TW202108629A - 用於t細胞活化之抗體 - Google Patents

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Abstract

本文提供包括與CD137結合之抗原結合區之抗體。本文亦提供雙特異性抗體，其包括與CD137結合之第一抗原結合區及與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合之第二抗原結合區。本文提供包括該等抗體之醫藥組合物及治療癌症之方法。

Description

用於T細胞活化之抗體
本發明大體係關於抗體及其抗原結合片段，且更特定而言，係關於用於提昇T細胞功能之抗體及抗原結合片段。
適應性免疫系統之免疫調節因副作用較少及長期免於癌症復發而成為有吸引力之癌症免疫療法領域。使T細胞充分活化通常需要兩種信號：來自T細胞受體(TCR)之抗原特異性信號及來自諸如CD28之共刺激分子之信號。在過去十年內，在T細胞上發現額外共刺激以及共抑制分子，該等分子可正向或負向調節TCR信號傳導。
1989年自經活化之T細胞選殖出屬於TNF受體超家族之共刺激分子CD137 (4-1BB) (Kwon及Weissman，1989)。儘管4-1BB在強TCR信號傳導之存在下發生的接合可以獨立於CD28之方式誘導IL-2產生，但4-1BB:4-1BBL路徑似乎放大現有共刺激信號。CD137信號傳導已證明可促進TCR信號傳導、誘導細胞介素合成及T細胞增殖，且抑制活化誘導細胞凋亡。T細胞上之CD137刺激誘導分別負責防止T細胞活化誘導細胞凋亡及誘導T細胞增殖之NF-κB及PI3K/ERK傳導信號路徑。CD4及CD8 T細胞均響應CD137刺激，從而增強擴增及效應子功能，而CD8 T細胞藉由誘導更多細胞介素產生而優先響應CD137信號傳導。除在活化之T細胞上表現外，CD137亦表現於造血細胞之多個譜系上，包括調節性T細胞、B細胞、自然殺手細胞、(NK)、單核球及樹狀細胞(DC)。在DC中，CD137刺激使IL-6及IL-12分泌增強，且更重要的是，其提昇DC響應同種異體抗原及標稱抗原(nominal antigen)而刺激T細胞增殖之能力。在NK中，CD137刺激促進增殖及IFN-γ產生，但未提高細胞溶解活性。然而，經CD137刺激之NK細胞在促進經活化之T細胞擴增中顯示輔助作用。
在臨床中，抗CD137促效劑抗體優瑞路單抗(Urelumab) (BMS-663513)已顯示疾病之部分緩解及一定穩定跡象。然而，致命肝臟毒性導致多數試驗終止。另一抗CD137抗體優妥米單抗(Utomilumab) (PF-05082566)之試驗在患有實性瘤之患者中達到3.8%之客觀響應率，且在患有默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)之患者中達到13.3%，包括完整及部分響應，且不產生肝臟毒性。優瑞路單抗及優妥米單抗顯示不同特性。對於促效劑活性，優瑞路單抗較強且不依賴交聯反應，優妥米單抗較弱且依賴交聯反應。優瑞路單抗及優妥米單抗與CD137之晶體結構揭示影響CD137-CD137L互動之不同結合抗原決定基。抗原決定基識別及CD137-CD137L結合障礙不同可導致此兩種抗CD137抗體之效力及毒性不同。然而，因抗4-1BB單株抗體(mAb) 3H3及2A對CD137L結合具有不利影響，故而配體參與無法確定CD137介導之毒性，但顯示相似肝臟毒性情況。近來已顯示，較弱促效抗體之經改造的Fc區選擇性地與FcγRIIB結合(A/I FcγR結合比較低)，因此相較於優瑞路單抗具有有力促效活性且不誘導乾燥毒性。已顯示，促效抗CD137抗體藉由以CD40依賴型方式增強T細胞細胞毒性而具有抗癌活性。此外，抗CD137抗體需要抗原表現以使經確定之低抗原性腫瘤退化。此外，相較於使用各抗體進行單一治療，抗PD-1與抗CD137抗體之組合藉由提昇T細胞效應子功能及腫瘤浸潤而在小鼠腫瘤模型中顯示出經提昇之抗腫瘤活性。除抗癌治療外，取決於治療時機，亦已顯示抗CD137促效劑抗體緩解實驗性自體免疫腦脊髓炎且提昇抗病毒免疫性。
PD-1首先自經歷細胞凋亡之T細胞分離。隨後識別其配體PD-L1，且已顯示PD-1與PD-L1之間的相互作用阻礙T細胞活化。PD-1未表現於剩餘T細胞上，但其係在活化時誘導產生。在慢性感染及癌症中所消耗之T細胞上發現PD-1之持久表現。在一般條件下，PD-1/PD-L1路徑對保持周邊耐受性以防止自體免疫性而言很重要。然而，PD-L1之自我保護功能在癌症中受限，同時各種癌細胞類型所表現之PD-L1躲避免疫系統監測。靶向PD-1/PD-L1之抗體阻止抑制性傳導信號且恢復T細胞之抗癌活性。已將PD-1/PD-L1路徑視為抗腫瘤T細胞之效應子功能的顯性失活調節物。在臨床中，在諸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、默克細胞癌及黑色素瘤之一些癌症類型中，封鎖此路徑已達到35%至87%範圍內之較高客觀響應率。諸如NSCLC、頭頸癌及腎細胞癌之其他癌症類型達到15%至25%範圍內之較低客觀響應率。
相較於使用各抗體進行單一治療，抗PD-1與抗CD137抗體之組合藉由提昇T細胞效應子功能及腫瘤浸潤而在小鼠腫瘤模型中顯示出經提昇之抗腫瘤活性。在臨床中，優妥米單抗(0.45–5.0 mg/kg)與帕博利珠單抗(Pembrolizumab)之組合在患有晚期實性瘤之患者中顯示出協同抗腫瘤效應且無劑量限制性毒性。
根據CD137之免疫調節作用，抗人類4-1BB促效劑抗體可用於治療癌症及自體免疫疾病及感染性疾病。然而，抗人類4-1BB促效劑抗體之用途因肝毒性而受限。此外，未描述在無肝毒性之情況下使4-1BB:4-1BBL路徑活化同時封鎖免疫抑制性或腫瘤傳導信號路徑之有效治療。因此，需要4-1BB:4-1BBL路徑之有效參與同時緩解免疫活化之抑制作用或同時抑制腫瘤細胞傳導信號。
本發明係基於以下重大發現：可產生具有交聯作用依賴型強力促效劑活性且可規避在臨床試驗中發現之肝毒性的抗CD137抗體。本發明進一步基於以下發現：靶向PD-L1及CD137之雙特異性抗體具有優於使用各抗體進行單一治療或組合治療之非凡活性以在活體內促進T細胞效應子功能且抑制腫瘤生長。舉例而言，雙特異性抗體可具有獨特之抗CD137單鏈可變片段(scFv)，該片段在交聯時經由與PD-L1結合之雙特異性抗體的其他抗體臂使T細胞活化。雙特異性抗體亦可藉由將抗PD-L1臂改變為其他腫瘤特異性結合物而靶向不表現PD-L1之腫瘤，如本文提供，該等結合物係諸如抗Her2或抗腫瘤特異性聚醣。誘導標靶依賴型T細胞活化的雙特異性抗體可避免肝臟毒性，同時保持抗CD137單株抗體之抗腫瘤效力。
在一些實施例中，本發明提供三種促效劑抗體或其抗原結合片段：抗CD137抗體純系15 (CD137 #15)、抗CD137抗體純系31 (CD137 #31)及抗CD137抗體純系54 (CD137 #54)。在一個態樣中，本文所提供之抗CD137抗體包括重鏈可變(VH )區，該區包括與選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17之序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及輕鏈可變(VL )區，該區包括與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18之序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:1至少80%一致之胺基酸序列的VH 區及包括與SEQ ID NO:2至少80%一致之胺基酸序列的VL 區之抗體或抗原結合片段包括：(a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包括與SEQ ID NO:3至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包括與SEQ ID NO:4至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包括與SEQ ID NO:5至少80%一致之胺基酸序列；及(b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包括與SEQ ID NO:6至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包括與SEQ ID NO:7至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包括與SEQ ID NO:8至少80%一致之胺基酸序列。
在另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:9至少80%一致之胺基酸序列的VH 區及包括與SEQ ID NO:10至少80%一致之胺基酸序列的VL 區之抗體或其抗原結合片段包括：(a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包括與SEQ ID NO:11至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包括與SEQ ID NO:12至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包括與SEQ ID NO:13至少80%一致之胺基酸序列；及(b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包括與SEQ ID NO:14至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包括與SEQ ID NO:15至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包括與SEQ ID NO:16至少80%一致之胺基酸序列。
在又另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:17至少80%一致之胺基酸序列的VH 區及包括與SEQ ID NO:18至少80%一致之胺基酸序列的VL 區之抗體或其抗原結合片段包括：(a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包括與SEQ ID NO:19至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包括與SEQ ID NO:20至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包括與SEQ ID NO:21至少80%一致之胺基酸序列；及(b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包括與SEQ ID NO:22至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包括與SEQ ID NO:23至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包括與SEQ ID NO:24至少80%一致之胺基酸序列。
在一個態樣中，本文所提供之抗體或其抗原結合片段包括Fc域。在另一態樣中，Fc域係IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY域。在又另一態樣中，IgG域係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4域。在另一態樣中，IgG1域包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列。在特定態樣中，相較於野生型IgG1，IgG1包括調整或減少抗體依賴型細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴型細胞毒性(CDC)的點突變。例示性點突變包括K297A及K322A突變。在又另一態樣中，IgG4域包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列。在另一態樣中，本文所提供之抗原片段包括scFv、F(ab)2或Fab。
在一實施例中，本發明亦提供一種醫藥組合物，其包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段中之任一者。在一個態樣中，本文所提供之醫藥組合物的抗體或抗原結合片段包括與抗體或其抗原結合片段之一或多個多肽之C端結合之醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，本文所提供之醫藥組合物包括雙特異性抗體。
在一個實施例中，本發明亦提供一種治療癌症之方法，其包括向有需要之個體投與有效量之本文所提供的抗體或其抗原結合片段或有效量之本文所提供的雙特異性抗體。在一個態樣中，癌症係選自***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
在一個實施例中，本文提供雙特異性抗體，其包括第一抗原結合區及第二抗原結合區，其中第一抗原結合區與CD137結合。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括(i) VH 區，其包括與選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:17之序列至少80%一致之胺基酸序列；及(ii) VL 區，其包括與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:18之序列的約100至120個胺基酸之N端序列至少80%一致之胺基酸序列，其中第二抗原結合區與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:30之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:36之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:35之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:38之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:37之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:40之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:39之輕鏈序列。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括具有以下之第一抗原結合區：(a) VH 區，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列，及VL 區，其包括SEQ ID NO:10之N端序列之約100至120個胺基酸之胺基酸序列；或(b) VH 區，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列，及VL 區，其包括SEQ ID NO:18之N端序列之約100至120個胺基酸之胺基酸序列。在另一態樣中，第二抗原結合區與選自PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG3、CD28、CD40、CD137、CD27、ICOS、Her2或聚醣之抗原結合。在又另一態樣中，第二抗原結合區與PD-L1、Her2或聚醣結合。
