ES2960381T3

ES2960381T3 - Expresión acelular de proteínas utilizando ADN concatemérico bicatenario

Info

Publication number: ES2960381T3
Application number: ES18752135T
Authority: ES
Inventors: Erik Kvam; John Nelson; Wei Gao
Original assignee: Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Current assignee: Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2024-03-04
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: WO2019030155A1; KR102664617B1; JP2023052556A; KR20200036925A; AU2018314605A1; EP3665286A1; US11001868B2; CN110997922B; JP2020533964A; CN110997922A; EP3665286B1; US20190048379A1; JP7258361B2

Abstract

Se proporcionan métodos para la transcripción y traducción in vitro utilizando un ADN concatemérico bicatenario en un sistema de expresión libre de células eucariotas. El método incluye las etapas de (a) poner en contacto un ADN concatemérico bicatenario con un sistema de expresión libre de células eucariotas, y (b) expresar una proteína in vitro a partir del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión libre de células eucariotas. El ADN concatemérico bicatenario incluye una pluralidad de secuencias repetidas en tándem. La pluralidad de secuencias repetidas en tándem incluye una secuencia de expresión que incluye un promotor, un elemento de traducción independiente de caperuza (CITE) y un marco de lectura abierto. Una concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión libre de células eucariotas está en un intervalo de aproximadamente 0,1 ng/μL a aproximadamente 35 ng/μL. Se puede utilizar un ADN producto de RCA como ADN concatémero bicatenario para los métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión acelular de proteínas utilizando ADN concatemérico bicatenario

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene un listado de secuencias, que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 16 de junio de 2017, lleva el nombre 316478-1_SL.txt y tiene un tamaño de 5663 bytes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere en general a sistemas mejorados de expresión acelular de proteínas que implican la transcripción y traducciónin vitro(IVTT) de un ADN concatemérico bicatenario.

ANTECEDENTES

La expresión acelular de proteínas proporciona un método simple y eficiente para generar proteínas sin las complicaciones del cultivo celular, la ingeniería celular o la transfección celular. Los sistemas acelulares de expresión de proteínas para expresar proteínas recombinantes abordan diversas limitaciones de los sistemas celulares de expresión, como la toxicidad de las proteínas, la degradación de las proteínas, la agregación y el plegamiento incorrecto de las proteínas, la modificación postraduccional incontrolada o los efectos negativos de la expresión de proteínas en el crecimiento celular debido al secuestro de la maquinaria celular. Se pueden expresar cantidades significativamente mayores de proteínas en menos tiempo utilizando un sistema acelular de expresión de proteínas que se puede emplear para análisis estructurales y funcionales posteriores de alto rendimiento. Tal expresión de proteínasin vitrotambién tiene ventajas significativas en términos de ahorro de costes, producción optimizada, escalado más sencillo y purificación simplificada. En un sistema acelular de expresión de proteínas, una proteína deseada de interés se expresa al añadir un ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN) que codifica un gen de la proteína de interés a un extracto celular competente en transcripción y traducción, y realizar la transcripción y/o traducción del gen de interés. La transcripción y traducción del ADN que contiene el gen de interés se puede acoplar en una única reacción para permitir la traducción inmediata de un ARNm recién sintetizado en su proteína o pueden estar vinculadas, generando un ARNm en una primera reacción seguida de la traducción del ARNm generado en una proteína en una segunda reacción. La transcripción y traducciónin vitroacopladas (transcripcióntraducción acopladas en un sistema acelular) generalmente aumenta el rendimiento de las proteínas expresadas en menos tiempo y con menos manipulaciónin vitro.La traducción inmediata del ARNm también evita los posibles efectos adversos asociados a la degradación o el mal plegamiento del ARNm.

Una limitación de los sistemas de transcripción-traducciónin vitroes que requieren mayor cantidad (generalmente microgramos) de una plantilla de ADN. Generalmente, solo se pueden obtener cantidades suficientes de dichas plantillas de ADN mediante un flujo de trabajo con múltiples etapas y una gran cantidad de mano de obra. Por ejemplo, se pueden generar plantillas de ADN adecuadas para IVTT sintetizando una plantilla de ADN a partir de múltiples reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y/o clonando la plantilla de ADN en un vector plasmídico y propagando el vector plasmídico en una célula hospedadora tal comoE. coi.Sin embargo, la PCR a menudo no es adecuada para la generación a gran escala de ADN de alta calidad, debido en parte a la alta tasa de mutación de la PCR. Además, el ciclado térmico de las reacciones de PCR es difícil de escalar a reacciones más grandes debido a las limitaciones en la rapidez con la que se puede aumentar la temperatura en los grandes volúmenes. Además, los productos de la PCR, al ser secuencias de ADN lineales, los degradan rápidamente las nucleasas presentes en los extractos acelulares de transcripción y traducción. Además, la subclonación de un gen de interés en un vector plasmídico seguida de una propagación a gran escala enE. colimediante selección genética requiere mucho tiempo y trabajo.

