JP2021509010A - 真核細胞ディスプレイ系におけるポリペプチド薬物の開発性のための選択 - Google Patents

真核細胞ディスプレイ系におけるポリペプチド薬物の開発性のための選択 Download PDF

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Abstract

インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤（例えば、抗体、受容体）の表面提示レベルを、結合剤の開発性特性、例えば溶解度の予測指標として使用すること。表面表示された結合剤を標的結合の開発性および親和性についてスクリーニングすることにおける使用に適合させた、高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞のディスプレイライブラリ。結合剤の溶解度、高濃度で製剤化できる能力、非特異的結合の傾向の低さ、および半減期を含む開発性に対する固有の選択を有するディスプレイライブラリのハイスループットスクリーニング。結合剤コードＤＮＡに作動可能に連結した誘導性プロモーターからの結合剤の細胞表面提示を制御することにより、開発性特性ならびに／または標的結合および親和性などの他の性質について結合剤の集団を富化すること。【選択図】なし

Description

本発明は、溶解度、高濃度で製剤化できる能力、非特異的結合の傾向の低さ、および最適な半減期などの望ましい開発性特性を有する候補ポリペプチド薬物の特定に関する。本発明はさらに、抗体発見を含む創薬における結合剤のスクリーニングに関する。
抗体は、極めて成果を挙げている薬物クラスであることが証明されており、これまでに７０を超える治療用抗体が承認され、さらに多くが開発パイプラインにある。しかしながら、抗体などのポリペプチド薬の製造および製剤化は、多くの点で、小分子医薬品よりも複雑な試みである。いくつかの要因が、抗体などのポリペプチド薬の開発の実用性に影響を与え、有力候補の抗体が、効果的であるだけでなく、製造性があり、安定かつ安全である薬物へと首尾よく開発されるかどうかに影響する。このような要因には、化学的安定性（例えば、断片化、脱アミド化、酸化、および異性化への耐性）、物理的安定性（例えば、立体配座安定性、タンパク質の折畳がほどける傾向、凝集および／または沈殿、コロイド安定性）、および溶液特性（例えば、溶解度、溶液中で可逆的に自己会合する性向、および高濃度での粘度）が挙げられる。宿主細胞から分泌されるポリペプチドの量が培地から回収可能な産物の収量を決定するため、ポリペプチドが細胞培養において高収量で発現する能力も、関連性のある検討事項である。抗体またはポリペプチド薬の免疫原性も検討事項である。これらすべての要因は、製品の「開発性」特性と総称される。これらは、製品のコストおよび製造の実用性、安全性プロファイル、投薬スケジュール、および投与様式に影響を与えるため、重要な検討事項である。開発性の問題が発生した場合、それらは抗体の可用性または商業的成功に影響する可能性があり、開発プロセス中に有力な分子の失敗を引き起こし得る。抗体薬の開発性の態様、およびそれらを測定する方法については、概説されている１〜３。
患者への投与には、安定した可溶性タンパク質を高濃度で産生させることが所望される。例えば、比較的大きな薬量を少しの体積で投与しなければならない皮下投与には、５０ｍｇ／ｍｌ以上の抗体濃度が求められる。治療用途に理想的なポリペプチドは、緩衝水溶液に非常に溶けやすく、よって高濃度に濃縮できるものである。高濃度での可溶性タンパク質の生産が成功するかどうかは、少なくとも部分的には、自己会合に対するポリペプチドの耐性に依存し、これは、逆に粘度および／または沈殿の増加につながり得る。分子の溶解限度に達すると、溶解濃度をさらに上げることができなくなり、分子が溶液から沈殿するなどの望ましくない影響が生じる。溶解限度に近づくと、溶液が粘稠になることがあり、かつ／または溶解したポリペプチドが溶液中で自己会合することがあり（可逆的または不可逆的に）、このような影響によって、溶液の取扱および製剤化が複雑になる。さらに悪いことに、難溶性および／または不安定なポリペプチドによる凝集体の形成が、製品を患者に投与する際に免疫原性のリスクを高め得る４、５。抗薬物免疫応答（例えば、抗薬物抗体）により治療効果が中和される可能性があり、過感受性により疾病または死亡が生じ得る。
ポリペプチドが高レベルで発現する能力は、生産の経済性に影響し得る。抗体発見の初期段階では、哺乳動物細胞培養における最適化された一過性発現から得られる収量は５０μｇ／ｍｌ以上に達し得る。一過性発現は一時的な発現系であり、目的の産物をコードするプラスミドが細胞にトランスフェクトされ、一定期間発現し、通常は、プラスミドが細胞から失われるにつれ２〜７日後に減少する。薬物製造用に組換え細胞を安定して発現させるには、コードＤＮＡを細胞ゲノムに安定して組み入れる必要がある。安定した製造用細胞株を創出したら、細胞を１週間または２週間培養して、約１ｍｇ／ｍｌ以上であり得る高収量を得ることができる。
一過性発現による低い収量は、候補薬の可能性のある開発性の問題を示し得る。例えば、凝集しやすい抗アンジオポエチン抗体（「Ａｎｇ２」）の収量はわずか１０μｇ／ｍｌであると報告されたのに対し、抗体の最適化された変異型では２６０μｇ／ｍｌ６が得られた。しかしながら、良好な収量が一過性発現から得られる場合（例えば、５０μｇ／ｍｌ超）、および／または安定した細胞株から得られる場合（例えば、１ｍｇ／ｍｌ超）であっても、ポリペプチドが１ｍｇ／ｍｌを超えて富化されると、生物物理学的問題が生じ得る。Ｄｏｂｓｏｎら（２０１６７）は、抗ＮＧＦ抗体ＭＥＤＩ１９１２が、その親抗体ＭＥＤＩ５７６と比較した場合に重大な生物物理学的問題を抱えていることを見出したが、これは約２００μｇ／ｍｌの一過性培養から報告された発現レベルには反映されなかった。したがって、細胞培養における発現からの収量は、開発性の１つの態様にすぎず、他の重要な態様を予測するものではない場合がある。
過去数十年にかけて、ディスプレイ技術により、所望の標的結合特性を有する個々の変異型を単離することができる、抗体ならびに他のタンパク質およびペプチドの大型かつ多様な集団の創出が可能となった。所望の結合特性には、適切な特異性（例えば、オルソログおよびパラログに対するもの）および適切な親和性による標的上の適切なエピトープへの結合（例えば、受容体−リガンド相互作用を阻害するため）が含まれる。ディスプレイ技術は、いくつかのそのような態様が選択中に富化されるようにすることにより、所望の特性を有する結合剤を発見するのに役立ち得る。例えば、選択を駆動するために限定量の抗原を使用することにより、より高い親和性の抗体を選択することができる。望ましくないパラログへの結合に対する選択解除も説明されている。インビトロの結合剤ディスプレイプラットフォーム、および開発性のいくつかの態様を含む所望の特性を選択する際のそれらの使用については、概説されている８。マウスなどの実験動物の免疫を含む、抗体を生成するインビボ法も既知である。動物の免疫系を使用して抗体のパネルを創出し、これをマルチウェルプレートにおいてまたは流動選別により望ましい特性（例えば、腫瘍関連抗原の結合、サイトカイン中和）についてスクリーニングすることで、多くの承認されている抗体薬物分子が発見されている。
動物から直接取得されるか、または酵母ディスプレイもしくはファージディスプレイなどの組み合わせディスプレイ系に組み込まれるかに関係なく、「天然の」供給源から単離された抗体遺伝子が良好な開発性を呈する抗体をコードするという保証はない。このことは、未感作の供給源から得られた抗体遺伝子だけでなく、免疫後にインビボで生成されたものにも当てはまり、そのような抗体が良好な開発性特性を有すると仮定する先験的な理由はない。免疫系は、医薬品としての工業的製造または製剤化に役立つ抗体を創出するのではなく、高親和性の抗体を作製することを目的とする。インビボまたはインビトロのいずれかで生成された抗体は、必ずしも医薬製剤に好適なレベルに濃縮される能力を有するとは限らない。ヒト血清中のＩｇＧの平均総濃度は１２ｍｇ／ｍｌであり、いずれの個々の抗体も著しく低い濃度で表される。個々の抗体の割合にも大きな変動があり、免疫応答中、個々のＢ細胞間で１０００倍の発現の違いが観察される６。したがって、抗体の起源（例えば、免疫された動物／ヒトドナー、合成または半合成の供給源）に関係なく、高濃度でのその溶解性を仮定することはできない。
伝統的に、創薬の初期段階は、標的結合特性などの所望の治療作用機序を有する分子の特定に焦点を当てるが、開発性の評価は、後の段階、多くの場合、前臨床開発のための有力な分子または限られた分子パネルが選択された後まで先送りされる。これの不運な結果は、開発性の問題が明らかになるのが創薬の比較的遅い段階であり、このときにはかなりの時間および費用がすでに費やされているということである。このような失敗は高くつく。バイオ医薬品業界では、候補薬の失敗が創薬の普遍的特徴であることが認識されているものの（可能性のある薬物の大部分は臨床には届かない）、無駄を減らし、成功がより稀なものに資源を流用できるようにするために、「早期に失敗する」薬物が望まれている。
親和性の改善に焦点を当てて抗体を操作すると、自己会合の傾向などの生物物理学的特性に悪影響を与える変異を伴う親和性強化変異型を生成できることが示されている。抗ＮＧＦ抗体ＭＥＤＩ１９１２がその一例である。ＭＥＤＩ１９１２は、親抗体ＭＥＤＩ５７８から親和性成熟したＮＧＦ７に対してｐＭ親和性を有することが報告されている。しかしながら、ＭＥＤＩ５７８と比較して、親和性成熟したＭＥＤＩ１９１２抗体は、溶解度が低く、コロイド安定性が悪く、低濃度で凝集し、かつ半減期が短かった。
開発性のいくつかの態様の選択またはスクリーニングをファージディスプレイなどのインビトロ選択プラットフォームに組み入れる努力がなされてきた。ＶＨまたはＶＬドメインのみを保有する単一ドメイン抗体またはｄＡｂの場合、熱チャレンジにより、抗原に対する選択の前に、より低い融解温度（Ｔｍ）の抗体の割合を低下させることができる。Ｔｍの増加は、可逆的な折畳の解消、凝集に対する耐性、溶解度、細菌における発現および精製収率などの生物物理学的特性の全体的な改善と関連付けられている。しかしながら、Ｔｍが類似している分子は生物物理学的特性の差異を呈し得る（Ｄｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１６７および実施例３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子も、二重特異性プラットフォーム９〜１１に含めるために安定性を改善するように設計されている。さらに、いずれの可能性のある翻訳後修飾部位（例えば、脱アミド化部位、異性化部位、プロテアーゼ切断部位、および酸化部位）の包含も回避しながら、ライブラリに多様性を導入することを目指すファージディスプレイが構築されている（例えば、Ｔｉｌｌｅｒら（２０１３）１２）。
分子挙動のインシリコ予測のために多数のアルゴリズムが創出されており、そのようなアルゴリズムは、比較的多数の可能性のある候補薬物分子の開発性特性の比較を容易にする。この種類のアルゴリズムは、原因となり得るアミノ酸配列の特徴を特定することにより、開発性の問題の根底にある、見込まれる理由を突き止めるのに役立ち得る。例えば、配列中の疎水性パッチは、分子の「粘着性」を引き起こし、ポリペプチドが密接に会合しているために高濃度で発生する可能性が高い非特異的結合および／または自己凝集を呈することが認識されている。タンパク質の折畳み解除は、分子内に本来の構造で埋め込まれている疎水性残基を露出させ得る。
開発プロセス中に予測されるかまたは単純に遭遇するかにかかわらず、開発性の問題が生じる場合、タンパク質工学を使用して困難に対処する試みが成され得る。Ｄｕｄｇｅｏｎら１３は、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基の導入が生物物理学的特性を改善した抗体ＶＨおよびＶＬドメインの特定の位置を特定した。得られた抗体は非凝集性であり、十分に発現され、熱による再折畳が可能であると言われた。特定された変異は、抗体配列の残りとは無関係に、特定の位置での局所電荷分布を改変することにより凝集耐性を高めると報告されているため、優れた生物物理学的特性を有するヒト抗体可変ドメインを操作するための一般的なテンプレートとして示されている。他の場合では、特定の抗体配列が、開発性を制約し得る個々の特徴について調査されている。例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマキャンペーンから特定された抗アンジオポエチン抗体「Ａｎｇ２」は、一過性培養において低レベルの発現のレベルが低く、凝集しやすいことが見出された６。その配列の分析により、軽鎖可変ドメインフレームワークの４９位に不対システインが特定された。２０個の個々の変異型が作製され、凝集についての評価を受け、システイン４９がトレオニン（Ｃ４９Ｔ）に変化した、溶解度が改善されたバージョンが特定された。この場合、親クローンのベースライン発現は非常に低く、Ｃ４９Ｔ変異型において結合を損なうことなく収量の改善も観察された。
別の例は、開発中に行き詰った７、上述の親和性が向上したＭＥＤＩ９１２抗体の「修復」である。水素：重水素交換と構造モデリングとの組み合わせにより、ＶＨドメイン内の３つの非パラトピック（ｐａｒａｔｏｐｉｃ）疎水性残基が特定され、これらは親抗体に見られる残基に戻された。３０位のトリプトファン、３１位のフェニルアラニン、５６位のロイシンは、それぞれ、セリン、トレオニン、およびトレオニンに変換された（Ｗ３０Ｓ、Ｆ３１Ｔ、Ｌ５６Ｔと表され、番号は抗体鎖内のアミノ酸位置を示し、最初の文字は元のアミノ酸を示し、最後の文字は置換アミノ酸を表す）。ＭＥＤＩ１９１２−ＳＴＴと称される開発性が改善したバージョンは、凝集の減少を示し、非特異的結合の減少および半減期の増加を含む多数の他の側面において改善された。
Ｂｅｔｈｅａら（２０１２）１４は、１３ｍｇ／ｍｌで沈殿につながる自己凝集を含む生物物理学的特性が不十分な抗ＩＬ−１３抗体について説明している。フェニルアラニン、ヒスチジン、およびトリプトファンからなる重鎖のＣＤＲ３における芳香族トライアドが可能性のある問題として特定された。著者らは、溶解度を改善し、非特異的相互作用を減少させる単一のアミノ酸変化（１００ａ位のトリプトファン残基へのアラニンの置換）を含むいくつかの変異の導入について説明している。この場合、この変化により、標的結合も減少した。
配列の最適化により、非特異的結合と自己凝集などの他の望ましくない挙動との両方を同時に減少させることができたＭＥＤＩ９１２−ＳＴＴおよび抗ＩＬ−１３抗体の例は、複数の開発性パラメータが相互に関連し得、共通の根本的な原因を有し得ることを示す。しかしながら、非特異的な相互作用が見られるものの、自己相互作用の証拠がほとんどない他のケースが報告されている２、１５。
非特異的相互作用は、薬物分子の性能、特異性、インビボ分布、または半減期に悪影響を与え得るため、創薬において重要な検討事項である。抗体のインビボ半減期は、同じＦｃ領域を有する抗体間で大きく異なり得１６、このことは抗体可変ドメインが半減期に与える影響を示している。これは、多くの場合、非特異的相互作用に起因している。投与された薬物が非標的成分との非特異的結合相互作用の「シンク」に引き込まれると、その標的分子への結合にあまり利用できなくなり、標的組織または病変部位に到達または浸透する能力が低下し得る。特に標的が非常に豊富である場合、低親和性の非特異的相互作用でさえ重要になり得る。例えば、循環中の抗体は、０．５ｍｍ以上の深さに達すると報告されている内皮グリコカリックスの広大な面積（推定面積３５０ｍ２）に露出する。負に荷電しているグリコカリックスは、ヒアルロン酸などの様々なグリコサミノグリカンとヘパリン硫酸などのプロテオグリカンとで構成され、これらが一緒になって主成分を構成する。これは、吸収された血漿タンパク質も提示する１７、１８。このマトリックスおよび循環中の抗体に提示される他の表面との低親和性の会合は、薬物動態に大きな影響を与え得る。
非特異的相互作用をスクリーニングする方法が存在し、これらは、通常、目的の個々の結合剤が特定された後、クローンごとに実行される。Ｈｏｔｚｅｌら（２０１２）は、ＥＬＩＳＡにおいてバキュロウイルス粒子への結合をスクリーニングすることにより、非特異的相互作用を呈する抗体を特定するのに役立つ戦略について説明している１６。また、Ｘｕらは、特異性の低い抗体を特定するための、酵母ディスプレイプラットフォームを用いた標識されたタンパク質混合物を使用する多重特異性試薬結合アッセイ（ＰＳＲ ＭＦＩ）を説明している１９。非特異的相互作用を起こしやすい抗体を特定するのに役立てるために、クロマトグラフィー法も多数開発されている。これらは、典型的には、相互作用パートナー、化合物、または目的の表面をセファロースなどのマトリックスに固定化した後、試験抗体分子をマトリックスに通過させ、保持の程度を、決まったまたは変化する洗浄条件で試験抗体と対照抗体とで比較することを伴う。交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）１５、疎水性クロマトグラフィー、およびヘパリンなどの方法が使用されている。
開発性に関するさらなる検討事項は、インビボでの治療用タンパク質の半減期である。全身投与される多くの薬物の最適な効力を達成するために、それらの血清濃度をある期間特定のレベル（または標的範囲内）に維持することが必要である。ポリペプチドの半減期および／またはインビボでの有効濃度は、上で考察した非特異的結合相互作用の影響をある程度受けることがある。さらに、Ｆｃ領域を含む抗体および他の分子の場合、内皮細胞で発現される受容体であるＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合によって半減期が強く影響され得る。ヒトＩｇＧは、他の循環分子と比較して半減期が比較的長く、これは、それらのＦｃＲｎとのｐＨ依存性相互作用に起因するとされている。飲作用およびエンドソーム輸送に続いて、比較的高い親和性相互作用が、抗体をリソソーム分解から保護する抗体Ｆｃ受容体とＦｃＲｎ受容体との間で生じる。中性ｐＨでは、ＦｃとＦｃＲｎの間の親和性は低く、細胞表面への再循環時に中性ｐＨが生じる。これらの条件下では、抗体は循環に再放出される。したがって、ＦｃＲｎ受容体へのｐＨ依存性結合は、ＩｇＧ分子の重要な特性である。ラットＩｇＧ２ａ Ｆｃと複合体化したＦｃＲｎの結晶構造２０により、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ＣＨ２残基２５２〜２５４および３０９〜３１１、ならびにＣＨ３残基４３４〜４３６）へのＦｃＲｎ結合が示され、重要なｐＨ依存性結合を説明するのに役立てられる。Ｆｃ工学により、半減期が改善したＦｃ変異型が生成されている。
Ｓｕｚｕｋｉら（２０１０）は、他の要因が寄与し得ることは明らかであるものの、中性ｐＨでの低い親和性と長いインビボ半減期との間の正の相関２１を示している。抗ＩＬ−１２抗体であるブリアキヌマブおよびウステキヌマブの半減期は、Ｆｃドメインが類似しているにもかかわらず、それぞれ８日および２２日である。これらの抗体および一連の交差変異型を使用して、Ｓｃｈｏｃｈら（２０１５）２２は、中性ｐＨでの保持された結合とインビボ半減期との間の良好な相関を示した。Ｓｃｈｏｃｈらは、ＦｃＲｎとの静電相互作用の増加を引き起こし、それにより細胞外ｐＨでのＦｃＲｎ−ＩｇＧ解離を制限するものとして、ブリアキヌマブのＶＬ上の大型の正に荷電したパッチを指摘した。同様のｐＨ依存性相互作用がＫｅｌｌｙら（２０１６）に記載されているが、他のタンパク質との非特異的相互作用も半減期の短さに寄与し得ると主張している２３。
通常、ディスプレイライブラリを使用した創薬における主な狙いは、目的の標的分子への結合に対して高い親和性を有する結合剤を発現するクローンのライブラリを富化することである。ファージディスプレイライブラリを使用して、結合剤を非結合剤から富化し、より低い親和性のクローンと比較してより高い親和性のクローンを富化することができる。親和性に基づく相対的富化により、ファージディスプレイを抗体の親和性成熟に使用できるようになった。典型的には、ビオチン化抗原を使用して、関連するディスプレイパッケージと一緒に抗体：抗原複合体の回収を可能にする（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用）。抗原の濃度が低い場合、集団内の親和性のより高い抗体は、親和性のより低い抗体よりも複合体を形成する可能性が高く、結果としてこれらの抗体が相対的に富化される。
しかしながら、真核細胞で結合剤を表示する場合、ビーズ上での固相回収と組み合わせて制限抗原を使用するアプローチは、高親和性結合剤の富化では、ファージディスプレイよりも効果が低い場合がある。一価のファージディスプレイとは異なり、真核細胞はその表面に同じ結合剤の多くのコピーを有する多価のディスプレイパッケージである。選択中に細胞集団内に提示される結合剤の濃度は、解決しようとする抗原濃度および／または親和性と比較して比較的高い可能性がある。これは、親和性の影響を隠し、混合された集団における異なるクローンに表示される結合剤の親和性の違いを解決することを困難にし、その結果、ファージディスプレイなどのアプローチと比較して達成される富化係数を低減し得る。
ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ２４は、限界濃度の蛍光標識された一価抗原をフローサイトメトリーと併用して親和性を選択し、細胞ごとに結合した抗体の量を測定して、発現の違いを制御することで、真核細胞ディスプレイライブラリにおいて、厳密性を高め、親和性の選択を可能にすると主張する方法について説明している。この系では、結合剤に対するターゲットの濃度を低下させることにより、結合の厳密性が増大したと報告されており、そのため、標的のより多くの分子がより低い親和性の結合剤よりもより高い親和性の結合剤に結合したことを理由に、より高い親和性の結合剤が、標的から検出されたシグナルのレベルに基づいて検出されると言われている。
多くの出版物が、標的結合および抗体発現を同時に調査した場合の選択について説明している。このようにして、達成されたディスプレイのレベルに基づいて、抗原結合の程度を正規化することができる。米国第８，７７１，９６０号（ＤＫＦＺ）は、抗体ライブラリまたは異なる抗原特異的ハイブリドーマ細胞のグループがＰＥ標識された抗原で染色され、ＦＩＴＣ標識されたタンパク質Ｇで対比染色された蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法を使用する、より高い親和性のモノクローナル抗体の選択について説明している。ＰＥ染色：ＦＩＴＣ染色の商が最大の細胞がＦＡＣＳで選択され、その後、選択に使用した標的抗原に対して比較的高い親和性を有する抗体を各々産生する個々の細胞が拡大された。このため、抗体に結合した抗原と抗体に結合していない抗原との比率が、その抗原に対する抗体親和性の直接的な尺度として使用された。
Ｃｈａｏら（２００６）２５は、酵母凝集素Ａｇａ２ｐサブユニットと遺伝的に融合したｓｃＦｖのレパートリーをコードする遺伝子について説明している。Ａｇａ２ｐ酵母ディスプレイ系では、目的の結合剤（ここではｓｃＦｖ）は、ジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に存在するＡｇａ１ｐサブユニットに結合するＡｇａ２ｐサブユニットに融合される。標的特異的結合分子を発現する酵母細胞は、直接または間接的に標識された標的分子を使用するフローサイトメトリーによって特定され得る。例えば、ビオチン化標的が細胞に追加され、細胞壁内に提示されたｓｃＦｖへの結合がストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出され得る。標的分子の濃度を制限することで、より親和性の高い結合剤を発現するクローンを富化することが可能になり、これは、これらのクローンがより多くの標的分子を捕捉し、結果、より明るい蛍光を呈したためである。異なる細胞におけるｓｃＦｖ発現の変動を制御するために、Ｃｈａｏら（２００６）２５は蛍光標識された抗タグ抗体を使用して、各細胞の表面の抗体発現レベルを測定し、発現レベルの変動を正規化した。このため、このアプローチにより、高親和性結合分子を表示する酵母細胞を、高レベルのより低い親和性の抗体を発現する細胞と区別することが可能となった。したがって、この場合の抗体ディスプレイを測定する目的は、発現の違いを正規化し、それにより親和性の選択を容易にすることであった。
提示レベルが分泌型の同じタンパク質の可能性のある発現収量の指標として使用される方法も記載されている。抗体産生のための安定した細胞株の創出中に高度に発現される細胞クローンを特定することを目指し、国際公開第ＷＯ２０１５１２８５０９号（Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）では、抗体が分泌形態で発現されるが、細胞表面での提示のために一部が「サンプリング」されるアプローチが説明されている。このサンプリングは、最初の停止コドンを迂回し、抗体ｍＲＮＡの一部で、抗体遺伝子を、膜貫通ドメインをコードするエクソンにスプライスする、スプライシング事象の結果として生じる。この系では、抗体のディスプレイレベルは、発現された可溶性抗体の量に直接相関すると報告されている。
酵母を用いた多くの研究により、酵母細胞上の結合剤の表面提示のレベル、結合剤の熱安定性、および／または細胞培養からの結合剤の収量の間の関連が報告されている。Ｓｈｕｓｔａら２６は、可溶性単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）変異型をＡｇａ２ｐに融合させ、様々な変異体の熱安定性がそれらの可溶性分泌レベルおよび酵母細胞壁上のＡｇａ２ｐへの融合として表示されるｓｃＴＣＲの量と強く相関していることを報告した。Ｓｈｕｓｔａらは、小胞体（ＥＲ）の品質管理装置による熱力学的に不安定な変異体の細胞内タンパク質分解が、タンパク質発現の効率を決定づけると提案した。Ｋｏｗａｌｓｋｉら２７、２８は、酵母における可溶性ポリペプチドフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメインの変異型の可溶性発現を調査し、ポリペプチドの熱力学的安定性と分泌効率（したがって収量）の相関についても報告している。酵母ディスプレイ系を使用して、ハッケルら２９は、ＦｎＩＩＩドメインの熱力学的安定性の影響をさらに調査した。Ｈａｃｋｅｌらは、広範なＡｇａ２ｐ融合ＦｎＩＩＩ変異型を発現する酵母を培養して、それらの熱安定性を低下させ、熱安定性と表面コピー数との間に正の相関があることを発見した。したがって、より熱的に不安定な変異体は、減少した表面ディスプレイレベルを呈した。
国際公開第ＷＯ２０１２／１５８７３９号は、インビトロのリボソームディスプレイライブラリからの抗原ベースの選択に続いて、選択した結合剤をさらなる抗原ベースの選択のために酵母ディスプレイライブラリに変換することを伴うＦｎＩＩＩドメインに基づいてライブラリからポリペプチドを選択するための２段階プロセスを説明している。インビトロのリボソームディスプレイ系により、大部分が凝集したポリペプチドが生成されたが、酵母ディスプレイ選択を含めると、選択した集団における高度に凝集したポリペプチドの数が減少したものの、単量体を産生するクローンの割合は低いままであった。新たなクローンの発現挙動におけるわずかな改善は、酵母系が、誤った折畳の（例えば、熱的に不安定な）タンパク質の発現に対して許容度が低く、その結果、そのようなタンパク質は、酵母ライブラリからの選択にさほど利用可能でなかったことに起因した。ここでも、この作業にはＡｇａ１ｐ：Ａｇａ２ｐ−ＦｎＩＩＩディスプレイ系が関与した。
一方、Ｊｕｌｉａｎら３０は、抗原結合と酵母上のＶＨドメインの表面ディスプレイとを同時に選択すると、親和性はより高いが安定性がより低い抗体が得られることを発見した。最も親和性の高いＶＨドメインは非常に不安定であった。この研究では、様々な熱安定性にわたって酵母のディスプレイレベルにわずかな変化（１．６倍）しか見られなかったため、著者らは、ディスプレイレベルでは親和性と安定性との両方を一緒に改善する変異体のセットの選択を導くことができなかったと報告している。
抗体の親和性、特異性、安定性、および溶解度の関係に関する最近の報告では、どのようにして１つの特性（例えば、親和性）の改善が他の特性（例えば、安定性）の低下につながるか、およびどのようにしてこれらのトレードオフのバランスを取り、抗体の複数の特性を同時に最適化できるかが説明されている３１。
したがって、複数の分野での広範囲にわたる研究は、開発性に影響を与えるポリペプチドの異なる特性間の可能性のある関連性を特定し理解することを目指してきた。それにもかかわらず、特に薬物の溶解性および非特異的結合の回避などの態様について、開発性スクリーニングを候補薬物の選択の初期段階に簡便に組み入れるポリペプチド創薬方法は、依然として欠如したままである。
本発明は、ディスプレイライブラリからの発見の段階におけるポリペプチドの開発性の問題の検出を容易にすることで、不利益な開発性を有する分子を回避し、開発性特性がより良好なものについて候補薬物分子のプールを富化することを可能にする方法および製品を提供する。
発明者らは、驚くべきことに、真核生物宿主細胞の表面に提示されるポリペプチドのレベルが、溶液中のその溶解度およびその自己会合に対する耐性などの溶液中のその特性を含む、ポリペプチドの特定の開発性特性に関連することを発見した。組換え遺伝子からポリペプチドを発現し、その表面上にポリペプチドを表示する宿主細胞は、細胞表面上でのその提示のレベルを決定することにより、ポリペプチドのそのような開発性特性を評価またはスクリーニングするために使用され得る。これは、複数の宿主細胞クローンの並行したハイスループットスクリーニングに役立ち、相対的な表面提示の比較、およびより良好な開発性特性を有するポリペプチドを示すクローンの選択が可能となる。したがって、ポリペプチドの表面提示レベルは、抗体発見など、ポリペプチド結合剤をスクリーニングする方法における開発性の予測指標となる。さらに、表面提示のレベルと自己会合などの生物物理学的特性との間のこの関連により、そのような最適な生物物理学的特性を有する結合剤を結合剤のライブラリから選択するか、そのようなライブラリ内で富化することができるようになる。逆に、生物物理学的特性がより不良（例えば、溶解度がより低い）結合剤は、結合剤のライブラリに対して選択またはライブラリから除外することができる。
発明者らはまた、非特異的結合、血清中または標的器官および組織中の半減期および有効濃度などのポリペプチド薬のインビボ特性に関する開発性の側面について、インビトロで高等真核細胞において発現されるポリペプチドをスクリーニングする方法を考案した。
本発明による方法および使用は、抗体などの結合剤の大型かつ多様なライブラリのスクリーニングを含む、初期段階のスクリーニング中に特定の利点を有する。本発明は、創薬の最も早い段階で候補ポリペプチド薬の開発性スクリーニングを組み入れることにより、費用のかかる後期段階での失敗のリスクを低減する。本発明による開発性スクリーニングはまた、開発性がより良好なポリペプチドについてプールを富化するように、および／または創薬のための有力な分子の選択について決定に情報を与えるように、候補ポリペプチド薬の後期段階のプール、任意選択で、共通系統を共有する抗体の「ファミリー」の中から選択するために使用されてもよい。加えて、本発明の技法は、既存の候補ポリペプチド薬の改善された変異型、例えば、１つ以上の開発性基準を満たせなかった、または１つ以上の開発性特性の改善が望まれる候補薬を特定するために使用されてもよい。したがって、改善された開発性特性を呈する誘導体配列の生成および迅速なスクリーニングのための方法が本明細書に記載される。
哺乳動物細胞におけるポリペプチド発現経路は、小胞体上の翻訳機構（リボソームなど）で始まり、その後、新生ポリペプチドがゴルジ複合体を通過して細胞膜に輸送され、そこで細胞から分泌されるか、または細胞表面で保持される（例えば、膜タンパク質として）。組換え産生されたポリペプチドは、分泌されると、すぐに大量の培地に希釈され、数日／数週間の蓄積後、典型的には１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で存在するようになる。これは、患者への投与のために製剤化された医薬品におけるポリペプチド薬の望ましい濃度と比較して低い。分泌されたポリペプチドとは対照的に、細胞表面に保持されている発現されたポリペプチドは、細胞表面に高い局所濃度を形成し得る。発現されたポリペプチドが細胞表面に保持されると、ポリペプチドが利用できる量が大幅に減少するため、高濃度を達成する機会がもたらされる。示されたポリペプチドがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターから発現される場合、濃度は特に高くなり得る。したがって、組換え細胞ライブラリ内の哺乳動物および他の真核細胞の表面にポリペプチド結合剤が保持されると、コードされたポリペプチドが全ポリペプチド合成のかなりの割合を占める組換え遺伝子を強力に発現する宿主細胞が使用される場合には特に、結合剤が細胞膜表面において局所的に高い密度で富化されるようになる。ポリペプチドのレパートリーを発現するクローンのパネル全体に適用すると、異なるポリペプチドの表面提示レベルのクローン間変動は、自己会合に対する耐性などのポリペプチドの特性を反映し得る。自己会合する傾向が低いポリペプチドは、細胞表面上でより高いレベルに富化され得、これは、ポリペプチドが接近したときに凝集に抵抗する能力によって支援される。したがって、培養中の真核細胞ディスプレイライブラリは、良好な開発性特性を呈する結合剤のインビトロ選択環境として機能し得る。これは、本明細書に示される実施例において証拠により裏付けられる。
本発明の第１の態様によれば、培養真核細胞クローンの表面上のポリペプチド結合剤（例えば、抗体）の表面提示レベルは、それらの溶解性、溶液中の自己会合に対する耐性、および／または溶液中での濃縮能などの結合剤の開発性特性の予測指標として使用される。理論に拘束されることを望むものではないが、結合剤の溶解度に関連する１つの要素は、その親水性であり、親水性が高い（疎水性が低い）と、溶解度が高くなり、水溶液中での自己会合への耐性が高くなり、溶液中で到達できる濃度が高くなる。よって、本発明の方法を使用して、親水性の高い結合剤（候補のポリペプチド薬）を、本明細書に記載の真核細胞ディスプレイ系におけるそれらの表面提示の程度に基づいて、親水性の低い結合剤から区別することができる。
本発明は、
各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核（例えば、哺乳動物）細胞クローンのライブラリを提供することと、
クローンを結合剤の発現のための条件下でインビトロで培養することであって、結合剤が細胞表面に提示される、培養することと、
複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを決定することと、
他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、
１つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、開発性特性が良好であるものとして特定することと、を含む方法を提供する。
本発明は、結合剤を、それらの開発性特性に従って区別もしくはランク付けするため、および／または開発性特性が良好である１つ以上の結合剤を選択するために使用されてもよい。そのような方法で評価される開発性特性は、本明細書の他箇所で詳細に考察されるように、溶解度、自己会合に対する耐性、および／または水溶液中で富化される能力などの結合剤の溶液特性であってもよい。
表面提示がより高いクローンの選択により、結合剤の表面提示がより高いクローンについて富化された選択された細胞集団がもたらされ、これを、その後、任意選択で、追加の回のスクリーニンなどの１つ以上のさらなる方法で使用してもよい。
表面提示レベルを決定する方法は、本明細書の他箇所で詳述されており、検出可能な（例えば、蛍光）標識を組み込んだ薬剤で結合剤を標識することを任意選択で含む。Ｆｃ領域を含む抗体および他の結合剤では、Ｆｃ領域に結合する薬剤により標識することが簡便である。例えば、検出剤は標識された抗ＩｇＧ抗体であってもよい。本方法には、表面提示レベルを決定すること、およびライブラリの細胞における様々な結合剤提示レベルを観察することが含まれ得る。コピー数の範囲の例は、本明細書の他箇所に見られる。
本発明のさらなる態様は、ディスプレイライブラリにおける結合剤発見中の非特異的結合の評価に関する。最初の結合剤発見中に非標的分子との相互作用を特定することが有利である。本発明の方法は、最適な生物物理学的特性およびインビボの非標的分子との非特異的相互作用の低い傾向について、高等真核細胞上に表示される結合剤（例えば、抗体）の集団をスクリーニングする際に用いられてもよい。標的分子（例えば、それがインビボで結合し、生物学的効果を発揮するポリペプチド薬物の分子標的）への望ましい結合のための候補ポリペプチド薬物を選択することが慣例であるが、非標的分子（例えば、核酸のような負に荷電したポリマーへの結合など、結合剤が非特異的結合を示す分子の成分またはクラス）に望ましくない結合を呈する候補ポリペプチド薬に対して負の選択を行うことに注意を払う場合にも、開発性に伴う問題は軽減し得る。非標的分子は、非標的分子を認識する結合剤が保持されるのではなく廃棄され、それにより非標的分子を認識しない結合剤を富化することを除いて、結合剤を選択する方法において標的分子の代わりになり得る。
本発明は、非特異的結合の傾向が低い結合剤を選択し、非特異的結合の少ないものについて候補薬物のプールを富化し、異なる候補薬物製品の予測される薬物動態性能を比較する方法を提供する。このような方法は、創薬中、任意選択でスクリーニングの初期段階で、または創薬のための有力分子の選択について決定に情報を与えるために使用され得る。
本発明は、
（ｉ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
（ｉｉ）結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
（ｉｉｉ）結合剤を、非標的分子を含むマトリックスに露出させて、結合を可能にすることと、
（ｉｖ）マトリックスへの結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
（ｖ）マトリックスへの結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む、インビトロのスクリーニング方法を提供する。結合剤、およびそれによりそれらを表示する細胞は、それらのマトリックスへの相対的な結合に従って分離される。マトリックスに結合する細胞は廃棄され、非結合細胞は収集される。
細胞表面に表示される抗体の価数が高いと、親和性の低い交差反応性の検出が容易となる。結合剤を提示する細胞の集団がマトリックス上を通過するとき、マトリックスへの結合は、通過の遅延によって明らかになり得る。相互作用の可能性が低い結合剤を表示する細胞は、より後になって出現する非特異的相互作用を呈する結合剤を表示するクローンとは対照的に、より容易にマトリックスを通って進行し、収集することができる。このように、クローンのライブラリをマトリックスに通すと、マトリックスの１つ以上の構成要素に結合する傾向が高い結合剤を表示するクローンが、マトリックスを通るのにより長い時間がかかることになるか、またはマトリックスからまったく出現しないことさえあり得るため、時間の経過とともにクローンの分離が達成される。本方法は、マトリックスをより素早く通る細胞を収集することと、より緩徐に通る、かつ／またはマトリックスに結合したままである細胞を廃棄することとを含み得る。マトリックスは、一般に、１つ以上の非標的構成要素が固定されている固体または半固体の基質（例えば、任意選択でカラム内に詰められている、ビーズ）を含むことになる。ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび血流中で遭遇する他の豊富な構成要素など、いくつかの非標的分子が試験され得る。マトリックスは、グリコカリックスの１つ以上の構成要素、例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸を含んでもよい。あるいは、収集パラメータが目的の相互作用パートナー、化合物、または表面への結合の程度に基づく非標的分子を用いて、流動選別または磁気ビーズでの選別を使用してもよい。したがって、本方法を使用して、結合剤が投与される哺乳動物対象において非標的分子とインビボで結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞を富化し得る。
結合剤は、
（ｉ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
（ｉｉ）結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
（ｉｉｉ）結合剤を、１つ以上の非標的分子に露出させて、結合を可能にすることと、
（ｉｖ）１つ以上の非標的分子への結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
（ｖ）結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法において、１つ以上の非標的分子への結合についてスクリーニングされ得る。
そのような方法を、結合剤を提示する高等真核細胞のライブラリの細胞（または細胞の試料）に適用して、１つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化してもよい。
非標的分子を認識する結合剤を発現する細胞の特定および／または分離を容易にするために、非標的分子を、例えば蛍光標識で検出可能に標識してもよい。蛍光を使用することで、ＦＡＣＳでの流動選別により細胞を分離できるようになり、ここで、非染色（非標識）細胞が染色（蛍光標識）細胞と区別可能になり、それに応じて収集画分または廃棄画分に送ることができる。好都合に、これを標識化と組み合わせて、ＦｃＲｎ結合の検出、ならびに／または結合剤の表面ディスプレイの存在およびレベルの検出（例えば、Ｆｃ領域を含む結合剤に結合するために抗Ｆｃ抗体を使用する）、ならびに／または標的結合の検出（例えば、標識抗原を使用する）を行ってもよい。複数の異なる標識、例えば、異なる波長のフルオロフォアを使用すると、組み合わせた特性について同時に標識および選別を行うことが可能となる。
本発明のさらなる態様は、ＦｃＲｎ受容体とのｐＨ依存性相互作用についてポリペプチドをスクリーニングすることに関する。抗体（または他のＦｃ含有薬物）は、ＦｃＲｎと相互作用して、半減期を延長または短縮し得る。すでに述べたように、Ｆｃドメインを含む結合剤は、内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体と相互作用し、分解から保護され得る。ＦｃＲｎ再循環経路の操作はｐＨに依存し、ポリペプチドを受容体に安全にドッキングさせるためにエンドソームコンパートメントの低いｐＨ内でより強い結合を必要とし、ポリペプチドを血流に戻して放出するためにより高いｐＨの細胞外環境でより低い親和性の結合を必要とする。いくつかの場合には、半減期を制御する以上の理由でＦｃＲｎへの結合を増大させることが望ましい。例えば、「包括的抗体（ｓｗｅｅｐｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」アプローチ３２を使用して、投与された抗体が中性のｐＨでＦｃＲｎと良好に係合し、血清中の他の天然抗体と比較して優先的な相互作用を確実にすることが望ましい。今度は、この抗体が、結合した標的分子をエンドソームコンパートメントに送達し得、そこで、結合した標的は、低下したｐＨによって放出され、続いて、例えばリソソーム内で分解される。
開発性の複数の態様の選択（例えば、本明細書に記載される本発明の任意のそのような態様に従い）、または標的への結合の選択と組み合わせることが望まれ得る。この目的のために、結合剤を標的に露出させることにより選択を行うことで、同種結合剤による標的の認識が可能となり、それにより同種結合剤を表示するクローンが標的に結合した状態となり得る。次に、同種結合剤を表示する１つ以上のクローンが選択される。標的は、同種結合剤を表示するクローンの選択を容易にするために、検出可能な（例えば、蛍光）標識を運んでもよい。好都合に、本方法は、結合剤の表面提示レベルと結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、表面提示がより高い同種結合剤を表示するクローンを同時選択することを含んでもよい。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用すると、細胞を、それらの発せられた蛍光に従って選別できるようになり、表面提示および標的結合の並列選択が、異なる蛍光標識を使用して表面提示対結合標的を検出することにより実施され得る。したがって、選択された閾値を超える表面提示を呈し、かつ標的結合も呈するクローンが選択され得る。
本発明のさらなる態様は、目的の標的への結合に対して高い親和性を有する結合剤の選択における改善に関する。発明者らは、細胞表面上の結合剤の高レベルの提示がディスプレイライブラリにおいて利点を有し得る一方で、これが標的結合のための親和性に基づく選択の感度または厳密性を望ましくなく制限し得ることに注目した。発明者らは、ディスプレイライブラリにおける結合剤の提示レベルを制限することにより、より親和性の高い結合剤の選択が容易になることを認識した。
この態様によれば、本発明は、
（ａ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核（例えば、哺乳動物）細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ／または細胞あたり１００〜６０，０００個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
（ｂ）ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を表示する細胞を標的に結合した状態にすることと、
（ｃ）標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を表示する選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法を提供する。
こうして、標的に対してより高い親和性を有する結合剤をコードするクローンが富化されたクローンのプールが得られる。本方法は、
（ｄ）選択された細胞の集団を標的における１回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させること、および／または
（ｅ）標的に対する所望の結合レベルを有する同種結合剤を表示する１つ以上のクローンを選択すること、を含む方法をさらに含んでもよい。
使用される標的の濃度は、あらかじめ決められていてもよく、あるいは様々な標的濃度を使用すること、および細胞結合の程度が対照細胞（例えば、結合剤を発現しない細胞、または標的を認識しない結合剤を発現する細胞）で見られる程度よりも高い抗原濃度を選択することに基づいて実験的に判断されてもよい。
流動選別を使用して、標的濃度の異なる条件下での所望の結合レベルおよび／または結合剤ディスプレイのレベルを有するライブラリ内のクローンの集団を特定してもよい。選択されたクローンは、細胞に結合した蛍光の程度に基づいて特定され得る。結合した分子の数が減少すると（標的濃度の低下および／または結合剤ディスプレイのレベルの低下により）、特に標識されていない細胞が自己蛍光の有意なベースラインを呈する場合に、標識された細胞と標識されていない細胞とを区別する能力が減退する。その場合、回収可能な標的分子（例えば、ビオチン化標的）および磁気ビーズ（例えば、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズ）を標識された細胞の分離に使用すると、標識の程度が大幅に低下した細胞を標識されていない細胞から分離できるようになり得る、それにより、増大した厳密性を選択に使用できるようになる。
この方法を使用して、所望の親和性で標的分子を認識する結合剤を特定し、親和性に従って結合剤を選択し、かつ／またはクローンのプールを、標的に対してより高い親和性の結合剤を発現するクローンについて富化し得る。標的は、ヒト受容体、リガンド、酵素、または他のポリペプチドなどの任意の目的の分子であり得る。
本発明は、上記（ａ）で定義したライブラリ、および標的に対する所望の親和性を有する結合剤の選択のためのそれらの使用を提供する。そのようなライブラリおよびそれらを生成する方法は、本明細書でさらに説明する。
上記で概説したように、細胞ライブラリは、結合剤が細胞表面で発現されるレベルに応じて、異なる特性（開発性および親和性）に基づいて結合剤を区別するために使用され得る。創薬中は、当然、良好な親和性および良好な開発性の両方を選択することが望まれ得、その場合には、本発明の複数の態様を組み合わせてもよい。例えば、比較的低いレベルで結合剤を表示する細胞を使用して目的の標的への結合剤を選択することで、高い親和性の結合剤を表示するクローンについて富化された細胞の集団を得てもよい。次いで、それらのコード化ＤＮＡを、より高いレベルで結合剤を発現するクローンに提供して、所望の開発性特質のための結合剤を選択してもよい。これらの選択は、いずれの順序でも実行でき（親和性の選択に続いて開発性の選択、またはその逆）、複数回の選択（例えば、最初の親和性選択、次に開発性の選択、次にさらなる回の親和性選択）が含まれてもよい。
結合剤の表面表現を外部制御スイッチまたは調節可能な要素のもとに置くことにより、親和性および開発性の両方の選択における使用に適合可能である、兼用ディスプレイライブラリを構築することができる。例えば、結合剤をコードするＤＮＡは、細胞培地への誘導因子または抑制因子の添加により発現が調節され得るプロモーターに作動可能に連結されてもよい。次に、細胞外から発現を制御することで、本方法のオペレーターが発現のレベルを自由に上方調節または下方調節できるようになる。したがって、誘導性プロモーターの場合、外部のオペレーターによる誘導因子の添加によりプロモーターが活性化するため、誘導が最終的には細胞内で生じるとはいえ、外部誘導性であるとみなされ得る。いくつかの誘導性プロモーター系が説明されており、典型的な例はテトラサイクリン誘導性プロモーターである３３。結合剤ＤＮＡの発現が外部制御下にある（例えば、誘導プロモーターの制御下にある）兼用ライブラリには、結合剤遺伝子の発現レベルの変化が迅速かつ単純であり、コード化ＤＮＡを新しい細胞集団に再クローニングする必要がないという利点がある。
そのようなライブラリを伴う結合剤ディスプレイの方法は、本発明の一部をなす。標的を認識する結合剤を特定する方法は、
（ｉ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む真核（例えば、哺乳動物）細胞クローンのライブラリを提供することであって、細胞表面における結合剤の発現が外部調節可能であり（例えば、結合剤の表面発現が外部調節可能なプロモーターの制御下にあり）、かつ結合剤が細胞表面位提示される、提供することと、
（ｉｉ）ライブラリの細胞を、細胞表面上の低い提示のための（例えば、プロモーターの活性が弱い）条件下で培養することと、
（ｉｉｉ）ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
（ｉｖ）同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
（ｖ）選択された細胞の集団を、細胞表面上の増加した提示のための（例えば、プロモーターの活性がより強い、任意選択で活性が最大である）条件下で培養することと、
（ｖｉ）複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
（ｖｉｉ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
したがって、表面提示がより高い結合剤（よってクローン）を選択／富化することにより、開発性特性が良好な結合剤（およびそれらを発現するクローン）が特定、選択、および／または富化される。こうして、本方法は、開発性特性が良好な結合剤を発現するクローンについて富化されたクローンのプールを提供することができる。
そのような方法は、本明細書の他箇所で詳述する本発明の複数の態様、すなわち、標的に対する結合剤の選択および結合剤の表面提示に基づく細胞の選択を効果的に組み合わせる。本明細書の他箇所に記載するこれらの態様の特徴は、例えば、厳密な選択のための標的濃度の選択、結合剤の表面提示のレベル、および細胞を選択する方法を含む、組み合わせた方法において用いられてもよい。
調節可能なプロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。使用される誘導性プロモーター系の種類に応じて、培地中に誘導因子（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリン）の非存在下で、低レベルまたは基礎発現が得られてもよい。あるいは、低濃度の誘導因子を加えてもよい。プロモーターからの発現は、好ましくは最大限のプロモーター活性得るために、誘導因子の添加により、または培地中の誘導因子の濃度を増加させることにより、滴定され得る。誘導性プロモーターの代わりは抑制性プロモーターであり、ここでは、プロモーターの初期状態が活性であり、その活性が、培地への抑制因子の添加により減衰または遮断される。
プロモーターの活性を上方調節して、結合剤の細胞表面提示を増大させ、開発性を選択する前に、基礎発現状態のライブラリから始め、標的に初回（複数可）の選択を実施することが好都合となる場合が多い。しかしながら、いくつかの場合には、親和性の選択を実施する前に、プロモーターを活性化させた状態でまず開発性を選択し、その後、プロモーターの活性を抑制するか、またはその活性を衰退させること（例えば、培地からの誘導因子を除去することにより）が望ましい場合がある。これは、抑制性プロモーターを使用する場合により好都合であり得る。したがって、上記の番号付きの方法ステップを参照して、ステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）に続いて、ステップ（ｖ）〜（ｖｉｉ）を実施するか、またはステップ（ｖ）〜（ｖｉｉ）に続いて、ステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を実施してもよい。
本発明はさらに、上記の方法で使用するためのライブラリを提供し、その例は、結合剤のレパートリーをコードするＤＮＡを含む真核生物（例えば、哺乳動物）細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであり、ここでは、結合剤の発現（および故に細胞表面でのその提示）は、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある。好ましくは、コードＤＮＡは、細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座で組み入れられる。そのようなライブラリは、
結合剤をコードするドナーＤＮＡ分子、および真核（例えば、哺乳動物）細胞を提供することと、
ドナーＤＮＡを細胞に導入することにより、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
ドナーＤＮＡの発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む方法により生成されてもよい。
任意選択で、ドナーＤＮＡの組入れは、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することにより達成され、ここで、ヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡ中の認識配列を切断して、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れは、細胞の内部のＤＮＡ修復機序を通じて生じる。
好ましくは、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、結合剤をコードするドナーＤＮＡ分子上にあるが、これは、所望であれば別個に組み入れられてもよい。一般に、組換え細胞のドナーＤＮＡおよび／または細胞ＤＮＡは、発現のためのプロモーターの下流にある結合剤をコードするＤＮＡを含むことになる。ライブラリを構築したら、プロモーターからドナーＤＮＡの発現を誘導することができ、細胞表面に結合剤を提示するための条件下で細胞を培養することができる。
結合剤ＤＮＡの発現が誘導性プロモーターの制御下に置かれている細胞はまた、発現クローン上の結合剤の細胞表面提示がある特定のレベルに達する速度を評価し、短時間の誘導後の提示レベルを比較することにより、複数のクローンにわたって速度を比較する機会を提供する。これは、事前に決定されても（例えば、４時間または８時間または１２時間）、あるいは誘導後の結合剤提示の外観を観察することによって実験的に導き出されてもよい。誘導性プロモーターからの発現が開始される時点から始めて、経時的に細胞表面提示をプロットし、発現および表面提示の増加速度を観察することができる。ポリペプチドの発現は、典型的には、細胞表面で安定レベルまたは平衡レベルに達するまで、時間とともに増加することになる。最終的な発現レベルに達する前の早い段階で、クローン間の細胞表面提示を決定および比較することにより、開発性の側面の最初の兆候がすでに見られてもよい。これらの開発性の側面には、発現からの回収可能な収量に加えて、ポリペプチドが溶液中で富化される能力、その溶解度、溶液中での自己会合に対する耐性、および／または本明細書で考察される他の開発性特性が含まれる。
高等真核細胞上に表示される結合剤の代謝回転、分解、または内部移行の速度も、そのような開発性特性の指標として使用することができる。これは、表示された結合剤が、新しく発現された結合剤で継続的に補充されない（つまり、細胞表面からの結合剤の枯渇、すなわち、表面提示のレベルの低下として現れる）条件下で、任意選択で評価されてもよい。結合剤を標識し、結合していない標識を洗い流し、分解および／または内部移行により、標識された結合剤が時間とともに細胞表面から枯渇する速度を観察してもよい。いくつかのクローンでは、他のクローンと比べて高いレベルの結合剤の枯渇が観察され得る。表面提示のレベルが高いクローンを選択することで、より優れた開発性特性がより良好な（例えば、溶解度が高く、溶液中での自己会合に対する耐性が良好であり、非特異的結合が少ない）クローンが選択される。
細胞のライブラリにおいて、一部のクローンの表面提示の増加速度が他のクローンよりも優れていることが観察され得る。これは、ライブラリから最適な特性を有するクローンを選択できるようにする、ポリペプチドの開発性の可能性の初期指標として使用され得る。
本発明の方法によれば、一般に、クローンを選択するか、または所望の特性を有するクローンが富化された細胞の集団を選択したら、その後、選択したクローンまたは集団を１つ以上のさらなるスクリーニング方法に使用してもよく、これらの方法の例は本明細書で提供される。選択したクローンは、一緒に培養しても、個々に培養してもよい。本明細書に記載の標的結合および様々な開発性特性を含む複数の特性についてクローンをスクリーニングできるように、方法を組み合わせてもよい。
本発明の方法は、抗体発見の最も初期の段階における高濃度での抗体の挙動を評価するために使用され得る。好ましい実施形態では、高濃度での抗体または他のポリペプチド結合剤の自己相互作用の傾向は、流動選別、ビーズベースの選択、またはクロマトグラフィーなどのライブラリ選択技法を使用してクローンのライブラリをスクリーニングすることによって検出される。
本発明の任意の態様における所望の結合剤をコードするＤＮＡを含む１つ以上のクローンの選択後、結合剤をコードする核酸が回収されてもよく、かつ／または結合剤をコードする核酸の配列が決定されてもよい。結合剤をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、単離された形態、例えば、組換えベクターで提供されてもよい。
目的の結合剤コードするＤＮＡは、宿主細胞中インビトロで、任意選択で結合剤の可溶形態における発現のための条件下で、発現されてもよい。したがって、宿主細胞は結合剤を分泌して、細胞培地からのその回収を容易にし得る。結合剤の収量（例えば、安定にトランスフェクトされた宿主細胞に由来する）は、例えば、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも５ｍｇ／ｍｌであってもよい。結合剤を精製および／または濃縮して、結合剤の水溶液を提供してもよい。有利には、結合剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、任意選択で少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に提供される。いくつかの実施形態では、結合剤は、５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に提供される。
本発明による方法を使用して特定または選択される結合剤自体も、実施例に記載のもの（限定されないが、本明細書に示される抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列などの開示された配列を含む結合剤が挙げられるが、これらに限定されない）および本発明の方法を実施した結果として得られるさらなる結合剤を含めて、本明細書における本発明の態様として提供される。目的の結合剤は、薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に製剤化されてもよい。本発明は、そのような組成物およびそれらの臨床用途にまで及び、治療によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するための結合剤を含む。本方法には、皮下投与による結合剤を含む組成物の投与が含まれてもよい。溶液中の結合剤を含む組成物は、任意選択で、針、および／または注射、例えば、皮下注射による組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書など、１つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、注射用の充填済みシリンジ中で提供されてもよい。
本発明の文脈における真核細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞などの高等真核細胞である。哺乳動物細胞は、臨床用途を目的としたポリペプチド製剤（例えば、抗体）の大量発現に一般的に使用される。その結果、創薬における候補ポリペプチドの特性を評価するときに哺乳動物細胞を使用することは有利である。ポリペプチド結合剤は、哺乳動物細胞における発見の初期段階の間に、その意図された最終分子形式で発現され得る。例えば、所望の臨床製品が全長抗体（例えば、ＩｇＧ）である場合、全長抗体（例えば、ＩｇＧ）を発現する哺乳動物細胞が、本発明の方法において使用され得る。
本発明は、集団中の異なるクローンにおいて発現される結合剤遺伝子の数またはアイデンティティの差異から生じるコピー数の影響または不均一性を回避するために、ゲノムごとに一定数（好ましくは１つ）の組み入れられた結合剤遺伝子が存在する細胞集団において最も有利に使用され得る。加えて、結合剤をコードするＤＮＡは、さもなければ転写活性が異なるゲノム領域から生じ得るコードＤＮＡの組入れ位置の変動による発現への外的影響の複雑化を回避するために、すべてのクローンの細胞ＤＮＡにおいて同じ遺伝子座に組み入れられることが好ましい。これには、結合剤発現の転写正規化という利益がある。したがって、好ましくは、本発明は、異なる結合剤配列をコードするＤＮＡを各々含む複数（例えば、大型ライブラリ）の哺乳動物細胞クローンを用い、ここで、コードＤＮＡは細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座にあり、コードされた結合剤は細胞表面に提示される。それにもかかわらず、本発明の利益は、コードＤＮＡが細胞ＤＮＡにランダムに組み入れられるかまたは一過性発現のためにプラスミド上に提供されるクローンを使用して、依然として獲得され得る（例えば、実施例１１）。単一または限られた数の遺伝子座における結合剤をコードするＤＮＡの組入れにより、必要に応じて、例えば誘導性プロモーターを使用することで、発現をより良好に制御できるようになり、かつ好ましくは、結合剤をコードするＤＮＡは、細胞あたり１回、または２倍体ゲノム中の染色体コピーあたり１回、存在する。したがって、ライブラリのクローンは、各々、結合剤のレパートリーの１つまたは２つのメンバーのみを発現することが好ましい。
本発明の様々な特徴を以下でさらに説明する。本明細書全体で使用される見出しは、検索を助けるためのものでしかなく、限定的なものとして解釈されるべきではない。異なる節で説明される実施形態は、適宜組み合わせてもよい。
この文書内の見出しおよび小見出しは、検索を助けるためだけに含まれており、限定的であるものと解釈されるべきではない。本発明の複数の態様および実施形態を組み合わせてもよく、開発性に基づいてポリペプチド薬を選択する方法は、望ましくは、本明細書に記載の個々の特徴およびステップの連続および／または並行した組み合わせを包含することになる。
開発性
複数の開発性特性についてのスクリーニングを創薬の過程に組み入れて、初期段階で開発性に対する洞察を提供し、開発性リスクを低減できるようにすることが望ましい。ここで詳述するように、結合剤（およびそれらのコード細胞クローン）は、１つ以上の望ましい発生性特性について特定および選択されてもよい。本発明における開発性のスクリーニングまたは選択は、概して、予測される開発性を指し、ここでは、開発性特質を示す代理マーカーが評価され、ハイスループット選択および初期段階の発見への開発性選択の組込みを可能にする。本発明は、より好ましい開発性特性を有する結合剤の富化を介して、開発性リスクを特定および低減することを可能にする。次に、個々のポリペプチドの開発性特性（複数可）が、以下に記載されるような方法によって直接確認され得る。したがって、結合剤をある特定の特性を有するものとして特定することは、本発明の方法から得られたデータに基づいて、結合剤がその特性を有することが予測されると結論付けることを含んでもよい。
結合剤を開発の候補結合剤として特定すること、または結合剤を開発性特性が良好なものとして特定することは、結合剤を開発性特性が良好なものとして特定する報告を作成することを含んでもよい。結合剤のプールを、開発性特性が良好な結合剤について富化されているものとして特定することは、このプールを、開発性特性が良好な結合剤について富化されているものとして特定する報告を作成することを含んでもよい。同様に、選択された細胞を、開発性特性が良好な結合剤を発現するもの（または結合剤を発現するクローンについて富化されているもの）として特定することは、細胞（例えば、選択された細胞集団）を、開発性特性が良好な結合剤を発現するもの（または結合剤の発現について富化されているもの）として特定する報告を作成することを含んでもよい。報告は、電子形式および／または印刷物で提供され得る書面による報告であってもよい。報告は、例えば、本明細書に記載の１つ以上の方法からのデータを含む、開発性に関する定量的および／または定性的情報を提供し得る。
溶液中の溶解度、濃度、および自己会合
組換え発現されたポリペプチドは、通常、細胞培養物から精製され、例えば医薬品として使用するために、より高い濃度で製剤化される必要がある。例えば、タンパク質は、タンパク質を皮下投与でより高い濃度、例えば５０ｍｇ／ｍｌ以上にて患者に提供する条件で、一時的細胞培養においては１００μｇ／ｍｌ、または安定な細胞培養においては１ｍｇ／ｍｌで発現されてもよい。
Ｗａｌｋｅｒら（２００８）３４、Ｊａｎｓｏｎら（２０１２）３５など、抗体などの可溶性結合剤の発現、精製、および定量のためのいくつかの単純な技法が当業者の知るところとなる。溶液中の精製されたポリペプチド結合剤の濃度は、いくつかの方法で決定することができる。例えば、２８０ｎｍの波長での溶液の吸光度を測定し、その値を使用して、ポリペプチドの吸光係数に基づいて濃度を決定することができる。あるいは、試験試料を既知の濃度の標準タンパク質と比較してもよく、このための様々な比色および蛍光アッセイが当業者に知られている。
望ましい開発性特性は、水溶液への高い溶解度である。ポリペプチドは、望ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上で可溶性であってもよい。溶液は、ＰＢＳなどの水性緩衝溶液であってもよい。ポリペプチドの溶解限度は、１０ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、７５ｍｇ／ｍｌ超、１００ｍｇ／ｍｌ超、１５０ｍｇ／ｍｌ超、または２００ｍｇ／ｍｌ超であってもよい。分子の自己相互作用および溶解限界にさらに近づくと起こり得る他の望ましくない影響を最小限に抑えるために、溶解限界を大きく下回る濃度で溶液中にポリペプチドを提供することが有利である。ポリペプチドの自己会合は、粘度の増加または相分離を含む製品の品質および安定性の点で望ましくない結果を招き得る。分子の溶解限度に達すると、溶解濃度をさらに増大させることができなくなり、分子の沈殿などの望ましくない影響が発生することになる。いくつかの実施形態では、選択されたポリペプチド結合剤（例えば、改善された変異型）の溶解限度は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである。
ポリペプチド溶液を沈殿点に至らせて、次に濾過または遠心分離を行った後、残りの可溶性物質の濃度を決定して、その溶解限度を決定することが可能であり得る。これは、タンパク質の最大溶解度とも称され得る。しかしながら、沈殿に必要な濃度よりも低い濃度で生じ得る、自己会合の開始を測定するためのより感受性の高い方法がある。例えば、臨界濃度では、単量体分子が二量体および高次の可溶性凝集体を形成し始める。このような凝集体は、様々な方法で検出することができる。「臨界濃度」は、これらの方法のうちの１つ以上を使用して自己相互作用が明らかである濃度として定義される。結合剤の所望の開発性特性は、その臨界濃度が高いことであり、その結果、溶液中の結合剤の医薬製剤が臨界濃度を優に下回る。臨界濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、５０ｍｇ／ｍｌ超、７５ｍｇ／ｍｌ超、１００ｍｇ／ｍｌ超、１５０ｍｇ／ｍｌ超、または２００ｍｇ／ｍｌ超である。いくつかの実施形態では、選択されたポリペプチド結合剤（例えば、改善された変異型）の臨界濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである。
沈殿などの自己相互作用の結果の一部は、長期間にわたって生じてもよく、これは製品の貯蔵期間に関連する。緩衝液の組成、ｐＨ、および温度も影響し得る。したがって、濃度などのパラメータは、一連の参照条件下で、例えば、ｐＨ７．４のＰＢＳなどの標準緩衝液を用いて４℃で、決定され得る。自己相互作用に対するポリペプチドの耐性は、長期間の後に、例えば、これらの条件下での４週間の貯蔵後（および任意選択でその間の追加の時点）の試験により、確認され得る。ポリペプチドは、任意選択で、そのような条件下で少なくとも６か月間自己相互作用に抵抗することができ、溶液がその臨界濃度を下回ることが確認される。
