JP2021024860A - Agent for preventing or treating bone tissue-related disease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、骨再生、骨組織関連疾患の予防または治療等に使用しうる剤に関する。より詳しくは、本発明は、所定の細胞培養物を有効成分として含有する剤に関する。 The present invention relates to an agent that can be used for bone regeneration, prevention or treatment of bone tissue-related diseases, and the like. More specifically, the present invention relates to an agent containing a predetermined cell culture as an active ingredient.
骨欠損や骨折などの修復および治療に関する臨床応用が研究されている。例えば、特許文献１では、細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルに、骨形成を誘導する作用を有する蛋白質（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein）を含ませることにより、骨の形成量や成熟速度を増加させることができることが開示されている。 Clinical applications for repair and treatment of bone defects and fractures are being studied. For example, in Patent Document 1, the amount of bone formed by including a protein (BMP: Bone morphogenetic protein) having an action of inducing bone formation in a self-assembling peptide hydrogel used as a scaffold for cell culture. It is disclosed that the rate of maturation can be increased.
しかしながら、本発明者の検討によれば、投与する蛋白質による副作用が生じたり、その調製方法が煩雑であったりするなど、蛋白製剤には問題があった。また、細胞製剤とする場合には、二次元の細胞培養体では効果が十分ではなかったり、三次元の細胞培養体では足場材料との好適な組み合わせを見つけ、その調製方法を確立させるには困難が多かったりするため、更なる改良の余地があった。 However, according to the study by the present inventor, there are problems with the protein preparation, such as side effects caused by the protein to be administered and the complicated preparation method. In addition, in the case of cell preparation, the effect is not sufficient in the two-dimensional cell culture, and it is difficult to find a suitable combination with the scaffold material in the three-dimensional cell culture and establish the preparation method thereof. There was room for further improvement because there were many.
また、骨形成においては、軟骨細胞が肥大軟骨細胞に分化し、血管侵入を受けて石灰化すると、血管から侵入した骨芽細胞や破骨細胞によって骨組織へと置換されることによって、骨が形成されるものと考えられる。即ち、骨形成においては、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞など種々の細胞群が関係するものと考えられる。 In bone formation, chondrocytes differentiate into hypertrophic chondrocytes, and when they undergo vascular invasion and become calcified, bone is replaced with bone tissue by osteoblasts and osteoclasts that have invaded from the blood vessels. It is thought to be formed. That is, it is considered that various cell groups such as chondrocytes, osteoblasts, and osteoclasts are involved in bone formation.
一方で、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）は、優れた抗炎症作用ならびに自己再生能および多分化能を有する。このような間葉系幹細胞を細胞製剤として用いる際には、培養された細胞同士が三次元的にネットワークを形成したスフェロイド（細胞塊；細胞凝集体）の形態で用いることが、疾患の創傷治癒効果を向上させるという観点からは好ましい。しかしながら、スフェロイドを有効成分として含有する細胞製剤のうち、骨再生を示すもの、さらには、骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示すものは未だ知られていない。 On the other hand, mesenchymal stem cells (MSCs) have excellent anti-inflammatory activity and self-renewal ability and pluripotency. When such mesenchymal stem cells are used as cell preparations, it is recommended to use them in the form of spheroids (cell clusters; cell aggregates) in which cultured cells form a three-dimensional network to heal wounds of diseases. It is preferable from the viewpoint of improving the effect. However, among cell preparations containing spheroids as an active ingredient, those showing bone regeneration and those showing a high therapeutic effect on bone tissue-related diseases are not yet known.
本発明は、間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、骨再生剤や、骨組織関連疾患の予防または治療剤等を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a bone regenerating agent, a prophylactic or therapeutic agent for bone tissue-related diseases, etc., which contains a spheroid containing mesenchymal stem cells as an active ingredient.
本発明は、下記〔１〕〜〔１２〕に関する。
〔１〕 間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、骨再生剤。
〔２〕 間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、骨組織関連疾患の予防または治療剤。
〔３〕 さらに、抗炎症のための剤である、前記〔１〕又は〔２〕記載の剤。
〔４〕 さらに、軟骨再生のための剤である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕 開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を複数有する細胞培養用基材上で培養されたスフェロイドである、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の剤。
〔６〕 培養面が細胞接着性表面を有する細胞培養用基材上で培養されたスフェロイドである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤。
〔７〕 細胞接着性表面が細胞接着性を示す物質で構成される、前記〔６〕記載の剤。
〔８〕 細胞接着性表面がポリイミド樹脂を含む、前記〔６〕又は〔７〕記載の剤。
〔９〕 開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用基材で培養されたスフェロイドである、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の剤。
〔１０〕 スフェロイドが、抗炎症に関係するタンパク質及び／又はそれをコードする遺伝子を発現している、前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の剤。
〔１１〕 抗炎症に関係するタンパク質が、TSG-6である、前記〔１０〕記載の剤。
〔１２〕 骨組織関連疾患が、変形性関節症、離断性骨軟骨炎、関節軟骨損傷、骨折、難治性骨折、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、痛風性関節炎、偽痛風性関節炎、骨形成不全症、及び骨粗鬆症からなる群より選ばれる、前記〔２〕〜〔１１〕のいずれかに記載の剤。
The present invention relates to the following [1] to [12].
[1] A bone regenerating agent containing a spheroid containing mesenchymal stem cells as an active ingredient.
[2] A prophylactic or therapeutic agent for bone tissue-related diseases containing spheroids containing mesenchymal stem cells as an active ingredient.
[3] Further, the agent according to the above [1] or [2], which is an agent for anti-inflammatory.
[4] Further, the agent according to any one of the above [1] to [3], which is an agent for cartilage regeneration.
[5] The agent according to any one of [1] to [4] above, which is a spheroid cultured on a cell culture substrate having a plurality of recesses having an opening having a diameter of 1000 μm or less.
[6] The agent according to any one of [1] to [5] above, wherein the spheroid is cultivated on a cell culture substrate having a cell-adhesive surface as the culture surface.
[7] The agent according to [6] above, wherein the cell adhesion surface is composed of a substance exhibiting cell adhesion.
[8] The agent according to the above [6] or [7], wherein the cell adhesive surface contains a polyimide resin.
[9] A cell culture group having a plurality of recesses having an opening having a diameter of 1000 μm or less, the inner surface of the recess having a cell non-adhesive surface, and the bottom surface of the recess having a cell adhesive surface. The agent according to any one of the above [1] to [8], which is a spheroid cultured in a material.
[10] The agent according to any one of the above [1] to [9], wherein the spheroid expresses a protein related to anti-inflammatory and / or a gene encoding the same.
[11] The agent according to the above [10], wherein the protein involved in anti-inflammatory is TSG-6.
[12] Bone tissue-related diseases include osteoarthritis, osteochondritis dissecans, articular cartilage injury, fractures, refractory fractures, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, spondyloarthritis, gouty arthritis, pseudogouty arthritis, The agent according to any one of the above [2] to [11], which is selected from the group consisting of osteodysplasia and osteoporosis.
本発明によれば、骨再生、さらには、骨組織関連疾患に対して高い治療効果を示しうる、スフェロイド含有細胞製剤が提供される。 According to the present invention, there is provided a spheroid-containing cell preparation capable of exhibiting a high therapeutic effect on bone regeneration and bone tissue-related diseases.
本発明の一形態は、間葉系幹細胞を含むスフェロイドを有効成分として含有する、剤である。このような剤は、例えば、骨再生（骨組織の修復）剤、さらには、骨組織関連疾患の予防または治療剤等として使用しうる。 One form of the present invention is an agent containing a spheroid containing mesenchymal stem cells as an active ingredient. Such agents can be used, for example, as bone regeneration (repair of bone tissue) agents, and as preventive or therapeutic agents for bone tissue-related diseases.
本発明におけるスフェロイドは、間葉系幹細胞を含むものであればよく、間葉系幹細胞を培養して得られたものであってもよい。 The spheroid in the present invention may be any spheroid containing mesenchymal stem cells, and may be obtained by culturing mesenchymal stem cells.
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としては、未分化の間葉系細胞である限り特に制限はされず、哺乳動物の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から常法に従い採取したものを用いることができる。また、採取後、未分化のＭＳＣをプラスチック付着性の有無等により選択することもできる。ここで、ＭＳＣとしては、調達の容易さおよび高い増殖性という観点から、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。また、ＭＳＣとしては、本発明の剤の投与対象と同種の哺乳動物由来のＭＳＣを用いることが好ましく、投与対象以外の同種の哺乳動物由来のＭＳＣや、投与対象自身のＭＳＣ（自家細胞）を用いることができる。これらの細胞が由来する生物種も特に制限されず、ヒトおよび非ヒト哺乳動物由来の各種細胞を用いることができる。細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー、タマリンおよびマーモセット等の霊長類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が例示できる。なお、ＭＳＣとしては、ＭＳＣを７０〜９０％コンフルエント（好ましくは８０％コンフルエント）まで増殖させて得られた細胞をゼロ継代とし、それをさらに増殖させて、例えば、１〜１０継代のＭＳＣを用いてもよい。 The mesenchymal stem cells (MSCs) are not particularly limited as long as they are undifferentiated mesenchymal cells, and those collected from the bone marrow, periosteum, adipose tissue, peripheral blood, cord blood, etc. of mammals according to a conventional method are used. Can be used. In addition, after collection, undifferentiated MSC can be selected depending on the presence or absence of plastic adhesion. Here, as the MSC, it is preferable to use mesenchymal stem cells derived from adipose tissue from the viewpoint of ease of procurement and high proliferation. Further, as the MSC, it is preferable to use an MSC derived from a mammal of the same type as the administration target of the agent of the present invention, and an MSC derived from a mammal of the same type other than the administration target or an MSC (autologous cell) of the administration target itself can be used. Can be used. The species from which these cells are derived is not particularly limited, and various cells derived from humans and non-human mammals can be used. Species from which the cells are derived include, for example, humans, rhesus monkeys, green monkeys, cynomolgus monkeys, chimpanzees, tamarins and marmosets and other primates, mice, rats, hamsters and guinea pigs and other rodents, dogs, cats, rabbits and pigs. Examples include cows, goats, sheep, and horses. As the MSC, the cells obtained by proliferating the MSC to 70 to 90% confluent (preferably 80% confluent) are set to zero passage, and the cells are further proliferated to, for example, MSCs of 1 to 10 passages. May be used.
スフェロイドとしては、特に限定されず、公知のものを用いてもよいが、得られるスフェロイドの細胞外マトリックス含有量、均一性等の観点から、開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を複数有する細胞培養用基材上で培養されたスフェロイドであってもよい。 The spheroid is not particularly limited, and a known one may be used, but from the viewpoint of the extracellular matrix content and uniformity of the obtained spheroid, a cell having a plurality of recesses having an opening diameter of 1000 μm or less. It may be a spheroid cultured on a culture substrate.
例えば、凹部内にてスフェロイドを調製する場合、基材における凹部の個数は、基材面積や培養する細胞の種類等によって一概に設定することはできず、当該技術常識に従って適宜設定することができる。例えば、単位面積(cm2)あたりの下限個数は1個としてもよいが、10個、20個、30個、50個などを例示でき、上限個数は1000個、500個、300個、200個、100個などを例示することができる。また、基材表面における凹部の総数は、例えば、10個以上、100個以上、1000個以上、10000個以上、50000個以上など、適宜設定することができる。 For example, when spheroids are prepared in the recesses, the number of recesses in the base material cannot be unconditionally set depending on the area of the base material, the type of cells to be cultured, and the like, and can be appropriately set according to the common general technical knowledge. .. For example, the lower limit of the number per unit area (cm 2 ) may be 1, but 10, 20, 30, 50, etc. can be exemplified, and the upper limit is 1000, 500, 300, 200. , 100 pieces, etc. can be exemplified. Further, the total number of recesses on the surface of the base material can be appropriately set, for example, 10 or more, 100 or more, 1000 or more, 10000 or more, 50,000 or more.
前記凹部の開口部の形状は、円形に限られず、例えば、多角形や楕円であってもよい。開口部の口径は直径1000μm以下であればよく、培養する細胞のサイズによって当該技術常識に従って適宜設定することができる。本発明において、口径とは、対象箇所の形状によらず、対象箇所を包接するようにして形成される円の直径(最大長さ)のことである。開口部の口径としては、例えば、10〜1000μm、10〜700μm、10〜600μm、10〜500μmの範囲内が例示される。 The shape of the opening of the recess is not limited to a circular shape, and may be, for example, a polygon or an ellipse. The diameter of the opening may be 1000 μm or less, and can be appropriately set according to the common general knowledge of the art depending on the size of the cells to be cultured. In the present invention, the diameter is the diameter (maximum length) of a circle formed so as to enclose the target portion regardless of the shape of the target portion. Examples of the diameter of the opening include the range of 10 to 1000 μm, 10 to 700 μm, 10 to 600 μm, and 10 to 500 μm.
