JP6901252B2 - Adhesive cell culture substrate, cell culture container and cell culture method using this - Google Patents
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Description
本発明は、接着性細胞培養用基材、ならびに当該接着性細胞培養用基材を有する細胞培養容器、および当該接着性細胞培養用基材を使用した細胞培養方法に関する。 The present invention relates to an adhesive cell culture substrate, a cell culture container having the adhesive cell culture substrate, and a cell culture method using the adhesive cell culture substrate.
肝臓、膵臓、皮膚、血管等の各器官を形成する細胞は、生体内において、細胞同士が三次元的にネットワークを形成し機能を発現している。 The cells that form each organ such as the liver, pancreas, skin, and blood vessels express their functions by forming a three-dimensional network of cells in the living body.
そこでこれらの器官の機能を再生する再生医療の研究において、これらの器官の細胞を培養する場合には、細胞同士が三次元的にネットワークを形成できるような培養（すなわち、三次元培養）が求められる。細胞同士が三次元的にネットワークを形成した組織としてスフェロイドがある。しかしながら一般的な樹脂製の細胞培養用基材の表面で細胞を培養する場合、細胞は平面状に広がって増殖（二次元培養）し、三次元的なネットワークは形成されない。 Therefore, in research on regenerative medicine that regenerates the functions of these organs, when culturing cells in these organs, a culture that allows the cells to form a three-dimensional network (that is, three-dimensional culture) is required. Be done. Spheroid is a tissue in which cells form a three-dimensional network. However, when cells are cultured on the surface of a general resin cell culture substrate, the cells spread in a plane and proliferate (two-dimensional culture), and a three-dimensional network is not formed.
三次元培養を行うための手法として、細胞接着性が低い樹脂層を形成した容器内にて浮遊状態で培養を行う方法（特許文献１）や、凹凸構造をナノインプリントした基材を用いる方法（特許文献２）が知られている。 As a method for performing three-dimensional culture, a method of culturing in a floating state in a container having a resin layer having low cell adhesion (Patent Document 1) and a method of using a substrate having a nanoimprinted uneven structure (Patent). Document 2) is known.
特許文献１に記載されるような細胞接着性の低い基材を用いて培養を行うと、細胞の運動性が高くなるため細胞同士の接着性が高くなる。これにより、形成されるスフェロイドの大きさを制御することが困難となる。また、浮遊培養ではスフェロイドのサイズが大きくなるため、スフェロイドの中心部に存在する細胞が壊死するおそれがある。また、細胞を培養する場合、定期的に培地の交換が必須であるが、特許文献１に記載されるような細胞付着性の低い基材の場合、スフェロイドが浮遊した状態で形成されるため、培地交換時の培地除去の際に培地とともにスフェロイドも除去され、長期間の培養が困難である。
When culturing is performed using a substrate having low cell adhesion as described in
特許文献２に記載されるような凹凸構造をインプリントした基材（すなわち、ナノ凹凸構造を形成した基材）を用いることでスフェロイド形成が促進されるものの、かような微細構造を有する基材はインプリント加工に伴うコストが高く、また使用時に凹部に溜まった気泡抜きが必要であるため作業が煩雑となる。また、凹凸構造をインプリントした基材（すなわち、ナノ凹凸構造を形成した基材）ではスフェロイドが基材に弱く付着しているため、スフェロイド同士が会合しやすく、スフェロイドの大きさの制御が困難な場合がある。さらに、スフェロイドが基材から離れやすいため、培地交換時にスフェロイドを失いやすい問題があった。 Although spheroid formation is promoted by using a base material imprinted with a concavo-convex structure as described in Patent Document 2 (that is, a base material having a nano-concavo-convex structure formed), a base material having such a fine structure is used. The cost associated with imprinting is high, and the work becomes complicated because it is necessary to remove air bubbles accumulated in the recesses during use. In addition, since the spheroids are weakly attached to the base material on the base material on which the uneven structure is imprinted (that is, the base material on which the nano-concavo-convex structure is formed), the spheroids easily associate with each other and it is difficult to control the size of the spheroids. In some cases. Further, since the spheroid is easily separated from the base material, there is a problem that the spheroid is easily lost at the time of medium replacement.
細胞培養に用いられる器具類は、培養に使用する前にあらかじめ滅菌処理を行う必要がある。細胞培養用器具類の滅菌処理としては、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、ガンマ線滅菌などが知られている。しかしながら、オートクレーブ滅菌は熱可塑性樹脂製等の耐熱性の低い器具類の滅菌処理には適さず、エチレンオキサイドガスは器具類に吸収された残留ガスによる安全性の観点から再生医療目的で使用される細胞培養用器具類の滅菌に用いるには懸念が残る。一方、ガンマ線滅菌は耐熱耐圧性の低い器具類の滅菌にも適用でき、またエチレンオキサイドガスのような残留ガスの問題も無いという利点がある。上記のような滅菌手段について、本発明者らは、従来の細胞培養用基材はガンマ線滅菌に適しないという課題が存在することを見出した。すなわち、従来の細胞培養用基材をガンマ線滅菌して細胞培養に用いると、細胞による三次元的なネットワーク形成が著しく低下することを見出した。 Instruments used for cell culture must be sterilized in advance before being used for culture. Known sterilization treatments for cell culture instruments include autoclave sterilization, ethylene oxide gas sterilization, and gamma ray sterilization. However, autoclave sterilization is not suitable for sterilization of instruments with low heat resistance such as those made of thermoplastic resin, and ethylene oxide gas is used for regenerative medicine purposes from the viewpoint of safety due to residual gas absorbed in the instruments. Concerns remain regarding its use in sterilization of cell culture instruments. On the other hand, gamma ray sterilization can be applied to sterilization of instruments having low heat resistance and pressure resistance, and has an advantage that there is no problem of residual gas such as ethylene oxide gas. Regarding the above-mentioned sterilization means, the present inventors have found that the conventional cell culture substrate has a problem that it is not suitable for gamma-ray sterilization. That is, it has been found that when a conventional cell culture substrate is gamma-sterilized and used for cell culture, the formation of a three-dimensional network by cells is significantly reduced.
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、凹凸構造のインプリント（すなわち、ナノ凹凸構造の形成）を必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に形成可能な接着性細胞培養用基材を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention has been made in view of the above circumstances, and the spheroid is used as a base material even after gamma-ray sterilization without the need for imprinting of an uneven structure (that is, formation of a nano-concavo-convex structure). It is an object of the present invention to provide a substrate for adhesive cell culture that can be formed on the surface.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、細胞培養面のアルブミン吸着量が所定数値以上である接着性細胞培養用基材によって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。 The present inventors have conducted diligent research in order to solve the above problems. As a result, they have found that the above-mentioned problems can be solved by an adhesive cell culture substrate having an albumin adsorption amount on the cell culture surface of a predetermined value or more, and have completed the present invention.
本発明によれば、凹凸構造のインプリント（すなわち、ナノ凹凸構造の形成）を必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することができる接着性細胞培養用基材を提供できる。スフェロイドが基材表面に付着しているため、スフェロイド同士が会合して大きくなることが回避でき、かつ培地交換時にスフェロイドを失うことも回避できる。 According to the present invention, spheroids can be formed on the surface of a substrate without the need for imprinting of an uneven structure (that is, formation of a nano-concavo-convex structure) and even after gamma-ray sterilization. A possible adhesive cell culture substrate can be provided. Since the spheroids are attached to the surface of the base material, it is possible to prevent the spheroids from associating with each other and increasing in size, and it is also possible to avoid losing the spheroids at the time of medium exchange.
＜接着性細胞培養用基材＞
本発明の一形態は、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超える、接着性細胞培養用基材である。かような接着性細胞培養用基材を用いることにより、凹凸構造のナノインプリントを必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することができる。そのメカニズムは依然として明確ではないが、以下のように推測される。
<Base material for adhesive cell culture>
One embodiment of the present invention is a base material for adhesive cell culture in which the amount of albumin adsorbed on the cell culture surface exceeds 830 ng / cm 2. By using such an adhesive cell culture substrate, spheroids can be formed on the surface of the substrate without the need for nanoimprint of an uneven structure and even after gamma ray sterilization. .. The mechanism is still unclear, but it is speculated as follows.
接着性細胞培養用基材をガンマ線照射により滅菌した場合、基材表面において樹脂等の基材の形成材料の改質反応が起こり、結果として基材上に化学結合手が生じると考えられる。かような基材上の化学結合手の存在等により、細胞の基材への接着性が向上すると考えられる。このため、細胞が平面的に広がって増殖しやすくなり、二次元的な培養になるため、スフェロイド形成が困難になると考えられる。 When the base material for adhesive cell culture is sterilized by gamma irradiation, it is considered that a modification reaction of a base material forming material such as resin occurs on the base material surface, and as a result, a chemical bond is generated on the base material. It is considered that the adhesiveness of cells to the substrate is improved by the presence of such chemically bonded hands on the substrate. For this reason, it is considered that spheroid formation becomes difficult because the cells spread in a plane and easily proliferate, resulting in a two-dimensional culture.