この点で開発性が不良なポリペプチドとは、例えば４℃で、ＰＢＳなどの標準緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ以下など、溶液中の濃度がより低くても、自己凝集の兆候が明白なものである。理想的なポリペプチドは、１００ｍｇ／ｍｌ以上の臨界濃度を有するもの、すなわち、そのような自己相互作用に抵抗して、１００ｍｇ／ｍｌへの濃縮が可能なものである。これらの両極端の間で、本明細書に概説される方法を使用して選択された改善されたポリペプチドが、出発ポリペプチドよりも１．５倍以上改善された臨界濃度を呈する場合があり得る。したがって、「改善」は、変異型を親結合剤と比較する本明細書の他箇所に記載する方法においてなど、出発ポリペプチドに関して定義することができる。ナイーブライブラリであるか、別の方法に由来富化された集団（任意選択で、ファージディスプレイ選択の出力に由来するクローンの集団、または免疫化に由来する抗体集団）であるかにかかわらず、差異は、親結合剤の異なる誘導体もしくは変異型の間、またはライブラリ内のクローンの集団にわたってなど、より一般的に異なるクローンからの結合剤間で比較することができる。本発明を使用して細胞表面により高いレベルで存在する結合剤をコードするクローンを、選択解除された同じ集団内の表面提示レベルがより低いポリペプチドをコードするクローンと比較してもよい。選択されたクローンからのポリペプチドの生物物理学的挙動は、同じ集団からの表面提示レベルがより低い選択解除されたクローンに由来するポリペプチドと比較することができる。本発明を使用する発見の恩恵を受ける抗体または他の結合剤は、自己相互作用の開始前により高い濃度レベルが達成され得ることを、いずれかの方法により示すことができるもの、または比較ポリペプチドと比較して、所与のアッセイ内で自己相互作用の程度が減少するものとなる。例えば、１０ｍｇ／ｍｌで自己凝集の証拠を示す開始ポリペプチドは、１５ｍｇ／ｍｌ以上に改善され得る。あるいは、ライブラリから選択された最適なポリペプチドは、１０ｍｇ／ｍｌで自己凝集に抵抗してもよいが、同じ集団内の拒絶されたクローンに由来する他のポリペプチドは１０ｍｇ／ｍｌ以下で自己相互作用を呈してもよい。いずれの場合も、親ポリペプチドまたは拒絶されたクローンに由来するポリペプチドは「比較ポリペプチド」と称される。
本発明において選択される自己会合および他の生物物理学的特性の対照として、既知の望ましい特性を有する抗体を使用してもよく、親抗体およびその改善された誘導体（または選択されたライブラリメンバー対選択解除されたメンバー）の相対的性能をこれと比較する。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、ＮＩＳＴ ＲＭ ８６７１抗体を「ゴールドスタンダード」参照抗体として使用しており、これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ３６が発行している３巻の一部として公開されている比較を用いて、１００人を超える共同研究者により大規模に特性評価されている。ＮＩＳＴ ＲＭ ８６７１抗体は、自己相互作用が最小限であることが示された（Ｓａｒｏ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＮＩＳＴ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ３７）。あるいは、アダリムマブ抗体は、自己相互作用および交差相互作用が最小限であることが示されており、いくつかの研究において、例えば、Ｊａｉｎら（２０１７）２およびＳｕｎら（２０１３）３８により、対照として使用されている。本明細書に記載されている結合剤、特に抗体の臨界濃度または溶解度を、ベンチマークの目的で、１つ以上のそのような参照抗体と比較してもよい。
自己相互作用は、より低いディスプレイレベルに基づいて選択解除された抗体と比較した、高レベルの表面提示について選択された抗体間の直接的かつ定量可能な比較を可能にするいくつかの方法で決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、ポリペプチドの単量体および多量体形態（二量体およびより高次の形態を含む）の分離が可能となる。二量体および／または多量体形態の材料の割合は定量化することができ、多量体形成の程度は結合剤間（例えば、親結合剤と改善された変異型との間）で比較することができ、これは、保持時間の増加および／またはカラム通過後のより広い溶出ピークとして検出され得る。ＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルは、単一の濃度で決定してもよく、多量体の割合、および／または保持時間を比較する。保持時間またはピーク幅のいずれの検出可能かつ再現可能な減少も、改善と見なされることになる。多量体ピークが親クローンでのその値の６０％に低下すると、改善とみなされる。あるいは、多量体化の閾値が生じる臨界濃度は、濃度の範囲を試験し、この多量体化の閾値（例えば、５％）が生じる濃度を決定することにより、各クローンについて決定することができる。あるいは、多量体化の増加を経時的にプロットし、多量体の蓄積速度を比較することもできる２。いずれの場合も、臨界濃度の増加は改善を表す。臨界濃度の改善の大きさは、例えば、少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍であってもよい。
溶解限度の改善、または臨界濃度の改善は、任意選択で、１．５倍〜５０倍、例えば、１．５倍〜１５倍、１．５倍〜１０倍、または２倍〜１０倍である。
ポリペプチドの自己会合を決定する方法には、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）が含まれる。この技法では、抗体などの結合剤がマトリックス上に固定され、同じ結合剤の溶液がマトリックス上を通過する。対照抗体と比較して延長した保持時間は、自己相互作用３８（またはマトリックスとの相互作用）を示す。あるいは、ハイスループットアプローチを使用することができ、これにおいては、異なる結合剤を生物層干渉法チップ（ＢＬＩ）に固定し、その可溶性形態の溶液を浸漬することにより自己相互作用について試験して、結合する可溶性結合剤の量に関する信号を得る。この「生物層干渉法を使用する抗体クローン自己相互作用（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｌｏｎｅ Ｓｅｌｆ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）」（ＣＳＩ−ＢＬＩ）アプローチは、ＳＩＣなどのより手間のかかるアプローチと良好に相関し、必要な材料が少ないことが示された。いずれの場合も、試験結合剤の保持時間（ＳＩＣの場合）および（ＣＳＩ−ＢＬＩ）の場合に達成される信号を、親結合剤および自己凝集に抵抗することが分かっている対照結合剤（上述のベンチマーク抗体など）と比較することができる。
親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）では、試験抗体が細胞表面に提示され、それらが他のビーズに提示された抗体と強く自己相互作用する可能性を評価する３９〜４１。相互作用の結果として起こる粒子間距離の減少は、金コロイド溶液のプラズモン波長の増加として検出され得る。ＡＣ−ＳＩＮＳは、感度が高く単純なアッセイであるため、臨界濃度の決定に好ましい技法である。好ましい実施形態では、結合剤の開発性の改善は、溶液中のポリペプチドの臨界濃度の増加として検出可能であり、臨界濃度は、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイでプラズモン波長の変化を測定することにより測定可能である。
自己会合は、静的および動的光散乱（ＤＬＳ）４２、４３により測定することもでき、この場合、試料中の分子の流体力学的半径および多分散性パーセントを計算して、溶液中の分子のサイズおよび形状に関する情報を得ることができる。ＤＬＳでは、相互拡散係数を自己会合の尺度として抗体濃度に関連して評価する。分析的超遠心分離４４、膜浸透圧測定４５、および中性子散乱４６などの自己相互作用を測定する他の方法を使用することができる。
本発明の方法は、結合剤の表面提示が他のクローンと比較して高い１つ以上のクローンを選択することと、１つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および／または自己会合に対する耐性が良好なものとして特定することとを含み、ここで、結合剤（単数または複数）の臨界濃度は、集団内の１つ以上の他のクローンによりコードされる結合剤と比較して、または選択された結合剤が変異型である親結合剤と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％増加し、かつ／あるいは結合剤（単数または複数）の臨界濃度は、集団内の１つ以上の他のクローンによりコードされる結合剤と比較して、または選択された結合剤が変異型である親結合剤と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍増加する。
考察したように、本明細書の方法を使用して、開発性の不良な結合剤を除外し（またはその頻度または普及率を低下させ）、開発性特性がより良好な結合剤の（その頻度または普及率の増大、その富化による）選択を奨励することができる。そのような方法は、「問題のある」結合剤を単に特定して回避することに留まらない。本明細書に記載の技術の感度により、それらを、溶解度が良好な複数の結合剤のなかから最良の（例えば、最も溶解度の高い）候補を区別することに使用できるようになる。本発明はまた、親和性に基づく選択中に維持または増強された開発性に有利な選択圧をかけるために使用することができる。
比較ポリペプチドは、選択されていないクローン集団（または結合剤提示レベルが決定された閾値レベル未満であるクローン）からのいずれの結合剤であってもよい。比較ポリペプチドは、溶解限界が、例えば本明細書に記載の任意の方法により決定して、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。比較ポリペプチドは、任意選択で、臨界濃度が、例えば本明細書に記載の任意の方法により決定して、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。選択したクローンからの結合剤は、比較ポリペプチド（例えば、選択されていない集団からのクローン、または親結合剤）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の開発性特性、例えば溶解限界または臨界濃度の改善を呈してもよい。選択されたクローンからの結合剤は、比較ポリペプチドと比較して、少なくとも１．５倍の開発性特性の改善、例えば、溶解限界の増加または臨界濃度の増加を呈してもよい。比較ポリペプチドは、任意選択で、臨界濃度が、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ポリペプチドの特性を比較ポリペプチドと比較する場合、比較は、当該技術分野における対照の使用について標準である条件と同一の条件下で行われることが理解されよう。
この方法には、例えば、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイにおいてプラズモン波長の変化を決定することにより臨界濃度を実験的に測定することにより、臨界濃度の改善を確認することが含まれてもよい。溶解限度および臨界濃度などのパラメータを決定するための標準的な緩衝液条件には、４℃でｐＨ７．４のＰＢＳが含まれる。パラメータは、新たに合成されたポリペプチドが該水性緩衝溶液に製剤化された直後に測定してもよい。あるいは、パラメータは、貯蔵期間、例えば、標準的な緩衝液条件下で、１時間、１週間、２週間、２８日間、または６か月間の貯蔵時間の後に測定してもよい。
パラメータを高温に露出させた後に決定することが望まれてもよく、その場合、溶液を測定のために４℃に戻す前の貯蔵期間中に、温度を、例えば、２５℃、３７℃、または５０℃に上昇させてもよい。
非特異的結合
非特異的結合、「多反応性」、「多特異性」、または「低特異性」は、その同種標的に加えて、結合剤と複数の非標的分子との相互作用を指し、例えば、ポリペプチドは、疎水性の表面、負に荷電した表面、または正に荷電した表面に非特異的に結合してもよい。多反応性ポリペプチドは、結合剤ポリペプチドとその標的との間の特異的認識に加えて、この種類の相互作用による非標的分子へのその結合を反映して、「粘着性」を示すと説明され得る。多くの場合、非特異的結合は親和性の低い相互作用として現れるが、それでも非標的分子が豊富な場合は問題になり得る。多反応性は、結合剤ポリペプチドの表面上のクラスター化した疎水性または荷電アミノ酸残基（抗体の場合、これは、重および／または軽可変ドメインにあり得る）に起因してもよく、他の（非標的）分子との非特異的相互作用のクラスにつながる。例えば、ポリペプチドは疎水性表面への結合を呈してもよく、これは、ポリペプチドがその表面上に１つ以上の疎水性パッチを提示する場合、または疎水性パッチが溶液中のポリペプチドの折畳解除によって露出される場合に起こり得る。あるいは、ポリペプチドは、負に荷電した表面またはＤＮＡの負に荷電した骨格などの正味の負電荷（中性ｐＨ）を運ぶ分子、またはヘパリンもしくはヘパラン硫酸などの他の負に荷電したポリマーへの結合を呈してもよい。これらの非特異的相互作用の原因となる根本的な分子モチーフに関係なく、多反応性は、一般に、候補ポリペプチド薬にとって望ましくない特徴である。ポリペプチド薬の多反応性は、インビボでの短い半減期などの不良な薬物動態、および／または循環からの組織への薬物の不良な取込みがと関連する。
本発明の態様では、結合剤を発現する細胞（例えば、ライブラリ、またはライブラリからの細胞の試料）は、１つ以上の非標的分子または「多反応性プローブ」に露出する。これは、該多反応性プローブと相互作用する結合剤を提示する集団内の細胞クローンを、そのようなプローブへの結合が存在しないかまたは小さい細胞クローンから区別するために使用することができる。多反応性プローブは、核酸（例えば、ＤＮＡ）、ストレプトアビジン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシルデキストラン、他の硫酸化プロテオグリカン、インスリン、リポ多糖、バキュロウイルス、ＫＬＨ、ＦｃＲｎ、ラミニン、コラーゲン、トリガー因子、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、または他の熱ショックタンパク質もしくはシャペロンタンパク質、ヒアルロン酸または他のグリコカリックス成分のうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。非標的分子は、単離された形態で、または混合調製物として提示されてもよく、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）からの膜調製物は、多反応性を試験するために使用され得る。非標的分子は、インビボで、例えば哺乳動物に、例えばヒトに見られるものであってもよい。これは、細胞外マトリックスもしくは血流中、および／または細胞表面上に見られてもよい。非標的分子の合成代用物を調製し、多反応性プローブとして使用してもよい。
多反応性プローブは、非特異的結合の特定の様式をスクリーニングするように、例えば、負に荷電した表面への非特異的結合を検出するように選択され、ヘパリン硫酸、ＤＮＡ、もしくはストレプトアビジン、および／またはＦｃＲｎなどの負に荷電した表面領域を保有する分子のような、中性ｐＨでの正味の負電荷を帯びる多反応性プローブが選択されてもよい。好適な多反応性プローブは、それらの計算された等電点（ｐＩ）に基づいて特定され得る。ｐＩは、タンパク質の電荷の測定値であり、タンパク質が正味の電荷を帯びないｐＨとして定義される。負に荷電した表面への非特異的結合を示す結合剤を検出するためには、ｐＩが６未満の多反応性プローブが選択され得る。例については、当業者には既知であり、ストレプトアビジン、核酸、およびヘパリン硫酸またはカルボキシルデキストランなどの硫酸化プロテオグリカンが挙げられる。逆に、正に荷電した表面への非特異的結合を検出するためには、正に荷電した表面領域および／または基本ｐＩ（例えば、８超のｐＩ）を有する多反応性プローブが選択され得る。そのようなプローブはまた、インビボでの負に荷電した細胞表面からの望ましくない静電反発力をもたらし得る、負に荷電した表面パッチを有する結合剤を検出するために使用されてもよい。疎水性引力を介して多反応性をプローブするには、表面に１つ以上の疎水性領域を有する多反応性プローブ、例えばＨｓｐ７０またはＨｓｐ９０が選択され得る。
個々のクローンを低い特異性についてスクリーニングするために、いくつかの方法が利用可能である。交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）４７は、標的分子または混合物、多くの場合ポリクローナル抗体調製物を、クロマトグラフィーマトリックスに固定化し、様々な抗体の保持時間を測定する方法である。固定された分子または樹脂自体との相互作用による保持の遅延は、特異性が低いことを示す。このアプローチは、組み換え抗体を特徴評価するためにいくつかの研究において使用されている（例えば、２、１５、３８）。上に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合剤とマトリックスとの相互作用を決定してもよい。本文脈において、目的の非標的分子（複数可）は、これらの方法における「標的」の場所を占め、結合剤の相互作用が試験されている分子成分であることが理解されるであろう。
抗体および他のポリペプチドの特性評価には、代替マトリックスまたはタ標的分子との相互作用も使用されている。例えば、細胞を、グリコカリックス、例えば、ヘパラン硫酸（ＨＳ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合したコアタンパク質で構成されるヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に存在する豊富な分子へのそれらの結合についてスクリーニングしてもよい。グリコカリックスにおいてそのような分子の表面積および量が大きいことを考えると、これは試験に特に適切なクラスの分子である。ヘパリン親和性クロマトグラフィーは、固定化ヘパリンを含むマトリックスに試料を通すことを伴う４８。既製の樹脂は、いくつかの供給元から利用可能である（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｒｉｉｈｍ Ｐｈａｒｍａ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｐａｒｉｎ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。結合物質は、保持されるか、またはそれらの通過が遅延することになる。非結合物質は、通過するか、または洗浄時に除去されることになる。結合した物質は、変更された緩衝液条件、例えば、塩濃度の増加を使用して除去される。この方法は、可溶性抗体をスクリーニングし、それらがヘパリンと相互作用する程度を決定するために使用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーも、抗体を、それらが疎水性マトリックスと相互作用する傾向によって特性評するために使用し得る４９、５０。
１つ以上の非標的分子がマトリックス上に提示される場合、マトリックスへの結合剤の結合は、マトリックスへの細胞の結合の増加、例えば、マトリックスを通過する細胞の遅延、または非標的分子（複数可）でコーティングされたビーズ（例えば、磁気ビーズ）への結合として現れる。したがって、１つ以上の非標的分子への結合がより大きい結合剤は、結合がより大きい細胞の画分を除去する（破棄する、または選択しない）ことにより分離されてもよく、一方、結合がより小さい細胞は、回収して、任意選択でさらなるステップのために選択されてもよい。上記のように、比較ポリペプチドおよび対照ポリペプチドを使用して、本発明から得られる改善を確認することができる。改善は、非特異的相互作用が明白である濃度を特定することにより決定されてもよく、濃度は、任意選択で、標準的な条件下で定義される。あるいは、非特異的相互作用の程度は、決まった濃度で決定されてもよい。非特異的結合をアッセイする方法により、結合剤の「粘着性測定」が生成され、他の結合剤と比較され得る非特異的結合の定量的測定が提供される。したがって、任意の所与のアッセイの「粘着性測定」は、非特異的相互作用が非常に低いことが知られている対照ポリペプチドと比較した、試験ポリペプチドの値の間の差である。例えば、承認された抗体アダリムマブ２、３８または抗体ＮＩＳＴ ＲＭ ８６７１は、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）および交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）法により推定して、他のポリクローナルＩｇＧ分子との自己相互作用または会合が最小限である。（Ｓａｒｏ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＮＩＳＴ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ３７）。本発明による承認されたポリペプチドは、比較クローンと比較して「粘着性測定」の改善が観察されるものである。比較クローンは、改善されている開始クローンであってもよく、または本発明の使用によって選択解除されたクローンであってもよい。
これらのクロマトグラフィー法を含むいくつかの方法は、典型的には、個々の抗体を特徴評価し、「粘着性測定」を生成するために使用される。クロマトグラフィーマトリックスは、細胞を、その固定された分子との相互作用に基づいて分離するために使用することができる。例えば、臭化シアン活性化セファロースに固定されたレクチンは、Ｔ細胞集団を分離するために使用されている５１。そのような系は、抗体を発現している細胞を、ポリクローナル抗体、ヘパリン硫酸、または他の試験分子などの固定された標的とのその相互作用に基づいて分離するように改変され得る。固定された標的または支持マトリックスとの相互作用がある場合、そのような抗体を担持する細胞は、相互作用しない細胞と比べて保持または遅延される。結合傾向が異なる抗体を提示する細胞を分離するために使用する場合、ローディングまたは洗浄緩衝液を改変して、目的の厳密性を達成し得る。
非クロマトグラフィー法を使用して、個々の抗体内の低い特異性を特定および定量することも可能である。例えば、Ｈｏｔｚｅｌら（２０１２）は、ＥＬＩＳＡにおいてバキュロウイルス粒子への抗体の結合を使用して、非特異的相互作用を呈する抗体を特定する１６。同様の方法で、他の試験分子（例えば、ヘパリン硫酸）をビーズに固定するかまたは提示させて、個々の抗体との相互作用を試験し得る。これらのような非クロマトグラフィー法は、高等真核生物に表示されたライブラリから低い特異性を呈するクローンを特定するために適合させ得る。
特異性が低い抗体を表示する酵母ライブラリ内でクローンを特定するために、界面活性剤で可溶化された膜タンパク質の混合物が調製され、ビオチン化され、使用されている１９。界面活性剤の存在は、酵母ライブラリを使用して許容され得るが、哺乳動物細胞などの高等真核生物に基づくディスプレイ系には好適でない可能性がある。特異性が低い相互作用を特定するために使用される試験分子または混合物は、フルオロフォアまたはビオチンなどの分子で標識され、ストレプトアビジンでコーティングされた表面上の分子およびその複合体の標識または回収を容易にする。例えば、フルオロフォアで標識されたコンドロイチン硫酸またはヘパリン硫酸などの分子（例えば、ＡＭＳカタログ番号ＡＭＳ．ＣＳＲ．ＦＡＣＳ−Ａ１、Ｃ１、またはＤ１、またはＥ１、またはＡＭＳ．ＣＳＲ．ＦＡＨＳ−Ｐ１由来のもの）を使用して、標識された試験分子との相互作用の程度に応じて流動選別においてクローンを分離し得る。細胞表面でのポリペプチドの高親和力発現は、特に多価標的分子が使用される場合に、このアプローチの感度を高める。ライブラリ内のクローンは、蛍光分子の結合に基づいてフローサイトメトリーにより分離され得る。標的への結合などの他の望ましい特性、またはＦｃ受容体などの目的の他の分子の他の結合／回避に関して、事前に、同時に、または続いて選択するために、これらの試験分子を他の標識された分子と併用し得る。他の方法には、上述のＡＣ−ＳＩＮＳが含まれる。この技法では、試験結合剤が細胞表面に提示され、他の細胞またはビーズに提示された１つ以上の非標的構成要素とのそれらの相互作用の可能性が評価される３９。相互作用の結果として起こる粒子間距離の減少は、金コロイド溶液のプラズモン波長の増加として検出され得る。
結合剤を発現する細胞を、クローンの混合物（例えば、ライブラリまたはそこからの試料）が１つの容器にまとめられている１つ以上の非標的分子に露出させてもよく、これは、例えばＦＡＣＳなどの方法、またはクロマトグラフィー技法で簡便である。他の場合には、結合剤を発現する細胞を、別個の容器、例えば、容器ごとに１つのクローンで、１つ以上の非標的分子に露出させ、その後、結果として得られる相互作用または結合のレベルを個々に測定および比較してもよく、これは、ＡＣ−ＳＩＮＳなどの粒子間距離を測定する方法、または比較的少数の結合剤発現クローンを比較する場合により簡便であり得る。
したがって、蛍光標識された多反応性プローブを細胞の集団と混合することができ、多反応性結合剤を発現する細胞性クローン（多反応性プローブへの結合によって特定される）を、そうでない結合剤を発現するクローンから区別するために、検出または分離方法が使用される。標識プローブに結合できない細胞クローンは、流動選別、磁気ビーズ分離、および他の分離方法により分離され、多反応性抗体を発現するクローンよりも富化され得る。実施例６は、集団内の多反応性クローンと非多反応性クローンとの間の十分な区別を達成することが可能であるだけでなく、これを、それらの分離を可能にする単純かつ実用的なステップを使用して行うことができることを実証する。
候補薬の開発可能な変異型の特定
本発明は、結合剤の初期段階の選択（例えば、ナイーブライブラリ、または免疫化もしくは他のディスプレイアプローチから得られた選択された集団から）を含む創薬のすべての段階で、および後に候補分子の選考に残ったパネルの品質を比較するために使用され得るが、目的の結合剤がすでに特定されているものの、後になって１つ以上の開発性特性の改善が必要であることが分ったという状況においても使用が見出される。任意の供給源から特定された結合剤は、理想的とは言えない開発性特性を呈することが判明することがあり、そのような場合、代替の分子を見出すために新しい創薬プログラムを最初からやり直すよりも、既存の分子の配列を改良する方が好ましくあり得る。
本発明の方法は、結合剤の変異型を特定するために使用されてもよく、ここでは、結合剤は、１つ以上の開発性特性（例えば、自己会合、溶解度、非特異的結合、および／または考察される他のもの）の改善を必要とすると特定されており、発明を使用して、１つ以上の変異型が改善された開発性を呈するか否かが予測される。したがって、本発明の選択方法は、「親」結合剤の変異型を表示する細胞の集団に対して行われてもよい。これらは、ライブラリと称されてもよく、かついくつかの場合には、変異型結合剤の大型かつ多様な集団を表示するが、いくつかの場合における比較対象のクローンの数は、比較的少ない、例えば最大で１０個であり得る。したがって、本発明の方法は、ライブラリまたは複数のクローンを提供することを含んでもよく、ここでは、結合剤は細胞表面に提示され、クローンは、親結合剤配列の生成された変異型配列、および変異型をコードするＤＮＡを細胞に導入してＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み入れられるようにすることにより産生される。好適な方法および技法については、本文書の他の節で詳述する。
変異型が生成される元である「親」結合剤は、１つ以上の開発性アッセイの性能が低いため、改善が必要であると特定されたものであってもよい。あるいは、配列の変化によってその開発性を改善できるかどうかを調査することが単に所望されてもよい。開発性の様々な態様が本明細書で考察され、親分子はこれらのうちのいずれかの改善を必要とするものとし特定され得る。親分子は、５０ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、または１ｍｇ／ｍｌ未満の溶解限界（最大溶解度）を有することが判明し得る。親分子は、５０ｍｇ／ｍｌ未満、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、または１ｍｇ／ｍｌ未満の臨界濃度を有することが判明し得る。親は、溶液中で望ましくない凝集を呈することがあり、かつ／または凝集および／もしくは沈殿せずに溶液中で１ｍｇ／ｍｌを超えて濃縮できないことがある。親は、１つ以上の非標的分子への非特異的結合を示してもよい。親は、ＦｃＲｎへの結合および／またはＦｃＲｎからの解離を改善する必要があると特定されてもよい。
任意選択で、親ポリペプチド配列のバイオインフォマティクス評価を行って、変異が予測される配列の可能性のある特徴を特定し、特定された開発性の問題を軽減することで、性能を改善する。故に、開発性（例えば、溶解度、自己会合、非特異的結合）に関連すると予測される１つ以上のアミノ酸位置が特定され得る。
このようなバイオインフォマティクス評価は、変異戦略に情報を与えるために使用することができる。故に、バイオインフォマティクス評価で特定された１つ以上のアミノ酸位置の変異を任意選択で含む、親ポリペプチド配列の変異型を生成することができる。したがって、自己会合、凝集、および／または非特異的結合を促進し、かつ／または溶解度を低下させると予測される親結合剤のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸残基で変異が行われ得る。変異により、親配列の１つ以上の変異型をコードするＤＮＡが生成され、これを、高等真核細胞に導入して、変異型結合剤をコードする細胞の集団を生成させてもよい（その方法は本明細書に記載する）。細胞を、結合剤が細胞表面に提示される結合剤の発現のための条件下で培養してもよい。結合剤を発現する複数の細胞を本明細書に記載のライブラリとして使用してもよく、改善された開発性特性の指標として、結合剤の表面提示がより高いクローンを特定するために選択を行ってもよい。
本明細書に記載の様々な例では、問題となる可能性のある残基を特定するために配列分析が使用される。あるいは、ランダムな配列変動が使用され得る。変異型および派生ライブラリを生成する方法については、本明細書の他箇所に記載する。個々の変異型を作製し、生物物理学的特性の改善について評価することができる。多くのそのような変異型の大型ライブラリを創出し、自己凝集に対する耐性などの改善された特性を直接選択できることで、最適な溶解特性を有する抗体および他の結合剤の発見が大幅に促進される。溶解度に利益をもたらす変化は同時に標的結合を減退させ得るため、特にパラトピック残基が関与する場合１４、本発明の方法は、開発性の選択と保持された標的結合の選択とを組み合わせてもよい。このような選択は任意選択で同時に行われ、親和性および溶解度を同時にまたは順次スクリーニングするための方法が説明される。
考察したように、結合剤の表面提示のレベルに基づく選択を含む本発明の方法を使用して、改善された溶液特性が改善された変異型を特定してもよい。例えば、「親」結合剤（例えば、抗体）の開発性特性を改善する方法は、
結合剤のアミノ酸配列に変異を導入して、変異型を生成することと、
変異型をコードするＤＮＡを真核（例えば、哺乳動物）細胞に導入して、誘導体抗体をコードするＤＮＡを各々含む複数の細胞クローンを提供することと、
親結合剤をコードするＤＮＡを真核（例えば、哺乳動物）細胞に導入して、親をコードするＤＮＡを含む細胞クローンを提供することと、
細胞表面に結合剤を提示するための条件下で、インビトロでクローンを培養することと、
複数のクローンにおける結合剤の表面提示レベルを決定することと、
誘導体抗体の表面提示が親を発現するクローンと比較して高い１つ以上のクローンを選択することと、
１つ以上の選択されたクローンによってコードされる１つ以上の変異型結合剤を、開発性特性が親抗体と比較して改善したものとして特定することと、を含んでもよい。
自己相互作用の傾向と非標的相互作用の傾向との間には関係がある。少数のアミノ酸変化（１〜３）が両方の側面に有益な効果をもたらし得ることが分かっている６、７、１４。他の場合には、特異性が低いという証拠を示して、自己相互作用が制限され得る。いずれの場合でも、非特異的結合がより小さい結合剤の選択を含む本発明の方法も使用され得る。したがって、本明細書の他箇所で考察するように、本系は、「低特異性」および「多重特異性」とも称される他の分子との望ましくない非特異的相互作用を特定するために使用されてもよい。本発明は、臨床で使用される製品の製造に典型的に使用される産生細胞株に見られるものをより密に反映するグリコシル化などの修飾を伴う、哺乳動物細胞などの高等真核細胞上の発現という背景で、そのようなスクリーニングを実施する利益を有する。細胞上のポリペプチドの高い提示レベル２３は、任意の相互作用の親和力を増大させることにより、親和性の低い望ましくない相互作用を検出する際の本系の感度を増大させる働きをすることになる。さらに、高等真核生物自体の表面（または小胞体およびゴルジ装置の環境）は、結合剤が比較的高い濃度で多様なポリペプチドに露出することで、特異性が低い結合剤を同じ分子または隣接する分子上で非標的分子と相互作用するのを可能にし得るマトリックスとして機能することができる。これにより、提示レベルの低下が生じる。これはまた、集団内の他の細胞との提示細胞の凝集を生じさせてもよい。結果として得られる細胞凝集体は、除去されて（例えば、濾過または沈降により）、そのようなクローンを集団から枯渇させ得る。凝集した細胞の除去は、自己相互作用クローンの表示を減少させるためにも使用され得る。
さらなる用途では、内因性または外因性の遺伝子からの望ましくない標的を発現する宿主細胞を使用して、交差反応性クローンを枯渇させ得る。例えば、目的の遺伝子でトランスフェクトされたグリコカリックスまたは哺乳動物細胞の成分を発現する内皮細胞。標的に結合するクローンは、低い表面発現または細胞凝集に基づいて枯渇されてもよい。
単一濃度のポリペプチドでの生物物理学的測定値を、本発明を使用して生成した開始クローンと改善したクローンとの間で比較してもよい。あるいは、不要な生物物理学的パラメータが測定される濃度を比較してもよい。方法は、１つ以上の所望の開発性特性、例えば、より高い溶解度、溶液中での自己会合のより低い傾向、非標的分子へのより低い非特異的結合、より高い臨界濃度などが改善した変異型を選択することを含んでもよい。倍数差異または差異％が測定可能であってもよく、値の例は本明細書の他箇所に示す。比較は、通常、親結合剤に対して行われることになる。しかしながら、本発明により選択されたクローンからの変異型ポリペプチドと本発明により選択解除された比較ポリペプチドとの比較は、本発明が本明細書に記載の他の生物物理学的特性を選択するために使用される場合、改善を確認および定量するためにも使用され得る。
変異型および派生ライブラリを生成する方法
本明細書で考察する任意の選択方法に従って、表示された結合剤をコードするＤＮＡを１つ以上の選択された細胞から回収し、任意選択で変異させて変異型を生成し、かつ／またはサブクローニングして、例えば、第２のディスプレイ系内で追加の回の選択を可能にすることができる。これは、異なるレベルの表面提示をもたらす別の真核生物ディスプレイ系であり得るか、またはファージディスプレイなどの完全に異なるディスプレイ系であり得る。第２の系は、分泌発現を使用してもよく、かつ／または前述のように、直接的な機能選択を可能にしてもよい（参考文献５２〜５４および国際公開第ＷＯ２０１５／１６６２７２号を参照されたい）。あるいは、結合剤をコードする入力ＤＮＡは、選択されていないライブラリからの結合剤の集団、あるいは免疫化、または酵母もしくはファージディスプレイなどの別のディスプレイ技術に由来する集団であり得る。
したがって、本発明の方法によるライブラリの生成に続いて、１つ以上のライブラリクローンが選択され、さらなる第２世代ライブラリを生成するために使用されてもよい。本明細書に記載するように真核細胞にＤＮＡを導入することによりライブラリが生成された場合、ライブラリを培養して結合剤を発現させ、例えば、本明細書の他箇所で説明するように標的に対して結合剤を選択することにより、目的の結合剤を発現する１つ以上のクローンを回収してもよい。続いて、これらのクローンを使用して、結合剤の第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む派生ライブラリを生成してもよい。
他の例では、開発性特性が改善した変異型を選択するための複数の変異型を提供するために、親結合剤の変異型を生成することが望ましい。
派生ライブラリを生成するために、１つ以上の回収されたクローンのドナーＤＮＡを変異させて、結合剤の第２のレパートリーを提供する。同様に、変異型を生成するために、親結合剤をコードするＤＮＡを変異させる。変異は、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換、または欠失であってもよい。変異は、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失によって、コードされた結合剤の配列を変化させる。変異は、抗体分子の１つ以上のＣＤＲなどの１つ以上の領域に焦点を当ててもよく、本明細書の他箇所に記載するように、多様性の１つ以上の領域が異なる共通構造クラスの結合剤のレパートリーを提供する。
一般に、核酸配列の操作および／または修飾は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで行われ得る。したがって、本明細書におけるＤＮＡへの言及は、文脈により別途求められない限り、等価の他の核酸（例えば、ＲＮＡ）を含むように一般化され得る。故に、結合剤をコードするＲＮＡの提供、単離、または変異は、結合剤をコードするＤＮＡの提供、単離、または変異の代替である。ＲＮＡは、ｃＤＮＡを生成するために任意選択で使用される。
派生ライブラリの生成には、１つ以上の回収されたクローンから結合剤をコードする核酸を単離すること（例えば、ドナーＤＮＡまたはそのコードされたＲＮＡを単離すること）と、核酸（例えば、ＤＮＡ）に変異を導入して、結合剤の第２のレパートリーをコードするドナーＤＮＡ分子の派生集団を提供することと、ドナーＤＮＡ分子の派生集団を細胞に導入して、結合剤の第２のレパートリーをコードするＤＮＡを含む細胞の派生ライブラリを創出することとが含まれる。
結合剤をコードする核酸（例えば、ドナーＤＮＡ）の単離には、クローンからのＤＮＡまたはＲＮＡの入手および／または特定が伴ってもよい。そのような方法には、例えばＰＣＲによって、結合剤をコードするＤＮＡを回収されたクローンから増幅し、変異を導入することが包含されてもよい。ＤＮＡの配列決定を行い、変異したＤＮＡを合成する。
あるいは、クローン内でＤＮＡの変異を誘発することにより、１つ以上の回収されたクローンのドナーＤＮＡに変異を導入してもよい。したがって、ＤＮＡの単離を必要とせずに、例えば、鳥類ＤＴ４０細胞における内因性変異を介して、１つ以上のクローンから派生ライブラリを創出してもよい。あるいは、結合剤をコードする遺伝子は、ゲノム内に存在してもよく、変異誘発は、短い相同性アームを有するオリゴヌクレオチドの導入によって行われる。欠陥のあるＧＦＰ遺伝子を修復するために８０ｂｐの一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することで、最大４５％のトランスフェクション効率が達成されることが示されている（Ｉｇｏｕｃｈｅｖａ，Ｏ．，Ａｌｅｘｅｅｖ，Ｖ．，Ｙｏｏｎ，Ｋ．，２００１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（５），３９１−３９９５５，Ｌｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ（２０１７）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇＲＮＡ，Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４１，１３６−１４６５６）。
抗体ディスプレイは、派生ライブラリの創出に特に役立つ。抗体遺伝子が単離されると、様々な変異誘発アプローチ（例えば、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、鎖シャッフリング）を使用して、改善された変異型を選択できる関連クローンのディスプレイライブラリを創出することが可能である。例えば、選択されたＶＨクローンの集団をコードするＤＮＡの鎖シャッフリングを用いると、オリゴクローナルミックスまたは集団を、好適な抗体形式をコードし、ＶＬ鎖の適切にフォーマットされたレパートリーをコードするベクターにサブクローニングすることができる５７。あるいは、またここでも、ＶＨの例を使用して、ＶＨクローンのオリゴミックスまたは集団を、適切にフォーマットされた軽鎖パートナー（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂフォーマットされた重鎖との会合のためのＶＬ−ＣＬ鎖）の集団をコードし発現する真核細胞の集団に導入し得る。ＶＨ集団は、免疫された動物のＢ細胞または選択されたファージ集団からのｓｃＦｖ遺伝子を含む、上で考察した供給源のうちのいずれかから生じ得る。後者の例では、選択したＶＨを軽鎖のレパートリーにクローニングすることで、１つのステップで鎖シャッフリングと再フォーマット（例えば、ＩｇＧフォーマットへの）とを組み合わせ得る。
結合剤の細胞表面提示
細胞表面での結合剤の保持は、結合剤とコードＤＮＡとの間の物理的な会合を提供して、所望の特性を有する結合剤を発現する細胞の物理的単離後のＤＮＡの回復を容易にするので、ディスプレイライブラリの特徴である。結合剤の表面提示（または単に「提示」）は、結合剤のディスプレイまたは表面発現と称されてもよい。結合剤の表面提示のレベルは、細胞表面での高濃度に長時間露出した後の、その発現レベルおよびその保持された提示レベルを反映する。本明細書に記載の方法では、結合剤の表面提示の相対レベルは、異なる結合剤を発現するクローン間で比較され、自己会合の傾向が低く、溶解度が高く、医薬用途に好適な濃度で水性緩衝溶液に製剤化することができる結合剤を特定するために使用される。したがって、提示レベルは、所望の特性を有するクローンを選択するために使用することができる。このため、ディスプレイライブラリ上の結合剤の表面提示は、開発性特性の選択に使用することができる固有の特徴を示す。
細胞表面での様々な固定化手段を用いることができる。結合剤は、結合剤の細胞外提示のために、膜貫通ドメインなどの膜アンカーを含んでもよく、あるいはそれに連結してもよい。これには、ＧＰＩ認識配列などの膜局在化シグナルまたはＰＤＧＦ受容体の膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインへの結合剤の直接融合が関与し得る５８。
細胞表面上の結合剤の保持を達成する他の方法には、結合剤と、同じ細胞内で発現される別の細胞表面に保持された分子との間接的な会合が含まれる。この会合分子は、それ自体が、直接係留されていない軽鎖パートナーと会合している係留された抗体重鎖などのヘテロ二量体結合剤の一部であり得る。国際公開第ＷＯ２０１５／１６６２７２号（参照により本明細書に組み込まれる）は、分泌された発現および膜ディスプレイの組み合わせを可能にする方法を含む、発現された結合剤をそれらの宿主細胞上に保持するための様々な技法を説明している。したがって、発現された結合剤の一部は細胞表面に保持されてもよいが、同じ結合剤の他のコピーは同じ細胞から可溶性形態で分泌される。細胞は、細胞表面に提示された結合剤の大部分（例えば、８０％以上、または９０％以上）を保持し、少数は培地に分泌される。任意選択で、結合剤は、細胞表面に保持されるだけで、可溶性形態で分泌されることはない。
実施例１に例示するように、抗体の重鎖は、ＰＤＧＦＲ ＴＭドメインに融合され、全長免疫グロブリン、例えばＩｇＧの表面提示のためにその同種軽鎖とともに発現されてもよい。細胞内の結合剤をコードする遺伝子またはそのポリペプチドサブユニット（例えば、抗体重鎖）は、小胞体（ＥＲ）を介した細胞表面への分泌のためのリーダー配列をコードするＤＮＡを含んでもよい。結合剤をコードする遺伝子は、膜貫通ドメイン、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）タンパク質のＴＭドメインなどの膜アンカーをコードするＤＮＡを含んでもよい。あるいは、この遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーなどの翻訳後膜アンカーの付着シグナルをコードするＤＮＡを含んでもよい。ポリペプチド結合剤のＣ末端領域は、通常、膜アンカーの付着またはＴＭドメインの融合のために選択される。
細胞表面発現のレベルに影響を与える方法は、例えばプロモーターを使用して、結合剤がそのコードＤＮＡから発現されるレベルを制御することを含み、そのための方法は本明細書の他箇所に記載されている。あるいは、例えば国際公開第ＷＯ２０１５１２８５０９号（Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に記載されているように、発現された結合剤をコードするＤＮＡが膜貫通ドメインをコードするエクソンにスプライスされる程度に影響を与えることにより、表面発現レベルを制御することができる。このアプローチも本明細書で例示されており、様々なレベルの結合剤の表面提示が所望される本発明の方法において有用に用いられ得る発現系を説明する、実施例８ａおよび実施例８ｂを参照されたい。
本発明の実施形態では、結合剤は細胞で発現され、細胞膜に輸送され、そこで膜タンパク質として細胞表面に保持される。例えば、結合剤は、少なくとも１つの膜貫通ドメインまたは膜アンカーを有する１つ以上のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ポリペプチド結合剤が抗体重鎖（またはその一部）および抗体軽鎖（またはその一部）を含み、かつ重鎖および／または軽鎖に連結した膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含む場合、結合剤は、ＥＲ内で合成され、ゴルジ装置に出芽し、そこから細胞膜と融合する細胞内小胞中の細胞表面に輸送された後、結合剤は、その膜貫通ドメインまたは膜アンカーによって保持され、細胞外に提示される。したがって、結合剤の膜への組入れは、細胞表面への輸送前に細胞内で生じる。適用可能な場合、マルチサブユニット結合剤（例えば、別個の重鎖および軽鎖、またはそれらの一部を含む抗体）のアセンブリも、典型的には細胞内で生じ得る。
細胞表面提示のレベルは、コピー数（細胞あたりの表示された結合剤の数）で測定されてもよい。較正ビーズとの比較、ならびにリガンド濃度および受容体占有率のスキャッチャードプロットを含む、いくつかの方法が利用可能である５９〜６１。細胞半径の知識、および利用可能な体積または表面積に関する一定の仮定により、これを使用して、それぞれ濃度または密度を推定することができる（実施例３）。本発明が関係する一般論のレベルでは、コピー数は、提示レベルが増加するにつれて見られる、より高い濃度で達成される濃度に関係する。コピー数と細胞表面の濃度との関係は、細胞サイズにも影響される。小さい細胞および大きい細胞上で同じ数の結合剤が提示されると、抗体はより大きい細胞においてより大きな体積を占めることになるため、異なる濃度をもたらすことになる（細胞サイズと達成された濃度とを比較する実施例３を参照されたい）。
多数の組換え発現系が利用可能であり、細胞表面に表示される結合剤の絶対数は、系により異なることになる。当業者は、異なる細胞（例えば、異なるサイズ）、異なるプロモーター、異なる誘導機序、異なるスプライシング機序、輸送効率などを使用するときに観察される提示レベルの範囲に応じて、本発明の方法を適切に較正することができるであろう。しかしながら、以下の指針を例として提供する。
活性の弱いプロモーターでは、結合剤は、細胞あたり１００〜１００，０００個の範囲のコピー数で細胞表面に提示されてもよい。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個、または少なくとも１０，０００個であってもよい。細胞あたりの結合剤の数は、最大１，０００個、最大１０，０００個、または最大１００，０００個であってもよい。好ましい実施形態では、コピー数は、約８０，０００個以下、細胞あたり約６０，０００個以下、細胞あたり約５０，０００個以下、または細胞あたり約４０，０００個以下である。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個、または少なくとも１０，０００個であってもよい。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり１，０００〜６０，０００個の範囲であってもよい。これは、約１０，０００個、約５０，０００個、または約６０，０００個であってもよい。
活性の強いプロモーターでは、結合剤は、細胞あたり１００，０００〜１０，０００，０００個の範囲のコピー数で細胞表面に提示されてもよい。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも１００，０００個、または少なくとも１，０００，０００個であってもよい。細胞あたりの結合剤の数は、最大１，０００，０００個、または最大１０，０００，０００個であってもよい。これは、約１，０００，０００個であってもよい。
言うまでもなく、単一のクローンであっても、異なる細胞上の結合剤の正確な数には変動があるが、クローンの細胞間のコピー数のこのような変動は、本明細書に記載の選択および富化方法が活用するクローン間のコピー数の変動と比較すると小さいものである。例となる数値および範囲は、おおよその平均（ａｖｅｒａｇｅ）（平均（ｍｅａｎ））コピー数を表す。コピー数は、集団内の細胞の平均（ａｖｅｒａｇｅ）（平均（ｍｅａｎ））コピー数であってもよい。親和性を選択するときには、結合の厳密性を高め、高親和性クローンを富化するために小さいコピー数が好ましいが、開発性、例えば、結合剤の溶液特性を選択するときには、大きいコピー数が好ましい。
結合剤を発現する細胞のライブラリ内のコピー数は、比較的小さい数（例えば、細胞あたり１０，０００、５０，０００、１００，０００、または２５０，０００コピー）から比較的大きい数（例えば、細胞あたり１，０００，０００コピー）の範囲であってもよい。ここで引用するコピー数は指針でしかなく、半径が１０μｍほどである、懸濁培養中のＨＥＫ細胞のライブラリで観察されたコピー数に基づく９５。大型の細胞の表面に所与の密度で提示されたポリペプチドは、小型の細胞に同じ密度で提示された場合よりも大きいコピー数となるため、大型の細胞または小型の細胞から生成されたライブラリで観察される絶対コピー数は、それに応じて異なり得る。実施例３ｂを参照されたい。
本発明の方法を実施する場合、通常は、クローン間で比較した相対的な提示レベルに関心が向けられ、この場合、重要なのは、結合剤の絶対数（細胞あたりの絶対コピー数）ではなく、結合剤が細胞表面に表示される様々なレベルに応じてクローンをランク付けまたは区別する能力である。
ライブラリからのクローンの代表的な試料の表面提示レベルを決定し、これを使用して、ライブラリのクローンに存在する表面提示レベルの平均（最頻値（ｍｏｄｅ）、平均（ｍｅａｎ）、および中央値（ｍｅｄｉａｎ））および広がり（範囲）を推定することができる。
任意の好適な方法を使用して、ポリペプチドが細胞表面に存在するレベルを決定することにより、それらの相対量を比較することができる。細胞間の結合剤提示の相対的差異を測定する好ましい方法は、検出可能な（例えば、蛍光）標識を担持する薬剤に細胞を曝露出させ、薬剤の結合剤への結合を可能にし、細胞上の標識の相対量を検出することであり、これにおいて、検出可能な標識からのより強いシグナル（例えば、より多くの蛍光ユニット）は、細胞上の結合剤のより高い提示レベルを示す。検出可能な標識が蛍光である場合、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して選別を行ってもよい。あるいは、またはＦＡＣＳに加えて、磁気ビーズによる選択を使用することができる。
一般に、結合剤の定常領域に結合する薬剤が選択される、すべての結合剤をそれらの配列とは無関係に等しく標識することができる。Ｆｃ領域を含む抗体および他の結合剤では、Ｆｃ領域に結合する薬剤で標識することが簡便である。例えば、結合剤がＩｇＧ抗体である場合、細胞を、ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合する検出可能な物質、例えば、標識された抗ＩｇＧ抗体と接触させてもよい。適切な場合、例えば、ライブラリが、それらのＦｃ領域の配列が異なる結合剤を含み、Ｆｃの非多様性部分または結合剤分子の他の領域に結合する薬剤を用いることができる場合に、本方法を適合させることができる。ペプチド発現タグ（例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ−Ｍｙｃ）は、結合剤ポリペプチドに組み込まれ（例えば、抗体足場に組み込まれ）てもよく、タグに結合した薬剤を検出することにより、表示された結合剤を検出することを可能にする。これは、抗体発現レベルに基づいて抗原結合シグナルを正規化するために、正しく組み立てられた抗体を選択するという背景ですでに説明されている２４、６２。結合剤の表面提示レベルを検出するための薬剤は、単独で、すなわち、抗原結合または標的特異性などの他の特徴の同時検出または同時選択なしで使用してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、結合剤の定常領域に結合する薬剤を使用して結合剤提示レベルを検出するステップは、標識された標的を使用して結合剤を検出することを含まない。他の実施形態では、マルチパラメータ選択を行ってもよい。広範な表面提示レベルがライブラリの結合剤発現クローンによって呈されてもよく、これは高レベルのクローン間変動を反映する。ライブラリからの細胞の代表的な試料について、例えば、ＦＡＣＳによる検出後、表面提示レベルをその提示レベルが観察された頻度に対してプロットすることができる。このいくつかの実施形態は、図３１を参照して、そこに例示されている、実施例１０に記載されている。試料について検出された表面提示レベルまたは最頻値の表面提示レベル、ならびに提示レベルの広がりおよび中央値または最頻値からのそれらの偏差を、観察および／または計算し得る。最頻値表面提示は、細胞数に対する表面提示レベルのプロットの最高ピークとして簡便に視覚化することができる。
クローンの集団で観察された表面提示レベルの広がりは、最頻値（ｍｏｄａｌ ｖａｌｕｅ）（最頻値（ｍｏｄｅ））からの分散の程度によって表されてもよい。クローンの集団は、特に結合剤が構造に大きな変動を呈する場合（例えば、異なる一次配列）、クローン間の表面提示のレベルに幅広い変動を示してもよく、その結果、一部のクローンは他よりはるかに高い密度で結合剤を表示する。一部のクローン集団では、表面提示レベルのクローン間変動はより低くてもよいが、それでも本方法を使用して、閾値提示レベルを設定し、より提示が高いクローンをより提示が低いクローンと区別してもよい。広がりのひとつの統計的尺度は、上位四分位点（第三四分位数）と下位四分位点（第一四分位数）との差である四分位範囲である。第三四分位数（上位四分位点の下限として表される）でのコピー数は、第一四分位数（下位四分位点の上限で表される）でのコピー数とは、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍異なってもよい。
いくつかの実施形態では、表面提示レベルの範囲、および上述の基準点間の表面提示の倍率差は、結合剤の高い表面提示を有するクローンについて細胞の集団が次第に富化されるため、表面提示レベルの各回の選択とともに減少することが観察され得る。いくつかの実施形態では、最頻値は、より高い表面提示についての各富化とともに次第に増加することが観察され得る。選択に続いて、結合剤の集団における表面提示レベルの増加を決定または観察する方法には、例えば、ＦＡＣＳまたは本明細書に記載の類似の方法により測定される平均（例えば、中央または最頻）コピー数の増加を決定または観察することが含まれてもよい。選択された集団（またはそのクローン）は、平均表面提示レベルが、選択されていない集団または比較ポリペプチドを発現するクローンの平均表面提示レベルよりも、例えば、集団が由来する親結合剤を発現するクローンの平均表面提示レベルよりも高いことが観察され得る。例えば、選択したクローンまたは選択した集団の最頻値または中央値のコピー数は、比較または親のコピー数よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％高く、そのクローンは、表面提示レベルのその改善に基づいて選択され得る。
結合剤のより高い表面提示を発現するクローンを選択するため、または表面提示がより高い結合剤をコードするクローンについて富化されたクローンの集団を選択するために、細胞を、細胞における結合剤の表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し得る。表面提示が所定の閾値を上回る細胞は、収集画分に選別され、表面提示が所定の閾値を下回る細胞は、廃棄画分に選別される。表面提示は、任意選択で、このステップ中に選択／富化が行われる唯一の基準である。これは、任意選択で結合剤による標的認識の検出のない状態で、すべての結合剤を標識する検出可能な薬剤を使用することにより促進され得る。
結合剤の表面提示がより低い細胞の画分を廃棄することにより、開発性特性が不良な結合剤を発現するクローンが集団から枯渇する。残りの細胞のすべてまたは一部を選択することで、他のクローンと比較して結合剤の表面提示が高い結合剤を発現するクローンが富化された、選択された細胞集団が得られる。こうして、選択された細胞、クローン、または集団が、開始集団またはライブラリと比較して、および選択されていない細胞、クローン、または集団と比較して、開発性特性が良好であるものとして特定され得る。
上記のように、細胞表面上の結合剤の絶対数は変動し、使用中の系に好適な閾値は当業者により決定されることになる。例えば、閾値は、例えばライブラリの最初の試験試料に基づいて、結合剤の最も高い表面提示を発現する集団内の特定のパーセンテージのクローンを選択するように予め決定されてもよい。閾値は、例えば、細胞の上位５０％、上位３０％、上位２５％、上位２０％、上位１５％、上位１０％、または上位５％を選択するように設定されてもよい。
ライブラリからの細胞の代表的な試料の表面提示レベルを決定し、試料のコピー数の最頻値、中央値、広がり、および／または四分位範囲を観察または計算したら、適切な閾値コピー数を設定し得る。ＦＡＣＳを使用する場合、これは細胞あたりの閾値蛍光強度に対応することになり、例えば、細胞の収集に関するＦＡＣＳ閾値が、試料の最頻値に対応する中央値の蛍光強度を有するライブラリの細胞を収集するように設定されている場合、その蛍光レベルまたはそれを上回るレベルを有する細胞が収集されることになる。表面提示レベルをさらによく富化するためには、細胞の収集のためのＦＡＣＳ閾値を、試料中の細胞の第三四分位数の蛍光強度に相当する蛍光強度を有するライブラリの細胞を収集するように設定してもよい。
閾値は、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約５００，０００個、または少なくとも約１，０００，０００個の、細胞あたりの提示される結合剤の数を表し得る。
選択および富化
クローンの選択、細胞の選択、または集団の選択には、クローン、細胞、または集団を、他のクローンもしくは細胞から、またはより広い集団もしくはライブラリから物理的に分離させることが含まれてもよい。選択されたクローン、細胞、または集団は、単離された形態で提供されてもよい。
複数の細胞またはクローンの物理的分離が選択に含まれる場合、これには、典型的には、収集画分および廃棄画分の生成が含まれることになる。収集画分は、本方法において選択された特性を有する結合剤を表示するクローンについて富化されることになる。富化とは、集団におけるこれらのクローンの相対的存在量が増加することを意味する。富化は、選択ステップの前の細胞またはクローンのプール、例えばライブラリまたは開始集団に対するものである。選択中に細胞の一部（例えば、結合剤の表面提示がより低い細胞、親和性がより低い細胞など）を廃棄することにより、あまり望ましくない特性（例えば、不良な開発性特性）を有する結合剤を発現するクローンが除外される。したがって、選択ステップの結果として、あまり望ましくない特性を有する細胞／結合剤の相対的存在量が、集団において減少する。所望であれば、選択した細胞のすべてまたは一部（収集画分）をさらなる選択方法に進めてもよく、任意選択で、１つ以上のクローンを、単独での個々の培養に対して選択する。任意選択で、１つ以上の選択された細胞もしくは結合剤または選択された集団を、本明細書の他箇所に記載するように、派生ライブラリの創出に使用してもよい。
クローンの収集画分を選択する際に、本方法のオペレーターは、「上位」または「最良」のクローンの設定されたパーセンテージまたは割合を得てもよい。この原理の実施形態は、高い表面提示のための選択を参照して詳細に考察されている。標的分子または非標的分子への結合などの他の特性を選択するときにも同じ原理が適用されることを理解されたい。したがって、標的を認識する結合剤を発現するクローンを選択する場合（例えば、親和性選択）、オペレーターは、標的への結合が最も高いクローン（例えば、標識された標的を使用する方法においてクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して）の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。非標的分子への非特異的結合の減少（または不在）を示す結合剤を発現するクローンを選択する場合、オペレーターは、非標的分子への結合が最も低いクローン（例えば、本明細書で言及する様々な多反応性プローブのうちのいずれかなど、標識された非標的分子を使用する方法におけるクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して）の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。一般に、「良好な」特性（例えば、表面提示レベル、標的への親和性）についてポジティブ選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比べて高いクローンを選択し、「不良な」特性（例えば、非特異的結合）に対して選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比較して低いクローンを選択することになる。
本明細書の他箇所で考察するように、選択閾値は、手元の状況に従ってオペレーターによって決定されてもよく、集団の試料（例えば、ライブラリからのクローンの代表的な試料）の初期評価により導かれてもよい。閾値は、所望の特性の場合、シグナルレベルが最も高いクローン、例えば、細胞の上位５０％、上位３０％、上位２５％、上位２０％、上位１５％、上位１０％、または上位５％を富化するように設定されてもよい（例えば、表面提示のレベルもしくは標的結合のレベルを表す、結合した検出可能な標識の量に基づいて、またはＡＣ−ＳＩＮＳにより決定した粒子間距離に基づいて、または溶液中の単量体産生に基づいて）。選択された上位％のクローンが収集画分となり、他のクローンは破棄される。望ましくない特性に対する選択では、例えば、多反応性プローブに結合した検出可能な標識の量、または非特異的結合を検出するためのマトリックス上の遅延の程度に基づいて、閾値は、シグナルレベルが最も低いクローンを富化するように、例えば、結合した検出可能な標識の量が最も少ないか、またはマトリックス上の遅延の程度が最も低いクローンのパーセンテージ（例えば、５０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％）を選択するように、設定されてもよい。収集の例示的な％は、言うまでもなくガイドラインでしかなく、オペレーターが本方法の原則を順守している限り、数値の正確さは重要ではない。
差異の定量化および測定
本発明の様々な方法には、例えば、提示レベル、結合、濃度（例えば、臨界濃度）、溶解限界などといった特性について、結合剤および／またはそれらのコード化クローンの特性を比較することが含まれる。方法には、集団内の他の結合剤と比較して（例えば、１つ以上の他のものと比較して、または集団平均（平均（ｍｅａｎ））と比較して）良好な結合剤、および／またはそれらが由来する親分子と比べて１つ以上の特性が改善した結合剤を特定することが含まれてもよい。また、ベンチマーク結合剤に対して比較を行ってもよく、抗体の例では、これはＮＩＳＴ ＲＭ ８６７１抗体であってもよい（Ｓａｒｏ Ｄ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＮＩＳＴ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ３７）。選択および改善のための望ましい特性は、本明細書の他箇所で考察されており、これらの特性には、より高い溶解度、より高い臨界濃度、より小さい非特異的結合、および／または標的に対するより高い親和性が含まれる。「より大きい」または「より少ない」、「より高いレベル」または「より低いレベル」、「より良好」または「より不良」、「より多い」または「より少ない」などの相対語は、一般に、結合剤またはクローンをそれらの特性に基づいて区別するのを可能にする、関連性のある実験的背景において観察される差を指す。差は統計的に有意であり得る。差は、任意選択で、少なくとも１０％、少なくとも２５％、または少なくとも５０％の差など、％の観点で定量化されてもよい。あるいは、任意選択で、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍など、倍数差が考慮され得る。
標的結合
結合剤は、任意選択で受容体、酵素などの別のポリペプチド、および／または腫瘍関連抗原などの疾患関連ポリペプチドであってもよい、目的の標的分子への結合について選択され得る。他の標的分子クラスには、核酸、炭水化物、脂質、および小分子が含まれる。例示的な結合剤および標的は、本明細書の他箇所で詳述する。古典的な例は抗体分子のライブラリであり、これを目的の標的抗原への結合についてスクリーニングしてもよい。他の例には、標的ＭＨＣ：ペプチド複合体に対するＴＣＲのライブラリのスクリーニング、または標的ＴＣＲに対するＭＨＣ：ペプチド複合体のライブラリのスクリーニングが含まれる。
標的を認識する結合剤（同種結合剤）をコードするクローンについての選択には、本明細書に記載のディスプレイライブラリを標的と接触させることにより、結合剤を標的に露出させて、同種結合剤（存在する場合）によるターゲットの認識を可能することと、標的が同種結合剤により認識されるかどうかを検出することとが含まれてもよい。その後、同種結合剤を表示する１つ以上のクローンを選択してもよい。
標的は可溶性形態で提供されてもよい。標的は、検出を容易にするために標識されてもよく、例えば、標識は、蛍光標識を保持してもよく、またはビオチン化されてもよい。標的特異的結合剤を発現する細胞は、直接または間接的に標識された標的分子を使用して特定されてもよく、ここでは、結合剤が標識された分子を捕捉する。例えば、結合剤：標的相互作用を介して、蛍光標識された標的に結合している細胞を、フローサイトメトリーによって検出および選別して、所望の細胞を単離することができる。サイトメトリーを伴う選択には、直接蛍光標識されているか、または二次試薬で検出できる分子で標識されている標的分子が必要となり、例えば、ビオチン化標的を細胞に加えて、ストレプトアビジン−フィコエリトリンなどの蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて細胞表面への結合を検出することができる。さらなる可能性は、磁気ビーズまたはアガロースビーズなどの固体表面上の標的に結合する標的分子または二次試薬を固定して、標的に結合する細胞の富化を可能にすることである。例えば、結合剤：標的相互作用を介してビオチン化標的に結合する細胞は、ストレプトアビジンでコーティングされた基質、例えばストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上で単離することができる。磁気ビーズは、ビーズの磁気回収による、ビオチン化抗原に結合した細胞の捕捉に便利である。最適な標的濃度は、事前に決定されてもよく、または広範な濃度を使用し。バックグラウンド対照と比較することにより実験的に決定されてもよい。
標的への結合を選択する方法には、細胞を、細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することが含まれ、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を有する細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る結合した標的を有する細胞が廃棄画分に選別される。閾値は、同種結合剤を表示しない陰性対照に対して設定されてもよい。ＦＡＣＳでは、典型的には、同種および非同種結合剤を表示する細胞を選別するときに、陰性対照のピークが観察される。閾値は、陰性対照よりも統計的に有意に高いレベルで蛍光を表示するすべての細胞が収集画分に選別されるように設定されてもよく、あるいは同種結合剤の選択および同種結合剤を表示するクローンのより優れた富化においてより優れた信頼度を達成するように、より高い閾値が選択されてもよい。結合剤の細胞表面提示の決定に関してすでに考察したように、細胞の試料を使用して較正を行い、好適な閾値を決定してもよい。非結合剤からの結合剤の富化を達成することができる。より高い親和性の結合剤を富化する方法は、本明細書の他箇所でさらに説明する。
標的に対する選択は、本発明の他の方法の前もしくは後の追加のステップとして組み込むか、またはその中に含めてもよい。溶解度または低特異性または最適なＦｃＲｎ結合などの開発性の側面を改善するための開始ドメインの変異誘発による変異型のライブラリの構築は、一部のライブラリメンバーにおいて、標的への結合を損ない得る（例えば、接触ＣＤＲの変異誘発が実行される場合）。例えば、結合剤提示レベルについて選択されたクローンは、その後、標的に対して選択されてもよい。表面提示レベルと標的結合とを同時決定することも、高い表面提示レベルで同種結合剤を表示しているクローンの同時選択を使用することにより可能である。そのような方法は、本明細書の他箇所に記載するように、結合剤提示レベルを決定するために検出可能な標識を組み込んだ薬剤の使用を含んでもよく、また結合剤を標的に露出させることをさらに含んでもよく、ここで、標的は、標的結合の検出を可能にするために、第２の検出可能な標識を組み込んだ第２の薬剤で標識される。蛍光標識を使用する場合には、ＦＡＣＳを使用して、細胞を結合剤の提示と標的認識との両方のために同時に選別してもよい。異なる波長で発光する標識を選択して、それらの異なるシグナルを区別できるようにしてもよい。
したがって、本発明の方法は、各々に異なる検出可能な標識を使用する、結合剤提示レベルおよび標的結合レベルの同時検出を含んでもよい。他の実施形態では、標的結合は、細胞上の結合剤提示レベルを決定することなく検出され、例えば、標識された標的を使用して結合剤を検出するステップは、結合剤の定常領域に結合する薬剤を使用して結合剤提示レベルを検出することを含まない。