En general, la transcripción y traducción acelulares en un extracto sin células de mamífero no es tan eficiente como la que utiliza un extracto de células procarióticas. Un método habitual para mejorar la expresión de proteínas utilizando extracto acelular de mamífero es suministrar reactivos en exceso (por ejemplo, aminoácidos y fuentes de energía) y usar una membrana de diálisis para eliminar los productos de desecho que afectan negativamente a la traducción. Sin embargo, en una diálisis, el volumen de la reacción de la IVTT aumenta significativamente. Además, es posible que el ADN de plantilla no se pueda recuperar de la cámara de diálisis. Por lo tanto, el ADN de plantilla debe proporcionarse en cantidades sustancialmente mayores para mantener la concentración final requerida del ADN de plantilla para una IVTT eficaz cuando se emplea la diálisis.

Se pueden emplear técnicas de amplificación isotérmica del ADN, tal como la amplificación por círculo rodante (RCA, por su nombre en inglés), para generar grandes cantidades de ADN de alta calidad con menos esfuerzo, tiempo y gasto. Las reacciones de amplificación isotérmica facilitan el aumento de escala a tamaños de reacción más grandes, ya que no es necesario un calentamiento y enfriamiento rápidos. La amplificación por círculo rodante emplea una plantilla de ADN circular y genera productos de RCA que son unidades repetidas en tándem (concatémeros) del ADN de plantilla. La RCA de un ADN plasmídico, seguido de la transcripción y traducción acopladasin vitro,puede generar la proteína de interés. Sin embargo, estos plásmidos generalmente se crean mediante métodos de clonación estándar que implican la selección genética dentro de una célula hospedadora tal comoE. coli.Dichos plásmidos contienen muchas secuencias codificantes y no codificantes adicionales, incluidas las secuencias para el origen de replicación (p. ej.,oriC), selección de antibióticos (p. ej.,amppara la p-lactamasa), y secuencias accesorias que se utilizan para la selección y/o cribado de plásmidos (p. ej.,lacZ,p-galactosidasa) en las células hospedadoras. La transcripción y/o expresión de estas secuencias auxiliares no resulta deseable y pueden hacer que todo el flujo de trabajo sea ineficiente.

La solicitud de patente internacional WO 2017/191007 A1 se refiere a métodos para la transcripción y traducciónin vitrode un producto de RCA. Los métodos comprenden proporcionar un producto bicatenario por RCA, en donde el producto bicatenario por RCA consiste esencialmente en repeticiones en tándem de una secuencia para expresión minimalista. Los métodos comprenden además expresar una proteína del producto bicatenario de la RCA en un sistema de expresión acelular.

Naoko Abe et al: "Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells",Scientific Reports, vol 5, n.° 1, 10 de noviembre de 2015, DOI: 10.1038/srep16435 se refiere a ARN circulares con un marco de lectura abierto infinito y su traducción en sistemas eucarióticos. Los ARN circulares se tradujeron en proteínas largas en lisados de reticulocitos de conejo en ausencia de cualquier elemento particular para la entrada interna a los ribosomas, una cola poli-A o una estructura de tipo caperuza. Los sistemas de traducción en los eucariotas pueden aceptar un ARN mucho más simple como plantilla para la síntesis de proteínas mediante ciclación. Las secuencias concateméricas no se mencionan en este artículo.

Gyanendra Kumar et al: "Cell-free protein synthesis using multiply-primed rolling circle amplification products”,Biotechniques rapiddispatches,vol 47, n.° 1, 1 de julio de 2009, páginas 637-639, ISSN de EE. UU.: 0736-6205, DOI: 10.2144 /000113171 se refiere al uso de ADN bicatenario generado mediante la amplificación por círculo rodante como plantilla en la transcripción y traducción utilizando un sistema acelular basado enE. coli.Este sistema no es eucariótico y no se mencionan las secuencias concateméricas.

Existe una necesidad de mejorar los sistemas eucarióticos de transcripción y traducciónin vitropara una fácil generación de las proteínas deseadas a partir de una concentración escasa de ADN de plantilla en comparación con el ADN plasmídico y, por lo tanto, no requiere la síntesis de ADN de plantilla por PCR. Además, es deseable habilitar sistemas acelulares de proteínas utilizando métodos que sean simples, baratos y que requieran menos tiempo.

BREVE DESCRIPCIÓN

En algunas realizaciones de la invención se da a conocer un método para la transcripción y traducciónin vitroutilizando un ADN concatemérico bicatenario. El método incluye las etapas de (a) poner en contacto un ADN concatemérico bicatenario con un sistema de expresión acelular eucariótico, y (b) expresar una proteínain vitroa partir del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico. El ADN concatemérico bicatenario incluye una pluralidad de secuencias repetidas en tándem, en donde cada una de las secuencias repetidas en tándem incluye una secuencia para expresión. La secuencia para expresión incluye un promotor, un elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) y un marco abierto de lectura (ORF). Una concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un intervalo de aproximadamente 0,1 ng/pl a aproximadamente 35 ng/pl.

En algunas realizaciones de la invención se da a conocer un método para la transcripción y traducciónin vitroutilizando un concatémero bicatenario (ADN) generado a partir de un minicírculo de ADN. El método comprende las etapas de (a) proporcionar un minicírculo de ADN, (b) generar un ADN concatemérico bicatenario mediante amplificación por círculo rodante del minicírculo de ADN, y (c) poner en contacto el ADN concatemérico bicatenario generado con un sistema de expresión acelular eucarióticoin vitropara expresar una proteína desde el ADN concatemérico bicatenario mediante transcripción y traducción. La concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/pl a 35 ng/pl.