在一個態樣中，本發明揭示抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體(bsAb)可用作經由抗CD137#54單鏈之交聯依賴型促效劑活性使標靶依賴型T細胞活化之平台。
在另一態樣中，與CD137及PD-L1結合之雙特異性抗體經修飾以與CD137及其他表現於腫瘤上之標靶結合，該等標靶包括免疫調節分子及腫瘤特異性標記，諸如Her2或腫瘤特異性聚醣。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體的第一抗原結合區及第二抗原結合區包括Fc域、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)或其任何組合。在又另一態樣中，scFv包括(i) VH 區，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列，及VL 區，其包括SEQ ID NO:10之N端序列之約100至120個胺基酸之胺基酸序列；或(ii) VH 區，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列，及VL 區，其包括SEQ ID NO:18之N端序列之約100至120個胺基酸之胺基酸序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括scFv之VH 區與VL 區之間的連接子。在另一態樣中，scFv包括SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括Fc域。在另一態樣中，Fc係IgG域、IgE域、IgM域及IgD域、IgA域或IgY域。在又另一態樣中，Fc域係IgG域。在另一態樣中，IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。
在一個態樣中，scFv係連接至Fc域之C端。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括Fab域與scFv域之間的連接子。在另一態樣中，Fab片段係連接至Fc域之N端。在又另一態樣中，Fab包括PD-L1結合位點、Her2結合位點或聚醣結合位點，且scFv包括CD137結合位點。
在一個實施例中，本發明提供一種包括治療劑及抗體之抗體-藥物結合物，該抗體包括本文所提供之任何雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一個態樣中，治療劑係經由連接子共價連接至抗體或抗原結合片段。
在一個實施例中，本文提供包括本文所提供之任何雙特異性抗體及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一個實施例中，本發明提供一種如SEQ ID NO:1-26中所列舉之經分離之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供一種如SEQ ID NO:30-40中所列舉之經分離之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明亦提供一種經分離之核酸序列，其編碼本發明之抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。在另一實施例中，本發明提供一種經分離之核酸，其編碼SEQ ID NO:1-26中之任一者。在另一實施例中，本發明提供一種經分離之核酸序列，其編碼SEQ ID NO:30-40中之任一者。
相關申請案之交叉參照
本申請案依據35 U.S.C. §119(e)主張2019年6月26日申請之美國第62/866,699號及2019年12月24日申請之美國第62/953,302號之優先權，其二者均以全文引用方式併入本文中。 序列表之併入
隨附序列表中之材料在此以引用之方式併入本申請案中。名為AP1100_2TW_Sequence_Listing.txt之隨附序列表文本檔案建立於2020年6月12日且係66 kb。可在使用Windows OS之電腦上使用Microsoft Word存取該檔案。
在描述本組合物及方法前，應理解，此發明不限於所描述之特定組合物、方法及實驗條件，此係因為此類組合物、方法及條件可變化。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲限制該等實施例，此係因為本發明之範疇應僅在所附申請專利範圍中受到限制。
在一些實施例中，本發明提供結合CD137之抗體及其抗原結合片段。本文亦提供結合CD137之抗體的胺基序列。如本文所用，術語「抗體」係指能夠與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子。除非上下文另外明確指示，否則術語「抗體」包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體及抗遺傳性抗體。在一個態樣中，本文所提供之抗體包括單株抗體。本文所提供之抗體包括任何同型及類別(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或子類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。如本文所用，「抗原結合片段」意謂能夠特異性結合至與免疫球蛋白分子或抗體相同之抗原的免疫球蛋白分子或抗原的片段或部分。例示性抗原結合片段包括scFv、Fab或F(ab)2片段。如本文所用，「抗原結合區」意謂例如藉由接觸抗原或蛋白質而與抗原或蛋白質結合之抗體或免疫球蛋白分子之部分。抗原結合區通常包括重鏈可變(VH )區及輕鏈可變(VL )區。抗原結合區通常包括一或多個抗原結合位點或互補位。
本文所提供之抗體具有包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17之序列至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列的VH 區。本文所提供之抗體亦包括包含與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18之序列至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列的VL 區。
一般而言，可互換使用之「序列一致性」或「序列同源性」分別係指兩個聚核苷酸或多肽序列之精確的核苷酸與核苷酸或胺基酸與胺基酸對應性。通常，用於測定序列一致性之技術包括測定多肽之核苷酸序列及/或測定其編碼之胺基酸序列或多肽之胺基酸序列，且比較此等序列與第二核苷酸或胺基酸序列。如本文所用，術語「序列一致性百分比(%)」或「一致性百分比(%)」 (亦包括「同源性」)係指比對序列且視情況引入間隔以達到最大序列一致性百分比且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分後，序列中與參考序列中之胺基酸殘基或核苷酸一致的胺基酸殘基或核苷酸之百分比。因此，兩個或更多個序列(聚核苷酸或胺基酸)可藉由測定其「一致性百分比」 (亦稱為「同源性百分比」)而進行比較。與可為較長分子(例如，聚核苷酸或多肽)中之序列的參考序列(例如，核酸或胺基酸序列)之一致性百分比可計算如下：兩個經最佳比對之序列之間的精確匹配數目除以參考序列之長度且乘以100。亦可例如藉由使用可獲自國立衛生研究所(National Institutes of Health)之高級BLAST電腦程式(包括2.2.9版本)比較序列資訊來測定一致性百分比。BLAST程式係基於以下之比對方法：Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)，且如以下中所論述：Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)；Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)；及Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)。簡言之，BLAST程式將一致性定義為相同經比對之符號(亦即，核苷酸或胺基酸)的數目除以兩個序列之較短序列中之符號的總數。程式可用於測定經比較之序列的整個長度上的一致性百分比。提供預設參數以藉由短查詢序列，例如藉由blastp程式使檢索最佳化。程式亦允許使用SEG濾波器來屏蔽查詢序列之片段，如藉由Wootton及Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993)之SEG程式所測定。序列一致性之所需程度範圍係大約80%至100%及其間的整數值。參考序列與所要求之序列之間的一致性百分比可為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%。一般而言，精確匹配表示參考序列之長度內的100%一致。用於比較序列及/或分析序列一致性之其他程式及方法包括尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm) (參見例如，可獲自www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/之EMBOSS Needle對準儀，視情況使用默認設置)、史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm) (參見例如，可獲自www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/之EMBOSS Water對準儀，視情況使用默認設置)、Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444之相似性查詢方法或使用此等算法之電腦程式(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis中之GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA)。在一些態樣中，百分比序列一致性係指如使用BLAST (基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))量測之序列一致性。在其他態樣中，ClustalW用於多種序列比對。最佳比對可使用所選算法之任何合適參數，包括預設參數來評估。
在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段具有包括與SEQ ID NO:1至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任意數字或範圍之胺基酸序列的VH 區，及包括與SEQ ID NO:2至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任意數字或範圍之胺基酸序列的VL 區。SEQ ID NO:1提供包括抗CD137抗體純系#15重鏈之可變區的胺基酸序列。SEQ ID NO: 2提供包括抗CD137純系#15輕鏈之可變區的胺基酸序列。
抗體或其抗原結合片段之抗原結合區通常包括互補決定區(CDR)。「互補決定區(CDR)」係指VH 及VL 之高度可變區。CDR包括賦予蛋白質或抗原結合以特異性之標靶蛋白質或抗體之抗原結合位點。VH 及VL 通常包括三個按序編號之CDR。如本文所用，CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3係指自重鏈多肽之N端編號，重鏈可變區(VH )之三個連續排列之CDR。如本文所用，CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3係指自輕鏈多肽之N端編號，輕鏈可變區(VL )之三個連續排列之CDR。
在一個態樣中，具有包括與SEQ ID NO:1至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:2至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-H1，其包括與SEQ ID NO:3至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-H2，其包括與SEQ ID NO:4至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-H3，其包括與SEQ ID NO:5至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。在另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:1至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:2至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-L1，其包括與SEQ ID NO:6至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-L2，其包括與SEQ ID NO:7至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-L3，其包括與SEQ ID NO:8至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包括：VH 區，其包括與SEQ ID NO:9至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及VL 區，其包括與SEQ ID NO:10至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。SEQ ID NO:9提供包括抗CD137抗體純系#31重鏈之可變區的胺基酸序列。SEQ ID NO: 10提供包括抗CD137抗體純系#31輕鏈之可變區的胺基酸序列。
在一個態樣中，具有包括與SEQ ID NO:9至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:10至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-H1，其包括與SEQ ID NO:11至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-H2，其包括與SEQ ID NO:12至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-H3，其包括與SEQ ID NO:13至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。在另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:9至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:10至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-L1，其包括與SEQ ID NO:14至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-L2，其包括與SEQ ID NO:15至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-L3，其包括與SEQ ID NO:16至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。