同種結合剤による標的認識の検出後、同種結合剤をコードするＤＮＡを含む選択されたクローンの細胞を回収してもよい。次に、結合剤をコードするＤＮＡを特定し、増幅し、かつ／または単離形態で提供することで、標的を認識する結合剤をコードするＤＮＡを得てもよい。
複数選択
複数選択を並行して実行する考えは、本明細書に記載の任意の２つ以上の特徴に基づいて細胞の共選別に拡張され得る。上記の議論において、細胞の同時共選択は、結合剤の表面提示レベルおよび結合剤による標的結合のレベルを同時に決定し、より高い表面提示を呈する同種結合剤を表示するクローンを共選択することによって行われる。本発明の他の方法も、並行して採用され得る。方法は、以下、
（ｉ）表面提示レベル
（ｉｉ）非標的分子への非特異的結合のレベル
（ｉｉｉ）標的結合のレベル
（ｉｖ）ＦｃＲｎ結合のレベル、
のうちいずれか２つ以上を同時に決定することと、それに応じてクローンを共選択することと、を含むことができる。ＦＡＣＳは、並列選択が異なる波長で蛍光を発する複数の標識を使用して実行されることを可能にする。
利点と相乗効果は、複数のタイプの選択を直列または並列に実行することで、例えば、溶解度についての選択を非特異的結合に対する選択と組み合わせることによって得られることができる。ライブラリにおけるクローンの集団に適用される各選択は、その選択基準を満たす変異型を優先して進化圧を生成する（例えば、高い表面提示レベル）。単一のパラメータの繰り返された選択は、枯渇または消失するリスクがある他の品質（例えば、標的結合に対する親和性）を犠牲にして、この特徴（例えば、高い溶解度）への進化を駆動することができる３１。このことは、例えば、溶解度を増加させる変異が親和性も低下させる際に発生し得る。選択方法の賢明な組み合わせは、複数の所望の特徴を有するポリペプチドを発現するクローンへの集団の進化を誘導し、ポリペプチド薬物の要求される要件の全範囲にわたって最適に（または少なくとも許容可能に）実行するポリペプチドの特定を可能にすることができる。
非特異的結合に対する選択は、増加した表面提示レベルについての選択の前または後に実行され得る。例えば、溶液中のそれらの溶解度および／もしくは自己会合に対する耐性に従って結合剤を区別またはランク付けする方法、ならびに／または溶液中の自己会合に対するより高い溶解度および／もしくはより高い耐性を呈する結合剤について富化する方法を実行して選択されたクローンの集団をもたらし、次いで選択された集団を１つ以上の非ターゲット分子に結合する低い傾向を呈する結合剤を発現するクローンについてスクリーニングし、それにより非特異的結合も有する１つ以上のクローンを特定することができる。
いくつかの実施形態では、非特異的結合についてのスクリーニングは、表面提示レベルについてのスクリーニングと同時に組み入れられ得る。例えば、（ｉ）検出可能な標識（例えば、蛍光的に標識された抗Ｆｃ）を担持する、すべての提示された結合剤を結合するための薬剤、および（ｉｉ）（例えば、異なる蛍光波長の）異なる検出可能な標識を担持する１つ以上の非標的分子（例えば、非特異的結合が回避されるヘパリンまたは他の分子）への細胞の二重露出は、実行され得る。クローンの二重染色は、表面提示レベルおよび非特異的またはオフターゲット結合の両方に基づいてクローンが区別されることを可能にする。選別閾値は、より高い表面提示レベルおよび非標的分子へのより小さい結合を呈する細胞を収集するように設定され得る。このことは、選択されたクローンにおいて開発性の乏しい抗体を排除するか、または少なくともその有病率を低下させる。
同様に、非標的分子（例えば、ヘパリンまたは非特異的結合が回避される他の分子）への結合に対する選択は、本明細書に記載の方法におけるＦｃＲｎ結合についての選択と組み合わされ得る。
いくつかの状況において、１つの特徴を選択すること（例えば、高いレベルの表面提示を選択すること）は、開発性のあるある特定の態様の連関する結果として、複数の有益な品質を有する結合剤について富化するであろう。例えば、いくつかのクローンは、細胞表面上の非標的分子（例えば、プロテオグリカン）と相互作用する多反応性結合剤を発現することができる−例えば、それらはヘパリンに非特異的に結合することができる。高等真核細胞ディスプレイ系では、結合剤発現細胞クローン自体は、同じまたは類似の非標的分子（例えば、細胞に内因性のプロテオグリカン）を発現することができ、結果として生じる効果は、表面表示された結合剤がそれが表示される細胞上の１つ以上の分子と非特異的に相互作用することである。このことは、結合剤が細胞内に内在化され、したがってより低いレベルの表面提示を呈することにつながり、その発現するクローンの選択解除をもたらすことができる。そのような場合において、結合剤のより高いレベルの表面提示を表示するクローンを選択することは、複数のフロントでより優れた開発性を有する結合剤を発現するクローン、例えば、より溶解度が高く非特異的結合の対象になりにくい両方である、について並行して富化または選択するであろう。
このことの別の例は、自己凝集についてのより低い傾向を有する結合剤を富化することにより、方法が、医薬品製剤において使用される場合に免疫原性凝縮物を形成する傾向があるそれらの結合剤を選択から除外することにより、インビボでより低い程度の免疫原性を示す結合剤の選択を促進することができることである。
このことに加えて、前述のように、並列選択のさらなる次元は、さらに標識された検出剤、例えば標識されたＦｃＲｎ、標識された標的、他の標識された多反応性プローブを含むことにより組み込まれ得る。異なる標識（例えば、異なる波長のフルオロフォア）の範囲の迅速な利用可能性、およびマルチプレックス検出および選別を実行するＦＡＣＳ機械の能力は、そのような並列選択の設計に役立つことができる。
親和性選択
標的への結合剤の選択において、親和性に基づいて結合剤を選択できることはしばしば有用であり、標的結合に対して高い親和性を有する結合剤を発現するクローンについて富化を可能にする。
親和性は、一般的にＫｄ、平衡解離定数として表現される。Ｋｄは、結合剤とその標的との間（例えば、抗体とその抗原との間）の相互作用についての比率ｋ（オフ）／ｋ（オン）である。Ｋｄ値は結合剤の濃度に関し、Ｋｄ値がより低くなると（より低い濃度）結合剤の親和性がより高くなる。その標的を特異的に認識する結合剤は、その抗原を認識する抗体の様式で、同種結合剤として称され得る。同種結合剤による標的の認識は、望ましくは高親和性相互作用である。結合剤のＫｄ：標的相互作用は、１μＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満であり得る。
本発明の方法は、標的へのより高い親和性の結合剤をコードする（および提示する）細胞の集団を富化することを含むことができる。選択のストリンジェンシーは、親和性についての選択を駆動するために、結合剤が比較的低いコピー数で提示されている真核細胞を使用することにより、増強され得る。目的の標的に結合する結合剤を選択する方法は、各々が結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを採用することができ、結合剤は細胞表面に提示され、コードされた結合剤は活性の弱いプロモーターから発現されるか、および／または比較的低いコピー数で細胞表面に発現される。このことは、活性の弱いプロモーターから駆動される発現にからのものか、転写産物不安定性もしくは最適でないスプライシング、翻訳、表面への輸送、または細胞表面上の保持の結果としてであり得る。
高等真核細胞の高密度懸濁液の提示（例えば、１０７／ｍｌの高レベルの表面提示（例えば、６×１０５結合部位／細胞は、比較的高濃度の抗体（この例では１０ｎＭ）を提示する。その状況において、低濃度の抗原が選択のストリンジェンシー、例えば０．１ｎＭを駆動しようとして使用された際でも、高濃度の抗体は高親和性クローンと低親和性クローンと間の相対的富化を限定して会合を駆動する（例８ａおよび例８ｂ）。１ｎＭ以下の結合剤の投入濃度が好ましいだろう。細胞密度がより低い場合でも、高密度の固定化された結合剤の存在における標的の再結合という潜在的な問題がある。この問題は、表面プラズモン共鳴などの表面ベースの親和性測定（ＢＩＡｃｏｒｅマニュアル）において特によく認識され、文書化されている。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり１００〜１００，０００の範囲であり得る。好ましい実施形態では、コピー数は、細胞あたり約６０，０００以下、任意選択で細胞あたり約５０，０００以下、または細胞あたり約４０，０００以下である。検出を促進するために、コピー数は、細胞あたり少なくとも１００、少なくとも１，０００、または少なくとも１０，０００であり得る。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり１，０００〜６０，０００個の範囲であってもよい。結合剤の表面提示の文脈におけるコピー数およびコピー数を決定する方法は、本明細書の他の箇所で考察される。
ライブラリは標的に露出され（例えば、ライブラリの結合剤を発現する細胞の懸濁液に標的を添加することにより）、結合剤を標的と接触させ、したがって、存在する場合は同種結合剤による標的の認識を可能にする。同種結合剤を表示する細胞は、標的に結合される。限られた濃度の標的を使用することにより、より高い親和性の結合剤が標的によって優先的に結合される。標的を認識しないか、またはより低い親和性を有する標的を認識する結合剤を表示する細胞は、より高い親和性の結合剤を表示する細胞と比較して、標的に結合しないか、細胞あたりの標的のより少ない分子を表示するだろう。次いで、標的に結合した細胞は単離され、それにより、同種結合剤を提示する細胞について富化された細胞の集団を選択することができる。
選択手順は、選択のストリンジェンシーを次第に増加させ、より高い親和性のクローンについて富化の程度を増加させるために、標的の濃度を減少させることを使用して任意選択で繰り返され得る。高親和性結合剤についてのさらなる富化の前に、変異は、変異型を生成するために選択された集団の結合剤に導入され得る。派生ライブラリの生成は、本明細書の他の場所に記載される。
使用される標的の濃度は、方法により単離されることが求められている結合剤の相互作用のＫｄ未満であり得る。
次いで、標的に対する所望の親和性を有する１つ以上のクローンは選択され、次いで任意選択でコードＤＮＡは回収され、結合剤は本明細書の他の場所に記載されるように、個々に培養された組換え細胞から発現され得る。
細胞上の低レベルの表面提示を達成するために、結合剤遺伝子は低レベルで発現され得、例えば、活性の弱いプロモーターに動作可能に連結されるか、または転写産物不安定性もしくは最適でないスプライシング、翻訳、表面への輸送、もしくは細胞表面上の保持の結果としてであり得る。誘導性プロモーターおよび他の制御可能な発現系は、本明細書の他の場所に詳細に記載される。例えば、例８ａまたは例８ｂを参照されたい。
ライブラリ
各々が結合剤をコードする組換えＤＮＡを含む細胞クローンのコレクションは、一緒にライブラリを形成する。ライブラリの多様性は、クローンによってコードされた異なる結合剤の数の関数である。創薬において、すべての所望の基準を満たす結合剤を特定する可能性を最大化するために、大きく多様なライブラリを提供することは有利である。ライブラリの各クローンは、本明細書の他の場所に記載されるように、結合剤をコードするＤＮＡを細胞ＤＮＡに組み入れて組換え細胞を形成することにより生成され得る。ＤＮＡは、各々が多様なレパートリーからの少なくとも１つの結合剤をコードする組換え細胞の集団を生成するために、並行して多くの細胞に導入され得る。ドナーＤＮＡの細胞ＤＮＡへの組入れ後、結果として生じた組換え細胞は、それらの複製を可能にするために培養され、各最初に産生された組換え細胞から細胞のクローンを生成する。したがって、各クローンは、ドナーＤＮＡが組み入れられた１つの元の細胞に由来する（例えば、部位特異的なヌクレアーゼによって、または本明細書に記載される他の方法によって創出される組入れ部位）。本発明に従うライブラリは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個のクローンを含むことができる。
本発明に一致するライブラリは、以下の特徴のうちの１つ以上を有することができる。
多様性。ライブラリは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９個の異なる結合剤をコードおよび／または発現することができる。様々な配列の結合剤がレパートリーを構成する。
均一な組入れ。ライブラリは、決まった遺伝子座で、または細胞ＤＮＡの限られた数の決まった遺伝子座で組み入れられたドナーＤＮＡを含むクローンからなることができる。したがって、ライブラリにおける各クローンは、好ましくは決まった遺伝子座でまたは決まった遺伝子座のうちの少なくとも１つでドナーＤＮＡを含む。好ましくは、クローンは、細胞ＤＮＡにおける１つまたは２つの決まった遺伝子座で組み入れられたドナーＤＮＡを含む。本明細書の他の場所で説明されるように、組入れ部位は、部位特異的ヌクレアーゼに対する認識配列であり得る。組換えＤＮＡを産生するためのドナーＤＮＡの組入れは、本明細書の他の場所に詳細に記載され、組入れ部位の数に応じて異なる結果を生成できる。ライブラリを生成するために使用される細胞において単一の潜在的な組入れ部位がある場合、ライブラリは、単一の決まった遺伝子座に組み入れられたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリであるだろう。したがって、ライブラリのすべてのクローンは、細胞ＤＮＡにおける同じ位置で結合剤遺伝子を含む。あるいは、複数の潜在的な組入れ部位がある場合、ライブラリは、複数のおよび／または異なる決まった遺伝子座で組み入れられたドナーＤＮＡを含むクローンのライブラリであり得る。好ましくは、ライブラリの各クローンは、第１および／または第２の決まった遺伝子座に組み入れられたドナーＤＮＡを含む。例えば、ライブラリは、ドナーＤＮＡが第１の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ドナーＤＮＡが第２の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ならびにドナーＤＮＡが第１および第２の決まった遺伝子座の両方で組み入れられるクローンを含むことができる。好ましい実施形態では、ライブラリにおけるクローンにおいて１つまたは２つの決まった遺伝子座しかないが、特定の用途のために望ましい場合、複数の遺伝子座でドナーＤＮＡを組み入れることが可能である。したがって、いくつかのライブラリでは、各クローンは、いくつかの決まった遺伝子座、例えば３、４、５、または６つの決まった遺伝子座のうちの任意の１つ以上で組み入れられたドナーＤＮＡを含むことができる。
別個の部位で組み入れられた結合剤サブユニットを含むライブラリについて、ライブラリのクローンは、第１の決まった遺伝子座で組み入れられた第１の結合剤サブユニットをコードするＤＮＡと、第２の決まった遺伝子座で組み入れられた第２の結合剤サブユニットをコードするＤＮＡと、を含み、クローンは、第１および第２のサブユニットを含む多量体結合剤を発現する。
均一な転写。ライブラリの異なるクローン間の結合剤の転写の相対レベルは、制御された数の遺伝子座で、および異なるクローンにおける同じ遺伝子座（決まった遺伝子座）で組み入れられるドナーＤＮＡにより、制御された限度内に保たれる。結合剤遺伝子の比較的均一な転写は、ライブラリにおけるクローン上またはクローンからの同等レベルの結合剤の発現につながる。ライブラリの細胞の表面上に表示される結合剤は、同じ細胞上に表示される他の結合剤と同一（同じアミノ酸配列を有する）であり得る。ライブラリは、各々が結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示する細胞のクローン、または細胞あたりの結合剤のレパートリーの複数のメンバーを表示するクローンからなることができる。あるいは、ライブラリは、結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示するいくつかのクローン、および結合剤のレパートリーの複数のメンバー（例えば、２つ）を表示するいくつかのクローンを含むことができる。好ましくは、ライブラリのクローンは、結合剤のレパートリーの１つまたは２つのメンバーを発現する。
例えば、本発明に従う真核細胞クローンのライブラリは、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９個の異なる結合剤のレパートリー、例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体断片を発現することができる。各細胞は、細胞ＤＮＡに組み入れられたドナーＤＮＡを含む。ドナーＤＮＡは、結合剤をコードし、ドナーＤＮＡが組み入れられる細胞の選択のための遺伝的要素をさらに含むことができる。ライブラリの細胞は、外因性の部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含むことができる。
ライブラリの細胞の表面上に表示される結合剤は、同じ細胞上に表示される他の結合剤と同一（同じアミノ酸配列を有する）であり得る。ライブラリは、各々が結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示する細胞のクローン、または細胞あたりの結合剤のレパートリーの複数のメンバーを表示するクローンからなることができる。あるいは、ライブラリは、結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示するいくつかのクローン、および結合剤のレパートリーの複数のメンバー（例えば、２つ）を表示するいくつかのクローンを含むことができる。したがって、本発明に従うライブラリは、結合剤のレパートリーの２つ以上のメンバーをコードするクローンを含むことができ、ドナーＤＮＡは、重複した決まった遺伝子座または複数の独立した決まった遺伝子座で組み入れられる。
対応するクローンが１つの結合剤のみを発現する場合、結合剤について対応するコードＤＮＡを特定することは最も簡単である。典型的には、ドナーＤＮＡの分子は、単一の結合剤をコードするであろう。結合剤は、多量体であり得、ドナーＤＮＡの分子は、多量体結合剤の様々なサブユニットに対応する複数の遺伝子またはオープンリーディングフレームを含む。
述べたように、本発明に従うライブラリは、少なくとも１００、１０３、１０４、１０５または１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個の異なる結合剤をコードすることができる。結合剤が多量体である場合、多様性は、結合剤の１つ以上のサブユニットによって提供され得る。多量体結合剤は、１つ以上の可変サブユニットを１つ以上の定常サブユニットと組み合わせることができ、定常サブユニットは、ライブラリのすべてのクローンにわたって同じ（またはより限定された多様性）である。多量体結合剤のライブラリを生成する際に、結合剤サブユニットの第１のレパートリーが結合剤サブユニットの第２のレパートリーのいずれかと対合することができる組み合わせ多様性が可能である。
本発明に従うライブラリのこれらおよび他の特徴は、本明細書の他の場所でさらに説明され、適切なライブラリならびにそれらの構築および使用のための方法の例は、ＷＯ２０１５／１６６２７２（Ｉｏｎｔａｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）にも示され、その内容は、本明細書に参照により組み込まれる。適切な遺伝子座は、細胞染色体へのコード化ＤＮＡの標的化組入れのために特定され得、そしていくつかの例は、当該技術分野で既知である。ＡＡＶＳ遺伝子座は、本明細書に例示されるように使用され得る。他の適切な組入れ部位は、ＲＯＳＡ２６、ＨＰＲＴおよびＦＵＴ８遺伝子座（例えば、ＣＨＯ細胞内）を含む。標的化された組入れは利点を有することができるが、ランダム組入れは、適切な代替手段であり、多くの状況で使用され得る。ヌクレアーゼ媒介性の標的化された組入れとは別に、表面発現ポリペプチドのライブラリを生成する方法は、真核細胞をポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトすること、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはトランズポゾンを使用すること、またはＦｌｐ、Ｂｘｂ２リコンビナーゼ、もしくはｐｈｉリコンビナーゼ部位などの内因性の潜在的リコンビナーゼ部位のようなゲノム的に埋め込まれたリコンビナーゼ部位を使用することを含む。これらまたは任意の他の技法によって創出されたライブラリは、本明細書に記載の方法で使用され得る。本発明は、他の真核細胞の不在下でのライブラリクローンの集団としての純粋な形態、または他の真核細胞と混合されたいずれかのライブラリに拡張する。他の細胞は、同じタイプの真核細胞（例えば、同じ細胞株）または異なる細胞であり得る。さらなる利点は、スクリーニングを促進または拡大するためか、または本明細書に記載のもしくは当業者には明らかであろう他の用途のために、本発明に従う２つ以上のライブラリを組み合わせるか、または本発明に従うライブラリを第２のライブラリもしくは細胞の第２の集団と組み合わせることにより、得られることができる。
本発明に従うライブラリ、ライブラリから得られた１つ以上のクローン、またはライブラリからの結合剤をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞は、細胞培養培地に提供され得る。細胞は、培養され、次いで濃縮されて便利な輸送または貯蔵のための細胞ペレットを形成することができる。
ライブラリは通常、インビトロで提供されるであろう。ライブラリは、培養培地に懸濁されたライブラリの細胞を含む細胞培養フラスコのような容器、またはライブラリを含む真核細胞のペレットまたは濃縮懸濁液を含む容器中にあり得る。ライブラリは、容器内の真核細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％を構成することができる。選択ステップは、混合培養におけるライブラリで実行され得、したがって、ハイスループットを促進する。
ライブラリのクローンの混合物を共培養する代わりに、各々をそれら自体の別個のフラスコまたは他の容器において個々にクローンを培養することが便利な場合があり得る。個々の培養物は、例えば、親結合剤が１つ以上の変異型（例えば、最大１０の変異体）を生成するために変異されており、本発明が親および／または相互に相対的な変異体の質を比較するために使用される場合などの、比較的少数のクローンが比較される場合に使用され得る。
本明細書に記載の選択方法は、ナイーブライブラリ、すなわち、親和性ベースの選択を受けていないライブラリに適用され得る。したがって、方法は、親和性ベースの選択を実行する前に、高い溶解度および／またはより低い非特異的結合を有するクローンについてのライブラリを富化する（逆に、低い溶解度および／またはより高い非特異的結合を呈するクローンにおいてライブラリを枯渇させる）ために使用され得る。次いで、より開発性のあるクローンについて「事前選択」されているそのようなライブラリは、目的の標的を使用して親和性ベースの選択を実行するのに非常に適している。親和性選択ステップにおいて得られたクローンは、開発性について事前スクリーニングされていないライブラリから選択されたクローンと比較して、良好な溶解度、高い臨界濃度、低い非特異的結合、および／または他の開発可能な質をより呈しそうである。
真核細胞
本発明に従う真核細胞は、好ましくは、１２×１０６塩基対（ｂｐ）のゲノムサイズを有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのものよりも大きいゲノムを有する細胞として本明細書に定義される高等真核細胞である。高等真核細胞は、例えば、２×１０７塩基対よりも大きいゲノムサイズを有することができる。これは、例えば、哺乳動物、鳥類、昆虫または植物細胞を含む。本発明の真核細胞は、好ましくは、細胞壁を欠く。好ましくは、それらは、酵母細胞または他の真菌細胞ではない。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、例えばマウスまたはヒトである。細胞は、初代細胞であり得るか、または細胞株であり得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体およびタンパク質発現に一般的に使用されるが、本発明において、任意の代替の安定した細胞株は、使用され得る。ＨＥＫ２９３細胞は、本明細書のいくつかの実施例において使用される。
哺乳動物細胞などの高等真核生物を使用する結合剤のディスプレイは、研究、診断、および治療用途のための抗体の製造が、典型的にはこれらの細胞で行われるため、利点を有する。同じ発現環境および同じ翻訳後修飾を呈する哺乳動物細胞で創薬を実行することは、最適な発現特性を有するクローンの早期特定を可能にするダウンストリーム製造についての潜在的な問題または利益のよりよい指標を与えるであろう。対照的に、細菌および酵母細胞は、高等真核生物のグリコシル化、発現、および分泌機構を完全に再現しない。したがって、哺乳動物細胞でのディスプレイは、将来の研究の使用または下流の製造についての影響を有する、より良い提示レベルまたは安定性特性を有するクローンを特定するのに役立ち得る。哺乳動物細胞の表面上に抗体の大規模なライブラリを表示する能力は、抗体開発の発見段階中に製造細胞株を使用する可能性を有する結合および提示特性について、数百万のクローンを直接スクリーニングすることを可能にするであろう。
ＣＨＯ細胞株は、１９５７年に最初に単離され６３、この細胞株の派生物は、治療用抗体の大部分の生産細胞株となっている６４。例えば、ハーセプチン（乳がんを治療するために承認された抗ＨＥＲ−２抗体）は、ＣＨＯ細胞における発現により、年間１メトリックトン超生産される。ＣＨＯ細胞は、ヒト細胞と比較して、それらがほとんどのヒト病原性ウイルスを増殖させないため、ヒトへの投与のための製品を製造するための利点を有する。加えて、それらはそれらのゲノムへの外来ＤＮＡの組入れを可能にし、迅速かつ頑健に成長する。生物物理学的特性、安定性薬物動態および免疫原性を含む抗体および他のポリペプチド結合剤の特性は、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体などの細胞の分泌経路内で獲得されるグリコシル化６５などの翻訳後修飾によって影響され得る。ここでは、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸などの単糖単位は、特定のアミノ酸に共有結合する。「Ｏ連結型」または「Ｎ連結型」グリコシル化は、セリンもしくはスレオニン残基の酸素原子に結合したグリカン、またはアスパラギン残基のアミド窒素原子に結合したグリカンのいずれかを指す。グリコシル化の複雑性は、線状または分岐のいずれかであるグリコシル化と、単糖単位内の様々な位置でのグリコシド結合（例えば、αまたはβ）の原子位置および立体構造によって導入され得る。抗体グリコシル化プロファイルの正確な性質は、発現のために使用される宿主細胞株によって影響され得る６５。したがって、抗体および治療用タンパク質のスクリーニング中に、最終生産細胞株に可能な限り近い宿主細胞株において組換えタンパク質を生産することは、有利である。これにより、スクリーニングされるポリペプチドの翻訳後修飾、および、したがってそれらの特性が、それらの大規模製造中に取得されるであろうものと同一または可能な限り類似することが保証される。ヒト治療用抗体の大部分がＣＨＯ細胞で産生されるため、したがってＣＨＯ宿主細胞株において高等真核生物ディスプレイを実施することは有利。実施例１２は、ＣＨＯ細胞ライブラリにおける候補ポリペプチド薬物の開発性ベースの選択を実証する。
本発明の方法および使用において、一般に、複数の細胞クローンは、任意選択で、単一の容器内の同じ培養培地において一緒に培養された、少なくとも１０００個のクローンのライブラリであり得る。それは、ナイーブライブラリ、すなわち、標的への結合するための選択を以前に受けていない結合剤のレパートリーをコードするものであり得る。このことは多くの場合、初期段階の発見における場合となるであろうが、標的への結合についての選択の１つ以上の以前のラウンドの結果である結合剤のレパートリーをコードするライブラリを使用することが望ましくあり得る。例えば、ファージディスプレイライブラリの選択出力は、真核細胞ライブラリに導入され得る。
本発明は哺乳動物細胞を特に参照して本明細書に記載され、哺乳動物細胞は、実施例において本発明を例示するために使用された。しかしながら、文脈が別途必要としない限り、他の高等真核細胞が代わりに使用され得ることが理解されるべきである。例えば、昆虫またはニワトリ細胞が、使用され得る。
結合剤
本発明に従う「結合剤」は、結合分子であり、別の分子の特異的結合パートナーを表す。特異的結合パートナーの典型的な例は、抗体−抗原および受容体−リガンドである。本発明の多くの原理は、酵素、補因子、凝固因子およびそれらの阻害剤、補体因子およびそれらの阻害剤など、古典的に「結合剤」とみなされ得ないポリペプチドに拡張する。多くの場合、そのようなポリペプチドは、大規模に生産することおよび／または高濃度で提供することが望ましい候補臨床薬物を表す。したがって、それらの開発性の質は、重要な検討事項である。例えば、第ＶＩＩＩ因子は血友病において使用されるが、検討すべき開発性の問題を有する。開発性に関する本発明の態様は、すべてのそのようなポリペプチドに適用され得る。したがって、文脈が別途必要としない限り、本発明が、抗体のような古典的な特異的結合分子に限定されると解釈されるべきではなく、一般に、１つ以上の他の分子と相互作用するように設計されたポリペプチドに拡張すると理解されるべきである。
本発明は、細胞においてコードＤＮＡから発現され、任意選択で、切断、グリコシル化などのような翻訳後修飾を受けるポリペプチド、すなわちアミノ酸のポリマーである結合剤に関する。結合剤は、およそ、例えば、１０〜３０アミノ酸の短いペプチドを含むことができる。結合剤はまた、より長いポリペプチドであり得、任意選択で複数のサブユニットを含むことができる。
結合剤は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト起源のポリペプチドを含む。結合剤は、ヒト抗体（任意選択で、ヒト抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））、ヒトＴＣＲまたは他の受容体、または他のヒトポリペプチドを含むことができる。結合剤は、可溶性ペプチドまたはポリペプチド（例えば、サイトカイン、ケモカイン、補体タンパク質または補体調節因子、酵素（産業使用のための酵素を含む）、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子）であり得る。結合剤は、哺乳動物（例えば、ヒト）膜タンパク質であり得、または１つ以上のＴＭドメインまたは他の膜アンカーを含むように操作された可溶性哺乳動物（例えば、ヒト）タンパク質／ペプチドであり得る。結合剤は、天然の天然型ポリペプチドであってもよく、または（頻繁に）合成変異型であろう。例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのライブラリは、ヒト第ＶＩＩＩ因子と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）を有する結合剤を含むことができる。
ライブラリによってコードされた結合剤のレパートリーは、通常、共通の構造を共有し、１つ以上の多様性の領域を有するであろう。したがって、ライブラリは、ペプチドまたはｓｃＦｖ抗体分子などの分子の所望の構造クラスのメンバーの選択を可能にする。したがって、本発明に従う結合剤のライブラリまたは集団において、結合剤ポリペプチドは、共通の構造（例えば、任意選択で、非常に類似したまたは同一のアミノ酸配列の領域−「定常領域」を含む、関連する二次および／または三次構造）を共有し、アミノ酸配列多様性の１つ以上の領域−「可変領域」を有することができる。
このことは、抗体のレパートリーを検討することによって例示され得る。これらは、それらの配列の１つ以上の領域が異なる、共通の構造クラス、例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−ＦｃまたはｓｃＦｖの抗体であり得る。抗体は、典型的には、主に抗原認識に関与する領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）において配列のばらつきを有する。本発明における結合剤のレパートリーは、１つ以上のＣＤＲにおいて異なる抗体分子のレパートリーであり得、例えば、６つすべてのＣＤＲ、または重鎖ＣＤＲ３および／もしくは軽鎖ＣＤＲ３などの１つ以上の特定のＣＤＲがあり得る。
抗体および他の結合剤は、本明細書の他の場所でより詳細に説明される。しかしながら、本発明の可能性は、抗体ディスプレイを超えて、受容体、リガンド、個々のタンパク質ドメインおよび代替タンパク質足場を含むペプチドまたは操作されたタンパク質のライブラリのディスプレイを含むように拡張する６６〜６８。例は、ＤＡＲＰｉｎおよびリポカリン、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）およびアドヒロン（ａｄｈｉｒｏｎ）などの単量体結合ドメインを有するポリペプチドである。本発明は、複雑な多量体結合剤とともにも使用され得る。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴ細胞上で発現され、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子と複合体で提示されるペプチドを認識するように進化している。ＴＣＲのレパートリーをコードおよび発現するライブラリは、生成され、ＭＨＣペプチド複合体への結合を特定するためにスクリーニングされ得る。
多量体結合剤について、結合剤をコードするドナーＤＮＡは、１つ以上のＤＮＡ分子として提供され得る。例えば、個々の抗体のＶＨおよびＶＬドメインが別個に発現される場合、これらはドナーＤＮＡの別個の分子上でコードされ得る。ドナーＤＮＡは、複数の組入れ部位で細胞ＤＮＡに組み入れられ、すなわち、１つの遺伝子座でＶＨに対する結合遺伝子、および第２の遺伝子座でＶＬに対する結合遺伝子である。別個の結合剤サブユニットをコードするドナーＤＮＡを導入する方法は、本明細書の他の場所および参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／１６６２７２（Ｉｏｎｔａｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）にさらに詳細に説明される。あるいは、多量体結合剤の両方のサブユニットまたは部分は、決まった遺伝子座に組み入れるドナーＤＮＡの同じ分子にコードされ得る。
結合剤は、抗原結合部位を含む抗体または非抗体タンパク質であり得る。抗原結合部位は、フィブロネクチンやシトクロムＢなどのような非抗体タンパク質足場上のペプチドループの配置の手段によって、またはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化または変異させることによって、所望の標的へ結合を付与するよう提供され得る。（Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６６９、７０、抗体模倣体のタンパク質足場は、発明者が少なくとも１つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣体）を説明するＷＯ／００３４７８４に開示される。１つ以上のペプチドループ、例えば、抗体ＶＨ ＣＤＲループのセットを移植するための好適な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。
非抗体タンパク質足場における抗原結合部位の使用は、以前にレビューされている（Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）。典型的なものは、安定した骨格および１つ以上の可変ループを有するタンパク質であり、アミノ酸配列のループまたはループが特異的またはランダムに変異して、標的抗原に結合することを示す抗原結合部位を創出する。そのようなタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、第１０のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）およびリポカリンを含む。他のアプローチは、例えば、「ノッチン」およびシクロチド足場に基づく小さな制約されたペプチドを含む７１。特にジスルフィド結合の正しい形成に関連して小さなサイズおよび複雑性を考えると、これらの足場に基づく新規結合剤の選択のために真核細胞の使用は利点があり得る。これらのペプチドの一般的な機能を考えると、これらの足場に基づく結合剤のライブラリは、イオンチャネルとプロテアーゼをブロッキングする際に特定の用途を有する小さな高親和性結合剤を生成することに有利であり得る。ＷＯ２０１７／１１８７６１（Ｉｏｎｔａｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、各々がシステインリッチタンパク質のようなドナー多様性骨格ドメインを含む融合タンパク質を含み、抗体定常または可変ドメインなどのレシピエント多様性骨格ドメイン内に挿入された結合メンバーのライブラリを説明した。ＷＯ２０１７／１１８７６１に記載されるようなそのような結合剤およびライブラリは本発明において使用され得、文献は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に従う結合剤は、抗体可変ドメイン内に挿入されたシステインリッチタンパク質を含む「ノットボディ（ｋｎｏｔｂｏｄｙ）」である。本明細書の実施例１５を参照されたい。
抗体配列および／または抗原結合部位に加えて、結合剤は、他のアミノ酸を含むことができ、例えば、折り畳みドメインなどのペプチドまたはポリペプチドを形成するか、または抗原に結合する能力に加えて、別の機能的特徴を分子に付与する。結合剤は、検出可能な標識を担持することができるか、または毒素または標的化部分または酵素に（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）複合体化され得る。例えば、結合剤は、抗原結合部位と同様に触媒部位（例えば、酵素ドメインにおける）を含むことができ、抗原結合部位は、抗原に結合し、したがって、触媒部位を抗原に標的化させる。触媒部位は、例えば切断により、抗原の生物学的機能を阻害することができる。
任意選択で、ライブラリの結合剤は、熱安定性（例えば、融解温度によって決定される）が結合剤の溶解度または溶液中での自己会合に対する耐性を予測しないポリペプチドの集団である。熱安定性と溶液中の溶解度／自己会合に対する耐性との間のこの無相関は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの溶解度または臨界濃度を有するライブラリにおけるすべての結合剤を検討する際に適用することができる（本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法）。それは、少なくとも１０３、細胞あたり少なくとも１０４、細胞あたり少なくとも１０５、または細胞あたり少なくとも１０６個の表面提示を有するすべての結合剤を検討する際に適用することができる（本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法、例えば、ＦＡＣＳゲーティング）。任意選択で、それは、ライブラリにおける表面発現結合剤の総集団を検討する際に適用することができる。
抗体
抗体は、好ましい結合剤である。それらは、４つのポリペプチド鎖−２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を有する、抗体全体または免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。重鎖および軽鎖はペアを形成し、各々が抗原結合部位を含むＶＨ−ＶＬドメインペアを有する。重鎖および軽鎖は、定常領域、軽鎖ＣＬ、ならびに重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および時にはＣＨ４も含む。２つの重鎖は、柔軟なヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている。抗体分子は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むことができる。
抗体分子の最も一般的な天然形式は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖からなるヘテロ四量体であるＩｇＧである。重鎖および軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって安定化された４本鎖逆平行ベータシートおよび３本鎖逆平行ベータシートからなる保存された二次構造を有するモジュラードメインで構成される。抗体重鎖は、各々Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）および３つの比較的保存された「定常」免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有し、軽鎖は１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ジスルフィド結合は個々のドメインを安定化させ、共有結合を形成して安定した複合体において４つの鎖を結合する。軽鎖のＶＬとＣＬは重鎖のＶＨとＣＨ１に会合し、これらの要素は単独で発現されてＦａｂ断片を形成することができる。ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」とも呼ばれる）は、別のＣＨ２：ＣＨ３ペアと会合して、「Ｙ」の先端で重鎖および軽鎖からの可変ドメインを有する四量体Ｙ型分子を与える。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、エフェクター細胞との相互作用および免疫系内の補体構成要素に関与する。組換え抗体は、以前はＩｇＧ形式またはＦａｂｓ（ＶＨ：ＣＨ１の二量体および軽鎖からなる）として発現されていた。追加的に、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる人工構築物は、使用され得柔軟なリンカーをコードするＤＮＡと遺伝的に融合したＶＨおよびＶＬ断片をコードするＤＮＡからなる。
ＩｇＧは、治療用途のための抗体の好ましいクラスのうちの１つである。高等真核細胞、特に哺乳動物細胞を使用する利点は、ＩｇＧ形式での抗体で研究できることである。このことは、創薬およびスクリーニングがＩｇＧ製造のために使用される生産細胞型において直接実施されることを可能にする。
結合剤は、ヒト抗体分子であり得る。したがって、定常ドメインが存在する場合、これらは好ましくはヒト定常ドメインである。
結合剤は、抗体断片または１本鎖抗体分子などのより小さな抗体分子形式であり得る。例えば、抗体分子は、リンカーペプチドによって結合されたＶＨドメインおよびＶＬドメインからなるｓｃＦｖ分子であり得る。ｓｃＦｖ分子において、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬの相補性決定領域が一緒に抗原結合部位を形成するＶＨ−ＶＬペアを形成する。
抗体抗原結合部位を含む他の抗体断片は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片７２〜７４、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２価の断片が２つの連結されたＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されるｓｃＦｖ７５、７６（ｖｉｉｉ）二重特異性１本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合物（ＷＯ９４／１３８０４、７７）によって構築された多価または多重特異断片である二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化され得る７８。
例えばＦａｂ２、Ｆａｂ３、二重特異性抗体、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（小さな免疫タンパク質）を含む、１つ以上の抗体抗原結合部位を含む様々な他の抗体分子が操作されている。抗体分子およびそれらの構築および使用のための方法は、説明されている７９。
結合フラグメントの他の例は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で数個の残基の添加だけＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’であるＦａｂ’−ＳＨである。
ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の小さな単量体抗原結合断片、つまり抗体の重鎖または軽鎖の可変領域である。ＶＨ ｄＡｂは、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ）において自然に発生し、ラクダ科を標的抗原で免疫化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることにより産生され得る。ｄＡｂは、細胞培養物においても産生可能である。それらの小さなサイズ、良好な溶解度および温度安定性は、それらを特に生理学的に有用で選択および親和性成熟に適するようにする。ラクダ科ＶＨ ｄＡｂは、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）」の名前で治療用のために開発されている。
合成抗体分子は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．またはＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌにより説明されるように、好適な発現ベクター内で合成され組み立てられたオリゴヌクレオチドの手段により生成された遺伝子からの発現により創出され得る８０、８１。
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる可変領域が同じ分子において組み合わされる第２世代のモノクローナル抗体を形成する６３。それらの使用は、新しいエフェクター機能を動員する能力、または腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的化するそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方において実証されている。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法で製造され得る、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製される従来の二重特異性抗体であり得るか、または上記の二重特異性抗体断片のいずれかであり得る８２。これらの抗体は、化学的方法８３、８４または体細胞方法８５、８６）によって、しかし同様に優先的に、ヘテロ二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）が強制されることを可能にし、したがって求められる抗体の精製のプロセスを促進する遺伝子工学技法によって得られる８７。二重特異性抗体の例は、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインが使用されて短い柔軟なペプチドを介して直接され得るＢｉＴＥ（商標）技術のものを含む。これは、短い単一のポリペプチド鎖上で２つの抗体を組み合わせる。二重特異性抗体およびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用し、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減してＦｃ領域なしで構築され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、結合剤は二重特異性抗体であり、それらのコードクローンは２つの異なる抗体重鎖および任意選択で２つの異なる抗体軽鎖または好ましくは共通の軽鎖を含む。成功した重鎖間のヘテロ二量体ペアリングは、二重特異性抗体の細胞表面提示をもたらし、各抗体は重鎖のヘテロ二量体ペアを含み、任意選択で、各重鎖は軽鎖、任意選択で、共通の軽鎖と対合する（すなわち、各重鎖とペアになった軽鎖は同じアミノ酸配列を有する）。Ｆｃ領域が含まれる場合、本発明は、ヘテロ二量体化を改善することができるＦｃ配列変異型を評価するために使用され得る。Ｆｃ領域がヘテロ二量体化を改善するように操作されていた以前の研究では、開発性プロファイルは、変化によって損なわれた６７。本発明は、それらのヘテロ二量化の可能性とともに、そのような変異型を開発性（例えば、溶解度および多重特異性）についてスクリーニングする機会を提供する。
二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、二重特異性抗体として、または他に二重特異性ｓｃＦｖとして構築され得る。さらに、２つの二重特異性抗体は、四価抗体を形成するために当該技術分野で既知の日常的な方法を使用して連結され得る。
二重特異性完全抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは対照的に、二重特異性二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉａｂｏｄｙ）は、特に有用でもあり得る。適切な結合特異性の二重特異性抗体（および抗体断片のような多くの他のポリペプチド）は、容易に選択され得る。二重特異性抗体の一方のアームが、例えば、目的の抗原に対して指向した特異性で一定に保たれる場合、他方のアームが変更されて適切な特異性の抗体が選択されるライブラリが作製され得る。二重特異性完全抗体は、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，（１９９６））に説明されるような代替的な工学的手法によって作製され得る。
二重特異性抗体の代替的な形式は、ＣＨ３のループ領域が抗原結合部位を提供するように操作されている免疫グロブリンを含むｍＡｂ２（「ｍＡｂ二乗」）分子を含む（例えば、ＷＯ２００６０７２６２０、ＷＯ２００８００３１０３、ＷＯ２００８００３１１６を参照されたい）。修飾されたＣＨ３領域は、Ｆｃａｂと称される。１つの結合特異性はＦｖ領域の抗体抗原結合部位によって提供され、異なる結合特異性（またはさらなる原子価）はＦｃａｂにおける結合部位によって提供される。
本発明に従うライブラリは、目的の１つ以上の抗原に結合する抗体を選択するために使用され得る。ライブラリからの選択は、本明細書の他の場所で詳細に説明される。選択後、抗体は異なる形式へと設計され、および／または追加的な機能を含むように設計され得る。例えば、選択された抗体は、上に記載される抗体形式のうちの１つなどの異なる形式に変換され得る。選択された抗体、および選択された抗体分子のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを含む抗体は、本発明の態様である。抗体およびそれらのコード核酸は、単離された形態で提供され得る。
抗体断片は、酵素、例えば、ペプシンまたはパパインによる消化などの方法により、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、抗体分子から出発して得られることができる。別の様式では、抗体断片は、当業者に周知の遺伝的組換えの技術によって、または、他に、例えば、自動ペプチド合成機の手段によるペプチド合成によって、もしくは核酸合成および発現によって得られることができる。
モノクローナルおよび他の抗体を取り、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはＣＤＲをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域に導入することを伴うことができる。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００、および多数のその後の文献を参照されたい。
抗体分子は、ライブラリから選択され、次いで修飾され得、例えば、抗体分子のインビボ半減期は、化学的修飾、例えばＰＥＧ化により、またはリポソームへの取り込みにより増加され得る。
結合剤は、任意選択で、１つ以上の相補性決定領域において配列多様性を呈する抗体可変ドメインを含むことができる。結合剤はまた、またはあるいは、任意選択で配列多様性を呈する抗体定常領域またはＦｃ領域を含むことができる。Ｆｃ領域の機能は、以下でさらに説明される。
ＦＣ領域
結合剤は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドであり得る。結合剤は、Ｆｃ領域を含む、抗体、ノットボディまたは他のポリペプチド、任意選択で融合タンパク質であり得る。Ｆｃ領域は、結合剤の定常領域であり得るか、またはそれを含み得、すなわち、ライブラリの結合剤間で比較した場合、非常に類似したまたは同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの場合において、抗体の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ領域、またはＣＬもしくはＣＨ１ドメイン）は、可変アミノ酸配列であり得るか、またはそれを含むことができ、したがって、ライブラリにおける結合剤のレパートリーにわたって配列多様性を呈する。配列多様性は、任意選択で、ＦｃのＣＨ３ドメインにあり得る。例えば、結合剤は、Ｆｃａｂの結合ループがライブラリにおいて多様であるＦｃａｂまたはｍＡｂ２を含むことができる。ｍＡｂ２は、多様なＦｃａｂ領域およびＦｖ領域の非変異型（ｎｏｎ−ｖａｒｉａｎｔ）または多様な抗原結合部位のいずれかを含むことができる。結合剤のアミノ酸配列の多様性は、Ｆｃ領域に制限され、任意選択でＣＨ３ドメインに制限され得る。
本発明のディスプレイライブラリを使用して、Ｆｃドメインのライブラリは、改変された機能および開発性の基準について、任意選択で同時にスクリーニングされ得る。
様々な工学アプローチは、Ｆｃドメインとその相互作用パートナーとの相互作用を操作するために取られている。例えば、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」アプローチは、細胞からの共発現（または共培養細胞におけるそれらの発現）が主に２つの変異型Ｆｃｓドメイン間のヘテロ二量体形成をもたらすように２つの対合したＦｃ配列を修飾し、このことは二重特異性抗体の生成において有利である。残念ながら、そのような変異は、開発性に対する影響を有することができる８８。本発明は、開発性の可能性について、候補「ノブイントゥホール」変異を含むＦｃドメインを含むＦｃ変異型を評価するために使用され得る。
Ｆｃエンジニアリングは、Ｆｃガンマ受容体との親和性または特異性を改変するため、例えば、低下したＦｃガンマ受容体相互作用で「ヌル変異型」を創出するためにも使用されている。抗体定常ドメインの変異と、所望の結合品質を有する変異型の選択は、安定性と製造性を低下させることができる。さらにまた、本発明は、変異型Ｆｃドメインのライブラリを評価して、改善された特性を有するものについて富化するために使用され得る。
修飾は、半減期を正または負に修飾する目的で、ＦｃのＦｃＲｎとの相互作用を増加または減少するためにもなされている８９。例えば、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（いわゆる「ＹＴＥ変異」）の変異のトリプレットは、半減期を延長し、投与頻度とコストを低下させる増加したＩｇＧ半減期を有する。
Ｆｃドメインへの変異の導入が、凝集および乏しい開発性の低下につながり、変異型の生物物理学的特性に対する有害な影響も有することが理解される。例えば、Ｂｏｒｒｏｋ ｅｔ ａｌ（２０１７）９０は、ＦｃＲｎとの相互作用に影響する変異および他のＦｃ受容体との相互作用に影響する変異をレビューする。彼らは、半減期を増加させる変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、いわゆる「ＹＴＥ変異」）を組み合わせた抗体およびＣＨ２ドメインのＦｃガンマ受容体との相互作用を低下させる抗体（Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、いわゆるＴＭ変異体）９０を組み合わせる抗体を説明する。野生型と比較して、このＴＭ−ＹＴＥ変異体は、低下した熱安定性、より高い立体構造柔軟性、増加した自己会合が増加し、より乏しい溶解度およびより乏しい凝集プロファイルを有した。候補変異を選択することにより、彼らは、延長した半減期ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞毒性および補体依存性細胞毒性活性の欠乏を保持した一方で、有意に改善した立体構造およびコロイド安定性を有する新しいＦＱＱ−ＹＴＥ変異型（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｑ／Ｋ３２２Ｑ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を創出することができた。
本発明は、自己凝集または低い特異性などの開発性基準とともに、Ｆｃドメインの改変された結合特性について多数の変異型を同時にスクリーニングする機会を提供する。したがって、本発明の様々な実施形態では、結合剤は、例えば、ＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基において、配列多様性を提示するＦｃ領域を含むことができる。Ｆｃドメイン外の１つ以上の可変領域（例えば、抗体重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン）において配列多様性を呈し、任意選択で不変配列の定常Ｆｃドメインを有する結合剤は、スクリーニングされ得る。ＦｃＲｎ相互作用に対する可変領域配列の効果を特定するためにスクリーニングされ得る（実施例９を参照されたい）。そのような効果は、例えば、可変領域の受容体への直接結合を欠く場合、分子の立体構造に影響するか、さもなければより遠くの結合に影響する、間接的なものであり得る。
ポリペプチドのＦｃＲｎ結合特性についてのスクリーニングは、創薬に組み入れられ得る。方法は、配列変異型のライブラリ内の最適なｐＨ依存性ＦｃＲｎ相互作用について選択することを含むことができる。本明細書に記載されるのは、ＦｃＲｎとのそれらの相互作用の性質に起因する延長または低下したインビボ半減期を有する結合剤を特定または選択する方法である。
本発明に従う方法は、
Ｆｃドメインを含む結合剤をコードするＤＮＡを各々が含む複数の真核細胞（例えば、哺乳動物）細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
ＦｃドメインによるＦｃＲｎの認識を可能にする低ｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）または中性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）でＦｃＲｎ受容体にクローンを露出させることと、
より高いｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）で溶出し、より高いｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）での結合と比較して約ｐＨ６．０でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する１つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
選択されたクローンは、溶出画分から得られることができる。溶出されたクローンの結合剤は、インビボでの延長した半減期を有するものとして特定され得る。
あるいは、より高いｐＨへの切り替え後に保持される結合剤は、例えば、低下した半減期のためまたは「掃引抗体」アプローチでの使用のために、より高いｐＨで保持された結合が望まれる場合に収集され得る３２。そのような場合、方法は、
Ｆｃドメインを含む結合剤をコードするＤＮＡを各々が含む複数の真核細胞（例えば、哺乳動物）細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
ＦｃドメインによるＦｃＲｎの認識を可能にする低ｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）でＦｃＲｎ受容体にクローンを露出させることと、
より高いｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）で洗浄し、より高いｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）での結合と比較して約ｐＨ６．０でより低いまたは類似の親和性結合を呈する結合剤を発現する１つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
選択されたクローンは、より高いｐＨの洗浄では溶出されない保持された画分から得られることができる。そのようなクローンは、ｐＨ７．４超またはｐＨ６未満のより極端なｐＨで溶出され得る。より低いｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）でのより高い親和性結合は、選択中にそのｐＨで使用されるＦｃＲｎの濃度を低下させ、それにより選択のストリンジェンシーを増加させることによって選択され得る。
２つのｐＨ間の親和性のより大きな差を呈する結合剤は、これらが最大半減期の延長を示すことができるため、優先的に選択され得る。逆に、より短い半減期が求められる場合、２つのｐＨ間のＦｃＲｎに対する親和性のより小さい差がある（または有意差がない）結合剤を発現するクローンを選択するであろう。したがって、方法は、より短いまたはより長い半減期についていずれかを選択するように適合され得る。したがって、クローンの集団は、所望の半減期を有する結合剤を発現するクローンについて富化される。
ビオチン化ＦｃＲｎへの結合は、結合が発生していることを確認するためにｐＨ６．０で行われ得、溶出した試料は、増加するｐＨの緩衝液で洗浄した後収集され得る。あるいは、蛍光標識の保持または消失の選択は、フローソーティングを使用して行われ得る。ｐＨ勾配溶出法と組み合わせたＦｃＲｎベースのアフィニティクロマトグラフィー法は、抗体を特徴付けることについて説明されている９１。そのような方法は、細胞上に表示された抗体変異型のライブラリとともに使用され得、そこでは、所望のｐＨ依存性結合特性を有するクローンが収集され得、抗体遺伝子が回収され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、結合剤の表面提示のレベルを決定するために抗Ｆｃ検出剤を使用する。そのような薬剤は、多様性が検出可能な薬剤の結合に影響しない限り、Ｆｃ配列の多様性を有する結合剤と関連して依然として使用され得、例えば、結合剤が共通の配列を共有するＦｃの領域に検出剤が結合することが保証され得る。代替的な実施形態では、結合剤は、配列多様性を呈しないＦｃ領域を含む。
細胞培養および結合剤発現
目的の標的に対するスクリーニングおよび／または開発性の特徴のための結合剤のレパートリーを提供するために、ライブラリは、培養されてコードＤＮＡから結合剤を発現することができる。議論されたように、結合剤は、膜貫通ドメイン、膜アンカーを含むことができるか、または細胞外ディスプレイのために膜結合パートナー分子と会合することができる。結合剤の発現のために細胞を培養することは、一般に、適切な培養培地において、任意選択で懸濁培養において、および細胞の増殖の助けになる温度（例えば、哺乳動物細胞については３７℃）でインキュベートすることを伴うであろう。コードＤＮＡからのポリペプチド結合剤の発現は、プロモーター（および任意選択でエンハンサーなどの他の要素）の制御下で開始され、結合剤の表面提示は、しばらくすると観察され始め、例えば、１２時間以内に検出可能になるはずであるが、結合剤の提示が細胞表面上の最終濃度または平衡濃度に達するには、より長い期間（例えば、２４時間または４８時間）が必要とされ得る。
プロモーター
本発明に従う細胞において、結合剤をコードするＤＮＡは、発現のためのプロモーターに動作可能に連結されている。異種プロモーターは使用され得、これは、それが天然にコードＤＮＡと関連するプロモーターではないことを意味し、例えば、抗体をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンからのプロモーター以外のプロモーターに動作可能に連結され得る。プロモーターを細胞ＤＮＡに任意選択でシスで（結合剤をコードする配列と同じドナーＤＮＡに）組み入れることは一般的に便利であるが、代替案は組み入れられた結合剤ＤＮＡを宿主細胞に内在するプロモーターから発現させることである。
結合剤をコードするＤＮＡの発現が強力なプロモーター、例えば、発現が最大限に誘導されている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある場合、高レベルの結合剤提示は、達成され得る。逆に、結合剤をコードするＤＮＡの発現が活性の弱いプロモーター、例えば、発現が最小限に誘導されているか、または基礎レベルの活性のみを示す弱いプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある場合、低レベルの結合剤提示は、達成され得る。プロモーターの強度は、レポーター遺伝子を使用して定量化され得、レポーターの発現、例えば、ＧＦＰの発現のレベルは、定量化され得る蛍光として検出され得る。活性の弱いまたは弱いプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーターと比較して、例えば、活性が十分なまたは構成的プロモーターの活性の約１〜１０％を示すことができる。
結合剤の細胞表面提示を制御するための便利な方法は、細胞における結合剤コードＤＮＡに動作可能に連結された誘導性プロモーターを提供することである。テトラサイクリン誘導性プロモーターは好適であり、これらの様々なものが利用可能である。Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、第１世代のｒｔＴＡタンパク質を説明した（ＥＰ０８０４５６５およびＧｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５９２）。ＶＰ１６活性化ドメインは、特定のＤＮＡ結合のためにある特定のテトラサイクリン（Ｔｃ）誘導体を必要とする転写トランス活性化因子「ｒｔＴＡ」を生成するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの変異体Ｔｅｔリプレッサーと融合された。ドキシサイクリンはこの系において誘導因子であり、遺伝子発現がｒｔＴＡの制御下にある培養細胞へのその添加は、誘導性プロモーターからの発現において１０００倍の増加を受けることができる。ｐＴｉｇｈｔまたはＰｔｅｔ−１４という名前の第２世代の「ＴｅｔＯ／ＣＭＶ」プロモーターは、最適化された７ ＴｅｔＯ間隔と、低下した基本発現レベルを呈する切断された最小ＣＭＶプロモーターで設計された（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｌｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００３，１８（３）：１３−１４）。プロモーター配列は、以下のとおりである。
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣ
この誘導性プロモーター、または様々な他の調節可能なプロモーターは、本発明において結合剤提示レベルを制御するために使用され得る。ＤＮＡ結合ドメインが、タンパク質立体構造変化またはＤＮＡ認識配列に対する親和性の変化をもたらす誘導因子分子に結合することができるタンパク質ドメインに融合される場合、任意の誘導性系が採用され得る。このことは、タンパク質発現につながる転写の抑制解除または活性化のいずれかをもたらすであろう。例えば、Ｔ−Ｒｅｘまたはクメート（ｃｕｍａｔｅ）スイッチ系の場合、誘導因子のリプレッサータンパク質への結合は、ＤＮＡ結合の消失および転写の抑制解除をもたらす。あるいは、転写活性化ドメイン融合タンパク質に融合したＤＮＡ結合ドメインへの誘導因子の結合は、Ｔｅｔ−ｏｎ９２、１１４またはＧＡＬ４ ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系１２１の場合のように、ＤＮＡ結合および転写因子の動員をもたらすであろう。
上記のテトラサイクリン誘導性プロモーター系は、１〜６へのＴｅｔＯ反復配列の数の減少１１８によって、またはｒＴＡタンパク質の修飾によってより調整可能な均一かつ滴定可能な誘導に変換可能であり得る。実施例８ｂは、改善された範囲の発現を達成した第３世代の誘導性ｔｅｔプロモーター系を説明する。詳細は図３７に例示される。代替的な誘導性発現系は、クメートスイッチ１１９、Ｔ−Ｒｅｘ１２０またはＧＡＬ４系１２１を含み採用もされ得る。
結合剤およびコード核酸の回収
ライブラリから目的の結合剤またはクローンの選択後、一般的な次のステップは、結合剤をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離、特定、および／または増幅することである。任意選択で、結合剤をコードする核酸を修飾すること、例えば、結合剤を再構築すること、および／またはコード配列を異なるベクターに挿入することが望ましくあり得る。表示された結合剤をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、選択された細胞から回収され、発現ベクターにクローニングされ、コードされたポリペプチドは分泌形態でまたはディスプレイ用のいずれかで発現され得る。このことは、個々のクローンでなされ得る。
ライブラリを創出するために使用されるドナーＤＮＡ分子の集団が同じ配列の複数のコピーを含む場合、同じ結合剤をコードするＤＮＡを含む２つ以上のクローンが得られることができる。例えば、本明細書の他の箇所で詳述されるように、部位特異的ヌクレアーゼに対する２つ以上の認識配列がある場合、クローンが２つ以上の異なる結合剤をコードするドナーＤＮＡを含むことができる場合もあり得る。したがって、コード化または発現された異なる結合剤の数の点で、ライブラリの多様性は、得られたクローンの数とは異なり得る。
ライブラリにおけるクローンは、好ましくは、結合剤のレパートリーの１つまたは２つのメンバーをコードするドナーＤＮＡを含み、および／または好ましくは、結合剤のレパートリーの１つまたは２つのメンバーのみを発現する。細胞あたりの限定された数の異なる結合剤は、所与の標的に対してライブラリをスクリーニングする際に特定の特定された結合剤をコードするクローンおよび／またはＤＮＡを特定することに関すると、有利である。このことは、クローンが結合剤のレパートリーの単一のメンバーをコードする際に最も簡単である。しかしながら、ライブラリから選択されたクローンが少数の異なる結合剤をコードする、例えば、クローンが結合剤のレパートリーの２つのメンバーをコードできる場合、所望の結合剤に関連するコードＤＮＡを特定することも簡単である。本明細書の他の箇所で議論されるように、１つまたは２つの結合剤をコードするクローンは、２倍体細胞が重複した固定遺伝子座を各染色体コピーに１つずつ含むため、２倍体ゲノムにおいて染色体コピーあたり１回発生する部位特異的ヌクレアーゼに対する認識配列を選択することによって生成するのに特に便利であり、ドナーＤＮＡは、一方または両方の固定遺伝子座で組み入れることができる。したがって、ライブラリのクローンは、各々、結合剤のレパートリーの１つまたは２つのメンバーのみを発現することができる。