前記凹部の底面の形状は、円形に限られず、例えば、多角形や楕円であってもよく、開口部の形状と同一であっても異なるものであってもよい。また、底面は、平板状（平坦状）であっても湾曲していてもよく、平滑であってもよいが、平坦及び／又は平滑な底面であることがより好ましい。底面の口径(長さ)は開口部の口径と同一であっても異なるものであってもよく、底面の口径が開口部の口径より小さいものであっても、底面の口径が開口部の口径より大きいものであってもよい。底面の口径としては、例えば、10〜1000μm、10〜700μm、10〜600μm、10〜500μm、10〜400μm、10〜300μmの範囲内が例示される。例えば、底面の口径が開口部の口径より小さい場合、凹部の形状としては、凹部の底面側に向かったテーパー形状が形成される。 The shape of the bottom surface of the recess is not limited to a circle, and may be, for example, a polygon or an ellipse, and may be the same as or different from the shape of the opening. Further, the bottom surface may be flat (flat), curved, or smooth, but it is more preferable that the bottom surface is flat and / or smooth. The caliber (length) of the bottom surface may be the same as or different from the caliber of the opening, and even if the caliber of the bottom surface is smaller than the caliber of the opening, the caliber of the bottom surface is the caliber of the opening. It may be larger. Examples of the diameter of the bottom surface include the range of 10 to 1000 μm, 10 to 700 μm, 10 to 600 μm, 10 to 500 μm, 10 to 400 μm, and 10 to 300 μm. For example, when the diameter of the bottom surface is smaller than the diameter of the opening, the shape of the recess is a tapered shape toward the bottom surface of the recess.
底面の口径と開口部の口径の比(底面の口径／開口部の口径)は、特に限定されるものではないが、細胞の播種や回収のしやすさの観点から、5/1〜1/5、3/1〜1/3、1/1〜1/2が例示される。 The ratio of the diameter of the bottom surface to the diameter of the opening (the diameter of the bottom surface / the diameter of the opening) is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of seeding and recovery of cells, 5/1 to 1 / 5, 3/1 to 1/3, 1/1 to 1/2 are exemplified.
また、開口部と隣接する開口部との間の距離(間隙)は、特に限定されるものではないが、所望する細胞培養に応じて、例えば、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、300μm以下、200μm以下、100μm以下などの範囲内が例示され、有限値であればよい。 The distance (gap) between the opening and the adjacent opening is not particularly limited, but is, for example, 800 μm or less, 700 μm or less, 600 μm or less, 500 μm or less, depending on the desired cell culture. Examples are in the range of 300 μm or less, 200 μm or less, 100 μm or less, and any finite value may be used.
前記凹部の深さは、培養する細胞のサイズによって当該技術常識に従って適宜設定することができる。例えば、10〜1000μm、10〜300μm等の範囲内が例示される。 The depth of the recess can be appropriately set according to the common general technical knowledge according to the size of the cells to be cultured. For example, the range of 10 to 1000 μm, 10 to 300 μm, etc. is exemplified.
開口部の口径と凹部の深さの比(開口部の口径／凹部の深さ)は、特に限定されるものではないが、細胞の播種や回収のしやすさの観点から、5/1〜1/5、3/1〜1/3、2/1〜1/2が例示される。前記範囲内の場合、細胞が凹部から飛び出し難く、また、細胞の回収や脱泡処理といった作業がしやすくなる。 The ratio of the diameter of the opening to the depth of the recess (diameter of the opening / depth of the recess) is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of seeding and recovery of cells, 5/1 to Examples are 1/5, 3/1 to 1/3, and 2/1 to 1/2. Within the above range, cells are less likely to pop out from the recesses, and operations such as cell collection and defoaming treatment become easier.
前記凹部の底面の厚みは、特に限定されず、当該技術常識に従って適宜設定することができる。 The thickness of the bottom surface of the recess is not particularly limited and can be appropriately set according to the common general technical knowledge.
また、前記凹部の内表面はスフェロイドを形成できるのであれば特に制限されない。スフェロイドを凹部内で形成させる観点、及び得られるスフェロイドの接着性を向上させる観点から、スフェロイドの培養面が細胞接着性表面を有するような細胞培養用基材を用いてもよい。この場合、細胞接着性表面が凹部内表面の一部を形成しても全面であってもよく、例えば、凹部の内側面や底面の一部又は全面であってもよい。 Further, the inner surface of the recess is not particularly limited as long as it can form a spheroid. From the viewpoint of forming the spheroid in the recess and improving the adhesiveness of the obtained spheroid, a cell culture substrate may be used such that the culture surface of the spheroid has a cell adhesive surface. In this case, the cell adhesion surface may form a part of the inner surface of the recess or may be the entire surface, and may be, for example, a part or the entire surface of the inner surface or the bottom surface of the recess.
細胞接着性表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、ある一定の接着点を持って接着することである。または、ピペッティング等の液流等によって剥離可能な程度に固定化されるように接着する表面のことである。また、細胞が接着して二次元的に維持又は増殖されるような表面ではなく、層状やスフェロイド状等の立体的な又は三次元の組織体を形成することが可能な程度に接着する表面を挙げることができる。かかる表面は、例えば、細胞接着性を示す物質が凹部底面を構成する基材表面に物理的又は化学的に固定又は配置されて形成されたものであればよく、細胞接着性を示す物質が該凹部以外に配置されたものでも、基材そのものが細胞接着性を示す物質からなるものであってもよい。 The cell adhesion surface is, for example, that when cells settle on the surface in a solution used for culturing, the cells adhere to each other with a certain adhesion point. Alternatively, it is a surface to be adhered so as to be fixed to such an extent that it can be peeled off by a liquid flow such as pipetting. In addition, a surface that adheres to the extent that it is possible to form a three-dimensional or three-dimensional tissue such as a layered or spheroid, rather than a surface on which cells adhere and maintain or proliferate two-dimensionally. Can be mentioned. Such a surface may be formed, for example, by physically or chemically fixing or arranging a substance exhibiting cell adhesion on the surface of a base material constituting the bottom surface of the recess, and the substance exhibiting cell adhesion is said to be. It may be arranged in a place other than the recess, or the base material itself may be made of a substance exhibiting cell adhesion.
細胞接着性を示す物質としては、培養に用いる細胞が接着するか、又は用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合し得る物質であれば特に限られず用いることができる。親水性を示すものであっても疎水性を示すものであってもよいが、細胞接着性やスフェロイドの形成性等の観点から、親水性（特に、超親水性ではない親水性）又は疎水性（特に、超疎水性ではない疎水性）のものが好ましく、更に好ましくは、疎水性を示すものが好ましい。また、細胞接着性を示す物質の接着性の程度は、細胞が凹部内から飛び出さない程度であってもよい。このような物質の一例を挙げると、生体から取得され若しくは合成された物質が挙げられ、例えば、タンパク質(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等)や、合成樹脂(フッ素樹脂、ポリイミド樹脂、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリジメチルシロキサン、これらの混合物等)が含まれる。合成樹脂を選択する場合、合成樹脂自体の強度や耐熱性から、取り扱い性に優れる細胞培養用基材を得ることができる。また、生体適合性の観点から、接着性のスフェロイドが得られる観点から、得られるスフェロイドの均一性が向上する観点から、または種々の細胞と適度に接着することにより培地交換作業が容易となる観点から、ポリイミド樹脂のような合成樹脂を選択することが好ましい。ポリイミド樹脂のような非生物由来の成分を選択することで、ポリイミド樹脂を含む細胞培養用基材により得られるスフェロイドは、再生医療や創薬等の分野への適用が容易となる。 The substance exhibiting cell adhesion is not particularly limited as long as it is a substance that the cells used for culture adhere to or can bind to cell surface molecules such as proteins and sugar chains present in the cell membrane of the cells used. Can be done. It may be hydrophilic or hydrophobic, but from the viewpoint of cell adhesion, spheroid formation, etc., it is hydrophilic (particularly hydrophilic, not superhydrophilic) or hydrophobic. (In particular, hydrophobic ones that are not superhydrophobic) are preferable, and those exhibiting hydrophobicity are more preferable. Further, the degree of adhesion of the substance exhibiting cell adhesion may be such that the cells do not pop out from the recess. Examples of such substances include substances obtained or synthesized from living organisms, such as proteins (collagen, fibronectin, laminin, etc.) and synthetic resins (fluororesin, polyimide resin, polysulfone, polyethersulfone, etc.). , Polydimethylsiloxane, mixtures thereof, etc.). When a synthetic resin is selected, a cell culture substrate having excellent handleability can be obtained from the strength and heat resistance of the synthetic resin itself. Further, from the viewpoint of biocompatibility, from the viewpoint of obtaining adhesive spheroids, from the viewpoint of improving the uniformity of the obtained spheroids, or from the viewpoint of facilitating the medium exchange work by appropriately adhering to various cells. Therefore, it is preferable to select a synthetic resin such as a polyimide resin. By selecting a non-living component such as a polyimide resin, the spheroid obtained from the cell culture substrate containing the polyimide resin can be easily applied to fields such as regenerative medicine and drug discovery.
ポリイミド樹脂としては、以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含むポリイミド樹脂が例示できる。また、スフェロイド形成が良好であるという観点から、分子内にフッ素原子を有する樹脂が好ましく、含フッ素ポリイミド（含フッ素ポリイミド樹脂）がより好ましい。本発明で用いられるポリイミド樹脂は、典型的には、酸二無水物とジアミンとを各々１種以上重合させて得られるポリアミド酸をイミド化することにより得られる。ポリイミド樹脂は、ポリアミド酸を化学構造の一部に含んでいてもよい。ポリイミド樹脂を製造する方法としては、公知の手法で製造すればよい。一例として二段合成法が使用できる。ポリイミド樹脂の二段合成法は前駆体としてポリアミド酸を合成し、ポリアミド酸をポリイミド酸に変換する方法である。前駆体としてのポリアミド酸はポリアミド酸誘導体であってもよい。ポリアミド酸誘導体としては、例えばポリアミド酸塩、ポリアミド酸アルキルエステル、ポリアミド酸アミド、ビスメチリデンピロメリチドからのポリアミド酸誘導体、ポリアミド酸シリルエステル、ポリアミド酸イソイミドなどが挙げられる。ポリイミドとしてはピロメリット酸二無水物、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物等の酸無水物と、オキシジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、ベンゾフェノンジアミン等のジアミンとからなるポリイミドが例示できる。フッ素原子を有する樹脂としては、例えば、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）／１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）共重合体、６ＦＤＡ／１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＲ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’−オキシジフタル酸無水物（ＯＤＰＡ）／ＴＰＥＱ共重合体、４，４’−（４，４’−イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）／２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）、６ＦＤＡ／２，２−ビス（４−（４−アミノフェノキシ）フェニル）プロパン（ＢＡＰＰ）共重合体、６ＦＤＡ／２，２’−ビス（トリフルオロメチル）ベンジジン（ＴＦＭＢ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル（ＢＡＰＢ）共重合体等の以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミド樹脂；エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体等が例示できる。 As the polyimide resin, a polyimide resin containing a structural unit represented by the following formula (I) can be exemplified. Further, from the viewpoint of good spheroid formation, a resin having a fluorine atom in the molecule is preferable, and a fluorine-containing polyimide (fluorine-containing polyimide resin) is more preferable. The polyimide resin used in the present invention is typically obtained by imidizing a polyamic acid obtained by polymerizing one or more kinds of acid dianhydride and diamine. The polyimide resin may contain polyamic acid as part of its chemical structure. As a method for producing the polyimide resin, it may be produced by a known method. As an example, the two-stage synthesis method can be used. The two-stage synthesis method of a polyimide resin is a method of synthesizing a polyamic acid as a precursor and converting the polyamic acid into a polyimide acid. The polyamic acid as a precursor may be a polyamic acid derivative. Examples of the polyamic acid derivative include a polyamic acid salt, a polyamic acid alkyl ester, a polyamic acid amide, a polyamic acid derivative from bismethylidene pyromeride, a polyamic acid silyl ester, and a polyamic acid isoimide. The polyimide consists of acid anhydrides such as pyromellitic dianhydride, biphenyltetracarboxylic dianhydride, and benzophenonetetracarboxylic dianhydride, and diamines such as oxydiamine, paraphenylenediamine, metaphenylenediamine, and benzophenonediamine. Polyimide can be exemplified. Examples of the resin having a fluorine atom include 4,4'-hexafluoroisopropyridene diphthalic acid anhydride (6FDA) / 1,4-bis (aminophenoxy) benzene (TPEQ) copolymer, 6FDA / 1,3. -Bis (4-aminophenoxy) benzene (TPER) copolymer, 6FDA / 4,4'-oxydiphthalic acid anhydride (ODPA) / TPEQ copolymer, 4,4'-(4,4'-isopropridende Phenoxy) diphthalic acid (BPADA) / 2,2-bis [4- (4-aminophenoxy) phenyl] hexafluoropropane (HFBAPP), 6FDA / 2,2-bis (4- (4-aminophenoxy) phenyl) propane (BAPP) copolymer, 6FDA / 2,2'-bis (trifluoromethyl) benzidine (TFMB) copolymer, 6FDA / 4,4'-diaminodiphenyl ether (ODA) copolymer, 6FDA / 4,4' A fluorine-containing polyimide resin containing a structural unit represented by the following formula (I) such as a −bis (4-aminophenoxy) biphenyl (BABP) copolymer; an ethylene-tetrafluoroethylene copolymer and the like can be exemplified.