在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段具有：VH 區，其包括與SEQ ID NO:17至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及VL 區，其包括與SEQ ID NO:18至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。SEQ ID NO:17提供包括抗CD137抗體純系#54重鏈之可變區的胺基酸序列。SEQ ID NO: 18提供包括抗CD137純系#54輕鏈之可變區的胺基酸序列。
在一個態樣中，具有包括與SEQ ID NO:17至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:18至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-H1，其包括與SEQ ID NO:19至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-H2，其包括與SEQ ID NO:20至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-H3，其包括與SEQ ID NO:21至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。在另一態樣中，具有包括與SEQ ID NO:17至少約80%一致之胺基酸序列之VH 區及包括與SEQ ID NO:18至少約80%一致之胺基酸序列之VL 區的抗體或其抗原結合片段之抗原結合區具有：CDR-L1，其包括與SEQ ID NO:22至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；CDR-L2，其包括與SEQ ID NO:23至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列；及CDR-L3，其包括與SEQ ID NO:24至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致、至少約99.5%一致、至少約99.9%一致及其間任何數字或範圍之胺基酸序列。
本文所提供之抗體或其抗原結合片段進一步包括Fc域。如本文所使用，除非上下文另外明確指示，否則術語Fc域係指至少包括鉸鏈區、CH2域及CH3域之抗體區。除非上下文另外明確指示，否則術語Fc域及Fc區可互換使用。在特定態樣中，Fc域係IgG域、IgE域、IgM域及IgD域、IgA域或IgY域。可使用任何序列及來自任何物種之Fc域，包括人類、猿類、猴子、小鼠、兔、山羊、綿羊、天竺鼠、馬及其他物種。在特定態樣中，Fc域經改造，亦即例如使用分子生物學之技術產生之非天然存在或重組Fc域。在一些態樣中，IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。在一個態樣中，IgG4域包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列。在另一態樣中，IgG1域包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列。在一個態樣中，Fc域係人類。
在一些實施例中，本文亦提供醫藥組合物，其包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在一些態樣中，醫藥學上可接受之載劑係與抗體或抗原結合片段之一或多個多肽的C端結合。可使用任何結合醫藥學上可接受之載劑的合適方式，例如包括共價結合及使用連接子。
在一些實施例中，本文提供如SEQ ID NO:1-26中所列舉之經分離之胺基酸序列。在一些實施例中，本文亦提供經分離之核酸序列，其編碼SEQ ID NO:1-26之胺基酸序列中之任一者。
在一些實施例中，本文提供治療個體中之癌症的方法。在一些態樣中，治療癌症之方法包括向個體投與一定量之有效用於治療癌症之結合CD137的本文所提供之抗體或其抗原結合片段中之任一者。在一些態樣中，癌症係***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment)」、「療法」、「治療性」及類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理學效應，包括(但不限於)減輕、延遲或延緩進程、減少影響或症狀、預防發作、抑制、改善疾病或病症之發作、就疾病、病症或醫學病況取得有益或所需結果，諸如治療效益及/或疾病預防效益。如本文所用，「治療」包括哺乳動物、尤其人類中之疾病的任何治療，且包括：(a)防止疾病在個體中出現，包括易感染疾病或具有患病風險但未確診患有該疾病之個體；(b)抑制疾病，亦即，阻止其發展；及(c)緩解疾病，亦即，使疾病消退。治療效益包括根除或改善所治療之潛在病症。此外，經由根除或改善與潛在病症相關之一或多種生理症狀來達成治療效益，從而觀測到個體之改善，但該個體仍可能罹患潛在病症。在一些態樣中，針對疾病預防效益，儘管可能未作出此疾病之診斷，但仍將治療或用於治療之組合物投與至具有發展特定疾病之風險的個體或投與至呈現疾病之生理性症狀中之一或多者的個體。本發明之方法可用於任何哺乳動物或其他動物。在一些態樣中，治療導致症狀減少或消失。預防效益包括延緩或根除疾病或病況之出現；延緩或根除疾病或病況之症狀發作；減緩、阻止或逆轉疾病或病況之進展；或其任何組合。
如本文所用，術語「個體」係指對其進行本文所揭示之方法的任何個體或患者。術語「個體(subject)」可與術語「個體(individual)」或「患者」互換使用。儘管個體可為動物，但如熟習此項技術者所理解，個體可為人類。因此，其他動物包括於個體之定義內，包括諸如鼠類(包括小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠)、貓、狗、兔、包括奶牛、馬、山羊、綿羊、豬等之農場動物及靈長類(包括猴子、黑猩猩、人猿及大猩猩)之哺乳動物。
如本文所用，術語「有效量」或「治療有效量」係指足以實現所需施用之本文所描述的抗體、其抗原結合片段或其他組合物之量，該施用包括(但不限於)如本文所界定之疾病治療。治療有效量可視所需治療施用(例如，活體內)或所治療之患者及疾病狀況而變化，例如，患者之體重及年齡、疾病狀況之嚴重性、投與方式及類似者，該等因素可由一般熟習此項技術者之一所輕易確定。該術語亦適用於將在標靶細胞中誘導特定反應之劑量。特定劑量將視所選之特定抗體、其抗原結合片段或其他組合物、隨後之給藥方案、是否與其他化合物組合投與、投與時間、投與組織及攜載該藥物之物理投遞系統而變化。
在一些態樣中，本發明之抗體或其抗原結合片段係用作單一療法或與諸如放射療法、細胞毒性化學療法之其他治療劑及諸如疫苗、介白素、細胞介素、趨化介素及生物製劑之其他免疫調節劑組合用作組合療法。用於免疫療法之例示性介白素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及IL-23。用於免疫療法之例示性細胞介素包括干擾素、TNF-α、TGF-β、G-CSF及GM-CSF。用於免疫療法之例示性趨化介素包括CCL3、CCL26及CXCL7。例示性生物製劑包括CAR T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)療法及諸如以下之單株抗體：阿侖單抗(alemtuzumab，CAMPATH)、曲妥珠單抗(trastuzumab，HERCEPTIN)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan，ZEVALIN)、本妥昔單抗(brentuximab vedotin，ADCETRIS)、曲妥珠單抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine，KADCYLA)、博納吐單抗(blinatumomab，BLINCYTO)、貝伐單抗(bevacizumab，AVASTIN)及西妥昔單抗(cetuximab，ERBITUX)。抗體亦包括查核點抑制劑，包括PD-1抑制劑，諸如帕博利珠單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA)、納武利尤單抗(nivolumab，OPDIVO)及西米單抗(cemiplimab，LIBTAYO)；例如PD-L1抑制劑，諸如阿特珠單抗(atezolizumab，TECENTRIQ)、阿維單抗(avelumab，BAVENCIO)及德瓦魯單抗(durvalumab，IMFINZI)；例如CTLA-4抑制劑，諸如伊匹單抗(iplimumab，YERVOY)；及例如其他查核點抑制劑，諸如抗B7-H3抗體(MGA271)、抗KIR抗體(利伊單抗(lirilumab))及抗LAG3抗體(BMS-986016)。
在一些實施例中，如下文實例中詳述，本發明進一步提供抗CD137促效劑抗體之表現、純化及特徵化。單一序列可包括於本文所提供之抗體的表現結構體中。可使用任何合適之單一序列，諸如SEQ ID NO:27之序列。在一些態樣中，用本文所提供之抗PD-L1抗體以及抗CD137抗體治療之T細胞顯示T細胞效應子功能進一步提昇。在不受理論限制之情況下，此表示組合治療或使用同時靶向CD137及PD-L1之雙特異性抗體的治療可解決在臨床試驗中單獨使用各抗體所見的單一療法之較低響應率問題。除抗PD-L1抗體外，舉例而言，可使用第二抗體，其用於靶向諸如CD40或CTLA-4之其他免疫增強抗原的組合治療或使用靶向CD137及諸如PD-L1、CD40或CTLA-4之第二抗原的雙特異性抗體之治療。
諸如雙特異性抗體(bsAb)之雙特異性分子提供使用單一治療劑同時靶向相同或不同分子標靶上的多個目標抗原決定基的途徑。在不受理論束縛之情況下，舉例而言，相較於兩種單株抗體之混合物(mAb)，如癌症治療劑之雙特異性分子可能賦予新穎或更強效之活性、較低產品價格，且促進新穎治療方案之發展。
相應地，本文亦提供包括雙特異性抗體之雙官能蛋白質之表現、純化及特徵化。如本文所用，術語「雙官能蛋白質」係指具有至少兩種功能之蛋白質。雙官能蛋白質之非限制性實例包括能夠與兩個抗原結合之雙特異性抗體。舉例而言，本文所提供之雙特異性抗體可包括與CD137結合且與抗PD-L1抗體之Fc域的C端稠合之經分離的、官能性scFv片段。在一些態樣中，舉例而言，本文提供之稠合結構體中結合CD137之位於C端的scFv係與結合至諸如CD40或CTLA-4之其他免疫調節分子的抗體之Fc域稠合。在其他態樣中，舉例而言，位於C端之scFv可與諸如CD40或CTLA-4之免疫調節分子結合。
在一些實施例中，本文提供包括第一抗原結合區及第二抗原結合區之雙特異性抗體。大體而言，第一抗原結合區及第二抗原結合區特異性地與不同抗原或標靶結合。在一些態樣中，第一抗原結合區及第二抗原結合區與相同抗原或標靶中之不同抗原決定基結合。
在一實施例中，本文所提供之雙特異性抗體包括與CD137結合之第一抗原結合區。第一抗原結合區包括VH 區，其包括與選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:17之序列至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.9%一致及其間任何數字或範圍的胺基酸序列；及VL 區，其包括與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:18之序列之N端序列的約100至120個胺基酸至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少91%一致、至少92%一致、至少93%一致、至少94%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致、至少99.5%一致、至少99.9%一致及其間任何數字或範圍的胺基酸序列。在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之第二抗原結合區與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。
雙特異性抗體可包括如包括VH 區之SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:17中所列舉或如包括VL 區之SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18中所列舉之序列的任何數目之胺基酸。雙特異性抗體可包括本文所提供之具有VH 區或VL 區之序列的N端或C端序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之N端或C端序列的約100至105個胺基酸、約100至110個胺基酸、約100至115個胺基酸、約100至120個胺基酸、約100至125個胺基酸及其間之任何數字或範圍。在另一態樣中，雙特異性抗體包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17之序列。在又另一態樣中，雙特異性抗體包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18之N端序列的約100至120個胺基酸。在又另一態樣中，雙特異性抗體包括SEQ ID NO:10之N端序列的約112個胺基酸或SEQ ID NO:18之N端序列的約108個胺基酸。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之第一抗原結合區包括VH 區，其具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及VL 區，其具有SEQ ID NO:10之N端序列的約100至120個胺基酸之胺基酸序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之第一抗原結合區包括VH 區，其具有SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及VL 區，其具有SEQ ID NO:18之N端序列的約100至120個胺基酸之胺基酸序列。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之第二抗原結合區與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。如本文所用，術語「免疫查核點分子」係指任何抑制或負向調節免疫反應之分子。在一個態樣中，第二抗原結合區與免疫查核點分子之結合抑制免疫查核點分子。例示性免疫查核點分子包括PD-L1、PD-1、CTLA-4及LAG3。如本文所用，術語「免疫刺激分子」係指任何誘導、提昇或正向調節免疫反應之分子。例示性免疫調節分子包括CD28、CD40、CD137、CD27及ICOS。在一些態樣中，舉例而言，第二抗原結合區與免疫刺激分子之結合使免疫刺激分子活化，導致傳導信號提昇且導致免疫活化提昇。如本文所用，術語「腫瘤抗原」係指任何存在於腫瘤細胞之表面上或表現於腫瘤細胞中之抗原。例示性腫瘤抗原包括突變致癌基因之產物、突變腫瘤抑制基因之產物、除致癌基因或腫瘤抑制基因之突變基因的產物、由致癌病毒產生之腫瘤抗原、經改變之細胞表面醣脂及醣蛋白、致癌胎兒抗原及其他抗原。腫瘤抗原亦包括免疫調節分子，諸如免疫查核點抑制劑及免疫刺激分子。相應地，在一些態樣中，腫瘤抗原與本文所提供之雙特異性抗體之第二抗原結合區結合以作為免疫調節分子。在一個態樣中，舉例而言，第二抗原結合區與腫瘤抗原之結合使諸如T細胞之免疫細胞靶向腫瘤細胞。