結合剤が抗体分子である場合、方法は、抗体分子をコードするＤＮＡをクローンの細胞から単離することと、少なくとも１つの抗体可変領域、好ましくはＶＨおよびＶＬドメインの両方をコードするＤＮＡを増幅することと、および抗体分子をコードするベクターを提供するためにＤＮＡをベクターに挿入することと、を含むことができる。定常ドメインを持つ多量体抗体分子は、可溶性分泌形式での発現のために１本鎖抗体分子に変換され得る。抗体は様々な形式で提示され得るが、抗体が選択された形式が何であれ、抗体遺伝子が単離されると、それをいくつかの異なる形式で再構成することが可能である。ＶＨまたはＶＬドメインが単離されると、それらは必要なパートナードメインを包含する発現ベクターに再クローニングされ得る。
選択された結合剤をコードするＤＮＡは、発現のために宿主細胞染色体に組み入れられ得る。組換えタンパク質の発現は、典型的には、その細胞で発現されるプロモーターの制御下で所望のタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入することを伴う。例えば、遺伝子は、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターの制御下にあり得、一般的に使用されるヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞に導入され得る。発現構築物を宿主細胞に導入するための標準的な方法は、周知である。分泌された可溶性タンパク質の産生のために、コードされた遺伝子の前に、コードされたタンパク質を小胞体に導くリーダー配列が続く。膜貫通ドメインが存在しない場合、コードされた遺伝子は、それが精製および濃縮され得る培養培地に分泌される。
本発明の任意の方法に従って、例えば、結合剤の発現のために安定的にトランスフェクトされた宿主細胞からの分泌後に、所望の結合剤は、溶液中で単離された形態で提供され得る。次いで、可溶性結合剤の特性は、その性能を確認するため、例えば、溶解度、自己会合、非特異的結合、ＦｃＲｎ相互作用などのような開発性特性を評価するため、または親和性を評価するため、試験され得る。これらの特徴の各々を決定するための適切なアッセイは、この文書の関連セクションに提供され、結合剤が所望の特性を呈する、および／または関連特徴の改善を示すこと、例えば、それが親分子と比較して改善されることを確認するために実行され得る。
結合剤の医薬製剤
本発明の方法を使用して得られた結合剤は、精製および／または単離された形態で提供され得、１つ以上の追加的な構成要素を含む組成物に製剤化され得る。組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤を含むことができる。例示的な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。インビボでの使用を意図される結合剤は、例えば注射用の液体（任意選択で、水溶液）において、患者への所望の投与経路のために製剤化され得る。様々な送達系が既知であり、結合剤を含む医薬組成物を投与するために使用され得る。投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む。組成物は、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、任意の便利な経路によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は全身的または局所的であり得る。
結合剤、またはそれを含む組成物は、薬瓶、注射器、静脈内容器または注射装置などの医療用容器に含まれ得る。実施例では、治療法における使用のための結合剤、パッケージングおよび説明書を含むキットが提供される。方法は、患者への皮下投与を含むことができる。
結合剤は、少なくとも（またはそれを超える）、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌの濃度で結合剤を含む組成物、任意選択で、水性緩衝溶液に製剤化され得る。結合剤は、５０〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、５０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度であり得る。
発現された組換えタンパク質を濃縮するための多くの方法は、当業者に既知であるが、カラムクロマトグラフィー（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）および限外濾過２７を含むことができる。
項
以下の番号付けされた項は、発明の陳述を表し、説明の部分である。
１．インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤の表面提示レベルを、溶液中の結合剤の溶解度および／またはそれらの自己会合に対する耐性の予測指標として使用すること。
２．培養細胞が、結合剤の多様なレパートリーを発現するディスプレイライブラリのクローンである、項１に記載の使用。
３．溶液中のより高い溶解度および／または自己会合のより低い傾向について結合剤をインビトロで選択するための高等真核細胞の培養ライブラリの使用であって、
ライブラリが、各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリであり、コードされた結合剤が、細胞表面に提示される、使用。
４．ディスプレイライブラリの培養高等真核細胞クローンの表面における結合剤の表面提示レベルが、溶液中の結合剤および／または自己会合に対するそれらの耐性の予測指標として使用される、結合剤発見方法。
５．結合剤を、それらの溶液中の溶解度および／または自己会合に対する耐性に従って区別およびランク付けし、溶液中でより高い溶解度および／または自己会合に対するより高い耐性を呈する結合剤を富化する方法であって、
（ｉ）各々が結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
（ｉｉ）結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
（ｉｉｉ）クローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
（ｉｖ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、
（ｖ）１つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および／または自己会合に対する耐性が良好であるものとして特定することと、任意選択で、選択されたクローンを、１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するために提供することと、を含む、方法。
６．結合剤が膜貫通ドメイン含有ポリペプチドである、項１〜３のいずれかに記載の使用、または項４もしくは項５に記載の方法。
７．クローン上での結合剤の表面提示レベルを、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することを含み、薬剤が結合剤の定常領域に結合し、任意選択で、結合剤がＦｃ領域を含み、薬剤がＦｃ領域に結合する、項４または項５に記載の方法。
８．細胞を、細胞上の結合剤の表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し、それにより、所定の閾値を上回る表面提示を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る表面提示を示す細胞が廃棄画分に選別される、項４〜７のいずれかに記載の方法。
９．廃棄画分が、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの臨界濃度を有する比較ポリペプチドを発現する細胞を含み、収集画分が、廃棄画分中の比較ポリペプチドよりも少なくとも１．５倍高い臨界濃度を有する結合剤を発現する細胞を含む、項８に記載の方法。
１０．選別が蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる、項８または項９に記載の方法。
１１．ステップ（ｉｉ）が、ライブラリのクローンを１つの容器内で混合物として培養することを含む、項４〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．ステップ（ｉｉ）が、ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、項４〜１０のいずれかに記載の方法。
１３．結合剤が親結合剤の配列変異型である、項４〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．親結合剤が、溶液中の溶解度または自己会合に対する耐性の改善が必要であると特定されている、項１３に記載の方法。
１５．方法が、親結合剤の配列変異型を生成することと、配列変異型をコードするＤＮＡを高等真核細胞の細胞ＤＮＡに組み入れて、結合剤をコードするＤＮＡを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、自己会合を促進し、かつ／または溶解度を低下させることが予測される１つ以上のアミノ酸残基を特定することと、１つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項１３または項１４に記載の方法。
１６．親結合剤が、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）中５０ｍｇ／ｍｌ未満の臨界濃度を有し、かつ／またはリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）中５０ｍｇ／ｍｌ未満の溶解限度を有し、
かつ／または方法が、１つ以上の選択されたクローンによりコードされた結合剤を、親結合剤のものよりも少なくとも１．５倍高い臨界濃度および／もしくは溶解限度を有すると特定することを含む、項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．結合剤の親水性を、細胞クローン上のそれらの表面提示レベルに基づいて予測すること、および／または１つ以上の選択されたクローンの結合剤を、より親水性であると特定することを含む、項４〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．結合剤を示す高等真核細胞のライブラリをスクリーニングして、インビボで哺乳動物において１つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化するインビトロの方法であって、
（ｉ）各々が結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
（ｉｉ）結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
（ｉｉｉ）結合剤を１つ以上の非標的分子に露出させて、結合剤と１つ以上の非標的分子との結合を可能にすることと、
（ｉｖ）１つ以上の非標的分子への結合がより大きい細胞を廃棄することと、
（ｖ）１つ以上の非標的分子への結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、方法。
１９．（ｉｉｉ）結合剤を、１つ以上の非標的分子を含むマトリックスに露出させて、マトリックスへの結合を可能にすることと、
（ｉｖ）マトリックスへの結合がより大きい細胞を廃棄することと、
（ｖ）マトリックスへの結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、項１８に記載の方法。
２０．非標的分子が、ＤＮＡ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シャンペロンタンパク質、ヒアルロン酸、またはグリコカリックスの１つ以上の構成要素を含む、項１８または項１９に記載の方法。
２１．非標的分子への結合が、低親和性非特異的結合である、項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．ライブラリのクローンを１つの容器内の混合物として培養し、混合物をマトリックスに露出させることを含む、項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
２４．結合剤が親結合剤の配列変異型である、項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．親結合剤が、１つ以上の非標的分子への結合の減少を必要とすると特定されている、項２４に記載の方法。
２６．方法が、親結合剤の配列変異型を生成することと、配列変異型をコードするＤＮＡを高等真核細胞の細胞ＤＮＡに組み入れて、結合剤をコードするＤＮＡを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、非特異的結合を促進することが予測される１つ以上のアミノ酸残基を特定することと、１つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項２４または項２５に記載の方法。
２７．親結合剤が、１つ以上の非標的分子への顕著な結合を呈する、項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．（ｉｉｉ）結合剤を、１つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズに露出させることを含む、項１８〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．結合剤発現細胞と１つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズとの相互作用を検出することを含む、項２８に記載の方法。
３０．ＡＣ−ＳＩＮＳを使用して粒子間距離を検出し、より大きい粒子間距離を呈する細胞により提示される結合剤を選択することを含む、項２９に記載の方法。
３１．１つ以上の非標的分子が検出可能に標識される、項１８に記載の方法。
３２．１つ以上の非標的分子が蛍光標識される、項３１に記載の方法。
３３．細胞を、１つ以上の非標的分子への結合レベルに従って、ＦＡＣＳにより収集画分と廃棄とに流動選別し、それにより、所定の閾値を上回る標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が廃棄画分に選別される、項３２に記載の方法。
３４．結合剤をコードするＤＮＡの発現が、強力なプロモーターの制御下にある、項４〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．プロモーターが構成的プロモーターである、項３４に記載の方法。
３６．プロモーターがＣＭＶプロモーターである、項３５に記載の方法。
３７．プロモーターが、発現が最大限に誘導された誘導性プロモーターである、項３４に記載の方法。
３８．項５〜１７のいずれかに記載の方法を後に行うことをさらに含む、項１８〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．項５〜１７のいずれかに記載の方法を最初に行うことをさらに含む、項１８〜３７のいずれかに記載の方法。
４０．標的に１つ以上の結合剤を選択する方法であって、
項５〜３９のいずれかに定義の方法を行うことを含み、
同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞が標的に結合した状態にするために、結合剤を標的に露出させることと、
同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
４１．（ｉ）結合剤の表面提示レベルと結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して表面提示がより高い同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
（ｉｉ）結合剤の表面提示レベルと非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して、表面提示がより高く、非特異的結合がより小さい結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
（ｉｉｉ）標的結合のレベルと結合剤による非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して非特異的結合がより小さい同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、を含む、項１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．所望の親和性を有する標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
（ａ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、結合剤が細胞表面に提示され、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ／または細胞あたり１００〜６０，０００個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
（ｂ）同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にするために、ライブラリを標的に露出させることと、
（ｃ）標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を示す細胞が富化された、選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
（ｄ）選択された細胞の集団を標的における１回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させることと、任意選択で
（ｅ）標的に対する所望の親和性を有する同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
４３．同種結合剤を示す細胞が富化された選択された細胞の集団を提供することと、その後、
高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ内の活性の強いプロモーターの制御下にある選択された細胞の集団からの結合剤コードＤＮＡを提供することと、
項５〜１７のいずれかに記載の方法を行うことと、を含む、項４２に記載の方法。
４４．項５〜１７のいずれか一項に定義の方法を行って、結合剤の表面提示がより高い選択されたクローンを提供することと、その後、
各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ中の活性の弱いプロモーターから結合剤を発現させることと、その後、
項４２に記載の方法を行うことと、を含む、項４２に記載の方法。
４５．標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
（ｉ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
（ｉｉ）ライブラリの細胞を、誘導性プロモーターの活性が弱い条件下で培養することと、
（ｉｉｉ）ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
（ｉｖ）同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
（ｖ）選択された細胞の集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の増加した発現のための条件下で培養することと、
（ｖｉ）複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
（ｖｉｉ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
４６．標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
（ｉ）各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
（ｉｉ）ライブラリを、誘導性プロモーターからの結合剤の強力な発現のための条件下で培養することと、
（ｉｉｉ）複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
（ｉｖ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈するクローンの集団を選択することと、
（ｖ）選択された集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の弱い発現のための条件下で培養することと、
（ｖｉｉ）ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
（ｉｖ）同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
４７．プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、項４２〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．標的が、蛍光標識などの検出可能な薬剤で標識される、項４２〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．方法が、細胞を、細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することを含み、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る結合した標的を示す細胞が廃棄画分に選別される、項４８に記載の方法。
５０．選別が蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる、項４９に記載の方法。
５１．１つ以上の選択されたクローンから、結合剤をコードするＤＮＡの配列を決定することと、
結合剤をコードする単離された核酸を提供することと、を含む、項５〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．１つ以上の選択されたクローンから、結合剤をコードするＤＮＡの配列を決定することと、
結合剤の可溶形態における分泌のための条件下、インビトロで、宿主細胞において、結合剤をコードするＤＮＡを発現させることと、をさらに含む、項５〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．分泌された結合剤が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの収量で得られる、項５２に記載の方法。
５４．結合剤を精製および／または濃縮して、結合剤の水溶液を少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度で得ることをさらに含む、項５２または項５３に記載の方法。
５５．濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍｌである、項５４に記載の方法。
５６．濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである、項５５に記載の方法。
５７．薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に結合剤を製剤化することを含む、項５２〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．任意選択で針および／または注射による組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書などの１つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、組成物を注射用の充填済みシリンジ中で提供することを含む、項５７に記載の方法。
５９．ＦｃＲｎと相互作用する結合剤を特定する方法であって、
Ｆｃドメインを有する異なる結合剤をコードするＤＮＡを各々含む複数の高等真核細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
クローンを約ｐＨ６．０および約ｐＨ７．４でＦｃＲｎ受容体に露出させて、ＦｃドメインによるＦｃＲｎの認識を可能にすることと、
約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより高い親和性結合を呈する結合剤、約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより低い親和性結合を呈する結合剤、または約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でほぼ同じ親和性結合を呈する結合剤、を発現する１つ以上のクローンを選択することと、
任意選択で、１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択されたクローンを提供することと、を含む、方法。
６０．約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する１つ以上のクローンを選択することと、１つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、インビボでの半減期が延長したものと特定することと、を含む、項５９に記載の方法。
６１．結合剤が、配列多様性を呈する可変ドメインを、任意選択で１つ以上の相補性決定領域に含む、項５９または項６０に記載の方法。
６２．結合剤が、配列多様性を呈するＦｃ領域を、任意選択でそれらのＣＨ３ドメインに含む、項５９〜６１のいずれかに記載の方法。
６３．結合剤のＦｃ領域が、配列多様性を呈しない、項５９〜６１のいずれかに記載の方法。
６４．実質的に本明細書に記載され、かつ／あるいは項１〜６３のいずれかに記載の方法により特定または選択される、クローン、クローンによる発現される結合剤、または結合剤をコードする核酸。
６５．結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンであって、コードＤＮＡが、任意選択で、細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座にあり、コードされた結合剤が、細胞あたり１００〜１０００個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、高等真核細胞クローン。
６６．標的に対する結合剤の親和性に基づく選択のための項６５に定義のライブラリの使用。
６７．結合剤のレパートリーをコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、ディスプレイライブラリ。
６８．結合剤のレパートリーをコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを作製する方法であって、
結合剤をコードするドナーＤＮＡ分子、および高等真核細胞を提供することと、
ドナーＤＮＡを細胞に導入することにより、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
結合剤の発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む、方法。
６９．組換え細胞が、ドナーＤＮＡを細胞に導入すること、および細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することにより創出され、ヌクレアーゼが、細胞ＤＮＡ中の認識配列を切断し、ドナーＤＮＡが細胞ＤＮＡに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れが細胞の内部のＤＮＡ修復機序を通して生じる、項６８に記載の方法。
７０．テトラサイクリン誘導性プロモーターからのドナーＤＮＡの発現を誘導することと、細胞を、結合剤の発現のための条件下で培養し、細胞表面における結合剤の提示を得ることと、をさらに含む、項６８または項６９に記載の方法。
７１．ライブラリを、項１〜７０のいずれかに定義の方法または使用において使用することをさらに含む、項６９または項７０に記載の方法。
７２．高等真核細胞が哺乳動物細胞である、項１〜７１のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
７３．哺乳動物細胞が、ヒト細胞株またはＣＨＯ細胞株である、項１〜７２のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
７４．高等真核細胞が懸濁培養中にある、項１〜７３のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
７５．結合剤をコードするＤＮＡが、細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座で組み入れられる、項１〜７４のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
７６．結合剤が抗体である、項１〜７５のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
７７．抗体が全長免疫グロブリンである、項７６に記載の使用、方法、またはライブラリ。
７８．抗体がＩｇＧである、項７７に記載の使用、方法、またはライブラリ。
７９．抗体が、膜貫通ドメインに融合した重鎖と軽鎖とを含む、項７６〜７８のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８０．結合剤が、融合タンパク質であって、レシピエント多様性骨格ドメインに挿入されたドナー多様性骨格ドメインを含み、任意選択で、融合タンパク質と関連するパートナードメインを含む、融合タンパク質であり、
ドナー多様性骨格ドメインが、ドナー骨格とドナー相互作用配列とを含み、レシピエント多様性骨格ドメインが、レシピエント骨格とレシピエント相互作用配列とを含む、項１〜７９のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８１．融合タンパク質が、抗体可変ドメインに挿入されたシステインリッチペプチドを含むノットボディである、項８０に記載の使用、方法、またはライブラリ。
８２．ノットボディが、膜貫通ドメインに融合した抗体重鎖と抗体軽鎖とを含む、項８１に記載の使用、方法、またはライブラリ。
８３．結合剤が、配列多様性を呈する抗体可変ドメインを、任意選択で１つ以上の相補性決定領域に含む、項１〜８２のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８４．結合剤が、配列多様性を呈するＦｃ領域を、任意選択でそれらのＣＨ３ドメインに含む、項１〜８３のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８５．結合剤が、第１の標的のための第１の結合部位と、第２の標的のための第２の結合部位とを含む、多重特異性である、項１〜８４のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８６．ライブラリが、少なくとも１０３個のクローンを含む、項１〜８５のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８７．ライブラリがナイーブライブラリである、項１〜８６のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８８．ライブラリのクローンが、選択された標的への結合について事前選択されている、項１〜８６のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
８９．標的がヒトポリペプチドである、項８８に記載の使用、方法、またはライブラリ。
９０．ライブラリのクローンが、２つの異なる標的への二重特異性結合について事前選択されている、項８８または項８９に記載の使用、方法、またはライブラリ。
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本発明の他の態様および実施形態は、用語「を含む」が用語「からなる」に置き換えられた上に記載される態様および実施形態と、用語「を含む」が用語「から本質的になる」に置き換えられた上に記載される態様および実施形態を提供する。
文脈が別途要求しない限り、本出願が、上記の態様および上に記載される実施形態のいずれかの互いのすべての組み合わせを開示することを理解されたい。同様に、本出願は、文脈が別途要求しない限り、単独でまたは他の態様のいずれかと一緒に、好ましいおよび／または任意の特徴のすべての組み合わせを開示する。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の組成物および方法が本開示の方法の実施または試験において使用され得るが、例示的な組成物および方法は、本明細書に記載される。本明細書に記載される開示の態様および実施形態のいずれかも、組み合わされ得る。例えば、本明細書で開示される従属または独立請求項の主題は、複数組み合わされ得る（例えば、各従属請求項からの１つ以上の記載は、それらが依存する独立請求項に基づいて単一の請求項に組み合わされ得る）。
本明細書および請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「ペプチド鎖」への言及は、１つ以上のペプチド鎖への言及であり、当業者に既知のその均等物を含む。
この明細書で言及されるすべての文書および配列データベースのエントリは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない２つの特定の特徴または構成要素の各々の特定の開示としてみなされるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書で個々に示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示とみなされるべきである。
次に、本発明の実施形態が、以下の図面を参照してより詳細に説明される。
［図１］ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ、表面発現用デュアルプロモーター抗体ＩｇＧ発現カセット
ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ、主要な特徴（１〜７５００ｂｐ）を示す概略図が示される
ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−Ｄ１．３、抗リゾチーム抗体Ｄ１．３の表面発現用のデュアルプロモーター抗体発現カセット。注釈付きの完全な核酸配列が示される。特徴：
ＡＡＶＳ左相同性アーム ９〜８１２
ブラストサイジン耐性遺伝子 ８５３〜１２５４
ｐＥＦプロモーター １５２２〜２７０５
ＢＭ４０リーダー ２７４５〜２７９９
ヒト化Ｄ１．３ ＶＬ ２７９９〜３１３０
ヒトＣカッパ ３１３８〜３４４３
ＢＧＨポリＡ ３４６８〜３６８２
ＣＭＶプロモーター ３７０１〜４２７３
イントロンを有するマウスＶＨリーダー ４２９９〜４４２６
ヒト化Ｄ１．３ ＶＨ ４４３２〜４７７９
最適化されたヒトＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ３ ４７８０〜５７７５
Ｍｙｃタグ ５７７６〜５８０５
ＰＤＧＦＲアンカー ５８０６〜５９６１
ＢＧＨポリＡ ６０１１〜６２２５
ＡＡＶＳ右相同性アーム ６２８８〜７１２４
ｆ１複製起点 ７２８２〜７６９５
ｐＵＣ複製起点 ７９１６〜８５９０
カナマイシン耐性遺伝子 ９３１０〜１０１０４
［図２］細胞表面でのＩｇＧの発現。
ＦＬ３チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。ＦＬ３チャネルにおける染色に対して陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮの存在下でｐＩＮＴ１７抗体でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの１４日後、抗Ｆｃ ＰＥ（ＦＬ２）で細胞を染色した。蛍光強度（抗Ｆｃ−ＰＥ、ｘ軸）を示すパネルは、細胞数（ｙ軸）に対してプロットしＣＮＴＯ６０７（ａ）、ＭＥＤＩ１９１２（ｂ）、およびＡｎｇ２ｍＡｂ（ｃ）のペアを含む。すべてのパネルについて、プロットは、染色されたＨＥＫ２９３細胞（点線）、親抗体（破線）、改善された変異体（黒の実線）を含む。
［図３］ＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２−ＳＴＴの分取サイズ排除クロマトグラフィー。プロテインＡアフィニティ精製および透析が後に続くＥｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたＭＥＤＩ−１９１２（０．５ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ）またはＭＥＤＩ−１９１２ −ＳＴＴ（０．５ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）泳動用緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ系に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００カラムに負荷した。ｙ軸の２８０ｎｍ（ｍＡＵ）での吸光度に対してｘ軸にプロットされた溶出量（ｍｌ）ｕｓ。ＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２−ＳＴＴの溶出量（Ｖｅ）は、それぞれ１０．３ｍｌおよび１１．７ｍｌであった。ＭＥＤＩ−１９１２は、自己相互作用を示す以前の溶出量を示す。
［図４］ＭＥＤ−１９１２可変重鎖（ＶＨ）のＤＮＡおよびタンパク質配列。
ライブラリ作成のために採用されるプライマーは、核酸配列の上に標識される。
［図５］混合細胞のＦＡＣＳ分離は、抗体発現に基づく抗体集団を表示した。
ＭＥＤＩ−１９１２とＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ ＩｇＧ遺伝子の均等な混合は、ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化された。トランスフェクションから１５日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ選別機を使用してＦＡＣＳによる抗体発現に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗Ｆｃおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたＮＧＦ−ビオチン／ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λｅｍ＝４５０／４０、λｅｘｃ＝３５５チャネルでの染色に対する陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。
ａ．混合入力集団（破線）、およびＭＥＤＩ−１９１２（灰色線）とＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（黒色線）を表示するモノクローナルＨＥＫ２９３細胞株についての細胞数に対する抗Ｆｃ−ＰＥの蛍光強度のヒストグラムプロット。
ｂ．ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Ｆｃ−ＰＥ（ｘ軸）についての蛍光強度を示し、ｙ軸上で抗原結合（ＮＧＦ−ビオチン／ＮＧＦ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ）についての蛍光強度に対してプロットされる。高抗体発現集団と低抗体発現集団とを分離するために選択されたゲートは、Ｐ５およびＰ６と標識され、ドットプロット上に黒色ボックスとして示される。総イベント数は３．９×１０６個の細胞であり、Ｐ５およびＰ６ゲートにおいて選別された細胞の数は、それぞれ２．５×１０５および２．８×１０５個の細胞であった。
［図６］哺乳動物細胞のディスプレイレベルにより選択された抗体の富化。
ゲート５および６において選別された細胞（図５）を拡大し、ゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによって抗体ＶＨ遺伝子を単離した。２つの抗体集団をＮｅｘｔｇｅｎ配列決定によって分析して、２つのゲーティングされた集団におけるＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴの割合を決定した。ヒストグラムは、低抗体発現集団（ゲート６）および高抗体発現集団（ゲート５）におけるＭＥＤＩ−１９１２（斜線の棒）およびＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（黒色の棒）のパーセンテージ頻度を示す。
［図７］抗体発現に基づくＭＥＤＩ−１９１２ライブラリ抗体集団のＦＡＣＳ分離。
ＮＮＳオリゴヌクレオチド指向変異誘発がＷ３０、Ｆ３１、およびＬ５６をコードするコドンをランダムに変異させるために使用される、ＭＥＮＳ−１９１２ ＩｇＧ遺伝子のライブラリを、ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。トランスフェクションから１５日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ選別機を使用してＦＡＣＳによる抗体発現および抗原結合に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗Ｆｃおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたＮＧＦ−ビオチン／ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λｅｍ＝４５０／４０、λｅｘｃ＝３５５チャネルでの染色に対する陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Ｆｃ−ＰＥ（ｘ軸）についての蛍光強度を示し、モノクローナル細胞株を表示する親ＭＥＤＩ−１９１２（ａ）、モノクローナル細胞株を表示するＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（ｂ）ならびにＭＥＤＩ−１９１２アミノ酸３０位、３１位および５６位ランダムライブラリ（ｃ）についてｙ軸上で抗原結合（ＮＧＦ−ビオチン／ＮＧＦ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ）についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、Ｐ５およびＰ６と標識され、ドットプロット上にボックスとして示される。
［図８］選択されたＭＥＤＩ−１９１２変異型の配列分布。
哺乳動物ディスプレイ後のＭＥＤＩ−１９１２ ＶＨライブラリについてのＭＥＤＩ−１９１２ ＶＨ３０位、３１位、および５６位、ならびにＦｃ発現およびＮＧＦ結合に対してゲーティングされたＦＡＣＳでのアミノ酸同一性頻度のヒストグラムプロット（Ｐ５ゲート、図７）。アミノ酸（１文字コード）は、隣接するアミノ酸３０、斜線の棒および３１、黒色の棒（ａ）およびアミノ酸５６（ｂ）についてｙ軸上に頻度（発生パーセンテージ）に対してｘ軸上にプロットされる。５６位のロイシンを分析から除外した。
［図９］ボコシズマブマウス親抗体５Ａ１０ ＶＨ（Ａ）およびＶＬ（Ｂ）とヒト化中間抗体５Ａ１０−ｉおよびボコシズマブとのアラインメント。
ＣＤＲは配列の上のバーで示され、変異される残基は太字および下線で強調される。パラトピック残基（ＰＣＳＫ９への直接結合に寄与するアミノ酸）は、斜体および下線で強調される。ドットは親マウスｍＡｂ ５Ａ１０との同一性を示す。
［図１０］抗体哺乳動物はボコシズマブおよび親ヒト化中間抗体５Ａ１０−ｉの発現を表示する
ボコシズマブまたは５Ａ１０−ｉ）ＩｇＧをコードする標的化ベクターｐＩＮＴ１７を、ＴＡＬＥヌクレアーゼを介してＨｅｋ２９３細胞のＡＡＶＳ遺伝子座に組み入れた。トランスフェクションの１、８、または２１日後（ｄｐｔ）、細胞（１０６）を抗Ｆｃ−ＰＥで染色し、１０６の細胞をｉＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅフローサイトメーターでフローサイトメトリーによって分析した。死んだ細胞を分析から除外した。ヒストグラムプロットは、陰性対照としてインキュベートされた野生型ＨＥＫ２９３細胞の染色を有するトランスフェクションの１、８、および２１日後（ｄｐｔ）でのボコシズマブおよび５Ａ１０−ｉ細胞ディスプレイ集団についての細胞数に対する蛍光強度（抗Ｆｃ−ＰＥ）を示す。
［図１１］ボコシズマブＶＨのヒト生殖細胞系列配列（ＩＭＧＴ）とのアラインメント。
ボコシズマブＶＨ（Ｑｕｅｒｙ＿１）は、ヒトＶＤＪデータベースに対するＩｇ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ（ＩｇＢＬＡＳＴ）に関するものであった。結果は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３を包含するクエリ配列（同一性のパーセント順）（第２列）に対するアラインメントとして提示される。ヒト生殖細胞系列細胞は列１に示される。ボコシズマブＶＨ配列（．）および差異（単一アミノ酸コード）に対する残基の同一性は、マルチプルアラインメントにおいて表示される。
［図１２］ボコシズマブのＶＨ変異型およびＶＬに加え停止コドンテンプレートをコードするＤＮＡ配列。元の「野生型」ボコシズマブ（行ｆ）と比較した変動は、太字および下線で強調される。隣接する５’および３’ ＶＨ制限部位（ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ）またはＶＬ制限部位（ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ）に下線が引かれている。ＶＬ停止コドンは太字および下線で強調される。
［図１３］ボコシズマブライブラリのＭＡＣＳ精製後の分析フローサイトメトリー分析
ボコシズマブライブラリでトランスフェクトされたＨｅｋ２９３細胞を、抗ＦｃまたはＰＣＳＫ９ｉのいずれかで７ｄｐｔにＭＡＣＳ精製した。（ａ）フローサイトメトリードットプロットは、ＭＡＣＳ後の精製ライブラリ、ＨＥＫ２９３細胞ならびに未選別ライブラリ、ボコシズマブおよび５Ａ１０ｉトランスフェクタント、９ｄｐｔについてのＰＣＳＫ９結合（ＦＬ４、ｙ軸）に対してプロットされた抗Ｆｃ発現（ＦＬ２、ｘ軸）について示される。（ｂ）細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム（抗Ｆｃ、ＦＬ２、ｘ軸）。プロットは、（上から下に）ＨＥＫ２９３コントロール、ボコシズマブ、５Ａ１０ｉ、ボコシズマブライブラリ、抗ＰＣＳＫ９ ＭＡＣＳ精製ボコシズマブライブラリ、および抗Ｆｃ ＭＡＣＳ精製ボコシズマブライブラリである。
［図１４］抗原結合または抗Ｆｃに基づいて以前にＭＡＣＳ精製されたボコシズマブライブラリのＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ選別機ドットプロット。
ボコシズマブＩｇＧ遺伝子のライブラリを、ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。ＰＣＳＫ９結合（ａ）または抗Ｆｃ（ｂ）に基づいて、この混合細胞集団をまずＭＡＣＳ精製した。トランスフェクションの１６日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ選別機を使用して、ＦＡＣＳによる抗体発現と抗原結合に基づいて、ＭＡＣＳ富化ライブラリを分離した。フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗Ｆｃおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されたＰＣＳＫ９−ビオチン／ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λｅｍ＝４５０／４０、λｅｘｃ＝３５５チャネルでの染色に対する陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Ｆｃ−ＰＥ（ｘ軸）についての蛍光強度を示し、ｙ軸上に抗原結合（ＰＣＳＫ９−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ）についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートはＰ５と標識され、Ｐ６はドットプロット上のボックスとして示される。
［図１５］哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブＶＨ分布。
ランダムな選択されていない入力クローン（８４）、選別された抗原（７５）、および選択されたＦｃ（８５）を配列決定し、ＶＨ同一性を決定した。ヒストグラムプロットは、入力（白色の塗りつぶされた棒）、選択された抗原および抗Ｆｃ ＦＡＣＳが後に続く抗原ＭＡＣＳ（黒色の塗りつぶされた棒）ならびに選択された抗原および抗Ｆｃ ＦＡＣＳが後に続く抗Ｆｃ ＭＡＣＳ（灰色の塗りつぶされた棒）哺乳動物細胞選択集団についての発生パーセンテージに対してプロットされたｘ軸上にＶＨ生殖細胞系列同一性を示す。
［図１６］哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブＶＬ配列分析。
ランダムな選択されていない入力クローン（８４）、選別された抗原（７５）、および選択されたＦｃ（８５）を配列決定し、ＶＬ配列を決定した。３つの変異コドンについて平均ｐＩと脂肪族インデックスを計算した。これは、哺乳動物ディスプレイ選択抗体についてのｐＩおよび脂肪族指数の両方の低下を示した。
［図１７］抗体ディスプレイレベル（抗Ｆｃ）および抗原結合の両方についてＦＡＣＳ富化が後に続くＭＡＣＳによって抗原結合について富化された、哺乳動物ディスプレイボコシズマブクローンを列挙した表。
クローンを配列決定し、ＶＨ ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ならびにＶＬ ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１文字のアミノ酸配列が、太字と赤色で強調される元のボコシズマブ配列からの変動で示される。ボコシズマブ配列を保持した標的化されたアミノ酸には、下線が引かれている。元の親抗体ボコシズマブおよび５Ａ１０−ｉを含む抗体の、キャプチャーＥＬＩＳＡにおける抗原への結合を実行し、蛍光ユニットにおける結合シグナルが列２に示される。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１４３０によって以前に説明されたようにＡＣ−ＳＩＮＳアッセイを実行し、列３は無抗体ＰＢＳ対照と比較した最大吸光波長シフトを示す（ｎｍ）。選択されたヒトＶＨ生殖細胞系列は、実施例５において詳述されるように、列６にも文字で示される。
ａ：ＶＨ Ｙ３３Ａ−ＩＧＨＶ１−３＊０１
ｂ：ＶＨ Ｙ３３Ｄ−ＩＧＨＶ１−８＊０１
ｃ：ＶＨ Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ−ＩＧＨＶ１−４６＊０１
ｄ：ＶＨ Ｙ３３Ａ、Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ（ａ．およびｃ．の変異体は組み合わせられた）
ｅ：ＶＨ Ｙ３３Ｄ、Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ（ｂ．およびｃ．の変異体は組み合わせられた）
ｆ：ボコシズマブ「野生型」配列
［図１８］抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ１抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ。
抗体を、Ｅｘｐｉ−２９３細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ機器を使用して０．３５ｍｌ／ｍｉｎの流量でＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ、２．７ｕｍ、４．６×３００ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＬ１５８０−５３０１）上に試料（１ｍｇ／ｍｌで２μｌ）を負荷した。選択された抗体について吸光度に対する保持時間のプロットが示される。黒から次第に薄い灰色への色合いは、５Ａ１０−ｉ、８８４＿０１＿Ｇ０１（哺乳動物細胞ディスプレイによって特定される）、ボコシズマブ、アリロクマブである。
［図１９］ゲル濾過分析ニボルマブ（ａ）およびベセンクマブ（ｂ）。
プロテインＡアフィニティ精製および透析が後に続くＥｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたニボルマブ（０．５ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ）またはベセンクマブ（０．５ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）泳動用緩衝液を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ系に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００カラムに負荷した。ｙ軸の２８０ｎｍ（ｍＡＵ）での吸光度に対してｘ軸にプロットされた溶出量（ｍｌ）ｕｓ。ニボルマブおよびベセンクマブについての溶出量（Ｖｅ）は、それぞれ１２．０ ｍｌおよび１３．７ ｍｌであった。
［図２０］４ｏＣで２週間貯蔵後のニボルマブ（ａ）およびベセンクマブ（ｂ）の安定性決定。
サイズ排除クロマトグラフィー（図１９を参照されたい）によってベセンクマブおよびニボルマブを精製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において０．５ｍｇ／ｍｌに濃度を調整した。次いで、抗体を４℃で２週間保存した。製造業者の指示に従って、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して２０ｏＣで動的光散乱測定を実行した。流体力学的半径を、アインシュタイン・ストークス方程式で評価し、散乱強度に対してプロットした。ベセンクマブについての複数の凝集ピーク（ｂ）と比較して、ニボルマブ（ａ）について単一の単分散ピークを観察した。
［図２１］細胞表面上のＩｇＧに結合するヒト血清。
ＦＬ３チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。ＦＬ３チャネルにおける染色に対して陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮの存在下で、ｐＩＮＴ１７−ニボルマブまたはｐＩＮＴ１７−ベセンクマブで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの２０日後、抗Ｆｃ ＰＥ（ＦＬ２）およびＤｙｌｉｇｈｔ ６３３（３２５−００００、Ｉｎｎｏｖａ）で標識されたヒト血清（Ｈ４５２２、Ｓｉｇｍａ）で細胞を染色した。パネルは、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞（ａ）、ｐＩＮＴ１７−ニボルマブ（ｂ）またはｐＩＮＴ１７−ベセンクマブ（ｃ）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞である。
［図２２］親和性、抗原の濃度、および抗体の濃度の間の関係
ａ ＫＤ １０ｎＭ（破線）または０．１ｎＭ（実線）のいずれかの抗体の異なる濃度を有する０．１ｎＭ抗原を使用した複合体の濃度。
ｂｉ 異なる抗体濃度でのより低い親和性（ＫＤ １０ｎＭ）に対するより高い親和性抗体（ＫＤ ０．１ｎＭ）についての０．１ｎＭ抗原への結合の相対的選択性
低い抗原濃度（「ストリンジェントな」）である場合でさえも、高い抗体濃度では比較的低い選択性があるが、これは抗原濃度が低下するにつれて増加する。
［図２３］抗体ディスプレイレベルを制御するためのスプライスアクセプター／ドナー変異型。
スプライスドナー領域を含むＨｉｎｄＩＩＩ部位から５’イントロンまでの核酸配列は、ｐＩＮＴ１７−Ｊ９、Ｊ１０、Ｊ２９およびＪ３０変異型について示される。元のヒト「野生型」配列はＪ９であり、Ｊ１０、Ｊ２９、Ｊ３０についてのスプライスジャンクションでＪ９と異なるヌクレオチドには下線が引かれている。
［図２４］ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０、低下したディスプレイ表面発現についてのデュアルプロモーター抗体ＩｇＧ発現カセット。注釈付きの核酸配列は、ＸｈｏＩ（４８０４）およびＳｂｆＩ（８３８７）の制限部位の間に示される。特徴：
ＩｇＧ１ ＣＨ１−３ ４８０５〜５８０８
スプライスジャンクション ５８０１〜５８０２
イントロン ５８０２〜７１０４
Ｍ１エクソン ７１０５〜７２３９
ＢＧＨ ｐＡ ７２６４〜７４７８
ＡＡＶＳ右相同性アーム ７５４４〜８３８１
３’β−グロビンインスレーター８４２１〜８４９２
［図２５］代替膜貫通ドメインおよびスプライス変異型を使用する細胞表面上のＩｇＧの低下した表面発現。
ＦＬ３チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。ＦＬ３チャネルにおける染色に対して陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮの存在下で、ｐＩＮＴ１７標的化ベクターで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの２７日後、抗Ｆｃ ＰＥ（ＦＬ２）で細胞を染色した。フローサイトメトリーのドットプロットパネルは、ｐＩＮＴ１７−Ｊ９−ニボルマブ（ａ）、ｐＩＮＴ１７−Ｊ１０−ニボルマブ（ｂ）、ｐＩＮＴ１７−Ｊ２９−ニボルマブ（ｃ）、ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０−ニボルマブ（ｄ）およびｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ニボルマブ（ｅ）を含む。
［図２６］ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤまたはｐＩＮＴ１７−Ｊ３０標的化ベクターから発現された抗体についての細胞表面上のＩｇＧディスプレイレベルの定量化
マウスＩｇＧ−ＰＥ標識で染色されたＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧビーズ（カタログ番号８１５、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）の製造業者の説明書に記載されるように、キャリブレーションビーズＦＬ２染色を実行した。（ａ）標識されたヒストグラムプロットは、それぞれ１２２５７、７２７４５、２８３３６０、８８６４１７のビーズコピー数を表す、１、２、３、および４と標識されたピークを有するキャリブレーションビーズセットの染色を示す。ブランクのピークは、捕捉抗体のないビーズを表す。（ｂ）コピー数（ｙ軸）に対してプロットされた蛍光強度の中央値（ｘ軸）を示すキャリブレーショングラフ。ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤまたはｐＩＮＴ１７−Ｊ３０発現カセットのいずれかからの３３７＿１＿Ｃ０８（ｃ）およびニボルマブ（ｄ）を表示する細胞株を、抗Ｆｃ−ＰＥ（５μｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ；１０５細胞）で染色した。ＦＬ３チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。ＦＬ３チャネルにおける染色に対して陽性の細胞（７−ＡＡＤを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ヒストグラムのプロットは、ＰＤＧＦＲ ＴＭを有するｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（標識されかつ黒色の線）、ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０（標識されかつ点線）ならびに３３７＿１＿Ｃ０８（ｃ）およびニボルマブ（ｄ）を表示する細胞についての野生型ＨＥＫ２９３細胞株（灰色の実線）についての細胞数に対して蛍光強度をそれぞれ示す。
［図２７］細胞ディスプレイのコピー数の低下によって、哺乳動物ディスプレイによるそれらの標的に対する異なる親和性を有する抗体の分離が可能になる。
ニボルマブおよび３３７＿１＿Ｃ０８抗体を表示するＨｅｋ２９３細胞を、それぞれ５０ｎＭセルトラッカー緑色および５０ｎＭセルトラッカー赤色で標識した。（ａ）Ｊ３０スプライスバリアントを使用したディスプレイを示し、（ｂ）ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤベクターによってコードされたＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインを使用したディスプレイを実証する。標識された細胞を均等に混合し、抗原結合に基づいてＭＡＣＳを選別した。インテリサイト（ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）フローサイトメーターを使用して選別された細胞を分析した。ドットプロットは、ｘ軸（ＦＬ１）上にニボルマブを、ｙ軸（ＦＬ４）上に３３７＿１＿Ｃ０８を表す。パネルｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、およびｉｖは、それぞれＭＡＣＳ精製のために採用された１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭの抗原、抗原がないことを表す。
［図２８］ｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１、低下したディスプレイ表面発現のための誘導性プロモーター抗体ＩｇＧ発現ベクター。注釈付きの核酸配列は、ＡｓｉＳＩ（５）およびＳｂｆＩ（７６７２）制限部位の間に示される。複製の起点およびカナマイシン耐性遺伝子を包含する、ＡｓｉＳＩおよびＳｂｆＩ部位（７６７３〜１０９２２および１〜４）の外側のベクター骨格は、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤと同一である（図１）。
主要な特徴：
ＡＡＶＳ左相同性アーム ９〜８１２
ブラストサイジン耐性遺伝子 ８５３〜１２５４
ＣＭＶプロモーター １５４０〜２１１２
逆Ｔｅｔ活性化因子（ｔＴＡ）ＣＤＳ ２１６４〜３１６８
ＳＶ４０ ｐＡ ３１７８〜３３９５
ｔｅｔＯヘプタマー ３６７９〜３９３２
最小限のＣＭＶプロモーター（ＰｍｉｎＣＭＶ）３９４６〜４００５
ＢＭ４０リーダー ４０１６〜４０６６
抗ＰＤ１ ＭＫ３４７５ ＶＬ ４０６８〜４４１３
ヒトＣカッパ ４４２１〜４７３８
フューリン切断部位 ４７４５〜４７５６
Ｐ２Ａペプチド ４７５７〜４８１６
イントロンを有するマウスＶＨリーダー ４８２９〜４９６０
抗ＰＤ１ ＭＫ３４７５ ＶＨ ４９６２〜５３２１
最適化されたヒトＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ３ ５３２２〜６３１７
Ｍｙｃタグ ６３１８〜６３４７
ＰＤＧＦＲアンカー ６３４８〜６５０３
ＢＧＨポリＡ ６５５３〜６７６７
ＡＡＶＳ右相同性アーム ６８２９〜７６６６
３’β−グロビンインスレーター７７０６〜７７７７
ｆ１複製起点 ７８２４〜８２３７
ｐＵＣ複製起点 ８４５８〜９１３２
カナマイシン耐性遺伝子 ９８５２〜１０６４６
［図２９］誘導性哺乳動物ディスプレイ発現
ｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１−３７７＿１＿Ｃ０８およびＴＡＬＥヌクレアーゼで同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株ならびにブラストサイジンの存在下で２０日間選択された安定した細胞集団からの染色結果を表すヒストグラム。試料を、２０ｍｌで５×１０５細胞／ｍｌに分割し、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで誘導した。誘導の２４時間後、各ドキシサイクリン誘導サンプルからの１×１０６個の細胞を使用してフロー染色を行った。抗Ｆｃ−ＰＥおよびＴＯＰＲＯ−３生存率染色を使用して細胞を染色した。ヒストグラムは、細胞数に対してプロットされたＦＬ２チャネル（抗Ｆｃ−ＰＥ）に関する蛍光強度を示す。ＨＥＫ２９３ ＷＴ対照（灰色の実線）、０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリン（黒色の破線）、２ｎｇ／ｍｌドキシサイクリン（黒い点線）および２０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリン（黒色の実線）で誘導されたＨＥＫ２９３−ｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１−３７７＿１＿Ｃ０８安定細胞株。
［図３０］細胞の結合はＦｃＲｎに対する抗体を表示した。
ブリアキヌマブおよびウステンキヌマブ（Ｕｓｔｅｎｋｉｎｕｍａｂ）を発現するＨＥＫ２９３細胞を、異なる緩衝液を使用して、ストレプトアビジンＰＥ（１１ｎＭ）と事前複合体化したビオチン化ＦｃＲｎ（５０ｎＭ）で染色した。
ａ．Ｈｅｋ２９３ ＷＴ
ｂ．ストレプトアビジンＰＥ対照
ｃ．緩衝液ｐＨ６．０で染色された細胞
ｄ．緩衝液ｐＨ７．４で染色された細胞
［図３１］ＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ分離は、抗メソテリンＩｇＧをディスプレイレベルで表示した。
抗メソテリン抗体遺伝子の集団を、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子導入により、ＨＥＫ２９３細胞のヒトＡＡＶＳ遺伝子座に組み入れた。抗体を表示したＨＥＫ２９３細胞のポリクローナル集団を、抗ヒトＦｃ−ＰＥで染色することにより、抗体ディスプレイレベルに従ってＦＡＣＳによって分離した。トランスフェクションの１６日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ選別機を使用したＦＡＣＳによる抗体発現に基づいて、ＭＡＣＳ富化ライブラリを分離した。フィコエリトリン（ＰＥ）で標識された抗Ｆｃで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λｅｍ＝４５０／４０、λｅｘｃ＝３５５チャネルでの染色に対する陽性の細胞（ＤＡＰＩを取り込んだ非生存細胞を表す）を除外した。ヒストグラムは、抗体発現レベルを表す抗Ｆｃ−ＰＥについての蛍光強度（ｘ軸）を示し、ｙ軸上の細胞数に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、それぞれ低、中、高のディスプレイレベルの集団をすＰ４、Ｐ６、およびＰ５と標識される。
［図３２］高ディスプレイレベルグループ（実線）および低ディスプレイレベルグループ（点線）にそれぞれ由来する２つの抗メソテリンＩｇＧ１抗体クローンのＨＰＬＣ−ＳＥＣ。
［図３３］ＭＡＣＳを使用したＤＮＡ結合とＤＮＡ結合剤の枯渇。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞（灰色の実線）、またはストレプトアビジンＰＥで検出されたビオチン化ＤＮＡで染色されたウステキヌマブ（破線）、ブリアキヌマブ（長破線）およびアマツキシマブ（点線）を表示するＨＥＫ２９３細胞のオーバーレイ、（Ｂ）ＭＡＣＳ選別の前にＤＮＡで染色されたウステキヌマブ（標識なし、Ｑ４）、アマツキシマブ（ＣｅｌｌＴａｃｅ Ｆａｒ赤色で標識された、Ｘ軸）およびブリアキヌマブ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥで標識された、Ｙ軸）を表示する３つの抗体細胞集団の混合物を表すドットプロット、（Ｃ）ＤＮＡ結合剤の枯渇を示すフロースルーのドットプロット。
［図３４］ヘパリン−ＦＩＴＣ（ｘ軸）および抗ヒトＦｃ ＡＰＣ（ｙ軸）での二重染色。（ａ）ウステキヌマブ（灰色）とブリアキヌマブ（黒色）のオーバーレイを示すドットプロット。（ｂ）ウステキヌマブ（灰色）とガニツマブ（黒色）のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびヘパリンに対する非結合剤であることを示す。
［図３５］ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３（ｘ軸）および抗ヒトＦｃ ＰＥ（ｙ軸）で複合体化されたシャペロンでの二重染色。（ａ）Ｈｓｐ７０−ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３および抗ヒトＦｃ ＰＥで二重染色されたウステキヌマブ（灰色）およびブリアキヌマブ（黒色）のオーバーレイを示すドットプロット。（ｂ）Ｈｓｐ９０−ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３および抗ヒトＦｃ ＰＥで二重染色されたウステキヌマブ（灰色）およびブリアキヌマブ（黒色）のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびシャペロン（Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０）に対する非結合剤であることを示す。（ｃおよびｄ）オーバーレイヒストグラムプロットは、レンジルマブおよびブレンツキシマブの結合Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０をそれぞれ示す。
