JP2021187761A - ANTI-SARS-CoV-2 AGENT - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬に関する。 The present invention relates to an anti-SARS-CoV-2 drug.
コロナウイルスは、本来、ヒトには風邪の症状を引き起こすウイルスであり、４種類のコロナウイルスが知られており、風邪の１０〜１５％がこれらのウイルスによって起こる。加えて、致死率の高い重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすコロナウイルスがこれまでに知られている。ＳＡＲＳ患者は約８，０００人、致死率は約１０％、ＭＡＲＳ患者は約２，５００人、致死率は約３５％である。
コロナウイルスは、直径約１００ｎｍのエンベロープを有する＋鎖ＲＮＡウイルスであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶは第二種病原体、ＭＥＲＳ−ＣｏＶは第三種病原体に分類されている。
Coronavirus is originally a virus that causes the symptoms of colds in humans, and four types of coronaviruses are known, and 10 to 15% of colds are caused by these viruses. In addition, coronaviruses that cause the highly lethal severe acute respiratory syndrome (SARS) and Middle East respiratory syndrome (MERS) have been known so far. The number of SARS patients is about 8,000, the case fatality rate is about 10%, the number of MARS patients is about 2,500, and the case fatality rate is about 35%.
Coronavirus is a + chain RNA virus having an envelope with a diameter of about 100 nm, and SARS-CoV is classified as a second-class pathogen and MERS-CoV is classified as a third-class pathogen.
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、現在、新型コロナウイルスとも呼ばれており、当該ウイルスによる感染症は、ＷＨＯによりＣＯＶＩＤ−１９と命名されている。ＣＯＶＩＤ−１９に対するワクチンや治療薬の開発が急務であるが、それには時間がかかる。そこで、別の目的で開発された既存の薬剤の中から、ＣＯＶＩＤ−１９の治療に転用しようとする試みがなされている。これまでに、抗エボラ薬として臨床試験が行われたレムデシビルが２０２０年５月７日に特例承認され、抗インフルエンザ薬のファビピラビルなどについて、ＣＯＶＩＤ−１９に対する臨床試験が行われている。 SARS-CoV-2 is now also called the new coronavirus, and the infectious disease caused by the virus is named COVID-19 by WHO. There is an urgent need to develop vaccines and therapeutic agents for COVID-19, but this will take time. Therefore, an attempt has been made to divert the existing drug developed for another purpose to the treatment of COVID-19. So far, remdesivir, which has been clinically tested as an anti-Ebola drug, was approved as a special case on May 7, 2020, and clinical trials for COVID-19 are being conducted for the anti-influenza drug favipiravir and the like.
一方、セニクリビロク(cenicriviroc)は、ＴＡＫ−６５２とも呼ばれ、次式：
しかしながら、セニクリビロクと抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２活性との関係についてはこれまで報告されたことはない。
On the other hand, cenicriviroc is also called TAK-652, and the following equation:
However, the relationship between cenicriviroc and anti-SARS-CoV-2 activity has never been reported.
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に有効な抗ウイルス薬を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an effective antiviral drug for SARS-CoV-2.
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、薬剤の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２アッセイ系を確立し、種々の薬剤についてスクリーニングを進めた結果、セニクリビロクに選択的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を認め、本発明を完成するに至った。 The present inventors have established an anti-SARS-CoV-2 assay system for drugs in order to solve the above-mentioned problems, and as a result of proceeding with screening for various drugs, the anti-SARS-CoV-2 effect selective for cenicriviroc This led to the completion of the present invention.
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）セニクリビロクもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。
（２）ＣＯＶＩＤ−１９の予防又は治療に用いられる前記（１）に記載の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) An anti-SARS-CoV-2 drug containing cenicriviroc or a salt thereof or a solvate thereof.
(2) The anti-SARS-CoV-2 drug according to (1) above, which is used for the prevention or treatment of COVID-19.
本発明によれば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に有効な抗ウイルス薬を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an effective antiviral drug for SARS-CoV-2.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明に用いるセニクリビロク及びその塩は市販されており、これらの市販品をそのまま、又は必要に応じて精製して本発明の有効成分として用いることができる。 Cenicriviroc and its salts used in the present invention are commercially available, and these commercially available products can be used as they are or after purification as needed as the active ingredient of the present invention.
セニクリビロクの塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸（メシル酸）、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。 The salt of senikuribiroku is preferably a pharmaceutically acceptable salt, for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodide, nitrate, pyrosulfate, metaphosphate, or citric acid. , And salts with organic acids such as benzoic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, sulfonic acid (eg, methanesulfonic acid (mesylic acid), p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid).
セニクリビロク又はその塩の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。 Examples of the solvate of cenicriviroc or a salt thereof include hydrates.
