害剤には、８−［４−（１−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン（ＭＫ−２２０６、ＣＡＳ １０３２３４９−９３−１）；ペリホシン（ＫＲＸ０４０１）；４−ドデシル−Ｎ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル−ベンゼンスルホンアミド（ＰＨＴ−４２７、ＣＡＳ １１９１９５１−５７−１）；４−［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−７−［（３Ｓ）−３−ピペリジニルメトキシ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−イル］−２−メチル−３−ブチン−２−オール（ＧＳＫ６９０６９３、ＣＡＳ ９３７１７４−７６−０）；８−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン（パロミド５２９、Ｐ５２９またはＳＧ−００５２９）；トリシルビン（Ｔｒｉｃｉｒｂｉｎｅ）（６−アミノ−４−メチル−８−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４Ｈ，８Ｈ−ピロロ［４，３，２−デ］ピリミド［４，５−ｃ］ピリダジン）；（αＳ）−α−［［［５−（３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−３−ピリジニル］オキシ］メチル］−ベンゼンエタンアミン（Ａ６７４５６３、ＣＡＳ ５５２３２５−７３−２）；４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジンアミン（ＣＣＴ１２８９３０、ＣＡＳ ８８５４９９−６１−６）；４−（４−クロロフェニル）−４−［４−（１Ｈピラゾール−４−イル）フェニル］−ピペリジン（ＡＴ７８６７、ＣＡＳ ８５７５３１−００−１）；およびアルケキシン（Ａｒｃｈｅｘｉｎ）（ＲＸ−０２０１、ＣＡＳ ６６３２３２−２７−７）が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態においては、ＣＥＲ改変細胞と組み合わせて使用されるチロシンキナーゼ阻害剤は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ：ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤である。例示的なＡＬＫ阻害剤には、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ダランテルセプト（ｄａｌａｎｔｅｒｃｅｐｔ）、エントレクチニブ（ｅｎｔｒｅｃｔｉｎｉｂ）およびロルラチニブが含まれる。
タンデム発現カセット改変細胞が１つまたは複数の追加の療法と組み合わせて投与されるある特定の実施形態においては、１つまたは複数の追加の療法は、別の方法で単独療法として投与された場合に治療量未満であると考えられ得る用量において投与され得る。そのような実施形態においては、１つまたは複数の追加の療法がより低い用量において投与され得るように、タンデム発現カセットは、相加的または相乗的効果を提供し得る。組合せ療法は、追加の療法の前（例えば追加の療法の１日〜３０日前またはそれよりも前）の、追加の療法と同時（同日）の、または追加の療法の後（例えば追加の療法の１日〜３０日後またはそれよりも後）の本明細書において説明するタンデム発現カセット組成物の投与を含む。ある特定の実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、１つまたは複数の追加の療法の投与後に投与される。さらなる実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、１つまたは複数の追加の療法の投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日後に投与される。またさらなる実施形態においては、タンデム発現カセット改変細胞は、１つまたは複数の追加の療法の投与後４週間以内、３週間以内、２週間以内または１週間以内に投与される。１つまたは複数の追加の療法が多数の用量を含む場合、タンデム発現カセット改変細胞は、１つまたは複数の追加の療法の初回用量後に、１つまたは複数の追加の療法の最終用量後に、または１つまたは複数の追加の療法の多数の用量間において投与され得る。
ある特定の実施形態においては、本開示の方法は、枯渇工程を含む。タンデム発現カセット改変細胞を対象から除去するための枯渇工程は、対象への毒性を軽減するために、治療利益に十分な時間後に行い得る。そのような実施形態においては、タンデム発現カセットを含むベクターは、誘導性自殺遺伝子、例としてｉＣＡＳＰ９、誘導性ＦａｓまたはＨＳＶ−ＴＫを含み得る。同様に、ベクターは、関連付けられるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＣＤ２０についてのリツキシマブまたはＥＧＦＲについてのセツキシマブの点滴を通して、形質導入された細胞の枯渇を促進する公知の細胞表面抗原、例としてＣＤ２０または切断型ＥＧＦＲ（配列番号８２）の発現のために設計され得る。また、成熟リンパ球の表面上に存在するＣＤ５２をターゲティングするアレムツズマブは、形質導入されたＢ細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を枯渇するために使用され得る。
本開示の組成物および方法によって治療され得る対象には、動物、例としてヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはブタが含まれる。対象は、男性であっても、女性であってもよく、幼児、若年、青年、成人および老年の対象を含む任意の好適な年齢であり得る。
実施例１
タンデム発現カセットの構築
ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、ＴＬＲ４の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号９７のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ５」を創出した。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、ＴＬＲ５の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号９８のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ１９」を創出した。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインを含むポリヌクレオチドは、配列番号９９のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ２１」が創出されるように、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインおよびＴＬＲ８細胞内シグナル伝達ドメインであった。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、ＮＦＡＭ１の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号１００のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ２５」を創出した。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、ＴＬＲ２の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号１０１のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ２７」を創出した。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、Ｔｒａｆ６の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号１０２のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ２９」を創出した。ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインとＴｉｍ４膜貫通ドメインとを含むポリヌクレオチドを、Ｔｒａｆ３の細胞内シグナル伝達ドメインに融合して、配列番号１０３のアミノ酸配列をコードするキメラ貪食受容体「ＣＥＲ３１」を創出した。
ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲのＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴＣＲαをコードするポリヌクレオチド（ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５／１８４２２８号を参照のこと）を、それらの間にＰ２Ａ自己切断ペプチドの配列を使用して融合した。ＴＣＲ Ｖαドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、ＴＣＲ Ｖβ領域は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。Ｃαドメインは、システイン置換、および１２、１４および１５位におけるＬＶＬ置換を含み、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。また、Ｃβは、システイン置換を含み、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。コードされるＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。この実施例において説明するタンデム発現コンストラクトのアミノ酸配列を、表２に提供する。
Figure 2021519580
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選択されたＣＥＲポリヌクレオチドおよびＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲポリヌクレオチドを、それらの間にＴ２Ａ配列（配列番号６８のアミノ酸配列をコードする）を伴って同じｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１Ａ〜１Ｇを参照のこと）。ヒトドナーから静脈穿刺により末梢血を収集し、リンパ球分離媒体を使用する密度勾配遠心分離によってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を単離した。市販されている単離キットを使用してＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を富化し、完全細胞増殖培地において抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により活性化した。ＣＥＲ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲの組合せを発現する５０μｌのウイルスベクターを、０．５ｍｌの完全細胞増殖培地中に希釈し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に添加した。その後、形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞を、３２℃の事前に温めた遠心分離機において２７０ｘｇ ｒｐｍにて１時間遠心分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を３７℃において２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を完全細胞増殖培地においてさらなる７２時間拡大増殖させ、ビーズを除去し、５日間拡大増殖させ、その後、機能アッセイに利用した。
実施例２
ＣＥＲ−ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞は抗原特異的細胞溶解活性および食作用活性を示す
活性化カスパーゼ３／７認識モチーフを切断に際して蛍光を発する赤色試薬とカップリングするカスパーゼ３／７アポトーシス試薬［ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）］を使用して、タンデム発現カセット形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を検出した。蛍光顕微鏡を使用して蛍光シグナルを測定した。形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＰＶ１６ Ｅ７＋頭頸部扁平上皮癌細胞（ＳＣＣ１５２）と１：１の比において共培養し、カスパーゼ３／７アポトーシス試薬を共培養物に添加した。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを含むＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＣＣ１５２細胞に対する細胞傷害活性を示す（図２を参照のこと）。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞傷害応答は、６時間まででＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を含むＣＤ８＋Ｔ細胞よりも指数関数的に高いように見える（図３を参照のこと）。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセット、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットまたはＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１：１の標的：エフェクター細胞比においてＳＣＣ１５２細胞と共培養した。カスパーゼ３／７アポトーシス試薬を、共培養物に添加し、蛍光を測定することによって細胞傷害活性を経時的に測定した（図４および５を参照のこと）。対照試料は、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ単独を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞または模擬形質導入Ｔ細胞であった。
タンデム発現カセット形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞の食作用活性を、タンデム発現カセット形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞をＳＣＣ１５２細胞と１：１の比において６時間共培養することによって検出した。ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−Ｘ７１０蛍光顕微鏡、２０Ｘ対物レンズおよびハイブリッドキャプチャーソフトウェアを使用して、食作用事象を可視化および定量した。ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲまたはＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデムカセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＣＣ１５２細胞に対して食作用を示すことができた（図６および７を参照のこと）。また、Ｒａｃ１阻害剤ＮＳＣ２３７６６（５０μＭ）を、共培養実験に添加し、インビトロ食作用を測定した。Ｒａｃ１阻害剤による処理は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ、ＣＥＲ２９−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲまたはＣＥＲ３１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によるＳＣＣ１５２細胞の貪食が、Ｒａｃ１依存的様式において起こったことを明らかにした（図８〜１０を参照のこと）。図１１および１２は、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞が、ビオチンをコンジュゲートしたホスファチジルセリンによりコーティングされたストレプトアビジンコーティングしたラテックスビーズを貪食したことを示す。約３０分間のインキュベーション後、ホスファチジルセリンコーティングしたビーズは、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ＋Ｔ細胞の内側で可視化され得る。
ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲタンデム発現カセットを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン応答を、ＳＣＣ１５２細胞との共培養実験中に細胞上清を試料採取することによって測定し、ＣＥＲ２１−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＴＣＲ＋Ｔ細胞が、ＩＦＮγ応答によって測定される抗原特異的エフェクター機能を示すことを示した（図１４を参照のこと）。