［図３６］抗ヒトＦｃ ＰＥで染色した抗体および多反応性プローブについてのヒストグラムプロット。抗体の選択を表示する安定したモノクローナルＨＥＫ２９３細胞株は、ヌクレアーゼ媒介性の遺伝子組入れによって創出された。蛍光強度（ｘ軸）に対する細胞数（ｙ軸）のヒストグラムプロットは、次のプローブでＨＥＫ２９３細胞の表面上に表示された様々な抗体について表示される：（ａ）抗ヒトＦｃ−ＰＥ、（ｂ）ストレプトアビジンＰＥを使用して検出されたビオチン化ＤＮＡ、（ｃ）ヘパリン−ＦＩＴＣ、（ｄ）ストレプトアビジンＰＥ、（ｅ）Ｈｓｐ７０−ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、（ｆ）Ｈｓｐ９０−ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、および（ｇ）ストレプトアビジンＰＥと事前複合体化したＦｃＲｎ。
［図３７］ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔ−Ｄ１．３、誘導性抗体ＩｇＧ哺乳動物ディスプレイ発現ベクター。注釈付きの完全な核酸配列は、ＡＡＶＳ相同性アームとＢｇｌＩＩからＢｓｔＺ１７１制限部位までのプロモーターレスブラストサイジン遺伝子との間に示される。番号付けはＢｇｌＩＩ制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。
ＢＧＨポリＡ ２２３〜９（逆鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ））
ヒトＣカッパ ５４４〜２３６（逆鎖）
Ｄ１．３ ＶＬ ８７７〜５４９（逆鎖）
イントロンを有するヒトＶＬリーダー １１６８〜８８３（逆鎖）
ＴＲＥ３Ｇプロモーター １２３０〜１６１８
ＣＭＶプロモーター １２３７〜１８０９
イントロンを有するＶＨリーダー １６４４〜１７８２
Ｄ１．３ ＶＨ １７８３〜２１２７
ＩｇＧ１ ＣＨ１−３ ２１２５〜３１２０
Ｍｙｃタグ ３１２１〜３１５０
ＰＤＧＦＲアンカー ３１５１〜３３０６
ＢＧＨポリＡ ３３５６〜３５７０
ｐＥＦプロモーター ３６２１〜４９５５
ｒｔＴＡ−３Ｇ ５０６３〜５８０９
ＳＶ４０ポリＡ ５８３２〜６２７４
［図３８］誘導性ＩｇＧ哺乳動物ディスプレイ細胞株。１５４９＿０２＿Ｄ０６（１）、１５３５＿０１＿Ｅ０３（２）、および３３７＿１＿Ｃ０８（３）、ボコシズマブ（４）、８８４＿０１＿Ｇ０１（５）、５Ａ１０ｉ（６）、およびアリロクマブ（７）。２７ｄｐｔで、０（ａ）、２（ｂ）、４（ｃ）、または１００（ｄ）ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の２４時間後、細胞を抗Ｆｃ−ＰＥで染色した。細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム（抗Ｆｃ、ＦＬ２、ｘ軸）。
［図３９］誘導性ＩｇＧ哺乳動物ディスプレイ細胞株：細胞表面ＩｇＧターンオーバー
抗ＰＤ１抗体のＶＨとＶＬを含むｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔ：１５４９＿０２＿Ｄ０６（１）、１５３５＿０１＿Ｅ０３（２）、および３３７＿１＿Ｃ０８（３）および抗ＰＣＳＫ９抗体ボコシズマブ（４）、８８４＿０１＿Ｇ０１（５）、５Ａ１０ｉ（６）およびアリロクマブ（７）を、ＡＡＶＳ ＴＡＬＥヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れおよびブラストサイジン選択によって安定したＨＥＫ２９３細胞株を創出するために使用した。２７ｄｐｔで、１００ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の４８時間後、細胞を抗Ｆｃ−ＰＥで染色した。蛍光強度のヒストグラム（抗Ｆｃ、ＦＬ２、ｘ軸）は、細胞数に対してプロットされて示される。
［図４０］抗ＰＤ１抗体１５４９＿０２＿Ｄ０６（ＰＤ−１についてＫＤ＝２．９ｎＭ）および３３７＿１＿Ｃ０８（ＰＤ−１についてＫＤ＝７４ｎＭ）を表示する細胞株を、（ａ）０、（ｂ）２、（ｃ）４および（ｄ）１００ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンでそれぞれ誘導した。前方側方散乱（ＦＳＣ、ｘ軸）に対するＦＬ１チャネル（ｙ軸）における蛍光のドットプロットが示される。１５４９＿０２＿Ｄ０６を表示する標識された細胞は、各ドットプロットの上部の象限に示され、３３７＿１＿Ｃ０８を表示する標識されない細胞は、下部の象限に示される。パネルｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、およびｉｖは、それぞれＭＡＣＳ精製のために採用されたＰＤ−１−ビオチンの０．１、１、１０ｎＭ濃度を表す。パネルｉｖは、入力されたＭＡＣＳ前の集団を表す。各細胞集団のパーセンテージは、各象限内に示される。
［図４１］ウステキヌマブ（灰色）とブリアキヌマブ（黒色）の二重染色集団のオーバーレイドットプロット。ストレプトアビジンＰＥ（ｘ軸）および抗ヒトＦｃ ＡＰＣ（ｙ軸）と事前複合体化した５０ｎＭ ＦｃＲｎ−Ａｖｉタグでの二重染色。プロット内のゲートは、ＦｃＲｎ結合剤からＦＡＣＳで選別され得るＦｃＲｎ非結合剤としてウステキヌマブを表す。
［図４２］抗メソテリン可変重（ＶＨ）ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各ＶＨ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
［図４３］抗メソテリン可変光カッパ（ＶＬκ）ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各ＶＬκ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
［図４４］抗メソテリン可変軽λ（ＶＬλ）ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各ＶＬλ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
［図４５］抗メソテリンＩｇＧ１抗体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ。抗体を、Ｅｘｐｉ−２９３細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ機器を使用して０．３５ｍｌ／ｍｉｎの流量でＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ、２．７ｕｍ、４．６×３００ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＬ１５８０−５３０１）上に試料（１ｍｇ／ｍｌで２μｌ）を負荷した。保持時間に対する２１５ｎｍでの吸光度のプロットが、選択された抗メソテリン抗体について示される：高ディスプレイレベルグループに由来する９３２＿０１＿Ａ０３（黒色の線）および９３０＿０１＿Ａ１２（交互の点線および破線）９３０＿０１＿Ｂ０２（長い破線）、低ディスプレイレベルグループに由来する９３０＿０１＿Ｃ１２（短い破線）。
［図４６］ヒトおよびＣＨＯ ＡＡＶＳイントロン１ ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）標的結合部位のアラインメント。ＣＨＯ ＡＡＶＳイントロン１のＤＮＡ配列を、ＥＮＳＥＭＢＬ注釈付きＣＨＯ−Ｋ１グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）ノックアウト細胞株から得た、アクセッション：ＣＨＯＫ１ＧＳ＿ＨＤｖ１：ｓｃａｆｆｏｌｄ＿５２：２３７４８２８：２４０６１７７：１。番号付けは、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃイントロン１の開始を参照される。太字は、ヒトＴＡＬＥＮ標的部位の左右のアームを示す。アスタリスクはヒトおよびＣＨＯ配列の間の相同性を示し、破線（−）は欠失を示す。下線および斜体は、ｐＩＮＴ１７標的化ベクター内のＡＡＶＳ左および右相同性アームの端を示す。このアラインメントを、ｐＩＮＴ１７−ＣＨＯ標的化ベクター内のＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アーム、および比較のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを設計するために使用した。１〜３と番号付けされたセンスまたはアンチセンスＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ認識部位は、それぞれ配列の上または下に表示される。
［図４７］ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ内のＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アーム、ＣＨＯ細胞上の表面発現用のデュアルプロモーター抗体ＩｇＧ発現カセット。注釈付きＤＮＡ配列が、ベクター内の左右のＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームについて示される。この図に示されていないものを含む、デュアルプロモーター抗体発現カセットを包含するすべての残りの特徴は、ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（図１）について説明されるとおりであり、以下に列挙される。
特徴：
ＣＨＯ ＡＡＶＳ左相同性アーム ９〜８９９
ブラストサイジン耐性遺伝子 ９４２〜１３４３
ｐＥＦプロモーター １６１１〜２７９４
ＢＭ４０リーダー ２８３４〜２８８５
ヒト化Ｄ１．３ ＶＬ ２８８８〜３２１９
ヒトＣカッパ ３２２７〜３５３２
ＢＧＨポリＡ ３４６８〜３６８２
ＣＭＶプロモーター ３７９０〜４３６２
イントロンを有するマウスＶＨリーダー ４３８８〜４５１５
ヒト化Ｄ１．３ ＶＨ ４５２１〜４８６８
最適化されたヒトＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ３ ４８６９〜５８６４
Ｍｙｃタグ ５８６５〜５８９４
ＰＤＧＦＲアンカー ５８９５〜６０５０
ＢＧＨポリＡ ６１００〜６３１４
ＣＨＯ ＡＡＶＳ左相同性アーム ６３７６〜７２６６
ｆ１複製起点 ７４２４〜７８３７
ｐＵＣ複製起点 ８０５８〜８７３２
カナマイシン耐性遺伝子 ９４５２〜１０２４６
［図４８］ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れによるＣＨＯ細胞の表面上の抗体のディスプレイ。細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム（抗Ｆｃ、ＦＬ２、ｘ軸）。プロットは（上から下に）、ＣＨＯ対照、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ Ｖ２−ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ Ｖ１−ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ Ｖ１−ニボルマブプラスＣＨＯ ＴＡＬＥＮ、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ− ＣＨＯ Ｖ１−ニボルマブプラスＣＲＩＳＰＲ３、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ Ｖ１−ニボルマブプラスＣＲＩＳＰＲ２、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ Ｖ１−ニボルマブプラスＣＲＩＳＰＲ１である。
［図４９］ＣＨＯの表面上の抗体のディスプレイレベル。ＣＨＯ細胞の細胞数（塗りつぶされたプロット）に対してプロットされた蛍光強度（抗Ｆｃ、ＦＬ２、ｘ軸）のヒストグラム（ａ）ボコシズマブ（実線）および８８４＿０１＿Ｇ０１（破線）。（ｂ）ＭＥＤＩ−１９１２（実線）およびＭＥＤＩ−１９１２−ＳＴＴ（破線）。
［図５０］その後の結合選択のために哺乳動物ディスプレイを使用する「開発性が増強された」集団の作成
ａ．抗ＰＤ１ ３３７＿１＿Ｃ０８ ＶＨ（ｉ）およびＶＬ（ｉｉ）鎖の配列。ヌクレオチド配列は、コドンの上に翻訳１文字のアミノ酸コードで示される。ＣＤＲは注釈付き（下線付き）であり、ＣＤＲ３アミノ酸は太字で強調された部位指向変異誘発を対象とする。
ｂ．抗ＰＤ１抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３哺乳動物ディスプレイライブラリを、高、中、低の抗体細胞ディスプレイレベルに基づいてＦＡＣＳで分離し、抗Ｆｃ−ＰＥでの染色による分析フローサイトメトリーで分析した。Ｆｃ発現（ｘ軸）に対する細胞数（ｙ軸）のヒストグラムプロットは、高（ｉ）、中（ｉｉ）、および低（ｉｉｉ）抗ＰＤ１集団として（上から下に）示される。参考のために、抗Ｆｃ ＭＡＣＳ集団（ｉｖ）、「野生型」３３７＿１＿Ｃ０８親クローン（ｖ）、および表示された抗体を有しないＨＥＫ２９３細胞（ｖｉ）が示される。
［図５１］ｐＩＮＴ１７−Ｂｉ−ＣＭＶ−エミシズマブ、二重特異性「ノブイントゥホール」の細胞表面発現のためのプラスミドを含む双方向性のＣＭＶおよび伸長因子（ｐＥＦ）プロモーター、共通の軽鎖ＩｇＧエミシズマブ。これは、３つの遺伝子、抗ＦＩＸａ重鎖、抗ＦＸ重鎖、および共通の軽鎖の発現を駆動する３つのプロモーターを有する三シストロン性標的化ベクターである。注釈付きの完全な核酸配列は、ＢｇｌＩＩからＢｓｔＺ１７１制限部位までのＡＡＶＳ相同性アームの間に示される。番号付けはＢｇｌＩＩ制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。
ＢＧＨポリＡ ２２２〜８（逆鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ））
ヒトＣカッパ ５４６〜２３２（逆鎖）
エミシズマブＶＬ ８７６〜５４７（逆鎖）
イントロンを有するヒトＶＬリーダー １１４３〜８８４（逆鎖）
最小限のＣＭＶプロモーター １２３０〜１１６７（逆鎖）
ＣＭＶプロモーター １２３７〜１８０９
イントロンを有するマウスＶＨリーダー １８３５〜１９７３
エミシズマブ抗ＦＩＸａ ＶＨ １９７４〜２３３９
エミシズマブ抗ＦＩＸａ ＣＨ１−３ ２３４０〜３３１７
Ｍｙｃタグ ３３１８〜３３４７
ＰＤＧＦＲアンカー ３３４８〜３５０３
ＢＧＨポリＡ ３５５３〜３７６７
ｐＥＦプロモーター ３８１８〜５１５２
イントロンを有するヒトＶＨリーダー ５２６０〜５４０１
エミシズマブ抗ＦＸ ＶＨ ５４０２〜５７５８
エミシズマブ抗ＦＸ ＣＨ１−３ ５７５９〜６７３３
Ｍｙｃタグ ６７３４〜６７６３
ＰＤＧＦＲアンカー ６７６４〜６９１６
ＳＶ４０ポリＡ ６９４２〜７３８４
［図５２］ＨＥＫ２９３細胞の表面上に表示されたＦＩＸａおよびＦＸの二重特異性抗体エミシズマブへの結合
ｐＩＮＴ１７−Ｂｉ−ＣＭＶ−エミシズマブまたはｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−抗ＦＩＸａを、ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドの存在下でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を分析した抗体ディスプレイおよび抗原ＦＩＸａまたはＦＸに結合する能力。ヒストグラムプロットは、左から右に染色された際の蛍光強度に対する細胞数を示す：（ａ）二重特異性エミシズマブ（黒色の破線）、（ｂ）抗ＦＩＸａ ＩｇＧ（黒色の実線）、（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を表示するＨＥＫ２９３細胞について、抗Ｆｃ−ＡＰＣ、ストレプトアビジン−ＰＥと事前複合体化したＦＸ−ビオチンもしくはＦＩＸａ−ビオチンまたはストレプトアビジン−ＰＥのみ。
［図５３］エミシズマブＶＬの親エミシズマブＶＬとのアラインメント。
ＣＤＲは配列の上の棒によって示される。ドットは、最終的なエミシズマブＶＬとの同一性を示す。正電荷パッチに寄与する残基は、太字で強調される。
［図５４］ＨＥＫ２９３細胞の表面上のノットボディのディスプレイとそれらの生物物理学的性質との関係
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮの存在下でｐＩＮＴ１７−ノットボディでトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの７日後、細胞を、抗Ｆｃ ＰＥ（ＦＬ２）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、蛍光強度（抗Ｆｃ−ＰＥ、ｘ軸）に対する細胞数（ｙ軸）プロットを示し、ＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩ（黒色の実線）、ＫＢ＿Ａ１２ Ｈｓｔｘ１（点線）およびＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩ（破線）を含む。ＫＢ＿Ａ１２ Ｈｓｔｘ１（点線）およびＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩ（破線）の跡が重なり、合わさったように見える。
ノットボディを、Ｅｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ノットボディを上に記載されるようにＨＰＬＣ−ＳＥＣで分析し、溶出量に対する吸光度のプロットは（ｂ）ＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩ、（ｃ）トラスツズマブおよび（ｄ）ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩについて示される。
［図５５］ノットボディの変異体ライブラリは、親ノットボディと比較して改善したディスプレイレベルを有するクローンを含む。ノットボディを表示するＨＥＫ２９３細胞を、抗Ｆｃ−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムプロットは、細胞株を表示する関連する親ノボディ（ｋｎｏｂｏｄｙ）対照と比較して３つのライブラリ（抗Ｆｃ ＭＡＣＳ精製後）について表示される。（左から右へ）：（ａ）ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩライブラリセットＡ（点線）とＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩ対照（黒線）、（ｂ）ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩライブラリセットＢ（点線）とＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩ対照（黒線）、（ｃ）ＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１ライブラリ（点線）とＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１対照（黒線）。
実施例１．可溶性発現についての標的化ベクターおよび細胞表面の構築はＩｇＧ形式の抗体を表示した
高等真核細胞の表面上での抗体を含む結合剤分子のディスプレイおよびそれらのその後の遺伝的選択を可能にするために、ベクターは、結合剤遺伝子を宿主ゲノムの特定の位置に標的化するために使用され得る。ベクターは、選択可能なマーカーをコードして、安定した細胞株の選択を可能にすることができ、この選択可能なマーカーは、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する遺伝子をコードすることができる。標的化ベクターは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターを含むことができる。あるいは、導入遺伝子は、内因性プロモーターの下流の位置で細胞ＤＮＡに組み入れられて、正しく組み入れられた導入遺伝子の優先的な選択を可能にすることができる。標的化ベクターはまた、相同性アームをコードして、関連する染色体遺伝子座およびプロモーターへの相同組換えを可能にし、結合剤分子およびポリアデニル化（ｐＡ）部位の発現を駆動するであろう。結合剤分子遺伝子は、小胞体（ＥＲ）を介して細胞表面および膜貫通ドメインまたはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーのような膜アンカーへの分泌を可能にするリーダー配列をコードするＤＮＡに融合されるであろう。
本明細書で使用される標的化ベクターの概略図が図１ａに示され、注釈付きの完全なＤＮＡ配列が図１ｂに示される。プラスミドは、発現カセットに隣接するＡＡＶＳ相同性アームを含み、導入遺伝子のヒトＡＡＶＳ部位への相同組換えを可能にする。ＡＡＶＳ遺伝子座は、最初にアデノ随伴ウイルスの共通の組入れ部位として特定され、ヒト細胞における異種遺伝子の挿入および発現のための「安全な港」の遺伝子座である９３。ＡＡＶＳ部位内でのヌクレアーゼ媒介性切断後、標的化ベクターにおけるＡＡＶＳ相同性アームは、相同組換えによる発現カセットの組入れを促進する。ブラストサイジン遺伝子は、ベクター内のプロモーターを欠くが、ＡＡＶＳ遺伝子座の上流のエクソンとインフレーム融合を創出するスプライスアクセプターがその前に続く。抗体重鎖および軽鎖発現カセットの詳細は、以下および図１で説明される。
標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（図１ａおよび１ｂ）を、その後のアセンブリを可能にする制限部位を有する前述のベクター（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）から選択された断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって構築した。次に、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤの様々な要素の起源が説明される。５’ ＡｓｉＳＩおよび３’ ＢｇｌＩＩ制限酵素の添加を伴うＰＣＲ増幅（１５１１ｂｐ）によるｐＤ２プラスミド（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）に由来する、ＡＡＶＳ左相同性アーム、スプライスアクセプター、ブラストサイジン耐性遺伝子、ポリアデニル化部位、および伸長因子１アルファプロモーター（ｐＥＦ１α）をコードするＤＮＡ。ＭｙｃタグおよびＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインをコードするＤＮＡを、ｐＤ２プラスミドから５’ＩｇＧ１ ＣＨ３相同性配列および３’− ＨｉｎｄＩＩＩ部位を添加してＰＣＲ増幅した。軽鎖ＢＭ４０リーダー、抗リゾチーム抗体Ｄ１．３の可変軽鎖（ＶＬ）９４、ヒト定常光（ＣＬ）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐＡ、最初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、イントロンにより分割されたマウス重鎖リーダー、抗リゾチーム抗体Ｄ１．３の可変重鎖（ＶＨ）およびＩｇＧ１抗体定常重ドメイン１〜３（ＩｇＧ１ ＣＨ１−３）をコードするＤＮＡを、５’ ＢｇｌＩＩ部位およびＭｙｃタグをコードするＤＮＡの３’添加を有する、前述のｐＩＮＴ３プラスミド（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）からＰＣＲ増幅した。ＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのｐＩＮＴ１７−ＢＳＤの４４４６ｂｐ領域をコードする２つのフラグメントを、ＰＣＲアセンブリで組み合わせて、ＰＤＧＲ膜貫通ドメインを直接ＣＨ３末端に添加した。ＡＡＶＳ右相同性アームをコードするＨｉｎｄＩＩＩからＳｂｆＩまでの領域を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｂｆＩ制限部位の添加を有するｐＤ２プラスミド（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）からＰＣＲ増幅（１１６８ｂｐ）した。ｆ１およびｐＵＣ複製起点ならびにｐＳＦ−ＥＦ１ａｌｐｈａ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＯＧ４３）に由来するＳｂｆＩからＡｓｉＳＩ部位までのカナマイシン耐性遺伝子を包含するベクター骨格。図１ｂに示される例は、ヒト抗リゾチーム抗体のＶＬとＶＨをコードするが、これは、標準的な分子生物学的技術（例えば、隣接する制限酵素を使用してＶＬ遺伝子とＶＨ遺伝子を置き換える）を使用して、他の特異性を簡単に置き換えられ得る。
実施例２．３対の抗体に対する親および開発性が強化されたクローンの表面提示レベルの比較
３つの抗体対を調査したが、元の親抗体は、不十分な開発性プロファイルと、それらの自己相互作用および交差相互作用の特性を改善するために改変された、それらの再操作された娘分子と、を保持する。このパネルは、インターロイキンＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体であるＣＮＴＯ６０７と、その修飾された対応物であるＣＮＴＯ６０７ Ｗ１００Ａ１４を含んだ。ＣＮＴＯ６０７は、中性ｐＨで溶解性が不十分であり、ＰＢＳ緩衝液において高濃度で沈殿し、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）アッセイ３９で測定された自己相互作用を表示する。ＣＮＴＯ６９７の構造決定は、重鎖ＣＤＲ３における疎水性パッチを明らかにした。ＶＨ ＣＤＲ３変異Ｗ１００Ａは、その抗体溶解度および交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）プロファイルの両方を改善した４７。ＣＩＣは、カラムマトリックスに固定化されたヒト血清ポリクローナル抗体への結合を測定する。第２の例は、Ｔｉｅ２受容体の可溶性リガンドであり、病的な血管新生の調節因子であるアンジオポエチン２を標的化するＡｎｇ２ｍＡｂという名前のモノクローナル抗体である。しかしながら、Ａｎｇ２ｍＡｂは不十分な発現および凝集両方を呈することが報告されている。１９の変異型の構造モデリングと実験的スクリーニングの組み合わせは、不対システイン残基を変異させた、よりよく発現するＡｎｇ２ｍＡｂ Ｃ４９Ｔ６の操作につながる。最後に、ＴｒｋＡおよびｐ７５受容体を介したシグナル伝達を阻害する抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体であるＭＥＤＩ−１９１２を含めた７。ＭＥＤＩ−１９１２は、慢性疼痛の治療に潜在的に使用され得るが、溶液における沈殿および凝集ならびに不十分な薬物動態プロファイルを示す。ＭＥＤＩ−１９１２はピコモルの親和性でＮＧＦに結合し、自己凝集の点で良好に動作したＭＥＤＩ−５７８という名前の「祖父母」抗体から親和性成熟された。水素／重水素交換−質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）および分子モデリングにより、ＶＨドメイン上にＶＨ ＣＤＲ１およびＣＤＲ２内の残基によって引き起こされる疎水性パッチを特定した。このことは、自己会合および結果として生じる凝集の原因となるアミノ酸の予測を可能にした。このことは、次いでＮＧＦ７についての効力と親和性を保持しながら自己相互作用インターフェースを中断する変異Ｗ３０Ｓ、Ｆ３１Ｔ、およびＬ５６Ｔを有する三重変異体（ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ）の設計を可能にした。
ＣＮＴＯ６０７、ＣＮＴＯ６０７−Ｗ１００Ａ、Ａｎｇ２ｍＡｂ、Ａｎｇ２ｍＡｂ−Ｃ４９Ｔ、ＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴの重および軽可変ドメイン（配列について表１）を参照されたい）をコードする合成ＤＮＡを、哺乳動物ディスプレイベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤにクローニングし（ベクターマップおよび配列については実施例１を参照されたい）、ＤＮＡ配列を確認し、トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを調製した。トランスフェクションの１日前に、懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地に５×１０５個の細胞／ｍｌで播種した。細胞が１０ｍｌ中１×１０６細胞／ｍｌの密度に達した際に、ＰＥＩトランスフェクションを実行した。ｐＩＮＴ１７を保持する抗体遺伝子（１ｕｇ）、左右のＴＡＬＥＮプラスミド（各５ｕｇ）を、混合し、無添加のＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（１ｍｌ）において希釈した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、線形、２５０００ Ｄａ ＭＷ（１０ｕｌ、１ｍｇ／ｍｌ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、添加し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３懸濁細胞に添加した（１０ｍｌのＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地中１×１０６細胞／ｍｌ）。トランスフェクションの４８時間後に、７μｇ／ｍｌの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクション１５日後（ｄｐｔ）、抗ヒトＦｃ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で細胞を染色した。次いで、抗体を表示するモノクローナル細胞株を以下のプロトコルによって染色した。抗体または野生型ＨＥＫ２９３細胞（１００万個の細胞）を表示するＨＥＫ２９３細胞株を、ペレット化した（２００ｇ、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）で３分）。ペレットをＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、遠心分離した（６００ｇ、２．５分）。ペレットを、１％ＢＳＡ、抗Ｆｃ ＰＥ（５μｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁した。混合物を、遮光して、４℃で３０分間インキュベートした。０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（９００μｌ）を添加し、細胞をペレット化した（６００ｇ、２．５分）。細胞を０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、この洗浄ステップを１回繰り返した。細胞を、７−ＡＡＤ（１００万個の細胞あたり５μｌ）を含む０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（２００μｌ）に再懸濁した。標識された細胞（５０μｌ）を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ｉＱｕｅスクリーナーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析（図２）は、元の問題のある親分子と比較して、３つすべての抗体対についての改善された娘分子について改善されたディスプレイレベルに対して、増加した抗体ディスプレイレベルを示した。
Figure 2021509010
実施例３ａ．高濃度での細胞表面提示レベルと自己相互作用との関係
実施例２に記載される抗体の特性を調査するために、抗体発現および精製を実施した。ＣＮＴＯ６０７、ＣＮＴＯ６０７−Ｗ１００Ａ、Ａｎｇ２ｍＡｂ、Ａｎｇ２ｍＡｂ−Ｃ４９Ｔ、ＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴの重および軽可変ドメインをコードする合成ＤＮＡ（配列については表１を参照されたい）を、ｐＩＮＴ３（ＷＯ２０１５／１６６２７２Ａ２）に基づくデュアルプロモーターＩｇＧ可溶性発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列によって正しいクローニングを確認した。
プラスミドＤＮＡを調製し、これを使用して、製造業者の指示（Ａ１４５２５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＥｘｐｉ２９３細胞（最終培養体積スケール３０ｍｌ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、２５．５ｍｌのＥｘｐｉ２９３発現培地に２×１０６個の細胞／ｍｌの密度で細胞を播種した。プラスミドＤＮＡ（３０μｇ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１．５ｍｌ）で希釈し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（８０μｌ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１．５ｍｌ）で希釈して、室温で５分間インキュベートした。次いで、希釈したプラスミドＤＮＡ（１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中３０μｇ）を希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中８０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ）に添加し、室温で２０分間インキュベートした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、５％湿度でインキュベートし、１３０ｒｐｍで撹拌した（２５ｍｍ軌道スロー、ＩＳＦ１−Ｘ、Ｃｌｉｍｏ−Ｓｈａｋｅｒ、Ｋｕｈｎｅｒ）。発現の５日後、培養上清を遠心分離（２０００ｇ、２０分）によって採取した。
５０ｍｌ遠沈管中の培養上清を１／１０容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）の添加によりｐＨ調整し、プロテインＡセファロースＦＦ樹脂（３００μｌ、Ｇｅｎｅｒｏｎ、ＰＣ−Ａ１００）を添加し、室温で１時間攪拌してインキュベートした。５０ｍｌチューブを２０００ｇで５分間遠心分離してビーズを回収し、おおよそ１ｍｌのビーズスラリーを残して上清を廃棄した。このスラリーを、フリットを有するカラムに負荷し（Ｐｒｏｔｅｕｓ「１ステップバッチ」ミディ（ｍｉｄｉ）遠心カラム。Ｇｅｎｅｒｏｎ、ＧＥＮ−１ＳＢ０８）、遠心分離し（５０ｇ、４℃で１分間）、フロースルーを廃棄した。カラムを２ｘＰＢＳ（２×１０ｍｌ）で洗浄した後、各洗浄ステップ後に遠心分離（５０ｇ、４℃で１分）した。カラムマトリックスに添加された溶出緩衝液（９００ｕｌ、０．２ＭグリシンｐＨ２．６）を使用して抗体を溶出し、中和緩衝液（３００ｕｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）を使用して溶出液を直ちに中和した。次いで、抗体をプロテインＡセファロースカラムから遠心分離（５０ｇ、４℃で１分）により直接中和緩衝液に溶出した。抗体を、ＧｅＢＡｆｌｅｘマキシチューブ（８ｋＤａ分子量カットオフ、Ｇｅｎｅｒｏｎ、Ｄ０４５）への移動で緩衝液交換し、４リットルのＰＢＳおよびインキュベーション中において４℃で少なくとも３〜１８時間透析した。この透析ステップを、第２の４Ｌ ＰＢＳ透析ステップで繰り返した。抗体の収量および濃度を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定し、濃度を見積もるために１．４の推定吸光係数を使用してランバート・ベールの法則を使用して計算することによって決定した。
一過性発現によって生成されたポリペプチドの収量は、開発性の指標と考えられ得る。実施例２からの３対の抗体間の一過性トランスフェクションにおける発現収量を比較は親抗体のより低い発現を示したが、開発性の可能性の有意差は、一過性トランスフェクションの収量を単に比較するだけでは、明らかではなかった（表２）。例えば、親ＣＮＴＯ６０７抗体の発現収量は３４ｍｇ／Ｌであったが、改善した溶解度ＣＮＴＯ６０７−Ｗ１００Ａ抗体発現収量は５５ｍｇ／Ｌであった。同様に、ＭＥＤＩ−１９１２の親抗体の発現収量は、改善したバージョンについての５３ｍｇ／Ｌと比較して３３であった。Ａｎｇ２ｍＡｂの収量は、操作された子孫Ａｎｇ Ｃ４９Ｔについての３４ｍｇ／Ｌと比較して１３ｍｇ／Ｌであった。
ポリペプチドの融解温度は、「開発性」を予測するための代用物とみなされることがあり、場合によっては、抗体は、より開発可能な抗体９〜１１の生成を期待して、改善した融解温度のために選択されている。融解温度（Ｔｍ）および凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を、製造業者の指示に従ってプロメテウスＮＴ．４Ｂ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して決定した。小さな毛細血管を使用して、０．５ｍｇ／ｍｌでの抗体溶液を約８〜１０μｌ採取した。次いで、キャピラリーを適所にクリップして、熱溶融分析用のＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ装置による蛍光スキャンを行った。Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓフィッティングソフトウェアを使用して、融解の開始温度と散乱の開始温度を決定した。抗体の融解温度（Ｔｍ）および凝集温度（Ｔａｇｇ）は、抗体対セットの間および臨床的に承認された陽性対照抗ＰＤ１抗体と比較しての両方で、類似していた（表２を参照されたい）。このデータは、この抗体セットの融解温度および凝集温度が自己相互作用および非特異的交差相互作用の生物物理学的プロファイルを予測するものでないことを示す。
分取サイズ排除クロマトグラフィー中に、ＭＥＤＩ−１９１２はＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（図３）と比較してより早い溶出プロファイルを表示し、かつそれが高分子量種として存在し自己相互作用を起こしやすいことを示す。残りの抗体は、ニボルマブと同様のプロファイルで溶出した。動的光散乱（ＤＬＳ）による抗体自己相互作用の測定を可能にするために、サイズ精製された抗体を限外濾過のよって濃縮した。各抗体対について達成された抗体濃度を表２に示す。これは、限外濾過膜を遮断する抗体沈殿が起こる前に、親抗体ＭＥＤＩ−１９１２およびＣＮＴＯ６０７をそれぞれ１．４ｍｇ／ｍｌおよび１．８ｍｇ／ｍｌを超えて濃縮することが不可能であることを明らかにした。対照的に、溶解度が増強された娘分子ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴおよびＣＮＴＯ６０７＿Ｗ１００Ａを、沈殿の証拠を伴わずそれぞれ２９および３０ｍｇ／ｍｌに濃縮することは可能であった。濃縮されたＡｎｇ２ｍＡｂ対については沈殿は観察されなかった。動的光散乱（ＤＬＳ）は、親抗体ＭＥＤＩ−１９１２およびＣＮＴＯ６０７（表２）について高次の凝集種を検出したが、計算された多分散指数（ＰＤＩ）およびキュムラント（またはｚ平均）サイズから判断すると、娘分子ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴおよびＣＮＴＯ６０７＿Ｗ１００Ａについては検出しなかった。例えば、親ＣＮＴＯ６０７およびＭＥＤＩ−１９１２についてのＰＤＩはそれぞれ０．２２と０．１５であったが、娘分子についてのＰＤＩはそれぞれ０．１および０．１２であり、より均一な単分散状態を示す（表２）。同様に、親ＭＥＤＩ−１９１２の平均粒子サイズはそれぞれ２２ｎｍでしたが、娘分子ＭＥＤＩ−１９１２−ＳＴＴの平均粒子サイズは１３ｎｍであり、低次の凝集状態を示す（表２）。したがって、有意な自己相互作用が発生しており、より低い濃度での検出可能な自己相互作用がおよびより高い濃度での沈殿をもたらす。
Figure 2021509010
この実施例は、抗体の哺乳動物細胞ディスプレイレベルと３つの異なる抗体対の生物物理学的特性との非常に明確な関係を実証する。自己相互作用、交差相互作用、および不十分な薬物動態（ＭＥＤＩ−１９１２）に関する文書化された問題を有するＩＬ−１３（ＣＮＴＯ６０７）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２ｍＡｂ）、神経成長因子（ＭＥＤＩ−１９１２）に特異的な親抗体はすべて、溶解度が増強された娘分子と比較してより低い細胞ディスプレイレベルをもたらした（図２）。
実施例３ｂ．細胞表面での抗体濃度に関する支持理論
この実施例は、真核細胞における強力なポリペプチド発現がポリペプチドが細胞表面に保持されている場合に潜在的に高い局所濃度を達成できるという発明者の提案を理解することに役立ち得る根本的な理由を提示する。
本明細書に記載の研究において、懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞が抗体ディスプレイに使用される。ＨＥＫ２９３細胞株は哺乳動物（ヒト）由来である。細胞は半径１０ミクロンのほぼ球形である９５。懸濁液ＨＥＫ２９３細胞を球として扱うと、その表面上の抗体が占める体積を計算できる。（この実施例のために、細胞表面のすべての領域が抗体ディスプレイのために等しくアクセス可能であると仮定する。このことが事実でなければ、抗体のより高い局所濃度が達成されるであろう。）球の半径（ｒ）は、式４／３πｒ３＝４．１８ｒ３から算出され得る。抗体の高さを１５０オングストローム（Å）（＝１５ｎｍ）とすると、それは容積４．１８（ｒ ＋ １５０ Å）３のより大きな球に存在するであろう。したがって、抗体の体積は、これと細胞の体積との差異である。
半径１０ミクロンの細胞の体積は、
４．１８×１０−１５ｍ３（４１８０×１０−１５リットル）である。
抗体を含むより大きな球の体積は、
４．１９８×１０−１５ｍ３（４１９８×１０−１５リットル）である。
したがって、表示される抗体は、
０．０１８×１０−１５ｍ３の（１８×１０−１５リットル）の体積を占める。
同様に、異なるサイズの細胞について体積の差異を計算できる。
抗体／細胞の数、分子量、および占有体積が分かれば、細胞表面で達成される濃度を計算できる。Ａｖｏｇａｄｒｏの定数を使用すると、６×１０２３抗体分子／ｌが１５０，０００ｍｇ／ｍｌの濃度になることがわかる。したがって、６×１０１８抗体分子／ｍｌの濃度は１．５ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）になる。このアプローチにより、表３に示される濃度が計算される。
Figure 2021509010
これらの計算では、細胞表面上の抗体の数は１０６コピー／細胞とみなされる。コピー数を実験的に決定する方法は、本明細書の他の場所で詳述されており、実施例７に例示される。
表３から、半径１０ミクロンの細胞（懸濁培養のＨＥＫ２９３細胞など）上での１０６抗体／細胞のディスプレイが１０ｍｇ／ｍｌを超える濃度であると推定される。そのような濃度では、タンパク質自己相互作用の問題が起こり得る。したがって、凝集する傾向を有する抗体は、小胞体の通過の減少９６および分解の増加により、細胞表面上での低下した表示を有し得る。結果として、より低いレベルのディスプレイは、自己相互作用しない抗体と比較して、自己凝集しやすい抗体について観察されるであろう。
実施例４．表面提示レベルに基づいて「開発性が強化された」抗ＮＧＦ抗体を富化する
実施例３では、抗体の生物物理学的特性、特に自己凝集とそれらの哺乳動物細胞ディスプレイレベルとの間の関係が説明された。このことは、元の親抗体が自己および交差相互作用の点で不十分な生物物理学的特性を備有する３つの抗体対を取ることによって例示され、これらの特性は、選択されたアミノ酸を変更して改善された生物物理学的特性を有する娘分子を創出することによって改善された。３つすべての場合で、問題のある親抗体と比較して、改善された生物物理学的特性を有する娘分子がＨＥＫ２９３細胞の表面上に増加したレベルで表示する。この実施例では、哺乳動物のディスプレイによってクローンの混合集団から優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化することが可能であることを実証する。マウスモデル７で自己相互作用特性および不十分な薬物動態を有する親抗ＮＧＦ ＭＥＤＩ−１９１２、および改善された娘ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴがこの研究のために選択された。モデル実験が行われ、以前説明されたように（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）、ＡＡＶＳ遺伝子座にドナープラスミドを誘導するＴＡＬＥヌクレアーゼ対をコードするプラスミドとともに親および修飾されたＴＥＫをコードするプラスミドとともに親抗体と修飾抗体をコードする哺乳類ディスプレイプラスミド（実施例１）を等量でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、ＭＥＤＩ−１９１２またはＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴを表示するＨＥＫ２９３細胞の混合集団を創出した薬物選択後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行い、高い抗体提示レベル、選択された抗体遺伝子および配列の単離に基づいて細胞を選択した混合集団からの改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を実証する。
ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２およびｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（説明については実施例２を参照されたい）を、１：１の比率で混合し、この混合物を、ＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化を使用してＨＥＫ２９３細胞のゲノムに組み入れた。対数増殖期中期のＨＥＫ２９３懸濁細胞（１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖）を２００ｇで１０分間遠心分離して回収し、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液に１×１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２（１μｇ）、ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ（１μｇ）、ＡＡＶＳ指向性ＴＡＬＥＮベクター対（各１０μｇ）からなるプラスミドＤＮＡ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞（１００μｌ、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液において合計１×１０７細胞）に添加し、ＯＣ１００電気穿孔キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ電気穿孔系を使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を３７℃で２０分間回収し、ＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で希釈し、５％ＣＯ２下、１２０ｒｐｍ、３７℃で維持した。トランスフェクションの４８時間後に、７μｇ／ｍｌの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクションの１５日後、ＤＡＰＩ染色が７−ＡＡＤ染色に置き換わり、ＮＧＦ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＡＰＣ染色を採用して抗原結合を検出し、１，０００万個の細胞を染色するまでスケールアップした以外は、実施例２に記載のように細胞を染色した。ＭＥＤＩ−１９１２／ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ混合ＨＥＫ２９３哺乳動物ディスプレイ集団を、フローサイトメトリー（図５ａ）によって抗体提示レベルについて分析し、これは、異なる抗体レベルを表示する２つの主要な細胞集団を明らかにした。２つの集団は、オーバーレイプロット（図５ａ）に示されるように、モノクローナルＭＥＤＩ−１９１２およびＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴ抗体のディスプレイレベルと相関した。混合集団は、ＦＡＣＳによって２つの集団に選別された：抗体提示レベルの低および高提示レベルグループ（それぞれゲート５および６、図５ｂ）。
ゲノムＤＮＡは、ＦＡＣＳで選別された細胞集団から調製された（ゲート５および６、図５ｂ）。ＩｇＧインサートをコードするＤＮＡを、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅した。アウターＰＣＲは、以下のゲノム特異的プライマーで実行した。フォワード：ＣＣＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＣおよびリバース：ＴＣＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＧ。外側のＰＣＲからのＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、組み入れられたＩｇＧインサートを以下のプライマーで増幅した。ＫＯＤポリメラーゼ（７１０８６、Ｍｅｒｃｋ）を製造元の条件に従って使用する、フォワード：ＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣおよびリバース：ＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧ。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示（２００１５９６４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってバーコード化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォームで配列決定した。おおよそ１００万の読み取りを分析し、このことは、高い抗体提示レベル（ゲート５、図５ｂ）について選別された集団がＭＥＤＩ−１９２２＿ＳＴＴ抗体（９６％、図６）に富むことを明らかにした。低い抗体提示について選別された集団を、親ＭＥＤＩ−１９１２抗体について富化した（８５％、図６）。この実施例は、抗体細胞表面ディスプレイレベルに基づいてクローンを選択することによって、混合集団から、哺乳動物細胞ディスプレイによって改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を示す。これは、安定した細胞株の混合集団からの親抗体ＭＥＤＩ−１９１２と比較して優れた生物物理学的特性を有するＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴの富化によって例示される。
混合集団において優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化することが可能であることを示し、哺乳動物ディスプレイによる提示レベルのみに基づく変異型の大規模なライブラリから改善された抗体を特定することが可能であることを実証する。説明したように、ＶＨ ＭＥＤＩ１９１２上の残基Ｗ３０、Ｆ３１、およびＬ５６は、この抗体の表面上に疎水性パッチを形成する可能性を有する７。これらの残基をランダム化のために選択し、ＶＨライブラリを合成ＤＮＡテンプレートからＰＣＲアセンブリ変異誘発によって構築した（アミノ酸および核酸の配列ならびにプライマーの位置については図４を参照されたい）。製造業者の指示に従って、ＫＯＤポリメラーゼ（７１０８６−３、Ｍｅｒｃｋ）を使用して、３つのＰＣＲ産物をＶＨテンプレートから増幅した。
ａ．プライマーＭＥＤＩ−１９１２−Ｆ３（ＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧ）およびＭＥＤＩ１９１２＿Ｗ３０ＮＮＳ＿Ｆ３１ＮＮＳ（ＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＡＡＡＧＧＣＧＣＣＳＮＮＳＮＮＡＡＡＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡ）で増幅されたＶＨ１（９５ｂｐ）。
ｂ．プライマーＭＥＤＩ−１９１２−Ｆ（ＧＧＣＧＣＣＴＴＴＡＣＡＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧ）およびＭＥＤＩ−１９１２＿Ｌ５６ＮＮＳ（ＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴＧＧＴＳＮＮＧＣＣＧＡＡＧＡＴＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣ）で増幅されたＶＨ２（１０２ｂｐ）。
ｃ．プライマーＭＥＤＩ−１９１２−Ｆ２（ＡＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧ）およびＭＥＤＩ−１９１２−Ｒ（ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＧ）で増幅されたＶＨ３（２１３ｂｐ）
上記に列挙された３つのＰＣＲ産物（ＶＨ１、ＶＨ２、およびＶＨ３）を、組み合わせ（各１０ｎｇ）、メーカーの指示に従ってＫＯＤポリメラーゼ（７１０８６−３、Ｍｅｒｃｋ）を使用する外側プライマーＭＥＤＩ−１９１２−Ｆ３およびＭＥＤＩ−１９１２−ＲでのＰＣＲ反応において組み立てた）。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ １で消化したｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２（ＭＥＤＩ１９１２のＶＬをコードするｐＩＮＴ１７哺乳動物ディスプレイベクター（図１））、（１００ｎｇ）とライゲーションした。次いで、このライゲーション混合物をｍｉｎｉ−Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、精製したライゲーション混合物を５０μｌのＥ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ ｅｌｉｔｅエレクトロコンピテント細胞（６００６１−１、Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。０．１ｃｍのキュベットを使用して細胞をパルスし、２ｍｌの回収培地で回収し、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間増殖させた。ライブラリサイズを計算するために、細胞を１０００分の１に希釈し、直径１０ｃｍの２ＴＹ−カナマイシンプレートに１０μｌと１００μｌを播種した。残りの細胞を遠沈し、直径２×１０ｃｍの２ＴＹ−カナマイシンプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを１０ｕｌプレートからカウントし、１．１×１０６のライブラリサイズを計算した。ＮＮＳコドンを使用して３つの残基をランダム化して構築されたライブラリは３２，７６８の変異型をコードするため、実験的なライブラリのサイズは理論的なライブラリのサイズを３４倍超えた。形質転換体プレートをかき取り、細胞密度を６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）を読み取ることにより測定し、培地の２ ＯＤユニット（２ｘＯＤ６００）の均等物を５０ｍｌのＣｉｒｃｌｅｇｒｏｗ培地に接種するために使用し、２５０ｍｌバッフルフラスコにおいて３７℃で３〜４時間培養し、おおよそ４００ｘＯＤ６００ユニットを回収し、ミディプレップ（ｍｉｄｉｐｒｅｐ）プラスミドＤＮＡを調製した（ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２−ライブラリ）。
ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２−ライブラリを、ＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のために使用した。対数増殖期中期のＨＥＫ２９３懸濁細胞（１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖）を２００ｇで１０分間遠心分離して回収し、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液に１×１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２−ライブラリ（８μｇ）、ＡＡＶＳ指向性ＴＡＬＥＮベクター対（各４０μｇ）からなるプラスミドＤＮＡ混合物を、ＨＥＫ２９３細胞（４００μｌ、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液において合計４×１０７細胞）に添加し、ＯＣ４００電気穿孔キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ電気穿孔系を使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を３７℃で２０分間回収し、ＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で希釈し、５％ＣＯ２下、１２０ｒｐｍ、３７℃で維持した。トランスフェクションの４８時間後に、７μｇ／ｍｌの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクション１５日後、実施例３に記載のように細胞を分析し染色した。ＭＥＤＩ−１９１２ライブラリ（図７ｃ）を表示したＨＥＫ２９３のフローサイトメトリー分析は、ライブラリが、ＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴモノクローナル細胞株と同等の抗体ディスプレイレベル（図７ｂ）と、親ＭＥＤＩ−１９１２モノクローナル細胞株より高いディスプレイレベル（図７ａ）とを示した混合集団内で細胞を保持することを示した。このことは、ディスプレイレベルの点でＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴと同等のクローンがＭＥＤＩ−１９１２集団に存在することを示唆した。
ライブラリ集団を抗体提示レベル（図７ｃ）に従ってＦＡＣＳによって選別し、抗体遺伝子をＰ５およびＰ６ゲーティングされた集団から回収し、ＶＨ遺伝子を上に記載されるように「次世代配列決定」（ＮｅｘｔＧｅｎ）によって配列決定した。図８は、哺乳動物ディスプレイで選択された集団について残基３０、３１、５６についてのアミノ酸同一性ヒストグラムプロットを示す。このことは、３１位でのアミノ酸Ｓ、Ｔ、Ｐの濃縮、３２位のアミノ酸Ｓ、Ｐ、Ｎの富化、ならびに５６位でのアミノ酸Ｒ、Ｓ、ＴおよびＰの富化を示した。
哺乳動物のディスプレイで選択された抗体の生物物理学的特徴付けを可能にするために、ＶＨ遺伝子を、実施例３で説明されるように、選択された集団のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（ゲートＰ５およびＰ６図７）。上に記載されるように、ＶＨインサートをｐＩＮＴ１７−ＭＥＤＩ−１９１２、ＮｃｏＩおよびＭＥＤＩ−１９１２ ＶＬを収容するＸｈｏＩカットベクターにクローニングし、ライゲーション混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。１８８個の形質転換体を選び、プラスミドＤＮＡを調製し、これらをＤＮＡ配列決定して、３０、３１および５６位でのコドンの同一性を特定した。次に、ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定（図８）による出現頻度に基づいて選択されたクローンを、実施例２に記載されているように、一過性トランスフェクションおよびアフィニティ精製による発現用に選んだ。限外濾過による動的光散乱（ＤＬＳ）による分析の前に、抗体を濃縮した。すべての抗体は、親ＭＥＤＩ−１９１２抗体より８倍〜２９倍まで濃縮されることができ（表４）、これらの濃度での沈殿の証拠はなく、選択された抗体が親の抗体よりも高い溶解度を有することを示した。ＤＬＳは、選択された抗体が親抗体ＭＥＤＩ−１９１２よりも小さな平均粒子サイズ（Ｚ−Ａｖｅ）および低い多分散性（ＰＤＩ）を有することも示した（表４）。４つの選択されたクローン（Ｐ５＿Ｃ０６、Ｐ５＿Ｆ０１、Ｐ６＿Ｃ０８およびＰ６＿Ｆ０２）は、以前に報告された改善されたクローンＭＥＤＩ−１９１２＿ＳＴＴと比較して、優れたまたは同等の単分散性を示した。ランダムなサブライブラリの作成と哺乳動物のディスプレイの選択によって選択された改善された変異型は、平均して元の疎水性残基を親水性残基に変更した。
Figure 2021509010
この実施例は、不十分な生物物理学的特性を有する抗体を哺乳動物ディスプレイ選択による溶解度およびより低い自己相互作用の点で改善された特性を有するものに形質転換することが可能であることを示す。このことは、選択された残基のランダム変異誘発と、ＨＥＫ２９３細胞の表面上に表示される大きなランダム抗体変異型ライブラリの作成とによって達成された。抗体の開発性プロファイル（例えば、溶解度）を評価する現在の最新技術は、完全な生物物理学的およびＰＫ測定を可能にするために、マルチｍｇスケールでの大規模な発現および精製を必要とする。ポリペプチド提示レベルの差異を使用するこの実施例では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の違いによって判断されるように、数百万の変異型を作成し、改善した生物物理学的特性有することがその後示された抗体を選択することが可能であることを実証する。このプロセスは、新規抗体がナイーブライブラリまたはファージディスプレイのような別の系で事前選択されたライブラリから選択される場合に適用され得る。あるいは、本発明はまた、変異型のライブラリが創出されて哺乳動物細胞の表面上に提示される抗体の親和性成熟またはヒト化の間に適用され得る。
実施例５．変異型ライブラリの構築および開発性が増強された抗ＰＳＫ９クローンの選択
ボコシズマブは、血清中の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を低減するためにＰｆｉｚｅｒによって開発されていた、抗プロプロテイン転換酵素サブスチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）ｍＡｂである。ボコシズマブの作用機序は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）のＰＣＳＫ９介在性分解を阻害し、それによって血清ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を減少させることある９７。この抗体は２０１６年１１月に開発から取り下げられ、Ｐｆｉｚｅｒが「患者、医師、株主に価値を提供することはなさそうだ」と発表した。ボコシズマブの生物物理学的特性は最適ではないことが報告されており２、このことはその臨床的失敗の理由であり得る。例えば、ボコシズマブは、様々なアッセイで自己凝集および交差相互作用の両方を表示した２。対照的に、ＦＤＡ承認の抗ＰＣＳＫ９アリロクマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）抗体は、同じアッセイにおいて同じレベルの自己凝集および交差相互作用を表示しなかった。
ボコシズマブは当初、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスの免疫化と、それらのＰＣＳＫ９活性を阻害する能力についてハイブリドーマクローンを産生するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をスクリーニングすることと、によって発見された９８。次いで、マウスｍＡｂ ５Ａ１０（米国特許：ＵＳ ８３９９６４６ Ｂ２）を、ＶＨ ＣＤＲ１およびＶＨ ＣＤＲ２におけるアミノ酸置換で、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）ドメインから相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡをヒトフレームワーク９９にクローニングすることによってヒト化し、ヒト化ｍＡｂ ５Ａ１０−ｉを得た。このヒト化抗体５Ａ１０−ｉを、以前に説明されたようにさらに親和性成熟させ１００、ボコシジマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｉｍａｂ）を得た。親マウスｍＡｂ ５Ａ１０、ヒト化中間抗体５Ａ１０−ｉ、およびボコシズマブについてＶＨおよびＶＬドメインについての配列アラインメントが図９に示される。ＰＣＳＫ９に対する５Ａ１０、５Ａ１０−ｉ、およびボコシジマブの親和性（平衡解離定数またはＫＤ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはＫｉｎＥｘＡ（米国特許：ＵＳ ８３９９６４６ Ｂ２）によって決定されると、それぞれ１ｎＭ、１．５ｎＭ、７ｐＭである。ＰＣＳＫ９と複合体化したボコシジマブＦａｂ断片の結晶構造は決定されており９８、このことは、ＶＨ ＣＤＲ３を通じた主な寄与を伴い、抗体が軽鎖および重鎖の両方を通じてＰＳＫ９の触媒ドメインに結合することを示している。
ＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介性抗体遺伝子組入れおよび細胞表面上のディスプレイ後、それが由来するヒト化中間バージョン５Ａ１０−ｉと比較して、ボコシズマブの低下した細胞表面提示を観察した（図１０）。この実施例の目的は、変異型のライブラリから、ボコシズマブの変異型が、安定性の改善された生物物理学的特性、低下した自己凝集、低下した交差相互作用特性または保持された標的抗原結合を有する「粘着性」を示す、良好な提示レベルを有する哺乳動物ディスプレイにより選択され得ることを示すことである。その不十分な生物物理学的特性に寄与し得る抗体の領域または「パッチ」を最初に特定することが重要である。例えば、ポリペプチド配列内の隣接する疎水性アミノ酸残基は、そのタンパク質の不十分な発現レベルをもたらし得ることが知られている１０１。また、抗体上の疎水性パッチは不十分な生物物理学的特性をもたらし得る６、７、１４。同様に、クラスター化されたリジンまたはアルギニン残基から抗体表面上の正電荷のパッチはまた、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）２２またはヘパリン硫酸などの負に荷電した分子を発現した細胞２３への非特異的結合により交差相互作用をもたらし得る。
本発明を使用して改善された結合剤を作成するプロセスは、ライブラリ内で変更するための候補としての配列内の残基の特定から始まる。これらの位置は、２つ以上の代替的なアミノ酸を使用するランダム化のための部位として機能するか、または単一のアミノ酸での置換のための部位であり得る。変異誘発は、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発などの当業者に既知のアプローチを使用して行われ得る（１０２Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびその中の参考文献）。このボコシズマブの場合、三次元構造が利用可能であり、これを分析し、候補アミノ酸残基を変異誘発のために特定した。構造モデリングは、変異誘発のための標的アミノ酸を特定するのに役立てるため、代替として使用され得る。
本発明内で数百万の変異型を創出およびスクリーニングする機能は、配列変異型の徹底的な検索が、例えば、線形配列を見ることによる３Ｄ構造情報またはモデルがなくても行われ得ることを意味する。このことは、疎水性や電荷クラスタリングなどの特徴に対する線形配列を分析することで実行され得る。代替として、個々のアミノ酸に焦点を当てた変異スキャンは、親和性成熟キャンペーン中に大規模な組み合わせ変異誘発キャンペーンを導くために行われ得る１０３。同じアプローチにより、個々のアミノ酸は、代替的なアミノ酸セットで置換され、生物物理学的特性を改善する可能性を有する個々の残基を特定することができる。これらはその後、複数の位置が同時に変化される組み合わせ変異誘発の基礎を形成することができる。抗体遺伝子の場合、生殖細胞系列配列とのアラインメントは、発現を改善するための最適なアミノ酸変化を特定するのに役立ち得る。このアプローチを、ＶＨ上の非パラトピックアミノ酸残基に対して行った。疎水性パッチまたは電荷パッチに貢献した残基は、ＶＨ ＣＤＲ１内のＹ３３、ＶＨ ＣＤＲ２内のＦ５４およびＲ５７であった（図９）。ヒトＶＨ生殖細胞系列配列とのマルチプルアラインメントが、図１１に示される。このアラインメントに基づいて、疎水性または電荷パッチに貢献する非パラトピックのボコシズマブＶＨアミノ酸は、以下にリストされた生殖細胞系列配列に戻された。
ａ．ＶＨ Ｙ３３Ａ（生殖細胞系列ＩＧＨＶ１−３＊０１への復帰）
ｂ．ＶＨ Ｙ３３Ｄ（生殖細胞系列ＩＧＨＶ１−８＊０１への復帰）
ｃ．ＶＨ Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ（生殖細胞系列ＩＧＨＶ１−４６＊０１への三重変異体復帰）
ｄ．ＶＨ Ｙ３３Ａ、Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ（ａ．およびｃ．変異体が組み合わされた）
ｅ．ＶＨ Ｙ３３Ｄ、Ｓ５２Ｎ、Ｆ５４Ｓ、Ｒ５７Ｓ（ｂ．およびｃ．変異体が組み合わされた）
パラトピック残基については、ランダム変異ライブラリを創出して、提示と保持された抗原結合との両方の選択を可能にした（図９）。ＶＬ内の問題のある残基の候補は、Ｙ５３、Ｌ９４、およびＷ９５であった。ＰＣＳＫ９を有するボコシズマブの共結晶構造から、これらの残基は、アロステリック相互作用を通じて標的と直接的に相互作用するか、または結合に間接的に貢献する（例えば、ＶＬ ＣＤＲ３残基Ｗ９５はＶＨ ＣＤＲ３残基に対して集まり、ＰＣＳＫ９に対する最適な結合についてのＶＨ ＣＤＲ３立体構造を維持することができる。これらの位置へのランダムライブラリの構築および選択により、保持された抗原結合を有する改善された生物物理学的特性のための最適なアミノ酸の組み合わせがあるかどうかを調べることができる。代替的なライブラリ設計は、ＶＨ ＣＤＲ１およびＣＤＲ２内の選択された非パラトピック残基のランダム変異誘発に関与することができたかもしれない。
合成ＶＨ遺伝子ブロックを、上記の（ａ）〜（ｅ）および元の野生型ボコシズマブ（ｆ）に列挙された以下の構築物をコードして設計および合成した。これらの合成遺伝子をコードするＤＮＡ配列を図１２に示す。これらの遺伝子ブロックを、プライマー３０５４および３０５５（表５）でＰＣＲ増幅して、３７５ｂｐの産物を得た。この産物をスピンカラム精製し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化し、スピンカラム精製した。次いで、６つの消化されたＶＨインサートを、ｐＩＮＴ１７−ブラストサイジンＮｃｏＩ／ＸｈｏＩカットベクターでライゲーションし、ライゲーションを使用してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、個々のコロニーを選び、ミニプレッププラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列を確認した。
