CN112194726B - 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种针对病原体的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)多肽，其具有：(a)细胞外结构域，包括一个或多个病理性蛋白聚集体特异性的抗原结合区；(b)跨膜结构域；(c)吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域的至少一个拷贝。进一步，本发明还提供编码所述多肽的多核苷酸、基因载体、携带用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体的重组细胞和组合物。本发明提供的针对病理性蛋白聚集体的嵌合多肽，其胞外结构域能够特异性识别病理性蛋白聚集体，同时其胞内信号结构域能够激活介导细胞吞噬清除病理性蛋白聚集体，且这一过程并不介导细胞因子的释放、不介导抗原递呈、不介导组织损伤。

Description

用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及一种新颖的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor，CAR)设计方案和用途。该CAR用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体特异性的结合病原体抗原，同时激活其胞内的吞噬细胞特异性吞噬信号，介导重组细胞吞噬清除病理性蛋白聚集体，且在这一过程中，重组细胞并不杀伤抗原表达细胞、不显著释放细胞因子、不介导抗原递呈，具有非常好的安全性特征。
背景技术
病理性的蛋白质沉积和聚集是多种疾病的共同病理现象，表现为蛋白质的异常折叠或蛋白质不适当的沉积和聚集。针对病理性蛋白质聚集的清除药物，一直是领域内的前沿热点，如有报道显示利用针对血清淀粉样蛋白P组分(SAP)的单克隆抗体(mAb)以清除淀粉样蛋白，但其对疾病的长期治疗作用并不明显(Richards，et.al，N Engl J Med2015；373：1106-1114)。在针对朊病毒的治疗性模型中，针对朊病毒蛋白的单克隆抗体药物可以介导病理性的PrP(Sc)聚集减少，从而减少脑部的病变(Ohsawa N,Song C H,Suzuki A,etal.Therapeutic effect of peripheral administration of an anti-prion proteinantibody on mice infected with prions[J].Microbiology and immunology,2013,57(4):288-297.)。但由于血脑屏障的存在和脑脊液的主动清除机制，脑内单克隆抗体比循环血液的浓度低1000倍，难以达到有效剂量。针对心血管疾病的病理性蛋白聚集物的清除也有一些利用单克隆抗体的药物，但效果均不理想。
以嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)为代表的人工受体—工程细胞治疗方案已经获得系列的治疗性突破，尤其是在肿瘤相关疾病中的应用。拓宽该类人工分子的应用方向是本领域的重大问题。CAR受体的结构一般由细胞外识别结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域组成。其中，细胞外识别结构域用于特异性抗原的识别；跨膜结构域提供跨膜的支撑和细胞内外信号的传导，胞内信号结构与用于激活特定的信号。在具体应用中，常通过基因工程技术，利用携带CAR的免疫细胞作为工程化的效应细胞，实现具体的用途，如肿瘤的治疗。但目前CAR的应用主要集中在癌症治疗中，对于在其他领域研究较少。
之前，已有公开利用载有嵌合抗原受体的单核细胞针对病理性蛋白聚集物清除的手段，见专利文件(WO2019152781)。本发明人在研究中发现，该专利文件公开的CAR设计，其胞内段采用共刺激分子和CD3等胞内结构域，具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosin-based activation motifs,ITAMs)。携带该类CAR的巨噬细胞可以吞噬病理性的蛋白质聚集物，但具有以下技术问题：(1)激活巨噬细胞对吞噬的聚集物进行抗原提呈，将吞噬的病理性蛋白通过MHC途径展示在巨噬细胞表面，增加了产生针对这些蛋白质自身抗体的产生，提示可能具有极大的副作用。(2)另一方面，该吞噬过程中巨噬细胞释放大量促炎因子，如TNFα，IL-6，IL-8等，可以造成局部炎症细胞浸润，造成组织损伤。(3)该类CAR巨噬细胞不仅吞噬病理性蛋白聚集物，还能直接吞噬表达靶蛋白的细胞，直接造成组织损伤。综合来看，该类CAR和携带CAR的免疫细胞副作用极大。
因此需要开发能清除病理性蛋白聚集物，减少副作用的新手段，以解决这些需求。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题进行的，对用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体以及应用进行探索。
本发明的第一方面，提供一种嵌合多肽，其包括：(a)细胞外结构域，其包括一个或多个病理性蛋白聚集体特异性的抗原结合区；(b)跨膜结构域；(c)吞噬细胞中特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域的至少一个拷贝。
在某些情况下，该嵌合多肽还包括信号肽，信号肽可通过基因工程方法连接在细胞外结构域的上游(例如，多肽链的N端)。
抗原结合区包括编码抗体或其功能片段的氨基酸序列，该抗体或其功能片段包括病原体的抗原结合片段(Fab)，单链可变片段(scFv)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单域抗体(single domain antibody，sdAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双特异性抗体、双体(diabody)，或上述结构的功能性片段。
所述病理性蛋白聚集体是本领域的专业术语，描述在疾病过程中由于蛋白质折叠异常沉积在组织中的病理变化，其特征已在多篇专利文献和非专利文献详细描述，此处不再赘述，可参考专利文献CN 1437442 A和WO2019152781。本发明的一些实施方案中，所述病理性蛋白聚集体包括神经退行性疾病(neurodegenerative disease)，炎性疾病(inflammatory disease)，心血管疾病(cardiovascular disease)，纤维变性疾病(fibrotic disease)、淀粉样变性(amyloidosis)的受试者组织中的病理性蛋白聚集体。