アルブミンは血漿中に多く含まれるタンパク質であるが、疎水性相互作用や静電気相互作用等により樹脂製素材等の各種の素材に吸着することが知られている。また、一般に、基材に対する細胞の接着性は、基材表面が適度な疎水性を有する場合に強くなり、親水性表面には接着しにくいことが知られている。したがって、アルブミン吸着量が所定数値以上の接着性細胞培養用基材では、基材上へ培養細胞を播種した際、細胞の基材表面への接着性が過度に強固にならず、スフェロイド形成が可能となるのではないかと推測される。一方、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２以下の基材は、細胞が二次元的な増殖を示すか、または基材上に細胞が接着できなくなるため、浮遊したスフェロイドが形成される。これは、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２以下の基材は、（１）細胞培養面の疎水性が細胞の接着にとって適度な範囲となり、細胞の基材への接着性が強くなる結果、細胞が平面的に広がって増殖する、あるいは（２）細胞が分泌する細胞外マトリックスを構成するタンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチンなど）等の成分や、インテグリン等の細胞接着タンパク質の基材への接着性が低く、細胞が浮遊してしまうためではないかと考えられる。なお、以上のメカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。 Albumin is a protein that is abundantly contained in plasma, but it is known that albumin is adsorbed on various materials such as resin materials by hydrophobic interaction and electrostatic interaction. Further, it is generally known that the adhesion of cells to a substrate becomes stronger when the surface of the substrate has appropriate hydrophobicity, and it is difficult to adhere to the hydrophilic surface. Therefore, in an adhesive cell culture substrate having an albumin adsorption amount of a predetermined value or more, when the cultured cells are seeded on the substrate, the adhesiveness of the cells to the substrate surface does not become excessively strong, and spheroid formation occurs. It is speculated that it will be possible. On the other hand, in a substrate having an albumin adsorption amount of 830 ng / cm 2 or less on the cell culture surface, floating spheroids are formed because the cells show two-dimensional proliferation or the cells cannot adhere to the substrate. .. This is because a substrate having an albumin adsorption amount of 830 ng / cm 2 or less on the cell culture surface has (1) the hydrophobicity of the cell culture surface in an appropriate range for cell adhesion and strong cell adhesion to the cell substrate. As a result, cells spread and proliferate in a plane, or (2) components such as proteins (for example, collagen, elastin, etc.) that constitute an extracellular matrix secreted by cells, and a base material for cell adhesion proteins such as integrin. It is thought that this is because the adhesion to the cells is low and the cells float. The above mechanism is speculative and does not limit the technical scope of the present invention.
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. The present invention is not limited to the following embodiments.
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。 In the present specification, "X to Y" indicating a range means "X or more and Y or less". Unless otherwise specified, the operation and physical properties are measured under the conditions of room temperature (20 to 25 ° C.) / relative humidity of 40 to 50% RH.
＜接着性細胞培養用基材＞
本発明にかかる接着性細胞培養用基材（以下、単純に「基材」とも称する。）は、後述の方法により測定されるアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超えることを特徴とする。これにより、凹凸構造のナノインプリントを必要とせずに、かつガンマ線滅菌後であっても、スフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することができる。なお、本明細書において、単に「アルブミン吸着量」と記載する場合、ガンマ線未照射の接着性細胞培養用基材を用いて測定した値を指す。ガンマ線照射後にアルブミン吸着量は低下する傾向にあるものの、ガンマ線照射前のアルブミン吸着量が上記範囲であれば、ガンマ線照射後であっても高いアルブミン吸着量が達成される。ゆえに、スフェロイドの形成が促進される。
<Base material for adhesive cell culture>
The base material for adhesive cell culture according to the present invention (hereinafter, also simply referred to as “base material”) is characterized in that the amount of albumin adsorbed by the method described later exceeds 830 ng / cm 2. As a result, spheroids can be formed on the surface of the substrate without the need for nanoimprint of the uneven structure and even after gamma-ray sterilization. In the present specification, the term "albumin adsorption amount" refers to a value measured using a gamma-ray-unirradiated adhesive cell culture substrate. Although the albumin adsorption amount tends to decrease after gamma ray irradiation, if the albumin adsorption amount before gamma ray irradiation is within the above range, a high albumin adsorption amount can be achieved even after gamma ray irradiation. Therefore, the formation of spheroids is promoted.
（アルブミン吸着量の測定方法）
以下、適宜図１を参酌しながら、アルブミン吸着量の測定方法について説明する。図１は、アルブミン吸着量の測定方法のうち、接着性細胞培養用基材に対するアルブミンを吸着させるステップを示す。図１に示すように、台座３上に、接着性細胞培養用基材１ｂ、３００μｌのアルブミン溶液２および接着性細胞培養用基材１ａをこの順で配置する。このとき、接着性細胞培養用基材１ａおよび１ｂは、細胞培養面がアルブミン溶液２と接するように配置する。台座３は、振動安定性確保のため、シャーレ４に収容されている。シャーレ４に収容された台座３、当該台座３上に配置された接着性細胞培養用基材１ｂ、アルブミン溶液２および接着性細胞培養用基材１ａを、まとめてユニット１０と称する。アルブミン溶液２は、ウシ血清アルブミン粉末を、終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（−）に使用直前に溶解して調製する。接着性細胞培養用基材１ａおよび１ｂは、それぞれ直径１４ｍｍの円形とする。水を入れたバットを収容して加湿した３７℃の５体積％ＣＯ２インキュベーター内にユニット１０を静置し、収容から７時間後に取り出してアルブミン溶液を回収する。回収後、後のアルブミン濃度測定をすぐに行わない場合は、回収した溶液を−２０℃で保管する。回収したアルブミン溶液中のアルブミン濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定する。ＥＬＩＳＡ法としては、市販のサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡキットを用いて行うことができるが、本発明においては、実施例に記載のアルブミン測定用ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）またはこれの同等品を用いて行う。初期濃度（２０μｇ／ｍＬ）と７時間後のアルブミン濃度との差およびフィルムの面積（１枚片面当たり１．５４ｃｍ２×２枚分で３．０８ｃｍ２）から、基材の単位面積当たりのアルブミン吸着量（ｎｇ／ｃｍ２）を算出する。
(Measuring method of albumin adsorption amount)
Hereinafter, a method for measuring the amount of albumin adsorbed will be described with reference to FIG. 1 as appropriate. FIG. 1 shows a step of adsorbing albumin to an adhesive cell culture substrate among the methods for measuring the amount of albumin adsorbed. As shown in FIG. 1, an adhesive
ガンマ線未照射の接着性細胞培養用基材について上記方法にて測定されるアルブミン吸着量は８３０ｎｇ／ｃｍ２を超であれば特に制限されないが、好ましくは８４０ｎｇ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは９００ｎｇ／ｃｍ２以上、更に好ましくは９５０ｎｇ／ｃｍ２以上であり、特に好ましくは１０００ｎｇ／ｃｍ２以上である。これにより、細胞が浮遊することなく適度に基材に付着するため、ガンマ線照射後であってもスフェロイドを基材表面上に付着した状態で形成することが可能となる。アルブミン吸着量の上限は特に制限されないが、スフェロイド形成がより良好であるという観点から、好ましくは１２００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、より好ましくは１１５０ｎｇ／ｃｍ２以下であり、更に好ましくは１１００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、特に好ましくは１０５０ｎｇ／ｃｍ２以下である。 The albumin adsorption amount measured by the above method for the adhesive cell culture substrate not irradiated with gamma rays is not particularly limited as long as it exceeds 830 ng / cm 2 , but is preferably 840 ng / cm 2 or more, more preferably. 900 ng / cm 2 or more, further preferably 950ng / cm 2 or more, particularly preferably 1000 ng / cm 2 or more. As a result, the cells are appropriately attached to the base material without floating, so that the spheroids can be formed in a state of being attached to the base material surface even after gamma-ray irradiation. The upper limit of the amount of albumin adsorbed is not particularly limited, but from the viewpoint of better spheroid formation, it is preferably 1200 ng / cm 2 or less, more preferably 1150 ng / cm 2 or less, still more preferably 1100 ng / cm 2. It is less than or equal to, and particularly preferably 1050 ng / cm 2 or less.
基材のアルブミン吸着量は、適切な材質を選択することによって基材のアルブミン吸着量を所望の数値に設定することができる。特に制限されるものではないが、より具体的には、基材を形成する樹脂の製造時における焼成温度や、樹脂を構成する分子構造内における撥水性を発現する官能基（例えば、トリフルオロメチル基等のフッ素含有基）の割合等を調整すること等により、アルブミン吸着量を制御することができる。例えば、樹脂製造時における焼成温度を高くすることにより、基材のアルブミン吸着量を多くすることができる。この詳細なメカニズムは不明であるものの、例えばポリイミドのような樹脂の場合、焼成温度の向上によるイミド化率の向上と関係しているものと推測される。また、樹脂の単位構造当たりのフッ素原子の割合を多くすることにより、おそらくは撥水性の向上によりアルブミンが樹脂にアクセスしにくくなるため、基材のアルブミン吸着量を少なくすることができる。なお、本発明において、基材のアルブミン吸着量が所望の範囲である限り、その制御手段が上記に制限されるものではない。 As for the albumin adsorption amount of the base material, the albumin adsorption amount of the base material can be set to a desired value by selecting an appropriate material. Although not particularly limited, more specifically, the firing temperature at the time of producing the resin forming the base material and the functional group (for example, trifluoromethyl) that expresses water repellency in the molecular structure constituting the resin. The amount of adsorbed albumin can be controlled by adjusting the ratio of fluorine-containing groups such as groups). For example, the amount of albumin adsorbed on the base material can be increased by raising the firing temperature during resin production. Although the detailed mechanism is unknown, in the case of a resin such as polyimide, it is presumed that it is related to the improvement of the imidization rate due to the improvement of the firing temperature. Further, by increasing the ratio of fluorine atoms per unit structure of the resin, albumin is less likely to access the resin, probably due to the improvement of water repellency, so that the amount of albumin adsorbed on the base material can be reduced. In the present invention, the control means is not limited to the above as long as the amount of albumin adsorbed on the base material is within a desired range.