Figure 2021509010
ＶＬ Ｙ５３、Ｌ９４、Ｗ９５コドンを、変異誘発の対象となる位置で停止コドンを含むＶＬ遺伝子テンプレートを使用して、ＮＮＳ ＰＣＲアセンブリ変異誘発によってランダム化した（ＶＬ遺伝子テンプレート配列については図１２を参照されたい）。以下のＰＣＲを行った。
ａ）ボコシズマブＶＬプラス停止遺伝子ブロック（配列については図１２を参照されたい）を、プライマー３０７１／３０４７（表５）でＰＣＲ増幅して、３５３ｂｐの産物を得た。
ｂ）プライマー３０７１／３０６９（表５）を含む上記のテンプレート（ａ）を使用してＰＣＲを行い、１９１ｂｐの産物を得た。
ｃ）プライマー３０７３／３０７０を含む上記のテンプレート（ａ）を使用してＰＣＲを行い、１４６ｂｐの産物を得た。
ｄ）外側プライマー３０７１／３０７５を含む上記のＰＣＲ反応ｂおよびｃの産物でＰＣＲアセンブリ反応を行い、３５３ｂｐのインサートを得た。産物をＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、スピンカラムによって精製した。
上記の６つのＶＨバリアントａ〜ｆ（図１２を参照）は、定常カッパ軽鎖（ＣＬ−カッパ）、ポリＡ、ＣＭＶプロモーター、シグナル配列、およびＶＬ ＮＮＳライブラリをコードする「スタッファー」フラグメントでＰＣＲ組み立てした。スタッファー断片を、プライマーカッパスタッファーＦ４（ＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＧ）およびラムダスタッファーＲ３（ＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧ）を使用して、ｐＩＮＴ３プラスミド（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）から増幅した。組み立てられたインサートを、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、スピンカラム精製し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで事前に消化したｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ標的化ベクター（１００ｎｇ）でライゲーションした（ライゲーション反応あたり５０ｎｇインサート）。ライゲーション混合物（２０μｌ）を、ｍｉｎｉ−Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、精製したライゲーション混合（４μｌ）を、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ ｅｌｉｔｅエレクトロコンピテント細胞（５０μｌ、６００５１２、Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。０．１ｃｍのキュベットを使用して細胞をパルスし、２ｍｌの回収培地で回収し、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間増殖させた。ライブラリサイズを計算するために、細胞を１０００分の１に希釈し、直径１０ｃｍの２ＴＹ−カナマイシンプレートに播種した（１０μｌおよび１００μｌ）。残りの細胞を遠沈し、直径２×１０ｃｍの２ＴＹ−カナマイシンプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを１０μｌのプレートからカウントし、ライブラリサイズを２×１０６個の形質転換体であると計算した。すべての変異型を表すために、必要なライブラリサイズは１．２×１０５個のクローンであり（３２３＝ライブラリあたり３．４×１０４×６個のＶＨ変異体）、したがって、生成されたライブラリは、必要なライブラリ多様性の１６倍の過剰表現を表した。形質転換体プレートをかき取り、ＯＤ６００を測定し、２個のＯＤ６００を使用して５０ｍｌのサークルグロー培養に接種し、培養物を２５０ｍｌのバッフル付きフラスコで、３７ｏＣで３〜４時間増殖させ、約４００個のＯＤ６００ユニットを採取し、６個のミディプレッププラスミドＤＮＡを調製し、３つのＮＮＳコドンＶＬライブラリと組み合わせた６つのＶＨボコシズマブ変異型を表した（図１２）。６つのミディプレッププラスミドＤＮＡを、２６０ｎｍでの吸光度を読み取り、等モル比で混合することによって定量化し、ボコシズマブ標的化ベクターライブラリｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−Ｂｏｃｏ１−ライブラリを得た。
トランスフェクションの２日前に、懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地に１ｍｌあたり２．５×１０５個の細胞で播種した。トランスフェクションの日に細胞を遠心分離し、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ボコシズマブ−ライブラリ（２０μｇならびにＡＡＶＳ左および右ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、各１００μｇ）をコードするプラスミドを含む製造業者の電気穿孔用緩衝液（１ｍｌ、Ｍａｘｃｙｔｅ電気穿孔用緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＣ０８５６４２８）中１０８個の細胞／ｍＬの最終体積に再懸濁した。ＨＥＫ２９３／プラスミドＤＮＡ混合（０．４ｍｌ）を、単一のＯＣ−４００キュベット（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ−４００Ｒ１０）に移し、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸＧ２で、ＨＥＫ２９３設定でパルスした。対照（ＴＡＬＥＮおよびｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ボコシズマブおよびｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−５Ａ１０−ｉを差し引く）を、同じ設定でＯＣ−１００キュベット（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ−１００Ｒ１０）を使用してトランスフェクトした。電気穿孔した細胞を三角フラスコ（２５０ｍｌ）に移した後、細胞を３０分間静置してから、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（４０ｍｌ、ＬｉｆｅＴｅｃｈ．カタログ番号１２３３８０１８）を添加した。細胞を完全に再懸濁し、１３０ＲＰＭ、３７℃、および５％ＣＯ２に設定された軌道振盪インキュベーターに置いた。
２４時間後、１×１０６個の細胞を、抗ヒトＦｃ ＰＥ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）で染色し、一過性発現を確認した。簡潔には、細胞を６００ｘｇで２．５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を０．１％ＢＳＡ（７．５％溶液から希釈：ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号１５２６００３７）に再懸濁した。これらを再度遠心分離し、１μｌの抗ヒトＦｃ ＰＥを添加した１００μｌの１％ＢＳＡ、ＰＢＳに再懸濁した。これらを４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１ｍｌの０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳで２回洗浄し、５μｌの７−ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−６９９３−５０）を含む０．５ｍｌの０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳに再懸濁した。５０μｌを取り除き、９６ウェルプレートのウェルに添加した。ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔフローサイトメーターを使用して掲示レベルを分析し、これはトランスフェクションに対して一過性細胞表面抗体を示した。一過性発現が観察されたため、培養物を、７．５μｇ／ｍｌの濃度で抗生物質のブラストサイジンＳ ＨＣｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ｒ２１００１）を使用して選択のために進めた。細胞を三角フラスコに１ｍｌあたり０．２５×１０６個の細胞で播種した。細胞を、１０，０００個の細胞または１０ｍｌ中１０００個の細胞のいずれかで、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ９６６５−５００ＭＬ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ０７８１−１００ＭＬ）を含むＤＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号４１９６５０３９）中１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３００３）に播種した。これらは、ブラストサイジンＳ ＨＣｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ｒ２１００１）を７．５μｇ／ｍｌで添加する前に、２４時間付着させた。トランスフェクションの１２日後、プレートを２％メチレンブルーで染色した。トランスフェクション効率のパーセンテージを、全細胞の所与のインプットを達成したブラストサイジンコロニーの数をカウントすることによって計算した。統合効率を２％であると計算し、４０百万の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは８００，０００であり、必要な理論ライブラリサイズ（１２０，０００）の７倍であった。したがって、哺乳動物ディスプレイライブラリを、変異型の可能なすべての組み合わせをコードして構築した。
ブラストサイジンＳ ＨＣｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ｒ２１００１）選択の５日後、ＭＡＣＳビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４８−８０１およびカタログ番号１３０−０４２−４０１）を使用して細胞を富化した。ライブラリは２００百万個を超える細胞に拡張された。１００百万個の細胞を２００ｘｇで遠心分離し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した。これらを９．９ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁し、１００μｌの抗ヒトＦｃ ＰＥ抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）を添加した。残りの１００百万個も遠沈し、洗浄し、ビオチン化ＰＣＳＫ９抗原（１０ｎＭ、ＰＣ９−Ｈ８２Ｅ７、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１０ｍｌ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈）とともにインキュベートした。両方を暗所で、４℃で３０分間インキュベートした。この時点から、ａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−２２１）を使用した。細胞をａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液（１０ｍｌ、１ｘＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、２００ｘｇで遠心分離し、８００μｌのａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液に再懸濁した。２００μｌの抗ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４８−８０１）マイクロビーズまたはストレプトアビジン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４８−１０１）マイクロビーズのいずれかを添加した。これらを暗所で、４℃で１０分間インキュベートした後、１０ｍｌのａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液で洗浄し、５ｍｌに再懸濁してカラムに適用する準備ができた。ＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）を、細胞を添加する前に、３ｍｌのａｕｔｏＭＡＣＳすすぎ溶液で事前洗浄した。細胞の各セットに４ｘカラムを使用した。１／４（約１．２５ｍｌ）の細胞を各カラムに添加すると、カラムを３ｍｌの緩衝液で３回洗浄した。ＬＳカラムを磁気ホルダーから取り外し、５ｍｌの緩衝液を添加した。これを、プランジャーを使用してカラムを通して１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに押し込み、結合した細胞を溶出した。集団をさらに精製するために、この５ｍｌを新鮮なカラム（以前のように事前洗浄した）に添加し、以前のように処理した。細胞をカウントし、５ｍｌ中約１．５×１０６個の細胞／ｍｌであることを見出した。これらを遠沈し、７．５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含む３０ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．カタログ番号１２３３８０１８）に再懸濁し、継代の準備ができるまで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
ＭＡＣＳの４８時間後、細胞をＦｃ提示および抗原結合について染色した（図１３）。したがって、２つの集団を、抗原またはＦｃ発現のいずれかに関する最初のラウンドの選択に基づいて創出した（それぞれ選択番号８８４および８８５）。これらをその後、フローサイトメトリーによる抗原およびＦｃ発現の組み合わせで選択した。手順は、以前に記載される２４時間染色と同じであったが、次のように調整した：細胞を１０ｎＭビオチン化ヒトＰＣＳＫ９、Ａｖｉ−Ｔａｇ（カタログ番号ＰＣ９−Ｈ８２Ｅ７−２５ｕｇ、ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、抗ヒトＦｃ ＰＥ（１×１０６個の細胞あたり１μｌ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）およびＡｎｔｉ−ｓｔｒｅｐ ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＡ１００５）（１×１０６個の細胞あたり０．５μｌ）の混合とともにインキュベートした。７−ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−６９９３−５０）を使用して、以前のように生存率を評価した。細胞を洗浄し、以前に記載のＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ機器を使用して分析した（図１０）。選択の１４日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘを使用してＦＡＣＳを実施した。抗原結合またはＦｃ掲示で選別されたＭＡＣＳ選別集団の２０×１０６個の細胞を、１０ｎＭビオチン化ヒトＰＣＳＫ９（ＰＣ９−Ｈ８２Ｅ７−２５ｕｇ、ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ともに（以前のように）インキュベートした後、洗浄し、抗ヒトＦｃ ＰＥ（１×１０６個の細胞あたり１μｌ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）および抗Ｓｔｒｅｐ ＡＰＣ（１×１０６あたり０．５μｌ、ＳＡ１００５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合とともにインキュベートした。選別の直前にＤＡＰＩを添加した（１μｌ／１００万個の細胞）。図１４に示されるように、細胞を、より高い抗原結合集団（ゲートＰ５）およびより低い抗原結合集団（ゲートＰ６）の２つのさらなる集団に選別した。これらのＦＡＣＳ精製された集団を、ブラストサイジンなしであるが、細胞選別プロセスからの汚染を回避するために１％ペニシリンストレプトマイシンを用いて増殖した。培養の４日後、各集団の１ｘ１０６個の細胞をゲノムＤＮＡ抽出のために採取した。
ＩｇＧをコードするＤＮＡを、実施例４に記載されるように、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するネステッドＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＩＮＴ３哺乳動物発現ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用した。
ランダムな選択されていない入力クローン（８４）、選別された抗原（７５）、および選択されたＦｃ（８５）を配列決定し、ＶＨ特異性を決定した。哺乳動物ディスプレイ選択のサイクルに由来する配列決定されたクローンのセットから、元のボコシズマブＶＨ遺伝子を有したものはなく、ＩＧＨＶ１−４６＊０１生殖細胞系列から構成される変異型に対する強いバイアスが存在した（図１５を参照されたい）。同じクローンセットについてＶＬ配列を決定した。平均ｐＩおよび脂肪族インデックスを、３つの変異コドンについて計算した。これは、哺乳動物ディスプレイで選択された抗体（図１６）のｐＩおよび脂肪族インデックスの両方の低減を示し、ＣＤＲ２および３の元の疎水性アミノ酸からの切り替えを示した。
哺乳動物ディスプレイで選択されたボコシズマブ変異型が、親抗体と比較して優れた生物物理学的特性を有したことを示すために、選択された抗体を次に発現させた。クローンを選択ごとに９６ウェルプレートへと選んだ（集団あたり９１個）：ＰＣＳＫ９上のＭＡＣＳ（選択８８４という名前）または抗Ｆｃ上のＭＡＣＳ（選択８８５という名前）。これらのコロニーを使用して、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎプラスミドプラス９６ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１６１８１）を使用してトランスフェクション用の２つのＤＮＡプレートを調製した。このＤＮＡを使用して、製造業者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３トランスフェクション系（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ａ１４５２５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞の２つの９６ウェルプレートにトランスフェクトした。５日後、これらを採取し、上清を４℃に保った。抗体が凝集する傾向を決定するために、ＡＣ−ＳＩＮＳ（親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法）と称される方法を使用した。使用した方法は、本質的には、次の改変を伴うＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４３９によって説明されるとおりであった。金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、クエン酸安定化２０ｎｍ金ナノ粒子、１５７０５、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）を、ＰＥＧチオールでブロックし、ＡｕＮＰを必要になるまで（最大１週間）４℃で保管した。シリンジフィルターを使用して１０倍に濃縮するのではなく、ＡｕＮＰを１５，０００ＲＰＭで、４℃で１０分間遠心分離し、上清の９５％を除去して、同じ条件でさらに遠心分離した。最終的なＡｕＮＰを、開始体積の１／１０で再懸濁した。ポリプロピレン９６ウェルプレートの各ウェルに１０μｌを添加した（上清またはＰＢＳで精製したもののいずれかに１００μｌの試験抗体を含む）。プレートを、７００ＲＰＭに設定された振盪台で、室温で２時間インキュベートした。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）３９に記載されているように、内容物をポリスチレンＵＶ透明プレートに慎重に移した。吸光度データを、ＢＭＧ Ｐｈｅｒａｓｔａｒ装置を使用して、２ｎｍ単位で４５０〜６５０ｎｍで収集する。最大吸光度の波長を特定し、ノイズによるエラーを低減するために、いずれかの側の１０ポイントを直前および直後のポイントで平均化する。これらの平均の最高点が最大吸光度としてみなされる。図１７は、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイの結果を抗体のＣＤＲ配列と一緒に示す。選択された変異型クローンの大部分（８６／９１）は、ヒト化中間クローン５Ａ１０−ｉと同等である、１２ｎｍ以下のＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトを表示した。この波長は、これらの試料では自己会合がそれほど発生していないことを示す。対照的に、ボコシズマブはＡＣ−ＳＩＮＳによって２６ｎｍの波長シフト（図１７）を示し、選択されたセットの５つのクローンのみが２０ｎｍを超える波長シフトをもたらした。したがって、ボコシズマブ変異型クローンは、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイによって判断されるように、元の親クローンよりも自己凝集するより低い傾向を有する哺乳動物細胞ディスプレイによって選択されている。
発現されたプレートからの上清もまた使用して、ＰＣＳＫ９への結合を保持する抗体の能力を比較した。単量体抗原を用いた捕捉ＥＬＩＳＡアッセイでこれを行い、これは、それらの標的と結合するための抗体の親和性ランク付けに効果的な方法であることが示されている。簡潔には、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３７１１１）を、４℃で一晩、ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌで、抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号２０９−００５−０９８）でコーティングした。翌日、プレートを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、続いて１ｘＰＢＳ（Ｍ−ＰＢＳ）中の３００μｌの３％（ｗ／ｖ）乾燥ミルク（Ｍａｒｖｅｌ）で、室温で１時間ブロックした。これらを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、３０μｌの６％（ｗ／ｖ）乾燥ミルク（Ｍａｒｖｅｌ）を各ウェルに添加した。３０μｌの各上清を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で３回、次いで１ｘＰＢＳで３回洗浄した。６０μｌ／ウェルの０．１ｎＭビオチン化ヒトＰＣＳＫ９、Ａｖｉ−Ｔａｇ（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＣ９−Ｈ８２Ｅ７）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを以前のように１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後１ｘＰＢＳで洗浄した。ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２４４−１１１）中の６０μｌ／ウェルのストレプトアビジンユウロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号１２４４−３６０）（５００分の１希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを最後に１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎおよび１ｘＰＢＳで洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ強化溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号４００１−００１０）を添加した。プレートをプレートシェーカーに３００ＲＰＭで５分間置き、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＨＥＲＡＳｔａｒプレートリーダー（励起３４０ｎｍ、発光６１５ｎｍ）で読み取った。これは、大部分の抗体がＰＣＳＫ９への結合を保持し、いくつかはボコシズマブ（ＫＤ＝７ｐＭ）および５Ａ１０−ｉ（ＫＤ＝１．５ｎＭ）中間体クローンと同等の捕捉ＥＬＩＳＡシグナルを表示したことを示した（図１７）。これは、ライブラリ創出および哺乳動物ディスプレイの選択により、抗体パラトープ残基を標的とし、かつ同時に、改善された生物物理特性および標的抗原と結合する保持された能力を有する抗体を選択することが可能であることを示す。
次いで、低ＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトのＡＣ−ＳＩＮＳ培養上清スコアおよび抗原結合の保持に基づいて、クローンを選択した（図１７）。次いで、これらのクローンを、ボコシズマブ、５Ａ１０−ｉ、およびアリロクマブ（承認された抗ＰＣＳＫ９抗体）と一緒に、Ｅｘｐｉ−２９３細胞（５０ｍｌスケール）の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製し、その後、実施例３に記載されるように透析した。次いで、抗体をＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析したところ、これは選択したすべての抗体が、対照のアリロクマブ抗体および５Ａ１０−ｉで同等のＨＰＬＣ保持時間およびピーク幅を表示したことを示した（図１８）。対照的に、ボコシズマブはカラムで遅延し、より長い保持時間を表示した。また、ボコシズマブは非対称のピークを示し、また交差相互作用特性を有し、カラムマトリックスに非特異的に結合していたことも示した。精製された抗体もＡＣ−ＳＩＮＳによって分析し、これは、アリロクマブおよび５Ａ１０−ｉ（Δλ＝８〜１２ｎｍ）と同等の波長シフトを示したが、ボコシズマブは、より長いＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトを表示し、自己相互作用特性を有したことを示した（Δλ＝３９ｎｍ）。発現収量、ＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフト、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ保持時間、およびＨＰＬＣ−ＳＥＣピーク幅を表６に要約する。
したがって、この実施例は、高次真核細胞で結合剤ディスプレイを使用して、標的への結合を保持しながら、低減された自己相互作用を含む改善された開発性プロファイルおよび低減された非特異的相互作用を有する変異型を選択することが可能であることを例示した。この実施例では、最初に抗体の表面の疎水性および正電荷パッチを特定し、ランダムまたは標的変異誘発を行い、変異型ライブラリを創出し、ヌクレアーゼ媒介結合剤遺伝子標的化を使用して細胞ごとに単一の遺伝子コピーを可能にすることによってこれを達成した。次いで、細胞ディスプレイライブラリを、細胞ディスプレイレベルおよび抗原結合に基づいて選別し、改善された生物物理学的特性を有する親抗体の変異型を特定した。
Figure 2021509010
実施例６ａ．非交差相互作用クローンの選択による開発性の向上
それらの標的以外の分子への非特異的結合の特性を有する抗体は、インビボで短い半減期を有する傾向があり、「オフターゲット」結合を引き起こし、不十分な薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）をもたらし得る。さらに、交差相互作用または「粘着性」の特性は、抗体の製造中に問題、例えば、精製または製剤の問題の間にカラムマトリックスへの遅延をもたらし得る。
この実施例は、抗体哺乳動物ディスプレイを使用して、既知の「粘着性」または交差相互作用の問題がある抗体と、良好に動作し、臨床使用が承認されている抗体とを区別することが可能であることを実証する。抗ニューロピリン−１抗体ベセンクマブ（またはＭＮＲＰ１６８５Ａ）を、「粘着性」抗体の例として選択した。この抗体は、サイズ排除クロマトグラフィー中に遅延することが知られており、カラムマトリックスと非特異的に結合する。これは、動物モデルにおけるその短い半減期に寄与すると考えられている１０４。さらに、タンパク尿の副作用の観察後、この抗体の臨床開発を中止した１０５。抗ＰＤ１抗体ニボルマブを、臨床使用が承認されている良好に動作する抗体の一例として選んだ１０６。ベセンクマブはまた、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）アッセイ３９でいくつかの自己相互作用を表示した。
Figure 2021509010
ベセンクマブおよびニボルマブの重および軽可変ドメインをコードする合成ＤＮＡ（配列については表７を参照されたい）を、ｐＩＮＴ３（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）に基づくデュアルプロモーターＩｇＧ可溶性発現ベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。可溶性抗体の特性を調べるために、ｐＩＮＴ３−ベセンクマブおよびｐＩＮＴ３−ニボルマブのプラスミドＤＮＡを調製し、これを使用して、製造業者の指示（Ａ１４５２５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＥｘｐｉ２９３細胞（最終培養体積スケール３０ｍｌ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、２５．５ｍｌのＥｘｐｉ２９３発現培地に２×１０６個の細胞／ｍｌの密度で細胞を播種した。プラスミドＤＮＡ（３０μｇ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１．５ｍｌ）で希釈し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（８０μｌ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１．５ｍｌ）で希釈して、室温で５分間インキュベートした。次いで、希釈したプラスミドＤＮＡ（１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中３０μｇ）を希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬（１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中８０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ）に添加し、室温で２０分間インキュベートした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、５％湿度でインキュベートし、２００ｒｐｍで撹拌した（５０ｍｍ軌道スロー、ＩＳＦ１−Ｘ、Ｃｌｉｍｏ−Ｓｈａｋｅｒ、Ｋｕｈｎｅｒ）。発現の５日後、培養上清を遠心分離（２０００ｇ、２０分）によって採取し、上に記載されるように（実施例３）プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。抗体の収量および濃度を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定し、濃度を見積もるために１．４の推定吸光係数を使用してランバート・ベールの法則を使用して計算することによって決定した。ベセンクマブおよびニボルマブの発現収量は類似していた（それぞれ９５ｍｇ／Ｌおよび１０３ｍｇ／Ｌ）。一過性のトランスフェクション効率で達成される発現収量はまた、抗体の濃度が増加したときに差し迫った問題を導くものではない。
ニボルマブおよびベセンクマブの生物物理学的特性は、いくつかの技法によって決定した。融解温度（Ｔｍ）および凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を、上に記載されるように（実施例３）プロメテウスＮＴ．４Ｂ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して決定した。２つの抗体の融解温度（Ｔｍ）および凝集温度（Ｔａｇｇ）は類似していた（表８ａを参照されたい）。これもまた、溶融温度が差し迫った問題を予測するものではないことを実証する。
Figure 2021509010
しかしながら、以前に記載されるように、分取サイズ排除クロマトグラフィーの実行中、重要なカラムマトリックスの結合および遅延が観察された（表８ａおよび図１９）。ニボルマブおよびベセンクマブの溶出量（Ｖｅ）は、それぞれ１２．０ｍｌおよび１３．７ｍｌであり、ベセンクマブの遅延およびカラムマトリックスとの非特異的相互作用を示す。１０．４ｍｌでの追加の溶出ピークは、いくつかのより高い分子量の凝集した抗体の存在を示し、ニボルマブについては観察されなかった。貯蔵中の抗体の安定性を調べるために、サイズ精製された抗体をＰＢＳ ｐＨ７．４中で、４℃で２週間インキュベートした。動的光散乱（ＤＬＳ）により、ベセンクマブでは高次凝集種を検出されたが、ニボルマブでは検出されなかった（方法論については、図２０および図の凡例を参照されたい）。動的光散乱測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して、４℃で２週間保存された試料に対して行った。計算された多分散性パーセンテージ、多分散性指数（ＰＤＩ）、キュムラント（またはｚ平均）サイズ、および平均分子量のＤＬＳ由来の生物物理学的パラメータを、表８に示し、同じ条件下で保存された場合に単分散であるニボルマブと比較して、４℃で２週間の貯蔵によるベセンクマブの著しい凝集を示すことを示す。
ベセンクマブおよびニボルマブの重および軽可変ドメインをコードする合成ＤＮＡを、哺乳動物のディスプレイベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（ベクターマップおよび配列については実施例１を参照されたい）にクローン化し、ＤＮＡ配列を確認し、トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを調製した。ＨＥＫ２９３細胞を、実施例２で上に記載されるように創出したＴＡＬＥヌクレアーゼおよび安定した細胞株でトランスフェクトした。トランスフェクション（ｄｐｔ）後から１４日後、細胞を、４℃で３０分間抗ヒトＦｃ ＰＥ（４０９３０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、抗体ディスプレイ提示レベルを決定した（実施例２を参照されたい）。次いで、ニボルマブまたはベセンクマブのいずれかを表示するモノクローナル細胞株を、以下のプロトコルによって標識ヒト血清で染色した。
熱不活性化された、ヒトＡＢ血清（５μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ Ｈ４５２２、Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ（１９５μｌ）で希釈して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。次いで、この希釈されたヒト血清を、製造業者の指示に従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒａｐｉｄ Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６３３キット（３２５−００００、Ｉｎｎｏｖａ）を使用してＤｙｌｉｇｈｔ ６３３で標識した。ニボルマブまたはベセンクマブまたは野生型ＨＥＫ２９３細胞（１００万個の細胞）を表示するＨＥＫ２９３細胞株をペレット化した（２００ｇ、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）で３分）。ペレットをＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、ペレット化した（６００ｇ、２．５分）。ペレットを、１％ＢＳＡ、抗Ｆｃ ＰＥ（０．５μｌ、４０９３０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁し、いずれかのＡＢ血清Ｄｙｌｉｇｈｔ ６３３で標識した（５μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ）。混合物を、遮光して、４℃で３０分間インキュベートした。０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（９００μｌ）を添加し、細胞をペレット化した（６００ｇ、２．５分）。細胞を０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、この洗浄ステップを１回繰り返した。細胞を、７−ＡＡＤ（１００万個の細胞あたり５μｌ）を含む０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ（２００μｌ）に再懸濁した。標識された細胞（５０μｌ）を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ｉＱｕｅスクリーナーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析（図２１）は、ニボルマブ（それぞれ１２．３％および３．７％）と比較して、ベセンクマブを表示するＨＥＫ２９３細胞への標識されたヒト血清の増加された結合を示した（それぞれ抗体およびヒト血清結合に対して二重陽性）。
ベセンクマブは、第１相臨床試験１０５を超えて開発することに失敗した抗体であり、既知の自己凝集および交差相互作用特性３９、１０４を有する抗体である。また、この抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーの間、交差相互作用を示さない臨床的に承認された抗ＰＤ１抗体ニボルマブと比較して、サイズ排除カラムマトリックス（図１９）との非特異的相互作用を示し、貯蔵時に凝集すること（図２０および表８）を示し、貯蔵後も単分散のままであることを示した。ここでは、交差相互作用フローサイトメトリーアッセイでＨＥＫ２９３細胞の表面に表示されたときに、ベセンクマブおよびニボルマブを区別することができることを示す。このアッセイを最適化して、「粘着性のある」抗体と良好に動作する抗体とのさらに大きな区別を可能にすることができる可能性が高い。例えば、ヒト血清をビオチン化し、親和力を増大させるために複合体化したフルオロフォア標識ストレプトアビジンに複合体化することができる。あるいは、任意の数の以前に記載されるフローサイトメトリーの交差相互作用アッセイ２を改変することができ、これらに限定されないが、標識されたバキュロウイルス１６、１９またはタンパク質、ＤＮＡ、およびヘパリン硫酸含有分子１０７の標識された混合物が含まれる。
実施例６ｂ．多反応性スクリーニングの改善
既知の多反応性プロファイルを有する既知の抗体を使用して、非標的分子（多反応性プローブ）への結合の違いに基づいて、結合剤ディスプレイ細胞クローンの集団内で多反応性結合剤と非多反応性結合剤とを区別する可能性をさらに例示する。多反応性プローブと結合することに失敗するクローンの富化を実証する。
ＨＥＫ２９３細胞の個々の集団を、ヌクレアーゼ指向組入れを使用して調製し、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、およびアマツキシマブを発現した。個々の集団を、ビオチン化ＤＮＡで染色した。ＤＮＡへの結合は、ブリアキヌマブおよびアマツキシマブを発現する細胞で検出されたが、ウステキヌマブを発現する細胞は染色されなかった。ＤＮＡ結合を、モードに正規化した。図３３Ａ．抗Ｆｃ抗体での染色は、ブリアキヌマブ集団が、集団内でＤＮＡ結合細胞およびＤＮＡ非結合細胞のおおよそ５０：５０混合を占める、ＩｇＧ発現細胞および非発現細胞の混合物であったことを明らかにした。異なる細胞集団を、セルトラッカー色素で標識し、同じ割合で混合した。アマツキシマブ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（図３３ＢおよびＣのＱ３のｘ軸に示される）で標識し、ブリアキヌマブをＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（図３３ＢおよびＣのＱ１のｙ軸に示される）で標識し、ウステキヌマブは標識しないままであった（図３３ＢおよびＣのＱ４の二重陰性集団）。混合集団を、ビオチン化ＤＮＡ（２００μｌ １％ＢＳＡ中１００万個の細胞あたり２０μｇ ＤＮＡ）で染色し、抗ビオチンマイクロビーズで標識した。集団を、ＭＳカラムと組み合わせてＭｉｎｉＭＡＣＳビーズを使用して選別した。ＭＡＣＳ選別からのフロースルー画分を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを使用して分析し、細胞をカウントした。７−ＡＡＤを生存率染色として使用し、死細胞を分析から除外した。ＤＮＡと結合しなかったウステキヌマブは、ブリアキヌマブおよびアマツキシマブと比較して富化されていることが観察された（図３３Ｂ、図３３Ｃ、表８ｂ）。
Figure 2021509010
ウステキヌマブを表示する細胞と比較して、ブリアキヌマブを表示する細胞の相対的なパーセンテージは３７％に低減され、アマツキシマブを表示する細胞は１０％に低減された。ブリアキヌマブの入力集団には比較的高割合の非抗体発現細胞が含まれ、これらはここで選択される「非結合集団」に保持されるため、富化係数はさらにより高くなり得る可能性が高い。このバックグラウンドは、前に記載されるようにＩｇＧ発現または抗原結合について細胞を事前選別、事後選別、または共選別することによってさらに低減され得る。
ここではＭＡＣＳを順調に使用したが、ＦＡＣＳによる流動選別により、解像度および効果的な富化がさらにより向上することが予期される。
追加の多反応性プローブもまた、多反応性抗体および非多反応性抗体のいずれかを発現する細胞クローンを区別するそれらの能力について試験した。
ウステキヌマブを発現する細胞は、ヘパリン硫酸結合の程度に基づいて、ブリアキヌマブまたはガニツマブを発現する細胞から区別および分離され得ることを見出した。簡潔には、実施例５で以前に記載されるように標準的な染色プロトコルを使用して、２５０，０００個の細胞を９μＭヘパリン−ＦＩＴＣ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ）で染色した。ブリアキヌマブおよびガニツマブは、ヘパリン結合を示した。オーバーレイプロットを図３４に示す。この非特異的結合は、ブリアキヌマブおよびガニツマブの重鎖ＣＤＲの正に荷電されたパッチを通じて生じる可能性がある。
シャペロンタンパク質は、多重特異性結合剤を選択解除するための非標的分子として使用され得るさらなる多反応性プローブを表す。シャペロンは機能的に関連しており、タンパク質の折り畳みを助ける。熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、高温などのストレス条件で過剰発現される。ほとんどのシャペロンはまた、それらが非天然タンパク質を認識および結合し、したがって凝集を防ぐ正常細胞で豊富に発現される。
様々な治療用抗体は、ＨＥＫ２９３細胞で表示され、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０への結合について試験した。
本実験で試験された抗体のうち、ブレンツキシマブおよびレンジルマブは、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０への結合を示した。ブレンツキシマブ（ベドチン）は、ホジキンリンパ腫を治療するための臨床試験に失敗した抗ＣＤ３０抗体−薬物複合体である。それは以前に、自己相互作用および交差相互作用２を呈することが示されていた。レンジルマブは、重度の喘息の第ＩＩ相試験に失敗した抗ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）抗体である。
図３５は、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３と複合体化した抗ヒトＦｃ ＰＥおよび熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０および９０）で二重染色したウステキヌマブおよびブリアキヌマブのオーバーレイを示す。オーバーレイプロット内のゲートは、シャペロン（Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０）との検出可能な相互作用を示さず、かつＦＡＣＳで選別されて、シャペロンを認識する結合剤が枯渇している（および好ましくは除去されている）クローンの選択された集団を提供し得る細胞を示す。
様々な異なる抗体および異なる多反応性プローブを用いた複数の実験からのプールされたデータを図３６に示す。個々のアンプルは別個の独立した実験で試験したが、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターは固定電圧を有するため、蛍光強度がすべての試料で一定であると予期される。さらに、Ｈｅｋ２９３、各実験の内部コントロールとして使用した。以下の表８ｃは、多反応性プローブへの結合について試験された抗体のパネルからのデータを要約する。
Figure 2021509010
アマツキシマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、およびレンジルマブは、シャペロンタンパク質への結合を示した。これらの抗体の多反応性は、抗体可変ドメイン内のアミノ酸の疎水性クラスターに起因して発生し得、シャペロンタンパク質などの疎水性領域も保持するタンパク質とのファンデルワールス相互作用をもたらす。多反応性の他の理由は、ＤＮＡまたはヘパラン硫酸などの正味の負電荷を有する分子と、またはそれらの表面２２に正電荷パッチを有するＦｃＲｎなどのタンパク質と相互作用するアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン残基からなる）の正荷電パッチの存在であり得る。本実験では、アマツキシマブ、ブリアキヌマブ、ガニツマブ、およびレンズリマブはすべて、ＤＮＡおよびヘパリンと結合した。それらの表面に疎水性パッチおよび正に荷電されたパッチの両方を保持する抗体は、増加された多反応性を有し得る。本データに基づくと、疎水性パッチを介してシャペロンタンパク質に結合すること、および中性ｐＨでＤＮＡ、ヘパリン硫酸、またはＦｃＲｎと結合することの両方が可能である抗体の例としては、ブリアキヌマブ、アマツキシマブ、およびレンズズリマブが挙げられる。これらのデータは、ブリアキヌマブ２によって示される非特異的結合に関する以前の報告と一致している。
実施例７．親クローンおよび改善されたクローンのディスプレイレベルの定量化
実施例２では、ＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介導入遺伝子組入れおよび安定した細胞株の選択後に、３対の抗体について高等真核細胞ディスプレイレベルの差を観察した。ＰＥ標識抗Ｆｃで細胞を染色し、フローサイトメトリーで平均蛍光強度を測定することによって判断されるディスプレイレベルは、抗体の自己相互作用および交差相互作用の特性によって相関する（実施例３）。この実施例７では、細胞表面上の抗体ディスプレイコピー数を定量化し、ディスプレイコピー数が抗体生物物理学的特性と相関することを示す。ビーズが正確に定義された数のＦｃ特異的捕捉抗体を有するビーズベースの較正曲線を使用して定量的測定を行った。
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（ＱＳＣ）ミクロスフェアキット（８１５、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）は、Ｆｃ特異的捕捉抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）の量の増加とともに、５つのビーズ集団−１つのブランクおよび４つのビーズ集団を有する。ＱＳＣビーズを、細胞を標識するために使用される同じフロロクロム複合体化抗体で染色し、製造業者の指示に従ってフローサイトメーターで分析する。簡潔には、１滴のＱＳＣミクロスフェアをマイクロ遠心チューブに添加し、５０μＬの染色緩衝液（１％ＢＳＡ）を添加し、チューブを軽くはじいた。５μｌのＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を、ＱＳＣミクロスフェアに添加し、穏やかに混合し、暗所で３０分間インキュベートした。２５００ｘＧで５分間遠心分離することによって、ＱＳＣミクロスフェアを１ｍｌ洗浄緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。ビーズペレットを１５０ｕｌ洗浄緩衝液に再懸濁した。染色されたビーズの集団およびブランクの集団を、単一のウェルで組み合わせ（集団あたり１０ｕｌ）、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔで実行する。並行して、実施例２に記載されるように、細胞表面上に異なる抗体を発現するＨＥＫ２９３細胞に対して細胞染色を行った。
較正曲線を、各ビーズ集団の蛍光強度の中央値（図２６）をその割り当てられた抗体結合能力に対してプロットすることによって生成する。抗体発現集団の蛍光強度を、ビーズの抗体結合能力と比較し、ＱｕｉｃｋＣａｌ（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して線形回帰を計算し、抗体ディスプレイコピー数を計算することを可能にする（表９）。
Figure 2021509010
低い自己相互作用特性２の点で良好な生物物理学的特性を有することが知られている、臨床的に承認された抗ＰＤ１抗体であるペンブロリズマブは、この試験セットの最も高いコピー数を有した。最も強力な較正ビーズは、８８６，０００個のコピー／ビーズを有し、これはそれを超えていた（おおよそ９１０，０００個のコピー／細胞）。同様に、クローン病の臨床治療のために承認された抗ＩＬ１２抗体であるウステキヌマブは、抗ＩＬ−１２抗体であるブリアキヌマブ（２７３，０００個のコピー）と比較して、細胞上でより高いコピー数（７０６，０００）を示し、それは乾癬を治療するための第ＩＩＩ相ヒト臨床試験で乏しい有効性を示した。ブリアキヌマブは、自己相互作用アッセイＡＣ−ＳＩＮＳと、多重特異性試薬およびバキュロウイルス粒子２、２３を用いる交差相互作用アッセイとを含むウステキヌマブと比較して、様々なアッセイで測定されるように、増加された自己相互作用および交差相互作用の特性を有するとして説明される。
３つの抗体対すべてについて、コピー数は対照よりも低く、改善された生物物理学的特性を有する再操作された娘クローンは、より高い細胞ディスプレイコピー数を有した。例えば、改善された娘抗体ＣＮＴＯ６０７−Ｗ１００Ａ、ＭＥＤ−１９１２＿ＳＴＴ、およびＡｎｇ２ｍＡｂ＿Ｃ４９は、自己相互作用および交差相互作用の既知の問題を伴う元の親分子と比較して、コピー数の２．８倍、９倍、および４．６倍の増加を表す、それぞれ３１３千、４３３千、および５７０千のディスプレイコピー数を有した。
この実施例では、宿主ゲノムへのヌクレアーゼ媒介導入遺伝子組入れおよび安定した細胞株の選択後、細胞表面に表示される抗体コピー数と、表示される抗体の生物物理学的特性との明確な関係を示す。自己相互作用および交差相互作用の特性を有する抗体は、自己相互作用および交差相互作用を測定するために設計されたアッセイで高度にスコアしなかった抗体と比較して、より低いコピー数を表示した。低い自己相互作用および低い交差相互作用の特性の良好な生物物理学的プロファイルを有する、より良好に動作する抗体は、高次真核細胞の表面に高いコピー数を表示した。
実施例８ａ．開発性のための高レベル発現および親和性厳密性のための低レベル発現の組み合わせ
例えば、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子が強力な構成的プロモーターによって駆動される抗体の高レベルのポリペプチド発現は、低い自己相互作用などの優れた生物物理学的特性を有する抗体の集団からの富化に有用であることが実証されている（実施例３、４、および５に上に記載されるとおり）。細胞上の高ポリペプチド濃度の提示は、自己相互作用を検出するのに役立ち得、増大された親和力は、他の分子との所望でない非特異的相互作用の高感度検出を可能にする。しかしながら、この１つの不利な結果は、低濃度の抗原を使用して厳密性を促進した場合でも、低親和性よりも高親和性の富化の達成率の低減が存在し得ることである。この「低出力」富化の追加の結果は、目標がより高い親和性の結合剤を富化することである場合でも、実際には表面提示の優先的な選択が存在し得ることである。しかしながら、富化速度は、細胞表面のより低い密度の結合剤掲示を使用することによって高められ得る。以下の説明では、異なる親和性の結合剤の相互作用を一般的に表す例として、抗体およびそれらの抗原を使用する。
１００マイクロリットルの体積で１０６個の細胞を考慮すると、６×１０５一価の結合部位／細胞が表示され、６×１０１１個の分子／１００マイクロリットルまたは６×１０１５個の分子／Ｌを有する。この体積でのこの結合部位の数は、１０ｎＭの濃度と同等である。この状況で１０ｎＭ未満の抗原濃度を使用することは、抗体が抗原よりも過剰になることを意味し、比較的高い抗体濃度は、より低い親和性の抗体でも会合を駆動するのに役立つ。例えば、ＫＤ ０．１ｎＭの抗体を発現する稀な細胞を、ＫＤ １０ｎＭのより低い親和性を有する抗体を発現する過剰な細胞から分離しようとする場合、上記の条件下（すなわち、１０ｎＭの抗体濃度と同等）で、抗原のかなりの割合は、より低い親和性の抗体と複合するであろう。
質量作用の法則は、複合体を形成する２つの相互作用する分子を扱う。これらの式は、自由溶液での相互作用を網羅することを意図し、懸濁細胞に固定化された抗体を扱っている。以下の選択性の計算では、溶液中の単一の抗体についてそれぞれの場合に形成される複合体の濃度を考慮する。それにもかかわらず、質量作用の法則からの溶液中の分子の挙動に関するこの知識を使用して、それが表面提示抗体に影響を与え得るため、親和性、抗体濃度、抗原濃度、および複合体の形成の間の関係をよりよく理解することができる。
２つの相互作用する分子、例えば、一価抗体（Ａ）および抗原（Ｂ）が混合されると、それらは複合体（Ａ：Ｂ）を形成し、最終的に平衡状態に達することができる。平衡の位置は、抗体および抗原の濃度に依存するが、解離定数ＫＤによって次のように説明することができる（［Ａ］、［Ｂ］および［ＡＢ］は平衡状態での濃度を示す）。
Figure 2021509010
この方程式は、ＫＤ、Ａの濃度、およびＢの濃度の様々な条件下で形成される複合体（ＡＢ）の濃度を計算するために再編成することができる。
平衡状態にある結合反応を有する場合、
Figure 2021509010
 解離定数（ＫＤ）は次のように定義され、
Figure 2021509010
 式中、［Ａ］、［Ｂ］、および［ＡＢ］は、平衡状態での反応物の濃度である。反応物の総濃度（「試験チューブ」に添加した濃度であるＡＴおよびＢＴ）は次のとおりである。
Figure 2021509010
 方程式３および方程式４を方程式２に代入する。
Figure 2021509010
 以下の方程式を再編成する：
Figure 2021509010
 それを乗算して、以下を、
Figure 2021509010
 以下の形態に再編成し（明確にするために、濃度の括弧は削除する）、
Figure 2021509010
 式中、以下のとおりであり、
Figure 2021509010
 これは、以下の二次方程式を介して解くことを可能にする。
Figure 2021509010
０．１ｎＭの抗原濃度が使用されると仮定すると、図２２ａは、異なる親和性の２つの抗体（Ａｂ１の場合は１０ｎＭまたはＡｂ２の場合は０．１ｎＭに等しいＫＤ）に対する抗体（Ａ）の濃度の変化の影響を示す。図２２ｂは、抗体が０．１ｎＭの抗原および異なる抗体濃度で個々にインキュベートされたときに形成される複合体の濃度の比率である２つの抗体間の相対的な「選択性」を示す。
これは、相互作用のＫＤをはるかに下回る抗原濃度を使用しているにもかかわらず、Ａｂ１が１０ｎＭの濃度で存在する場合、複合体の濃度は５０ｐＭであり、複合体中の抗原の５０％を表す。（１０ｎＭは、６×１０５個のコピー／細胞での細胞表面ディスプレイの上記の例で計算された濃度である）。高い親和性Ａｂ２抗体を使用する同じ条件下で、複合体の濃度は、９９ｐＭ（抗原の９９％を表す）になるため、選択性において、２倍の差のみ存在する（表１０）。しかしながら、抗体濃度を０．１ｎＭに低減すると（この実施例ではディスプレイレベルを１００倍低減することに相当）、Ａｂ１の場合は複合体の濃度が１ｐＭに下がるが、一方でＡｂ２では３８．２ｐＭの複合体の濃度が達成され（表１０）３８倍の選択性を表す。低減された密度は、標的再結合の可能性を低減するという利点も有する。高密度の固定化結合剤の存在下での再結合の問題は、表面プラズモン共鳴などの表面ベースの親和性測定（ＢＩＡｃｏｒｅマニュアル）で特によく認識され、文書化されている。
流動選別では、細胞表面の蛍光標識抗原（直接または間接的に標識された）の存在を検出することにより、複合体の相対濃度を測定する。したがって、フローサイトメーター内で検出された細胞の蛍光シグナルは、使用される条件下で細胞上に形成された複合体の濃度の指標である。したがって、抗体提示のより限定的な条件下では、高親和性抗体および低親和性抗体を提示するクローン間でより大きな分離が達成される。
Figure 2021509010
最適な抗体を選択するプロセス中、抗体発見キャンペーン中に、それらの標的に対してより高い親和性を有する抗体を選択することが望ましい場合がある。抗体ファージディスプレイ選択中に厳密性を増加させ、それらの標的に対する改善された親和性を有するクローンを富化する方法は、選択中に標的抗原の濃度を低減させることである５７（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ ＦＡ，Ｓｉｄｈｕ ＳＳ：Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｉｎ：Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈｏｗａｒｄ ＧＣ，Ｋａｓｅｒ ＭＲ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００７：１５７−１８０１０８）。哺乳動物のディスプレイ選択では、標識された抗原濃度をＦＡＣＳまたはＭＡＣＳの間に低減して、改善された親和性を有するクローンの選択的富化を可能にすることもできる。しかしながら、抗体発現が強力な構成的プロモーターによって駆動される場合に達成される高いディスプレイレベルは、所望の標的親和性を超える抗体の濃度と同等であり得る。したがって、上の実施例では、ＨＥＫ２９３細胞の抗体細胞ディスプレイレベルを、例えば、細胞あたり６０，０００以下に低減して、１０ｎＭ〜０．１ｎＭの１０倍の選択性を与えることが望ましい場合がある。これにより、より低い親和性のクローンよりも改善された親和性を有する抗体の優れた富化が可能になる。
抗体ディスプレイレベルは、抗体の転写段階、転写後段階、翻訳段階、または翻訳後段階でいくつかの異なる方法で低減され得る。例えば、弱いプロモーターを用いて、一次ｍＲＮＡ転写産物の生成速度を低減させることができ、非最適スプライス／アクセプター部位を組み込み、成熟ｍＲＮＡの生成および核から細胞質への輸出の効率および速度を低減することができる。ｍＲＮＡの安定性が低減し得るため、転写産物の半減期および有効濃度が低減する。発現の翻訳制御は、コザックコンセンサス配列を変更して、ｍＲＮＡへのリボソームの結合に影響を与えることによるものであり得る。翻訳後制御の例は、非最適リーダー配列を使用して、小胞体への輸送効率を低減することによるものであり得る。
この実施例では、抗体ディスプレイレベルを低減するためのスプライス／アクセプター部位操作の使用を示す。この低減されたディスプレイ系は、それらの標的に対して異なる親和性を有する抗体を表示するＨＥＫ２９３細胞株混合物のより効率的な分離を可能にすることが示された。
Ｂ細胞で使用される自然な系に基づく、表面ディスプレイを抗体分泌と組み合わせる方法を考案した。Ｂ細胞の成熟中、抗体は膜結合型で発現し、形質細胞が成熟するにつれて、これは主に分泌型に切り替わる。これは、細胞表面のディスプレイの能力が膜貫通型の発現に依存する真核生物のディスプレイの要件と一致する。あるいは、クローンが選択されると抗体を分泌型で発現する能力により、さらなる特徴付けのための遊離の可溶性抗体の即時生成が可能になる。
Ｂ細胞における表面ディスプレイおよび分泌の間のバランスは、ポリＡ添加（分泌されたＩｇＧにつながる）およびスプライシング（膜テザリングにつながる）１０９、１１０の間のバランスによって大きく駆動される。「近位」ポリアデニル化部位は、ＣＨ３ドメインの末端の後１００〜２００ｂｐに見出され、これは、ＣＨ３ドメインの末端で翻訳を停止し、分泌生成物をもたらすｍＲＮＡを生成する。ＣＨ３ドメインの末端の近くには、下流のエクソン（Ｍ１）にスプライスして、「ヒンジ」および膜貫通ドメインとのフレーム内融合を創出することができる、潜在的なスプライスドナー部位も存在する。（Ｍ１エクソンは、次いで、細胞内ドメインをコードするＭ２エクソンにスプライスする）。分泌型対膜結合型のＩｇＧ提示のバランスは、近位ポリＡ部位でのポリアデニル化およびＭ１エクソンへのスプライシングの間のバランスに依存する。これは、２つの代替エクソンのうちの１つを使用して、分泌型および膜結合型１１１を切り替える最近公開された方法とは異なる。
スプライシングは通常、スプライソソームアセンブリを開始してイントロンの除去につなげるために必要なＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を介して生じる。ＣＨ３の末端のスプライスドナー部位は、コンセンサススプライスドナー部位と比較して最適ではない。非最適スプライスドナーは、進化全体にわたって保存され、Ｕ１ ｓｎＲＮＡに非最適な塩基対を与えることが予期される。実際、非最適スプライスドナー部位のコンセンサススプライスドナー配列の変異が、増加されたスプライシングの結果として、主に分泌型をコードする処理されたＲＮＡから主に膜結合にバランスを変化させることが示されている８６。これは、スプライシングドナーを修飾してスプライシング対ポリアデニル化のバランスを変更し、分泌およびポリアデニル化のバランスの著しい変化に影響する初期の例を表す。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ １０９，１１０の研究に基づいて、スプライスドナーの最適化の程度が、スプライシングおよびポリアデニル化のバランスに影響を与え、したがって、ディーゼル抗体の比率に影響を与えることが予想される。膜および分泌型の最適なバランスを見つけるために、ＣＨ３エクソンの末端でいくつかの代替スプライスドナー部位を創出した。
スプライシング開始に関与するＵ１ ｓｎＲＮＡの配列を、ＩｇＧ２ ＣＨ３ドメインから生成されたｍＲＮＡ配列の上に示す。不一致の位置には下線が引かれている。
Figure 2021509010
図２３に示されるように、野生型（Ｊ９−ＧＧ／ＧＴＡＡＴ）、部分最適化（Ｊ１０−ＡＧ／ＧＴＡＡＡ）、部分最適化（Ｊ２９−ＧＧ／ＧＴＡＡＧ）、および完全最適化（Ｊ３０−ＡＧ／ＧＴＡＡＧ）を含む、４つの変異型をスプライスドナーの周りに設計した。Ｕ１ｓｎＲＮＡとのハイブリダイゼーションから、Ｊ３０変異型が最も効率的なスプライシングを可能にし、より低い効率のスプライシングがより低いレベルの膜テザリングされた抗体およびより大きな割合の分泌をもたらす「野生型」配列Ｊ９と比較して、細胞表面でのより大きな割合の膜テザリングされた抗体をもたらすことが予期される。部分最適化変異型であるＪ１０およびＪ２９は、Ｊ９およびＪ３０の中間の抗体ディスプレイレベルをもたらすと期待される。
抗体ディスプレイ標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤの変異型は、埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位がＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのＣ末端ならびにヒトＩｇＧイントロンおよびＭ１エクソンをコードするＤＮＡに添加されるところで構築され、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤによってコードされたＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインを置き換えた膜貫通ドメインをコードする（実施例１）。スプライスドナー変異型Ｊ９、１０、２９、および３０を、合成遺伝子合成、ＰＣＲアセンブリ、および制限酵素クローニングの組み合わせにより構築した。ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０ベクターの注釈付きＤＮＡ配列を、ＸｈｏＩからＳｂｆＩ制限酵素部位まで図２４に示す。ＸｈｏＩ−ＳｂｆＩ挿入の外側にあり、図２４には示されていないベクター骨格は、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（図１）と同一である。
抗ＰＤ１抗体ニボルマブのＶＨおよびＶＬ鎖をコードするＤＮＡを、実施例２に記載されるように、４つのスプライスドナー変異型標的化ベクターｐＩＮＴ１７−Ｊ９、ｐＩＮＴ１７−Ｊ１０、ｐＩＮＴ１７−Ｊ２９、およびｐＩＮＴ１７−Ｊ３０にクローニングし、ヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって安定した細胞株を創出するために使用した。比較のために、ニボルマブを、図１に示される標準ｐＩＮＴ１７＿ＢＳＤベクターにクローン化した。この構築物は、スプライシングなしで抗体ＣＨ３ドメインをＰＤＧＦｒ膜貫通ドメインに直接融合し、この実施例ではｐＩＮＴ１７−ＰＤＧＦＲと称される。ブラストサイジン選択の２７日後、細胞をＰＥで標識した抗Ｆｃで染色し、上に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した（図２５）。これは、ＣＨ３および膜貫通ドメイン（図２５ａ〜ｄ）の間に配置されたイントロンを有する陰性ＩｇＧ膜貫通ドメインを含む構築物と比較して、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインおよびＰＤＧＦＲ膜貫通（図２５ｅ）の間の直接融合で発現された抗体であるｐＩＮＴ１７−ＰＤＧＦＲの抗体ディスプレイレベルが、より高いことを示した。Ｊ３０は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡと完全に相補的であるため、Ｊ９、Ｊ１０、またはＪ２９変異型よりも膜貫通ドメインをコードするＭ１エクソンとのより効率的なスプライシングをもたらすことが予期される。図２５ｄは、これが実際に最高レベルを示すＪ３０変異型の場合であることを示す。しかしながら、以前の実施例を通じて使用されたｐＩＮＴ１７−ＰＤＧＦｒ構築物（図２５ｄ）で見出されたものと比べて、Ｊ３０変異型でも発現レベルは著しくより低いことも示す。
抗体ディスプレイコピー数の低減が、異なる親和性を有する抗体の区別および分離を助けることができることを実証するために、抗ＰＤ１抗体の試験対をそれらの標的に対して異なる親和性で選択した。選択された抗体は、それぞれ３ｎＭ１１２および７４ｎＭの、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された、平衡解離定数（ＫＤ）親和性を有するニボルマブおよび別のＰＤ１抗体（３３７＿１＿Ｃ０８）であった。抗ＰＤ１抗体のＶＨおよびＶＬ鎖をコードするＤＮＡを、標的化ベクターｐＩＮＴ１７−Ｊ３０およびｐＩＮＴ１７−ＰＤＧＦｒ（ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤとも称される）にクローン化し、実施例２に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れにより安定した細胞株を創出するために使用した。定量的フローサイトメトリー分析による抗体ディスプレイレベルの定量化は、ブラストサイジンの選択から２１日後の細胞について、以前に記載されるように１１３および製造業者の指示（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧビーズ、カタログ番号８１５、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）で行った（図２６）。細胞のコピー数を、参照ビーズセット（カタログ番号８１５、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）と比較して抗Ｆｃ−ＰＥで染色された細胞の蛍光強度の中央値の測定から計算した（図２６）。表１１Ａに示されるように、ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０（加えてイントロン）発現カセットの細胞ディスプレイコピー数は、両方の抗体について、ＣＨ３ドメインおよび膜貫通ドメインの間にイントロンを有さない、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ発現カセットと比較して低減した。
Figure 2021509010
抗体のコピー数および抗原の濃度が低下するにつれて、フローサイトメトリーにより観察されるシグナルの強度も低下する（図２５）。磁気ビーズ選別を使用して、フローサイトメトリーの感度限界以下で標識細胞を富化することが可能であり、これをここで採用した。細胞表面での低減されたコピー数が、異なる親和性を有する抗体の分離に役立つかどうかを試験するために、ニボルマブまたは３３７＿１＿Ｃ０８発現細胞株をそれぞれ異なるフルオロフォア色素で染色した。これは、他方よりも一方の細胞の相対的な富化が観察されるのを可能にする。標識細胞を混合し、異なる濃度のビオチン化ＰＤ１とともにインキュベートし、ＭＡＣＳによって分離した。次いで、フローサイトメトリー分析を行い、ＰＤ１に対するより高い親和性を有する抗体を発現する細胞の富化が存在したかどうかを判定した。この実施例では、４つのＨＥＫ２９３細胞株を試験したが、最初は以下でトランスフェクションした。