舉例而言，本文所提供之雙特異性抗體可包括第一與第二抗原結合區之任何組合，包括與任何免疫查核點分子、任何免疫刺激分子或任何腫瘤抗原結合之第一及第二抗原結合區。相應地，在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之第二抗原結合區與任何免疫查核點分子、任何免疫刺激分子或任何腫瘤抗原結合。在一些態樣中，第一及第二抗原結合區與相同分子結合。舉例而言，第一及第二抗原結合區可與相同分子之相同或不同抗原決定基結合。在其他態樣中，第一及第二抗原結合區與不同分子結合。
在一些態樣中，第二抗原結合區與選自PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG3、CD28、CD40、CD137、CD27、ICOS、人類表皮生長因子受體2 (Her2)或聚醣之抗原結合。例示性聚醣包括N聚醣、O聚醣及醣神經鞘脂質。舉例而言，聚醣可能僅表現於諸如GloboH之癌細胞中。在一個態樣中，第二抗原結合區與PD-L1結合。在另一態樣中，第二抗原結合區與Her2結合。在又另一態樣中，第二抗原結合區與聚醣結合。在另一態樣中，聚醣係GloboH。舉例而言，擴增與CD137及腫瘤上除PD-L1外所表現之抗原結合的雙特異性抗體之指令表允許將雙特異性抗體靶向不表現PD-L1之癌症類型。
在一個態樣中，具有與CD137結合之第一抗原結合區及與PD-L1結合之第二抗原結合區的雙特異性抗體同時與CD137及PD-L1結合(圖16)。在不受理論束縛之情況下，藉由設計能夠同時與CD137及PD-L1結合之雙特異性抗體以限制與表現PD-L1之腫瘤位點的抗CD137結合活性可降低在使用諸如優瑞路單抗之抗CD137抗體之臨床試驗中所見之肝臟毒性之風險且降低與其相關之死亡率。此外，咸信同時與CD137及PD-L1結合可提昇交聯後之T細胞活化(亦參見下文實例10)。在另一態樣中，相較於諸如優妥米單抗及優瑞路單抗之參考抗體，具有與CD137結合之第一抗原結合區及與PD-L1結合之第二抗原結合區之雙特異性抗體誘導更強烈之CD137內化(圖23)。
在一些態樣中，第一抗原結合區及第二抗原結合區包括scFv、F(ab)2、Fab或其任何組合。在一個態樣中，第一抗原結合區包括scFv，且第二抗原結合區包括Fab。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體所包括之scFv與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。在又另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體所包括之scFv與CD137結合。在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體所包括之Fab與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體所包括之Fab與PD-L1結合。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之scFv包括VH 區，其包括SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及VL 區，其包括SEQ ID NO:10之N端序列的約100至120個胺基酸之胺基酸序列。在又另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體之scFv包括VH 區，其包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及VL 區，其包括SEQ ID NO:18之N端序列的約100至120個胺基酸之胺基酸序列。
在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括結合CD137之第一抗原結合區及結合Her2之第二抗原結合區。結合CD137及Her2之雙特異性抗體包括結合CD137之scFv，其與結合至Her2之抗體的Fc域之C端稠合，抗體諸如曲妥珠單抗(重鏈SEQ ID NO:36)或抗Her2#3-7 (重鏈SEQ ID NO:38)。在特定態樣中，結合CD137及Her2之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:35 (曲妥珠單抗)或SEQ ID NO:37 (抗Her2#3-7)之輕鏈。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括結合CD137之第一抗原結合區及結合腫瘤特異性聚醣之第二抗原結合區。結合CD137及腫瘤特異性聚醣之雙特異性抗體包括結合CD137之scFv，其與結合至腫瘤特異性聚醣之抗體的Fc域之C端稠合，抗體諸如本文所提供之抗聚醣(重鏈SEQ ID NO:40)。在特定態樣中，結合CD137及腫瘤特異性聚醣之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:39 (抗聚醣)之輕鏈。在一些態樣中，結合CD137及Her2或CD137及腫瘤特異性聚醣之雙特異性抗體進一步包括將抗CD137 scFv連接至Fc域之連接子。可使用任何連接子，諸如GS連接子(SEQ ID NO:28)、G4S連接子(SEQ ID NO:29)或其倍數。在一個態樣中，連接子係G4S連接子。
相應地，本發明提供一種標靶依賴型T細胞活化之平台。在一個態樣中，舉例而言，如圖19及20中所顯示，在與諸如PD-L1之腫瘤特異性抗原結合時誘導抗CD137 scFv之促效劑活性。如圖21及22中所顯示，亦可藉由與諸如Her2及腫瘤特異性聚醣之其他腫瘤特異性抗原結合而使抗CD137促效劑抗體活化。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括scFv之VH 區與VL 區之間的連接子。可使用任何連接子。舉例而言，連接子可包括任何胺基酸序列。連接子可為任何長度，諸如一個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、20個胺基酸或更多個胺基酸。連接子亦可包括胺基酸序列之倍數。連接子可包括任何倍數之胺基酸序列。例示性連接子序列位於SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中。在一些態樣中，scFv包括SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括Fc域。在特定態樣中，Fc域係IgG域、IgE域、IgM域及IgD域、IgA域或IgY域。可使用任何序列及來自任何物種之Fc域，包括人類、猿類、猴子、小鼠、兔、山羊、綿羊、天竺鼠、馬及其他物種。在一些態樣中，IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。在一個態樣中，IgG4域包括SEQ ID NO:25之胺基酸序列。在另一態樣中，IgG1域包括SEQ ID NO:26之胺基酸序列。在一個態樣中，Fc域係人類。一般而言，人類Fc域在人類中並非係免疫性的，且因此適用於人類治療。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體的scFv係與Fc域之C端結合。在一個態樣中，Fc域與scFv之間包括連接子。在另一態樣中，連接子連接scFv與Fc域。可使用任何連接子，諸如本文所提供之G4S連接子。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體的Fab係與Fc域之N端連接。在一個態樣中，Fab係經由肽鍵與Fc域之N端直接連接。在另一態樣中，Fab域係經由連接子與Fc域之N端連接。
在一些態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO: 30之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:36之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:35之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:38之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:37之輕鏈序列。在一個態樣中，本文所提供之雙特異性抗體包括SEQ ID NO:40之重鏈序列。在另一態樣中，本文所提供之雙特異性抗體進一步包括SEQ ID NO:39之輕鏈序列。儘管可使用任何其他合適連接子，但諸如SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ IDNO:36、SEQ IDNO:38、SEQ IDNO:40及其他序列之重鏈序列可包括一或多個G連接子(SEQ ID NO:28)、一或多個G4S連接子(SEQ ID NO:29)或G連接子或G4S連接子之任何倍數。
在一些實施例中，本文提供如SEQ ID NO:30-40中所列舉之經分離之胺基酸序列。在一些實施例中，本文亦提供經分離之核酸序列，其編碼SEQ ID NO:30-40之胺基序列中之任一者。
在一些實施例中，本文提供抗體-藥物結合物。本文所提供之抗體-藥物結合物可包括本文所提供之任何抗體或其抗原結合片段。舉例而言，抗體-藥物結合物可包括與CD137特異性結合之抗體或其抗原結合片段。抗體-藥物結合物亦可包括本文所提供之任何雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，本文所提供之抗體-藥物結合物包括治療劑。本文所提供之抗體-藥物結合物可包括任何治療劑，包括小分子。在一些態樣中，治療劑具有細胞毒性活性。抗體-藥物結合物可包括任何具有細胞毒性活性之化學治療劑。例示性化學治療劑包括(但不限於)放線菌素、全反式視黃酸、抗***、阿紮胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、卡鉑(carboplatin)、卡培他濱(capecitabine)、順鉑、氯芥苯丁酸、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪(dacarbazine)、道諾黴素(daunorubicin)、多西他塞(docetaxel)、去氧氟尿苷、阿黴素、表柔比星(epirubicin)、埃博黴素(epothilone)、依託泊苷(etoposide)、氟脲嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、伊馬替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、二氯甲二乙胺、硫醇嘌呤、胺甲喋呤、絲裂黴素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、紫杉酚、泰紫帝、太莫西芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、硫鳥嘌呤、托普樂肯(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、威羅菲尼(vemurafenib)、長春花鹼、長春新鹼及長春地辛。
在一些態樣中，本文所提供之抗體-藥物結合物用於治療癌症。舉例而言，抗體-藥物結合物中所包括之抗體與腫瘤細胞上的抗原結合，由此將抗體-藥物結合物中所包括之具有細胞毒性活性之小分子或其他治療劑靶向腫瘤細胞。在抗體-藥物結合物與腫瘤細胞結合時，小分子或其他治療劑經內化且釋放於腫瘤細胞中。
在一些態樣中，本文所提供之抗體-藥物分子中所包括之治療劑係與本文所提供之抗體或其抗原結合片段或與本文所提供之雙特異性抗體或其抗原結合片段共價連接。連接子可用於使治療劑與抗體或其抗原結合片段或與雙特異性抗體或其抗原結合片段共價連接。任何合適連接子均可用於使治療劑與本文所提供之抗體或其抗原結合片段或與本文所提供之雙特異性抗體或其抗原結合片段共價連接。在一些態樣中，本文所提供之抗體-藥物結合物中所包括之連接子在靶細胞外係穩定的，包括在循環中係穩定的，且在靶細胞內裂解以釋放治療劑。舉例而言，具有細胞毒性活性之治療劑可在釋放時誘導靶細胞死亡。相應地，在一些態樣中，治療劑選擇性地靶向腫瘤細胞。舉例而言，治療劑選擇性地靶向腫瘤細胞通常導致針對非腫瘤細胞之細胞毒性減小且導致耐受度提高。
在一些實施例中，本文提供包括本文所提供之雙特異性抗體的醫藥組合物。醫藥組合物可包括本文所提供之任何雙特異性抗體。在一個態樣中，本文所提供之醫藥組合物中所包括的雙特異性抗體與CD137、PD-L1結合，或同時與CD137及PD-L1結合。醫藥組合物亦可包括本文所提供之抗體-藥物結合物。在一些態樣中，醫藥組合物用於治療癌症。可使用本文所提供之醫藥組合物治療任何癌症。例示性癌症包括***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌及白血病。
在一些實施例中，本文提供治療個體中之癌症的方法。治療癌症之方法包括向個體投與有效用於治療癌症之一定量的本文所提供之任何雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，癌症係***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。實例 實例 1
此實例闡釋自OmniMab庫產生之抗體。
為了產生針對CD137之治療抗體，使用OmniMab噬菌粒庫進行選擇。噬菌粒庫係由AP Biosciences Inc. (APBio Inc.)自一批來自超過一百個健康供體之周邊血液單核球建立。一同培育經預塗之CD137-Fc重組蛋白質與含有經保全之噬菌體之上清液1小時，且用含有0.1 % Tween-20之PBS洗滌三次。與HRP結合之抗M13抗體(Roche)偵測到經結合之噬菌體，且TMB受質係用於單次發展。記錄OD450讀數。
使用Hyperphage (Μ13Κ07ΔρΙΙΙ，Progen，海德堡，德國)進行第一輪淘選。針對CD137之固相淘選及細胞淘選係用於自OmniMab庫選擇及分離CD137特異性結合物。使用在第一輪選擇中所用之重組人類CD137-ECD-Fc (APBio Inc.)進行固相淘選。表現CD137之HEK293細胞係用於第二輪及第三輪濃化。在三輪淘選後，藉由直接ELISA及FACS篩選且分離特定CD137結合物(圖1及圖2)。對於FACS分析，用抗CD137噬菌體上清液(50微升/孔)使穩定表現CD137之293F細胞染色以測試CD137結合活性。亦在冰上一同培育穩定表現CD137之293F細胞與2.5 ug/ml抗CD137抗體(Ab) 1小時作為對照物。用1× PBS洗滌細胞三次，且隨後在冰上與抗M13抗體(Progen)一同培育1小時。再次用1× PBS洗滌細胞三次，且隨後在冰上與抗小鼠IgG-Alexa 488 (Invitrogen Inc.)一同培育額外1小時。染色後，用1× PBS洗滌細胞三次，在藉由FACS Calibur (BD Biosciences，Inc.)及FlowJo (TreeStar，LLC)分析前再懸浮於1× PBS中。針對穩定表現CD137之293F細胞純系13之FACS分析顯示於圖2中。分離陽性結合物，且測序以確定重鏈之序列及相異性。如圖1及圖2中所顯示，相較於陰性對照，分離特異性地識別CD137抗原之若干株系。
此等結果顯示，三輪CD137特異性濃化後所獲得之噬菌體純系特異性地識別CD137。實例 2
此實例闡釋IgG之形成中CD137特異性結合蛋白之亞純系、表現及純化。
為了快速篩選T細胞活化中具有官能性之候選物，由ELISA識別之陽性CD137或PD-L1結合物之重鏈及輕鏈經擴增、消化且亞純系為由APBio產生且攜載IgG4恆定區之IgG表現載體(SEQ ID NO. 25)。確認序列後，製備質體且使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)將其轉染為用於抗體表現之HEK293細胞。培養4日後，藉由蛋白質G層析術自培養物上清液對分泌至無血清培養基中之抗體進行親和力純化。濃縮經純化之抗體，隨後在PBS緩衝液中透析。使用NanoDrop2000分光光度計測定經透析之蛋白質的最終濃度，且在具有或不具有還原劑之情況下藉由SDS-PAGE測定純度及完整度。