本発明においては、ガンマ線未照射の状態での細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超える接着性細胞培養用基材であればよい。細胞培養面のアルブミン吸着量はガンマ線照射によって低下するが、接着性細胞培養用基材は、ガンマ線照射後の細胞培養面のアルブミン吸着量が８００ｎｇ／ｃｍ２以上であることが、スフェロイド形成性の観点から好ましい。なお、上記の「ガンマ線照射後の細胞培養面のアルブミン吸着量」は、接着性細胞培養用基材をガンマ線照射処理（８ｋＧｙ）した後に、上記のアルブミン吸着量の測定方法で測定された値である。ガンマ線照射後の細胞培養面のアルブミン吸着量は、より好ましくは８１０ｎｇ／ｃｍ２以上、更に好ましくは８２０ｎｇ／ｃｍ２以上、特に好ましくは８３０ｎｇ／ｃｍ２以上であり、最も好ましくは９００ｎｇ／ｃｍ２以上である。ガンマ線照射後のアルブミン吸着量の上限は特に制限されないが、細胞が二次元的に増殖することを防止する観点から、好ましくは１２００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、より好ましくは１１００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、更に好ましくは１０５０ｎｇ／ｃｍ２以下であり、特に好ましくは１０００ｎｇ／ｃｍ２以下である。 In the present invention, an adhesive cell culture substrate having an albumin adsorption amount of more than 830 ng / cm 2 on the cell culture surface in a state without gamma ray irradiation may be used. The amount of albumin adsorbed on the cell culture surface is reduced by gamma-ray irradiation, but the substrate for adhesive cell culture has spheroid-forming properties when the amount of adsorbed albumin on the cell culture surface after gamma-ray irradiation is 800 ng / cm 2 or more. Preferred from the point of view. The above-mentioned "amount of albumin adsorbed on the cell culture surface after gamma-ray irradiation" is a value measured by the above-mentioned method for measuring the amount of albumin-adsorbed after gamma-ray irradiation treatment (8 kGy) of the adhesive cell culture substrate. is there. The amount of albumin adsorbed on the cell culture surface after gamma irradiation is more preferably 810 ng / cm 2 or more, further preferably 820 ng / cm 2 or more, particularly preferably 830 ng / cm 2 or more, and most preferably 900 ng / cm 2 or more. Is. The upper limit of the amount of albumin adsorbed after gamma-ray irradiation is not particularly limited, but is preferably 1200 ng / cm 2 or less, more preferably 1100 ng / cm 2 or less, from the viewpoint of preventing cells from growing two-dimensionally. , still more preferably 1050 ng / cm 2 or less, particularly preferably 1000 ng / cm 2 or less.
接着性細胞培養用基材の細胞培養面は、静的水接触角が７５°以上かつ転落角が１５°以上であることが好ましい。接着性細胞培養用基材がかような条件を満たすことにより、接着性細胞培養用基材上でのスフェロイド形成がより一層促進される。スフェロイド形成性の観点から、静的水接触角は、より好ましくは８０°超、更に好ましくは８１°超であり、静的水接触角の上限は、例えば１５０°未満、好ましくは１２０°未満、より好ましくは１００°以下、更に好ましくは９０°未満である。スフェロイド形成性の観点から、転落角は、１８°以上、２０°以上、２２°以上、２４°以上の順で高いほど好ましい。転落角の上限値は、例えば８０°未満、好ましくは７０°未満、より好ましくは６０°未満、更に好ましくは５０°未満である。なお、上記の静的水接触角や転落角は、実施例に記載の方法で測定される値である。 The cell culture surface of the adhesive cell culture substrate preferably has a static water contact angle of 75 ° or more and a fall angle of 15 ° or more. When the adhesive cell culture substrate satisfies such conditions, spheroid formation on the adhesive cell culture substrate is further promoted. From the viewpoint of spheroid formation, the static water contact angle is more preferably more than 80 °, further preferably more than 81 °, and the upper limit of the static water contact angle is, for example, less than 150 °, preferably less than 120 °. It is more preferably 100 ° or less, still more preferably less than 90 °. From the viewpoint of spheroid formation, the higher the fall angle is, the more preferable it is in the order of 18 ° or more, 20 ° or more, 22 ° or more, and 24 ° or more. The upper limit of the fall angle is, for example, less than 80 °, preferably less than 70 °, more preferably less than 60 °, and even more preferably less than 50 °. The static water contact angle and the fall angle are the values measured by the method described in the examples.
接着性細胞培養用基材の材質は、樹脂等が例示できるが、アルブミン吸着量の制御のしやすさの観点から、好ましくは樹脂を含む。かような樹脂としては、接着性細胞培養用基材として利用可能な生体適合性の高いものであり、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超えるものであれば特に制限されない。特に限定されないが、例えば、接着性細胞培養用基材が含む樹脂は、フッ素樹脂、ポリイミド樹脂（例えば、含フッ素ポリイミド樹脂）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリジメチルシロキサン等や、これらのブレンドが例示でき、焼成温度によるアルブミン吸着量の制御が容易であるという観点から、ポリイミド樹脂が好ましく用いられる。すなわち、本発明の好ましい一実施形態では、接着性細胞培養用基材が、ポリイミド樹脂を含む。ポリイミド樹脂としては、以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含むポリイミド樹脂が例示できる。また、スフェロイド形成が良好であり、耐熱性が向上して焼成温度の制御がより容易になるという観点から、分子内にフッ素原子を有する樹脂が好ましく、含フッ素ポリイミド（含フッ素ポリイミド樹脂）がより好ましい。本発明で用いられるポリイミド樹脂は、典型的には、酸二無水物とジアミンとを各々１種以上重合させて得られるポリアミド酸をイミド化することにより得られる。ポリイミド樹脂は、ポリアミド酸を化学構造の一部に含んでいてもよい。ポリイミド樹脂を製造する方法としては、例えば二段合成法が使用できる。ポリイミド樹脂の二段合成法は前駆体としてポリアミド酸を合成し、ポリアミド酸をポリイミド酸に変換する方法である。前駆体としてのポリアミド酸はポリアミド酸誘導体であってもよい。ポリアミド酸誘導体としては、例えばポリアミド酸塩、ポリアミド酸アルキルエステル、ポリアミド酸アミド、ビスメチリデンピロメリチドからのポリアミド酸誘導体、ポリアミド酸シリルエステル、ポリアミド酸イソイミドなどが挙げられる。ポリイミドとしてはピロメリット酸二無水物、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物等の酸無水物と、オキシジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、ベンゾフェノンジアミン等のジアミンとからなるポリイミドが例示できる。フッ素原子を有する樹脂としては、例えば、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）／１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）共重合体、６ＦＤＡ／４，４’−オキシジフタル酸無水物（ＯＤＰＡ）／ＴＰＥＱ共重合体、４，４‘−（４−４’−イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）／２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）等の以下の式（Ｉ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミド樹脂；エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体等が例示できる。 Examples of the material of the base material for adhesive cell culture include resin, but from the viewpoint of ease of controlling the amount of albumin adsorbed, resin is preferably contained. Such a resin is highly biocompatible and can be used as a base material for adhesive cell culture, and is not particularly limited as long as the amount of albumin adsorbed on the cell culture surface exceeds 830 ng / cm 2. The resin contained in the base material for adhesive cell culture is not particularly limited, and examples thereof include fluororesin, polyimide resin (for example, fluoropolymer-containing polyimide resin), polysulfone, polyethersulfone, polydimethylsiloxane, and blends thereof. A polyimide resin is preferably used from the viewpoint that the amount of albumin adsorbed can be easily controlled by the firing temperature. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the adhesive cell culture substrate contains a polyimide resin. As the polyimide resin, a polyimide resin containing a structural unit represented by the following formula (I) can be exemplified. Further, from the viewpoint of good spheroid formation, improved heat resistance and easier control of firing temperature, a resin having a fluorine atom in the molecule is preferable, and a fluorine-containing polyimide (fluorine-containing polyimide resin) is more preferable. preferable. The polyimide resin used in the present invention is typically obtained by imidizing a polyamic acid obtained by polymerizing one or more kinds of acid dianhydride and diamine. The polyimide resin may contain polyamic acid as part of its chemical structure. As a method for producing the polyimide resin, for example, a two-stage synthesis method can be used. The two-step synthesis method of a polyimide resin is a method of synthesizing a polyamic acid as a precursor and converting the polyamic acid into a polyimide acid. The polyamic acid as a precursor may be a polyamic acid derivative. Examples of the polyamic acid derivative include a polyamic acid salt, a polyamic acid alkyl ester, a polyamic acid amide, a polyamic acid derivative from bismethylidene pyromeride, a polyamic acid silyl ester, and a polyamic acid isoimide. The polyimide consists of acid anhydrides such as pyromellitic dianhydride, biphenyltetracarboxylic dianhydride, and benzophenonetetracarboxylic dianhydride, and diamines such as oxydiamine, paraphenylenediamine, metaphenylenediamine, and benzophenonediamine. Polyimide can be exemplified. Examples of the resin having a fluorine atom include 4,4'-hexafluoroisopropyridenediphthalic anhydride (6FDA) / 1,4-bis (aminophenoxy) benzene (TPEQ) copolymer, 6FDA / 4,4. '-Oxydiphthalic anhydride (ODPA) / TPEQ copolymer, 4,4'-(4-4'-isopropyridene diphenoxy) diphthalic acid (BPADA) / 2,2-bis [4- (4-aminophenoxy) ) Phenyl] Fluorine-containing polyimide resin containing a structural unit represented by the following formula (I) such as hexafluoropropane (HFBAPP); ethylene-tetrafluoroethylene copolymer and the like can be exemplified.