ａ．ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ニボルマブ
ｂ．ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０−ニボルマブ
ｃ．ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−３３７＿１＿Ｃ０８
ｄ．ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０−３３７＿１＿Ｃ０８
ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ発現カセット（抗体ＣＨ３および膜貫通ドメインの間の直接融合）は、ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０発現カセットよりも高い抗体ディスプレイレベルを発現することが上記に示された。製造業者の指示に従って、ニボルマブ発現細胞（５×１０６）をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（５０ｎＭ、Ｃ７０２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、３３７＿１＿Ｃ０８発現細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（５０ｎＭ、Ｃ３４５６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。簡潔には、細胞をＰＢＳで洗浄し、トラッカー色素（５０ｎＭ）を含むＰＢＳとともにインキュベートし、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した。ｐＩＮＴ１７−Ｊ３０発現カセットに由来するニボルマブまたは３３７＿１＿Ｃ０８を発現する事前染色された細胞を、１：１の比率で混合した（１０ｍｌの体積でそれぞれ５×１０６個の細胞）。混合細胞をペレット化し（１００ｇ、３分）、各細胞ペレットを０、０．１、１、または１０ｎＭビオチン化ＰＤ１（ＰＤ１−Ｈ８２Ｅ４、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを含むＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、これを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ、およびストレプトアビジンビーズ（１０μｌ）で洗浄し、９０μｌｓの１％ＢＳＡを各試料に添加して混合した。試料を冷蔵庫（４℃）で１５分間インキュベートした。２ｍｌの０．１％ＢＳＡを使用して細胞を洗浄し、２００ｘＧで４分間遠沈した。ペレットを５００μｌｓの分離緩衝液（１ｘＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡからなるＭＡＣＳすすぎ緩衝液）に再懸濁した。ＬＳカラムを３ｍｌの分離緩衝液で洗浄した。細胞懸濁液をカラムに添加し、カラムあたり１試料とした。カラムを３ｍｌの分離緩衝液で３回洗浄することにより、未捕捉の細胞を収集し、フロースルーを収集した。カラムを新しい収集チューブに入れ、５ｍｌの分離緩衝液を各カラムに添加し、付属のカラムプランジャーを使用してすぐに洗い流した。溶出試料およびフロースルー試料を、セルカウンターおよびトリパンブルーを使用してカウントし、細胞回収率を決定した。各試料の１×１０６個の細胞を、５００μｌの０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳに希釈した。５０μｌの希釈細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
低密度ディスプレイベクターｐＩＮＴ１７−Ｊ３０を用いた場合、低親和性抗ＰＤ１抗体３３７＿１＿Ｃ０８を表示する細胞株を、より高い親和性抗ＰＤ１抗体ニボルマブ発現細胞から選択的に分離することが可能であった。これを、ＭＡＣＳ溶出またはフロースルー集団のいずれかについてドットプロットフローサイトメトリーの結果を表す図２７ａに示す。各パネルは、溶出および０、０．１、１、または１０ｎＭビオチン化ＰＤ１で事前インキュベートしたフロースルー画分について、ｘ軸（ＦＬ１、ニボルマブ発現細胞）に緑色の蛍光強度がプロットされ、ｙ軸（ＦＬ４、３３７＿Ｃ０８発現細胞）に赤色の蛍光強度がプロットされているドットプロットを示す。例えば、細胞株混合を１ｎＭビオチン化ＰＤ１とともにインキュベートし、続いてＭＡＣＳ分離を行うと、これは、赤色色素で染色されたより低い親和性抗ＰＤ１ ３３７＿１＿Ｃ０８抗体と比較して、緑色色素で染色された高親和性抗ＰＤ１ニボルマブディスプレイ細胞の９５％富化をもたらした。対照的に、フロースルーの非結合細胞は、主により低い親和性の赤色染色抗ＰＤ１ ３３７＿１＿Ｃ０８抗体ディスプレイ細胞を含んでいた。また、１０ｎＭ ＰＤ１インキュベーションと比較して、１ｎＭ ＰＤ１で優れた分離が観察された。しかしながら、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤカセットに由来するより高いコピー数の細胞株で同じ実験を行った場合、ニボルマブおよび３３７＿１＿Ｃ０８発現細胞の間に優先的な富化は観察されなかった（図２７ｂ）。
したがって、この実施例は、細胞表面の抗体ディスプレイレベルを低減することが、特に集団内で高親和性が達成されるため、より低い親和性の抗体よりも高親和性の抗体の富化を増加させることができることを例示した。その標的に対するより低い親和を有する抗体からの高親和性抗体の最適な細胞ディスプレイ分離は、抗体ディスプレイレベルの低減と、選択中に用いられる標識された標的抗原の濃度の低減との組み合わせによって達成された。真核細胞ディスプレイ選択中に、親和性に従って抗体を分離する能力は、所望の抗体の必要な標的候補プロファイルに応じて、抗体発見キャンペーン中に重要である。親和性成熟の間、それらの標的に対する改善された親和性を有する抗体を富化することも重要である。この実施例は、それらの標的に対して高い親和性を有する抗体を区別するのを助ける上での細胞ディスプレイコピー数の重要性を示した。
実施例８ｂ．誘導性ｔｅｔプロモーターを使用した改善
哺乳動物細胞提示抗体の誘導性発現を可能にするベクターを作製することが有利である。これは、異なる表面提示レベルでの選択ステップの組み合わせを容易にし、例えば、厳密な選択に必要な低いディスプレイレベルの選択に続いて、実施例４および５に例示されるように、改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択に必要な高ディスプレイレベルの誘導があり得る。
誘導性抗体ディスプレイ標的化ベクター（ｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１）を、合成遺伝子合成、ＰＣＲアセンブリ、および制限酵素媒介クローニングの組み合わせによって構築した（図２８）。ｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１は、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤと同じベクター骨格、ＡＡＶＳ相同性アーム、およびプロモーターレスブラストサイジン耐性遺伝子を含む。図２８は、ＡＡＶＳ相同性アーム間のｐＩＮＴ１８−Ｔｅｔ１の注釈付き核酸配列を示す。このベクターの主要な特徴には、逆Ｔｅｔ活性化因子（ｒｔＴＡ）タンパク質１１４の発現を駆動するＣＭＶプロモーター、Ｔｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）テトラド、続いて最小ＣＭＶプロモーター、軽鎖遺伝子（ＶＬおよびＣＬ）に融合したＢＭ４０リーダー、リボソームの「スキップ」を可能にするＰ２Ａペプチド１１５、続いて抗体重鎖コード配列が挙げられる。ペンブロリズマブ、ニボルマブ、および３３７＿１＿Ｃ０３の重および軽可変遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）を、この誘導性標的化ベクターにクローニングし、安定したＨＥＫ２９３細胞株を、上に記載されるようにヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって創出した。図２９は、細胞を抗Ｆｃ−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した場合の、ドキシサイクリンの不在下での低基礎抗体ディスプレイを示す。しかしながら、２０ｎｇ／ｍｌの添加後２４時間でドキシクリン抗体の発現が細胞表面に観察される。このディスプレイレベルは、ドキシクリン濃度を２ｎｇ／ｍｌに滴定すると、Ｆｃ染色の低減によって示されるように調整することができる。このように、誘導性細胞ディスプレイ結合剤の例示を示し、誘導因子の濃度を変えることによりディスプレイレベルを調整する能力を示す。
改善された（「第３世代」）誘導性標的化ベクターを、改善された範囲の抗体ディスプレイレベルを可能にするために後に構築した。ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔを、合成遺伝子合成、ＰＣＲアセンブリ、および制限酵素媒介クローニングの組み合わせによって構築した。ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔは、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤと同じベクター骨格、ＡＡＶＳ相同性アーム、およびプロモーターレスブラストサイジン耐性遺伝子を含む。図３７は、ＡＡＶＳ相同性アーム間のｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔの注釈付き核酸配列を示す。このプラスミドは、逆Ｔｅｔ活性化因子（ｒｔＴＡ−３Ｇ）の発現を駆動する伸長因子プロモーターを含む。ｒｔＴＡ−３Ｇは、誘導因子であるドキシサイクリン１１６に対してより高い感受性を示すように進化した元のｒｔＴＡタンパク質１１４の修飾型である。ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔはまた、抗体の重鎖および軽鎖の発現を駆動するｂ方向誘導性プロモーター（ｐＴＲＥ３Ｇ）を含む。ｐＴＲＥ３Ｇを、誘導後の低基礎発現および高最大発現の間のウィンドウを広げるために最適化した１１７。それは、２つの隣接する最小ＣＭＶプロモーターとの１９ｂｐのｔｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）配列の７つの繰り返しからなる。
抗ＰＤ−１抗体のＶＨおよびＶＬ遺伝子：１５４９＿０２＿Ｄ０６、１５３５＿０１＿Ｅ０３および３３７＿１＿Ｃ０８、抗ＰＣＳＫ９抗体のボコシズマブ、８８４＿０１＿Ｇ０１、５Ａ１０ｉ、ならびにアリロクマブを、ｐＴｅｔ１７−Ｔｅｔにクローニングした。抗ＰＤ１抗体３３７＿１＿Ｃ０８を、７４ｎＭのＰＤ１に対する親和性で実施例８に記載した。抗体１５４９＿０２＿Ｄ０６および１５３５＿０１＿Ｅ０３は、それぞれ２．９ｎＭおよび１７ｎＭのＰＤ−１に対する親和性（ＫＤ）を有する親抗体３３７＿１＿Ｃ０８の親和性成熟娘クローンである。抗ＰＣＳＫ９抗体であるボコシズマブ、８８４＿０１＿Ｇ０１、５Ａ１０ｉ、およびアリロクマブのＶＨおよびＶＬ遺伝子（すべて実施例５で以前に説明される）もｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔにクローニングした。
抗ＰＤ１および抗ＰＣＳＫ９抗体の遺伝子を含むｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔ標的化ベクターを使用して、上に記載されるようにＡＡＶＳ ＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ブラストサイジン薬物選択の２５日後、安定した細胞株を、０、２、４、または１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで誘導した。誘導の２４時間後、誘導された細胞株を抗Ｆｃ−ＰＥで染色し、細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞株のヒストグラムプロットを、蛍光強度に対して細胞数をプロットすることによって生成した。
細胞株は、ドクスサイクリンの不在下で非常に低い基礎発現を示した（図３８ａ）。誘導の２４時間後、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でのドキシサイクリンの添加により、完全な誘導を観察した（図３８ｄ）。中間誘導は、２および４ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン濃度の添加により達成した（図３８ｂおよび３８ｃ）。これは、完全な誘導と比較してより低い平均ディスプレイレベルをもたらしたが、７つのＴｅｔＯ繰り返しで以前に観察されたバイモーダル遺伝子発現に似た誘導の広がりをもたらした１１８。
抗体の平均ディスプレイコピー数を、実施例７に記載される方法により定量化した。ここで、様々な量のドキシサイクリンで誘導された細胞株の平均蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、これを使用して、マウスＩｇＧ−ＰＥ標識で染色したＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウスＩｇＧビーズ（カタログ番号８１５、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用して生成された較正プロットを使用してコピー数に変換した。表１１ｃおよび１１ｄは、誘導（ｈｐｉ）の２４または４８時間後の計算されたディスプレイコピー数を示す。ドキシサイクリンの不在下での抗体では、非常に低い基礎発現が観察され、いくつかの例では、抗Ｆｃ−ＰＥで染色すると検出限界を下回った。すべての抗体について４８ｈｐｉの検出可能な基礎発現が存在したが、これは、細胞が２４ｈｐｉと比較して定常成長期に達したためであり得る。ドキシサイクリンの濃度が、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンに対して２ｎｇ／ｍｌから４ｎｇ／ｍｌに増加すると、すべての抗体の平均ディスプレイレベルが増加した。１００ｎｇ／ｍｌを超えるドキシサイクリンの濃度の増加は、ディスプレイレベルの増加をもたらさなかったため、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの濃度で最大の誘導を達成した。
自己相互作用および多反応性２を起こしやすい抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧボコシズマブと、良好に動作する親抗体５Ａ１０ｉの間で、ディスプレイレベルの違いが観察された。親抗体５Ａ１０ｉを、２３５，０００のコピー数でＨＥＫ２９３細胞の表面に表示したが、ボコシズマブは、細胞が１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで誘導されると、３６，０００のコピー数でＨＥＫ２９３細胞の表面に表示され、ディスプレイレベルは誘導の２４時間後に決定した（ｈｐｉ）。これは、親抗体５Ａ１０ｉと比較して、ボコシズマブのディスプレイレベルの６．５倍低減を表す。５Ａ１０ｉと比較したボコシズマブの細胞ディスプレイコピー数のこの観察された低減を、抗体発現が構成的プロモーターによって駆動されたときに以前に観察した（実施例５、図１０）。したがって、この誘導性系は、完全誘導で、構成的プロモーターディスプレイ系で以前に実証したように、自己相互作用および多反応性の点で異なる開発性プロファイルを有する抗体を区別することができる。
また、８８４＿０１＿Ｇ０１という名前の哺乳動物ディスプレイライブラリスクリーニングによって同定されたボコシズマブの変異型を表示した（実施例５）。この抗体は、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣで生物物理的に良好に動作することが示された（表６、実施例５および図１８、実施例５）。この抗体は、ＨＥＫ２９３細胞の表面に７６８，０００のディスプレイコピー数で、２４ｈｐｉ（１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン）の高レベルで表示した（表１１Ｂ）。良好に動作する抗体アリロクマブ２もまた、完全な誘導条件下でＨＥＫ２９３細胞の表面に２４ｈｐｉの高レベルで表示した（表１１Ｂ）。
ドキシサイクリンは、培養条件によって応じて、培養上清では約１日の半減期で分解することが知られている。ドキシサイクリンを補充せずに誘導後の異なる時点での抗体のディスプレイレベルを調べることは、細胞表面での抗体の動的ターンオーバーに関するいくつかの証拠を提供する。あるいは、誘導は、２４時間の期間ドキシサイクリンの存在下で生じることができ、その後完全な培地交換により、細胞がドキシサイクリンにもはや露出されないようにすることができる。ここでは、誘導の４８時間後のディスプレイレベルを簡単に再調査した（表１１Ｃ）。アリロクマブなどのいくつかの良好に動作する抗体は、それらの細胞表面のディスプレイレベルを４８ｈｐｉに維持または増加した。ボコシズマブなどの他の抗体は、２４ｈｐｉと比較して、４８ｈｐｉで細胞表面ディスプレイレベルの２倍を超える低減を示した（図３９）。ディスプレイ抗体が新しく発現された抗体で継続的に補充されていない、細胞に表示された抗体のターンオーバー、分解、または内部移行の速度は、自己相互作用および安定性に関するそれらの開発性特性に基づいて、抗体を選択する追加の手段である（例１１も参照）。
Figure 2021509010
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したがって、ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔは、抗体自己相互作用および多反応性スクリーニングの上に記載される開発性スクリーニングを可能にするために高発現、完全誘導モードに切り替えられ得るヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによってモノクローナル細胞株を創出するために使用され得る、誘導性哺乳動物ディスプレイ標的化ベクターの例を表す。ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔで創出された細胞株は、誘導因子の不在下での基礎ディスプレイレベル、または制限濃度のドキシサイクリンを添加することのいずれかによって、低コピーディスプレイモードに切り替えることもできる。この低コピー数ディスプレイモードは、実施例８ａに記載されるように、異なる親和性を有する抗体クローンのより効率的な分離を可能にするであろう。
それらの標的に対して異なる親和性で細胞表面に表示された抗体の分離のための誘導性哺乳動物ディスプレイ細胞株の有用性を実証するために、高親和性抗ＰＤ１抗体１５４９＿０２＿Ｄ０６（ＰＤ−１についてＫＤ＝２．９ｎＭ）または低親和性抗ＰＤ−１抗体３３７＿１＿Ｃ０８（ＰＤ−１についてＫＤ＝７４ｎＭ）を表示するＨＥＫ２９３細胞を、ｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔ標的化ベクターとのヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって創出した。１５４９＿０２＿Ｄ０６抗体を表示するＨｅｋ２９３細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ｃ３４５５４−励起／発光波長−４９２ｎｍ／５１７ｎｍ）で標識し、３３７＿１＿Ｃ０８抗体を表示する細胞は標識しなかった。細胞を、０、２、４、または１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで誘導した。誘導の４８時間後（ｈｐｉ）、１５４９＿０２＿Ｄ０６を表示する細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｃ３４５５４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、３３７＿１＿Ｃ０８を表示する非標識細胞と混合した。標識細胞および非標識細胞を等しく混合し、次いで、実施例８ａで詳細に記載されるように、０．１、１、または１０ｎＭ ＰＤ−１−ビオチンを含む混合ＩｇＧディスプレイ細胞集団に対してＭＡＣＳ精製を行った。次いで、細胞をフローサイトメトリー（図４０）によって分析し、低親和性抗ＰＤ１ ＩｇＧと比較した高親和性抗ＰＤ１ ＩｇＧの相対的富化を決定した。
高親和性および低親和性の抗ＰＤ−１抗体を表示する細胞の最も効率的な分離は、表示された抗体レベルを低減するために２ｎｇ／ｍｌの制限ドキシサイクリン濃度で細胞が誘導され、ＭＡＣＳ精製で０．１ｎＭ ＰＤ−１ビオチンが使用されたときに生じた。ここでは、集団の９６％に対する高親和性クローンについて、集団の富化を達成した（図４０ｂｉ）。細胞を２ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで誘導した場合、細胞コピー数４８ｈｐｉは、高親和性および低親和性抗ＰＤ−１クローンでそれぞれ１１，０００および２０，０００であった。対照的に、細胞株が完全に誘導されると、０．１ｎＭ ＰＤ−１でのＭＡＣＳは、高親和性クローンの７７％の富化のみを達成した（図４０ｄｉ）。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで完全に誘導した場合、細胞コピー数４８ｈｐｉは、高親和性および低親和性抗ＰＤ−１クローンでそれぞれ３１７，０００および２９４，０００であった。これは、実施例８のデータに加えて、細胞表面抗体ディスプレイレベル（コピー数）の低減が、それらの標的に対して異なる親和性を有するディスプレイ抗体の分離の効率を増加させるであろうというさらなる証拠を提供する。ＭＡＣＳに使用されるＰＤ−１の濃度が増加すると、これは、実施例８の理論分析から予測されるように、高親和性クローンのより低い効率の富化をもたらした（図４０ｂｉｉおよび４０ｉｉｉ）。
この実施例では、自己相互作用および凝集傾向のスクリーニングのための高コピーディスプレイと、高親和性抗体の厳格な選択のための低コピー数ディスプレイの両方を可能にする、高次真核細胞ディスプレイへの誘導性プロモーター系の有用性を実証した。ここでは、誘導因子の制限濃度を使用して、同じ標的に対して７４ｎＭの親和性を有する第２のクローンから２．９ｎＭのその標的に対する親和性を有するクローンの効率的な分離のための低ディスプレイレベルを得た。細胞表面の表示された抗体のコピー数およびＭＡＣＳ分離に使用される標的抗原の濃度を調整することによって、１桁のｎＭ親和性を有するクローンから１ｎＭ未満のその標的に対する親和性（ＫＤ）を有する別個のクローンの効率を増加させることが想定される。
実施例９．Ｆｃ受容体との最適な相互作用のための選択による開発性の向上
実施例６は、異なる交差相互作用特性を有する真核細胞の表示された抗体を区別することが可能であることを実証した。これは、細胞を標識ヒト血清とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって結合を検出することによって達成された。第１相臨床試験８２よりも先に進まなかった、既知の交差相互作用特性３９を有する抗体であるベセンクマブは、良好に動作する抗体と見なされる臨床的に承認された抗体であるニボルマブと比較して、ヒト血清へのより大きな結合をもたらした。ベセンクマブは、インビボで短い半減期を有する１０５。抗体の「粘着性」または交差相互作用特性は、一般に、乏しい薬物動態と相関しており、インビボでの短い半減期は、播種性組織への非特異的結合による全身クリアランスによって引き起こされると考えられている２３、１２２、１２３。
インビボでの抗体半減期はまた、そのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを介したＩｇＧと、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）１２４との間の相互作用に決定的に依存している。循環における長い抗体半減期は、非特異的飲作用またはＦｃ受容体媒介取り込みによるＩｇＧの細胞内在化によって達成される。内在化すると、ＩｇＧは、ｐＨ５〜６でエンドソーム内のＦｃＲｎと高い親和性で結合し、それによってＩｇＧをリソソーム分解から保護する。最後に、ＩｇＧおよびＦｃＲｎの間の親和性が生理学的ｐＨ７．４で非常に弱いため、ＩｇＧを細胞表面に輸送し、循環に戻す。抗ＩＬ１２ブリアキヌマブ２０は、乾癬を治療する第ＩＩＩ相臨床試験で有効性を示さず、インビボで短い半減期を有することが知られている。ブリアキヌマブは、ＦｃＲｎ上の負電荷パッチと結合して、ｐＨ７．４でＦｃＲｎへの結合に対する増加された親和性をもたらすことができるその可変ドメイン内にアルギニンおよびリジン残基からなる正電荷パッチを有する。ｐＨ７．４でのブリアキヌマブのＦｃＲｎへの結合は、マウスのインビボでの短い半減期と相関していることが示されている。また、クローン病の治療に臨床的に承認された抗ＩＬ１２抗体ウステキヌマブは、その可変ドメイン内に正電荷パッチを保有せず、ｐＨ７．４でＦｃＲｎと弱く結合することが知られており、ブリアキヌマブと比較して優れたインビボ半減期を有する。この実施例では、高次真核細胞ディスプレイおよびフローサイトメトリーによるＦｃＲｎ結合の検出によって、ｐＨ７．４でＦｃＲｎに対する既知の異なる親和性を有する抗体を区別することが可能であることを示す。
ブリアキヌマブおよびウステニクマブの重および軽可変ドメインをコードする合成ＤＮＡ（配列については表１２を参照されたい）を、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ標的化ベクター（ベクターマップおよび配列については実施例１を参照されたい）にクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。
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トランスフェクションの１日前に、懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＥＫ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地に５×１０５個の細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションの日に細胞を遠心分離し、製造業者の電気穿孔用緩衝液（Ｍａｘｃｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＣ０８５６４２８）に１０８個の細胞／ｍｌの最終体積で再懸濁した。ＯＣ−１００キュベット（Ｍａｘｃｙｔｅ）を使用して１００μｌをパルスした。トランスフェクションの２日後、細胞を２．５×１０５個の細胞／ｍｌで播種し、７．５ｕｇ／ｍｌのブラストサイジンを添加した。トランスフェクションの５７日後に、ストレプトアビジンＰＥ（１１ｎＭ）と事前複合体化したビオチン化ＦｃＲｎ（５０ｎＭ）で細胞を標識した。事前複合体化は、異なるｐＨの染色緩衝液（１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４を含むＰＢＳ、または１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ＢＳＡ、ｐＨ６．０を含む２０ｍＭ ＭＥＳ）のいずれかで行った。簡潔には、１×１０６個の細胞を遠沈し、ｐＨ７．４のＰＢＳまたはｐＨ６．０の２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液のいずれかで１回洗浄した。細胞ペレットを１００ｕｌの染色緩衝液に再懸濁し、１．０ｍｌの洗浄緩衝液（０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４を含むＰＢＳまたは１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ＢＳＡ、ｐＨ６．０を含む２０ｍＭ ＭＥＳ）で２回洗浄した。細胞ペレットを、生存色素７ＡＡＤ（１００万個の細胞あたり５ｕｌ）を含む５００ｕｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。死細胞を分析中に除外した。ヒストグラムプロットを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して生成した（図３０）。
ｐＨ６では、抗体がＨＥＫ２９３細胞の表面に表示されると、ブリアキヌマブおよびウステキヌマブの両方がＦｃＲｎと結合した（図３０）。ｐＨ７．４では、ＦｃＲｎの結合が観察されなかったウステキヌマブとは異なり、ブリアキヌマブのみがＦｃＲｎへの有意な結合を表示した。この実施例は、より高い高次真核細胞ディスプレイおよびフローサイトメトリーによるＦｃＲｎ結合の分析によって、ｐＨ７．４でＦｃＲｎへの異なる結合親和性のクローンを区別することが可能であることを実証する。これは、抗体の薬物動態（ＰＫ）プロファイルの予測を可能にするであろう。また、細胞ディスプレイ結合剤のライブラリから選択すると、この技法を使用いて、ｐＨ７．４でＦｃＲｎと結合するクローンを排除し、したがって、良好なＰＫプロファイルを保有すると予期されるクローンを選択することができた。例えば、ＭＡＣＳビーズへの細胞ディスプレイ抗体の結合は、ｐＨ６で達成することができた。ｐＨ７．４でビーズを洗浄すると、ｐＨ７．４で低い親和性のクローンを溶出するはずであり、これらのクローンは、ｐＨ７．４で結合を保持する結合クローンと比較して、インビボでより長い半減期を示すと予期される。
ＩｇＧへのＦｃＲｎ結合は、ＩｇＧの翻訳後グリコシル化に部分的に依存することが知られている。したがって、高次真核細胞で説明される選択を実行することは、酵母などの未修飾の低次真核細胞ディスプレイ系でのディスプレイとは異なり、ＦｃＲｎ結合を可能にするために本物のグリコシル化が生じるという利点を有する。
さらに、混合抗体集団からＦｃＲｎへの低減された結合を示す抗体を単離することが可能であることを実証した。異なる抗ＩＬ−１２抗体を発現する高次真核細胞クローンの２つの集団、それぞれ、ブリアキヌマブおよびウステキヌマブを共培養した。ブリアキヌマブを発現する細胞は、ｐＨ７．４でＦｃＲｎと結合することが示された（図３０）。結合は、ＦｃＲｎの負に荷電された側鎖と結合するその可変ドメイン内の正電荷パッチに起因し得る（ブリアキヌマブが負に荷電された多反応性プローブと結合することが示された実施例６を参照されたい）。ウステキヌマブは、ｐＨ７．４でＦｃＲｎへの結合を示さなかった（図３０）。混合抗体発現集団を二重染色し、ウステキヌマブを表示する細胞についてＦＡＣＳによって富化した。図４１。したがって、ＦｃＲｎ結合剤も含む混合集団からＦｃＲｎ非結合剤を富化することが可能であることを実証した。同じ技法を、クローンのより多様な混合物、例えば、数百万の異なる抗体を含むライブラリに適用してもよい。
抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体１３９および補体結合１４０を含む複数のエフェクター機能を誘発することが知られている。Ｆｃドメインのライブラリの作成後、Ｆｃガンマ受容体、ＮＫ受容体、ＦｃＲｎ、または補体カスケードのメンバーなどの既知のエフェクター分子で選択することにより、高次真核細胞ディスプレイを使用して、エフェクター機能分子への結合を増強または低減する変異型を選択することが可能である。これは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強、低減、または抑制するＦｃ変異型を選択するか、またはインビボでの抗体半減期を増加させる。Ｆｃ受容体と結合して標的受容体のそれらのアゴニズムを増加させ、したがってそれらの効力１４１、１４２を増加させるＦｃ変異型も選択することができる。Ｆｃ変異型は抗体の安定性を低減し、それらの生物物理学的特性に悪影響を与え得る１３４、１４３。高次真核生物細胞ディスプレイによるＦｃ変異型の選択の利点は、細胞表面に高レベルで表示される変異型を選択することができ、これらの変異型は優れた生物物理学的特性を有することが予期されることである。
実施例１０．哺乳動物ディスプレイによる選択された集団内の最適な開発性クローンの選択（メソテリン選択）
ここでは、高次真核生物（哺乳動物）の細胞ディスプレイを使用して、抗体の非常に多様な入力パネルから最適な開発性を有する抗体を選択することが可能であることを実証する。異なる生殖細胞系列配列の抗体の錯体混合物を分離し、それらの自己相互作用特性に基づいて抗体をグループ化および選択することができるにした。
まず、抗体ファージディスプレイ選択によって抗メソテリン抗体の富化パネルを生成し、次いで、抗体を哺乳動物細胞ディスプレイライブラリにクローニングし、それぞれ高、中、または低表面提示を呈する細胞クローンからの結合剤の特性を比較することによってこれを示す。
メソテリンは、いくつかのヒト腫瘍で過剰発現される抗原であり、したがって、癌を治療するための治療用抗体標的として興味深い。抗ヒトメソテリンの富化集団を生成するために、以前に記載されているように、抗原がポリスチレン表面に直接固定化された２ラウンドの抗体ファージディスプレイ選択を行った８。以前に記載され、かつ以前に記載されるヒト未感作抗体ライブラリ８と同様の方法で構築された、未感作ヒト抗体ライブラリを採用した（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）。選択を、ＶＬラムダおよびＶＬカッパ生殖細胞系列で別個に行い、第１ラウンドの出力数は２×１０５（平均）であった。以前に説明されるように（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）、ＩｇＧ形式への変換およびｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ標的化ベクターへのクローニングを、「まとめて」行った。ラムダおよびカッパ富化集団のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を、実施例４および５に記載されるように寒天プレート上に播種して、２．４×１０６個のクローンの複合ライブラリサイズを創出した（入力抗体集団の１２倍過剰）。トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤベクター内の抗メソテリン抗体をコードして調製した。ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸＧ２のＨＥＫ２９３設定で、単一のＯＣ−４００キュベット（合計１０８個の細胞、ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ−４００Ｒ１０）を使用して、上に記載されるように（実施例２、４、および５）ＡＡＶＳ ＴＡＬＥヌクレアーゼでライブラリをトランスフェクトした。対照を、同じ設定でＯＣ−１００キュベット（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ−１００Ｒ１０）を使用してトランスフェクトした。電気穿孔した細胞を適切なサイズの三角フラスコに移した後、細胞を、適切な量のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ．カタログ番号１２３３８０１８）を添加する前に３０分間休ませた。細胞を再懸濁し、１３０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２に設定された軌道振盪インキュベーターに置いた。安定したトランスフェクション効率を、４．２％であると上に記載されるように（実施例４および５）計算し、４．２×１０６個の安定した抗体ディスプレイＨＥＫ２９３細胞株の合計ライブラリサイズを得た。ブラストサイジン選択の１９日後、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ細胞選別機を使用して、上に記載されるように（実施例４および５）ＦＡＣＳを実施した。１００×１０６個の細胞を、抗ヒトＦｃ ＰＥ（１×１０６個の細胞あたり１μＬ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）とともにインキュベートし、選別の直前にＤＡＰＩを添加した（１μＬ／百万個の細胞）。低ディスプレイレベルの集団（Ｐ４）、中ディスプレイレベルの集団（Ｐ６）、および高ディスプレイレベルの集団（Ｐ５）を可能にする３つのゲートを描いた。Ｉｎｆｌｕｘ選別機は、一度に２つの集団のみを選別することができ、したがって、５０×１０６個の細胞を、ゲートＰ４およびＰ５のために選別し、他の５０×１０６個の細胞を、Ｐ６のため選別した（図３１）。上に記載されるように（実施例４および５）３つの集団からゲノムＤＮＡを抽出し、抗体遺伝子をｐＩＮＴ３ベクター（ＷＯ２０１５１６６２７２Ａ２）にクローニングし、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を配列決定した。
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配列分析は、すべてのサブ集団内で大きな多様性を明らかにした（表１３）。これがサンプリングの問題によるものではなかったことを確認するために、異なるクローングループの異なるディスプレイグループへの「ビニング」が生じていたどうかを判定するために、１回を超えて出現したクローンの分析に焦点を当てた。したがって、重複分析を、低、中、高ディスプレイレベルの集団で複製クローンが識別された（ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３配列に基づいて）抗体に対して行った（表１４）。高ディスプレイレベルの集団には１３個のそのようなクローンがあり、低ディスプレイレベルの集団には複数回出現した２８個のクローンあり、それらの間に重複はなかった。「中程度の発現因子」として識別されたクローンのグループは、１回を超えて出現した１１個の配列を有し、これらもまた他のグループでは見出されなかった。「中」グループに出現した４個のクローンがあり、それは低グループでは３ケース、高グループでは１ケースで重複していた。この結果は、哺乳動物細胞でのディスプレイレベルに基づく選別が、そのグループに対して固有の配列の特定のサブ集団を選択する証拠である。
Figure 2021509010
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表面提示に基づいて選択された細胞集団の違いは、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用した抗体集団の詳細な分析によって確認した。簡潔には、高、中、および低ディスプレイレベルの集団ならびに入力集団からの抗体の対合した可変ドメイン遺伝子を増幅し、配列決定し、非対称バーコード１２５、１２６を使用して逆多重化し、次いで、出力ＢＡＭファイルを、ＦＡＳＴＱファイル形式に変換して、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓソフトウェアによる抗体配列分析を可能にした。
この分析の結果から合計１９７９２個の対合したＶＬおよびＶＨ遺伝子読み取りを得た。集団を逆多重化した後、これは、それぞれ入力レベル集団と高、中、および低ディスプレイレベル集団に対して２９９８、１５１６、６１８０、および９０９８ ＣＣＳ読み取りを発生もたらした。抗体配列に注釈を付け、それらのフレームワークおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）をマッピングし、重鎖および軽鎖生殖細胞系列をＩＭＧＴデータベース１２７に従って割り当てた。停止コドンを含まない注釈が付けられたＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３配列を有したクローンについてのこの分析の結果の要約を表１５に示す。未感作抗体ファージディスプレイライブラリ８を使用してメソテリンに対して２ラウンドの抗体ファージディスプレイ選択を行うことによって事前に選択された抗体入力集団は、ＶＨ ＣＤＲ３配列固有であるクローンの５１％およびＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３配列固有であるクローンの８８％で非常に多様であった。この入力集団はまた、配列決定された１０００個のクローンあたりそれぞれ識別された１９、１８、および１０のＶＨ、ＶＬκ、およびＶＬλ生殖細胞系列を有する多様な抗体生殖細胞系列であった。ＣＤＲ３配列および生殖細胞系列の両方に関するこの多様性は、高、中、および低の哺乳動物ディスプレイゲーティングされた集団を分析すると低減した。ＶＨ ＣＤＲ３固有抗体の数が４％未満に低下し、配列決定された１０００個のクローンあたりのＶＨ、ＶＬκ、およびＶＬλ生殖細胞系列の数がそれぞれ４、２、および３に低下すると、低ディスプレイレベルの集団の多様性が著しく低減した。入力集団と比較した抗体多様性のこの低減は、特定のクローンがディスプレイレベルのゲーティングされた抗体集団で富化されていることを示し、したがって、集団の冗長性が増加する。
ＶＬκおよびＶＬλ生殖細胞系列の比率もまた異なる集団で調査した。開始入力集団は、ＶＬκ抗体と比較してほぼ２倍過剰のＶＬλを有したが、この比率は、４倍過剰のＶＬκ抗体を有した低ディスプレイレベルのゲーティングされた集団では逆転した。これらの結果は、低ディスプレイグループが特定の軽鎖生殖細胞系列配列を有する抗体の特定のサブセットを富化していることを示す。
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入力集団と、低、中、および高ディスプレイレベルに基づいて高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを使用して選択されたクローンとのより詳細な生殖細胞系列分析を可能にするために、抗体をそれらの最も一致するＶＨ、ＶＬκ、およびＶＬλ生殖細胞系列に割り当てて、生殖細胞系列の発生頻度を、各グループについて計算した。結果を表形式（表１６、１７、および１８）およびヒストグラムプロット（図４２、４３、および４４）の両方で示す。これは、配列決定された集団において、いくつかの生殖細胞系列が低または高ディスプレイレベルグループで富化していたかまたは不在であったことを示し、抗体ディスプレイレベルに基づく哺乳動物ディスプレイ選択が抗体生殖細胞系列の選択的富化を可能にすることを示す。例えば、ＩＧＨＶ３−２３およびＩＧＨＶ１−２生殖細胞系列を、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループでそれぞれ１０５倍および９倍に富化した。ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−２１、およびＩＧＨＶ４−３４生殖細胞系列は、高ディスプレイグループではそれぞれ２．７％、１．１％、および０．９％の頻度で発生したが、低ディスプレイグループでは完全に不在であった。ＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列は、良好に動作する生殖細胞系列であると考えられ、アリロクマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、デュピルマブ、エミシズマブ、オクレリズマブ、ラニビズマブ、およびシルツキシマブを含む、臨床使用が承認されているいくつかの治療用抗体に表される。ＩＧＨＶ３−２１およびＩＧＨＶ３−５３生殖細胞系列は、良好に動作すると考えられ、ヒト合成抗体ライブラリ設計１２に含まれている。ＩＧＨＶ１−６９Ｄ、ＩＧＨ３−３０、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−５８、およびＩＧＨ３−６４Ｄの５つのＦＶ生殖細胞系列は、低ディスプレイグループで富化されていることが見出された。以前に、ＩＧＨ３−３０生殖細胞系列は、特定の軽鎖と対合した場合、動的光散乱測定１２によって決定されるように、自己相互作用する傾向があることが観察されている。
抗体軽鎖生殖細胞系列の発生頻度の分析は、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループの特定の生殖細胞系列の富化も示した。例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３およびＩＧＫＶ３−１９は、高ディスプレイグループではそれぞれ３．５％および６％の頻度で発生したが、低ディスプレイグループでは完全に不在であった。ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、およびＩＧＫＶ６−２１生殖細胞系列を、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループでそれぞれ１１倍、２２倍、６倍、１１倍、および１３２倍に富化した。ＩＧＫＶ２−２８および関連する生殖細胞系列ＩＧＫＶ２Ｄ−２９は、良好に動作すると考えられ、カンツズマブ、デュピルマブ、ルカツマブ、モガムリズマブ、オビヌツズマブ、セビルマブ、テナツモマブ、およびザツキシマブを含む、臨床使用が承認されているか、または臨床評価中のいくつかの抗体に表される。ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ２−３０、およびＩＧＫＶ４−１の４つのＶＬκ生殖細胞系列は、低ディスプレイグループで富化されていることが見出された。入力集団（ＩＧＬＶ３−１９）で単一のＶＨλ生殖細胞系列が優勢であるため、ＶＨλ生殖細胞系列分析はあまり明確ではない。それにもかかわらず、以下のＶＨλ生殖細胞系列が高ディスプレイグループで富化された：ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ３−１０およびＩＧＬＶ６−５７。Ｖλ１−４７およびＶλ２−１４軽鎖は、良好に動作することが知られており、合成ライブラリ設計１２、１２８において足場として含まれている。ＩＧＬＶ２−１４は、良好に動作する抗体２である臨床的に承認された抗ＰＣＳＫ９抗体であるエボロクマブに存在する軽鎖である。
この分析は、ヒト抗体生殖細胞系列の哺乳動物ディスプレイの高または低ディスプレイグループのいずれかへの「ビニング」を可能にする。高レベルディスプレイは、タンパク質自己相互作用の低い傾向に関して、良好に動作する生物物理学的特性と相関することが以前に示された（実施例３）。したがって、哺乳動物ディスプレイの高ディスプレイレベルグループにおける特定の生殖細胞系列の富化の観察は、それらの固有の生物物理学的特性によるものである。したがって、哺乳動物ディスプレイは、自己相互作用の低い傾向に関して、良好に動作する生物物理学的特性を有する抗体生殖細胞系列の富化および識別を可能にする。
Figure 2021509010
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クラスター分析を行い、４つの抗メソテリン抗体集団の各々について、それらの発生頻度とともに、配列固有ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３クローンの一覧を生成した。発生頻度による上位１０個のクローンを、図３１に示されるようにゲーティングされた高、中、および低ディスプレイレベルの抗メソテリン抗体ＦＡＣＳについて表１９に示す。比較のために、入力集団および代替集団におけるクローンの発生頻度も示す。より限定されたクローンセットで以前に示されたように、高ディスプレイレベルグループの上位７個の最も豊富なクローンおよび低ディスプレイグループの間に重複はなかった。高ディスプレイレベルグループで７個の最も豊富なクローンは、低ディスプレイレベルグループでは完全に不在であった。低ディスプレイレベルグループで９個の最も豊富なクローンは、高ディスプレイレベルグループでは完全に不在であった。最も豊富な中ディスプレイレベルグループでは、高および低ディスプレイレベルグループとのいくつかの重複があった：３個のクローンは中ディスプレイレベルグループにのみ存在し、２個のクローンは中および高ディスプレイレベルグループにのみ存在し、３個のクローンは３つのディスプレイレベルグループすべてに存在した。低ディスプレイレベルグループといくつかの重複があった高ディスプレイレベルグループに由来するクローン（例えば、クローン８、９、および１０）について、４１倍を超える高ディスプレイレベルグループこれらのクローンの富化があった。
それらの配列に従う高、中、および低ディスプレイレベルグループへの抗体のビニングは、真核細胞の抗体ディスプレイレベルに基づく分離が、それらのポリペプチド配列によって決定されるその抗体の特性に起因することを示す。ＰａｃＢｉｏ ＮＧＳ分析によって決定されるような抗体の出現頻度は、サンガー配列決定によってより限定されたセットのクローンを配列決定することからの結果とよく一致した。ＰａｃＢｉｏ ＮＧＳによって、低、中、および高ディスプレイレベルグループの上位１０の最も豊富なクローンのうちの９、８、および６は、サンガー配列決定によって以前に識別されていた。
次いで、高および低ディスプレイレベルグループから選択した抗体を発現させて精製し、それらの生物物理学的特性をＡＣ−ＳＩＮＳ４１またはＨＰＬＣ−ＳＥＣで決定した。ＡＣ−ＳＩＮＳの結果を、表１９の最後から２番目の列に示す。高または低ディスプレイグループに由来するクローンの平均ＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトは、それぞれ１．９および１５．２であった。高ディスプレイレベルグループと比較して、低ディスプレイレベルグループに由来するクローンから観察された有意により高い平均ＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトは、低ディスプレイレベルグループの抗体が、高ディスプレイレベルグループの抗体よりも自己相互作用および凝集をより起こしやすいことを示す。選択された抗体はまた、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって検査した。図４５は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって発現および精製および分析された、１つが高ディスプレイグループからのもの（９３２＿０１＿Ａ０３）であり、３つが低ディスプレイグループからのもの（９３０＿０１＿Ａ１２、９３０＿０１＿Ｂ０２、および９３０＿０１＿Ｃ１２）である４つのクローンの例を示す。これは、高ディスプレイレベルグループから単離された抗体９３２＿０１＿Ａ０３が、９６％単量体であることを示す。対照的に、抗体９３０＿０１＿Ｃ１２は、１８％二量体の８２％単量体であり、その後の溶出プロファイルでカラムでの一部の遅延が見られ、カラムとのいくつかの非特異的相互作用を示す。このクローンは、小さな断片（分子量１６ｋＤａ）を含み、発現または精製中に断片化した場合があることを示す。低ディスプレイグループからの２つの追加のクローン（９３０＿０１＿Ａ１２、９３０＿０１＿Ｂ０２）もまた、カラムでの保持時間の遅延を示し、抗体がカラムマトリックスに非特異的に吸収されたことを示す。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ保持体積（最後の列、表１９）は、カラムマトリックスと相互作用する非特異性抗体の測定値である。ここで、より大きな保持体積は、より広いＨＰＬＣ−ＳＥＣピークをもたらし、ＨＰＬＣ−ＳＥＣカラムマトリックスとの非特異的相互作用を示すことができる。高ディスプレイグループクローンの平均ＨＰＬＣ−ＳＥＣ保持体積は、１．５５ｍｌであったが、低ディスプレイグループクローンの平均ＨＰＬＣ−ＳＥＣ保持体積は、１．６ｍｌであり、低ディスプレイグループのクローンが高ディスプレイグループのクローンよりも非特異的ＨＰＬＣ−ＳＥＣカラムマトリックス相互作用を起こしやすかったという証拠を提供する。限外濾過による濃縮を試みた後、低ディスプレイレベルグループの１個のクローン（９３０＿０１＿Ｃ０７）が沈殿した。低ディスプレイレベルグループの２番目のクローンは、発現および精製に失敗した。高ディスプレイレベルグループに由来するクローンは、発現、精製、およびその後の分析中にいかなる問題も実証しなかった。これには、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１２ｍｇ／ｍｌ超に限外濾過によって濃縮される能力が含まれた。
したがって、この実施例では、高次真核生物の哺乳動物細胞ディスプレイを使用して、それらの自己相互作用および交差相互作用特性に基づいて、異なる生殖細胞系列配列を有する抗体を含む、錯体混合物内に存在する抗体を分離することが可能であることを示した。
実施例１１．細胞表面への急速な蓄積に基づく開発性クローンの選択
上記の実施例では、高次真核細胞の安定した集団の表面における構成的抗体ディスプレイレベルと、その抗体の生物物理学的特性との関係に言及した。ここでは、また、トランスフェクションの２４時間後にディスプレイレベルの違いが観察されることにも言及する。実施例５、図１０では、トランスフェクションの１日後（１ｄｐｔ）の時点で、ボコシズマブおよび親抗体５Ａ１０ｉの間のディスプレイレベルの違いを観察した（図１０、左パネル）。表示された抗体のこの初期蓄積率の違いは、平衡状態で安定した細胞株（図１０、右パネル、２１ｄｐｔ）のディスプレイレベルの違い、および抗体の生物物理学的特性と相関している。実施例５において、ボコシズマブは、ＡＣ−ＳＩＮＳアッセイおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣで測定される親抗体５Ａ１０−ｉと比較して、高い自己相互作用および交差相互作用特性を有することが示された。ボコシズマブは、親抗体５Ａ１０−ｉと比較して、トランスフェクションの２４時間後の移行相およびトランスフェクションの２１日後の安定した細胞株相の両方で、より低いレベルで表示された（図１０）。したがって、最初の一過性抗体細胞ディスプレイレベルは、数日間の薬物選択後に作成された安定した細胞株の抗体細胞ディスプレイレベルを予測するものである。
したがって、高次真核生物の細胞表面の表面での抗体のディスプレイ率と抗体の生物物理学的特性との関係を示した。抗体の最初の一過性ディスプレイとそれらの生物物理学的特性との実証された関係は、安定した細胞株の生成と比較してより早い段階で、抗体の集団またはライブラリから優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化するのに有用となる。また、個々のモノクローナルトランスフェクションによる抗体の個々のセットのスクリーニングにも有用となる。また、抗体の細胞表面ディスプレイの最初の比率の違いは、抗体発現が誘導性プロモーターによって調節され、細胞表面ディスプレイレベルに基づく集団の選択が誘導後に開始される場合に有用であり得る。
実施例１２．ＣＨＯ細胞ライブラリの表面提示レベルに基づくＩｇＧの開発性の選択
ＩｇＧ抗体は、自己相互作用および凝集するその傾向を含む個々の抗体の生物物理学的特性と相関しているディスプレイレベルで、ＣＨＯ細胞の表面に表示することができる。この実施例では、２つの代替ヌクレアーゼ媒介抗体遺伝子組入れ方法の後のＣＨＯ細胞の表面上の抗体ディスプレイを示し、ディスプレイレベルが、表示された抗体の生物物理学的特性と相関していることを実証する。
遺伝子標的化ベクターを設計し、実施例１に記載されるヒトＡＡＶＳゲノム遺伝子座９３にオーソロガスであるＣＨＯ ＡＡＶＳ遺伝子のイントロン１への抗体遺伝子発現カセットの組入れのために使用した。ＣＨＯ ＡＡＶＳ遺伝子座のイントロン１を標的とするＴＡＬＥＮヌクレアーゼは、この位置で二本鎖切断を創出した。比較のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼもまた平行法で試験した。
ＴＡＬＥＮ指向およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９指向組入れ方法の両方を使用して、ＣＨＯ細胞での抗体ディスプレイを無事に達成した。ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ対またはＣＲＩＳＰＲ １設計を使用して、最高のディスプレイレベルうぃ達成した。代替ＣＲＩＳＰＲ設計（ＣＲＩＳＰＲ ２およびＣＲＩＳＰＲ ３）も成功したが、わずかにより低いレベルの抗体ディスプレイが観察された。図４８．
さらに、ＣＨＯ細胞に表示された抗体の細胞表面レベルが、ＨＥＫ２９３細胞で見られた結果を反映して、表示された抗体の生物物理学的特性と相関していたことを実証した。選択された抗体を、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯ標的化ベクターにクローニングした：ＭＥＤＩ−１９１２、ＭＥＤＩ−１９１２−ＳＴＴ、ボコシズマブ、８８４＿０１＿Ｇ０１。
ＭＥＤＩ−１９１２（抗ＮＧＦ）は、自己凝集するその傾向に関して乏しい生物物理学的特性を有する７。溶解度が増強された娘クローンＭＥＤＩ１０１２−ＳＴＴと比較して、ＭＥＤＩ−１９１２のＣＨＯ細胞では、低減された細胞表面ディスプレイレベルが観察された。
８８４＿０１＿Ｇ０１は、ボコシズマブの誘導体であり、ディスプレイレベルおよびＰＣＳＫ９への保持された結合に基づいて、変異誘発および哺乳類動物ディスプレイの選択によって特定した（実施例５）。８８４＿０１＿Ｇ０１は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより低いＡＣ−ＳＩＮＳスコアおよび単量体のピークを与えるという点で、「良好に動作する」ことが以前に示された。改善された娘クローン８８４＿０１＿Ｇ０１と比較して、ボコシズマブでは、低減されたＣＨＯ細胞表面ディスプレイレベルも観察された。図４９．
したがって、この実施例は、それらの細胞表面ディスプレイレベルに基づいて、抗体のディスプレイおよび異なる生物物理学的特性を有する抗体の区別のためのＣＨＯ細胞の有用性を確認する。異なる生物物理学的特性を有する抗体は、フローサイトメトリーによって十分に分離することができ、錯体混合物内のＣＨＯ細胞ディスプレイにより、より良好な生物物理学的特性を有する抗体の分離を可能にする。
材料および方法
ＣＨＯ ＡＡＶＳの左および右の相同性アームをコードするＤＮＡを、プライマー対３１６５／３１６６および３１６９／３１７０（表２０）でＣＨＯ細胞から単離した、懸濁液適合ＣＨＯ細胞株ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅して、それぞれサイズが１．２ｋｂおよび１．３５ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。次いで、これらのＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して、その後の抗体遺伝子クローニングに必要な様々な制限部位を同時にノックアウトしながら、左および右のＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームを生成した。上に記載されるＣＨＯ ＡＡＶＳ左アームテンプレートを使用して、ＰＣＲプライマー対３１９５／３１９６、３１９７／３１９８、３１９９／３２００でのＰＣＲ増幅による既存のＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ、およびＤｒａＩＩＩ部位の変異とともに、ＣＨＯ左ＡＡＶＳホモロジーアームを創出して、それぞれ２４１ｂｐ、５７６ｂｐ、および１４２ｂｐのサイズの３つのＰＣＲ産物を創出した。次いで、プライマー３１９９および３１９６（表２０）を使用してフラグメントを組み立て、サイズが８９３ｂｐの産物を生成した。３１９６の代わりにプライマー３１２３を用いてわずかにより短いＡＡＶＳ左相同性アーム（８８０ｂｐ）を得たことを除いて、追加のアセンブリＰＣＲ反応を行った。このわずかに短い左相同性アームを生成する理由は、標的化ベクター内のＣＲＩＳＰＲ ２および３設計認識部位を回避するためである（図４６）。組み立てられたＡＡＶＳ左相同性アームを、ＡｓｉＳＩおよびＮｓｉＩ制限酵素で消化し、ＡｓｉＳＩおよびＮｓｉＩで事前に切断されたｐＩＮＴ１７−ＢＳＤベクターにクローニングした。ＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームをＰＣＲ増幅して、ＢｃｌＩ制限をノックアウトするために、プライマー対３２０１／３２０２および３２０３／３２０４で２つの別個のＰＣＲ反応を行い、それぞれ７０７ｂｐおよび２０８ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を創出し、次いで、それらをプライマー３２０１および３２０４で、ＰＣＲで組み立てし、９００ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を生成した。組み立てられたＡＡＶＳ右相同性アームを、ＢｓｔＺ１７１およびＳｂｆＩ制限酵素で消化し、ＢｓｔＺ１７１およびＳｂｆＩで事前に切断されたｐＩＮＴ１７−ＢＳＤベクターにクローニングし、次いで、左ＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームをすでに保持していたＢｓｔＺ１７１およびＳｂｆＩ切断ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ切断ベクターにクローニングした。次いで、これは、ＣＨＯ標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯを創出し、これは、ヒトＡＡＶＳ相同性アームがＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームにより置き換えられていることを除いて、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ（図１）と同一である。
Figure 2021509010
ＴＡＬＥＮ対を、図４６に示されるように、ＴＡＬ標的配列：ＴＣＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＣおよびＴＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴを認識したＣＨＯ ＡＡＶＳ遺伝子座を認識するように設計した。ＴＡＬＥＮによる部位特異的ＤＮＡ切断に対する比較のために、代替ヌクレアーゼ−核酸誘導ヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の性能もまた試験した。３つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを、ＣＨＯ ＡＡＶＳ遺伝子座を標的とするように設計し、認識配列を図４６に示す。
標的化ベクターにクローニングされたＣＨＯ ＡＡＶＳ相同性アームの核酸配列を図４７に示す。Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターガイドＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする合成遺伝子ブロックを設計し、プライマー３２２２および３２２３でＰＣＲ増幅した（表２１）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター（Ａ２１１７７、Ｇｅｎｅａｒｔ）をプライマー３２２０／３２２１でＰＣＲ増幅して、９３７５ｂｐの産物を生成した。次いで、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して３つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子ブロック（表２０）でこれを組み立て、図４６に示される３つのガイドＲＮＡをコードする３つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを生成した。
Figure 2021509010
ニボルマブ抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含む８９３ｂｐまたは８８０ｂｐ ＡＡＶＳ左相同性アーム（それぞれＶ１またはＶ２と名づけられている）を含む標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯを使用して、ＣＨＯ ＡＡＶＳ ＴＡＬ−１ＦおよびＣＨＯ ＡＡＶＳ ＴＡＬ−１Ｒ ＴＡＬＥＮ対（Ｍ３７７０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＣＨＯ ＡＡＶＳ特異的ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のいずれかをコードするプラスミドの不在または存在下で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をトランスフェクトし、ブラストサイジン薬物選択に晒した（７．５μｇ／ｍｌ）。トランスフェクション法は、ＴＡＬＥＮトランスフェクションについて実施例２に記載されるとおりであった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクションには、１０：１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯプラスミドＤＮＡ比を用いた。トランスフェクションの１４日後（ｄｐｔ）、細胞を抗Ｆｃ ＰＥで染色した。蛍光強度（抗Ｆｃ）を細胞カウントに対してプロットした。
２つの抗体対の重鎖および軽鎖遺伝子を、８９３ｂｐのＡＡＶＳ左相同性アームを使用してＣＨＯ標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−ＣＨＯにクローニングした（図４７）：抗ＮＧＦ抗体ＭＥＤＩ−１９１２またはＭＥＤ−１９１２−ＳＴＴ７または抗ＰＣＳＫ９ボコシズマブまたはボコシズマブ誘導体クローン８８４＿０１＿Ｇ０１（実施例５を参照されたい）。得られた標的化ベクターを使用して、ＣＨＯ ＡＡＶＳ ＴＡＬ−１ＦおよびＣＨＯ ＡＡＶＳ ＴＡＬ−１Ｒ ＴＡＬＥＮ対（Ｍ３７７０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコードするプラスミドの存在下で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をトランスフェクトし、ブラストサイジン薬物選択に晒した（７．５μｇ／ｍｌ）。実施例２に記載されるように、１５ｄｐｔの細胞を抗Ｆｃ−ＰＥで染色した。抗体を表示する１５ｄｐｔのＣＨＯ細胞を抗Ｆｃ−ＰＥ ＭＡＣＳで精製し、抗Ｆｃ ＰＥで染色した。蛍光強度（抗Ｆｃ）をＣＨＯ細胞カウントに対してプロットした。
実施例１３．その後の結合選択に哺乳動物ディスプレイを使用した「開発性が増強された」集団の創出
実施例１０は、抗原（この実施例では、ファージディスプレイ選択から）で予め選択されたクローンの集団が、生物物理的特性と順に相関する異なる提示レベルに基づいてさらに解明され得ることを実証する。他で記載されるように、多反応性プローブへの結合はまた、多反応性特性を有するクローンを特定および除去するためにも使用することができる。したがって、それ以外の場合はさらなる特徴付けまたは開発のために選択され得る問題のあるクローンを排除することができる。
実施例１０では、抗体集団を、最初に（この実施例ではファージディスプレイを使用して）結合特性に基づいて選択し、続いてその後の生物物理学的特性に基づく選択によって選択した。高次真核生物の提示レベルまたは多反応性プローブへの結合に基づいて、選択の順序を逆にし、最適な生物物理学的特性のために選択されたクローンの集団を生成することも可能である。例えば、結合剤のディスプレイライブラリを、哺乳動物細胞または他の高次真核生物で創出し、結合剤の定常領域と結合する薬剤を使用して掲示レベルを選択することができ、それによりすべての結合剤をそれらの配列とは無関係に等しく標識することができる。例えば、結合剤がＩｇＧ抗体である場合、細胞は、ＩｇＧ Ｆｃ領域と結合する検出可能な物質、例えば、標識された抗ＩｇＧ抗体と接触し得る。次いで、モードまたは中央値よりも高い提示レベルを示す集団の画分を、例えば、フローサイトメトリーによって選択することができる。例えば、提示レベルに基づくクローンの上位５％、１０％、または２５％は、本明細書に記載の方法を使用して、１ラウンド以上の選別で選択することができる。これにより、異なる抗原への結合に基づくその後の選択に使用され得る、結合剤の「開発性が増強された」集団が創出されるであろう。
実施例１０のアプローチを使用して、４×１０１０個のクローンの大きなファージディスプレイライブラリを選択し、結合剤のサブ集団を生成し、次いで、それらを掲示レベルに基づく選択のために哺乳動物ディスプレイライブラリに組み込んだ。順序を逆にする１つの潜在的な欠点、すなわち、結合剤の選択の前に高次真核生物の生物物理特性を事前に選択することは、リボソームディスプレイまたは細菌系（例えば、ファージディスプレイ）などのインビトロ系で使用するためのライブラリを創出するよりも、哺乳動物細胞での大きなライブラリの創出の方がより困難かつ費用がかかることである。したがって、例えば、１０７個のクローンの開始哺乳動物ディスプレイライブラリが使用され、上位１０％が掲示レベルに基づいて選択される場合、抗原結合のその後の選択に使用されるライブラリの潜在的な多様性は、例えば、高親和性結合剤を選択する可能性を低減する１０６個のクローンに低減される。代替戦略は、例えば、最適なＶＨおよび最適なＶＬ構成要素に別個に選択された抗体の場合に、哺乳動物ディスプレイでライブラリの構成要素を事前に選択することであり、次いで、それらを組み合わせて、組み合わせ多様性の恩恵を受けることである。
したがって、１つの分岐で、哺乳動物ディスプレイライブラリは、最適なＶＨ遺伝子を選択するために、ＶＬの単一または限定された選択およびＶＨ鎖の大きな多様性を含むＩｇＧまたはｓｃＦｖ形式の抗体で創出することができる。単一または限定されたパートナーＶＬ遺伝子は、ランダムに選択されるか、パートナーチェーンの不十分な生物物理学的特性を救うＶＨ遺伝子を選択する目的で、不十分な生物物理学的特性に基づいて選択される。あるいは、良好な生物物理学的特性を有するＶＬ遺伝子を選択して、掲示レベルを損なうＶＨ遺伝子を特定および除去してもよい。上の実施例と同じ数を使用して、ＶＨ多様性を有する１０７個のクローンのライブラリを創出して、掲示レベルに基づいてＶＨ遺伝子の上位１０％を選択し、１０６個の選択されたＶＨクローンを潜在的に生成し得る。並列分岐では、単一または限定された数のＶＨ遺伝子を、多様なＶＬ遺伝子と組み合わせて、最適なＶＬ遺伝子を選択してもよい。異なる選択されたＶＨおよびＶＬ遺伝子を一緒にする組み合わせ多様性は、個々の選択された鎖の数よりも著しく高くなるであろう。したがって、各分岐の上位１０６個のＶＨ遺伝子および上位１０６個のＶＬ遺伝子を選択により、１０１２変異型の潜在的な組み合わせ多様性を創出する。選択されたＶＨおよびＶＬドメインは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、および高次真核生物でのディスプレイを含む標的結合の選択を可能にする任意のディスプレイ系内に掲示されてもよい。このようにして、本発明を使用する最適な生物物理学的特性の選択を使用して、他のディスプレイ系内に「開発性が増強された」ライブラリを生成してもよい。例えば、最適な生物物理学的特性を有するクローンを産出するように事前に配置されているファージディスプレイライブラリ。