其中所述神经退行性疾病包括：Tau蛋白病(tauopathy)、早老性痴呆(preseniledementia)，老年性痴呆(senile dementia)，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，17号染色体相关的帕金森氏症(Parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17)，进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)，皮克氏病(Pick’s disease)，原发性进行性失语(primary progressive aphasia)，额颞部痴呆(frontotemporal dementia)，皮质基底痴呆(corticobasal dementia)，帕金森氏病(Parkinson’s disease)，帕金森病伴痴呆(Parkinson’s disease with dementia)，路易体痴呆(dementia with Lewybodies)，传染性海绵状脑病(Mad Cow Disease)、亨廷顿舞蹈病、唐氏综合征(Down’ssyndrome)、多***萎缩(Down’s syndrome)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)、Hallervorden-Spatz综合征(Hallervorden-Spatz syndrome)、多聚谷氨酰胺病(polyglutamine disease)、三核苷酸重复性疾病(trinucleotide repeatdisease)、家族性英国痴呆(Familial British dementia)、致命性家族性失眠(FatalFamilial Insomnia)、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(冰岛型)(Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis,Icelandic,HCHWA-I)，散发性致死性失眠(,poradic Fatal Insomnia,sFI)、可变蛋白酶敏感朊病毒病(Variably Protease-Sensitive Prionopathy,VPSPr)、家族性丹麦痴呆(FamilialDanish dementia)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)、变异性克雅氏病(ariant Creutzfeldt-Jakob Disease,vCJD)和朊病毒病(prion disease)。
所述炎性疾病包括：***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、血管炎(vasculitis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、牙周炎(periodontitis)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、鼻窦炎(sinusitis)、哮喘(asthma)、肺结核(tuberculosis)、克罗恩(Crohn’s disease)、慢性感染(chronic infection)、遗传性周期性发热(hereditary periodic fevers)、恶性肿瘤(malignancies)、***性血管炎(systemic vasculitides)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、支气管扩张(bronchiectasis)、大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa)、周期性中性粒细胞减少症(cyclic neutropenia，获得性或遗传性免疫缺陷(acquired or inheritedimmunodeficiencies，注射药物使用和痤疮聚集(injection-drug use and acneconglobate，Muckle Wells(MWS)疾病和常见的地中海热(amiliar Mediterranean Fever，FMF)。
所述心血管疾病包括：包涵体肌炎(IBM)、心房淀粉样变性、主动脉内测淀粉样蛋白变性、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、冠状动脉疾病(coronary artery disease)、外周动脉疾病(peripheral artery disease)、高血压心脏病(hypertensive heartdisease)、代谢综合征(metabolic syndrome)、高血压(hypertension)、脑血管病(cerebrovascular disease)和心力衰竭(heart failure)。
所述纤维变性疾病包括：肺纤维化(pulmonary fibrosis)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、肝硬化(cirrhosis)、囊性纤维化(cysticfibrosis)、硬皮病(scleroderma)、心脏纤维化(cardiac fibrosis)、放射性肺损伤(radiation-induced lung injury)、脂肪性肝炎(steatohepatitis)、肾小球硬化(glomerulosclerosis)、间质性肺病(interstitial lung disease)、肝纤维化(liverfibrosis)、纵隔纤维化(mediastinal fibrosis)、腹膜后腔纤维化(retroperitonealcavity fibrosis)、骨髓纤维化(bone marrow fibrosis)和皮肤纤维化(skin fibrosis)。
所述淀粉样变性包括：甲状腺髓样癌、泌乳素腺瘤、原发性淀粉样变(PrimaryAmyloidosis,AL)、继发性淀粉样变(Secondary Amyloidosis,AA)、家族性淀粉样变(Familial Amyloidosis,ATTR)、其他家族性淀粉样变(other Familial Amyloidoses)、β-2微球蛋白淀粉样变(Beta-2 Microglobulin Amyloidosis)、局限性淀粉样变(LocalizedAmyloidosis)、重链淀粉样变(Heavy Chain Amyloidosis,AH)、轻链淀粉样变病(LightChain Amyloidosis,AL)、原发性***性淀粉样变病(Primary Systemic Amyloidosis)、ApoAI淀粉样变(ApoAI Amyloidosis)、ApoAII淀粉样变(ApoAII Amyloidosis)、ApoAIV淀粉样变(ApoAIV Amyloidosis)、载脂蛋白C2淀粉样变(Apolipoprotein C2 Amyloidosis)、载脂蛋白C3淀粉样变(Apolipoprotein C3 Amyloidosis)、角膜乳铁蛋白淀粉样变(Corneal lactoferrin amyloidosis)、转甲状腺素相关淀粉样变(Transthyretin-Related Amyloidosis)、透析淀粉样变(Dialysis amyloidosis)、纤维蛋白原淀粉样变病(Fibrinogen amyloidosis)、Lect2淀粉样变病(Lect2 amyloidosis，ALECT2)、遗传性肾淀粉样变性、和溶菌酶淀粉样变病(Lysozyme amyloidosis)。
具有代表性的病理性蛋白聚集体包括：淀粉样β蛋白(Beta amyloid)、Tau蛋白、TDP-43、血清淀粉样P蛋白(serum amyloid P)、淀粉样蛋白(amyloid)、胶原(collagen)、α-突触核蛋白(Alpha-synuclein)、朊病毒，亨廷顿蛋白、降血钙素、心钠素(Atrialnatriuretic factor)、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A)、梅丁(Medin)、泌乳***(Prolactin)、运甲状腺素蛋白(Transthyretin)、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角膜上皮素(Keratoepithelin)、胱抑素(Cystatin)、免疫球蛋白轻链AL、纤维蛋白原。