上記式（Ｉ）中、Ｘ０は酸素原子、硫黄原子、または２価の有機基の何れかを示し；Ｙは２価の有機基を示し；Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は互いに独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子のいずれかを示し、ｐは０又は１である。なお、ポリイミド樹脂において、式（Ｉ）で示される化学構造は、樹脂の構成単位ごとに異なってもよく、同一であってもよい。Ｘ０、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６の少なくとも１つはフッ素原子を１個以上含むことが好ましい。 In formula (I) above, X 0 represents either an oxygen atom, a sulfur atom, or a divalent organic group; Y represents a divalent organic group; Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 and Z 6 independently represent either a hydrogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom, and p is 0 or 1. In the polyimide resin, the chemical structure represented by the formula (I) may be different or the same for each constituent unit of the resin. At least one of X 0 , Y, Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 preferably contains one or more fluorine atoms.
上記式（Ｉ）中、ｐ＝０である場合にはＸ０は存在していなくても（換言すれば、左右のベンゼン環が直接結合していても）よいが、ｐ＝１である場合には、左右のベンゼン環はＸ０を介して結合する。 In the above formula (I), when p = 0, X 0 may not exist (in other words, the left and right benzene rings may be directly bonded), but when p = 1. the left and right benzene ring linked via X 0.
Ｘ０で示される２価の有機基としては、具体的には、アルキレン基、アリーレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基等が挙げられ、これらの中でも、アルキレン基、アリーレンオキシ基、アリーレンチオ基が好ましく、アルキレン基、アリーレンオキシ基がより好ましく、これらはフッ素原子で置換されていてもよい。上記アルキレン基の炭素数は、例えば１〜１２であり、好ましくは１〜６である。 Specific examples of the divalent organic group represented by X 0 include an alkylene group, an arylene group, an aryleneoxy group, an arylentio group, and the like. Among these, an alkylene group, an aryleneoxy group, and an arylenthio group. Is preferable, an alkylene group and an aryleneoxy group are more preferable, and these may be substituted with a fluorine atom. The alkylene group has, for example, 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms.
Ｘ０の例であるフッ素原子で置換されたアルキレン基としては、例えば、−Ｃ（ＣＦ３）２−、−Ｃ（ＣＦ３）２−Ｃ（ＣＦ３）２−等を例示することができる。Ｘ０の例である上述したアルキレン基の中では、−Ｃ（ＣＦ３）２−が好適である。 Examples of the alkylene group substituted with a fluorine atom, which is an example of X 0 , include −C (CF 3 ) 2 −, −C (CF 3 ) 2 −C (CF 3 ) 2 −, and the like. .. Among the above-mentioned alkylene groups which are examples of X 0 , −C (CF 3 ) 2− is preferable.
Ｘ０の例であるアリーレン基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 As the arylene group which is an example of X 0 , for example, the following can be exemplified.
Ｘ０の例であるアリーレンオキシ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 Examples of the arylene oxy group, which is an example of X 0, include the following.
Ｘ０の例であるアリーレンチオ基としては、例えば、以下のものを例示することができる。 As the arylentio group which is an example of X 0 , for example, the following can be exemplified.
増殖活性が低下した細胞であっても、ガンマ線照射後の基材上にスフェロイドを良好に形成しうるという観点からは、Ｘ０で示される２価の有機基は、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択されることが好ましく、上記ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択されることがより好ましく、ｂ−８で表される構造であることが更に好ましい。 From the viewpoint that spheroids can be satisfactorily formed on the substrate after gamma irradiation even in cells with reduced proliferative activity, the divalent organic groups represented by X 0 are the above b-2 to b-. It is preferably selected from the group consisting of 10 and c-2 to c-10, and more preferably selected from the group consisting of b-7 to b-9 and c-7 to c-9. It is more preferable that the structure is represented by 8.
Ｘ０の例である上述したアリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基は、各々独立して、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子又は塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基及びトリフルオロメチル基よりなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。アリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基に置換している好適な置換基は、フッ素原子及び／又はトリフルオロメチル基であり、好適にはフッ素原子である。アリーレン基、アリーレンオキシ基及びアリーレンチオ基は、Ｙにフッ素原子が含まれない場合、少なくとも１つ以上のフッ素原子で置換されることが好ましい。 Above arylene group is an example of X 0, arylene group and Arirenchio groups are each independently a halogen atom (e.g., fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, preferably fluorine atom or chlorine It may be substituted with a group selected from the group consisting of an atom, more preferably a fluorine atom), a methyl group and a trifluoromethyl group. The number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other. Suitable substituents substituted with an arylene group, an aryleneoxy group and an arylentio group are a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, preferably a fluorine atom. The arylene group, the aryleneoxy group and the arylentio group are preferably substituted with at least one fluorine atom when Y does not contain a fluorine atom.
上記式（Ｉ）中、Ｙで示される２価の有機基としては、特に制限されないが、例えば、芳香環を有する２価の有機基が挙げられる。詳しくは、１個のベンゼン環からなる基もしくは、２個以上のベンゼン環が炭素原子（すなわち、単結合、またはアルキレン基）、酸素原子、硫黄原子を介して又は直接結合した構造を有する基が挙げられる。具体的には、以下の基を例示することができる。 In the above formula (I), the divalent organic group represented by Y is not particularly limited, and examples thereof include a divalent organic group having an aromatic ring. Specifically, a group consisting of one benzene ring or a group having a structure in which two or more benzene rings are directly bonded via a carbon atom (that is, a single bond or an alkylene group), an oxygen atom, or a sulfur atom. Can be mentioned. Specifically, the following groups can be exemplified.
Ｙの例である上述した芳香環を有する２価の有機基は、置換可能であれば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子又は塩素原子、より好ましくはフッ素原子である。）、メチル基及びトリフルオロメチル基からなる群から選択される基により置換されていてもよい。これら置換基は複数であってもよく、その場合には置換基の種類は互いに同一であっても異なっていてもよい。芳香環を有する２価の有機基に置換している好適な置換基は、特にＸ０にフッ素原子が含まれない場合は、フッ素原子及び／又はトリフルオロメチル基であることが好ましく、より好適にはフッ素原子である。 The above-mentioned divalent organic group having an aromatic ring, which is an example of Y, is a halogen atom (for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, preferably a fluorine atom or a chlorine atom, if substitutable. , More preferably a fluorine atom.), May be substituted with a group selected from the group consisting of a methyl group and a trifluoromethyl group. The number of these substituents may be plural, and in that case, the types of the substituents may be the same or different from each other. A suitable substituent substituted with a divalent organic group having an aromatic ring is preferably a fluorine atom and / or a trifluoromethyl group, particularly when X 0 does not contain a fluorine atom, and is more preferable. Is a fluorine atom.
スフェロイド形成性の観点から、上記式（Ｉ）中、Ｙはｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される構造であることが好ましく、より好ましくはｅ−１、ｅ−３またはｅ−４の構造であり、更に好ましくはｅ−４の構造である。 From the viewpoint of spheroid formation, Y is a structure selected from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7 in the above formula (I). It is preferable, more preferably the structure of e-1, e-3 or e-4, and further preferably the structure of e-4.
上記式（Ｉ）中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は、各々同じであってもよく異なっていてもよく、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子から選ばれ、Ｘ０およびＹの少なくとも一方にフッ素原子が含まれない場合、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６の少なくとも１つはフッ素原子であることが好ましい。 In the above formula (I), Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 may be the same or different from each other, and each of them independently has a hydrogen atom and a fluorine atom. , Chlorine atom, bromine atom or iodine atom, and if at least one of X 0 and Y does not contain a fluorine atom, at least one of Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Z 6 . One is preferably a fluorine atom.
スフェロイド形成性の観点から、本発明の好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、−Ｃ（ＣＦ３）２−、上記ｂ−２〜ｂ−１０およびｃ−２〜ｃ−１０からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｄ−３、ｄ−９、ｅ−１〜ｅ−４、ｆ−６、およびｆ−７からなる群から選択される。本発明のより好ましい一実施形態では、上記式（Ｉ）中、Ｘ０で示される２価の有機基が、ｂ−７〜ｂ−９およびｃ−７〜ｃ−９からなる群から選択され；かつ、Ｙが、ｅ−１、ｅ−３およびｅ−４からなる群から選択される。 From the viewpoint of spheroid formation, in a preferred embodiment of the present invention, the divalent organic group represented by X 0 in the above formula (I) is −C (CF 3 ) 2 −, the above b- 2 to b. Selected from the group consisting of -10 and c-2 to c-10; and Y from the group consisting of d-3, d-9, e-1 to e-4, f-6, and f-7. Be selected. In a more preferred embodiment of the present invention, in the above formula (I), the divalent organic group represented by X 0 is selected from the group consisting of b-7 to b-9 and c-7 to c-9. And Y is selected from the group consisting of e-1, e-3 and e-4.