上記式（Ｉ）中、Ｘ０は酸素原子、硫黄原子、または２価の有機基のいずれかを示し；
Ｙは２価の有機基を示し；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子のいずれかを示し、
ｐは０または１である。
なお、ポリイミド樹脂において、式（Ｉ）で示される化学構造は、樹脂の構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。Ｘ０、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含むことが好ましい。
In formula (I) above, X 0 represents either an oxygen atom, a sulfur atom, or a divalent organic group;
Y represents a divalent organic group;
Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 independently indicate either a hydrogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
p is 0 or 1.
In the polyimide resin, the chemical structure represented by the formula (I) may be different or the same for each constituent unit of the resin. It is preferable that at least one of X 0 , Y, Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 contains one or more fluorine atoms.
上記式（Ｉ）中、ｐ＝０である場合にはＸ０は存在していなくても（換言すれば、左右のベンゼン環が直接結合していても）よいが、ｐ＝１である場合には、左右のベンゼン環はＸ０を介して結合する。 In the above formula (I), when p = 0, X 0 may not exist (in other words, the left and right benzene rings may be directly bonded), but when p = 1. the left and right benzene ring linked via X 0.
Ｘ０で示される２価の有機基としては、具体的には、アルキレン基、アリーレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基等が挙げられ、これらの中でも、アルキレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基が好ましく、アルキレン基、アリーレンオキシ基がより好ましく、これらはフッ素原子で置換されていてもよい。上記アルキレン基の炭素数は、例えば１〜１２であり、好ましくは１〜６である。 Specific examples of the divalent organic group represented by X 0 include an alkylene group, an arylene group, an aryleneoxy group, an arylentio group, and the like. Among these, an alkylene group, an aryleneoxy group, and an arylenthio group. Is preferable, an alkylene group and an aryleneoxy group are more preferable, and these may be substituted with a fluorine atom. The alkylene group has, for example, 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms.
Ｘ０の例であるフッ素原子で置換されたアルキレン基としては、例えば、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−Ｃ（ＣＦ３）２−等を例示することができる。Ｘ０の例である上述したアルキレン基の中では、−Ｃ（ＣＦ３）２−が好適である。 Examples of the alkylene group substituted with a fluorine atom, which is an example of X 0 , include −C (CF 3 ) 2 −, −C (CF 3 ) 2 −C (CF 3 ) 2 −, and the like. .. Among the above-mentioned alkylene groups which are examples of X 0 , −C (CF 3 ) 2− is preferable.
Ｘ０の例であるアリーレン基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 Examples of the arylene group, which is an example of X 0, include the following.
Ｘ０の例であるアリーレンオキシ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 Examples of the arylene oxy group, which is an example of X 0, include the following.
Ｘ０の例であるアリーレンチオ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 As the arylentio group which is an example of X 0 , for example, the following can be exemplified.
基材上にスフェロイドを良好に形成しうるという観点からは、Ｘ０で示される２価の有機基は、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択されるものでもよく、上記ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択されるものでもよく、ｂ−８で表される構造であってもよい。 From the viewpoint that spheroids can be well formed on the substrate, the divalent organic group represented by X 0 is selected from the group consisting of b-2 to b-10 and c-2 to c-10. It may be one selected from the group consisting of b-7 to b-9 and c-7 to c-9, and may have a structure represented by b-8.
Ｘ０の例である上述したアリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基は、各々独立して、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子であり、より好ましくはフッ素原子である）、メチル基およびトリフルオロメチル基よりなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基に置換している好適な置換基は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であり、好適にはフッ素原子である。アリーレン基、アリーレンオキシ基およびアリーレンチオ基は、Ｙにフッ素原子が含まれない場合、少なくとも１つ以上のフッ素原子で置換されることが好ましい。 Above arylene group is an example of X 0, arylene group and Arirenchio groups are each independently a halogen atom (e.g., fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, preferably fluorine atom or chlorine It may be substituted with a group selected from the group consisting of an atom, more preferably a fluorine atom), a methyl group and a trifluoromethyl group. The number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other. Suitable substituents substituted with an arylene group, an aryleneoxy group and an arylentio group are a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, preferably a fluorine atom. The arylene group, the aryleneoxy group and the arylentio group are preferably substituted with at least one fluorine atom when Y does not contain a fluorine atom.
上記式（Ｉ）中、Ｙで示される２価の有機基としては、特に制限されないが、例えば、芳香環を有する２価の有機基が挙げられる。詳しくは、１個のベンゼン環からなる基もしくは、２個以上のベンゼン環が炭素原子（すなわち、単結合、またはアルキレン基）、酸素原子、硫黄原子を介してまたは直接結合した構造を有する基が挙げられる。具体的には、以下の基を例示することができる。 In the above formula (I), the divalent organic group represented by Y is not particularly limited, and examples thereof include a divalent organic group having an aromatic ring. Specifically, a group consisting of one benzene ring or a group having a structure in which two or more benzene rings are directly bonded via a carbon atom (that is, a single bond or an alkylene group), an oxygen atom, or a sulfur atom. Can be mentioned. Specifically, the following groups can be exemplified.
Ｙの例である上述した芳香環を有する２価の有機基は、置換可能であれば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子または塩素原子、より好ましくはフッ素原子である）、メチル基およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。芳香環を有する２価の有機基に置換している好適な置換基は、特にＸ０にフッ素原子が含まれない場合は、フッ素原子および／またはトリフルオロメチル基であることが好ましく、より好適にはフッ素原子である。 The above-mentioned divalent organic group having an aromatic ring, which is an example of Y, is a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, preferably a fluorine atom or a chlorine atom, if substitutable. , More preferably a fluorine atom), may be substituted with a group selected from the group consisting of a methyl group and a trifluoromethyl group. The number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other. A suitable substituent substituting a divalent organic group having an aromatic ring is preferably a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, particularly when X 0 does not contain a fluorine atom, and is more preferable. Is a fluorine atom.
スフェロイド形成性の観点から、上記式（Ｉ）中、Ｙはｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される構造であることが好ましく、より好ましくはｅ−１、ｅ−３またはｅ−４の構造である。 From the viewpoint of spheroid formation, Y is a structure selected from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7 in the above formula (I). The structure is preferably e-1, e-3 or e-4.
上記式（Ｉ）中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は、各々同じであってもよく異なっていてもよく、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子から選ばれ、Ｘ０およびＹの少なくとも一方にフッ素原子が含まれない場合、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６の少なくとも１つはフッ素原子であることが好ましい。 In the above formula (I), Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 may be the same or different from each other, and each of them independently has a hydrogen atom and a fluorine atom. , Chlorine atom, bromine atom or iodine atom, and if at least one of X 0 and Y does not contain a fluorine atom, at least one of Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 . One is preferably a fluorine atom.
スフェロイド形成性の観点から、本発明の好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、−Ｃ（ＣＦ３）２−、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される。本発明のより好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、−Ｃ（ＣＦ３）２−、ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｅ−１、ｅ−３およびｅ−４からなる群から選択される。 From the viewpoint of spheroid formation, in a preferred embodiment of the present invention, the divalent organic group represented by X 0 in the above formula (I) is −C (CF 3 ) 2 −, the above b- 2 to b. Selected from the group consisting of -10 and c-2 to c-10; and Y from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7. Be selected. In a more preferred embodiment of the present invention, in the above formula (I), the divalent organic group represented by X 0 is −C (CF 3 ) 2- , b-7 to b-9 and c-7 to. Selected from the group consisting of c-9; and Y is selected from the group consisting of e-1, e-3 and e-4.
上記の式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、酸二無水物とジアミンとの重合により得られるポリアミド酸を焼成する手法により得ることができる。なお、上記「式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂」のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）で表される構成単位のみからなるものであってもよいが、本発明の目的効果が損なわれない範囲において、環状イミド構造が脱水閉環せずにアミド酸のままである構成単位が一部に含まれていてもよい。 The polyimide resin composed of the structural unit represented by the above formula (I) can be obtained by a method of calcining a polyamic acid obtained by polymerizing an acid dianhydride and a diamine. The imidization rate of the above-mentioned "polyimide resin composed of the structural unit represented by the formula (I)" does not have to be 100%. That is, the polyimide resin composed of the structural units represented by the formula (I) may be composed of only the structural units represented by the above formula (I), but as long as the objective effect of the present invention is not impaired. , A structural unit in which the cyclic imide structure remains as an amic acid without dehydration ring closure may be partially contained.
ポリアミド酸合成反応は有機溶媒中で行われることが好適である。ポリアミド酸合成反応に用いられる有機溶媒としては、原料である酸二無水物とジアミンとの反応が効率よく進行でき、かつこれらの原料に対して不活性であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン、アセトン、メチルエチルケトン、イソブチルケトン、メタノール等の極性溶媒；トルエンやキシレン等の非極性溶媒等が挙げられる。中でも、極性溶媒を用いることが好ましい。これらの有機溶媒は、単独で使用されてもよいし、２種以上の混合物として使用されてもよい。アミド化反応後の反応混合物をそのまま熱イミド化に供してもよい。前記ポリアミド酸の溶液中の前記ポリアミド酸の濃度は特に限定されないが、得られる樹脂組成物の重合反応性と重合後の粘度、その後の製膜、焼成での取り扱いやすさから、好ましくは、５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上、好ましくは５０重量％以下、より好ましくは４０重量％以下である。前記ポリアミド酸の粘度は特に限定されるものではないが、公知の測定方法に従って測定することができ、例えば、２３℃において１〜２０Ｐａ・ｓ、好ましくは３〜１５Ｐａ・ｓの範囲内である。 The polyamic acid synthesis reaction is preferably carried out in an organic solvent. The organic solvent used in the polyamic acid synthesis reaction is not particularly limited as long as the reaction between the acid dianhydride as the raw material and the diamine can proceed efficiently and is inert to these raw materials. .. For example, N-methylpyrrolidone (NMP), N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, sulfolane, methyl isobutyl ketone, acetonitrile, benzonitrile, nitrobenzene, nitromethane, acetone, methyl ethyl ketone, isobutyl ketone. , Polar solvents such as methanol; non-polar solvents such as toluene and xylene. Above all, it is preferable to use a polar solvent. These organic solvents may be used alone or as a mixture of two or more. The reaction mixture after the amidation reaction may be directly subjected to thermal imidization. The concentration of the polyamic acid in the polyamic acid solution is not particularly limited, but is preferably 5 from the viewpoint of the polymerization reactivity of the obtained resin composition, the viscosity after the polymerization, and the ease of handling in the subsequent film formation and firing. By weight% or more, more preferably 10% by weight or more, preferably 50% by weight or less, more preferably 40% by weight or less. The viscosity of the polyamic acid is not particularly limited, but can be measured according to a known measuring method, and is, for example, in the range of 1 to 20 Pa · s, preferably 3 to 15 Pa · s at 23 ° C.
前記ポリアミド酸を、熱イミド化または化学イミド化のいずれかによりイミド化して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。特定の実施形態では、前記ポリアミド酸を、加熱処理によりイミド化（熱イミド化）して含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物を得る。熱イミド化で得られたポリイミドは、触媒の残存の可能性がなく、細胞培養用途ではより好ましい。 The polyamic acid is imidized by either thermal imidization or chemical imidization to obtain a resin composition containing a fluorine-containing polyimide. In a specific embodiment, the polyamic acid is imidized (thermally imidized) by heat treatment to obtain a resin composition containing a fluorine-containing polyimide. The polyimide obtained by thermal imidization has no possibility of residual catalyst and is more preferable for cell culture applications.