当病理性蛋白聚集体为淀粉样β蛋白时，单链抗体可变区选自Gantenerumab；当病理性蛋白聚集体为Tau蛋白时，单链抗体可变区选自RO7105705；当病理性蛋白聚集体为α-突触核蛋白时，单链抗体可变区选自prasinezumab；当病理性蛋白聚集体为朊病毒时，单链抗体可变区选自PrPc-O0059；当病理性蛋白聚集体为亨廷顿蛋白时，单链抗体可变区选自3B5H10；当病理性蛋白聚集体为降血钙素时，单链抗体可变区选自CA11；当病理性蛋白聚集体为心钠素时，单链抗体可变区选自JM08-36；当病理性蛋白聚集体为载脂蛋白AI时，单链抗体可变区选自MabA34；当病理性蛋白聚集体为血清淀粉样蛋白A时，单链抗体可变区选自birtamimab；当病理性蛋白聚集体为梅丁时，单链抗体可变区选自18G1；当病理性蛋白聚集体为运甲状腺素蛋白时，单链抗体可变区选自14G8；当病理性蛋白聚集体为溶菌酶时，单链抗体可变区选自NbHul6；当病理性蛋白聚集体为β2微球蛋白时，单链抗体可变区选自Nb24；当病理性蛋白聚集体为凝溶胶蛋白时，单链抗体可变区选自GsnVHH；当病理性蛋白聚集体为胱抑素时，单链抗体可变区选自M41；当病理性蛋白聚集体为纤维蛋白原时，单链抗体可变区选自LJ-134B29；当病理性蛋白聚集体为TDP-43时，单链抗体可变区选自NI-205.113C4；当病理性蛋白聚集体为血清淀粉样P蛋白时，单链抗体可变区选自Dezamizumab；当病理性蛋白聚集体为胶原时，单链抗体可变区选自MT293；当病理性蛋白聚集体为类风湿因子时，单链抗体可变区选自LPS10-1；当病理性蛋白聚集体为LDL时，单链抗体可变区选自IK17。
吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域指以单核细胞为代表的的吞噬细胞特有的吞噬信号受体，该类受体天然状况下介导吞噬细胞发生吞噬事件。在一些实施方案中，吞噬细胞特异性吞噬信号受体包括TAM家族受体受体酪氨酸激酶(TAM familyof receptor tyrosine kinases)、磷脂酰丝氨酸受体家族(Phosphatidylserinereceptors)、低密度脂蛋白受体相关蛋白家族(Prolow-density lipoprotein receptor-related proteins)、甘露糖受体家族(mannose receptors)、清道夫受体家族(scavengerreceptors)、TREM受体家族(Triggering receptor expressed on myeloid cells)。优选包括TYRO3(Uniport：Q06418)、AXL(Uniport：P30530)、MERTK(Uniport：Q12866)、ADGRB1(Uniport：O14514)、ADGRB3(Uniport：O60242)、HAVCR1(Uniport：Q96D42)、TIMD4(Uniport：Q96H15)、Stabilin-1(Uniport：Q9NY15)、Stabilin-2(Uniport：Q8WWQ8)、Integrinsubunit αv(Uniport：P06756)、Integrin subunitβ3(Uniport：P05106)Integrin subunitβ5(Uniport：P18084)、SCARF1(Uniport：Q14162)、AGER(Uniport：Q15109)、CD300LF(Uniport：Q8TDQ1)、CD36(Uniport：P16671)、LRP1(Uniport：Q07954)、MRC1(Uniport：P22897)、TREM2(Uniport：Q9NZC2)。
在一些优选的实施方案中，吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域不含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosin-based activationmotifs,ITAMs)。最优选TYRO3(Uniport：Q06418)、AXL(Uniport：P30530)、MERTK(Uniport：Q12866)，该三个胞内信号结构域属于TAM受体家族，不含有ITAM基序。
跨膜结构域包括源自CD8、TYRO3、AXL、MERTK、ADGRB1、ADGRB3、HAVCR1、TIMD4、Stabilin-1、Stabilin-2、Integrin subunit αv、Integrin subunitβ3、Integrin subunitβ5、SCARF1、AGER、CD300LF、CD36、LRP1、MRC1、或TREM2的茎(stalk)和/或跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可通过基因工程的方法连接在胞外结构域的下游和胞内信号结构域上游。在一些实施方案中，信号肽包括衍生自CD8、TYRO3、AXL、MERTK、ADGRB1、ADGRB3、HAVCR1、TIMD4、Stabilin-1、Stabilin-2、Integrin subunit αv、Integrin subunitβ3、Integrin subunitβ5、SCARF1、AGER、CD300LF、CD36、LRP1、MRC1、和TREM2的信号肽。
在本发明公开的一些实施方案中，所述嵌合多肽的优选结构包括：(a)信号肽；(b)胞外结构域，所述胞外结构域包括一个或多个病理性蛋白聚集体特异性的抗原结合区；(c)跨膜结构域；(d)来自吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域的至少一个拷贝。优选的，嵌合多肽包括：(a)来自CD8的信号肽；(b)细胞外单链抗体可变片段(scFv)，其对病理性蛋白聚集体具有特异性亲和性；(c)来自CD8的跨膜结构域；(d)来自TYRO3、AXL、MERTK的胞内信号结构域。
在本发明的某些优选实施例中，所述嵌合多肽的氨基酸序列如序列1-2所示。
相应的，本发明的第二方面，提供了编码上述的嵌合多肽的多核苷酸、运载该核苷酸的基因载体以及包含这种基因载体的重组细胞。
本发明提供的表达载体包含下述可通过基因工程方法连接的元件：转录启动子、编码合适的信号肽的DNA区、编码上述嵌合多肽的DNA区和转录终止子。载体是本领域技术人员所熟悉的技术，如参考非专利文献中的病毒载体[Morsut L,et al.Cell,2016,164(4):780-791.]和非病毒载体[Athanasopoulos T,et al.Hematology/Oncology Clinicsof North America,2017,31(5):753-770.]，转染的方法包括病毒转染、化学转染试剂转染或电击转染中的任意一种或至少两种的组合。
重组细胞是原核细胞、真核细胞或人细胞，优选免疫细胞，最优选吞噬功能细胞。该吞噬功能细胞包括巨噬细胞，树突细胞，肥大细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，小胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，吞噬细胞还可以是骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)或骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)。通过将嵌合多肽、多核苷酸或重组载体引入细胞中，即可获得重组细胞。
治疗患有所述疾病个体时，向个体施用有效数量的重组吞噬细胞，该吞噬细胞已被修饰以表达对与病理性蛋白聚集物具有特异性亲和性的多肽。优选情况为，吞噬细胞来源于患有病理性蛋白聚集物相关疾病的同一个体。
构建基因载体以及重组细胞时，优选同时表达至少两种能分别识别同一个抗原不同表位的嵌合多肽。经过实验验证，相对于仅运载一种嵌合多肽的重组细胞，当重组细胞表达针对同一个抗原且表位不完全相同的CAR受体时，可以显著的提高重组细胞对蛋白聚集体的吞噬和清除作用。而同时携带两种CAR的重组细胞即使共同处理也没有上述技术效果。
本发明的第三方面，还涉及细胞培养物，所述细胞培养物包括本文所公开的至少一个重组细胞和培养基。