上記の式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、酸二無水物とジアミンとの重合により得られるポリアミド酸を焼成する手法により得ることができる。以下に、一具体例として、６ＦＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体の合成過程を示す。なお、上記「式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂」のイミド化率は、１００％でなくともよい。すなわち、式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂は、上記式（Ｉ）で表される構造単位のみからなるものであってもよいが、本発明の目的効果が損なわれない範囲において、環状イミド構造が脱水閉環せずにアミド酸のままである構成単位が一部に含まれていてもよい。 The polyimide resin composed of the structural unit represented by the above formula (I) can be obtained by a method of calcining a polyamic acid obtained by polymerizing an acid dianhydride and a diamine. The synthesis process of the 6FDA / TPEQ copolymer is shown below as a specific example. The imidization rate of the above-mentioned "polyimide resin composed of the structural unit represented by the formula (I)" does not have to be 100%. That is, the polyimide resin composed of the structural units represented by the formula (I) may be composed of only the structural units represented by the above formula (I), but as long as the objective effect of the present invention is not impaired. , A structural unit in which the cyclic imide structure remains as an amic acid without dehydration ring closure may be partially contained.
ポリアミド酸合成反応は有機溶媒中で行われることが好適である。ポリアミド酸合成反応に用いられる有機溶媒としては、原料である酸二無水物とジアミンとの反応が効率よく進行でき、かつこれらの原料に対して不活性であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン、アセトン、メチルエチルケトン、イソブチルケトン、メタノール等の極性溶媒；トルエンやキシレン等の非極性溶媒等が挙げられる。中でも、極性溶媒を用いることが好ましい。これらの有機溶媒は、単独で使用されてもよいし、２種以上の混合物として使用されてもよい。 The polyamic acid synthesis reaction is preferably carried out in an organic solvent. The organic solvent used in the polyamic acid synthesis reaction is not particularly limited as long as the reaction between the acid dianhydride as the raw material and the diamine can proceed efficiently and is inert to these raw materials. .. For example, N-methylpyrrolidone (NMP), N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, sulfolane, methyl isobutyl ketone, acetonitrile, benzonitrile, nitrobenzene, nitromethane, acetone, methyl ethyl ketone, isobutyl ketone. , Polar solvents such as methanol; non-polar solvents such as toluene and xylene. Above all, it is preferable to use a polar solvent. These organic solvents may be used alone or as a mixture of two or more.
接着性細胞培養用基材の形成材料として、上記の式（Ｉ）で示される構成単位からなるポリイミド樹脂を用いる場合、細胞培養面のアルブミン吸着量を高くするためには、ポリイミド樹脂製造時の焼成温度を高くすればよい。焼成温度を高くすることによりアルブミン吸着量が向上する詳細なメカニズムは不明であるが、イミド化率と関連していると推測され、高温の焼成によってポリアミド酸のイミド化率が高くなりポリイミド樹脂の原料であるジアミンに由来する２級アミンの割合が減少することで樹脂の電荷が変化するためではないかと推測される。焼成温度は、樹脂の分子構造によっても異なるため一概には規定できないが、例えば、６ＦＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体、ＢＰＡＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体、またはＢＰＡＤＡ／ＨＦＢＡＰＰ共重合体を焼成する場合は３４０℃以上である。かような高い温度帯で焼成を行うことにより、接着性細胞培養用基材を、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超えるものとし、ガンマ線滅菌後であっても、ナノ凹凸構造の形成を必要とせずにスフェロイドを基材表面上に形成することができる。分子内にフッ素原子を有する樹脂（例えば、式（Ｉ）で示される構成単位を含む含フッ素ポリイミド樹脂）を用いることで、上記のような高温での焼成におけるアルブミン吸着量の制御がしやすくなる。焼成温度の上限は特に制限されないが、例えば、５００℃未満、好ましくは４５０℃以下である。焼成時間は、例えば、０．２〜１０時間である。 When a polyimide resin composed of the structural unit represented by the above formula (I) is used as a material for forming the base material for adhesive cell culture, in order to increase the amount of albumin adsorbed on the cell culture surface, it is necessary to manufacture the polyimide resin. The firing temperature may be raised. The detailed mechanism by which the amount of adsorbed albumin is improved by increasing the firing temperature is unknown, but it is presumed that it is related to the imidization rate. It is presumed that this is because the charge of the resin changes as the proportion of the secondary amine derived from the diamine, which is the raw material, decreases. The firing temperature cannot be unconditionally defined because it differs depending on the molecular structure of the resin, but for example, when firing a 6FDA / TPEQ copolymer, a BPADA / TPEQ copolymer, or a BPADA / HFBAPP copolymer, the firing temperature is 340 ° C. or higher. Is. By firing in such a high temperature range, the base material for adhesive cell culture has an albumin adsorption amount of more than 830 ng / cm 2 on the cell culture surface, and has a nanoconcavo-convex structure even after gamma ray sterilization. Spheroids can be formed on the surface of the substrate without the need for formation of. By using a resin having a fluorine atom in the molecule (for example, a fluorine-containing polyimide resin containing a structural unit represented by the formula (I)), it becomes easy to control the amount of albumin adsorbed in the above-mentioned high-temperature firing. .. The upper limit of the firing temperature is not particularly limited, but is, for example, less than 500 ° C., preferably 450 ° C. or lower. The firing time is, for example, 0.2 to 10 hours.
上記の接着性細胞培養用基材の形成材料である樹脂の重量平均分子量は、例えば、５，０００〜２，０００，０００、好ましくは８，０００〜１，０００，０００であり、さらに好ましくは２０，０００〜５００，０００である。なお、本明細書において、樹脂の重量平均分子量は、以下の手法により測定された値である。重量平均分子量が上記範囲であることにより、ガンマ線照射後のスフェロイド形成性がより良好となる。 The weight average molecular weight of the resin, which is the material for forming the above-mentioned adhesive cell culture substrate, is, for example, 5,000 to 2,000,000, preferably 8,000 to 1,000,000, and more preferably 8,000 to 1,000,000. It is 20,000 to 500,000. In this specification, the weight average molecular weight of the resin is a value measured by the following method. When the weight average molecular weight is in the above range, the spheroid formation property after gamma-ray irradiation becomes better.
（重量平均分子量の測定）
装置：東ソー株式会社製 ＨＣＬ−８２２０ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈ
溶離液（ＬｉＢｒ・Ｈ２Ｏ、リン酸入りＮＭＰ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ
測定方法：０．５重量％の溶液を溶離液で作製し、ポリスチレンで作製した検量線をもとに分子量を算出する。
(Measurement of weight average molecular weight)
Equipment: HCL-8220GPC manufactured by Tosoh Corporation
Column: TSKgel Super AWM-H
Eluent (LiBr · H 2 O, NMP containing phosphoric acid): 0.01 mol / L
Measuring method: A 0.5% by weight solution is prepared with an eluent, and the molecular weight is calculated based on a calibration curve prepared with polystyrene.
本発明にかかる接着性細胞培養用基材は、細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超えるものであればよく、上記樹脂等の主成分のみからなるものでも、他の材料を含むものでもよい。例えば、接着性細胞培養用基材は、アルブミン吸着量が少ない樹脂（例えばポリスチレン等）、無機ガラスまたは金属等の支持部材上に、アルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超える樹脂からなる樹脂層を細胞培養面に有する構成でもよい。あるいは、接着性細胞培養用基材は、可塑剤、酸化防止剤等の添加剤成分をさらに含んでもよい。基材の厚さも特に制限されず、任意に設定できるが、例えば０．１μｍ〜１０ｍｍ、好ましくは１μｍ〜１ｍｍである。 The base material for adhesive cell culture according to the present invention may have an albumin adsorption amount of more than 830 ng / cm 2 on the cell culture surface, and even if it is composed only of the main component such as the above resin, it contains other materials. It may be a thing. For example, as a base material for adhesive cell culture, a resin layer made of a resin having an albumin adsorption amount of more than 830 ng / cm 2 is formed on a support member such as a resin having a small albumin adsorption amount (for example, polystyrene), inorganic glass or metal. It may have a structure on the cell culture surface. Alternatively, the base material for adhesive cell culture may further contain additive components such as a plasticizer and an antioxidant. The thickness of the base material is also not particularly limited and can be set arbitrarily, but is, for example, 0.1 μm to 10 mm, preferably 1 μm to 1 mm.
本発明にかかる接着性細胞培養用基材は、ナノ凹凸構造の形成加工を施さなくともスフェロイド形成に用いることが可能であるが、ナノ凹凸構造を有するものを排除しない。接着性細胞培養用基材に対するナノ凹凸構造の形成加工は、例えば、特開２０１４−２１０４０４号公報に記載の手法により行うことができる。 The substrate for adhesive cell culture according to the present invention can be used for spheroid formation without subjecting the nano-concavo-convex structure to be formed, but those having the nano-concavo-convex structure are not excluded. The processing for forming the nano-concavo-convex structure on the substrate for adhesive cell culture can be performed, for example, by the method described in JP-A-2014-210404.