圖3顯示經純化之抗CD137抗體先導純系之第一批(圖3，上側)及第二批(圖3，下側)之代表性PAGE凝膠分析。使用蛋白質G層析術(Thermo Fisher)純化轉染4日後自哺乳動物細胞中收集之培養物上清液。在裝載於凝膠(3毫克/道)上之前，在還原或非還原條件下分析經純化之蛋白質。結果顯示，在非還原條件下，兩種蛋白質均具有約145 kDa之分子量，且在還原條件下，重鏈及輕鏈分別具有~55kDa及~25kDa之分子量。藉由蛋白質G層析術之一個步驟可獲得大於90%之純度。
此等結果顯示，HEK293細胞中各種經純化之抗體先導純系之完整度係正常的。實例 3
此實例闡釋抗CD137抗體與尤爾卡特細胞之結合。
亦將經純化之抗CD137抗體先導純系施用於經CD137誘導之尤爾卡特細胞以藉由FACS測定結合活性。用PMA (10 ng/ml)及離子黴素(1 μg/ml)處理尤爾卡特細胞2日以誘導CD137表現。在冰上一同培育經刺激之細胞與抗CD137 (0.5 μg/ml)及作為陽性對照物之參考物(ref) Ab (0.5 μg/ml) 1小時，不染色，或與作為陰性對照物之OX40參考物(ref) Ab一同培育。用1× PBS洗滌細胞三次，且隨後在冰上與結合至Alexa-488之山羊抗人類IgG (H+L) (Invitrogen Inc.)一同培育額外1小時。染色後，用1× PBS洗滌細胞三次，再懸浮於1× PBS中，隨後藉由FACS Calibur (BD Biosciences，Inc.)及FlowJo (TreeStar，LLC)分析。在CD137抗體先導純系中，如圖4中所示，相較於參考抗體，若干先導純系具有結合活性。
如流動式細胞量測術中可見，此等結果顯示抗CD137抗體之結合導致尤爾卡特細胞(Jurkat cell)之活化。實例 4
此實例闡釋藉由ELISA測定抗CD137抗體結合活性。
為了對與CD137結合之抗CD137抗體進行直接配體結合分析，使用重組CD137/Fc (100ng/ml)製備預塗孔。簡言之，在調節至1 mg/ml之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中透析經純化之人類CD137-IgG4 Fc (APBio)，且隨後用PBS稀釋至1 μg/ml之最終濃度。用重組CD137蛋白質以每孔0.1 ml對Nunc-Immuno Maxisorp 96孔培養盤進行預塗佈，將空孔用於非特異性結合對照物，且在4℃下培育隔夜。移除CD137重組蛋白質溶液，且用0.4 ml之洗滌緩衝液(0.1% Tween-20於PBS中)洗滌培養盤三次。將0.4 ml阻斷緩衝液(5%低脂奶粉於PBS中)添加至所有孔中，且在室溫下培育1小時。移除阻斷緩衝液，且用0.4 ml洗滌緩衝液洗滌三次。
用經純化之抗CD137抗體的連續稀釋液培育預塗孔。在PBS中製備CD137抗體之連續稀釋液，且將0.1 ml添加至各孔中。在室溫下培育培養盤1小時。移除抗體溶液，且用0.4 ml洗滌緩衝液洗滌培養盤三次。使用PBS以1:2000稀釋與HRP結合之山羊抗人類IgG、F(ab’)2特異性F(ab’)2抗體(Jackson Immunoresearch #109-036-097)，且以每孔0.1 ml進行添加。在室溫下培育培養盤1小時，且用每孔0.4 ml洗滌緩衝液洗滌三次。使培養盤與0.1 ml TMB試劑(Invitrogen)一同發展，且在室溫下培育1至5分鐘。添加0.05 ml 1N HCl以終止反應，且在Bio-Tek光譜上於450 nm處閱讀吸收率。針對抗CD137濃度繪製OD450讀數，且計算與CD137/Fc結合之抗CD137抗體的50%有效濃度(EC50 )值。使用GraphPad Prism (GraphPad Software，San Diego，CA)計算EC50 值。針對抗CD137抗體純系31及抗體純系54計算之EC50 值顯示與參考抗體類似之結合活性。針對抗CD137特異性抗體先導純系計算之EC50 值顯示相較於參考抗體之較佳結合活性(圖5)。
在顯色前，使用與HRP結合之抗人類IgG1 Fab抗體偵測抗PD-L1抗體，同時針對抗PD-L1濃度繪製OD450讀數。實例 5
此實例闡釋藉由SEC-HPLC評估高度濃縮之抗CD137抗體先導純系之蛋白質聚集。
使用具有Waters 2996光二極體列陣偵測器之Waters Alliance分離模塊2695進行SEC-HPLC。將樣本裝載於具有等度25 mM磷酸鈉、200 mM NaCl、pH 6.8作為移動相緩衝液之XBridge蛋白質BEH SEC管柱(Waters，Cat#176007640)上以供SEC分離。流速係0.4毫升/分鐘，且樣本注射體積係10 μL。藉由280 nm處之吸收率偵測峰。在注射至SEC上之前，用0.22 μm過濾器(Millipore，Cat#SLGP003RB)過濾所有樣本以移除任何沈澱之蛋白質材料。藉由Empower 2軟體分析資料。如圖6中所示，高度濃縮之抗CD137抗體純系31及抗體純系54的主峰百分比係大於90%，且無顯著蛋白質聚集。
此等結果顯示，高濃度抗CD137抗體不會導致聚集物之形成。實例 6
此實例闡釋抗CD137抗體之促效活性。
如根據提昇之人類CD3+ T細胞的細胞介素產生、增殖及增殖誘導情況所見，針對其提昇人類CD3+細胞之活化的能力依功能性篩選經純化之抗體先導純系。將抗CD3抗體(1 μg/ml，OKT3，BioLegend，目錄號317304)、抗CD137抗體先導純系或同型抗體(1、3及10 μg/ml)塗佈於Maxisorp 96孔培養盤上。使用RosetteSep™人類T細胞濃化雞尾酒療法(RosetteSep™ Human T Cell Enrichment Cocktail)(STEMCELL，目錄號15061)自健康成年志願者之周圍血液中分離人類CD3+ T細胞。用CFSE (CellTraceTM CFSE細胞增殖套組，Life Technologies，目錄號C34554)標記經分離之CD3+ T細胞，且將其接種於具有RPMI1640培養基(含有10%胎牛血清，2.5 mM L麩醯胺酸，1×青黴素/鏈黴素)之預塗孔中(每孔1 × 10^5個細胞)。三天後，藉由流動式細胞量測術分析細胞增殖，且藉由ELISA分析IL-2及INF-γ之細胞介素產生。如圖7及圖8中所示，抗CD137抗體先導純系#15、#31及#54顯示促效活性，在四個所測供體之至少兩者中以劑量依賴型及供體依賴型方式提昇CD3+ T細胞活性。相較於參考抗體(優妥米單抗；Chin等人，2018；www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?dr:D10997之抗體序列；亦參見美國專利第8,337,850號)，如經提昇之T細胞活化所見，抗CD137抗體純系#31及#54顯示類似或更高促效活性。因此，如下文所述，選擇抗體純系#31及#54作為雙特異性抗體結構。實例 7
此實例闡釋混合淋巴細胞反應中使用抗PD-L1與抗CD137抗體之組合治療。
藉由RosetteSep™人類單核球濃化雞尾酒療法(RosetteSep™ Human Monocyte Enrichment Cocktail)(目錄號15068)自健康供體之周圍血液分離單核球，且在含有人類GM-CSF及IL-4 (各1000 U/ml，R&D)之RPMI1640分化培養基中培養6日。使用流動式細胞量測術，藉由DC-SIGN、CD14、CD80或CD83之表現驗證樹狀細胞(DC)分化。在混合淋巴細胞反應(MLR)中，使用分化之DC作為抗原呈現細胞(APC)。使用RosetteSep™人類CD4+ T細胞濃化雞尾酒療法(RosetteSep™ Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail)(目錄號15062)自人類周圍血液分離異源性CD4+ T細胞。基於CD3及CD4表現，CD4+ T細胞之純度係約95%。在抗體先導純系(0.4、2及10 μg/ml)之存在下，共同培養經CFSE標記之CD4+ T細胞與DC持續3日及5日。藉由流動式細胞量測術分析CD4+ T細胞增殖，且藉由ELISA偵測培養基中IL-2及IFN-γ之細胞介素產生。相較於同型對照抗體，MLR中存在抗PD-L1抗體時，IL-2及INF-γ產生顯著提昇。有趣的是，如圖9中所示，舉例而言，在具有兩個不同供體對之MLR中，諸如抗體純系#31之抗CD137抗體進一步促進抗PD-L1抗體所介導之IFN-γ產生。實例 8
此實例闡釋抗CD137抗體對CD137-CD137L相互作用之影響。
在冰上使用同型對照物及抗CD137抗體(50 μg/ml)培育HEK-293F/CD137細胞30分鐘，用PBS/2% FBS (PBS2)洗滌兩次，且在冰上用經His標記之4-1BBL (0.5 μg/ml，Acro BIOSYSTEMS)培育20分鐘。在用PBS2洗滌兩次後，分別使用抗人類Fc-A488 (Jackson ImmunoResearch)及抗His抗體-APC (Biolegend)偵測HEK-293F/CD137細胞上抗CD137抗體及4-1BBL之存在，隨後使用Calibur流式細胞計量器(BD)分析。除與同型對照物一同培育外，幾乎所有細胞均係A488陽性。使用FlowJo (TreeStar，LLC)計算APC通道之平均螢光強度(MFI)，且值顯示為直方圖(圖10)。如圖10中所示，參考抗體1 (參考物1)及抗體純系#54有效阻止CD137-CD137L相互作用，而參考抗體2 (參考物2)抗體純系#15及抗體純系#31阻止CD137-CD137L相互作用之效率較低或無效。實例 9
此實例闡釋抗CD137抗體先導純系之活體內藥物動力學。
藉由靜脈內單次注射以每kg體重5 mg之劑量將抗體投與至SCID淺褐色小鼠中。注射後，在所指示之時間點處收集周圍血液。如下文所述藉由ELISA偵測抗體血漿濃度。使用滴定濃度之經純化的抗CD137 IgG4抗體培育CD137人類Fc (1 μg/mL)預塗孔以製備標準曲線以計算血漿中之抗體濃度(使用阻斷液中之新鮮製劑)。在不同時間點處收集之樣本亦施用於預塗之CD137人類Fc孔以供偵測。在用0.1% Tween-20於PBS中洗滌後，在顯色前使用與HRP結合之抗人類Fab抗體(0.4 μg/mL)偵測經結合之抗體。藉由內插法計算抗體血漿濃度。使用PKSolver軟體計算PK參數(Zhang，Huo，Zhou，& Xie，2010)。抗體顯示約176小時之較佳t1/2 及約7800微克/毫升*小時之AUC (圖11)。實例 10
此實例闡釋抗CD137抗體先導純系之交聯依賴型促效活性。
藉由使用NF-κB所驅動之螢光素酶及全長度CD137轉染HEK293細胞，隨後分別使用潮黴素及G418選擇以產生CD137報導細胞之穩定純系。對於促效活性分析，將單一抗CD137抗體(10、2及0.4 μg/ml)或與山羊抗人類IgG (5 μg/ml，Jackson ImmunoResearch，目錄號109-006-008)交聯之抗體添加至報導細胞中，且培育5小時。使用ONE-Glo™螢光素酶分析系統(Promega，目錄號E6120)偵測螢光素酶活性。與先前報導一致，優妥米單抗 (CD137參考物，圖12)顯示交聯依賴型促效劑活性，而優瑞路單抗 (CD137參考物2，圖12)顯示可能導致臨床試驗中所觀測之嚴重肝臟毒性的交聯依賴型促效劑活性。相較於優妥米單抗，CD137#54在交聯時顯示更大促效活性，而在無交聯之情況下，促效劑活性適中且與優妥米單抗之促效活性相似(圖12)。在不受理論限制之情況下，CD137#54之此特徵可在包括於具有腫瘤特異性結合物之雙特異性抗體中時誘導標靶依賴型T細胞活化。
總之，此等結果顯示，抗CD137#15、抗CD137#31、抗CD137#54促效劑活性之不同交聯依賴性。實例 11
此實例闡釋抗PD-L1-CD137雙特異性抗體之構建、表現及純化。
抗PD-L1抗體純系6係在無ADCC之情況下以IgG形式使用，且抗CD137抗體係以scFv格式使用且與抗PD-L1抗體純系6抗體Fc區之C端稠合。下文表1中顯示包括與CD137 scFv稠合之抗PD-L1抗體Fc區的雙特異性抗體結構體(序列)，圖10中顯示簡圖。將較短可撓性肽連接子(GGGGS)2 (SEQ ID NO: 29)置於Fc區之抗PD-L1抗體重鏈C端(SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO:26)與抗CD137 scFv之N端分子之間以確保正確摺疊且使位阻作用最小化。抗PD-L1-CD137 scFv重鏈之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:32中。使用Gibco ExpiCHO表現系統表現抗體Fc稠合蛋白結構體且經由1步式蛋白質G層析術自經轉染之細胞的細胞培養物上清液中純化該等結構體。
除上文所述與抗CD137 scFv稠合之雙特異性抗PD-L1抗體Fc外，與抗CD137 scFv稠合之抗體可包括抗抑制性免疫查核點抗體，諸如抗PD-1、抗CTLA-4、抗LAG3及其他抗體；或免疫刺激抗體，諸如抗CD28、抗CD40、抗CD137、抗CD27、抗ICOS及其他抗體。對於各雙特異性抗體，連接子可置於抗體Fc域與抗CD137 scFv之間以產生雙特異性抗體。
雙特異性抗體之純度係大於90% (圖14及圖15)。與具有正確分子量(Mw = 220kD)之經純化的稠合蛋白一致，在單步驟純化過程中獲得大於90%之純度。圖14顯示經純化之抗PD-L1-CD137雙特異性抗體(bsAb)之代表性PAGE凝膠分析。使用蛋白質G層析術(Thermo Fisher)純化在轉染4日後自哺乳動物細胞收集之培養物上清液。在還原或非還原條件下分析經純化之蛋白質，隨後裝載於凝膠上(3 毫克/道)。結果顯示，在非還原條件下，兩種蛋白質均具有約220 kDa之分子量，且在還原條件下，重鏈CD137 scFv及輕鏈分別具有~85 kDa及~25 kDa之分子量。圖15顯示藉由µCE-SDS之一步式蛋白質A所純化之抗PD-L1 #6-CD137 #54 bsAb的純度及完整度。實例 12
此實例闡釋抗PD-L1-CD137雙特異性抗體之抗原識別。
藉由FortéBio® (Menlo Park，Calif.)生物感測器分析測定抗PD-L1-CD137雙特異性抗體之結合活性。以5 μg/mL將經His標記之CD137 (ACROBiosystems)於具有0.02% Tween-20及0.1% BSA之DPBS中裝載於HIS1K (Anti-Penta-HIS)生物感測器(Cat#18-5120)上持續5分鐘。隨後如所指示使用相同緩衝液以100 nM使感測器曝露於抗體持續5分鐘，隨後與100 nM之第二抗原結合(PD-L1與小鼠Fc域稠合)另外持續5分鐘。隨後使用如廠商所述之Octet資料採集及分析軟體製備圖16中所示之結合圖。相較於對照抗體，兩種雙特異性抗體(抗PD-L1#6-CD137#31及抗PD-L1#6-CD137#54)均可首先識別CD137，且隨後同樣識別PD-L1，表示雙特異性抗體可同時靶向PD-L1及CD137。
總之，此等結果顯示，如藉由FortéBio®生物感測器分析所測定，抗PD-L1-CD137雙特異性抗體同時識別PD-L1及CD137。實例 13
此實例闡釋在異源性混合淋巴細胞反應中藉由抗PD-L1抗體及抗PD-L1-CD137 scFv雙特異性抗體(bsAb)提昇T細胞活化。