セニクリビロク又はその塩は、公知の方法、例えば、特表２０１８−５０５１４８号公報に記載の方法に従って、以下に示すようにして製造することができる。
ａ）化合物（II）と４−（（（１−プロピル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）スルフィニル）アニリン（化合物（III））とを塩基存在下で反応させてセニクリビロク（化合物（Ｉ））を生成させ（ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ２、ＯＣＯＲ２及びＮＨＲ２からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される。）、
ｂ）ステップａ）を水溶液で反応停止させ、
ｃ）メタンスルホン酸（メシル酸）を加え、
ｄ）化合物（Ｉ−ＭｓＯＨ）（セニクリビロクメシル酸塩）を結晶化させる。
Cenicriviroc or a salt thereof can be produced as shown below according to a known method, for example, the method described in JP-A-2018-505148.
a) Compound (II) and 4-(((1-propyl-1H-imidazol-5-yl) methyl) sulfinyl) aniline (compound (III)) are reacted in the presence of a base to form senikuribiroku (compound (I)). ) (Here, R 1 is selected from the group consisting of H, OH, Cl, Br, OR 2 , OCOR 2 and NHR 2 , and R 2 is H, alkyl, substituted alkyl, aryl and substituted aryl. It is selected from the group consisting of.),
b) Stop the reaction in step a) with an aqueous solution.
c) Add methanesulfonic acid (mesylic acid) and add
d) Crystallize compound (I-MsOH) (senicribirocumesylate).
前記のメタンスルホン酸（メシル酸）の代わりにその他の酸を用いれば、セニクリビロクメシル酸塩以外のセニクリビロクの酸付加塩を得ることができる。 If another acid is used instead of the above-mentioned methanesulfonic acid (mesylic acid), an acid addition salt of senikuribiroku other than senikuribirokumesilate can be obtained.
前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。 In order to purify the product obtained as described above, commonly used methods such as column chromatography using silica gel or the like as a carrier, methanol, ethanol, chloroform, dimethylsulfoxide, n-hexane-ethyl acetate, water and the like can be used. It may be according to the recrystallization method using. Examples of the elution solvent for column chromatography include methanol, ethanol, chloroform, acetone, hexane, dichloromethane, ethyl acetate, and a mixed solvent thereof.
前記の化合物は、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。 The above-mentioned compound can be formulated as an anti-SARS-CoV-2 drug in combination with a conventional pharmaceutical carrier. The dosage form is not particularly limited and is appropriately selected and used as necessary, and is used as tablets, capsules, granules, fine granules, powders, sustained release preparations, liquids, suspensions, emulsions and syrups. , Oral agents such as elixirs, parenteral agents such as injections and suppositories.
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。 The oral preparation is produced by a conventional method using, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, inorganic salts and the like. In addition to these, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a fragrance and the like can be appropriately added.
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。 Examples of the binder include starch, dextrin, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, crystalline cellulose, ethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol and the like.
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。 Examples of the disintegrant include starch, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose and the like.
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
Examples of the surfactant include sodium lauryl sulfate, soybean lecithin, sucrose fatty acid ester,
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。 Examples of the lubricant include talc, waxes, hydrogenated vegetable oil, sucrose fatty acid ester, magnesium stearate, calcium stearate, aluminum stearate, polyethylene glycol and the like.
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。 Examples of the fluidity accelerator include light anhydrous silicic acid, dry aluminum hydroxide gel, synthetic aluminum silicate, magnesium silicate and the like.
注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。セニクリビロクの注射剤中における割合は、５〜５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。 The injection is produced according to a conventional method, and generally distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, olive oil, sesame oil, lacquer oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol and the like can be used as the diluent. .. Further, if necessary, a bactericide, a preservative, a stabilizer, an tonicity agent, a painless agent and the like may be added. Further, from the viewpoint of stability, the injection can be filled in a vial or the like and then frozen, water is removed by a usual freeze-drying technique, and the liquid preparation can be reprepared from the freeze-dried product immediately before use. The proportion of cenicriviroc in injection can vary, but is not limited to, between 5 and 50% by weight.
その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。 Examples of other parenteral preparations include suppositories for intrarectal administration, which are manufactured according to a conventional method.
製剤化した抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。 The formulated anti-SARS-CoV-2 drug may be administered, for example, 1 to 4 times a day for a period of 1 week to 3 months, although it varies depending on the dosage form, administration route and the like.
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、セニクリビロクの重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。 In order to exert the desired effect as an oral preparation, the weight of cenicriviroc is usually 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 500 mg in the case of an adult, although it depends on the age, body weight and degree of disease of the patient. It is appropriate to take this in several divided doses a day.
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、セニクリビロクの重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。 In order to exert the desired effect as a parenteral preparation, it depends on the age, body weight, and degree of disease of the patient, but in the case of an adult, the weight of Senikuribiroku is, for example, 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 1. It is appropriate to administer 500 mg by intravenous injection, intravenous drip infusion, subcutaneous injection, or intramuscular injection.