熱イミド化によりイミド化する場合、例えば、前記ポリアミド酸を、空気中で、またはより好ましくは窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、或いは真空中で、好ましくは温度５０〜４００℃、より好ましくは１００〜３８０℃、好ましくは時間０．１〜１０時間、より好ましくは０．２〜５時間の条件下で焼成してイミド化反応を行うことによりポリイミドを含む樹脂組成物を得ることができる。 When imidizing by thermal imidization, for example, the polyamic acid is placed in air, more preferably in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen, helium, or argon, or in vacuum, preferably at a temperature of 50 to 400 ° C. , More preferably 100 to 380 ° C., preferably 0.1 to 10 hours, more preferably 0.2 to 5 hours, to carry out an imidization reaction to obtain a resin composition containing polyimide. be able to.
熱イミド化反応に供する前記ポリアミド酸は、適当な溶媒中に溶解された形態であることが好ましい。溶媒としては、ポリアミド酸を溶解するものであれば良く、ポリアミド酸合成反応に関して上記した溶媒を用いることもできる。 The polyamic acid to be subjected to the thermal imidization reaction is preferably in a form dissolved in a suitable solvent. The solvent may be any one that dissolves polyamic acid, and the above-mentioned solvent for the polyamic acid synthesis reaction can also be used.
化学イミド化によりイミド化する場合では、適当な溶媒中で後述の脱水環化試薬の使用によりポリアミド酸を直接イミド化することができる。 In the case of imidization by chemical imidization, the polyamic acid can be directly imidized in a suitable solvent by using the dehydration cyclization reagent described later.
前記脱水環化試薬は、ポリアミド酸を化学的に脱水環化してポリイミドとする作用を有するものであれば、特に制限なく用いることができる。このような脱水環化試薬としては、第三級アミン化合物を単独で用いるか、または、第三級アミン化合物とカルボン酸無水物とを組合せて用いることが、イミド化を効率よく促進させうる点で好ましい。 The dehydration cyclization reagent can be used without particular limitation as long as it has an action of chemically dehydrating and cyclizing polyamic acid to form polyimide. As such a dehydration cyclization reagent, the imidization can be efficiently promoted by using the tertiary amine compound alone or by using the tertiary amine compound and the carboxylic acid anhydride in combination. Is preferable.
第三級アミン化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン等が挙げられる。これらの中でも特に、ピリジン、ＤＡＢＣＯ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルジアミノメタンが好ましく、ＤＡＢＣＯがより好ましい。第三級アミン化合物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。 Examples of the tertiary amine compound include trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, tributylamine, pyridine, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO), and 1,8-diazabicyclo [5.4. 0] Undec-7-ene, 1,5-diazabicyclo [4.3.0] Nona-5-ene, N, N, N', N'-tetramethyldiaminomethane, N, N, N', N' -Tetramethylethylenediamine, N, N, N', N'-Tetramethyl-1,3-propanediamine, N, N, N', N'-tetramethyl-1,4-phenylenediamine, N, N, N ', N'-Tetramethyl-1,6-hexanediamine, N, N, N', N'-tetraethylmethylenediamine, N, N, N', N'-tetraethylethylenediamine and the like can be mentioned. Among these, pyridine, DABCO, N, N, N', N'-tetramethyldiaminomethane are preferable, and DABCO is more preferable. The tertiary amine compound may be only one kind or two or more kinds.
カルボン酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水コハク酸、無水マレイン酸等が挙げられる。これらの中でも特に、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸が好ましく、無水酢酸がより好ましい。カルボン酸無水物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。 Examples of the carboxylic acid anhydride include acetic anhydride, trifluoroacetic anhydride, propionic anhydride, butyric anhydride, isobutyric anhydride, succinic anhydride, maleic anhydride and the like. Among these, acetic anhydride and trifluoroacetic anhydride are particularly preferable, and acetic anhydride is more preferable. The carboxylic acid anhydride may be only one kind or two or more kinds.
化学イミド化においてポリアミド酸を溶解する溶媒としては、溶解性に優れる極性溶媒が好適である。例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらの中でも特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリドンからなる群より選ばれる１種以上であることが均一反応をする観点から好ましい。アミド化反応の溶媒としてこれらの溶媒を用いた場合、アミド化反応後の反応混合物からポリアミド酸を分離せずそのまま化学イミド化に用いることができる。 As the solvent that dissolves the polyamic acid in chemical imidization, a polar solvent having excellent solubility is preferable. For example, tetrahydrofuran, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide and the like can be mentioned, and among these, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide and N are particularly mentioned. -It is preferable that at least one selected from the group consisting of methylpyrrolidone is used from the viewpoint of performing a uniform reaction. When these solvents are used as the solvent for the amidation reaction, the polyamic acid can be used as it is for chemical imidization without being separated from the reaction mixture after the amidation reaction.
ポリイミド樹脂の重量平均分子量は、例えば、５，０００〜２，０００，０００、好ましくは８，０００〜１，０００，０００であり、さらに好ましくは２０，０００〜５００，０００である。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後のポリイミド樹脂の重量平均分子量とは実質的に同一であり、本明細書において、樹脂の重量平均分子量は、以下の手法により測定された値である。重量平均分子量が上記範囲であることにより、ポリイミド樹脂の合成および取扱い、フィルム化、スフェロイド形成性がより良好となる。 The weight average molecular weight of the polyimide resin is, for example, 5,000 to 2,000,000, preferably 8,000 to 1,000,000, and more preferably 20,000 to 500,000. The weight average molecular weight of the polyamic acid and the weight average molecular weight of the polyimide resin after firing are substantially the same, and in the present specification, the weight average molecular weight of the resin is a value measured by the following method. .. When the weight average molecular weight is in the above range, the synthesis and handling of the polyimide resin, film formation, and spheroid forming property become better.
（重量平均分子量の測定）
装置：東ソー株式会社製ＨＣＬ−８２２０ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ２Ｏ、リン酸入りＮＭＰ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ
測定方法：０．５重量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
(Measurement of weight average molecular weight)
Equipment: HCL-8220GPC manufactured by Tosoh Corporation
Column: TSKgel Super AWM-H
Eluent (LiBr · H2O, NMP containing phosphoric acid): 0.01 mol / L
Measuring method: A 0.5% by weight solution is prepared with an eluent, and the molecular weight is calculated based on a calibration curve prepared with polystyrene.
細胞接着性物質又は細胞接着性表面［疎水性（特に、超疎水性でない疎水性）の細胞接着性物質又は細胞接着性表面］は、好ましくは、静的水接触角が７０°以上であってもよく、転落角が１５°以上であってもよく、また、静的水接触角が７０°以上かつ転落角が１５°以上であってもよい。
細胞接着性物質又は細胞接着性表面がこのような条件を満たすことにより、スフェロイド形成がより一層促進される。
スフェロイドの接着性およびスフェロイド形成性の観点から、静的水接触角は、より好ましくは７５°以上（例えば、７５°超）であり、さらに好ましくは７７°以上、さらに好ましくは７９°以上、よりさらに好ましくは８０°以上（例えば、８０°超）であり、静的水接触角の上限は、例えば１５０°未満であり、好ましくは１２０°以下（例えば、１２０°未満）であり、より好ましくは１１０°以下であり、さらに好ましくは１００°以下（例えば、９９°未満、９８°以下、９７°以下、９５°以下等）である。
一方、細胞接着性物質又は細胞接着性表面［親水性（特に、超親水性でない親水性）の細胞接着性物質又は細胞接着性表面］は、静的水接触角が６５°以下であってもよく、より好ましくは５５°以下、更に好ましくは５０°以下を有していてもよい。なお、下限値は、０°以上となってもよく、好ましくは５°以上、より好ましくは１０°以上であってもよい。
スフェロイド形成性の観点から、転落角は、１８°以上、１９°以上、２０°以上、２２°以上、２４°以上、２６°以上、２８°以上、３０°以上の順で高いほど好ましい。転落角の上限値は、例えば８０°未満であり、好ましくは７０°以下（例えば、７０°未満）であり、より好ましくは６０°以下（例えば、６０°未満）であり、さらに好ましくは５０°以下（例えば、５０°未満）である。なお、上記の静的水接触角や転落角は、以下の方法により測定される値であってもよい。
The cell-adhesive substance or cell-adhesive surface [hydrophobic (particularly non-superhydrophobic hydrophobic) cell-adhesive substance or cell-adhesive surface] preferably has a static water contact angle of 70 ° or more. The roll angle may be 15 ° or more, and the static water contact angle may be 70 ° or more and the fall angle may be 15 ° or more.
When the cell adhesive substance or the cell adhesive surface satisfies such a condition, spheroid formation is further promoted.
From the viewpoint of spheroid adhesion and spheroid formation, the static water contact angle is more preferably 75 ° or more (for example, more than 75 °), still more preferably 77 ° or more, still more preferably 79 ° or more, and more. More preferably, it is 80 ° or more (for example, more than 80 °), and the upper limit of the static water contact angle is, for example, less than 150 °, preferably 120 ° or less (for example, less than 120 °), and more preferably. It is 110 ° or less, more preferably 100 ° or less (for example, less than 99 °, 98 ° or less, 97 ° or less, 95 ° or less, etc.).
On the other hand, the cell-adhesive substance or cell-adhesive surface [hydrophilic (particularly non-superhydrophilic) hydrophilic substance or cell-adhesive surface] has a static water contact angle of 65 ° or less. It is good, more preferably 55 ° or less, and even more preferably 50 ° or less. The lower limit value may be 0 ° or more, preferably 5 ° or more, and more preferably 10 ° or more.
From the viewpoint of spheroid formation, it is preferable that the falling angle is higher in the order of 18 ° or more, 19 ° or more, 20 ° or more, 22 ° or more, 24 ° or more, 26 ° or more, 28 ° or more, and 30 ° or more. The upper limit of the fall angle is, for example, less than 80 °, preferably 70 ° or less (for example, less than 70 °), more preferably 60 ° or less (for example, less than 60 °), and further preferably 50 °. The following (for example, less than 50 °). The static water contact angle and the fall angle may be values measured by the following method.
（静的水接触角の測定方法）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：表面（細胞非接着性表面又は細胞接着性表面）又はフィルム（細胞非接着性又は細胞接着性の物質で形成したフィルム）上に水２μＬを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する（測定温度：２５℃）。
(Measurement method of static water contact angle)
Equipment: Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: Measure the adhesion angle of the droplet immediately after dropping 2 μL of water on the surface (non-cell adhesive surface or cell adhesion surface) or film (film formed of non-cell adhesion or cell adhesion substance). (Measurement temperature: 25 ° C).
（転落角の測定方法）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：表面（細胞非接着性表面又は細胞接着性表面）又はフィルム（細胞非接着性又は細胞接着性の物質で形成したフィルム）上に水２５μＬを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする（測定温度：２５℃）。
(Measuring method of falling angle)
Equipment: Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: After dropping 25 μL of water on a surface (non-cell adhesive surface or cell adhesive surface) or a film (film formed of non-cell adhesive or cell adhesive substance), the substrate is continuously tilted. The fall angle is defined as the angle at which the cells flow down (measurement temperature: 25 ° C).
細胞接着性表面を構成する樹脂は、可塑剤、酸化防止剤等の添加剤成分をさらに含んでもよい。 The resin constituting the cell adhesive surface may further contain additive components such as a plasticizer and an antioxidant.
細胞接着性を示す表面が、凹部内表面を占める割合としては、特に限定はされないが、例えば、凹部の底面のうち、90％以上、95％以上、99％以上、実質的に底面全てを占めることが好ましい。 The ratio of the surface exhibiting cell adhesion to the inner surface of the recess is not particularly limited, but for example, 90% or more, 95% or more, 99% or more, substantially the entire bottom surface of the recess. Is preferable.
また、前記凹部は、前記した細胞接着性表面以外に、細胞非接着性表面を有するものであってもよい。例えば、凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、底面が細胞接着性表面を有する態様を挙げることができる。かかる構成を有することにより、得られるスフェロイドの均一性を向上することが可能となる。 Further, the recess may have a cell non-adhesive surface in addition to the cell adhesive surface described above. For example, an embodiment in which the inner surface of the recess has a cell non-adhesive surface and the bottom surface has a cell adhesive surface can be mentioned. By having such a configuration, it is possible to improve the uniformity of the obtained spheroid.
細胞非接着性表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状をほとんど変化させず、全く接着しないか又は一時的に弱く接着したとしても自然に脱離する表面のことである。かかる表面は、例えば、細胞非接着性を示す物質が凹部を構成する基材表面に物理的又は化学的に固定されて形成されたものであればよく、基材そのものが細胞非接着性を示す物質からなるものであってもよい。 The non-adhesive surface of cells means, for example, that when cells settle on the surface in a solution used for culturing, the cells hardly change their shape and do not adhere at all or temporarily weakly adhere. It is a surface that naturally detaches even if it does. Such a surface may be formed, for example, by physically or chemically fixing a substance exhibiting cell non-adhesion to the surface of a base material constituting a recess, and the base material itself exhibits cell non-adhesion. It may consist of a substance.