本发明的第四方面，还提供了一种药物组合物。该组合物包含上述的嵌合多肽、多核苷酸、载体、重组细胞，和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的第五方面，提供了上述用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体在制备诊断或治疗病理性蛋白聚集物相关疾病试剂、试剂盒或治疗药物中的用途。
该用途包括：1)介导细胞直接吞噬病理性蛋白聚集体抗原，如实施例1-2所述；2)不介导重组细胞杀伤抗原表达细胞，不造成组织和细胞损伤；如实施例3所述。3)吞噬蛋白聚集体抗原后并不显著释放促炎和或抗炎的细胞因子，如实施例4所述。4)吞噬蛋白聚集体抗原后并不介导针对吞噬抗原的抗原递呈作用，如实施例5所述。5)清除受试者体内的病理性蛋白聚集体，如实施例6-9所述。6)不造成组织损伤。如实施例6-7所述。
所述病理性蛋白聚集物相关疾病包括上述的神经退行性疾病(neurodegenerative disease)，炎性疾病(inflammatory disease)，心血管疾病(cardiovascular disease)，纤维变性疾病(fibrotic disease)、淀粉样变性(amyloidosis)。
相比现有技术，本发明的技术效果如下：
本发明提供了一种针对病理性蛋白聚集体的嵌合多肽，其胞外结构域能够特异性识别病理性蛋白聚集体，同时其胞内信号结构域能够激活介导细胞吞噬清除病理性蛋白聚集体，且这一过程并不介导细胞因子的释放、不介导抗原递呈、不介导组织损伤。即本发明所述的嵌合多肽实现的突出性技术效果在于：1)实现重组细胞对病理性蛋白聚焦体的吞噬清除；2)不增加甚至减少局部脏器的炎症状态；3)不介导抗原递呈；4)不介导重组细胞杀伤表达病理性蛋白聚集体抗原的细胞。
因此，本发明的实质性特征并不限制结构域所针对的病理性蛋白聚集体，可以应用于几乎所有病理性蛋白聚集体的特异性清除，即本发明所述的嵌合多肽可以实现的实质性特征是：嵌合多肽可以介导重组细胞产生吞噬病理性蛋白聚集体的生物学作用，且不激活免疫细胞释放大量促炎因子造成组织损伤。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如常用的抗体工程方法、那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法、合成细胞、装置、基因回路的构建方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括董志伟，王琰主编《抗体工程》第二版，北京医科大学出版社，2002；Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Press；Phage Display:A laboratory Manual,Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1.多种针对病理性聚集体的嵌合多肽及重组细胞制备
按照以下结构设计嵌合多肽：(a)来自CD8的信号肽；(b)细胞外单链抗体可变片段(scFv)，其对病理性蛋白聚集体具有特异性亲和性；(c)来自CD8的跨膜结构域；(d)来自FCER1G、CD3、MEGF10、TYRO3、MERTK、AXL的胞内区。并采用不含胞内区域的嵌合多肽作为对照。在CD8铰链区和跨膜结构域之间添加Myc标签以方便检测，嵌合多肽的构建信息见表1：
表1嵌合多肽结构
Figure BDA0002662344000000081
Figure BDA0002662344000000091
Figure BDA0002662344000000101
其中，αβ-CARMERTK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，αβad-CARMERTK的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
利用全基因合成的方法根据表1所述的嵌合多肽结构制备编码嵌合多肽的多核苷酸，在细胞外结构域和跨膜结构域之间增加Myc标签以利于检测；然后利用慢病毒表达***将编码嵌合多肽的核苷酸整合进入THP-1细胞。根据多肽链结构合成基因、利用慢病毒***使细胞表面表达人工多肽是本领域的通用常规技术，方法可参考专利文献(Klichinsky M,et al.Nature Biotechnology,2020:1-7.)。原代巨噬细胞的分离和基因过表达方法同非专利文献(Klichinsky M,et al.Nature Biotechnology,2020:1-7.)。最终获得的人工合成受体细胞如表。其中，αS1-CARΔ为不含有胞内信号结构与的对照嵌合多肽，未转染细胞作为阴性对照(untransduced，UTD)。另外，αβad-CARMERTK受体采用HA标签进行构建检测。
根据人工合成受体的构建方式，分别对其细胞外结构域和细胞内结构域以流式细胞术检测表达情况，利用流式细胞术检查工程细部表面受体的实验技术是本领域的通用技术，参考非专利文献[Fu W,et al.Nature communications,2019,10(1):1-12.]，结果如表2。
表2嵌合多肽表达情况
Figure BDA0002662344000000102
Figure BDA0002662344000000111
Figure BDA0002662344000000121
这些结果显示，嵌合多肽和重组细胞制备成功，受体表达率较高。
实施例2.嵌合多肽对病理性蛋白聚集体的结合吞噬清除作用
按照文献方法[Gach J S,et al..PLoS pathogens,2017,13(12):e1006793.]，分别利用生物素标记的重组蛋白以明确嵌合多肽及重组细胞所述抗原吞噬作用。流失细胞术利用含有荧光标记的链霉亲和素检测被细胞吞噬的重组蛋白，结果如表3-23所示：
表3对淀粉样β蛋白的吞噬作用
Figure BDA0002662344000000122
表4对Tau蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 80.74 10.29 -
αtau-CARMERTK 9812.43 1140.16 P＜0.01
αtau-CARζ 9023.15 579.78 P＜0.01
αtau-CARε 7069.37 950.96 P＜0.01
表5对α-突触核蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 95.29 26.25 -
αS-CARMERTK 9600.79 1434.28 P＜0.01
αS-CARζ 10288.42 3387.83 P＜0.01
表6对朊病毒的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 70.25 12.34 -
αP-CARMERTK 7531.89 1251.38 P＜0.01
αP-CARζ 9267.07 3326.86 P＜0.01
表7对亨廷顿蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 57.88 13.80 -
αh-CARMERTK 6631.18 1375.34 P＜0.01
αh-CARζ 7277.98 1690.55 P＜0.01
表8对降血钙素的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 83.56 6.96 -
αc-CARMERTK 8474.14 2048.19 P＜0.01
表9对心钠素的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 48.26 2.43 -
αJ-CARMERTK 9435.70 131.23 P＜0.01
