JP2021187761A

JP2021187761A - 抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬

Info

Publication number: JP2021187761A
Application number: JP2020092322A
Authority: JP
Inventors: 昌範馬場; Masanori Baba; 実佳岡本; Mika Okamoto; 政明外山; Masaaki Toyama
Original assignee: Kagoshima University NUC
Current assignee: Kagoshima University NUC
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2021-12-13

Abstract

【課題】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に有効な抗ウイルス薬を提供する。【解決手段】セニクリビロクもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。【選択図】なし

Description

本発明は、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬に関する。

コロナウイルスは、本来、ヒトには風邪の症状を引き起こすウイルスであり、４種類のコロナウイルスが知られており、風邪の１０〜１５％がこれらのウイルスによって起こる。加えて、致死率の高い重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすコロナウイルスがこれまでに知られている。ＳＡＲＳ患者は約８，０００人、致死率は約１０％、ＭＡＲＳ患者は約２，５００人、致死率は約３５％である。
コロナウイルスは、直径約１００ｎｍのエンベロープを有する＋鎖ＲＮＡウイルスであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶは第二種病原体、ＭＥＲＳ−ＣｏＶは第三種病原体に分類されている。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、現在、新型コロナウイルスとも呼ばれており、当該ウイルスによる感染症は、ＷＨＯによりＣＯＶＩＤ−１９と命名されている。ＣＯＶＩＤ−１９に対するワクチンや治療薬の開発が急務であるが、それには時間がかかる。そこで、別の目的で開発された既存の薬剤の中から、ＣＯＶＩＤ−１９の治療に転用しようとする試みがなされている。これまでに、抗エボラ薬として臨床試験が行われたレムデシビルが２０２０年５月７日に特例承認され、抗インフルエンザ薬のファビピラビルなどについて、ＣＯＶＩＤ−１９に対する臨床試験が行われている。

一方、セニクリビロク(cenicriviroc)は、ＴＡＫ−６５２とも呼ばれ、次式：

で示されるケモカインレセプター（ＣＣＲ５／ＣＣＲ２ｂ）阻害薬であり、抗ＨＩＶ−１薬として開発が行われている（非特許文献１及び２）。
しかしながら、セニクリビロクと抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２活性との関係についてはこれまで報告されたことはない。

Baba M, et al. TAK-652 inhibits CCR5-mediated HIV-1 infection in vitro and has favorable pharmacokinetics in human. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4584-4591 (2005). 馬場昌範、新規抗HIV-1薬開発とその増殖抑制機序の解明、日本エイズ学会誌 17: 87-89 (2015).

本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に有効な抗ウイルス薬を提供することを課題とする。

本発明者らは、前記の課題を解決すべく、薬剤の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２アッセイ系を確立し、種々の薬剤についてスクリーニングを進めた結果、セニクリビロクに選択的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を認め、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）セニクリビロクもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。
（２）ＣＯＶＩＤ−１９の予防又は治療に用いられる前記（１）に記載の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。

本発明によれば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に有効な抗ウイルス薬を提供することができる。

図１は実施例で行った抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２アッセイの概略を示す。図２はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染により誘導された細胞の変化（細胞死）と、それに対するセニクリビロク(cenicriviroc)及びケモカインレセプター（ＣＣＲ５）阻害薬のマラビロク(maraviroc)の効果を示す。図３はセニクリビロク(cenicriviroc)及びケモカインレセプター（ＣＣＲ５）阻害薬のマラビロク(maraviroc)の濃度と、ウイルス非感染細胞及び感染細胞の培養３日後の生細胞数との関係を示す。図４はセニクリビロク(cenicriviroc)及びケモカインレセプター（ＣＣＲ５）阻害薬のマラビロク(maraviroc)のＥＣ_５０を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に用いるセニクリビロク及びその塩は市販されており、これらの市販品をそのまま、又は必要に応じて精製して本発明の有効成分として用いることができる。

セニクリビロクの塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸（メシル酸）、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。

セニクリビロク又はその塩の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。

セニクリビロク又はその塩は、公知の方法、例えば、特表２０１８−５０５１４８号公報に記載の方法に従って、以下に示すようにして製造することができる。
ａ）化合物（II）と４−（（（１−プロピル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）スルフィニル）アニリン（化合物（III））とを塩基存在下で反応させてセニクリビロク（化合物（Ｉ））を生成させ（ここで、Ｒ_１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ_２、ＯＣＯＲ_２及びＮＨＲ_２からなる群から選択され、Ｒ_２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される。）、
ｂ）ステップａ）を水溶液で反応停止させ、
ｃ）メタンスルホン酸（メシル酸）を加え、
ｄ）化合物（Ｉ−ＭｓＯＨ）（セニクリビロクメシル酸塩）を結晶化させる。

前記のメタンスルホン酸（メシル酸）の代わりにその他の酸を用いれば、セニクリビロクメシル酸塩以外のセニクリビロクの酸付加塩を得ることができる。

前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。

前記の化合物は、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。

結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。セニクリビロクの注射剤中における割合は、５〜５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。