＜細胞培養容器、細胞培養方法＞
本発明の一実施形態では、上記の接着性細胞培養用基材を有する、細胞培養容器が提供される。本発明の細胞培養用容器は、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが組み合わされて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材のみにより構成されていてもよい。 図２に、本発明にかかる細胞培養容器の一実施形態を例示する。細胞培養容器は、図２（Ａ）のように接着性細胞培養用基材１からなるものでもよく、あるいは、図２（Ｂ）や（Ｃ）のように接着性細胞培養用基材１と支持部材２０とからなるものであってもよい。図２では、細胞培養容器を、開口した側から平面視したときの内郭形状及び外郭形状は、それぞれ例えば円、多角形（四角形、三角形等）などの任意の形状であることができる。支持部材２０を構成する材料としては、例えば、無機ガラス；カーボン；シリコン等の金属；ポリエチレン、ポリプロピレン、環状オレフィン等のポリオレフィン樹脂；ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂；ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系樹脂；エポキシ樹脂；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン）樹脂、ポリカーボネート樹脂、ビニルエーテル、ポリアセタール、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリアリールエーテル、ポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリアリールエーテルケトン、フェノール樹脂、ポリエーテルニトリル（ＰＥＮ）等が例示できる。
<Cell culture container, cell culture method>
In one embodiment of the present invention, a cell culture container having the above-mentioned adhesive cell culture substrate is provided. The cell culture container of the present invention may be configured by combining the cell culture base material of the present invention and other members, or the cell culture base material of the present invention and other members are integrated. It may be composed of only the cell culture substrate of the present invention. FIG. 2 illustrates an embodiment of the cell culture vessel according to the present invention. The cell culture vessel may be made of the adhesive
本発明の細胞培養用容器は、本発明の細胞培養用基材を備えていればよく、全体としてどのような形状であってもよい。例えば、シングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグ等の各種容器の形状であることができる。本発明の細胞培養用容器はまた、大量培養装置や潅流培養装置などの培養装置における細胞培養用容器の形態であってもよい。 The cell culture container of the present invention may be provided with the cell culture substrate of the present invention, and may have any shape as a whole. For example, it can be in the shape of a plate for culture such as a single or multi-well plate, and various containers such as a petri dish, a dish, a flask, and a bag. The cell culture container of the present invention may also be in the form of a cell culture container in a culture device such as a mass culture device or a perfusion culture device.
本発明の一実施形態では、上記の接着性細胞培養用基材上で接着性細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法が提供される。上記の接着性細胞培養用基材は、ナノ凹凸構造を形成しなくとも、その表面上で接着性細胞を培養することによりスフェロイドを形成することができる。また、上記の接着性細胞培養用基材は、ガンマ線滅菌をした後でもスフェロイド形成が可能であることから、耐熱耐圧性の低い部材と組み合わせた細胞培養用器具に用いることができる。さらに、ガンマ線滅菌が可能であるから、エチレンオキサイドガスのような残留ガスの問題も無いという利点がある。本発明のさらなる実施形態では、上記培養する工程において、接着性細胞を三次元培養する、細胞培養方法が提供される。 In one embodiment of the present invention, there is provided a cell culture method including the step of culturing adhesive cells on the above-mentioned adhesive cell culture substrate. The above-mentioned substrate for culturing adhesive cells can form spheroids by culturing adhesive cells on the surface of the substrate without forming a nano-concavo-convex structure. Further, since the above-mentioned adhesive cell culture substrate can form spheroids even after gamma-ray sterilization, it can be used as a cell culture instrument in combination with a member having low heat resistance and pressure resistance. Further, since gamma ray sterilization is possible, there is an advantage that there is no problem of residual gas such as ethylene oxide gas. In a further embodiment of the present invention, there is provided a cell culture method in which adhesive cells are three-dimensionally cultured in the above-mentioned culturing step.
本発明の細胞培養方法で培養される細胞の種類は特に限定されず、正常細胞、がん細胞、およびハイブリドーマ等の融合細胞等が使用でき、遺伝子導入等の人工的処理がされた細胞であってもよい。特に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞等の一般的に三次元培養を行うことが求められている細胞や、各種前駆細胞及び幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、網膜細胞、角膜由来細胞、生殖腺由来細胞、各種線細胞、その他間葉系前駆細胞、各種癌細胞等の細胞が挙げられる。これらの細胞が由来する生物種も特に制限されず、ヒトおよび非ヒト動物由来の各種細胞を用いることができる。細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー、タマリンおよびマーモセット等の霊長類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウズラ、ミンク、ツパイ、ならびにゼブラフィッシュ等が例示できる。 The type of cells to be cultured by the cell culture method of the present invention is not particularly limited, and normal cells, cancer cells, fusion cells such as hybridomas, etc. can be used, and the cells have been artificially treated such as gene transfer. You may. Although not particularly limited, for example, artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells and the like can be generally cultured in three dimensions. Fat cells, hepatocytes, kidney cells, pancreatic cells, mammary gland cells, endothelial cells, epithelial cells, smooth muscle cells, myoblasts, myocardial cells, nerve cells, including the required cells, various precursor cells and stem cells, Glia cells, dendritic cells, cartilage cells, osteoblasts, osteoclasts, bone cells, fibroblasts, various blood line cells, retinal cells, corneal-derived cells, gonad-derived cells, various line cells, and other mesenchymal precursors Examples include cells such as cells and various cancer cells. The species from which these cells are derived is not particularly limited, and various cells derived from humans and non-human animals can be used. Species from which the cells are derived include, for example, primates such as humans, rhesus monkeys, green monkeys, cynomolgus monkeys, chimpanzees, tamarins and marmosets, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, dogs, cats, rabbits and pigs. Examples thereof include cows, goats, sheep, horses, chickens, quail, minks, tsupai, and zebra fish.
細胞培養に用いる培地は、細胞に合わせて適宜選択すればよい。培地の種類は特に限定されないが、例えば、任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。具体的には、イーグル細小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｈａｗ ｍｅｄｉｕｍ、およびこれらの混合培地等が挙げられるが、これらには限定されず、細胞が増殖や分化に必要な成分が含まれる培地であれば利用可能である。さらに、血清、各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類等を添加した培地を使用してもよい。培養温度も特に制限されないが、通常は２５〜４０℃程度で行う。 The medium used for cell culture may be appropriately selected according to the cells. The type of medium is not particularly limited, and for example, any cell culture basic medium, differentiation medium, primary culture medium, or the like can be used. Specifically, Eagle's Small Essential Medium (EMEM), Dalveco Modified Eagle's Medium (DMEM), α-MEM, Glasgow MEM (GMEM), IMDM, RPMI1640, Ham F-12, MCDB Medium, Williams Medium E, Hepatocyte the medium medium. , And a mixed medium thereof, and the like, but the medium is not limited to these, and any medium containing components necessary for cell proliferation and differentiation can be used. Further, a medium to which serum, various growth factors, differentiation-inducing factors, antibiotics, hormones, amino acids, sugars, salts and the like are added may be used. The culture temperature is not particularly limited, but is usually about 25 to 40 ° C.
三次元培養により形成される組織としては、スフェロイドや、三次元細胞集合体が挙げられる。スフェロイド又は三次元細胞集合体は肝細胞のような単一な細胞で形成されたスフェロイド又は三次元細胞集合体でも、各種線維芽細胞や血管内皮細胞等と肝細胞のような２種以上の異なる細胞種が混在したスフェロイド又は三次元細胞集合体でも良い。使用できる細胞としては、上記の各種細胞が挙げられる。一実施形態では、上記の接着性細胞培養用基材であって、前記細胞培養面にスフェロイドが接着した、接着性細胞培養用基材が提供される。他の実施形態では、当該前記細胞培養面にスフェロイドが接着した接着性細胞培養用基材を有する、細胞培養容器が提供される。 Examples of tissues formed by 3D culture include spheroids and 3D cell aggregates. Spheroids or three-dimensional cell aggregates are spheroids or three-dimensional cell aggregates formed by a single cell such as hepatocytes, but are different from various fibroblasts, vascular endothelial cells, etc. and two or more types such as hepatocytes. It may be a spheroid in which cell types are mixed or a three-dimensional cell aggregate. Examples of cells that can be used include the above-mentioned various cells. In one embodiment, there is provided the above-mentioned adhesive cell culture substrate, wherein the spheroid is adhered to the cell culture surface, and the adhesive cell culture substrate is provided. In another embodiment, a cell culture vessel is provided having an adhesive cell culture substrate having a spheroid adhered to the cell culture surface.
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特記しない限り、以下の操作は室温（２５℃）で行った。 The effects of the present invention will be described with reference to the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following examples. Unless otherwise specified, the following operations were performed at room temperature (25 ° C.).
＜比較例１＞
１．ポリアミド酸樹脂組成物の調製
１００ｍｌ容量の三口フラスコに１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）２．９７６ｇ（１０．２ミリモル）、４，４’−ヘキサフルオロイソプロピリデンジフタル酸無水物（６ＦＤＡ）４．５２４ｇ（１０．２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド４２．５ｇを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１８万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
<Comparative example 1>
1. 1. Preparation of Polyamic Acid Resin Composition 2.976 g (10.2 mmol) of 1,4-bis (aminophenoxy) benzene (TPEQ) in a 100 ml volumetric flask, 4,4'-hexafluoroisopropyridene diphthalic anhydride 4.524 g (10.2 mmol) of (6 FDA) and 42.5 g of N, N-dimethylacetamide were charged. A fluoropolyamic acid resin composition (solid content concentration: 15.0% by mass) was obtained by stirring at room temperature for 5 days in a nitrogen atmosphere. The weight average molecular weight of the polyamic acid was 180,000. The weight average molecular weight of the polyamic acid and the weight average molecular weight of the fluorine-containing polyimide resin after firing are substantially the same.