上記のアプローチのさらなる実施例において、最適な生物物理学的特性の選択は、個々のドメイン内の領域に指向されてもよい。例えば、ＶＨドメインには、３つの異なる相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）が含まれ、生物物理学的な責任は、個々のＣＤＲまたはＣＤＲの組み合わせ内の配列によって引き起こされ得る。例えば、非免疫化抗体レパートリーのＶＨ遺伝子のＣＤＲ１および２領域は、最適な生物物理学的性質のために選択されたＣＤＲ１および２内に焦点を絞った多様性とともに、単一または限定された数のＶＨ ＣＤＲ３領域およびＶＬパートナー鎖、ならびに得られる抗体集団と組み合わせて回収されてもよい。次いで、選択されたＣＤＲ１および２領域は、ＣＤＲ３セグメントおよびＶＬセグメントの多様性と組み合わせることができ、これらは選択されていないか、同様の方法で最適な生物物理学的特性のために選択されていてもよい。この「シャッフル」アプローチにより、潜在的な組み合わせ多様性が増加する。上に記載される実施例は、ＣＤＲ １およびＣＤＲ２セグメントの最適な生物物理特性の選択を記載しているが、同じアプローチを異なるＣＤＲ領域だけで、または組み合わせてどのように使用され得るかは明らかである。いくつかの場合によっては、最適な生物物理学的特性のために選択される入力ライブラリは、非免疫化源からの、または開始足場の多様化からのナイーブライブラリであり得る。あるいは、入力ライブラリは、親和性とともに潜在的に生物物理学的特性を改善する目的で、入力開始クローンまたはクローンの選択に基づく多様化ライブラリであってもよい。
それぞれの場合において、上に記載されるアプローチは、当業者に既知である標準的な分子生物学技術を使用する。加えて、鎖がシャッフルされたライブラリを含むライブラリの構築および使用のための方法もまた、ＷＯ２０１５／１６６２７２（Ｉｏｎｔａｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＶＨまたはＶＬドメイン内の異なる領域を組み合わせることは、最適なＰＣＲプライマーを使用してＶＨおよびＶＬドメイン内の個々の領域を増幅することから利益を得るであろう。抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子の生殖細胞系列配列は、容易に入手可能であり、例えば、ＩＭＧＴデータベース１３２はそのようなプライマーの設計を可能にする。さらに、ＷＯ２０１７／１１８７６１（Ｉｏｎｔａｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）の実施例は、多様性を導入し、異なるＣＤＲ領域を組み合わせて、無傷のＶＨ：ＶＬの組み合わせを再構成する方法を記載している。
以下の実施例を例示のために使用する。最初のＰＤ１結合抗体クローンのＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３に多様性を導入し、得られた集団を哺乳動物細胞での最適な提示のために選択した。同じアプローチを採用して、生殖細胞系列コード化遺伝子のＣＤＲ １および２を含む他の開始フレームワークおよび他のＣＤＲに多様性を導入することができた。例えば、表１６は、哺乳動物細胞、例えば、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ３−２３、およびＩＧＫＶ６−２１で高レベルの掲示のために選択された集団に頻繁に出現する生殖細胞系列遺伝子を特定し、これらは、さらなる多様化および開発性の選択ために開始フレームワークとして選択してもよい。同様に、抗体以外の結合ドメインのサブ領域を、最適な生物物理学的特性の別個の選択のために特定することができる。
例として、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用をブロックした抗ＰＤ１抗体（３３７＿１＿Ｃ０８）を、ファージディスプレイによって特定した（図５０ａ）。ＰＤ−１に対する３３７＿１＿Ｃ０８の親和性（ＫＤ）は７４ｎＭである。これを使用して、ＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３に焦点を当てた多様化を有する変異誘発されたライブラリを創出した。多様化のための様々な方法が当業者に知られている。多様化は、例えば、ＮＮＳ（３２個のコドン内のすべての２０個のアミノ酸をコードする）などのランダム化コドンを使用する飽和変異誘発による変異誘発されたライブラリの創出を含み得る。代替案は、周囲の配列空間を探索しながら配列情報を保持することである。これを達成するために、オリゴヌクレオチドを、すべてのアミノ酸（システインを除く）を使用して、可能なすべての２量体および１量体の変異型が含まれるように、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３における８個のアミノ酸の連続ストレッチに設計した（図５０ａ）。
したがって、ライブラリを、各ＣＤＲ３領域の元の８個のアミノ酸のうち少なくとも６個のアミノ酸を保持するように設計した。ＶＨ ＣＤＲ３またはＶＬ ＣＤＲ３の各々に向けられた９２１６個のオリゴヌクレオチドの合成によってこれを達成することが可能であった。ＶＨおよびＶＬのＧｅｎｅｂｌｏｃｋは、すべての２量体アミノ酸の変動が８−アミノ酸ウィンドウ（９２１６個の変異型）内に包含され、ＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成した。各セット内のすべての９２１６個のオリゴヌクレオチドの存在を、ハイスループット配列決定（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって確認した。プライマー対プライマーフォワード：５’−ＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣ−３’およびリバース：５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ−３’を使用して、ＶＨ遺伝子を増幅した。プライマー対プライマーフォワード：５’−ＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣ−３’およびリバース：５’−ＧＴＣＡＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧ−３’を使用して、ＶＬ遺伝子を増幅した。プライマー対フォワード：５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＧＴＧＡＣ−３’およびリバース：５’−ＧＧＣＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧ−３’を使用して、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤベクターから定常光（ＣＬ）およびＣＭＶプロモートをコードする「スタッファー」断片をＰＣＲ増幅した。３つの遺伝子断片を、最初に「モック」ＰＣＲで、増幅プライマーなしで組み立て、部分的なアセンブリおよびその後の増幅によってバイアスが導入されないことを確実にした。上記の３つのＰＣＲ産物を等モル比（各９０ｎＭ）で混合し、６０℃のアニーリング温度および６８℃（４５秒）の伸長温度で製造業者の指示に従ってＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ、７１８４２）を使用して、ＰＣＲ反応を行うことによって、模擬ＰＣＲを行った。プライマー対プライマーフォワード：５’−ＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣ−３’およびリバース：５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ−３’を使用して、組み立てられた産物を続いて増幅した。組み立てられた抗ＰＤ−１ ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３ライブラリを、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ標的化ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ ＳＵＰＲＥＭＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６００８１−１）の電気穿孔により、形質転換混合物の希釈液で播種された寒天プレート上で個々のカナマイシン耐性コロニーをカウントすることによって決定されるように、１．１×１０８個のライブラリサイズを創出した。トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを調製して使用し、Ｔａｌｅ ＡＡＶＳの左および右アームヌクレアーゼでＭａｘｃｙｔｅ電気穿孔によりＨＥＫ２９３懸濁細胞（１．３５×１０９個の細胞）を同時トランスフェクトして、単一コピー抗体遺伝子組入れを可能にした。トランスフェクション後の希釈プレートでブラストサイジン耐性コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントすることによって判定された場合、遺伝子標的化の効率は０．８％であり、１０．８百万の哺乳動物ディスプレイライブラリサイズを得た。ライブラリをブラストサイジン選択下で７日間増殖させ、次に抗Ｆｃ ＭＡＣＳによって選択して、ＩｇＧを発現していなかったクローンを除去した。
実施例１０に記載されるように、Ｆｃ陽性細胞の集団を、蛍光標識された抗Ｆｃ抗体の結合を使用して、発現レベルに基づいてフローサイトメトリーによって分離した（図５０ｂ）。別個の集団を数日間培養し、Ｆｃ発現について再分析した。図５０ｂは、発現の異なるモーダル値を有する個別のサブ集団が生成されていることを示す。これには、提示レベルが劣る集団、ならびに親と同等の提示レベルを有する集団が含まれる。実施例１０に記載されているように、抗体遺伝子をこれらの細胞から回収して、最適な生物物理学的特性を有するサブ集団を生成することができる。この実施例では、細胞を生物物理学的特性のみに基づいて選別したが、抗原結合に基づいて一緒に、または順番に選別を行うことも可能である。
実施例１４．哺乳動物細胞の表面での二重特異性抗体のディスプレイ
二重特異性抗体または代替形式（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ，２０１５１２９によって概説される）により、以前は単一特異性抗体またはタンパク質では不可能であった新しい治療作用機序（ＭＯＡ）が可能になった。二重特異性治療薬の使用例は、Ｔ細胞の細胞毒性活性を癌治療薬として再指向すること、血液脳関門の通過を可能にすること、２つのシグナル伝達経路を同時にブロックすること、および抗体の組織特異的送達または活性１３０を含む。二重特異性形式は、自己または交差相互作用特性のそれらの傾向に関して、従来の単一特異性抗体と同じ開発性の障害に直面し得る。各結合領域は、その自己相互作用または交差相互作用特性を補償または複合し得る異なる特性を有し得るため、二重特異性部分の最終形式をスクリーニングすることが有利である。親和力は、ヘパリン硫酸などのオフターゲット分子に対する親和性を数桁増加させることができるため、二重特異性の個々の結合「アーム」をスクリーニングする場合、これらの特性は明らかでない場合がある。自己相互作用特性は、疎水性などの全体的な表面特性が変化し得るため、その個々の結合領域と比較して二重特異性分子でも異なり得る。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）形式は、多くの異なる形態で１２９に存在することができるが、κ／λ−体１３１などのＩｇＧ様ｂｓＡｂ、共通の軽鎖、ノブイントゥホール１３２、電荷対、およびクロスマブ形式１３０；ＢｉＴＥ形式などの断片ベースのｂｓＡｂ、ＤＶＤ−ＩｇＧなどの付加されたＩｇＧ、またはＦｃａｂもしくはｍＡｂ２形式１３３などのそれらの定常ドメインに追加の結合領域を有するように操作された抗体へと広義に分類することができる。しかしながら、ＦｃａｂｓのＣＨ３ドメインの構造的フレームワークの変化は、それらの開発性１３４を増加させるために必要とされたトＦｃａｂ分子のそれらの熱安定性１３４および追加のエンジニアリングを低減することが見出された。この実施例では、ＨＥＫ２９３細胞の表面に二重特異性抗体エミシズマブを表示し、これが抗原ＦＩＸａおよびＦＸと結合することができることを示すことによって、高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを二重特異性抗体の表示に適用することができることを実証する。
エミシズマブは、血友病を治療するために開発され、かつ第ＶＩＩＩ因子模倣１３５として作用する、記載以前に記載される共通の軽鎖との重鎖「ノブイントゥホール」技術１３２を用いて生成された二重特異性抗体である。エミシズマブの１つのアームは第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）に特異的であり、第２のアームは第Ｘ因子（ＦＸ）に特異的である。エミシズマブの抗ＦＩＸａ重鎖、抗ＦＸ重鎖、および共通の軽鎖遺伝子（表２２）を誘導性標的化ベクターｐＩＮＴ１７−Ｔｅｔにクローニングすることによって、三シストロン性標的化ベクターを構築した。下流のポリアデニル化（ｐＡ）部位を含む共通の軽鎖遺伝子を、ｐＩＮＴ１７−ＴｅｔのＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位にクローニングした。ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインを含む抗ＦＩＸａ重鎖遺伝子を、ｐＩＮＴ１７−ＴｅｔのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間にクローニングした。シグナルペプチド、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、およびＳＶ４０ ｐＡを含む抗ＦＸ重鎖遺伝子を、ｐＩＮＴ１７−ＴｅｔのＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＺ１７１制限部位の間にクローニングした。最終ベクター（ｐＩＮＴ１７−Ｂｉ−ＣＭＶ−エミシズマブ）には、ＡＡＶＳ相同性アーム間にコード配列が含まれていた。図５１．エミシズマブの抗ＦＩＸａおよびＶＬ遺伝子もまた、ｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ標的化ベクターにクローニングし、単一特異性抗ＦＩＸａ ＩｇＧ抗体のディスプレイを可能にした。
二重特異性抗体エミシズマブのＨＥＫ２９３細胞表面ディスプレイを実証するために、ｐＩＮＴ１７−Ｂｉ−ＣＭＶ−エミシズマブまたはｐＩＮＴ１７−ＢＳＤ−抗ＦＩＸａを使用して、上に記載されるようにＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドの存在下でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、抗Ｆｃ−ＡＰＣで抗体ディスプレイについて細胞を分析した（図５２）。これは、ＩｇＧ形式の単一特異性抗ＦＩＸａアームまたは二重特異性抗体エミシズマブでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞が、細胞表面で検出可能な抗体発現を有したことを示した。しかしながら、「ノブインホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」重鎖を有する二重特異性エミシズマブの発現は、標準的な単一特異性抗体形式と比較して低減された。Ｆｃ変異型のライブラリを創出し、その後哺乳動物ディスプレイによる高レベル発現を選択することにより、Ｆｃ変異型を選択して、より効率的な異種重鎖対合および増加された細胞ディスプレイレベルを可能にすることができたと考えられる。この方法では、両方が二重特異性抗体を創出するための異種重鎖対合においてより効率的であるが、また自己凝集の低い傾向を含む優れた開発性特性も有する、新しい抗体ＣＨ２もしくはＣＨ３変異型またはＣＨ２およびＣＨ３変異型の組み合わせを選択することができた。Ｆｃ変異型ライブラリは、他の分子と交差相互作用する低い傾向についてもスクリーニングすることができた。
表示された二重特異性エミシズマブがその標的抗原に結合する能力も、フローサイトメトリーによって実証した。ＦＩＸａおよびＦＸ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）を、化学的にビオチン化した（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＦＩＸａおよびＦＸに対するエミシズマブの親和性は比較的低いため（マイクロモル範囲のＫＤ １３６）。１００ｎＭの抗原複合体濃度で細胞を染色する前に、結合親和力を増大させるために、抗原を四量体ストレプトアビジン−ＰＥで事前に複合体化した。二重特異性エミシズマブを表示するＨＥＫ２９３細胞は、非複合体化ストレプトアビジン−ＰＥと結合せずに、ＦＩＸａおよびＦＸの両方と結合することが示された（図５２ａ）。これは、ＨＥＫ２９３細胞の表面の二重特異性抗体の機能的ディスプレイを実証する。ＨＥＫ２９３細胞の表面でのＩｇＧ形式の単一特異性抗ＦＩＸａアームのディスプレイはまた、ＦＩＸａと結合した（図５２ｂ）。抗ＦＩＸａ抗体もまた、ＦＸとの一部の結合を示したが、エミシズマブよりも低いレベルであったが、これは共通の軽鎖またはＦＸと交差反応する抗ＦＩＸａ重鎖のいずれかが原因であり得る。
実施例６ｂは、ＨＥＫ２９３細胞の表面に提示された抗ＩＬ１２抗体であるブリアキヌマブおよびウステキヌマブへの硫酸ヘパリンの示差的結合を説明した。ブリアキヌマブは、その可変ドメイン内に正電荷パッチを有し、これは、ＦｃＲｎ２２上の負電荷パッチのその結合に寄与する可能性が高い。ブリアキヌマブの正電荷パッチもまた、負電荷の硫酸ヘパリンとのその交差相互作用の原因である可能性が高い。ヘパリン硫酸への抗体の結合は、インビボでの増加された非特異的クリアランスをもたらし、減少された半減期をもたらし得る１３７、１３８。したがって、二重特異性分子を含む、抗体または治療用タンパク質のヘパリンへの結合は、所望でない特性である。実施例６ｂは、ヘパリン硫酸と結合する抗体を区別することが可能であるため、高次真核哺乳動物ディスプレイ選択によってヘパリン硫酸結合タンパク質を分離および排除することが可能であることを実証した。この実施例で提示されたデータから、ヘパリン硫酸と結合するそれらの能力に基づく一連の抗ＦＩＸａ／抗ＦＸ二重特異性抗体の区別の実証を想定することが可能である。
エミシズマブの開発の過程の間、ｈＢＳ１０６１３６という名前の前駆体ヒト化抗体を発見した。この分子は、ヒトＩｇＧ４と比較して、急速なクリアランスおよび短いインビボ半減期を有するマウスでは、不十分な薬物動態を有することが見出された。このインビボでの急速なクリアランスは、ＶＨおよびＶＬ抗ＦＩＸａアームの正電荷パッチに起因した。正電荷パッチに寄与する共通の軽鎖上のアミノ酸には、ＶＬ ＣＤＲ１内のＫ２４、Ｒ２７、およびＲ３１、ＶＬ ＣＤＲ２内のＲ５３およびＲ５４、ならびにＦＷ３内のＲ６１が含まれていた（図５３）。正電荷パッチに寄与するＶＨアミノ酸には、Ｒ６０およびＲ９５が含まれていた。正電荷パッチに寄与するリジンおよびアルギニン残基は、ＦＩＸａ結合に不可欠なパラトピック残基であった。したがって、負に荷電されたアミノ酸残基（グルタミン酸またはアスパラギン酸）を導入して、正電荷パッチを破壊し、また抗体の等電点（ｐＩ）も低下させた。共通の軽鎖への負に荷電されたアミノ酸変化の導入は、マウスのクリアランス率の８倍の低減、および最大インビボ血漿中濃度（Ｃｍａｘ）のほぼ６倍の増加をもたらした。図５３は、最終的なエミシズマブＶＬと比較して３〜１個少ない負電荷アミノ酸を有する一連の前駆体ＶＬ（ＵＳ２０１６／０２２２１２９）とのエミシズマブの共通のＶＬ鎖のアラインメントを示す。エミシズマブの親抗体の命名は、エミシズマブに関連している。例えば、クローン：Ｅ３０Ｙ＿Ｅ５５Ｙ＿Ｄ９３Ｓは、エミシズマブと比較して、それぞれグルタミン酸、グルタミン酸、およびアスパラギン酸の代わりに３０、５５、および９３位にチロシン、チロシン、およびセリン残基を有する。
エミシズマブ前駆体ＶＬ抗ＦＩＸａ遺伝子（表２３）を、ｐＩＮＴ１７−Ｂｉ−ＣＭＶ−エミシズマブ標的化ベクターにクローニングし、これを使用して上に記載されるようなヒトＡＡＶＳ ＴＡＬＥＮ対でＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトし、ヌクレアーゼ媒介抗体遺伝子組入れを可能にした。１４ｄｐｔ後、ＨＥＫ２９３細胞を、実施例Ｂに記載されるように、ヘパリン硫酸（ＦＩＴＣ標識）および抗Ｆｃ−ＰＥで染色することができた。フローサイトメトリー分析は、哺乳動物細胞が、抗ＦＩＸａエミシズマブクローンＥ３０Ｙ＿Ｋ５４Ｒ＿Ｅ５５Ｙ＿Ｄ９３ＳおよびＥ３０Ｙ＿Ｅ５５Ｙ＿Ｄ９３Ｓが抗ＦＩＸａエミシズマブおよびＥ３０Ｙ ＶＬクローンと比較してヘパリン硫酸への増強された結合を表示すると表示したことを示す。Ｅ３０Ｙ＿Ｋ５４Ｒ＿Ｅ５５Ｙ＿Ｄ９３ＳおよびＥ３０Ｙ＿Ｅ５５Ｙ＿Ｄ９３Ｓクローンは、最も完全な正電荷パッチを有し、これらのクローンは、これらの抗体を表示する細胞への検出可能なヘパリン硫酸結合をもたらす。この実施例は、高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを使用して、ヘパリン硫酸と結合するそれらの能力に点変異の違いがあるクローンを区別することが可能な方法を示した。これにより、ヘパリン硫酸と結合する錯体ライブラリ内の二重特異性クローンの排除が可能になり、したがって、インビボでの不十分な薬物動態に寄与し得るそれらの可変ドメイン内に正電荷パッチを有するクローンを除去することができるであろう。
この実施例は、哺乳動物ディスプレイによる二重特異性抗体または代替二重特異性形式のスクリーニングの可能性を例示した。二重特異性発見キャンペーンでスクリーニングする必要のある変異型の数は、単一の標的抗体発見プロジェクトと比較して数桁乗じられる。例えば、エミシズマブの発見キャンペーンでリード開始分子を特定するために、２００個の抗ＦＩＸａ抗体を、２００個の抗ＦＸ抗体を交差させて、４０，０００個の二重特異性分子を創出し、次いで困難なプレートベースのスクリーニングによりスクリーニングした。次いで、リード二重特異性分子は、可変ドメインの正電荷パッチ１３６の破壊による硫酸ヘパリンとの交差相互作用の低減に関して、ヒト化、親和性および特異性の最適化、および開発性の向上を含むいくつかの反復を行わなければならなかった。標的（複数可）に対する親和性、特異性、ディスプレイレベル（自己凝集する低い傾向をスクリーニングする）、および交差相互作用を含む哺乳動物ディスプレイにより、数百万の二重特異性抗体クローンに対して多次元ＦＡＣＳを行う能力は、より大きなスクリーニング深度で、より多くのクローンに対するより速く、より効率的な二重特異性抗体スクリーニングプロセスを可能にする。
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実施例１５．表面掲示レベルに基づくノットボディの開発性の選択
実施例１４は、「ノブインホール」二重特異性抗体エミシズマブをＨＥＫ２９３細胞の表面に表示することが可能であることを実証した。二重特異性分子はまた、抗体の重鎖または軽鎖へのポリペプチドの融合、または重鎖もしくは軽鎖のエンジニアリングによって創出され、新規の結合特異性を付与することができる１３３。哺乳動物細胞の表面に二重特異性分子を表示する能力は、上に記載されるように良好に動作する生物物理学的特性を有する二重特異性分子の選択と組み合わせて、両方の標的への結合のスクリーニングを可能にする。ノットボディは、システインリッチペプチド（ノッチン）が抗体ドメイン（ＷＯ２０１７／１１８７６１）の末梢ＣＤＲループに組み込まれ、ＶＨまたはＶＬドメインが同じ抗原または異なる抗原の２番目のエピトープと結合するために利用可能である新規の抗体融合形式である。この実施例の目的は、哺乳動物ディスプレイ技術が、それらの自己相互作用および多反応性特性に関して異なる特性を有するノットボディを区別および分離する能力を実証することであった。
ノットボディの特許ＷＯ２０１７／１１８７６１は、トリプシン結合ノッチンＥＥＴＩ−ＩＩを抗体のＶＬ ＣＤＲ２位置に挿入することによる２つのトリプシン結合ノットボディ（ＫＢ＿Ａ０７およびＫＢ＿Ａ１２）の生成について説明する。この実施例で試験されたノットボディは、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩ ２Ｍ（以後、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩと称される）およびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１であった。これらのノットボディを、ＫＢ＿Ａ１２ノットボディのＶＬ ＣＤＲ２位置にあるＥＥＴＩ−ＩＩノッチンを、イオンチャネルブロッキングノッチンまたは毒素ペプチドＰｒｏＴｘ−ＩＩＩ ２Ｍ（２０１８年７月１１日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６８８５５）およびＨｓＴｘＩ（２０１８年７月１１日出願のＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６８８５６）で置き換えることによって創出した。ＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩ、およびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１のＶＬ配列を表２４に示す。
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ノットボディＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩ、およびＨｓＴｘＩをコードする遺伝子を、標的化ベクターｐＩＮＴ１７−ＢＳＤにクローニングし、これを使用して、上に記載されるようにＨＥＫ２９３細胞へのヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって安定した細胞株を創出した。図５４ａは、ＨＥＫ２９３細胞の表面のＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩのディスプレイレベルが、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩまたはＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩよりも高かったことを示す。ＨＥＫ２９３細胞の表面に比較的低レベルで表示されたＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩまたはＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩと、Ｆｃ発現に対する細胞カウントのフローサイトメトリーヒストグラムプロット（図５４ａ）は同等である。ノットボディを、Ｅｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって分析した。図５４ｂは、ＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩが、良好に動作する抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブと同等の保持時間および体積を有する単量体ピークを表示したことを示す（図５４ｃ）。対照的に、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩは、より早い保持時間によって示されるように二量体および多量体の形成の証拠を例示した（図５４ｄ）。トラスツズマブおよびＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩと比較してＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩのより大きな溶出量は、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩ異種多量体および凝集体形成の証拠である。ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩおよびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩは、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩおよびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩがＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩと比較してより長いＡＣ−ＳＩＮＳ波長シフトを表示したＡＣ−ＳＩＮＳアッセイでのＫＢ＿Ａ１２ ＥＥＴＩ−ＩＩと比較して自己相互作用する増加された傾向も表示した（表２５）３９。したがって、以前にＩｇＧディスプレイで見られたように、ノットボディの高次真核細胞ディスプレイレベルと、自己相互作用および凝集する傾向のそれらの生物物理学的特性との間には関係がある。ノットボディは二重特異性抗体の例であり、したがって、高次真核生物細胞ディスプレイレベルと、表示された分子の生物物理学的特性との間のこの関係は、代替的な二重特異性モダリティに移行する可能性が高い１２９。
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これらのノットボディの生物物理学的特性を改善するために、３つのノットボディ哺乳動物ライブラリを、ノッチン配列の疎水性残基または正に荷電された残基の標的化された変異誘発によって創出した。各ノッチンの標的化された変異誘発のための疎水性残基または正に荷電された残基は、太字および下線で強調されている（以下を参照されたい）。これらの残基を、ＶＮＳコドン（アミノ酸配列ではＸとして表される）またはＮＳＧコドン（アミノ酸配列ではＺとして表される）をコードするプライマーを使用して変異させた。ＶＮＳコドン（Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、およびＳ＝Ｇ／Ｃ）は、２３個のコドンの組み合わせから１６個のアミノ酸（システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、および停止コドンを除く）をコードするが、一方でＮＳＧコドン（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／ＴおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）は、８個のコドンの組み合わせから７個のアミノ酸（アルギニン、トリプトファン、グリシン、スレオニン、セリン、アラニン、およびプロリン）をコードする。ＮＳＧコドンを、野生型トリプトファン残基がイオンチャネルへの結合接触に関与し得る位置で使用する。
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ライブラリを、ノットボディＶＬ遺伝子の２断片アセンブリＰＣＲによって生成した。各ライブラリの個々の断片を、表２６に記載されているプライマーおよびテンプレートを使用して増幅した。各ライブラリに対応する増幅された断片を、プライマーｐＩＮＴ ＢＭ４０リードフォワードおよびｐＩＮＴ ＣＬａｍｂｄａ非リバースを使用して組み立てた。すべてのプライマー配列が表２７に示される。組み立てられたＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を使用して消化し、Ｄ１Ａ１２またはＤ１２ ＶＨ（ＷＯ２０１７／１１８７６１に記載されている、ノットボディ構築物に使用される重鎖）をコードするｐＩＮＴ１７−ブラストサイジンベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使用して精製した。３ｘ２．５μｌの精製されたライゲーション混合を、３ｘ５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ Ｓｕｐｒｅｍｅ、Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６００８０−２）に電気穿孔した。簡潔には、５０μｌの細胞を、０．１ｃｍのキュベットを使用してパルスし、２ｍｌの回収培地で回収し、３７℃、２５０ｒｐｍで１時間増殖させ、希釈播種によってライブラリサイズを推定した。ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩセットＡ、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩセットＢ、およびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１ライブラリについて得られたライブラリサイズは、それぞれ９×１０７、７×１０７、および２×１０７であった。哺乳動物ディスプレイライブラリを創出するために、製造業者の指示に従ってＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ Ｍｉｄｉプレップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０４１０．１０）を使用して、これらのライブラリストックからトランスフェクション品質のＤＮＡを調製した。
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各ライブラリのＤＮＡを、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸＧ２を使用して、懸濁液適合ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に電気穿孔した（実施例５を参照されたい）。同様に、野生型ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩおよびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１構築物をクローニングし、対照としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞に電気穿孔した。各ライブラリには１００百万個の細胞を使用し、各対照構築物には１０百万個の細胞を使用した。トランスフェクションの２日後、抗生物質のブラストサイジンＳ ＨＣｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ｒ２１００１）を７．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。細胞を三角フラスコに１ｍｌあたり０．２５×１０６個の細胞で播種した。遺伝子組入れ効率を計算するために、実施例５に記載されるように、細胞を１０ｃｍディッシュに播種した。組入れ効率は、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩライブラリセットＡ、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘ−ＩＩＩライブラリセットＢ、およびＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘ１ライブラリで、それぞれ３％、２．５％、および２％であると計算した。したがって、１億回の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは、それぞれ、３×１０６、２．５×１０６、および２×１０６であった。ブラストサイジンＳ ＨＣｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号Ｒ２１００１）選択の５日後、実施例５に記載されるように、抗Ｆｃ ＭＡＣＳビーズを使用して細胞を富化した。選択の１４日後、ノットボディの発現レベルについてフローサイトメトリーによってライブラリを分析した。図５５に示されるように、３つすべてのノットボディライブラリは、ＨＥＫ２９３細胞に表示された親ノットボディと比較して、改善された平均発現レベルを表示した。これは、親ノットボディ分子と比較して改善された生物物理学的特性を有するノットボディ変形型が生成されている証拠を提供する。
次いで、ＢｉｏＲａｄ Ｓ３ｅ細胞選別機を使用してノットボディライブラリでＦＡＣＳを実施した。ＭＡＣＳにより選別された集団の３０×１０６個の細胞を（以前のように）抗ヒトＦｃ ＰＥ（１×１０６個の細胞あたり１μｌ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４０９３０４）とともにインキュベートした。ゲートを、３つのライブラリの高いＦｃ発現のヒストグラムプロットに描画した。これには、ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩセットＡライブラリのゲーティングされたセ細胞８．１６％が必要であったが、対照ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩの０．１５％がこの領域で見出された。ＫＢ＿Ａ１２ ＰｒｏＴｘＩＩＩセットＢライブラリのゲーティングされた細胞の７．２５％を採取したが、対照の０．１０％がこの領域で見出された。ＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩライブラリの１２．６％を採取したが、ＫＢ＿Ａ１２ ＨｓＴｘＩ対照の０．０３％がこの領域で見出された。各集団の０．５×１０６個の細胞をゲノムＤＮＡ抽出のために採取した。ＩｇＧをコードするＤＮＡを、実施例４に記載されるように、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するネステッドＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＩＮＴ３哺乳動物発現ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用した。
哺乳動物細胞ディスプレイ変異体ライブラリが創出され、次いでそれを表面ディスプレイレベルに基づいて選択した実施例４および５に記載されるものと同じ方法に従うことにより、個々のノットボディクローンを、それらの親分子と比較して改善された生物物理学的特性により特定する。したがって、この実施例は、ノットボディまたは任意の代替的な二重特異性形式の生物物理学的特性を改善するための高次真核生物の哺乳動物ディスプレイの有用性について説明した。ここで説明される方法は、多重パラメータＦＡＣＳを使用して、高ディスプレイレベルおよび標的分子への特異的結合の両方を選択することができるノットボディまたは二重特異性発見プロジェクト中にも行うことができた。
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Claims (90)

  1. インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤の表面提示レベルの、溶液中の前記結合剤の溶解度および／またはそれらの自己会合に対する耐性の予測指標としての使用。
  2. 前記培養細胞が、結合剤の多様なレパートリーを発現するディスプレイライブラリのクローンである、請求項１に記載の使用。
  3. 溶液中のより高い溶解度および／または自己会合のより低い傾向について結合剤をインビトロで選択するための高等真核細胞の培養ライブラリの使用であって、
    前記ライブラリが、各々結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリであり、前記コードされた結合剤が、前記細胞表面に提示される、使用。
  4. ディスプレイライブラリの培養高等真核細胞クローンの表面における前記結合剤の表面提示レベルが、溶液中の前記結合剤の溶解度および／または自己会合に対するそれらの耐性の予測指標として使用される、結合剤発見方法。
  5. 結合剤を、それらの溶液中の溶解度および／または自己会合に対する耐性に従って区別およびランク付けし、溶液中でより高い溶解度および／または自己会合に対するより高い耐性を呈する結合剤を富化する方法であって、
    （ｉ）各々が結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
    （ｉｉ）前記結合剤が前記細胞表面に提示される、前記結合剤の発現のための条件下で、前記クローンをインビトロで培養することと、
    （ｉｉｉ）前記クローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
    （ｉｖ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、
    （ｖ）前記１つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および／または自己会合に対する耐性が良好であるものとして特定することと、任意選択で、前記選択されたクローンを、１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するために提供することと、を含む、方法。
  6. 前記結合剤が膜貫通ドメイン含有ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用または請求項４もしくは請求項５に記載の方法。
  7. 前記クローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することを含み、前記薬剤が前記結合剤の定常領域に結合し、任意選択で、前記結合剤がＦｃ領域を含み、前記薬剤が前記Ｆｃ領域に結合する、請求項４または請求項５に記載の方法。
  8. 細胞を、前記細胞上の結合剤の前記表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し、それにより、所定の閾値を上回る表面提示を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る表面提示を示す細胞が廃棄画分に選別される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 廃棄画分が、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの臨界濃度を有する比較ポリペプチドを発現する細胞を含み、前記収集画分が、前記廃棄画分中の前記比較ポリペプチドよりも少なくとも１．５倍高い臨界濃度を有する結合剤を発現する細胞を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 選別が蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる、請求項８または請求項９に記載の方法。
  11. ステップ（ｉｉ）が、前記ライブラリの前記クローンを１つの容器内で混合物として培養することを含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ステップ（ｉｉ）が、前記ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記結合剤が親結合剤の配列変異型である、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記親結合剤が、溶液中の溶解度または自己会合に対する耐性の改善が必要であると特定されている、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記方法が、前記親結合剤の配列変異型を生成することと、前記配列変異型をコードするＤＮＡを高等真核細胞の細胞ＤＮＡに組み入れて、前記結合剤をコードするＤＮＡを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
    任意選択で、前記方法が、前記親の前記ポリペプチド配列を分析することと、自己会合を促進し、かつ／または溶解度を低下させることが予測される１つ以上のアミノ酸残基を特定することと、前記１つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
  16. 前記親結合剤が、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）中５０ｍｇ／ｍｌ未満の臨界濃度を有し、かつ／またはリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）中５０ｍｇ／ｍｌ未満の溶解限度を有し、
    かつ／または前記方法が、前記１つ以上の選択されたクローンによりコードされた結合剤を、前記親結合剤のものよりも少なくとも１．５倍高い臨界濃度および／もしくは溶解限度を有すると特定することを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 結合剤の親水性を、前記細胞クローン上のそれらの表面提示レベルに基づいて予測すること、および／または１つ以上の選択されたクローンの結合剤を、より親水性であると特定することを含む、請求項４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 結合剤を示す高等真核細胞のライブラリをスクリーニングして、インビボで哺乳動物において１つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化するインビトロの方法であって、
    （ｉ）各々が結合剤をコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
    （ｉｉ）前記結合剤が前記細胞表面に提示される、前記結合剤の発現のための条件下で、前記クローンをインビトロで培養することと、
    （ｉｉｉ）前記結合剤を前記１つ以上の非標的分子に露出させて、前記結合剤と１つ以上の非標的分子との結合を可能にすることと、
    （ｉｖ）前記１つ以上の非標的分子への結合がより大きい細胞を廃棄することと、
    （ｖ）前記１つ以上の非標的分子への結合が小さい細胞を選択し、前記非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
    １つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択された集団を提供することと、を含む、方法。
  19. （ｉｉｉ）前記結合剤を、前記１つ以上の非標的分子を含むマトリックスに露出させて、前記マトリックスへの結合を可能にすることと、
    （ｉｖ）前記マトリックスへの結合がより大きい細胞を廃棄することと、
    （ｖ）前記マトリックスへの結合が小さい細胞を選択し、前記非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
    １つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択された集団を提供することと、を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記非標的分子が、ＤＮＡ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シャンペロンタンパク質、ヒアルロン酸、またはグリコカリックスの１つ以上の構成要素を含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
  21. 前記非標的分子への結合が、低親和性非特異的結合である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ライブラリの前記クローンを１つの容器内の混合物として培養し、前記混合物を前記マトリックスに露出させることを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記結合剤が親結合剤の配列変異型である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記親結合剤が、１つ以上の非標的分子への結合の減少を必要とすると特定されている、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法が、前記親結合剤の配列変異型を生成することと、前記配列変異型をコードするＤＮＡを高等真核細胞の細胞ＤＮＡに組み入れて、前記結合剤をコードするＤＮＡを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
    任意選択で、前記方法が、前記親の前記ポリペプチド配列を分析することと、非特異的結合を促進することが予測される１つ以上のアミノ酸残基を特定することと、前記１つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
  27. 前記親結合剤が、１つ以上の非標的分子への顕著な結合を呈する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. （ｉｉｉ）前記結合剤を、前記１つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズに露出させることを含む、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 結合剤発現細胞と前記１つ以上の非標的分子を提示する前記細胞またはビーズとの相互作用を検出することを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. ＡＣ−ＳＩＮＳを使用して粒子間距離を検出し、より大きい粒子間距離を呈する細胞により提示される結合剤を選択することを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記１つ以上の非標的分子が検出可能に標識される、請求項１８に記載の方法。
  32. 前記１つ以上の非標的分子が蛍光標識される、請求項３１に記載の方法。
  33. 細胞を、前記１つ以上の非標的分子への結合レベルに従って、ＦＡＣＳにより収集画分と廃棄とに流動選別し、それにより、前記所定の閾値を上回る前記標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る前記標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が前記廃棄画分に選別される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記結合剤をコードする前記ＤＮＡの発現が、強力なプロモーターの制御下にある、請求項４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記プロモーターが、発現が最大限に誘導された誘導性プロモーターである、請求項３４に記載の方法。
  38. 請求項５〜１７のいずれかに記載の方法を後に行うことをさらに含む、請求項１８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 請求項５〜１７のいずれかに記載の方法を最初に行うことをさらに含む、請求項１８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 標的に１つ以上の結合剤を選択する方法であって、
    請求項５〜３９のいずれか一項に定義の方法を行うことを含み、
    同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞が前記標的に結合した状態にするために、前記結合剤を前記標的に露出させることと、
    同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
  41. （ｉ）前記結合剤の表面提示レベルと前記結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して表面提示がより高い同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
    （ｉｉ）前記結合剤の表面提示レベルと非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して、表面提示がより高く、非特異的結合がより小さい結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
    （ｉｉｉ）標的結合のレベルと前記結合剤による非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して非特異的結合がより小さい同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 所望の親和性を有する標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
    （ａ）結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、前記結合剤が前記細胞表面に提示され、前記コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ／または細胞あたり１００〜６０，０００個の範囲のコピー数で前記細胞表面に発現される、提供することと、
    （ｂ）同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にするために、前記ライブラリを前記標的に露出させることと、
    （ｃ）前記標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を示す細胞が富化された、選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
    （ｄ）前記選択された細胞の集団を前記標的における１回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、前記標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させることと、任意選択で
    （ｅ）前記標的に対する前記所望の親和性を有する同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
  43. 同種結合剤を示す細胞が富化された前記選択された細胞の集団を提供することと、その後、
    高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ内の活性の強いプロモーターの制御下にある前記選択された細胞の集団からの結合剤コードＤＮＡを提供することと、
    請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法を行うことと、を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項５〜１７のいずれか一項に定義の方法を行って、結合剤の表面提示がより高い選択されたクローンを提供することと、その後、
    結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ中の活性の弱いプロモーターから前記結合剤を発現させることと、その後、
    請求項４２に記載の方法を行うことと、を含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
    （ｉ）結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
    （ｉｉ）前記ライブラリの細胞を、前記誘導性プロモーターの活性が弱い条件下で培養することと、
    （ｉｉｉ）前記ライブラリを前記標的に露出させ、同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にすることと、
    （ｉｖ）同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
    （ｖ）前記選択された細胞の集団を、前記誘導性プロモーターからの結合剤の増加した発現のための条件下で培養することと、
    （ｖｉ）前記複数のクローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
    （ｖｉｉ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
  46. 標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
    （ｉ）結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
    （ｉｉ）前記ライブラリを、前記誘導性プロモーターからの結合剤の強力な発現のための条件下で培養することと、
    （ｉｉｉ）前記複数のクローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な（例えば、蛍光）標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
    （ｉｖ）他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈するクローンの集団を選択することと、
    （ｖ）前記選択された集団を、前記誘導性プロモーターからの結合剤の弱い発現のための条件下で培養することと、
    （ｖｉｉ）前記ライブラリを前記標的に露出させ、同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にすることと、
    （ｉｖ）同種結合剤を示す１つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
  47. 前記プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記標的が、蛍光標識などの検出可能な薬剤で標識される、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記方法が、細胞を、前記細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することを含み、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る結合した標的を示す細胞が廃棄画分に選別される、請求項４８に記載の方法。
  50. 選別が蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記１つ以上の選択されたクローンから、前記結合剤をコードする前記ＤＮＡの配列を決定することと、
    前記結合剤をコードする単離された核酸を提供することと、を含む、請求項５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記１つ以上の選択されたクローンから、前記結合剤をコードする前記ＤＮＡの配列を決定することと、
    前記結合剤の可溶形態における分泌のための条件下、インビトロで、宿主細胞において、前記結合剤をコードするＤＮＡを発現させることと、をさらに含む、請求項５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記分泌された結合剤が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの収量で得られる、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記結合剤を精製および／または濃縮して、前記結合剤の水溶液を少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度で得ることをさらに含む、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
  55. 前記濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍｌである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである、請求項５５に記載の方法。
  57. 薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に前記結合剤を製剤化することを含む、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 任意選択で針および／または注射による前記組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書などの１つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、前記組成物を注射用の充填済みシリンジ中で提供することを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. ＦｃＲｎと相互作用する結合剤を特定する方法であって、
    Ｆｃドメインを有する異なる結合剤をコードするＤＮＡを各々含む複数の高等真核細胞クローンを提供することと、
    細胞表面上に前記結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
    前記クローンを約ｐＨ６．０および約ｐＨ７．４でＦｃＲｎ受容体に露出させて、前記ＦｃドメインによるＦｃＲｎの認識を可能にすることと、
    約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより高い親和性結合を呈する結合剤、約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより低い親和性結合を呈する結合剤、または約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でほぼ同じ親和性結合を呈する結合剤、を発現する１つ以上のクローンを選択することと、
    任意選択で、１つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択されたクローンを提供することと、を含む、方法。
  60. 約ｐＨ７．４の場合と比較して約ｐＨ６．０でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する１つ以上のクローンを選択することと、前記１つ以上の選択されたクローンによりコードされる前記結合剤を、インビボでの半減期が延長したものと特定することと、を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記結合剤が、配列多様性を呈する可変ドメインを、任意選択で１つ以上の相補性決定領域に含む、請求項５９または請求項６０に記載の方法。
  62. 前記結合剤が、配列多様性を呈するＦｃ領域を、任意選択でそれらのＣＨ３ドメインに含む、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記結合剤の前記Ｆｃ領域が、配列多様性を呈しない、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 実質的に本明細書に記載され、かつ／あるいは請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法により特定または選択される、クローン、クローンによる発現される結合剤、または前記結合剤をコードする核酸。
  65. 結合剤をコードするＤＮＡを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリであって、前記コードＤＮＡが、任意選択で、前記細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座にあり、前記コードされた結合剤が、細胞あたり１００〜１０００個の範囲のコピー数で前記細胞表面に発現される、ライブラリ。
  66. 標的に対する結合剤の親和性に基づく選択のための請求項６５に定義のライブラリの使用。
  67. 結合剤のレパートリーをコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであって、結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、ディスプレイライブラリ。
  68. 結合剤のレパートリーをコードするＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを作製する方法であって、
    前記結合剤をコードするドナーＤＮＡ分子、および高等真核細胞を提供することと、
    前記ドナーＤＮＡを前記細胞に導入することにより、ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
    前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
    前記組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
    それにより、前記結合剤のレパートリーをコードするドナーＤＮＡを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む、方法。
  69. 前記組換え細胞が、前記ドナーＤＮＡを前記細胞に導入すること、および前記細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することにより創出され、前記ヌクレアーゼが、細胞ＤＮＡ中の認識配列を切断し、前記ドナーＤＮＡが前記細胞ＤＮＡに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れが前記細胞の内部のＤＮＡ修復機序を通して生じる、請求項６８に記載の方法。
  70. テトラサイクリン誘導性プロモーターからのドナーＤＮＡの発現を誘導することと、前記細胞を、前記結合剤の発現のための条件下で培養し、前記細胞表面における結合剤の提示を得ることと、をさらに含む、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ライブラリを、請求項１〜７０のいずれか一項に定義の方法または使用において使用することをさらに含む、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
  72. 前記高等真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  73. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞株またはＣＨＯ細胞株である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  74. 前記高等真核細胞が懸濁培養中にある、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  75. 前記結合剤をコードするＤＮＡが、前記細胞ＤＮＡ中の決まった遺伝子座で組み入れられる、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  76. 前記結合剤が抗体である、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  77. 前記抗体が全長免疫グロブリンである、請求項７６に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  78. 前記抗体がＩｇＧである、請求項７７に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  79. 前記抗体が、膜貫通ドメインに融合した重鎖と軽鎖とを含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  80. 前記結合剤が、融合タンパク質であって、レシピエント多様性骨格ドメインに挿入されたドナー多様性骨格ドメインを含み、任意選択で、前記融合タンパク質と関連するパートナードメインを含む、融合タンパク質であり、
    前記ドナー多様性骨格ドメインが、ドナー骨格とドナー相互作用配列とを含み、前記レシピエント多様性骨格ドメインが、レシピエント骨格とレシピエント相互作用配列とを含む、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  81. 前記融合タンパク質が、抗体可変ドメインに挿入されたシステインリッチペプチドを含むノットボディである、請求項８０に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  82. 前記ノットボディが、膜貫通ドメインに融合した抗体重鎖と抗体軽鎖とを含む、請求項８１に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  83. 前記結合剤が、配列多様性を呈する抗体可変ドメインを、任意選択で１つ以上の相補性決定領域に含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  84. 前記結合剤が、配列多様性を呈するＦｃ領域を、任意選択でそれらのＣＨ３ドメインに含む、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  85. 前記結合剤が、第１の標的のための第１の結合部位と、第２の標的のための第２の結合部位とを含む、多重特異性である、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  86. 前記ライブラリが、少なくとも１０３個のクローンを含む、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  87. 前記ライブラリがナイーブライブラリである、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  88. 前記ライブラリの前記クローンが、選択された標的への結合について事前選択されている、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  89. 前記標的がヒトポリペプチドである、請求項８８に記載の使用、方法、またはライブラリ。
  90. 前記ライブラリの前記クローンが、２つの異なる標的への二重特異性結合について事前選択されている、請求項８８または請求項８９に記載の使用、方法、またはライブラリ。
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