表10对载脂蛋白AI的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 76.85 8.04 -
αAI-CARMERTK 9485.83 601.56 P＜0.01
表11对血清淀粉样蛋白A的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 77.23 16.50 -
αSAA-CARMERTK 8129.92 821.92 P＜0.01
表12对梅丁的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 90.36 7.62 -
αM-CARMERTK 9501.21 1074.87 P＜0.01
表13对运甲状腺素蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 68.25 22.33 -
αT-CARMERTK 11850.37 1565.69 P＜0.01
表14对溶菌酶的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 60.17 13.99 -
αLy-CARMERTK 9850.22 1528.14 P＜0.01
表15对β2微球蛋白的吞噬作用
Figure BDA0002662344000000141
Figure BDA0002662344000000151
表16对凝溶胶蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 94.04 14.83 -
αCys-CARMERTK 8703.33 908.60 P＜0.01
表17对胱抑素的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 77.65 9.16 -
αF-CARMERTK 6019.61 1420.87 P＜0.01
表18对纤维蛋白原的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 60.13 13.96 -
αTDP-CARMERTK 9956.71 1517.01 P＜0.01
表19对TDP-43的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 76.01 15.72 -
αTDP-CARMERTK 8962.11 1595.96 P＜0.01
表20对血清淀粉样P蛋白的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 66.37 4.04 -
αSP-CARMERTK 9722.17 1198.78 P＜0.01
αSP-CARζ 8310.90 3635.50 P＜0.01
表21对胶原的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 65.07 20.46 -
αColl-CARMERTK 10236.25 670.35 P＜0.01
表22对类风湿因子的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 79.25 9.91 -
αRF-CARMERTK 8252.60 1137.27 P＜0.01
表23对LDL的吞噬作用
细胞 阳性细胞×平均荧光强度 SD P值(vs.UTD)
UTD 56.03 3.83 -
αLDL-CARMERTK 8822.38 3594.17 P＜0.01
这些结果可以看出，本发明所描述的嵌合多肽可以对多种病理性蛋白聚集体产生吞噬作用。进一步的，利用同样的实验方法，评估24小时后培养液中生物素标记抗原蛋白的水平来评价重组细胞对抗原的清除能力，在各处理组和对照组之间比较信号强度，结果如表24。
表24各处理组对病理性蛋白聚集体的清除作用
Figure BDA0002662344000000161
/>
Figure BDA0002662344000000171
/>
Figure BDA0002662344000000181
结果显示，本发明所描述的嵌合多肽和有效介导重组细胞清除蛋白聚集体抗原。值得注意的是，当重组细胞表达针对同一个抗原且表位不完全相同的CAR受体时，可以显著的提高重组细胞对蛋白聚集体的吞噬和清除作用。而同时携带两种CAR的重组细胞即使共同处理也没有上述技术效果。
实施例3重组细胞对病理性蛋白表达细胞的吞噬和裂解作用评估
利用过表达本发明所述的病理性聚集体蛋白抗原的293T细胞进行本实验，采用巨噬细胞对293T表面表达聚集体蛋白抗原细胞的吞噬实验检测细胞对表达抗原的裂解作用，方法参考非专利文献[Klichinsky M,et al.Nature Biotechnology,2020:1-7.]，结果如表25-30：
表25对表达淀粉样β蛋白抗原的293-T裂解作用检测
Figure BDA0002662344000000182
表26对表达Tau蛋白抗原的293-T裂解作用检测
细胞 裂解作用(％对照细胞) SD P值(vs.UTD)
UTD 10.99 3.34 -
αtau-CARMERTK 11.81 1.35 P＞0.05
αtau-CARζ 69.44 5.99 P＜0.01
αtau-CARε 61.01 23.68 P＜0.01
表27对表达α-突触核蛋白抗原的293-T裂解作用检测
细胞 裂解作用(％对照细胞) SD P值(vs.UTD)
UTD 9.76 1.85 -
αS-CARMERTK 13.76 1.75 P＞0.05
αS-CARζ 63.50 7.55 P＜0.01
表28对表达朊病毒抗原的293-T裂解作用检测
细胞 裂解作用(％对照细胞) SD P值(vs.UTD)
UTD 12.11 3.34 -
αP-CARMERTK 11.73 5.24 P＞0.05
αP-CARζ 53.34 7.72 P＜0.01
表29对表达亨廷顿蛋白抗原的293-T裂解作用检测
细胞 裂解作用(％对照细胞) SD P值(vs.UTD)
UTD 10.81 3.54 -
αh-CARMERTK 9.49 3.09 P＞0.05
αh-CARζ 47.36 12.07 P＜0.01
表30对表达血清淀粉样P蛋白的293-T裂解作用检测
Figure BDA0002662344000000191
Figure BDA0002662344000000201
这些结果显示，本发明所描述的嵌合多肽的代表物不介导重组细胞对靶细胞的损伤作用，而CARζ等嵌合多肽介导细胞的损伤，表明本发明所述的嵌合多肽具有显著的安全性特征。
实施例4重组细胞吞噬病理性蛋白聚焦体后细胞因子的释放检测
对实施例2中的部分吞噬蛋白聚集体后细胞培养液中的细胞因子进行检测，结果如表31-33：
表31不同重组细胞吞噬蛋白抗原后的IL-6的分泌表达情况
Figure BDA0002662344000000202
/>
Figure BDA0002662344000000211
表32不同重组细胞吞噬蛋白抗原后的IL-8的分泌表达情况
Figure BDA0002662344000000212
/>
Figure BDA0002662344000000221
/>
Figure BDA0002662344000000231
表33不同重组细胞吞噬蛋白抗原后的TNFα的分泌表达情况
Figure BDA0002662344000000232
/>
Figure BDA0002662344000000241
这些结果显示，本发明所描述的嵌合多肽和重组细胞在吞噬蛋白抗原后并不释放促炎的细胞因子，具有较好的安全性。
实施例5.嵌合多肽对介导重组细胞吞噬抗原后的抗原递呈作用