２．含フッ素ポリイミドフィルムの作製
得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが３０μｍとなるようにフィルム状に製膜し、３００℃で１時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム１を得た。
2. Preparation of Fluorine-Containing Polyimide Film The obtained fluorine-containing polyamic acid resin composition was formed into a film on a glass substrate using a die coater so that the thickness of the fluorine-containing polyimide film after firing was 30 μm. The film was baked at 300 ° C. for 1 hour in a nitrogen atmosphere. Then, the film was peeled from the glass to obtain a fluorine-containing
＜実施例１＞
焼成温度を３４０℃に変更した以外は比較例１と同様の操作を行い、含フッ素ポリイミドフィルム２を得た。
<Example 1>
The same operation as in Comparative Example 1 was carried out except that the firing temperature was changed to 340 ° C. to obtain a fluorine-containing
＜実施例２＞
１．ポリアミド酸樹脂組成物の調製
１００ｍｌ容量の三口フラスコに１，４−ビス（アミノフェノキシ）ベンゼン（ＴＰＥＱ）３．８４２ｇ（７．３８ミリモル）、４，４’−（４−４’−イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）２．１５８ｇ（７．３８ミリモル）、Ｎ−メチルピロリドン３４ｇを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１２万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後のポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
<Example 2>
1. 1. Preparation of Polyamic Acid Resin Composition 3.842 g (7.38 mmol) of 1,4-bis (aminophenoxy) benzene (TPEQ) in a 100 ml volumetric flask, 4,4'-(4-4'-isopropyridene) 2.158 g (7.38 mmol) of phenoxy) diphthalic acid (BPADA) and 34 g of N-methylpyrrolidone were charged. A polyamic acid resin composition (solid content concentration: 15.0% by mass) was obtained by stirring at room temperature for 5 days in a nitrogen atmosphere. The weight average molecular weight of the polyamic acid was 120,000. The weight average molecular weight of the polyamic acid and the weight average molecular weight of the polyimide resin after firing are substantially the same.
２．ポリイミドフィルムの作製
得られたポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後のポリイミドフィルムの厚みが３０μｍとなるようにフィルム状に製膜し、３４０℃で１時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、ポリイミドフィルム３を得た。ＢＰＡＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体の構成単位を、以下に示す。
2. Preparation of Polyimide Film The obtained polyamic acid resin composition was formed into a film on a glass substrate using a die coater so that the thickness of the polyimide film after firing was 30 μm, and the film was formed at 340 ° C. for 1 hour. Baking was performed in a nitrogen atmosphere. Then, the film was peeled from the glass to obtain a
＜実施例３＞
１．ポリアミド酸樹脂組成物の調製
１００ｍｌ容量の三口フラスコに２，２−ビス［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］ヘキサフルオロプロパン（ＨＦＢＡＰＰ）３．００６ｇ（５．７７ミリモル）、４，４’−（４−４’−イソプロピリデンジフェノキシ）ジフタル酸（ＢＰＡＤＡ）２．９９４ｇ（５．７７ミリモル）、Ｎ−メチルピロリドン３４ｇを仕込んだ。窒素雰囲気下、室温で５日間攪拌することで、含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物（固形分濃度１５．０質量％）を得た。該ポリアミド酸の重量平均分子量は１０万であった。なお、ポリアミド酸の重量平均分子量と、焼成後の含フッ素ポリイミド樹脂の重量平均分子量は実質的に同一である。
<Example 3>
1. 1. Preparation of Polyamic Acid Resin Composition In a 100 ml capacity three-necked flask, 3.006 g (5.77 mmol) of 2,2-bis [4- (4-aminophenoxy) phenyl] hexafluoropropane (HFBAPP), 4,4'- (4-4'-Isopropyridene diphenoxy) 2.994 g (5.77 mmol) of diphthalic acid (BPADA) and 34 g of N-methylpyrrolidone were charged. A fluoropolyamic acid resin composition (solid content concentration: 15.0% by mass) was obtained by stirring at room temperature for 5 days in a nitrogen atmosphere. The weight average molecular weight of the polyamic acid was 100,000. The weight average molecular weight of the polyamic acid and the weight average molecular weight of the fluorine-containing polyimide resin after firing are substantially the same.
２．含フッ素ポリイミドフィルムの作製
得られた含フッ素ポリアミド酸樹脂組成物を、硝子基材上にダイコーターを用いて焼成後の含フッ素ポリイミドフィルムの厚みが３０μｍとなるようにフィルム状に製膜し、３４０℃で１時間、窒素雰囲気下で焼成を行った。その後、フィルムを硝子から剥離して、含フッ素ポリイミドフィルム４を得た。ＢＰＡＤＡ／ＨＦＢＡＰＰ共重合体の式（Ｉ）で示される構成単位を、以下に示す。
2. Preparation of Fluorine-Containing Polyimide Film The obtained fluorine-containing polyamic acid resin composition was formed into a film on a glass substrate using a die coater so that the thickness of the fluorine-containing polyimide film after firing was 30 μm. The film was baked at 340 ° C. for 1 hour in a nitrogen atmosphere. Then, the film was peeled from the glass to obtain a fluorine-containing
＜静的水接触角の測定＞
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２μｌを滴下した直後の液滴の付着角度を測定した（測定温度：２５℃）。
<Measurement of static water contact angle>
Equipment: Automatic contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: The adhesion angle of the droplet immediately after dropping 2 μl of water on the film was measured (measurement temperature: 25 ° C.).
＜転落角の測定＞
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：フィルム上に水２５μｌを滴下した後、基材を連続的に傾けていき、流れ落ちた際の角度を転落角とした。（測定温度：２５℃）。
<Measurement of falling angle>
Equipment: Automatic contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science: DM-500)
Measuring method: After 25 μl of water was dropped on the film, the base material was continuously tilted, and the angle at which it flowed down was defined as the fall angle. (Measurement temperature: 25 ° C.).
＜アルブミン吸着量の測定＞
ウシ血清アルブミン（シグマ社；Ａ８０２２−１０Ｇ）をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（−）（Ｗａｋｏ社；０４１−２０２１１）でアルブミン濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、アルブミン溶液を得た。シャーレの上の台座に上記のフィルム１枚（直径１４ｍｍの円形）をセットし、当該フィルム上にアルブミン溶液を３００μＬマウントした。
<Measurement of albumin adsorption amount>
Bovine serum albumin (Sigma; A8022-10G) was dissolved in Dulvecco's PBS (-) (Wako; 041-20211) to an albumin concentration of 20 μg / mL to obtain an albumin solution. One of the above films (circle with a diameter of 14 mm) was set on a pedestal on a petri dish, and 300 μL of the albumin solution was mounted on the film.
同じ種類のフィルム（直径１４ｍｍの円形）を、アルブミン溶液にさらに１枚被せてアルブミン溶液を２枚のフィルムで挟み、フィルムとアルブミン溶液とが接触する面積が一定になるようにセットし、ユニットを得た。これを、水を入れたバットを収容して加湿した３７℃の５体積％ＣＯ２インキュベーター内に静置した。７時間後にユニットを取り出し、アルブミン溶液を回収した。回収した溶液は測定まで−２０℃で保管した。 A film of the same type (circle with a diameter of 14 mm) is further covered with the albumin solution, the albumin solution is sandwiched between the two films, and the unit is set so that the contact area between the film and the albumin solution is constant. Obtained. This was placed in a humidified 5% by volume CO 2 incubator at 37 ° C. containing a vat containing water. After 7 hours, the unit was removed and the albumin solution was recovered. The recovered solution was stored at −20 ° C. until measurement.
回収したアルブミン溶液中のアルブミン濃度を測定した。濃度の測定は、Ａｌｂｍｉｎ， Ｂｏｖｉｎｅ， ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行い、測定プロトコルは添付のマニュアルに準拠した。初期濃度（２０μｇ／ｍＬ）と７時間後のアルブミン濃度との差およびフィルムの面積（１枚片面当たり１．５４ｃｍ２×２枚分で３．０８ｃｍ２）から、単位面積当たりのアルブミン吸着量（μｇ／ｃｍ２）を算出した。 The albumin concentration in the recovered albumin solution was measured. The concentration was measured using Albmin, Bovine, and ELISA Quantification kit (Bethyl Laboratories), and the measurement protocol was based on the attached manual. From the difference between the initial concentration (20 μg / mL) and the albumin concentration after 7 hours and the area of the film (1.54 cm 2 x 2 sheets per sheet 3.08 cm 2 ), the amount of albumin adsorbed per unit area (1 sheet per side) μg / cm 2 ) was calculated.
測定結果を表２に示す。なお、表２中、アルブミン吸着量の測定は後述のガンマ線滅菌前後のフィルムを用いて行い、接触角および転落角の測定はガンマ線滅菌前のフィルムを用いて行った。 The measurement results are shown in Table 2. In Table 2, the albumin adsorption amount was measured using a film before and after gamma sterilization, which will be described later, and the contact angle and the fall angle were measured using a film before gamma sterilization.