DIBUJOS

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la invención se entenderán mejor cuando se lea la siguiente descripción detallada con referencia a las figuras adjuntas.

En la figura 1 se ilustra la expresión acelular de una proteína fluorescente verde Turbo (TurboGFP) usando diferentes concentraciones del ADN producido por RCA tioado o no tioado, generado a partir de un ADN plasmídico, como plantilla para la transcripción y traducciónin vitroen comparación con un ADN plasmídico no amplificado.

En la figura 2 se ilustra un minicírculo de ADN que tiene una secuencia para expresión minimalista.

La figura 3 es una imagen de un SDS PAGE que ilustra la expresión acelular de una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) cuando se usaron diferentes concentraciones del ADN producido por RCA derivado de un minicírculo de ADN para las reacciones de transcripción y traducciónin vitro.Como control se utilizó la expresión de TurboGFP mediante IVTT a partir de un plásmido pCFE-GFP.

En la figura 4 se ilustra la expresión acelular comparativa de una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) usando diferentes concentraciones de un ADN producido por RCA derivado de un minicírculo de ADN con el de una plantilla de ADN plasmídico como control, generado mediante densitometría en gel del SDS-PAGE de la figura 3.

En la figura 5 se ilustra la expresión acelular de una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) cuando un ADN producido por RCA derivado de un minicírculo de ADN se conjuga con perlas magnéticas y se usa como plantilla para la transcripción y traducciónin vitro, en donde una plantilla de ADN plasmídico no conjugado que codifica TurboGFP se usa como control.

La figura 6A-C son representaciones esquemáticas de secuencias repetidas en tándem que incluyen dos secuencias de expresión, en donde las secuencias de expresión codifican una misma proteína (figura 6A), las secuencias de expresión codifican dos proteínas diferentes (figura 6B), o cada una de las secuencias de expresión incluye dos ORF que codifican dos proteínas diferentes (figura 6C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La siguiente descripción detallada es ejemplar y no pretende limitar la invención ni los usos de la invención. A lo largo de la especificación, la ejemplificación de términos específicos debe considerarse como ejemplos no limitativos. Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se puede aplicar un lenguaje aproximado, tal como se utiliza en la presente memoria a lo largo de la especificación y las reivindicaciones, para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variar permisiblemente sin dar como resultado a un cambio en la función básica con la que está relacionada. En consecuencia, un valor modificado por un término como "acerca de" no debe limitarse al valor preciso especificado. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reacción, etc., utilizados en la especificación y en las reivindicaciones deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente especificación y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se desea obtener mediante la presente invención. Cuando fue necesario, se han suministrado márgenes y dichos márgenes incluyen todos los submárgenes intermedios. Para describir y señalar de forma más clara y concisa el objeto en cuestión de la invención reivindicada, se dan a conocer las siguientes definiciones para términos específicos, que se utilizan en la siguiente descripción y en las reivindicaciones adjuntas.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "nucleósido" se refiere a un compuesto de glucosilamina en donde una base de ácido nucleico (nucleobase) está unida a un resto de azúcar. Un "nucleótido" se refiere a un fosfato de nucleósido. Un nucleótido se puede representar con las letras del alfabeto (designación de letras) correspondientes a su nucleósido, como se describe en la tabla 1. Por ejemplo, A denota adenosina (un nucleósido que contiene la nucleobase adenina), C denota citidina, G denota guanosina, U denota uridina y T indica timidina (5-metiluridina). N representa un nucleósido aleatorio y dNTP se refiere a trifosfato de desoxirribonucleósido. N puede ser cualquiera de A, C, G o T/U.