また、セニクリビロクは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、セニクリビロクと組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えば、レムデシビル、ファビピラビル等が挙げられる。 Cenicriviroc may also be used in combination with other agents effective against SARS-CoV-2 infection. They are administered separately during the course of treatment or combined with cenicriviroc in a single dosage form such as tablets, intravenous solutions, or capsules. Examples of such other drugs include remdesivir, favipiravir and the like.
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例においては、セニクリビロクとしては遊離塩基体（市販品；MedChemExpress社より購入）を用いた。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
In the following examples, a free base (commercially available; purchased from MedChemExpress) was used as cenicriviroc.
［実施例１］ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染による細胞死に対するセニクリビロクの抑制効果
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２アッセイの概略を図１に示す。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に高い感受性を有するＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をマイクロプレートに播種した（２×１０４細胞／ウェル）。２４時間培養後、種々の濃度の薬剤とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＷＫ−５２１）（国立感染症研究所より入手）をmultiplicity of infection（ＭＯＩ）＝０．０１にて添加後、３７℃で３日間培養した。培養後、１１０μＬの培養上清を捨て、１０μＬのCell Counting Kit-8（（株）同仁化学研究所）（水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt）を発色試薬として用いた生細胞数測定キット）を添加した。２時間培養後、１００μＬの塩酸２−プロパノールを添加し、十分に混合した後、各ウェルの吸光度を４５０／６２０ｎｍにて測定した。薬剤の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果と細胞毒性は、それぞれ感染細胞と非感染細胞における生細胞数を薬剤非添加時のそれらと比較することにより判定した。
[Example 1] Suppressive effect of cenicriviroc on cell death due to SARS-CoV-2 infection The outline of the anti-SARS-CoV-2 assay is shown in FIG.
VeroE6 / TMPRSS2 cells with high sensitivity to SARS-CoV-2 were seeded on microplates (2 × 10 4 cells / well). After culturing for 24 hours, various concentrations of the drug and SARS-CoV-2 (WK-521) (obtained from the National Institute of Infectious Diseases) were added at a multiplicity of infection (MOI) = 0.01, and then 3 at 37 ° C. Incubated for days. After culturing, discard 110 μL of the culture supernatant, and discard 10 μL of Cell Counting Kit-8 (Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.) (water-soluble tetrazolium salt WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3-). (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt) was added as a viable cell count measurement kit) as a color-developing reagent. After culturing for 2 hours, 100 μL of 2-propanol hydrochloride was added, and after mixing well, the absorbance of each well was measured at 450/620 nm. The anti-SARS-CoV-2 effect and cytotoxicity of the drug were determined by comparing the viable cell numbers in infected and non-infected cells with those without the drug, respectively.
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染により誘導された細胞の変化（細胞死）と、それに対するセニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の効果を図２に示す。 FIG. 2 shows the cell changes (cell death) induced by SARS-CoV-2 infection and the effects of cenicriviroc and maraviroc on them.
図２から、薬剤非存在下ではＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染によってほぼ全ての細胞が破壊されているが（図２左下）、２０μＭのセニクリビロク(cenicriviroc)が存在すると、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染による細胞死が見られないことがわかる（図２中央下）。一方、セニクリビロク(cenicriviroc)と同様に強いＣＣＲ５に対する阻害作用を有し、抗ＨＩＶ−１薬としてエイズ患者に対し臨床的に用いられているマラビロク(maraviroc)は４０μＭでも抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さない（図２右下）。 From FIG. 2, almost all cells are destroyed by SARS-CoV-2 infection in the absence of the drug (lower left of FIG. 2), but in the presence of 20 μM cenicriviroc, cells due to SARS-CoV-2 infection. It can be seen that no death is seen (Fig. 2, bottom center). On the other hand, maraviroc, which has a strong inhibitory effect on CCR5 like cenicriviroc and is clinically used for AIDS patients as an anti-HIV-1 drug, has an anti-SARS-CoV-2 effect even at 40 μM. Not shown (bottom right of Figure 2).
セニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の濃度と、ウイルス非感染細胞及び感染細胞の培養３日後の生細胞数との関係を図３に示す。 FIG. 3 shows the relationship between the concentrations of cenicriviroc and maraviroc and the number of viable cells of non-virus-infected cells and infected cells after 3 days of culture.
図３の縦軸はウイルス非感染細胞及び感染細胞の培養３日後の生細胞数を示す。横軸は薬剤の濃度を示す。生細胞数は薬剤非存在下（０）の時を１００％として表している。セニクリビロク(cenicriviroc)の添加により感染細胞の生細胞数が増加することから、この薬剤は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有していることがわかる。一方、ＣＣＲ５阻害薬であるマラビロク(maraviroc)は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さなかった。
The vertical axis of FIG. 3 shows the number of non-virus-infected cells and the number of
セニクリビロク(cenicriviroc)及びマラビロク(maraviroc)の抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を表１に示す。 Table 1 shows the anti-SARS-CoV-2 effects of cenicriviroc and maraviroc.