細胞非接着性を示す物質としては、培養に用いる細胞が接着しないか又は用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合しない物質であれば特に限られず用いることができ、生体適合性を有するものであっても、有さないものであってもよい。また、疎水性を示すものであっても親水性を示すものであってもよく、例えば、超撥水性（超疎水性）のものや超親水性のものであってもよい。細胞の非接着性、スフェロイドの均一性および形成性等の観点から、疎水性（特に超疎水性）［例えば、疎水性又は親水性（特に疎水性）の細胞接着性表面又は当該表面を構成する樹脂（さらにはその接触角）に対してより疎水性（特に超疎水性）］を示す物質が特に好ましいが、親水性（特に超親水性）［例えば、親水性又は疎水性（例えば、疎水性）の細胞接着性表面又は当該表面を構成する樹脂（さらにはその接触角）に対してより親水性（特に超親水性）］を示す物質も好ましい。
このような物質の一例を示すと、エチレングリコール及びその誘導体、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)及びその誘導体、HEMA(ヒドロキシエチルメタクリレート)及びその誘導体等を含む化合物あるいはそれら化合物の重合体、SPC(セグメント化ポリウレタン)及びその誘導体等を含む化合物や、生体から取得されたタンパク質(アルブミン等)、細胞が接着しない糖鎖（アガロース、セルロース等）を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。なかでも、細胞接着性表面との接着性の観点から、または、細胞培養用基材の製造工程を簡素化できる観点から、または得られる細胞又はスフェロイドの均一性が向上する観点等から、MPC及びその誘導体あるいはそれらの重合体が好ましい。
なお、物質は、取扱性、所望の疎水性（例えば、超疎水性）・親水性（例えば、超親水性）の程度等に応じて、適宜、変性したものを使用してもよい。例えば、親水性の物質を架橋処理等することで、親水性と水に対する低溶解性を両立させてもよい。また、原料となる物質（例えば、疎水性又は親水性）を、適宜、疎水化処理ないし親水化処理（例えば、疎水性基ないし親水性基の導入等）し、所望の疎水性ないし親水性の材質を得てもよい。
The substance exhibiting cell non-adhesion is not particularly limited as long as it does not adhere to the cells used for culturing or does not bind to cell surface molecules such as proteins and sugar chains present in the cell membrane of the cells used. It may or may not be biocompatible. Further, it may be hydrophobic or hydrophilic, and may be, for example, superhydrophobic (superhydrophobic) or superhydrophilic. From the viewpoint of cell non-adhesiveness, spheroid uniformity and formability, etc., it constitutes a hydrophobic (particularly superhydrophobic) [for example, a hydrophobic or hydrophilic (particularly hydrophobic) cell-adhesive surface or the surface thereof. A substance that is more hydrophobic (particularly superhydrophobic) to the resin (and its contact angle)] is particularly preferred, but hydrophilic (particularly superhydrophilic) [eg, hydrophilic or hydrophobic (eg, hydrophobic). ), Or a substance that is more hydrophilic (particularly superhydrophilic) to the cell-adhesive surface or the resin (and the contact angle thereof) constituting the surface is also preferable.
Examples of such substances include ethylene glycol and its derivatives, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and its derivatives, HEMA (hydroxyethyl methacrylate) and its derivatives, compounds containing them, and polymers of these compounds, SPC. Compounds containing (segmented polyurethane) and its derivatives, proteins (albumin, etc.) obtained from living organisms, and sugar chains (agarose, cellulose, etc.) to which cells do not adhere are appropriately selected and used according to the type of cells. be able to. Among them, from the viewpoint of adhesion to the cell adhesion surface, from the viewpoint of simplifying the manufacturing process of the cell culture substrate, or from the viewpoint of improving the uniformity of the obtained cells or spheroids, MPC and The derivatives or polymers thereof are preferred.
The substance may be appropriately modified according to the handleability, the desired degree of hydrophobicity (for example, superhydrophobicity), hydrophilicity (for example, superhydrophilicity), and the like. For example, hydrophilicity and low solubility in water may be achieved at the same time by cross-linking a hydrophilic substance. Further, the raw material (for example, hydrophobic or hydrophilic) is appropriately hydrophobized or hydrophilized (for example, introduction of a hydrophobic group or a hydrophilic group) to obtain the desired hydrophobic or hydrophilic property. The material may be obtained.
細胞非接着性を示す物質の固定化は、これらを含有する溶液を基材表面上で乾燥させる方法、当該物質を溶融させて圧着する方法、基材に塗布した当該物質をＵＶ等のエネルギー線で硬化させる方法、当該物質が有する官能基と基材上の官能基との間で化学反応(例えば、カルボキシル基やアミノ基等の官能基間の縮合反応等)を起こさせて共有結合を形成させる方法、又は当該物質が有するチオール基と基材に予め形成された金属(プラチナ、金等)薄膜とを結合させる方法により、当該基材表面上に固定化することができる。固定化する際の厚みは特に限定されず、0.01〜1000μmが例示される。 Immobilization of substances exhibiting cell non-adhesiveness includes a method of drying a solution containing these on the surface of a base material, a method of melting and crimping the substance, and an energy ray such as UV applied to the material applied to the base material. A covalent bond is formed by causing a chemical reaction (for example, a condensation reaction between functional groups such as a carboxyl group and an amino group) between the functional group of the substance and the functional group on the base material. It can be immobilized on the surface of the base material by a method of subjecting the substance to a thiol group and a method of binding a metal (platinum, gold, etc.) thin film previously formed on the base material. The thickness at the time of immobilization is not particularly limited, and 0.01 to 1000 μm is exemplified.
細胞非接着性を示す表面が、凹部内表面を占める割合としては、特に限定はされないが、例えば、凹部の内側面を占める割合としては、培養細胞の凹部の内側面への付着性を低減させる程度であることが好ましい。好ましくは内側面の面積の９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは全てを占めることが好ましい。 The proportion of the surface exhibiting cell non-adhesiveness occupying the inner surface of the recess is not particularly limited, but for example, the proportion occupying the inner surface of the recess reduces the adhesion of cultured cells to the inner surface of the recess. It is preferably about. It is preferable to occupy 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably all of the area of the inner surface.
細胞非接着性を示す表面は、形成されるスフェロイドのサイズを均一にしたり、円形度を向上させる観点から、その表面特性として、例えば、前記した静的水接触角を指標として判断することができる。例えば、前記したような物質で形成された疎水性表面である場合、静的水接触角は好ましくは９０°以上、より好ましくは９３°以上、更に好ましくは９５°以上となる。また、１５０°以下となってもよく、好ましくは１３０°以下、より好ましくは１２０°以下である。
一方、親水性表面である場合、静的水接触角は好ましくは６５°以下、より好ましくは５５°以下、更に好ましくは５０°以下となる。また、０°以上となってもよく、好ましくは５°以上、より好ましくは１０°以上である。
一例を挙げると、疎水性が高いMPCポリマー（又は当該MPCで形成された表面）では、静的水接触角が、例えば、９０°以上、１００°以上のような静的水接触角を実現しうる。
なお、このような静的水接触角は、細胞非接着性表面における値であってもよく、細胞非接着性を示す物質（又は細胞非接着性表面を構成する物質）における値であってもよい。
The surface exhibiting cell non-adhesiveness can be determined from the viewpoint of making the size of the formed spheroids uniform and improving the circularity, for example, using the above-mentioned static water contact angle as an index as its surface characteristics. .. For example, in the case of a hydrophobic surface formed of the above-mentioned substance, the static water contact angle is preferably 90 ° or more, more preferably 93 ° or more, still more preferably 95 ° or more. Further, it may be 150 ° or less, preferably 130 ° or less, and more preferably 120 ° or less.
On the other hand, in the case of a hydrophilic surface, the static water contact angle is preferably 65 ° or less, more preferably 55 ° or less, still more preferably 50 ° or less. Further, it may be 0 ° or more, preferably 5 ° or more, and more preferably 10 ° or more.
For example, in a highly hydrophobic MPC polymer (or a surface formed by the MPC), a static water contact angle such as 90 ° or more and 100 ° or more is realized. sell.
In addition, such a static water contact angle may be a value on a cell non-adhesive surface, or may be a value on a substance exhibiting cell non-adhesiveness (or a substance constituting a cell non-adhesive surface). Good.
また、得られるスフェロイドのサイズ均一性や円形度を向上させる点においては、細胞接着性表面と細胞非接着性表面の接着程度のバランスをとることが重要でもある。よって、仮に、細胞非接着性表面が接着性を示すものであっても、細胞接着性表面より低接着性であればよい。例えば、上記の静的水接触角を指標とした場合、細胞接着性表面（又は細胞接着性物質）と細胞非接着性表面（又は細胞非接着性物質）における静的水接触角の差（又はその絶対値）が３°以上（例えば、５°以上）となることが好ましく、１０°以上（例えば、１２°以上）となることがより好ましく、１５°以上となることがさらに好ましい。また、上限は、細胞非接着性物質（表面）及び細胞接着性物質（表面）の疎水性・親水性の組み合わせ等に応じて適宜選択でき、特に限定されないが、例えば、１００°、９０°、８０°、７０°、６０°、５０°、４０°、３０°などであってもよい。 It is also important to balance the degree of adhesion between the cell-adhesive surface and the cell non-adhesive surface in order to improve the size uniformity and circularity of the obtained spheroids. Therefore, even if the non-cell adhesive surface exhibits adhesiveness, it may be less adhesive than the cell adhesive surface. For example, when the above static water contact angle is used as an index, the difference (or) in the static water contact angle between the cell adhesive surface (or cell adhesive substance) and the cell non-adhesive surface (or cell non-adhesive substance) is used. The absolute value) is preferably 3 ° or more (for example, 5 ° or more), more preferably 10 ° or more (for example, 12 ° or more), and further preferably 15 ° or more. The upper limit can be appropriately selected depending on the combination of hydrophobicity and hydrophilicity of the cell non-adhesive substance (surface) and the cell adhesive substance (surface), and is not particularly limited, but for example, 100 °, 90 °, It may be 80 °, 70 °, 60 °, 50 °, 40 °, 30 ° and the like.
凹部は前記した構造を有してもよいが、凹部の辺縁部でもある基材表面も、細胞培養用シート製造の簡便化の観点から細胞非接着性表面を有していてもよい。かかる構成を有することにより、辺縁部に播種された細胞も凹部内にてスフェロイドを形成しやすくなる。基材表面の細胞非接着性表面は、凹部の内側面と同じ細胞非接着性表面であっても、異なる細胞非接着性表面であってもよい。同じ細胞非接着性表面の場合は、基材表面と凹部の内側面は連続した表面を有していてもよい。細胞非接着性を示す表面が、凹部の辺縁部でもある基材表面を占める割合としては、特に限定はされないが、凹部の辺縁部のうち、90％以上、95％以上、99％以上、実質的に辺縁部全てを占めることが好ましい。細胞非接着性を示す表面が、凹部の辺縁部と凹部の内側面との合計を占める割合としては、特に限定はされないが、凹部の辺縁部と凹部の内側面との合計のうち、90％以上、95％以上、99％以上、実質的に辺縁部と内側面全てを占めることが好ましい。 The recess may have the above-mentioned structure, but the surface of the base material, which is also the edge of the recess, may also have a cell non-adhesive surface from the viewpoint of simplifying the production of a cell culture sheet. By having such a configuration, the cells seeded at the marginal portion also easily form spheroids in the recesses. The cell non-adhesive surface of the substrate surface may be the same cell non-adhesive surface as the inner surface of the recess or a different cell non-adhesive surface. In the case of the same cell non-adhesive surface, the surface of the substrate and the inner surface of the recess may have continuous surfaces. The ratio of the surface exhibiting cell non-adhesiveness to the surface of the base material, which is also the edge of the recess, is not particularly limited, but 90% or more, 95% or more, 99% or more of the edge of the recess. , It is preferable to occupy substantially all the margins. The ratio of the surface exhibiting cell non-adhesiveness to the total of the edge of the recess and the inner surface of the recess is not particularly limited, but is the total of the edge of the recess and the inner surface of the recess. It is preferable that 90% or more, 95% or more, 99% or more, substantially all of the edge and the inner surface.