Tabla 1: Letras asignadas a los distintos nucleótidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "análogo de nucleótido" se refiere a los compuestos que son estructuralmente análogos a los nucleótidos naturales. El análogo de nucleótido puede tener alterada la cadena principal de fosfatos, un resto de azúcar, una nucleobase o sus combinaciones. Los análogos de nucleótidos pueden ser un nucleótido natural, un nucleótido sintético, un nucleótido modificado o un resto de reemplazo sustituto (por ejemplo, inosina). Generalmente, los análogos de nucleótidos con nucleobases alteradas confieren, entre otras cosas, diferentes propiedades de emparejamiento de bases y apilamiento de bases. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "nucleótido de LNA (ácido nucleico bloqueado)" se refiere a un análogo de nucleótido, en donde el resto de azúcar del nucleótido contiene una unidad de furanosa bicíclica bloqueada en una conformación del azúcar que imita el ácido ribonucleico (ARN). El cambio estructural de un desoxirribonucleótido (o un ribonucleótido) al nucleótido de LNA está limitado desde una perspectiva química, es decir, la introducción de un enlace adicional entre los átomos de carbono en la posición 2' y la posición 4' (por ejemplo, enlace 2'-C, 4'-C-oximetileno; véase, por ejemplo, Singh, S. K., et al.,Chem. Comm.,4, 455-456, 1998, o Koshkin, A. A., et al.,Tetrahedron,54, 3607-3630, 1998.)). Las posiciones 2' y 4' de la unidad de furanosa en el nucleótido de LNA pueden estar unidas mediante un O-metileno (p. ej., oxi-LNA: nucleótido 2'-O,4'-C-metilén-p-D-ribofuranosilo), un S-metileno (tío-LNA), o un resto NH-metileno (amino-LNA), y similares. Tales enlaces restringen la libertad conformacional del anillo de furanosa. Los oligonucleótidos de LNA muestran mayor afinidad de hibridación por el ARN monocatenario complementario y el ADN monocatenario o bicatenario complementario. Los oligonucleótidos de LNA pueden inducir conformaciones dúplex de tipo A (similares al ARN). La cadena principal del PNA está compuesta por unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos. Las diversas bases purínicas y pirimidínicas están unidas al esqueleto mediante un puente de metileno (-CH<2>-) y un grupo carbonilo (-(C=O)-). Los PNA se representan como péptidos, con el extremo N en la primera posición (izquierda) y el extremo C en la última posición (derecha). Los oligómeros de PNA muestran una mayor especificidad en la unión por los ADN complementarios, y la eficacia y especificidad de unión también se aplica a los dúplex de PNA/ARN. Los PNA no son fácilmente reconocidos ni por las nucleasas ni por las proteasas, lo que los hace resistentes a la degradación enzimática. Los PNA también son estables en un amplio margen de pH. Los análogos de nucleótidos que tienen una cadena principal de fosfato-azúcar alterada (por ejemplo, PNA, LNA) a menudo modifican, entre otras cosas, las propiedades de la cadena, tales como la formación de estructuras secundarias. Un asterisco (*) delante de la designación de una letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido modificado con fosforotioato. Por ejemplo, *N representa un nucleótido cualquiera modificado con fosforotioato, "atN" representa un nucleótido aleatorio, en donde el nucleótido puede ser cualquiera de 2-amino dA, 2-tío-dT, G normal o C normal, el signo más (+) delante de una designación de letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido de LNA. Por ejemplo, A representa un nucleótido de LNA de adenosina y N representa un nucleótido cualquiera bloqueado (es decir, un nucleótido al azar de LNA).