将实施例2所述的重组细胞进一步裂解，利用免疫共沉淀手段富集MHC分子，然后利用肽指纹方法鉴定沉淀获得的MHC分子中是否结合有病理性蛋白聚集体抗原肽，免疫共沉淀和肽指纹的方法可以参考非专利文献[Shobako N,et al..Molecular Nutrition&Food Research,2018,62(4):1700732；Liu C,et al.Journal of Biological Chemistry,2016,291(15):8173-8188.]。结果如表34。
表34不同重组细胞吞噬蛋白抗原后的MHC分子结合抗原肽情况
Figure BDA0002662344000000251
/>
Figure BDA0002662344000000261
这些结果显示，本发明所述的嵌合多肽并介导重组细胞吞噬抗原后，并不介导抗原递呈。
实施例6体内小动物模型中血清淀粉样P蛋白聚集体的清除
按照非专利文献的方法建立淀粉样蛋白聚集模型[Murakami,T.,et al.TheAmerican journal of pathology 141.2(1992):451.]，造模成功后向动物模型中使本发明所述的重组细胞进行治疗性研究，每组7只小鼠，处理组使用携带αSP-CARMERTK和αSP-CARζ的小鼠单核细胞系RAW264.7。每周施用3次，每次每只剂量为1×106，对照组施用不携带重组多肽的小鼠单核细胞系(UTD)，模型组不进行任何处理。治疗四周后处死小鼠，取肝脏利用荧光组织化学检测血清淀粉样P蛋白的沉积，并评估组织炎症评分，结果如表35-36。
表35各处理组组织内血清淀粉样P蛋白沉积含量
Figure BDA0002662344000000262
表36：各处理组组织内损伤评分
细胞 损伤评分 SD P值(vs.模型组)
模型组 0.286 0.267 -
UTD 0.429 0.345 P＞0.05
αSP-CARMERTK 0.643 0.244 P＜0.01
αSP-CARζ 2.786 0.267 P＜0.01
这些结果显示，本发明所述的嵌合多肽可以有效减少组织内的病理性蛋白聚体沉积，且不造成组织的炎性损伤。
实施例7体内小动物模型中淀粉样β蛋白聚集体的清除
按照非专利文献的方法建立阿尔兹海默病脑内淀粉样β蛋白聚聚集模型[Bohrmann,Bernd,et al.Journal of Alzheimer's Disease 28.1(2012):49-69.]，造模成功后向动物模型中使本发明所述的重组细胞进行治疗性研究，每组7只小鼠，处理组使用本发明所述嵌合多肽的小鼠单核细胞系RAW264.7。每周施用3次，每次每只剂量为1×106，对照组施用不携带重组多肽的小鼠单核细胞系(UTD)，模型组不进行任何处理。治疗八周后处死小鼠，取动物脑组织利用荧光组织化学检测淀粉样β蛋白聚集体的沉积，并评估组织炎症评分，结果如表37-38。
表37：各处理组组织内淀粉样β蛋白沉积含量
Figure BDA0002662344000000271
表38：各处理组组织内损伤评分
Figure BDA0002662344000000281
/>
这些结果显示，本发明所述的嵌合多肽可以有效减少阿尔兹海默病模型脑组织内的病理性蛋白聚体沉积，且不造成组织的炎性损伤。值得注意的是，当重组细胞表达针对同一个抗原且表位不完全相同的CAR受体时，可以显著的提高重组细胞对蛋白聚集体的吞噬和清除作用，显著的减少病理性蛋白聚体沉积。而同时携带两种CAR的重组细胞即使共同处理也没有上述技术效果。
实施例8体内小动物模型中胶原蛋白沉积的清除
按照非专利文献的方法建立肺纤维化胶原蛋白沉积模型[Limjunyawong N,Mitzner W,Horton M R.A mouse model of chronic idiopathic pulmonary fibrosis[J].Physiological Reports,2014,2(2):e00249..]，造模成功后向动物模型中使本发明所述的重组细胞进行治疗性研究，每组8只小鼠，处理组使用本发明所述嵌合多肽的小鼠单核细胞系RAW264.7。每周施用3次，每次每只剂量为1×106，对照组施用不携带重组多肽的小鼠单核细胞系(UTD)，模型组不进行任何处理。治疗6周后处死小鼠，取动物组织利用荧光组织化学检测肺组织内胶原蛋白的沉积，结果如表39。
表39：各处理组组织内胶原蛋白沉积含量
细胞 胶原蛋白聚集体水平(％相对于模型组) SD P值(vs.模型组)
UTD 106.10 9.20 P＞0.05
αColl-CARMERTK 15.60 4.36 P＜0.01
这些结果显示，本发明所述的嵌合多肽可以有效减少特发性肺纤维化模型肺组织内的病理性蛋白聚体沉积
实施例9体内小动物模型中动脉粥样硬化板块的清除
按照非专利文献的方法建立动脉粥样硬化小鼠模型[Veseli B E,etal.European journal of pharmacology,2017,816:3-13..]，造模成功后向动物模型中使本发明所述的重组细胞进行治疗性研究，每组7只小鼠，处理组使用本发明所述嵌合多肽的小鼠单核细胞系RAW264.7。每周施用3次，每次每只剂量为1×106，对照组施用不携带重组多肽的小鼠单核细胞系(UTD)，模型组不进行任何处理。治疗8周后处死小鼠，取动物组织利用荧光组织化学检测肺主动脉弓组织内动脉粥样斑块LDL蛋白的沉积，结果如表40。
表40：各处理组主动脉弓内动脉粥样斑块LDL蛋白沉积含量
细胞 组织LDL板块含量(％相对于模型组) SD P值(vs.模型组)
UTD 109.85 6.06 P＞0.05
αLDL-CARMERTK 29.97 7.00 P＜0.01
这些结果显示，本发明所述的嵌合多肽可以有效减少动脉粥样硬化模型组织内的病理性蛋白聚体沉积。
本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实现。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 沣潮医药科技（上海）有限公司
<120> 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
<130> 权利要求书 说明书
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 812
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val
65 70 75 80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Ile Tyr Asn Met Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
245 250 255
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr
340 345 350
Glu Glu Asp Ser Glu Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe
355 360 365
Cys Arg Arg Ala Ile Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu
370 375 380
Glu Leu Gln Asn Lys Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu
385 390 395 400
Ile Leu Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu
405 410 415
Gly Asn Leu Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys Val Ala Val Lys
420 425 430
Thr Met Lys Leu Asp Asn Ser Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu
435 440 445
Ser Glu Ala Ala Cys Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg
450 455 460
Leu Leu Gly Val Cys Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro
465 470 475 480
Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu
485 490 495
Leu Tyr Ser Arg Leu Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr
500 505 510
Leu Leu Lys Phe Met Val Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser
515 520 525
Asn Arg Asn Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu
530 535 540
Arg Asp Asp Met Thr Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys
545 550 555 560
Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro
565 570 575
Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser
580 585 590
Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr
595 600 605
Arg Gly Met Thr Pro Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp
610 615 620
Tyr Leu Leu His Gly His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp
625 630 635 640
Glu Leu Tyr Glu Ile Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp
645 650 655
Arg Pro Thr Phe Ser Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu
660 665 670
Ser Leu Pro Asp Val Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr
675 680 685
Gln Leu Leu Glu Ser Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Ser Thr Leu Ala
690 695 700
Pro Leu Asp Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr
705 710 715 720
Pro Arg Ala Ala Ile Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys
725 730 735
Pro His Glu Gly Arg Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu
740 745 750
Asp Leu Thr Ser Ala Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser
755 760 765
Val Leu Pro Gly Glu Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His
770 775 780
Ser Ser Met Leu Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe
785 790 795 800
Ala Asp Asp Ser Ser Glu Gly Ser Glu Val Leu Met
805 810
<210> 2
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Gly
165 170 175
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
180 185 190
Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
195 200 205
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
210 215 220
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val
245 250 255
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp
340 345 350
Ser Glu Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg
355 360 365
Ala Ile Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln
370 375 380
Asn Lys Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu Ile Leu Gly
385 390 395 400
Lys Ile Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu
405 410 415
Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys
420 425 430
Leu Asp Asn Ser Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala
435 440 445
Ala Cys Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly
450 455 460
Val Cys Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile
465 470 475 480
Leu Pro Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser
485 490 495
Arg Leu Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys
500 505 510
Phe Met Val Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn
515 520 525
Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp
530 535 540
Met Thr Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser
545 550 555 560
Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp
565 570 575
Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp
580 585 590
Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Met
595 600 605
Thr Pro Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu
610 615 620
His Gly His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr
625 630 635 640
Glu Ile Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr
645 650 655
Phe Ser Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro
660 665 670
Asp Val Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu
675 680 685
Glu Ser Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Ser Thr Leu Ala Pro Leu Asp
690 695 700
Leu Asn Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala
705 710 715 720
Ala Ile Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu
725 730 735
Gly Arg Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr
740 745 750
Ser Ala Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro
755 760 765
Gly Glu Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met
770 775 780
Leu Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp
785 790 795 800
Ser Ser Glu Gly Ser Glu Val Leu Met
805

Claims (7)

1.一种用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体，其特征在于，具有：(a)细胞外结构域，包括一个或多个病理性蛋白聚集体特异性的抗原结合区；(b)跨膜结构域；(c)吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域的至少一个拷贝，
其中，所述病理性蛋白聚集体来源于神经退行性疾病、炎性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性的受试者组织中的病理性蛋白聚集体，能够激发受试者的免疫学反应，包括淀粉样β蛋白、Tau蛋白、TDP-43、血清淀粉样P蛋白、胶原、α-突触核蛋白、朊病毒，亨廷顿蛋白、降血钙素、心钠素、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、血清淀粉样蛋白A、梅丁、泌乳***、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮素、胱抑素、免疫球蛋白轻链AL或纤维蛋白原，
当所述病理性蛋白聚集体为淀粉样β蛋白时，抗原结合区选自Gantenerumab或aducanumab；
当所述病理性蛋白聚集体为Tau蛋白时，抗原结合区选自RO7105705；
当所述病理性蛋白聚集体为α-突触核蛋白时，抗原结合区选自prasinezumab；
当所述病理性蛋白聚集体为朊病毒时，抗原结合区选自PrPc-O0059；
当所述病理性蛋白聚集体为亨廷顿蛋白时，抗原结合区选自3B5H10；
当所述病理性蛋白聚集体为降血钙素时，抗原结合区选自CA11；
当所述病理性蛋白聚集体为心钠素时，抗原结合区选自JM08-36；
当所述病理性蛋白聚集体为载脂蛋白AI时，抗原结合区选自MabA34；
当所述病理性蛋白聚集体为血清淀粉样蛋白A时，抗原结合区选自birtamimab；
当所述病理性蛋白聚集体为梅丁时，抗原结合区选自18G1；
当所述病理性蛋白聚集体为运甲状腺素蛋白时，抗原结合区选自14G8；
当所述病理性蛋白聚集体为溶菌酶时，抗原结合区选自NbHul6；
当所述病理性蛋白聚集体为β2微球蛋白时，抗原结合区选自Nb24；
当所述病理性蛋白聚集体为凝溶胶蛋白时，抗原结合区选自GsnVHH；
当所述病理性蛋白聚集体为胱抑素时，抗原结合区选自M41；
当所述病理性蛋白聚集体为纤维蛋白原时，抗原结合区选自LJ-134B29；
当所述病理性蛋白聚集体为TDP-43时，抗原结合区选自NI-205.113C4；
当所述病理性蛋白聚集体为血清淀粉样P蛋白时，抗原结合区选自Dezamizumab；
当所述病理性蛋白聚集体为胶原时，抗原结合区选自MT293；
当所述病理性蛋白聚集体为类风湿因子时，抗原结合区选自LPS10-1；
当所述病理性蛋白聚集体为LDL时，抗原结合区选自IK17，
所述吞噬细胞特异性吞噬信号受体的细胞内信号结构域选自TYRO3、AXL或MERTK，
所述嵌合抗原受体不杀伤抗原表达细胞造成组织和细胞损伤，吞噬蛋白聚集体抗原后并不释放促炎和或抗炎的细胞因子，并不介导针对吞噬抗原的抗原递呈作用。
2.根据权利要求1所述的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体，其特征在于：
其中，所述跨膜结构域包括源自CD8、TYRO3、AXL、MERTK、ADGRB1、ADGRB3、HAVCR1、TIMD4、Stabilin-1、Stabilin-2、Integrin subunitαv、Integrin subunitβ3、Integrinsubunitβ5、SCARF1、AGER、CD300LF、CD36、LRP1、MRC1或TREM2的茎或跨膜结构域。
3.根据权利要求1所述的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体，其特征在于：
其中，当所述病理性蛋白聚集体为淀粉样β蛋白时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.编码权利要求1～3任一项所述的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体的多核苷酸、运载该多核苷酸的基因载体以及包含该基因载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体的多核苷酸、运载该多核苷酸的基因载体以及包含该基因载体的重组细胞，其特征在于：
其中，所述基因载体上运载有针对同一抗原不同表位的至少两个所述多核苷酸。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的稀释剂或赋形剂，该活性组分为权利要求1～3任一项所述的用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体或权利要求4所述的多核苷酸、运载该多核苷酸的基因载体或包含该基因载体的重组细胞。
7.权利要求1～3任一项所述用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体、编码其的多核苷酸、载体、重组细胞或权利要求6所述的组合物在制备诊断或治疗病理性蛋白聚集物相关疾病试剂、试剂盒或治疗药物中的应用。
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