本発明においてスフェロイドの調製に用いる細胞培養用基材としては、得られるスフェロイドのサイズ均一性や接着性を向上させる点においては、例えば、開口部の口径が直径1000μm以下の凹部を複数有し、該凹部の内側面が細胞非接着性表面を有し、かつ、該凹部の底面が細胞接着性表面を有する細胞培養用基材を挙げることができる。また、前記細胞培養用基材は、凹部の底面を含む層と凹部の内側面を含む層を含む層状構造物であってもよい。ここで、凹部の内側面を含む層とは、層自体は貫通孔を有する層を構成している。本発明で用いることができる細胞培養用基材の一態様として、例えば、貫通孔を有する細胞非接着性表面を有する層と、細胞接着性表面を有する層との積層物である細胞培養用シートを挙げることができる。 As the cell culture substrate used for the preparation of spheroids in the present invention, in terms of improving the size uniformity and adhesion of the obtained spheroids, for example, the opening has a plurality of recesses having a diameter of 1000 μm or less. Examples thereof include a cell culture substrate having an inner surface of the recess having a non-cell adhesive surface and a bottom surface of the recess having a cell adhesive surface. Further, the cell culture substrate may be a layered structure including a layer including the bottom surface of the recess and a layer including the inner surface of the recess. Here, the layer including the inner side surface of the recess constitutes a layer having a through hole. As one aspect of the cell culture substrate that can be used in the present invention, for example, a cell culture sheet that is a laminate of a layer having a cell non-adhesive surface having through holes and a layer having a cell adhesive surface. Can be mentioned.
細胞非接着性表面を有する層は、細胞非接着性を示す物質を層状の基材に固定化したものであっても、細胞非接着性を示す物質からなる層であってもよいが、貫通孔を形成する観点から、または細胞培養用シートの製造を簡略化する観点から、細胞非接着性を示す物質を層状の基材に固定化したものが好ましい。このような形態とすることにより、細胞培養用シートの製造がより簡便となり、さらに例えば基材に貫通孔または凹部を形成してから細胞非接着性を示す物質を固定すること等により、細胞培養用シートの凹部形成に伴い細胞非接着表面がダメージを受けることを無くすことも可能となるため、細胞培養用シートの細胞培養特性向上の観点からも好ましい。 The layer having a cell non-adhesive surface may be a layer in which a substance exhibiting cell non-adhesion is immobilized on a layered substrate, or a layer composed of a substance exhibiting cell non-adhesion, but it penetrates. From the viewpoint of forming pores or simplifying the production of a cell culture sheet, a substance exhibiting non-adhesive cells is preferably immobilized on a layered substrate. With such a form, the production of a cell culture sheet becomes simpler, and further, for example, by forming through holes or recesses in the base material and then fixing a substance exhibiting non-adhesiveness to cells, cell culture is performed. Since it is possible to prevent the non-adherent cell surface from being damaged due to the formation of recesses in the cell culture sheet, it is also preferable from the viewpoint of improving the cell culture characteristics of the cell culture sheet.
層状の基材としては、当該技術分野で公知のものであれば用いることができる。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、ポリシクロオレフィン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、シリコン等の合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ethylene Propylene Diene Monomer）等の合成ゴムや天然ゴム、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料等からなる板状体が挙げられる。透明基材であることも好ましい形態の一つである。 As the layered base material, any material known in the art can be used. For example, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyamide, polyacetal, polyester (polyethylene terephthalate, etc.), polyurethane, polysulfone, polyacrylate, polymethacrylate, polyvinyl, polycycloolefin, polyetherketone, polyetheretherketone, polyimide, silicon, etc. Examples thereof include synthetic resins of the above, synthetic rubbers such as EPDM (Ethylene Propylene Diene Monomer), and plate-like bodies made of metal materials such as natural rubbers, glass, ceramics, and stainless steel. A transparent substrate is also one of the preferable forms.
層状の基材への細胞非接着性を示す物質の固定化は、前記した凹部の内側面に細胞非接着性を示す物質を固定化する方法と同様に行うことができる。なお、作業性の観点から、後述の貫通孔を形成してから、固定化を行うことが好ましい。 Immobilization of the substance exhibiting cell non-adhesiveness on the layered substrate can be performed in the same manner as the method for immobilizing the substance exhibiting cell non-adhesiveness on the inner surface of the recess. From the viewpoint of workability, it is preferable to perform immobilization after forming the through hole described later.
細胞非接着性表面を有する層は、好ましくは細胞培養用シートのシート表面と貫通孔を含む。前記貫通孔は、好ましくはその壁が前記した凹部の内側面に相当するものであり、開口部やその反対の端部の口径や形状は、前記した凹部と同様に設定することができる。また、貫通孔の深さは細胞非接着性表面を有する層の厚みに相当するが、前記した凹部の深さにも相当し、凹部と同様に設定することができる。なお、細胞非接着性を示す物質を層状の基材に固定化する場合は、細胞非接着性を示す物質の層として、例えば、1nm以上であることが好ましく、10nm以上であることがより好ましく、細胞非接着性を示す物質の層と基材を含めた層全体の厚みが、前記した細胞非接着性表面を有する層の厚みの範囲内になるのであれば適宜設定することができる。 The layer having the cell non-adhesive surface preferably includes the sheet surface and the through hole of the cell culture sheet. The through hole preferably has a wall corresponding to the inner surface of the recess, and the diameter and shape of the opening and the opposite end can be set in the same manner as the recess. Further, the depth of the through hole corresponds to the thickness of the layer having the cell non-adhesive surface, but also corresponds to the depth of the recess mentioned above, and can be set in the same manner as the recess. When a substance exhibiting cell non-adhesiveness is immobilized on a layered substrate, the layer of the substance exhibiting cell non-adhesiveness is preferably, for example, 1 nm or more, and more preferably 10 nm or more. If the thickness of the entire layer including the layer of the substance exhibiting non-cell adhesion and the base material is within the range of the thickness of the layer having the non-adhesive surface of cells, it can be appropriately set.
貫通孔の形成は、前記したサイズの貫通孔が形成できるのであれば特に限定されず、実施することができる。例えば、穿孔加工(ドリル等)、光微細加工(レーザー(例えば、CO2レーザー、エキシマレーザー、半導体レーザー、YAGレーザー)等)、エッチング加工、エンボス加工等により形成することができる。前記加工において、貫通孔の形状がテーパー形状になるような加工であってもよく、その際に、端部の周囲が変形し、開口部の辺縁部と、開口部と隣接する開口部の中間領域に位置する部分の層厚みが異なるような構造を形成してもよい。 The formation of the through hole is not particularly limited as long as the through hole of the above size can be formed, and the through hole can be formed. For example, it can be formed by drilling (drilling or the like), optical micromachining (laser (for example, CO 2 laser, excimer laser, semiconductor laser, YAG laser), etc.), etching processing, embossing processing or the like. In the above-mentioned processing, the shape of the through hole may be tapered, and at that time, the periphery of the end portion is deformed, and the edge portion of the opening portion and the opening portion adjacent to the opening portion are formed. A structure may be formed in which the layer thicknesses of the portions located in the intermediate region are different.
細胞接着性表面を有する層は、細胞接着性を示す物質を層状の基材に固定化したものであっても、細胞接着性を示す物質からなる層であってもよい。 The layer having a cell adhesion surface may be a layer in which a substance exhibiting cell adhesion is immobilized on a layered base material, or a layer made of a substance exhibiting cell adhesion.
細胞接着性表面を有する層の厚みは、例えば、1nm以上、4mm以下であり、1μm以上、1mm以下であることが好ましく、前記した凹部の底面の厚みと同じであっても良い。 The thickness of the layer having the cell adhesion surface is, for example, 1 nm or more and 4 mm or less, preferably 1 μm or more and 1 mm or less, and may be the same as the thickness of the bottom surface of the recess.
細胞培養用シートとしては、前記した細胞接着性表面を有する層と細胞非接着性表面を有する層との間に、さらに接着層（粘着層）を含む態様も含む。 The cell culture sheet also includes an embodiment including an adhesive layer (adhesive layer) between the layer having the cell adhesive surface and the layer having the cell non-adhesive surface.
接着層としては、当該技術分野で公知のものであれば用いることができる。例えば、シリコン系樹脂、合成ゴム、天然ゴムなどが挙げられ、好ましくは低溶出性の接着層を用いることができる。好ましくは市販の両面テープなどを用いてもよい。 As the adhesive layer, any one known in the art can be used. For example, silicon-based resin, synthetic rubber, natural rubber and the like can be mentioned, and a low-elution adhesive layer can be preferably used. A commercially available double-sided tape or the like may be preferably used.
接着層の厚みは、特に限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、適宜設定することができる。例えば、0.5〜100μmが例示される。 The thickness of the adhesive layer is not particularly limited and can be appropriately set as long as the effect of the present invention is not impaired. For example, 0.5 to 100 μm is exemplified.
細胞培養用シートは、上記以外の層が積層されていても良く、空洞を有する層が積層されていても良い。 The cell culture sheet may be laminated with layers other than the above, or may be laminated with layers having cavities.
細胞培養用シートは、厚みは特に限定されないが、取り扱い性の観点から、10〜5000μmが好ましく、100〜2000μmがより好ましい。また、シート面積も特に限定されず、例えば、0.01〜10000cm2、好ましくは0.03〜5000cm2が例示される。 The thickness of the cell culture sheet is not particularly limited, but from the viewpoint of handleability, it is preferably 10 to 5000 μm, more preferably 100 to 2000 μm. The sheet surface area is not particularly limited, for example, 0.01～10000Cm 2, preferably 0.03～5000Cm 2 is illustrated.
前記細胞培養用シートは、公知の細胞培養装置にそのまま設置したものでもよい。また、対象装置の大きさに合わせて、適宜サイジング加工したものであってもよい。例えば、該シートを培養ディッシュ、フラスコ、培養バック等の各種細胞培養用容器に収容して固定し、該容器に細胞を含む培地を加えて培養を実施することができる。また、前記細胞培養用シートを設置した細胞培養用器具自体が、シングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、培養シャーレ、培養ディッシュ、フラスコ、培養バック等の各種細胞培養用容器の形態であってもよい。 The cell culture sheet may be directly installed in a known cell culture device. Further, it may be appropriately sized according to the size of the target device. For example, the sheet can be stored and fixed in various cell culture containers such as a culture dish, a flask, and a culture bag, and a medium containing cells can be added to the container to carry out the culture. Further, the cell culture device itself on which the cell culture sheet is installed is in the form of a culture plate such as a single or multi-well plate, and various cell culture containers such as a culture chalet, a culture dish, a flask, and a culture bag. You may.
細胞を培養する際に使用する培地や条件は、使用する細胞に応じて適宜設定することができる。なお、前記細胞培養用シート又は該シートを設置した細胞培養用器具を使用する際に、必要に応じて予め脱泡処理を行うことが好ましい。脱泡処理としては、特に限定されず、霧吹き、ピペッティング、振盪、加温冷却などの温度変化、遠心処理、真空脱気、超音波処理などの一般的な処理を行うことができ、好ましいのは、霧吹き、ピペッティング、温度変化である。 The medium and conditions used for culturing the cells can be appropriately set according to the cells to be used. When using the cell culture sheet or the cell culture device on which the sheet is installed, it is preferable to perform defoaming treatment in advance if necessary. The defoaming treatment is not particularly limited, and general treatments such as temperature change such as spraying, pipetting, shaking, heating and cooling, centrifugal treatment, vacuum deaeration, and sonication can be performed, which is preferable. Are spraying, pipetting, and temperature changes.
前記細胞培養用シートを用いることにより、区画分けされた形状（複数の凹部により形成される形状）により、播種細胞がソートされ、また、基材が保有する適度な付着性が発揮されることから、得られるスフェロイドの均一性が向上する。また、前記適度な付着性により、培養作業時の取扱いに優れ、細胞培養用シート又は細胞培養用器具を揺する又は軽くピペッティングするだけで、スフェロイドを回収することもできる。前記細胞培養用シートは、開口部の口径が1000μm以下といった微細な凹部であるにも関わらず、それぞれの凹部にて、細胞接着性の底面とそれを囲む細胞非接着性の内側面によって特殊な接着環境が形成されることになって、得られるスフェロイドのサイズ均一性や円形度が向上するだけでなく、収率も向上するという効果が奏されると推定される。但し、本発明は、これらの推測に拘束されるものではない。 By using the cell culture sheet, the seeded cells are sorted according to the partitioned shape (shape formed by a plurality of recesses), and the appropriate adhesion possessed by the base material is exhibited. , The uniformity of the resulting spheroids is improved. In addition, due to the appropriate adhesiveness, it is excellent in handling during culturing work, and spheroids can be recovered by simply shaking or lightly pipetting the cell culturing sheet or cell culturing instrument. Although the cell culture sheet has fine recesses having an opening diameter of 1000 μm or less, each recess is special due to the cell-adhesive bottom surface and the cell non-adhesive inner surface surrounding the recess. It is presumed that the formation of an adhesive environment not only improves the size uniformity and circularity of the obtained spheroids, but also improves the yield. However, the present invention is not bound by these speculations.