Tal como se usa en la presente memoria, el término ''nucleótidos modificados" se refiere a nucleótidos que tienen modificaciones, en donde un resto adicional está unido a los nucleótidos (por ejemplo, un nucleótido biotinilado). Las modificaciones pueden exponerse en el surco mayor o en el surco menor. Los nucleótidos modificados son una herramienta cómoda para la introducción enzimática de grupos funcionales en un ácido nucleico diana de interés. La modificación del surco mayor debido a la nucleobase permite una mejor eficiencia de incorporación con la posición 5 de las pirimidinas y la posición 7 de las purinas. A menudo, las modificaciones requeridas se introducen en un nucleótido a través de un conector (por ejemplo, un resto de biotina unido a un nucleótido mediante un conector). La flexibilidad del brazo conector que se une al sitio de modificación puede influir en la utilización de los nucleótidos. Por ejemplo, los conectores lineales rígidos proporcionan una mejor incorporación de dNTP durante la amplificación de ácidos nucleicos. La longitud del brazo conector también desempeña una función en la incorporación de dNTP modificados durante la amplificación. Por ejemplo, los nucleótidos biotinilados a menudo se preparan mediante la conjugación de 5-aminoalil-dCTP y 5-aminoalil-dUTP con un conector que contiene biotina para preparar los nucleótidos biotinilados. La posición y longitud del conector también afectan a la introducción de grupos funcionales para cada uno de los cuatro dNTP. Los dNTP modificados con brazos conectores más cortos son mejores sustratos para la reacción de amplificación que los nucleótidos con brazos conectores más largos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a oligómeros de nucleótidos. El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a polímeros de nucleótidos. El término "secuencia", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido o un ácido nucleico. A lo largo de la especificación, siempre que un oligonucleótido o ácido nucleico esté representado por una secuencia de letras, los nucleótidos están en orden 5 '^ 3 ' de izquierda a derecha. Los oligonucleótidos o ácidos nucleicos pueden ser un ADN, un ARN o sus análogos (por ejemplo, un análogo con fosforotioatos). Los oligonucleótidos o ácidos nucleicos también pueden incluir bases y/o cadenas principales modificadas (por ejemplo, enlace fosfato modificado o resto de azúcar modificado). Los ejemplos no limitantes de cadenas principales sintéticas que confieren estabilidad y/u otras ventajas a los ácidos nucleicos pueden incluir enlaces fosforotioato, ácido peptidonucleico, ácido nucleico bloqueado, ácido nucleico de xilosa o sus análogos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido lineal pequeño que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, una plantilla de ADN que se va a amplificar) para cebar una reacción de síntesis de ácidos nucleicos. El cebador puede ser un oligonucleótido de ARN, un oligonucleótido de ADN o una secuencia quimérica. El cebador puede contener nucleótidos naturales, sintéticos o modificados. Tanto el límite superior como el inferior de la longitud del cebador se determinan empíricamente. El límite inferior de la longitud del cebador es la longitud mínima que se requiere para formar un dúplex estable tras la hibridación con el ácido nucleico diana en las condiciones de reacción de amplificación de ácido nucleico. Los cebadores muy cortos (normalmente de menos de 3 nucleótidos de longitud) no forman dúplex termodinámicamente estables con el ácido nucleico diana en tales condiciones de hibridación. El límite superior suele estar determinado por la posibilidad de que se formen dúplex en una región distinta de la secuencia de ácido nucleico predeterminada en el ácido nucleico diana. Generalmente, las longitudes de cebador adecuadas están en el intervalo de aproximadamente 3 nucleótidos de longitud a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cebador aleatorio" se refiere a una mezcla de secuencias de cebadores, generadas aleatorizando un nucleótido en cualquier ubicación dada en una secuencia de oligonucleótido de tal manera que la ubicación dada pueda consistir en cualquiera de los posibles nucleótidos o sus análogos (aleatorización completa). Por tanto, el cebador aleatorio es una mezcla aleatoria de secuencias de oligonucleótidos, que consiste en todas las combinaciones posibles de nucleótidos dentro de la secuencia. Por ejemplo, un cebador aleatorio hexamérico puede estar representado por una secuencia NNNNNN o (N)6. Un cebador de ADN aleatorio hexamérico consiste en todas las combinaciones hexaméricas posibles de 4 nucleótidos de ADN, A, C, G y T, lo que da como resultado una mezcla aleatoria que comprende 46 (4096) secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN hexaméricos. Los cebadores aleatorios pueden usarse eficazmente para cebar una reacción de síntesis de ácidos nucleicos cuando se desconoce la secuencia del ácido nucleico diana o para realizar una reacción de amplificación de todo el genoma. Los cebadores aleatorios también pueden ser eficaces para cebar y producir un producto bicatenario de amplificación por círculo rodante (RCA) en lugar de un producto monocatenario de RCA, dependiendo de la concentración del cebador.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "amplificación por círculo rodante (RCA)" se refiere a una reacción de amplificación de ácido nucleico que amplifica una plantilla de ácido nucleico circular (por ejemplo, círculos de ADN monocatenario/bicatenario) mediante un mecanismo de círculo rodante. La reacción de amplificación por círculo rodante se inicia con la hibridación de un cebador con una plantilla de ácido nucleico circular, a menudo monocatenario. Luego, la polimerasa de ácido nucleico extiende el cebador que está hibridado a la plantilla de ácido nucleico circular progresando continuamente alrededor de la plantilla de ácido nucleico circular para replicar la secuencia de la plantilla de ácido nucleico una y otra vez (mecanismo de círculo rodante). La amplificación por círculo rodante normalmente produce concatémeros que comprenden unidades repetidas en tándem de la secuencia plantilla del ácido nucleico circular. La amplificación por círculo rodante puede ser una RCA lineal (LRCA), que exhibe una cinética de amplificación lineal (por ejemplo, RCA que usa un cebador único y específico), o puede ser una RCA exponencial (ERCA) que exhibe una cinética de amplificación exponencial. La amplificación por círculo rodante también se puede realizar utilizando cebadores múltiples (amplificación por círculo rodante con cebado múltiple o MPRCA) que conducen a concatémeros hiperramificados. Por ejemplo, en una RCA con doble cebado, un cebador puede ser complementario, como en la RCA lineal, a la plantilla de ácido nucleico circular, mientras que el otro puede ser complementario a las secuencias de ácido nucleico de las unidades repetidas en tándem del producto de RCA. En consecuencia, la RCA con doble cebado puede proceder como una reacción en cadena con una cinética de amplificación exponencial que presenta una cascada en serie de eventos de hibridación múltiple, extensión de cebador y desplazamiento de hebra que involucran tanto a los cebadores como a ambas hebras. Esto genera a menudo un conjunto discreto de productos de amplificación de ácidos nucleicos bicatenarios concateméricos. La RCA se puede realizarin vitroen las condiciones isotérmicas usando una polimerasa de ácido nucleico adecuada, tal como la ADN polimerasa de 029. Las polimerasas adecuadas poseen capacidad de síntesis de ADN por desplazamiento de hebra.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia para expresión" se refiere a una secuencia de ADN que es competente para la expresión de proteínas. En otras palabras, una secuencia para expresión es una unidad competente para la expresión que incluye al menos un promotor unido operativamente a uno o más marcos de lectura abiertos (ORF). Uno o más o Rf pueden codificar una o más proteínas iguales o diferentes. En algunos casos, una secuencia para expresión puede incluir un promotor unido operativamente a más de un ORF. Por ejemplo, una secuencia para expresión puede incluir un promotor funcionalmente unido a dos ORF diferentes, uno que codifica una cadena pesada y el otro que codifica una cadena ligera de un anticuerpo. Una secuencia para expresión puede incluir además secuencias tales como un elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) para ayudar a la expresión de proteínas eficiente.