実施例３
ＣＥＲによって特異的に誘導されるＴ細胞の食作用活性
ＣＥＲ改変Ｔ細胞の標的細胞を貪食し、貪食シグナル伝達事象を総括する能力を、共培養アッセイにおいて査定した。Ｔ細胞に、ＨＰＶ Ｅ７特異的ＴＣＲ（配列番号１５８を含むポリペプチド配列）をコードする核酸、またはＨＰＶ Ｅ７特異的ＴＣＲ＋ＣＥＲ２９（配列番号１６９を含むポリペプチド配列）をコードするタンデム発現カセットを形質導入した。ｐＨｒｏｄｏ標識ＨＰＶ＋ＳＣＣ１５２頭頸部がん細胞を、模擬形質導入Ｔ細胞、ＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞またはＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲ／ＣＥＲ２９形質導入Ｔ細胞とコインキュベートした。食作用をＦＡＣＳにより分析し、これは、ｐＨｒｏｄｏ陽性により二重に染色されたｃｅｌｌ−ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ標識Ｅ７ ＴＣＲ／ＣＥＲ２９−Ｔ細胞の大集団が存在することを示した（図１５Ａを参照のこと）。ＦＡＣＳデータの定量により、模擬形質導入Ｔ細胞とＥ７ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞との間に差は示されなかった（図１５Ｂを参照のこと）。
上記に説明する様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。非限定的に２０１８年３月２８日出願の米国仮特許出願第６２／６４９，４９９号を含む、本明細書において参照および／または出願データシートに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込む。実施形態の態様は、様々な特許、出願および刊行物の概念を用いて、またさらなる実施形態を提供するために必要な場合、改変され得る。
これらおよび他の変化は、上記に詳述される説明に照らして実施形態についてなされ得る。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲において開示されている特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える均等物の全範囲に沿った全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (46)

  1. （ａ）第１の標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    貪食シグナル伝達ドメインと、
    細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインと
    を含むキメラ貪食受容体（ＣＥＲ）をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｂ）第２の標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    細胞内シグナル伝達ドメインと、
    細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインと
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド
    を含む発現カセット。
  2. （ａ）第１の標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    貪食シグナル伝達ドメインと、
    細胞外ドメインと貪食シグナル伝達ドメインとの間に位置し、かつこれらを接続する膜貫通ドメインと
    を含むキメラ貪食受容体（ＣＥＲ）をコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ可変領域とＴＣＲベータ定常領域とを含む組換えＴＣＲ結合タンパク質ベータ鎖をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｃ）ＴＣＲアルファ可変領域とＴＣＲアルファ定常領域とを含む組換えＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチド
    を含む発現カセット。
  3. ＣＥＲの結合ドメインが、ｓｃＦｖ、受容体外部ドメインまたはリガンドを含む、請求項１または２に記載の発現カセット。
  4. ＣＥＲの細胞外ドメインが、スペーサードメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現カセット。
  5. ＣＥＲの膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＢＡＩ１、ＣＤ４、ＤＡＰ１２、ＭＲＣ１、ＦｃＲ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９膜貫通ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現カセット。
  6. ＣＥＲの貪食シグナル伝達ドメインが、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、ＩｔｇＢ５、ＭＲＣ１、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯ、Ａｘｌ、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、ＣＤ７９ｂ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、Ｔｒａｆ６、Ｔｒａｆ２またはＴｒａｆ３シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現カセット。
  7. ＣＥＲの貪食シグナル伝達ドメインが、一次貪食シグナル伝達ドメインおよび二次貪食シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセット。
  8. ＣＥＲの一次貪食シグナル伝達ドメインおよび二次貪食シグナル伝達ドメインが、異なる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  9. ＣＥＲの一次貪食シグナル伝達ドメインおよび二次貪食シグナル伝達ドメインが各々独立して、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、ＩｔｇＢ５、ＭＲＣ１、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯ、Ａｘｌ、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、ＣＤ７９ｂ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、Ｔｒａｆ６、Ｔｒａｆ２およびＴｒａｆ３シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  10. ＣＥＲの第１の標的抗原が、プロ貪食マーカー、腫瘍抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  11. プロ貪食マーカーが、ホスファチジルセリンである、請求項１０に記載の発現カセット。
  12. ＣＥＲの結合ドメインが、ホスファチジルセリンに結合するＴｉｍ４結合ドメインを含む、請求項１１に記載の発現カセット。
  13. ＣＡＲの結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項１および３〜１２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  14. ＣＡＲの細胞外ドメインが、スペーサードメインをさらに含む、請求項１および３〜１３のいずれか一項に記載の発現カセット。
  15. ＣＡＲの膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５またはＺａｐ７０膜貫通ドメインを含む、請求項１および３〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