ＣＣ５０：５０％毒性濃度（非感染細胞数を５０％減少させる薬剤の濃度）
CC 50 : 50% toxic concentration (concentration of drug that reduces the number of uninfected cells by 50%)
表１、並びに図２及び３から、セニクリビロク(cenicriviroc)が抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有することがわかる。 From Table 1 and FIGS. 2 and 3, it can be seen that cenicriviroc has an anti-SARS-CoV-2 effect.
［実施例２］感染細胞からのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２産生に対するセニクリビロクの抑制効果
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞をマイクロプレートに播種した（２×１０４細胞／ウェル）。２４時間培養後、種々の濃度の薬剤とＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＷＫ−５２１）（国立感染症研究所より入手）をmultiplicity of infection（ＭＯＩ）＝０．０１にて添加後、３７℃で３日間培養した。培養後、培養上清を採取し、１０μＬのSideStep Lysis and Stabilization Buffer（Agilent）が入ったＰＣＲプレートに１０μＬの培養上清を加え、十分に混合した。次に、８０μＬのnuclease-free waterを加え、十分に混合し、これをサンプルとした。逆転写（ＲＴ）反応はサンプル（５μＬ）、２×ＲＴ buffer（１２．５μＬ）、２０×ＲＴ enzyme mixture（１．２５μＬ）、そしてnuclease-free water（６．２５μＬ）を十分に混合し（総量２５μＬ）、３７℃（６０分）、９５℃（５分）、４℃の条件で実施した。次に、リアルタイム定量ＰＣＲは、前記のｃＤＮＡサンプル（５μＬ）、２×TaqManTM Gene Expression Master Mix（１２．５μＬ）、forward primer（０．２２５μＬ）、reverse primer（０．２２５μＬ）、TaqManTM probe（０．６２５μＬ）、そしてnuclease-free water（６．４２５μＬ）を十分に混合したもの（総量２５μＬ）を、５０℃（２分）、９５℃（１０分）に引き続き、９５℃（１５秒）／６０℃（１分）の４０サイクルの条件で増幅した。
[Example 2] Suppressive effect of cenicriviroc on SARS-CoV-2 production from infected cells VeroE6 / TMPRSS2 cells were seeded on a microplate (2 × 10 4 cells / well). After culturing for 24 hours, various concentrations of the drug and SARS-CoV-2 (WK-521) (obtained from the National Institute of Infectious Diseases) were added at a multiplicity of infection (MOI) = 0.01, and then 3 at 37 ° C. Incubated for days. After culturing, the culture supernatant was collected, 10 μL of the culture supernatant was added to a PCR plate containing 10 μL of SideStep Lysis and Stabilization Buffer (Agilent), and the mixture was thoroughly mixed. Next, 80 μL of nuclease-free water was added and mixed well, which was used as a sample. The reverse transcription (RT) reaction is a thorough mixture of sample (5 μL), 2 × RT buffer (12.5 μL), 20 × RT enzyme mixture (1.25 μL), and nuclease-free water (6.25 μL) (total volume). 25 μL), 37 ° C (60 minutes), 95 ° C (5 minutes), and 4 ° C. Next, real-time quantitative PCR was performed using the above-mentioned cDNA sample (5 μL), 2 × TaqMan TM Gene Expression Master Mix (12.5 μL), forward primer (0.225 μL), reverse primer (0.225 μL), TaqMan TM probe ( 0.625 μL) and a sufficient mixture of nuclease-free water (6.425 μL) (total volume 25 μL) at 50 ° C (2 minutes), 95 ° C (10 minutes), followed by 95 ° C (15 seconds) /. Amplification was performed under the condition of 40 cycles at 60 ° C. (1 minute).
結果を図４に示す。図４において、ＥＣ５０は５０％有効濃度（培養上清中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＲＮＡ量を５０％抑制する薬剤の濃度）を表す。 The results are shown in FIG. In FIG. 4, EC 50 represents a 50% effective concentration (concentration of a drug that suppresses the amount of RNA of SARS-CoV-2 in the culture supernatant by 50%).
図４から、セニクリビロク(ＣＶＣ)が抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を有することがわかる。一方、ＣＣＲ５阻害薬であるマラビロク(ＭＲＶ)は抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２効果を示さなかった。 From FIG. 4, it can be seen that cenicriviroc (CVC) has an anti-SARS-CoV-2 effect. On the other hand, the CCR5 inhibitor maraviroc (MRV) showed no anti-SARS-CoV-2 effect.
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