藉由RosetteSep™人類單核球濃化雞尾酒療法(Cat. No.15068)分離來自健康供體之周圍血液的單核球，且在含有人類GM-CSF及IL-4 (各1000 U/ml，R&D)之RPMI1640分化培養基中培養6日。藉由RosetteSep™ 人類CD4+ T細胞濃化雞尾酒療法(Cat. No. 15062)分離來自人類周圍血液之異源性CD4+ T細胞。基於CD3及CD4表現，CD4+ T細胞之純度係約95%。在抗體先導純系(1、3及10 μg/ml)之存在下，共同培養經CFSE標記之CD4+ T細胞與DC持續3日及5日。藉由流動式細胞量測術分析CD4+ T細胞增殖，且藉由ELISA偵測培養基中之IL-2及IFN-γ之細胞介素產生。相較於使用抗PD-L1及抗CD137抗體之單一治療及組合治療，抗PD-L1#6-CD137#54顯著提昇T細胞之活化(圖17，顯示兩個供體對之結果)。
此等結果顯示，相較於使用抗PDL-1及抗CD137抗體之單一治療或組合治療且相較於使用抗PD-L1#6-CD137#31 bsAb之治療，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb在混合淋巴細胞反應中誘導更強力之T細胞活化。實例 14
此實例闡釋藉由抗PD-L1-CD137 scFv雙特異性抗體先導純系促進抗原特異性T細胞活化。
分別使用EasySep™人類記憶CD4+ T細胞濃化套組(STEMCELL，目錄號19157)及人類CD8+ T細胞分離套組(STEMCELL，目錄號17953)分離人類記憶CD4及CD8 T細胞。在抗體(0.4、2、及10 μg/ml)之存在下，使用CEFX Ultra SuperStim Pool MHC-II子集(1 ug/ml，JPT)刺激記憶CD4-T細胞與自體未成熟DC之共培養物持續7日。對於CD8-T細胞之共培養物，藉由向分化培養基中添加IL-1β (10 ng/ml，PeproTech)、TNF-α (10 ng/ml，PeproTech)、IFN-γ (5000 IU/ml，PeproTech)、PGE2 (250 ng/ml，Sigma)、聚合I:C (10 µg/ml，Sigma)及R848 (5 µg/ml，Sigma)催熟作為未成熟之DC所產生之TLR-DC持續24小時。在抗體(0.4、2及10 μg/ml)之存在下，使用CEFX Ultra SuperStim Pool (1 μg/ml，JPT)刺激CD8 T細胞與自體TLR-DC之共培養物持續7日。與實例12之MLR中所觀測到的結果類似，相較於使用抗PD-L1或抗CD137單株抗體之單一治療或使用抗PD-L1與抗CD137單株抗體之組合治療，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb促進記憶CD4 T細胞(圖18，A組)及CD8 T細胞(圖18，B組)之召回反應(圖18A-B)。
總之，圖17 (實例13)及18 (此實例)中所示之結果顯示，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb顯著提昇T細胞活化，其相較於單獨或組合使用抗PD-L1及抗CD137單株抗體治療時所觀測到的T細胞活化更為穩健。此外，如使用CD4及CD8 T細胞之召回反應分析中所見，在使用抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之治療時所觀測到的T細胞活化係抗原依賴型活化。在不受理論束縛之情況下，相較於抗PD-L1#6-CD137#31 bsAb，使用抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb所見之T細胞活化的較強效力顯示，雙特異性抗體之抗CD137#54臂可與獨特CD137抗原決定基結合，且無藉由雙特異性抗體之抗PD-L1臂與PD-L1結合所產生之位阻現象。實例 15
此實例闡釋抗PD-L1-CD137雙特異性抗體所誘導之標靶依賴型T細胞活化。
使用RosetteSep™人類T細胞濃化雞尾酒療法(STEMCELL，目錄號15061)分離人類T細胞。藉由經培養盤限制之抗CD3(OKT3，1 μg/ml)使經純化之T細胞活化，且在所指示之抗體治療下與過度表現PD-L1之HEK293細胞或親代HEK293細胞共同培養(圖19)。如圖19中所示，相較於使用抗PD-L1及抗CD137單株抗體之單一治療或組合治療，在與過度表現PD-L1之細胞而非PD-L1陰性親代細胞共同培養時，抗L1-CD137雙特異性抗體顯著促進T細胞活化。
總之，此等結果顯示，在受培養盤限制之抗CD3 (OKT3)的存在下，當與過度表現PD-L1之HEK-293細胞而非親代HEK293細胞共同培養時，標靶依賴型T細胞活化僅由抗PD-L1#6-CD137 bsAb誘導。實例 16
此實例闡釋由抗腫瘤抗原特異性CD137#54雙特異性抗體誘導之腫瘤抗原依賴型T細胞活化。
藉由如上文(實例15)所述之陽性選擇分離人類CD8-T細胞。在抗CD3 (OKT3)塗佈之聚合珠粒的存在下，以1:1比例共同培養經純化之CD8-T細胞與PD-L1陽性腫瘤細胞(NCI-H1975、PC-3及MDA-MD-231)。三日後，如藉由ELISA量測，基於IFN-γ產生情況分析T細胞活化，且藉由CytoTox 96®細胞毒性分析(Promega，Cat. # G1780)偵測腫瘤細胞之細胞毒性。
相較於使用抗PD-L1 #6及抗CD137 #54抗體之單一治療或組合治療，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb誘導更穩健之IFN-γ產生(圖20)。在與PC-3細胞之共培養物中，觀測到CD8 T細胞之更高腫瘤細胞細胞活性(圖20B)。除PD-L1陽性腫瘤外，相較於單一治療或組合治療，由與CD137 #54 scFv結合之抗Her2 (曲妥珠單抗或#3-7)及抗腫瘤聚醣抗體標靶之Her2陽性(SKBR-3及MDA-MB-361)及聚醣陽性(MCF-7及NCI-N87)腫瘤細胞亦導致更強之CD8 T細胞的IFN-γ產生(圖21A-B及圖22A-B)及腫瘤細胞細胞活性(圖22A)。
此等結果顯示，靶向腫瘤之CD137#54 bsAb特異性地誘導標靶依賴型T細胞活化。實例 17
此實例闡釋藉由抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體誘導CD137內化。
為了測試CD137內化是否亦由抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體以及參考抗體優瑞路單抗及Utoliumab誘導，使用表現CD137之HEK293細胞進行內化分析(圖23)。將每孔5 × 10^3個表現CD137的細胞預接種於具有含有10%胎牛血清(Gibco)之杜氏改良伊格爾培養基(Invitrogen)的黑色96孔培養盤上，且在37℃、5% CO2 下培養隔夜。根據廠商協議用pHAb胺反應性染料(Promega Corp.)標記所指示的抗體，且隨後在培養基中自100 nM製備為3倍連續稀釋物。隨後用含有經標記之抗體的培養基替換經預接種之細胞的培養基，且在培育箱中另外培養細胞24小時。培育後，沖洗細胞且將其保持於PBS中以藉由SpectraMax iD3進行螢光記錄。使用GraphPad Prism計算EC50值。如圖23中所示，相較於使用參考抗CD137抗體之治療，使用抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體治療時觀測到更強之CD137內化誘導。在不受理論束縛之情況下，若雙特異性Ab僅經由連接CD137而與T細胞結合，CD137內化之水平可降低CD137活化。相應地，相較於參考抗體，且特定而言相較於優瑞路單抗，在進行雙特異性抗體之活體內投與時，使用雙特異性抗體可能觀測到更低毒性。實例 18
此實例闡釋藉由抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體保全Treg細胞所介導之T細胞增殖的抑制作用。
如實例12中所述，使用混合淋巴細胞反應確定Treg抑制分析。使用EasySep™人類CD4+ CD127low CD25+ 調節性T細胞分離套組(STEMCELL，目錄號18063)自周圍血液分離Treg細胞，且使用Dynabeads®人類Treg擴張器(Gibco，目錄號11129D)擴增。經擴增之Treg細胞顯著抑制CD4 T細胞之增殖及IL-2產生。藉由向培養物中添加抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb破壞Treg細胞之抑制活性(圖24A-B)。在Treg細胞之存在下，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb同時保全T細胞增殖(圖24，A組)及細胞介素產生(圖24，B組)。此等結果顯示，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb能夠保全T細胞活化之T-reg媒介抑制作用。實例 19
此實例闡釋活體內抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體對腫瘤生長之抑制。
為了確認不與小鼠PD-L1及小鼠CD137交叉反應之抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb的抗腫瘤活性，使人類腫瘤細胞(NCI-H292、NCI-H1975及BxPC-3)與人類PBMC預混合，且皮下移植至SCID淺褐色小鼠中以評估活體內抗癌活性。接種腫瘤七日後，以腹膜內注射方式每週兩次地注射相等莫耳之mAb (M.W.150 kDa，1 mg/kg)及bsAb (M.W. 195 kDa，1.3 mg/kg)。每週量測兩次腫瘤尺寸(mm3 )且計算為(長度×寬度×寬度)/2。在NCI-H292腫瘤模型中，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之腫瘤生長抑制指數(TGI) (TGI：67.5%)大於MPDL-3280a (TGI：44.3%)及PD-L1#6+CD137#54之組合(TGI：-18.77%)的TGI (圖25，組A)。類似地，在NCI-H1975腫瘤模型中，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之TGI (TGI: 80%)大於PD-L1#6+CD137#54之組合的TGI (TGI: 67.2%) (圖25，B組)。除肺癌外，在BxPC-3胰臟癌模型中，相較於組合療法(各10 mg/ml之TGI：-9.2%)，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb亦顯示較高抗腫瘤活性(1.3 mg/kg之TGI係43%) (圖25，C組)。因此，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb在兩個不同癌症模型中顯示活體內抗腫瘤活性。
總之，在小鼠中之移植腫瘤模型中，相較於使用抗PD-L1與抗CD137抗體之組合治療，此等結果顯示使用抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb治療時的腫瘤生長抑制作用較高。實例 20
此實例闡釋在雙特異性抗體之存在下體外的細胞介素釋放。一同培育來自三個供體之人類PBMC及同型、抗CD3抗體(OKT3，作為陽性對照物)及0.67、6.67及66.67 nM之三種雙特異性抗體(與CD137#54 scFv結合之抗PD-L1#6、抗Her2#3-7及抗聚醣)持續24小時。藉由多工ProcartaPlex免疫分析(ThermoFisher Scientific)偵測釋放至培養基中之細胞介素。OKT3誘導顯著之細胞介素釋放，而三種雙特異性抗體未誘導細胞介素釋放(圖26)。
此等結果顯示，相較於OKT3，PD-L1#6-CD137#54、Her2#3-7-CD137#54及聚醣CD137#54 bsAbs在與人類PBMC一同培養時未在背景之上誘導顯著細胞介素釋放。實例 21
此實例闡釋恆河猴中抗PD-L1#6-CD137#54雙特異性抗體之藥物動力學參數。
經由靜脈內單次注射將雙特異性抗PD-L1#6-CD137#54抗體(每kg體重5及25 mg)投與至兩組(每組一隻雄性及一隻雌性)恆河猴。在注射後0.5、6、24、48、72、及144小時處收集周圍血液。藉由ELISA測定抗體之血漿濃度。MaxiSorp盤(Invitrogen)塗有CD137-Fc稠合蛋白(AP Biosciences，1 μg/mL)，隨後施用經連續稀釋之血漿樣本及抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb作為標準曲線。使用TMB受質藉由生物素化PD-L1-Fc稠合蛋白(AP Biosciences)及與HRP結合之鏈親和素偵測經結合之抗體。藉由內插法計算血漿抗體濃度。使用PKSolver軟體計算PK參數(Zhang，Huo，Zhou，& Xie，2010)。在注射25 mg/kg及5 mg/kg之組別中，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之t1/2 分別係約87及49小時(圖27A-B)，且在實驗過程其間未觀測到ALT/AST之含量提昇(未顯示)。序列 SEQ ID NO 1 ： 抗CD137純系15重鏈
Figure 02_image001
SEQ ID NO 2 ： 抗CD137純系15輕鏈
Figure 02_image003
SEQ ID NO 3 ：抗CD137純系15之CDR-H1
Figure 02_image005
SEQ ID NO 4 ：抗CD137純系15之CDR-H2
Figure 02_image007
SEQ ID NO 5 ：抗CD137純系15之CDR-H3
Figure 02_image009
SEQ ID NO 6 ：抗CD137純系15之CDR-L1
Figure 02_image011
SEQ ID NO 7 ：抗CD137純系15之CDR-L2
Figure 02_image013
SEQ ID NO 8 ：抗CD137純系15之CDR-L3
Figure 02_image015
SEQ ID NO 9 ：抗CD137純系31重鏈
Figure 02_image017
SEQ ID NO 10 ：抗CD137純系31輕鏈
Figure 02_image019
SEQ ID NO 11 ：抗CD137純系31之CDR-H1
Figure 02_image021
SEQ ID NO 12 ：抗CD137純系31之CDR-H2
Figure 02_image023
SEQ ID NO 13 ：抗CD137純系31之CDR-H3
Figure 02_image025
SEQ ID NO 14 ：抗CD137純系31之CDR-L1
Figure 02_image027
SEQ ID NO 15 ：抗CD137純系31之CDR-L2
Figure 02_image029
SEQ ID NO 16 ：抗CD137純系31之CDR-L3
Figure 02_image031
SEQ ID NO 17 ：抗CD137純系54重鏈
Figure 02_image033
SEQ ID NO 18 ：抗CD137純系54輕鏈
Figure 02_image035
SEQ ID NO 19 ：抗CD137純系54之CDR-H1
Figure 02_image037
SEQ ID NO 20 ：抗CD137純系54之CDR-H2
Figure 02_image039
SEQ ID NO 21 ：抗CD137純系54之CDR-H3
Figure 02_image041
SEQ ID NO 22 ：抗CD137純系54之CDR-L1
Figure 02_image043
SEQ ID NO 23 ：抗CD137純系54之CDR-L2
Figure 02_image045
SEQ ID NO 24 ：抗CD137純系54之CDR-L3
Figure 02_image047