得られるスフェロイドの直径は、特に限定されないが、例えば10〜1000μm、好ましくは10〜800μmである。ここで、スフェロイドの直径は、常法(例えば、画像解析ソフト、粒度分布計)により測定することが可能であり、例えば、流体直径、円相当径として表示されうる。得られるスフェロイドは、円形度が例えば、0.5〜1.0、好ましくは0.7〜1.0である。 The diameter of the obtained spheroid is not particularly limited, but is, for example, 10 to 1000 μm, preferably 10 to 800 μm. Here, the diameter of the spheroid can be measured by a conventional method (for example, image analysis software, particle size distribution meter), and can be displayed as, for example, a fluid diameter or a circle-equivalent diameter. The resulting spheroid has a circularity of, for example, 0.5 to 1.0, preferably 0.7 to 1.0.
上述したスフェロイドを有効成分として含有する本発明に係る剤は、骨組織又は歯周組織における欠損部位や損傷部位の、修復、復元又は再生の用途に使用でき、前述のように、例えば、骨再生用（骨再生剤、骨補填剤）等として使用しうる。また、本発明に係る剤の適用分野は、特に制限されず、例えば、骨再生医療などの分野の他、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用できる。 The agent according to the present invention containing the above-mentioned spheroid as an active ingredient can be used for repair, restoration or regeneration of a defective or damaged site in bone tissue or periodontal tissue, and as described above, for example, bone regeneration. It can be used for purposes (bone regenerating agent, bone filling agent), etc. The fields of application of the agent according to the present invention are not particularly limited, and for example, in addition to fields such as bone regeneration medicine, cranial, jaw, and facial restoration surgery, cosmetic surgery, plastic surgery, orthopedics, oral surgery, and otolaryngology. It can be applied to fields such as throat surgery and dentistry.
また、本発明の剤は、骨組織関連疾患の予防または治療剤等として使用することもできる。上記のように、本発明の剤は、骨再生を伴いうるため、骨組織関連疾患の予防や治療用等として好適である。 In addition, the agent of the present invention can also be used as a prophylactic or therapeutic agent for bone tissue-related diseases. As described above, since the agent of the present invention may be accompanied by bone regeneration, it is suitable for prevention and treatment of bone tissue-related diseases.
骨組織関連疾患とは、骨組織に関連した疾患であり、骨の再生によって症状が改善しうる任意の疾患を意味する。骨組織関連疾患としては、例えば、変形性関節症、離断性骨軟骨炎、関節軟骨損傷、骨折、難治性骨折、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、痛風性関節炎、偽痛風性関節炎、骨形成不全症、骨粗鬆症などが挙げられる。 Bone tissue-related disease is a disease related to bone tissue and means any disease whose symptoms can be improved by bone regeneration. Bone tissue-related diseases include, for example, osteoarthritis, transected osteochondritis, articular cartilage injury, fractures, refractory fractures, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, spondyloarthritis, gouty arthritis, pseudogouty arthritis, etc. Examples include osteodysplasia and osteoarthritis.
本発明の一態様として、下記の態様も含む。
・間葉系幹細胞を含むスフェロイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、骨再生方法。
・骨再生に用いられる、間葉系幹細胞を含むスフェロイド。
・骨再生のための医薬の製造における、間葉系幹細胞を含むスフェロイドの使用。
As one aspect of the present invention, the following aspects are also included.
A method of bone regeneration comprising administering a spheroid containing mesenchymal stem cells to a patient in need thereof.
-A spheroid containing mesenchymal stem cells used for bone regeneration.
-Use of spheroids containing mesenchymal stem cells in the manufacture of drugs for bone regeneration.
本発明の一態様として、下記の態様も含む。
・間葉系幹細胞を含むスフェロイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、骨組織関連疾患の予防または治療方法。
・骨組織関連疾患の予防または治療に用いられる、間葉系幹細胞を含むスフェロイド。
・骨組織関連疾患の予防または治療のための医薬の製造における、間葉系幹細胞を含むスフェロイドの使用。
As one aspect of the present invention, the following aspects are also included.
A method for preventing or treating a bone tissue-related disease, which comprises administering a spheroid containing mesenchymal stem cells to a patient who needs it.
-A spheroid containing mesenchymal stem cells used for the prevention or treatment of bone tissue-related diseases.
-Use of spheroids containing mesenchymal stem cells in the manufacture of drugs for the prevention or treatment of bone tissue-related diseases.
本発明に係るスフェロイドは、間葉系幹細胞を有効成分として含有するものであることにより、TGFβ1（Transforming Growth Factor（腫瘍増殖因子）-β1）遺伝子を優位に発現している。TGFβ1は、TGF-βスーパーファミリーの一種であり、哺乳動物のTGF-βには、β１、β２及びβ３の３つのアイソフォームが存在している。TGFβ1は細胞増殖のほか、成長、分化や運動性の調節といった機能を担っており、胚形成、組織再構築や創傷治療などの生理的機能にも関与しているが、前記遺伝子の発現量の増加により、軟骨細胞や骨芽細胞などにも作用を及ぼし骨形成に何らかの作用を示すことができる。また、前記スフェロイドは、抗炎症に関係するタンパク質及び／又はそれをコードする遺伝子を発現している。抗炎症に関係するタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、TSG-6（Tumor necrosis factor (TNF)-stimulated gene 6）を指標として評価することができる。TSG-6は、ヒアルロン酸結合ドメインを有するヒアルロン酸結合タンパク質の一種であり、前記ヒアルロン酸結合ドメインは細胞外マトリックスの安定性と細胞移動に関与している。また、TSG-6は、インターα阻害剤（inter-alpha-inhibitor; IαI）と共有及び／又は非共有結合複合体を形成すると、IαIのセリンプロテアーゼ活性を増強する。前記抗炎症に関係するタンパク質の発現により、骨の再生や抗炎症効果を奏することから、骨組織関連疾患の予防・治療効果に優れるものと推定している。すなわち、本発明に係るスフェロイドは、骨再生や抗炎症の作用効果または作用機序を有しているといえる。 Since the spheroid according to the present invention contains mesenchymal stem cells as an active ingredient, it predominantly expresses the TGFβ1 (Transforming Growth Factor (tumor growth factor) -β1) gene. TGFβ1 is a member of the TGF-β superfamily, and there are three isoforms of β1, β2, and β3 in mammalian TGF-β. In addition to cell proliferation, TGFβ1 is responsible for functions such as growth, differentiation and regulation of motility, and is also involved in physiological functions such as embryogenesis, tissue remodeling and wound treatment. By increasing, it can also act on chondrocytes and osteoblasts and exert some effect on bone formation. In addition, the spheroid expresses a protein related to anti-inflammatory and / or a gene encoding the same. The protein related to anti-inflammatory is not particularly limited, but for example, TSG-6 (Tumor necrosis factor (TNF) -stimulated gene 6) can be evaluated as an index. TSG-6 is a type of hyaluronic acid-binding protein having a hyaluronic acid-binding domain, and the hyaluronic acid-binding domain is involved in extracellular matrix stability and cell migration. In addition, TSG-6 enhances the serine protease activity of IαI when it forms a covalent and / or non-covalent complex with an inter-alpha-inhibitor (IαI). It is presumed that the expression of the protein related to anti-inflammatory exerts a bone regeneration and anti-inflammatory effect, and thus has an excellent preventive / therapeutic effect on bone tissue-related diseases. That is, it can be said that the spheroid according to the present invention has an action effect or mechanism of action of bone regeneration and anti-inflammatory.
本発明に係る剤は、従来公知の細胞製剤における知見を参照しつつ、同様にして調製、保管、投与することが可能である。本発明に係る剤は、通常、注射剤の形態を有する。注射剤を調製する場合は、有効成分にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、および局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸食塩水などが挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、およびチオ乳酸などが挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、および塩酸リドカインなどが挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびブドウ糖などが例示されうる。 The agent according to the present invention can be prepared, stored, and administered in the same manner with reference to the findings in conventionally known cell preparations. The agent according to the present invention usually has the form of an injection. When preparing an injection, add a pH regulator, buffer, stabilizer, isotonic agent, local anesthetic, etc. to the active ingredient, and use a conventional method to make subcutaneous, intramuscular, and intravenous injections. Can be manufactured. Examples of the pH adjuster and buffer in this case include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate, and saline phosphate. Stabilizers include sodium metabisulfite, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), thioglycolic acid, thiolactic acid and the like. Examples of the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride. Examples of the tonicity agent include sodium chloride and glucose.
本発明に係る剤はまた、有効成分に加え、必要に応じて、一般的に用いられる各種の添加剤成分をさらに含みうる。 In addition to the active ingredient, the agent according to the present invention may further contain various commonly used additive components, if necessary.
本発明に係る剤に含有される有効成分の量は、当該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定されうる。 The amount of the active ingredient contained in the agent according to the present invention can be appropriately determined depending on the dose range of the active ingredient, the number of doses, and the like.
本発明に係る剤の投与方法としては、損傷部への局所投与のほか、関節内、髄腔内、静脈内、皮下組織内、筋肉内などへの注射投与を含み、これらに限られない。 The method for administering the agent according to the present invention includes, and is not limited to, topical administration to the injured part, injection administration into joints, intramedullary space, intravenous, subcutaneous tissue, intramuscular, and the like.
用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜設定されうる。 The dose range is not particularly limited, and the efficacy of the contained ingredients, the form of administration, the route of administration, the type of disease, the nature of the subject (weight, age, medical condition and the use of other drugs, etc.), and the doctor in charge It can be set as appropriate according to the judgment.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、室温とは２０〜３０℃を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In the following examples, room temperature means 20 to 30 ° C.
調製例１：細胞培養用シート
＜細胞接着性表面を有する層の調製（含フッ素ポリイミドフィルムの調製）＞
100mL容量の三口フラスコに、１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン2.976ｇ(10.2ミリモル)、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物4.524g(10.2ミリモル)、Ｎ−メチルピロリドン42.5gを仕込んだ。窒素雰囲気下室温で撹拌後、５日間保持することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度15.0質量％、６ＦＤＡ／ＴＰＥＱポリアミド酸）を得た。該ポリアミド酸の粘度は6Pa・sであった。
Preparation Example 1: Cell culture sheet <Preparation of layer having cell adhesive surface (preparation of fluorine-containing polyimide film)>
2.976 g (10.2 mmol) of 1,4-bis (aminophenoxy) benzene, 4.524 g (10.2 mmol) of 4,4'-hexafluoroisopropyridene diphthalic acid anhydride, 42.5 of N-methylpyrrolidone in a 100 mL volumetric flask. I prepared g. After stirring at room temperature in a nitrogen atmosphere and holding for 5 days, a fluorine-containing polyamic acid resin composition (solid content concentration 15.0% by mass, 6FDA / TPEQ polyamic acid) was obtained. The viscosity of the polyamic acid was 6 Pa · s.
上記で得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが40μmとなるようにダイコーターを用いてガラス基体上に塗布し、塗膜を形成した。次いで、360℃にて１時間、窒素雰囲気下で塗膜の焼成を行った。その後、焼成物をガラス基体から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルムを得た。この含フッ素ポリイミドフィルムの静的水接触角は80.8°、転落角は23.8°であった。 The fluorine-containing polyamic acid resin composition obtained above was applied onto a glass substrate using a die coater so that the thickness of the fluorine-containing polyimide film after firing was 40 μm to form a coating film. Then, the coating film was fired at 360 ° C. for 1 hour in a nitrogen atmosphere. Then, the fired product was peeled off from the glass substrate to obtain a fluorine-containing polyimide film. The static water contact angle of this fluorine-containing polyimide film was 80.8 °, and the fall angle was 23.8 °.
上記における物性の測定方法は以下の通りである。
（粘度の測定）
装置：アズワン製 粘度計 VISCOMETER TV-22
設定：VI RANGE：H ROTOR No.6 SPEED：10rpm
粘度計校正用標準液：日本グリース（株） JS 14000
測定方法：粘度計校正用標準液で校正後、ワニス0.3gを用いて測定する。（測定温度：２３℃）
（静的水接触角の測定）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２μＬを滴下した直後の液滴の付着角度を測定する（測定温度：２５℃）。
（転落角の測定）
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２５μＬを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とする（測定温度：２５℃）。
The method for measuring the physical properties in the above is as follows.
(Measurement of viscosity)
Equipment: AS ONE Viscometer VISCOMETER TV-22
Setting: VI RANGE: H ROTOR No.6 SPEED: 10rpm
Standard solution for viscometer calibration: Nippon Grease Co., Ltd. JS 14000
Measuring method: After calibrating with a standard solution for viscometer calibration, measure with 0.3 g of varnish. (Measurement temperature: 23 ° C)
(Measurement of static water contact angle)
Equipment: Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: Measure the adhesion angle of the droplet immediately after dropping 2 μL of water on the film (measurement temperature: 25 ° C.).