Una o más realizaciones de la invención se refieren a métodos para expresar una proteína en un sistema de expresión acelular eucariótico (p. ej., un sistema de transcripción y traducciónin vitroo IVTT). En una realización, la proteína se expresa por transcripción y traducciónin vitrode un ADN concatemérico bicatenario (por ejemplo, un ADN producido por RCA que se genera mediante amplificación por círculo rodante). Estas reacciones de transcripción y traducciónin vitroproducen productos proteicos que están desprovistos de cualquier contaminación de células intactas. La generación de tales proteínas puede ser deseable en una gran variedad de aplicaciones, incluida la proteómica estructural y funcional. La expresión acelular de tales proteínas puede ser particularmente deseable para las aplicaciones terapéuticas.

La expresión acelular generalmente abarca dos modos: (1) el ARNm y la proteína se producen en una sola reacción (p. ej., una IVTT acoplada) y (2) el ARNm se produce en una primera reacción y el producto de ARNm resultante se agrega a una segunda reacción de traducción distinta (por ejemplo, una IVTT vinculada). El ADN concatemérico bicatenario, tal como un ADN bicatenario producido por RCA, se puede utilizar para cualquiera de los modos (1) o (2). Por ejemplo, en una realización, el producto de RCA puede proporcionarse a una reacción de transcripción y traducciónin vitroacopladas, en donde el ADN producido por RCA se convierte en un ARNm y el ARNm se expresa simultáneamente en una proteína en una única mezcla de reacción que es capaz de producir ARN y proteína. En otra realización, el producto de RCA se puede proporcionar a una reacción de transcripción y traducción vinculadas, en donde el ADN producido por RCA se convierte primero en ARNm en una mezcla de reacción de transcripción, y luego el ARNm generado se agrega a una mezcla de reacción de traducción para la expresión de proteínas. En algunas realizaciones, los productos de RCA proporcionados a la reacción de transcripción y traducciónin vitroacopladas o la reacción de transcripción y traducción vinculadas proceden de un minicírculo de ADN.

En una realización de la invención, el método para la transcripción y traducciónin vitroincluye las etapas de poner en contacto un ADN concatemérico bicatenario con un sistema de expresión acelular eucariótico y expresar una proteínain vitroa partir del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico. El ADN concatemérico bicatenario comprende una pluralidad de secuencias repetidas en tándem. Cada una de la pluralidad de secuencias repetidas en tándem comprende una secuencia para expresión que comprende un promotor, un elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) y un ORF. Una concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un intervalo de aproximadamente 0,1 ng/pl a aproximadamente 35 ng/pl. En las figuras 1 y 3-5 se ilustra la expresión acelular de diferentes proteínas usando diferentes concentraciones de ADN concatemérico bicatenario como plantilla para las reacciones de transcripción y traducciónin vitro.En algunas realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario es un producto de amplificación por círculo rodante (RCA) bicatenario. En algunas realizaciones, el ADN producido por RCA procede de una secuencia para expresión minimalista. En la figura 2 se muestra una realización de la secuencia para expresión minimalista (minicírculo). En la figura 2 se ilustra una secuencia para expresión minimalista que comprende un terminador de la transcripción (terminador p11A T7) que incluye una secuencia poliA p11A, en donde p11A representa 11 restos de adenina.

En algunas realizaciones de la invención, cada una de las secuencias repetidas en tándem comprende al menos una secuencia para expresión. En tales realizaciones, al menos una secuencia para expresión comprende al menos un promotor, al menos un CITE y al menos un ORF. En algunas realizaciones de la invención, cada una de las secuencias repetidas en tándem comprende dos o más secuencias para expresión. Las dos o más secuencias para expresión pueden codificar una misma proteína o proteínas diferentes. En algunas realizaciones, la secuencia para expresión incluye al menos un promotor que está funcionalmente unido a al menos un ORF. Por ejemplo, en un aspecto, en una secuencia para expresión, un promotor está funcionalmente unido a un ORF como se ilustra esquemáticamente en la figura 6A y en la figura 6B. En otro aspecto, en una secuencia para expresión, un promotor está funcionalmente unido a dos ORF diferentes como se ilustra esquemáticamente en la figura 6C. En algunas realizaciones de la invención, la secuencia para expresión puede incluir dos o más promotores unidos funcionalmente a dos o más ORF.

En referencia adicional a las figuras 6A-C, en la figura 6A se ilustra una secuencia repetida en tándem que incluye dos secuencias para expresión, en donde ambas secuencias para expresión codifican la misma proteína. En otro ejemplo, en la figura 6B se ilustra una secuencia repetida en tándem que incluye dos secuencias para expresión, en donde una primera secuencia para expresión codifica una primera proteína y una segunda secuencia para expresión codifica una segunda proteína, en donde la primera proteína es diferente de la segunda proteína. En ambas figuras 6A y 6B, la secuencia para expresión ilustrada incluye un promotor funcionalmente unido a un elemento de traducción independiente de la caperuza (por ejemplo, IRES) y un único ORF.