SEQ ID NO 25 ：重鏈中之恆定域(IgG4)
Figure 02_image049
Figure 02_image051
SEQ ID NO 26 ：重鏈中之恆定域(經改造之IgG1)
Figure 02_image053
SEQ ID NO 27 ：SP1
Figure 02_image055
SEQ ID NO 28 ：GS連接子
Figure 02_image057
SEQ ID NO 29 ：(G4S)2連接子
Figure 02_image059
SEQ ID NO 30 ：抗PD-L1#6輕鏈
Figure 02_image061
SEQ ID NO 31 ：抗PD-L1 #6-CD137 #31 bsAb重鏈
Figure 02_image063
SEQ ID NO 32 ：抗PD-L1#6-CD137 #54 bsAb重鏈
Figure 02_image065
Figure 02_image067
SEQ ID NO 33 ：CD137#31-scFv
Figure 02_image069
SEQ ID NO 34 ：CD137#54-scFv
Figure 02_image071
SEQ ID NO 35 ：曲妥珠單抗輕鏈
Figure 02_image073
SEQ ID NO 36 ：曲妥珠單抗CD137 #54 bsAb重鏈
Figure 02_image075
SEQ ID NO 37 ：抗Her2 #3-7輕鏈
Figure 02_image077
SEQ ID NO 38 ：抗Her2 #3-7-CD137 #54 bsAb重鏈
Figure 02_image079
Figure 02_image081
SEQ ID NO 39 ：抗聚醣輕鏈
Figure 02_image083
SEQ ID NO 40 ：抗聚醣CD137 #54 bsAb重鏈
Figure 02_image085
SEQ ID NO 41 ：抗Her2#3-7之CDR-H1
Figure 02_image087
SEQ ID NO 42 ：抗Her2#3-7之CDR-H2
Figure 02_image089
SEQ ID NO 43 ：抗Her2#3-7之CDR-H3
Figure 02_image091
SEQ ID NO 44 ：抗Her2#3-7之CDR-L1
Figure 02_image093
SEQ ID NO 45 ：抗Her2#3-7之CDR-L2
Figure 02_image095
SEQ ID NO 46 ：抗Her2#3-7之CDR-L3
Figure 02_image097
表 1. 單株抗體及雙特異性抗體之單鏈可變片段 (scFv) 的經界定之 CDR 區的序列 .
名稱 序列
CDR1 CDR2 CDR3
CD137#15-H GGTFSSY (SEQ ID NO:3) IPILGI (SEQ ID NO:4) DLYQLLFPYYYGMDV (SEQ ID NO:5)
CD137#15-L TLSSGYSNYKVD (SEQ ID NO:6) VGTGGIVGSKGD (SEQ ID NO:7) GADHGSGSNLFW (SEQ ID NO:8)
CD137#31-H GYTFTGY (SEQ ID NO:11) NPNSGG (SEQ ID NO:12) DLRGAFDP (SEQ ID NO:13)
CD137#31-L TGTSSDVGAYNFVS (SEQ ID NO:14) DVSDRPS (SEQ ID NO:15) SSYTSSITRYV (SEQ ID NO:16)
CD137#54-H GGTFSSY (SEQ ID NO:19) IPILGI (SEQ ID NO:20) PPYYDSSGYYPLGAFDI (SEQ ID NO:21)
CD137#54-L SGDKLGEKYAS (SEQ ID NO:22) QDSKRPS (SEQ ID NO:23) QAWDGSSTYV (SEQ ID NO:24)
Her2#3-7-H GYSFTSY (SEQ ID NO:41) YPGDSD (SEQ ID NO:42) QDNWNHGPYDAFDI (SEQ ID NO:43)
Her2#3-7-L GLSSGSVSTSYYPS (SEQ ID NO:44) STNTRSS (SEQ ID NO:45) VLYMGSGIWV (SEQ ID NO:46)
CD137#31-scFv QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNFVSWYQQRPGKAPELMIYDVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYTSSITRYVFGTGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLRGAFDPWGQGTTVTVSSA (SEQ ID NO:33)
CD137#54-scFv QVQLVQSGAEVKKPGSTVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPPYYDSSGYYPLGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGEKYASWYQQKAGQSPILVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGLQAGDEADYYCQAWDGSSTYVFGTGTKVTVLG (SEQ ID NO:34)
參考文獻 Kwon, B. S., & Weissman, S. M. (1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci U S A, 86(6), 1963-1967. Zhang, Y., Huo, M., Zhou, J., & Xie, S. (2010). PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel.Comput Methods Programs Biomed, 99 (3), 306-314. doi:10.1016/j.cmpb.2010.01.007 Chin, S.M.等人. (2018). Structure of the 4-1BB/4-1BBL complex and distinct binding and functional properties of utomilumab and urelumab. Nature Communications 9:4679. DOI: 10.1038/s41467-018-07136-7
如此說明書及所附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)及該(the)」包括複數指代物。因此，舉例而言，「該方法」包括熟習此項技術者閱讀此發明時將顯而易見之一或多種方法及/或本文所描述之類型的步驟及類似方法。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用方式併入本文中，其引用的程度如各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用方式併入一般。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有此發明所屬領域之一般技術者之一所普遍理解之相同含義。儘管與本文所描述之彼等方法及材料相似或等效之任何方法及材料均可用於實踐或測試本發明，但應理解，修改及變化涵蓋於本發明之精神及範疇內。
範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍格式呈現。應理解，按範圍格式之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明之範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，諸如1至6之範圍描述應視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子範圍，以及彼範圍內之個別數值，例如1、2、2.1、2.2、2.7、3、4、5、5.5、5.75、5.8、5.85、5.9、5.95、5.99及6。不論範圍之廣度，上述均使用。
儘管已參考上文實例描述本發明，但應理解，修改及變化涵蓋於本發明之精神及範疇內。因此，本發明僅由以下申請專利範圍限定。
圖 1 藉由直接ELISA顯示靶向CD137之噬菌體純系的篩選。
圖 2 藉由流動式細胞量測術顯示過度表現CD137之HEK-293F細胞上靶向CD137之噬菌體純系的結合。
圖 3A-B 藉由PAGE顯示經一步式蛋白質G純化之抗CD137抗體先導純系的完整度及純度。其顯示兩批(上側及下側)之結果。
圖 4 藉由流動式細胞量測術顯示經活化之尤爾卡特細胞(Jurkat cell)上抗CD137抗體先導純系之結合。
圖 5 藉由ELISA顯示抗CD137抗體先導純系針對重組人類CD137之結合活性(EC50 )。
圖 6 藉由SEC-HPLC顯示高度集中之抗CD137抗體純系31及抗體純系54之蛋白質聚集。
圖 7 顯示抗CD137抗體先導純系之促效活性存在下的T細胞之細胞介素產生。
圖 8 顯示初生人類T細胞中抗CD137抗體先導純系對人類T細胞細胞介素產生之劑量依賴型誘導。
圖 9 顯示，使用抗CD137抗體之組合治療促進經混合之淋巴細胞反應中由抗PD-L1抗體介導之T細胞的IFN-γ產生。
圖 10 顯示抗CD137抗體純系對CD137-CD137L相互作用之不同影響。
圖 11 顯示抗CD137抗體純系#31及#54之活體內藥物動力學情況。
圖 12 顯示相較於優妥米單抗 (CD137參考物)及優瑞路單抗 (CD137參考物2)之抗CD137抗體純系之促效活性的不同交聯要求。
圖 13 顯示抗PD-L1-CD137雙特異性抗體(bsAb)之對稱形式。
圖 14 藉由SDS-PAGE顯示經蛋白質G純化之抗PD-L1-CD137 bsAb之純度及完整度。超過90%可藉由蛋白質G層析術之一個步驟獲得。
圖 15 藉由μCE-SDS顯示經蛋白質A純化之抗PD-L1-CD137 bsAb之純度及完整度。
如FortéBio®生物感測器分析所見，圖 16 顯示，抗PD-L1-CD137 bsAb同時識別CD137及PD-L1。
圖 17 顯示，在經混合之淋巴細胞反應中，相較於單一治療、組合治療或使用抗PD-L1#6-CD137#31 bsAb之治療，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb誘導協同性T細胞活化。
圖 18A-B 顯示，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb顯著促進記憶CD4 (A)及記憶CD8 (B) T細胞之抗原特異性召回反應。
圖 19 顯示，在共同培養T細胞與過度表現PD-L1之HEK-293細胞時，抗PD-L1#6-CD137#31或抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb誘導標靶依賴型T細胞活化。
圖 20A-C 顯示，在與PD-L1陽性癌細胞共同培養時，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb誘導T細胞之IFN-γ產生(圖20A、圖20C及圖20B之左側)及癌細胞毒性(圖20B之右側)。(A) NCI-H1975，非小細胞肺癌細胞；(B) PC-3，***癌細胞；(C) MDA-MB-231，乳癌細胞。
圖 21A-B 顯示，在與Her2陽性癌細胞共同培養時，曲妥珠單抗(Trastuzumab) (Tra)-CD137#54或抗Her2#3-7-CD137#54 bsAb誘導CD8 T細胞之IFN-γ產生。(A) SKBR-3，乳癌細胞；(B) MDA-MD-361，乳癌細胞。
圖 22A-B 顯示，在與聚醣陽性癌細胞共同培養時，抗聚醣CD137#54 bsAb誘導CD8 T細胞之IFN-γ產生(圖22A之左側及圖22B)及癌細胞毒性(圖22A之右側)。(A) MCF-7，乳癌細胞；(B) NCI-N87，胃癌細胞。
圖 23 顯示，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb誘導HEK293細胞上表現之CD137的內化。
圖 24A-B 顯示，抗PD-L1#6-CD137 bsAb在Treg細胞之存在下保全T細胞增殖(A)及細胞介素產生(B)。
圖 25A-C 顯示，在移植有PD-L1陽性(A) NCI-H292、(B) NCI-H1975及(C) BxPC-3腫瘤細胞之人源化小鼠中，相較於使用抗PD-L1#6與抗CD137#54抗體之組合治療，抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之腫瘤生長抑制性更強。
圖 26 顯示，PD-L1#6-CD137#54、Her2#3-7-CD137#54及聚醣CD137#54 bsAb在人類PBMC中並未誘導明顯細胞介素釋放。
圖 27A-B 顯示猴子中抗PD-L1#6-CD137#54 bsAb之PK參數，其呈(A)圖表及(B)表格形式。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0051

Claims (51)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) VH 區，其包含與選自由以下組成之群的序列至少80%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:9；及SEQ ID NO:17；及 (ii) VL 區，其包含與選自由以下組成之群的序列至少80%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:10；及SEQ ID NO:18，其中該抗體或抗原結合片段與CD137結合。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該VH 區包含與SEQ ID NO:1至少80%一致之胺基酸序列，且其中該VL 區包含與SEQ ID NO:2至少80%一致之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含： (a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包含與SEQ ID NO:3至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包含與SEQ ID NO:4至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包含與SEQ ID NO:5至少80%一致之胺基酸序列；及 (b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包含與SEQ ID NO:6至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包含與SEQ ID NO:7至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包含與SEQ ID NO:8至少80%一致之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該VH 區包含與SEQ ID NO:9至少80%一致之胺基酸序列，且其中該VL 區包含與SEQ ID NO:10至少80%一致之胺基酸序列。