  16. ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ｂ、ＦｃＲおよびＣＤ６６ｄシグナル伝達ドメインから選択されるＩＴＡＭ含有活性化シグナル伝達ドメインを含む、請求項１および３〜１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
  17. ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３シグナル伝達ドメインから選択される第１の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１および３〜１６のいずれか一項に記載の発現カセット。
  18. ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３シグナル伝達ドメインから選択される第２の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１および３〜１７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  19. ＣＡＲが、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲまたはＴＣＲ−ＣＡＲである、請求項１および３〜１８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  20. ＣＡＲの第２の標的抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である、請求項１および３〜１９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  21. ＣＡＲの第２の標的抗原が、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイス式Ａ抗原、ルイス式Ｙ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｏ−アセチル−ＧＤ２またはＧＤ２から選択される腫瘍抗原である、請求項２０のいずれか一項に記載の発現カセット。
  22. 組換えＴＣＲの第２の標的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＨＰＶ Ｅ７、サバイビン、αフェトプロテインまたは腫瘍新生抗原である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  23. ＴＣＲアルファ鎖が、１２、１４および１５位におけるＬＶＬ置換を含む、請求項２〜１２および２２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  24. ＴＣＲベータ鎖定常領域が５６位におけるシステイン置換を含むか、ＴＣＲアルファ鎖定常領域が４８位におけるシステイン置換を含むか、またはこれらの両方である、請求項２〜１２、２２および２３のいずれか一項に記載の発現カセット。
  25. ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドが、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの上流に存在する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の発現カセット。
  26. ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドとＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとの間にＩＲＥＳエレメントまたは２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１、３〜２１および２５のいずれか一項に記載の発現カセット。
  27. ＣＥＲ、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖をコードするポリヌクレオチドが、ＩＲＥＳエレメントまたは２Ａペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＩＲＥＳエレメントまたは２Ａペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項２〜１２、２２〜２４および２５のいずれか一項に記載の発現カセット。
  28. ２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａペプチドを含む、請求項２６または２７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  29. （ａ）ＣＥＲが、表１に列挙される配列番号のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）ＴＣＲが、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、
    請求項２に記載の発現カセット。
  30. 発現カセットに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  31. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
  32. ウイルスベクターである、請求項３１に記載のベクター。
  33. ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
  34. 請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
  35. Ｔ細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. Ｔ細胞が、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞またはこれらの両方である、請求項３５に記載の宿主細胞。
  37. Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞またはそれらの任意の組合せである、請求項３５または３６に記載の宿主細胞。
  38. ヒトである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  39. ＣＡＲまたはＴＣＲによってターゲティングされる抗原を発現する細胞に対する細胞溶解活性、およびＣＥＲによってターゲティングされる抗原を発現する細胞に対する食作用活性を示す、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  40. 有効量の請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞を投与することを含む、対象において疾患を治療する方法。
  41. 疾患が、がん、ウイルス感染、細菌感染または寄生生物感染である、請求項４０に記載の方法。
  42. がんが、固形腫瘍、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、腎がん、血液がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、結腸がん、直腸がん、胃がん、食道がん、膀胱がん、頭頸部がん、甲状腺がん、乳がん、三種陰性乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、尿路上皮がん、膵がん、神経膠芽腫、肝細胞がん、骨髄腫、多発性骨髄腫、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、脳がん、ＣＮＳがんまたは悪性神経膠腫である、請求項４１に記載の方法。
  43. 宿主細胞が、対象にとって自家または同種異系である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 宿主細胞が、追加の治療剤と組み合わせて対象に投与される、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 追加の治療剤が、抗体、放射線療法、化学療法剤、小分子療法、細胞免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス、電気パルス療法、ＵＶ光療法、高周波数超音波療法、抗生物質、抗真菌剤または抗ウイルス剤である、請求項４４に記載の方法。
  46. 追加の治療剤が、治療用量未満の用量において投与される、請求項４４または４５に記載の方法。
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