En la figura 6C se ilustra una secuencia para expresión que incluye dos ORF que codifican dos proteínas diferentes. En la figura 6C, una secuencia para expresión incluye un promotor unido operativamente a dos ORF diferentes, codificando cada uno de ellos una proteína que es diferente del otro. En este ejemplo, un único promotor está funcionalmente unido a dos ORF a través de un elemento de traducción independiente de la caperuza. Cada uno de los ORF incluye secuencias de inicio y parada de traducción. Se necesita tener una secuencia de terminación de la traducción o de parada; de lo contrario, se puede sintetizar una poliproteína infinita, lo cual no es deseable. Sin embargo, un codón de parada transcripcional puede ser opcional para el primer ORF que conduce a la generación de un ARNm policistrónico tras la transcripción. En tales casos, las secuencias intermedias entre el primer y el segundo ORF se pueden seleccionar de modo que tras la IVTT, incluso si se produce un único ARNm policistrónico, se pueda traducir en dos proteínas diferentes.

En la figura 6C, un promotor está funcionalmente acoplado a un IRES y dos ORF (por ejemplo, un primer ORF y un segundo ORF). El primer ORF codifica una primera proteína y el segundo ORF codifica una segunda proteína, diferente de la primera proteína. Cada uno de los ORF incluye secuencias de inicio y parada de traducción. Se genera un ARNm policistrónico tras la transcripción de la secuencia para expresión ilustrada en la figura 6C. La síntesis de la primera proteína mediante la traducción del primer ORF puede ir seguida de un deslizamiento ribosómico hacia la segunda secuencia de inicio de la traducción del segundo ORF para iniciar la síntesis de la segunda proteína a partir del segundo ORF. Esto se puede lograr incorporando "secuencias de autoescisión'' entre el primer y el segundo ORF. Las secuencias de autoescisión adecuadas, tal como el motivo vírico P2A, facilitan la creación de dos o más proteínas a partir de un único ARNm.

Tal como se señaló anteriormente, en ausencia de un elemento IRES, se pueden incorporar péptidos 2A “autoescindibles” en la secuencia policistrónica para producir cantidades equimolares de múltiples genes a partir del mismo ARNm tras la traducción. Estos péptidos 2A normalmente funcionan haciendo que el ribosoma se salte la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C de un elemento 2A, lo que lleva a una separación entre el final de la secuencia 2A y el comienzo del siguiente péptido que va detrás. La "escisión" ocurre entre los restos de glicina y prolina que se encuentran en el extremo C, lo que significa que al cistrón delantero se le agregarán algunos restos adicionales al final, mientras que el cistrón posterior comenzará con la prolina. Cuatro péptidos 2A diferentes, tales como las SEQ ID n.os 1-4, se usan habitualmente (tabla 2) con fines de autoescisión en las células eucariotas.

Tabla 2: Secuencias representativas del péptido 2A

SEQ ID n.2 Péptido Secuencia de aminoácidos

En una o más realizaciones de la invención, el ADN concatemérico bicatenario es un ADN bicatenario producido por RCA. El ADN producido por RCA puede ser un concatémero lineal o ramificado que tiene secuencias repetidas en tándem. En algunas realizaciones de la invención, se pueden emplear múltiples (por ejemplo, dos) ADN concateméricos bicatenarios por separado, en donde cada uno de los ADN concateméricos bicatenarios por separado incluyen secuencias de expresión que codifican diferentes proteínas. Por ejemplo, se pueden emplear dos ADN producidos por RCA, en donde un primer ADN producido por RCA incluye una primera secuencia para expresión que codifica una primera proteína y un segundo ADN producido por RCA incluye una segunda secuencia para expresión que codifica una segunda proteína, en donde la primera proteína es diferente de la segunda proteína. El ADN concatemérico bicatenario, tal como el ADN producido por RCA, puede comprender un nucleótido modificado, un análogo de nucleótido o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones de la invención, el ADN concatemérico bicatenario comprende un análogo de nucleótido (por ejemplo, un nucleótido con fosforotioato) o un nucleótido modificado (por ejemplo, un nucleótido biotinilado). El ADN concatemérico bicatenario puede incluir, entre otros, un nucleótido biotinilado, un nucleótido con fosforotioato, un nucleótido que contiene inosina, un nucleótido de LNA, un nucleótido de PNA, 2-aminodesoxiadenosina, 2-tiodesoxitimidina, un nucleótido policatiónico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, cada una de las secuencias repetidas en tándem del ADN concatemérico bicatenario comprende un análogo de nucleótido.

En alguna realización de la invención, el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido con fosforotioato. Los nucleótidos con fosforotioatos incluyen dNTP con fosforotioato, tales como a-S-dATP o a-S-dTTP. El término nucleótido con "fosforotioato" se utiliza indistintamente en lo sucesivo como nucleótido "tioado". En algunas realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario, tal como un ADN producido por RCA, puede estar tioado internamente (tener a-tío-dNTP). En algunas realizaciones de la invención, para generar un ADN concatemérico bicatenario que está internamente tioado, las reacciones de RCA se complementan con nucleótidos con fosforotioato. Los nucleótidos con fosforotioato se incorporan a la mezcla de dNTP para la incorporación aleatoria de bases tioadas en el ADN producido por RCA durante la amplificación. En algunas otras realizaciones de la invención, se puede generar un ADN producido por RCA que comprende un nucleótido con fosforotioato (por ejemplo, tioado, que tiene atío-dNTP) empleando una secuencia cebadora tioada para la reacción de RCA. En determinadas realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido biotinilado, que puede usarse para conjugar el ADN concatemérico bicatenario con un sustrato, tal como una perla que lleva unida estreptavidina. Se puede generar un ADN concatemérico bicatenario biotinilado realizando una reacción de RCA con un cebador biotinilado. El ADN biotinilado resultante producido por RCA generalmente se purifica para eliminar el exceso de cebadores biotinilados antes de la conjugación con la perla que lleva unida la estreptavidina. El ADN biotinilado purificado producido por RCA se puede mezclar con perlas de estreptavidina para conjugar el ADN producido por RCA con las perlas de estreptavidina.