  5. 如請求項4之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含： (a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包含與SEQ ID NO:11至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包含與SEQ ID NO:12至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包含與SEQ ID NO:13至少80%一致之胺基酸序列；及 (b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包含與SEQ ID NO:14至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包含與SEQ ID NO:15至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包含與SEQ ID NO:16至少80%一致之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該VH 區包含與SEQ ID NO:17至少80%一致之胺基酸序列，且其中該VL 區包含與SEQ ID NO:18至少80%一致之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含： (a) VH CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包含與SEQ ID NO:19至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-H2包含與SEQ ID NO:20至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-H3包含與SEQ ID NO:21至少80%一致之胺基酸序列；及 (b) VL CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-L1包含與SEQ ID NO:22至少80%一致之胺基酸序列，其中CDR-L2包含與SEQ ID NO:23至少80%一致之胺基酸序列，且其中CDR-L3包含與SEQ ID NO:24至少80%一致之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含Fc域。
  9. 如請求項8之抗體或抗原結合片段，其中該Fc域係IgG域、IgE域、IgM域及IgD域、IgA域或IgY域。
  10. 如請求項9之抗體或抗原結合片段，其中該IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。
  11. 如請求項10之抗體或抗原結合片段，其中該IgG1域包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。
  12. 如請求項10之抗體或抗原結合片段，其中該IgG4域包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列。
  13. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該抗原結合片段包含scFv、F(ab)2或Fab。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑係與該抗體或抗原結合片段之一或多個多肽之C端結合。
  16. 一種如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項14或15之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療個體之癌症用的藥品。
  17. 如請求項16之用途，其中該癌症係選自***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
  18. 一種經分離之胺基酸序列，其如SEQ ID NO:1-26中所列舉。
  19. 一種經分離之核酸序列，其編碼SEQ ID NO:1-26中之任一者。
  20. 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合區及第二抗原結合區，其中該第一抗原結合區與CD137結合。
  21. 如請求項20之雙特異性抗體，其中該抗體包含： (i) VH 區，其包含與選自由以下組成之群的序列至少80%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:9；及SEQ ID NO:17；及 (ii) VL 區，其包含與選自由以下組成之群的序列之約100至120個胺基酸之N端序列至少80%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:10；及SEQ ID NO:18；且其中該第二抗原結合區與免疫查核點分子、免疫刺激分子或腫瘤抗原結合。
  22. 如請求項21之雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含 (a) VH 區，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及VL 區，其包含SEQ ID NO:10之N端序列之約100至120個胺基酸的胺基酸序列；或 (b) VH 區，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及VL 區，其包含SEQ ID NO:18之N端序列之約100至120個胺基酸的胺基酸序列。
  23. 如請求項21之雙特異性抗體，其中該第二抗原結合區與選自以下之抗原結合：PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG3、CD28、CD40、CD137、CD27、ICOS、Her2或聚醣。
  24. 如請求項23之雙特異性抗體，其中該第二抗原結合區與PD-L1、Her2或聚醣結合。
  25. 如請求項23之雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區及該第二抗原結合區包含scFv、F(ab)2、Fab或其任何組合。
  26. 如請求項25之雙特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含scFv，且其中該第二抗原結合區包含Fab。
  27. 如請求項26之雙特異性抗體，其中該scFv包含： (i) VH 區，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及VL 區，其包含SEQ ID NO:10之N端序列之約100至120個胺基酸的胺基酸序列；或 (ii) VH 區，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及VL 區，其包含SEQ ID NO:18之N端序列之約100至120個胺基酸的胺基酸序列。
  28. 如請求項27之雙特異性抗體，其進一步包含該scFv之該VH 區與該VL 區之間的連接子。
  29. 如請求項28之雙特異性抗體，其中該scFv包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
  30. 如請求項26之雙特異性抗體，其進一步包含Fc域。
  31. 如請求項30之雙特異性抗體，其中該Fc域係IgG域、IgE域、IgM域及IgD域、IgA域或IgY域。
  32. 如請求項31之雙特異性抗體，其中該Fc域係IgG域。
  33. 如請求項32之雙特異性抗體，其中該IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。
  34. 如請求項30之雙特異性抗體，其中該scFv係連接至該Fc域之C端。
  35. 如請求項30之雙特異性抗體，其進一步包含該Fc域與該scFv之間的連接子。
  36. 如請求項30之雙特異性抗體，其中該Fab係連接至該Fc域之N端。
  37. 如請求項20之雙特異性抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32之重鏈序列。
  38. 如請求項37之雙特異性抗體，其進一步包含SEQ ID NO:30之輕鏈序列。
  39. 如請求項20之雙特異性抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO:36之重鏈序列。
  40. 如請求項39之雙特異性抗體，其進一步包含SEQ ID NO:35之輕鏈序列。
  41. 如請求項20之雙特異性抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO:38之重鏈序列。
  42. 如請求項41之雙特異性抗體，其進一步包含SEQ ID NO:37之輕鏈序列。
  43. 如請求項20之雙特異性抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO:40之重鏈序列。
  44. 如請求項43之雙特異性抗體，其進一步包含SEQ ID NO:39之輕鏈序列。
  45. 一種經分離之胺基酸序列，其如SEQ ID NO:30-40中所列舉。
  46. 一種經分離之核酸序列，其編碼SEQ ID NO:30-40中之任一者。
  47. 一種抗體-藥物結合物，其包含治療劑及如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項20至44中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段。
  48. 如請求項47之抗體-藥物結合物，其中該治療劑係經由連接子共價連接至該抗體或抗原結合片段。
  49. 一種醫藥組合物，其包含如請求項20至44中任一項之雙特異性抗體及至少一種醫藥學上可接受之載劑。
  50. 一種如請求項20至44中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造供治療個體之癌症用的藥品。
  51. 如請求項50之用途，其中該癌症係選自***癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、泌尿膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240084040A1 (en) * 2021-02-09 2024-03-14 Obi Pharma, Inc. Novel carbohydrate antibodies, pharmaceutical compositions and uses thereof
TW202304965A (zh) 2021-05-04 2023-02-01 美商艾吉納斯公司 抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ９６抗體及其使用方法
WO2023091712A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Ap Biosciences, Inc. Bispecific antibodies targeting cd137 and uses thereof for anti-cancer immunotherapy

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101017301B1 (ko) * 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
JP2010517529A (ja) * 2007-02-02 2010-05-27 アムジエン・インコーポレーテツド ヘプシジン及びヘプシジン抗体
JO3244B1 (ar) * 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
ES2926988T3 (es) * 2011-03-15 2022-10-31 X Body Inc Métodos de cribado de anticuerpos
US20160272697A2 (en) * 2011-04-28 2016-09-22 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Neutralizing Antibodies to Nipah and Hendra Virus
TWI591074B (zh) * 2011-12-05 2017-07-11 Ｘ 染色體有限公司 ＰＤＧＦ受體β結合多肽
KR20160145813A (ko) * 2014-04-25 2016-12-20 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 중화 항체 및 이의 사용 방법
CA2977257A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
SG11201805532XA (en) * 2016-01-11 2018-07-30 Inhibrx Inc Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins
RU2756236C2 (ru) 2016-06-20 2021-09-28 Кимаб Лимитед PD-L1 специфические антитела
CN106243223B (zh) * 2016-07-28 2019-03-05 北京百特美博生物科技有限公司 抗人pdl1抗体及其用途
EA201990578A1 (ru) * 2016-09-23 2019-10-31 Связывающие молекулы, которые модулируют биологическую активность, проявляемую клеткой
GB201619648D0 (en) * 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel antibodies and uses thereof
US11459394B2 (en) * 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
PE20191846A1 (es) * 2017-06-02 2019-12-31 Pfizer Anticuerpos especificos para flt3 y sus usos
BR112020001441A2 (pt) * 2017-08-01 2020-08-04 Eli Lilly And Company anticorpos anti-cd137
EP3470428A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-17 Numab Innovation AG Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof
WO2019089753A2 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
TWI701259B (zh) * 2017-11-09 2020-08-11 大陸商上海懷越生物科技有限公司 ４﹘１ｂｂ抗體及其製備方法和應用

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