その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。

製剤化した抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。

経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、セニクリビロクの重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。

非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、セニクリビロクの重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。

また、セニクリビロクは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、セニクリビロクと組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えば、レムデシビル、ファビピラビル等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例においては、セニクリビロクとしては遊離塩基体（市販品；MedChemExpress社より購入）を用いた。

［実施例１］ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染による細胞死に対するセニクリビロクの抑制効果
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２アッセイの概略を図１に示す。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に高い感受性を有するＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をマイクロプレートに播種した（２×１０^４細胞／ウェル）。２４時間培養後、種々の濃度の薬剤とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＷＫ−５２１）（国立感染症研究所より入手）をmultiplicity of infection（ＭＯＩ）＝０．０１にて添加後、３７℃で３日間培養した。培養後、１１０μＬの培養上清を捨て、１０μＬのCell Counting Kit-8（（株）同仁化学研究所）（水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt）を発色試薬として用いた生細胞数測定キット）を添加した。２時間培養後、１００μＬの塩酸２−プロパノールを添加し、十分に混合した後、各ウェルの吸光度を４５０／６２０ｎｍにて測定した。薬剤の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果と細胞毒性は、それぞれ感染細胞と非感染細胞における生細胞数を薬剤非添加時のそれらと比較することにより判定した。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染により誘導された細胞の変化（細胞死）と、それに対するセニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の効果を図２に示す。

図２から、薬剤非存在下ではＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染によってほぼ全ての細胞が破壊されているが（図２左下）、２０μＭのセニクリビロク(cenicriviroc)が存在すると、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染による細胞死が見られないことがわかる（図２中央下）。一方、セニクリビロク(cenicriviroc)と同様に強いＣＣＲ５に対する阻害作用を有し、抗ＨＩＶ−１薬としてエイズ患者に対し臨床的に用いられているマラビロク(maraviroc)は４０μＭでも抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さない（図２右下）。

セニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の濃度と、ウイルス非感染細胞及び感染細胞の培養３日後の生細胞数との関係を図３に示す。

図３の縦軸はウイルス非感染細胞及び感染細胞の培養３日後の生細胞数を示す。横軸は薬剤の濃度を示す。生細胞数は薬剤非存在下（０）の時を１００％として表している。セニクリビロク(cenicriviroc)の添加により感染細胞の生細胞数が増加することから、この薬剤は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有していることがわかる。一方、ＣＣＲ５阻害薬であるマラビロク(maraviroc)は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さなかった。

セニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を表１に示す。

ＥＣ_５０：５０％有効濃度（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染により誘導された細胞死を５０％抑制する薬剤の濃度）
ＣＣ_５０：５０％毒性濃度（非感染細胞数を５０％減少させる薬剤の濃度）

表１、並びに図２及び３から、セニクリビロク(cenicriviroc)が抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有することがわかる。

［実施例２］感染細胞からのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２産生に対するセニクリビロクの抑制効果
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をマイクロプレートに播種した（２×１０^４細胞／ウェル）。２４時間培養後、種々の濃度の薬剤とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＷＫ−５２１）（国立感染症研究所より入手）をmultiplicity of infection（ＭＯＩ）＝０．０１にて添加後、３７℃で３日間培養した。培養後、培養上清を採取し、１０μＬのSideStep Lysis and Stabilization Buffer（Agilent）が入ったＰＣＲプレートに１０μＬの培養上清を加え、十分に混合した。次に、８０μＬのnuclease-free waterを加え、十分に混合し、これをサンプルとした。逆転写（ＲＴ）反応はサンプル（５μＬ）、２×ＲＴ buffer（１２．５μＬ）、２０×ＲＴ enzyme mixture（１．２５μＬ）、そしてnuclease-free water（６．２５μＬ）を十分に混合し（総量２５μＬ）、３７℃（６０分）、９５℃（５分）、４℃の条件で実施した。次に、リアルタイム定量ＰＣＲは、前記のｃＤＮＡサンプル（５μＬ）、２×TaqMan^TM Gene Expression Master Mix（１２．５μＬ）、forward primer（０．２２５μＬ）、reverse primer（０．２２５μＬ）、TaqMan^TM probe（０．６２５μＬ）、そしてnuclease-free water（６．４２５μＬ）を十分に混合したもの（総量２５μＬ）を、５０℃（２分）、９５℃（１０分）に引き続き、９５℃（１５秒）／６０℃（１分）の４０サイクルの条件で増幅した。

結果を図４に示す。図４において、ＥＣ_５０は５０％有効濃度（培養上清中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＮＡ量を５０％抑制する薬剤の濃度）を表す。

図４から、セニクリビロク(ＣＶＣ)が抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有することがわかる。一方、ＣＣＲ５阻害薬であるマラビロク(ＭＲＶ)は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さなかった。

Claims

セニクリビロクもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。
ＣＯＶＩＤ−１９の予防又は治療に用いられる請求項１記載の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。