(Measurement of falling angle)
Equipment: Automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: After 25 μL of water is dropped on the film, the base material is continuously tilted, and the angle at which it flows down is defined as the fall angle (measurement temperature: 25 ° C.).
＜細胞非接着性表面を有する層の調製＞
両面テープ(厚み25μm)の片面の剥離テープを剥離後透明なPETフィルム(厚み250μm)に貼り合わせたものに対して、CO2レーザーを用いて、直径300μm、ピッチ500μmで千鳥配置の貫通孔を形成した(形成された貫通孔：400個/cm2レーザー入射側孔径500μm、レーザー放出側孔径300μm)。その後、PETフィルム側の表面にMPCポリマー溶液（0.5％エタノール溶液、疎水性MPCポリマー）を厚みが0.05μmとなるようにコーティングし、50℃の乾燥機内で2時間乾燥処理して、細胞非接着性表面を有する層［PETフィルムのコーティング層（MPCポリマーのコーティング層）側の静的水接触角107.5°］を得た。
<Preparation of layer with non-cell adhesive surface>
A single-sided release tape (thickness 25 μm) is attached to a transparent PET film (thickness 250 μm) after peeling, and a CO 2 laser is used to make staggered through holes with a diameter of 300 μm and a pitch of 500 μm. Formed (through holes formed: 400 pieces / cm 2 laser incident side hole diameter 500 μm, laser emitting side hole diameter 300 μm). After that, the surface on the PET film side was coated with an MPC polymer solution (0.5% ethanol solution, hydrophobic MPC polymer) to a thickness of 0.05 μm, and dried in a dryer at 50 ° C. for 2 hours to prevent cell adhesion. A layer having a property surface [static water contact angle 107.5 ° on the PET film coating layer (MPC polymer coating layer) side] was obtained.
＜細胞培養用シート・細胞培養用容器の調製＞
次いで、細胞非接着性表面を有する層の両面テープのもう一方の剥離テープを除去した側の面に、上記で作製した細胞接着性表面を有する層を貼りあわせて、細胞培養用シートを調製した(シート厚み：315μm)。得られた細胞培養用シートを培養プレート内へ設置し、細胞培養に用いる容器を完成した。
<Preparation of cell culture sheet / cell culture container>
Next, the layer having the cell-adhesive surface prepared above was attached to the surface on the side from which the other release tape of the double-sided tape having the cell non-adhesive surface was removed to prepare a cell culture sheet. (Sheet thickness: 315 μm). The obtained cell culture sheet was placed in a culture plate to complete a container used for cell culture.
実施例１
細胞は、GFP遺伝子導入Lewis系ラットから抽出した脂肪由来幹細胞を用いた。
Example 1
As cells, adipose-derived stem cells extracted from GFP-transfected Lewis rats were used.
＜脱泡処理＞
調製例１の細胞培養用容器の脱泡処理を行った。具体的には、容器に1mL程度のPBSを加えてピペッティングの作業を行い、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で15分間静置した。次いで、PBSをアスピレーターで吸引し、1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地を0.2mL加えて、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で１晩静置した。
<Defoaming treatment>
The cell culture container of Preparation Example 1 was defoamed. Specifically, about 1 mL of PBS was added to the container for pipetting work, and the container was allowed to stand in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C for 15 minutes. PBS was then aspirated with an ejector, 0.2 mL of KBM ADSC-2 medium containing 1% antibiotic was added, and the mixture was allowed to stand overnight in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C.
＜スフェロイドの作製＞
予め幹細胞を培養している培養用フラスコから培地を除去し、細胞剥離液アキュターゼTM(プロモセル製)を5mL添加した後、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で５分程度保持して細胞を剥離した。次いで、剥離液を回収し、PBSを10mL加えて洗浄してチューブへ移した。210×gで5分間遠心処理を施し、1mLの1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地で懸濁させて、細胞数のカウントを行った。その後、1.0×106細胞/mLの濃度となるように調製した。
37℃の5％(v/v)CO2インキュベーター内で１晩静置して脱泡処理を行った細胞培養用容器の培地を除去し、500細胞/穴となるように細胞を播種した。安全キャビネット内で15分静置した後、37℃の5％(v/v)CO2インキュベーターに入れて４時間静置した。次いで、追加で1％抗生物質を含んだKBM ADSC-2培地を加え、再び37℃の5％(v/v)CO2インキュベーターに入れて3日間培養し、直径が約150μmのスフェロイドを得た。
<Making spheroids>
Remove the medium from the culture flask in which the stem cells are cultured in advance, add 5 mL of cell exfoliating solution Accutase TM (manufactured by Promocell), and then hold in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C for about 5 minutes. The cells were detached. Then, the stripping solution was collected, 10 mL of PBS was added, washed, and transferred to a tube. The cells were counted by centrifuging at 210 xg for 5 minutes and suspending in 1 mL of KBM ADSC-2 medium containing 1% antibiotic. Then, the concentration was adjusted to 1.0 × 10 6 cells / mL.
The cells were allowed to stand overnight in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. to remove the medium of the defoamed cell culture vessel, and the cells were seeded to 500 cells / hole. After standing in a safety cabinet for 15 minutes, it was placed in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C and left to stand for 4 hours. Then, KBM ADSC-2 medium containing an additional 1% antibiotic was added, and the cells were placed again in a 5% (v / v) CO 2 incubator at 37 ° C. and cultured for 3 days to obtain spheroids having a diameter of about 150 μm. ..
試験例１（in vivo実験）
8週齢Lewis系ラット10匹の両側大腿骨滑車部にφ1.6mmの骨軟骨欠損を作製し、右膝に実施例１の脂肪由来幹細胞のスフェロイドを20個、左膝に脂肪由来幹細胞の単一細胞1.0×104個を投与した。また、ブランクとして、同様に骨軟骨欠損を作製し、そこにPBSを投与したものを用意した。4週後の修復組織の肉眼的評価、HE染色、トルイジンブルー染色、GFP及びII型コラーゲン、マッソントリクロームの免疫組織化学染色を用いて組織学的評価を行った。２週後、４週後及び１２週後の修復組織について、HE染色及びトルイジンブルー染色を用いて組織学的評価を行った。
Test Example 1 (in vivo experiment)
Ten 8-week-old Lewis rats had osteochondral defects of φ1.6 mm on both sides of the femur, 20 spheroids of the adipose-derived stem cells of Example 1 in the right knee, and a single adipose-derived stem cell in the left knee. One cell 1.0 × 10 4 cells were administered. In addition, as a blank, an osteochondral defect was prepared in the same manner, and a product to which PBS was administered was prepared. Histological evaluation was performed using gross evaluation of the repaired tissue after 4 weeks, HE staining, toluidine blue staining, and immunohistochemical staining of GFP and type II collagen and Masson trichrome. The repaired tissues after 2, 4, and 12 weeks were histologically evaluated using HE staining and toluidine blue staining.
結果、スフェロイド投与群では、4週経過時点で肉眼的に軟骨様組織での修復像を認め、組織学的にもトルイジンブルー染色で異染性が確認できた(図１)。同時にII型コラーゲンも陽性を示し(図２)、Wakitani scoreによる評価では、単一細胞投与群と比較し、スフェロイド投与群で軟骨構造の有意な改善を認めた(表１、図３)。また、GFP免疫染色では４週後の修復組織における軟骨様細胞で陽性を認めた(図１)ことから、修復された軟骨様細胞は脂肪由来幹細胞が直接分化した可能性が考えられた。さらにスフェロイド投与群では軟骨の修復（図1：欠損上部の軟骨の写真）ならびにマッソントリクローム軟骨下骨の修復も良好であることが確認された(図４：新生骨増加率評価)。なお、マッソントリクローム染色では、染色が濃い部分が骨化した部分、染色が淡い部分もしくは白い部分が未骨化の部分、肉芽組織であり、新生骨増加率としては、軟骨を除く欠損部分を選択した後、ImageJで2値化し、当該部分における濃い部分を検出して面積率を算出し、解析を行った。HE染色では、スフェロイド投与群において、２週経過時点で欠損孔の底部から骨の修復を確認でき、４週経過時点で軟骨様細胞の形成が確認でき、また、１２週経過時点ではスフェロイド投与群、単一細胞投与群共に、軟骨下骨の修復が確認でき、さらにスフェロイド投与群で単一細胞投与群よりもしっかりとした骨りょう構造を呈していた（図５）。また、トルイジンブルー染色では、スフェロイド投与群において、４週経過時点で旺盛な軟骨様細胞の確認、軟骨基質の再生に加え、海綿骨再生能も促進している様子が確認できた（図６）。 As a result, in the spheroid-administered group, a repair image of cartilage-like tissue was visually observed after 4 weeks, and histologically, toluidine blue staining confirmed that it was heterozygous (Fig. 1). At the same time, type II collagen was also positive (Fig. 2), and the evaluation by Wakitani score showed a significant improvement in cartilage structure in the spheroid-administered group compared with the single-cell administration group (Table 1, Fig. 3). In addition, GFP immunostaining showed positive results in cartilage-like cells in the repaired tissue after 4 weeks (Fig. 1), suggesting that the repaired cartilage-like cells may have been directly differentiated from adipose-derived stem cells. Furthermore, it was confirmed that cartilage repair (Fig. 1: photograph of cartilage in the upper part of the defect) and masson trichrome subchondral bone repair were also good in the spheroid-administered group (Fig. 4: Evaluation of new bone growth rate). In Masson's trichrome staining, the darkly stained part is the ossified part, the lightly stained or white part is the unossified part, and the granulated tissue, and the new bone growth rate is the defective part excluding cartilage. After selection, it was binarized with ImageJ, the dark part in the part was detected, the area ratio was calculated, and the analysis was performed. In the HE staining, bone repair could be confirmed from the bottom of the defect hole after 2 weeks in the spheroid-administered group, and cartilage-like cell formation could be confirmed at 4 weeks, and spheroid-administered group after 12 weeks. In both the single cell administration group, repair of subchondral bone was confirmed, and the spheroid administration group exhibited a firmer osteoporosis structure than the single cell administration group (Fig. 5). In addition, toluidine blue staining confirmed that in the spheroid-administered group, vigorous cartilage-like cells were confirmed and the ability to regenerate cancellous bone was promoted in addition to the regeneration of cartilage matrix (Fig. 6). ..
試験例２（in vitro実験）
Lewis系ラットより分離培養した脂肪由来幹細胞のスフェロイド型と単一細胞型においてPCR評価法を行った。治療関連遺伝子発現(性質の特定)、抗炎症性サイトカインの遺伝子発現(治療効果の根拠の特定)を評価した。上記脂肪由来幹細胞のスフェロイド型には、実施例１で得られたスフェロイドを使用した。
Test Example 2 (in vitro experiment)
PCR evaluation methods were performed on spheroid type and single cell type of adipose-derived stem cells isolated and cultured from Lewis rats. Treatment-related gene expression (identification of properties) and gene expression of anti-inflammatory cytokines (identification of the basis of therapeutic effect) were evaluated. The spheroid obtained in Example 1 was used as the spheroid type of the adipose-derived stem cells.
PCRの結果、脂肪由来幹細胞のスフェロイド型では抗炎症性サイトカインであるTSG-6及び、TGFβ1が多く発現していた(図７)。 As a result of PCR, the spheroid type of adipose-derived stem cells expressed a large amount of the anti-inflammatory cytokines TSG-6 and TGFβ1 (Fig. 7).
脂肪由来幹細胞のスフェロイドは、単一細胞よりも、抗炎症性サイトカインTSG-6及び、骨芽細胞の増殖を促すTGFβ1を多く発現し、骨と軟骨の修復に有効であった。また、その修復には投与した脂肪由来幹細胞自身が分化している可能性も示唆するものであった。 Adipose-derived stem cell spheroids expressed more anti-inflammatory cytokine TSG-6 and TGFβ1 that promotes osteoblast proliferation than single cells, and were effective in bone and cartilage repair. It also suggested that the administered adipose-derived stem cells themselves may have differentiated for the repair.
本発明の剤は、簡便に調製することができ、かつ、細胞培養の作業自体も効率的に行なうことが可能となるので、例えば、骨再生医療などの分野の他、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の抗炎症効果を期待する分野にも適用できる。 Since the agent of the present invention can be easily prepared and the cell culture work itself can be efficiently performed, for example, in fields such as bone regenerative medicine, the skull, chin, and face. It can also be applied to fields where anti-inflammatory effects are expected, such as reconstructive surgery, cosmetic surgery, plastic surgery, orthopedics, oral surgery, otolaryngology, and dentistry.
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