＜ラット初代肝細胞の取得＞
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅのＷｉｓｔａｒラット、オス、９週齢、体重２００ｇを日本エスエルシー株式会社より購入した。ラット初代肝細胞の取得は培養細胞実験ハンドブック（羊土社）第１０章、「肝細胞」に記載の方法を参考に行った。具体的には、Ｗｉｓｔａｒラットをイソフルラン麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して以下記載の組成の前かん流液を注入した。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、血液を放出させた。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止め、かん流液を以下記載の組成のコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行った。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止めた。肝臓を切り離し、ガラスシャーレに移した後、冷やしたＥＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｗａｋｏ社）を添加して、ピペッティングにより細胞を分散させた。次に１５０ｍｍ濾過器により未消化の組織を除去した。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去した。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞をラット初代肝細胞として培養試験に使用した。
<Acquisition of primary rat hepatocytes>
Wistar rats, males, 9 weeks old, and body weight 200 g of Special viral pathogen free were purchased from Nippon SLC Co., Ltd. The acquisition of rat primary hepatocytes was performed with reference to the method described in
＜ラット初代肝細胞を用いた３次元培養評価＞
細胞培養試験には、上記のように調製した含フッ素ポリイミドフィルム１および２（直径１４ｍｍの円形）をガンマ線滅菌して用いた（ガンマ線滅菌の条件：８ｋＧｙ）。
<Three-dimensional culture evaluation using rat primary hepatocytes>
In the cell culture test, the fluorine-containing
前述の方法で取得したラット初代肝細胞を、以下組成の血清培地で懸濁し、１．３３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように、６．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのラット初代肝細胞懸濁液 ０．４ｍＬを、ガンマ線滅菌処理したフィルムに播種し、３７℃，５％ ＣＯ２条件下で培養を行った。培地交換は播種後４時間、培養１日目、３日目、５日目に培地を全量除去後、血清培地を０．４ｍＬ添加して行った。培養５日目に各フィルム上のスフェロイド形成および付着細胞の有無の確認を行った。その結果、フィルム１上ではスフェロイドは形成されず、付着して伸展した細胞が多数観察された（図３）。これに対して、フィルム２上では付着細胞はほとんど観察されず、スフェロイドが基材表面上に付着した状態で形成されていることを確認した（図４）。
The rat primary hepatocytes obtained by the above method are suspended in a serum medium having the following composition, and 6.25 × 10 5 cells / mL rat primary hepatocytes so as to have 1.33 × 10 4 cells / cm 2. 0.4 mL of the suspension was seeded on a gamma-ray sterilized film and cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. The medium was exchanged 4 hours after sowing, after removing the entire amount of the medium on the 1st, 3rd, and 5th days of the culture, and then adding 0.4 mL of serum medium. On the 5th day of culturing, spheroid formation on each film and the presence or absence of attached cells were confirmed. As a result, spheroids were not formed on the
（血清培地の組成）
Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬）、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（和光純薬）、８．６ｎＭ インスリン、２５５ｎＭ デキサメサゾン、５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、５ＫＩＵ／ｍＬ アプロチニン、抗生物質（ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）／アムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ））。
(Composition of serum medium)
William's E medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10% (w / v) FBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 8.6 nM insulin, 255 nM dexamethasone, 50 ng / mL EGF, 5KIU / mL aprotinin, antibiotics (penicillin (100 unit / 100 unit /) mL) / streptomycin (100 μg / mL) / amphotericin B (0.25 μg / mL)).
＜ラット凍結肝細胞を用いた３次元培養評価＞
初代肝細胞に比べて、細胞の増殖活性が低下した凍結肝細胞を用いて、培養試験を行った。
<Three-dimensional culture evaluation using frozen rat hepatocytes>
A culture test was performed using frozen hepatocytes in which the proliferative activity of the cells was lower than that of the primary hepatocytes.
細胞培養試験には、上記のように調製したポリイミドフィルム３、含フッ素ポリイミドフィルム４（直径１４ｍｍの円形）をガンマ線滅菌して用いた。
In the cell culture test, the
ラット凍結肝細胞およびＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｈａｗ ｍｅｄｉｕｍはオリエンタル酵母工業より購入して実験に使用した。また、実験開始前に前記組成の血清培地２００μＬに、０．４（ｗ／ｖ）％ トリパンブルー溶液（和光純薬株式会社製）５０μＬを添加して、染色液を作製した。 Frozen rat hepatocytes and Hepatotic hepatocytes were purchased from Oriental Yeast Co., Ltd. and used in the experiments. Further, before the start of the experiment, 50 μL of 0.4 (w / v)% trypan blue solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 200 μL of the serum medium having the above composition to prepare a staining solution.
液体窒素からラット凍結肝細胞の入ったバイアルを取り出し、３７℃ウォーターバスにバイアルを入れて細胞懸濁液を融解した。７０％（ｖ／ｖ）エタノールでバイアルを拭いた後に、安全キャビネット内に移し、バイアル中の細胞懸濁液全量を、予め３７℃に温めたＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｈａｗ ｍｅｄｉｕｍ ４５ｍＬに添加し、室温、８６×ｇ、６分間遠心分離を行った。上清を廃棄後、前記血清培地 １０ｍＬを添加し、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液 ５０μＬと前記染色液 ５０μＬを混合し、血球計算盤を用いて生細胞数と生存率を測定し、生存率８５％以上のラット凍結肝細胞を用いて培養試験を実施した。 A vial containing frozen rat hepatocytes was removed from liquid nitrogen, and the vial was placed in a 37 ° C. water bath to thaw the cell suspension. After wiping the vial with 70% (v / v) ethanol, transfer to a safety cabinet and add the entire cell suspension in the vial to 45 mL of pre-warmed Hepatocyte thew medium at room temperature, 86 xg. , Centrifugation was performed for 6 minutes. After discarding the supernatant, 10 mL of the serum medium was added to prepare a cell suspension. 50 μL of the cell suspension and 50 μL of the staining solution were mixed, the number of viable cells and the survival rate were measured using a hemocytometer, and a culture test was carried out using frozen rat hepatocytes having a survival rate of 85% or more.
前述の方法で取得したラット凍結肝細胞を、前記組成の血清培地で懸濁し、１．３３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように、６．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのラット凍結肝細胞懸濁液 ０．４ｍＬを、ガンマ線滅菌処理したフィルムに播種し、３７℃、５体積％ ＣＯ２条件下で培養を行った。培地交換は播種後４時間、培養１日目、３日目、５日目に培地を全量除去後、血清培地を０．４ｍＬ添加して行った。培養５日目にフィルム上のスフェロイド形成および二次元的な付着細胞の有無の確認を行った。 The rat frozen hepatocytes obtained by the above method are suspended in a serum medium having the above composition, and 6.25 × 10 5 cells / mL rat frozen hepatocytes so as to have 1.33 × 10 4 cells / cm 2. 0.4 mL of the suspension was seeded on a gamma-ray sterilized film and cultured at 37 ° C. under 5% by volume CO 2 conditions. The medium was exchanged 4 hours after sowing, after removing the entire amount of the medium on the 1st, 3rd, and 5th days of the culture, and then adding 0.4 mL of serum medium. On the 5th day of culture, spheroid formation on the film and the presence or absence of two-dimensional attached cells were confirmed.
なお、実施例２におけるＢＰＡＤＡ／ＴＰＥＱ共重合体、および実施例３におけるＢＰＡＤＡ／ＨＦＢＡＰＰ共重合体についてのガンマ線未照射のアルブミン吸着量は、ガンマ線後より高い値であった。 The amount of albumin adsorbed on the BPADA / TPEQ copolymer in Example 2 and the BPADA / HFBAPP copolymer in Example 3 that had not been irradiated with gamma rays was higher than that after gamma rays.
１，１ａ，１ｂ 接着性細胞培養用基材（フィルム）、
２ アルブミン溶液、
３ 台座、
４ シャーレ、
１０ ユニット、
２０ 支持部材、
１００、１０１、１０２ 細胞培養容器。
1,1a, 1b Adhesive cell culture substrate (film),
2 Albumin solution,
3 pedestals,
4 petri dish,
10 units,
20 Support member,
100, 101, 102 cell culture vessels.
Claims (6)
ガンマ線未照射の細胞培養面のアルブミン吸着量が８３０ｎｇ／ｃｍ２を超え、１２００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、ガンマ線照射後の細胞培養面のアルブミン吸着量が８００ｎｇ／ｃｍ２以上１２００ｎｇ／ｃｍ２以下であり、
前記樹脂は、下記式（Ｉ）：
上記式（Ｉ）中、
ｐは、１であり、
Ｘ ０ は、−Ｃ（ＣＦ ３ ） ２ −、−Ｃ（ＣＦ ３ ） ２ −Ｃ（ＣＦ ３ ） ２ −、および下記ｂ−１〜ｂ−１０からなる群から選択される基であり、
Ｚ １ 、Ｚ ２ 、Ｚ ３ 、Ｚ ４ 、Ｚ ５ およびＺ ６ は、水素原子であり、
Ｙは、下記ｅ−１〜ｅ−５からなる群から選択される基である
で表される構成単位を含む、接着性細胞培養用基材。 Adhesive cell culture substrate containing resin and used after sterilization with gamma rays.
Albumin adsorption amount of the cell culture surface of the gamma ray unirradiated exceeds 830ng / cm 2, and at 1200 ng / cm 2 or less, albumin adsorption amount of the cell culture surface after gamma irradiation is 800 ng / cm 2 or more 1200 ng / cm 2 or less Oh it is,
The resin has the following formula (I):
In the above formula (I),
p is 1,
X 0 is, -C (CF 3) 2 - , - C (CF 3) 2 -C (CF 3) 2 -, and a group selected from the group consisting of b-1~b-10,
Z 1 , Z 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 and Z 6 are hydrogen atoms.
Y is a group selected from the group consisting of the following e-1 to e-5.
Adhesive cell culture substrate containing the structural unit represented by.
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