Convencionalmente, para una reacción de IVTT que utiliza un sistema de expresión acelular procariótico, tal como uno que utiliza un lisado de células deE. coli,se requieren de 5 a 10 ng de ADN para plantilla por microlitro de reacción de IVTT. Para una reacción de IVTT utilizando un lisado de células protozoarias, se necesitaron al menos 35 ng/pl de ADN plasmídico para una expresión proteica adecuada. Sin embargo, para la reacción de IVTT usando un lisado de células eucariotas o de mamíferos, tal como un lisado de células HeLa o CHO, se han usado convencionalmente más de 40 ng/pl de ADN plasmídico para un mayor rendimiento de la expresión acelular de proteínas. La generación de cantidades tan grandes de ADN plasmídico para la reacción de IVTT eucariótica suele requerir mucha mano de obra y no es rentable. Por el contrario, la eficacia de una expresión acelular eucariótica de una proteína deseada fue significativamente mayor incluso cuando se utilizó para la reacción una concentración significativamente menor de ADN concatemérico bicatenario en comparación con la de un ADN plasmídico. En algunas realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 0,5 ng/pl a aproximadamente 20 ng/pl. En determinadas realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 5 ng/pl a aproximadamente 20 ng/pl. En algunas otras realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 2 ng/pl a aproximadamente 10 ng/pl. En algunas realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 3 ng/pl a aproximadamente 7 ng/pl. En una realización ejemplar, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico es de aproximadamente 5 ng/pl.

Se observó que la expresión acelular de proteínas en el lisado eucariótico mejoró inesperadamente usando para la plantilla una concentración más baja de ADN concatemérico bicatenario (p. ej., 0,125 pg de un ADN producido por RCA en una reacción de IVTT de 25 pl) en comparación con el uso de concentraciones más altas (p. ej., más de 1 pg del ADN producido por RCA en una reacción de IVTT de 25 pl). Por ejemplo, la aplicación de concentraciones más altas de plantilla de ADN de RCA, que comprende un gen TurboGFP, que las sugeridas por un kit de IVT (por ejemplo, 2 pg o 3 pg) dio como resultado rendimientos más bajos de la proteína TurboGFP en un sistema acelular de expresión de proteínas, como se muestra en la figura 1. Sin embargo, cuando el ADN producido por RCA se usó en concentraciones por debajo de la concentración sugerida según los protocolos del kit de IVT (p. ej., 500 ng, 250 ng y 125 ng), se observó una expresión acelular elevada de la proteína TurboGFP (figura 1). Los resultados eran similares utilizando ADN con fosforotioatos y sin fosforotioatos producido por RCA, con una expresión de proteínas marginalmente mejor a partir del ADN con fosforotioatos producido por RCA. A diferencia del resultado obtenido con el ADN producido por RCA, el rendimiento de proteína disminuyó proporcionalmente a la concentración de plantilla del ADN plasmídico en las mismas condiciones experimentales de IVTT. Por ejemplo, 500 ng de ADN plasmídico (dilución 2x según el protocolo de IVT del fabricante) produjeron menos proteína TurboGFP que con el uso de 1 pg de ADN plasmídico como plantilla (figura 1). Por lo tanto, se obtuvo una mejora significativa de la expresión acelular de proteínas a una concentración más baja de una plantilla de ADN producido por RCA en comparación con la de una plantilla de ADN plasmídico en una reacción de IVTT, lo cual no se esperaba. La tendencia creciente de la expresión acelular de proteínas (figura 1) con la disminución de la concentración de la plantilla de ADN producido por RCA también fue inesperada en comparación con las tendencias generales de la cinética de reacción de IVTT, en donde la expresión acelular de proteínas es directamente proporcional a la concentración del ADN de plantilla en una reacción de IVTT típica.

Generalmente, se requiere una mayor cantidad de plantilla de ADN al aumentar el volumen de reacción de IVTT. Por ejemplo, el kit Maxi IVT de humano de alto rendimiento en 1 etapa está formulado para volúmenes de reacción de 2 ml. Según los protocolos del kit, se requiere una concentración final de 40 ng/pl de plantilla de ADN plasmídico (es decir, 80 pg de ADN plasmídico por 2 ml de volumen de reacción) para una expresión eficaz de proteínas en un experimento de IVTT. Para aumentar aún más dicho volumen de reacción, se requieren mayores cantidades totales de ADN plasmídico, lo que aumenta aún más el coste, el tiempo de preparación y la mano de obra. Por ejemplo, un volumen de reacción de 4 ml requeriría un total de 160 pg de ADN plasmídico para alcanzar una concentración final de plantilla de 40 ng/pl. Además, en caso de ampliar proporcionalmente las reacciones, el número de reacciones de IVTT aumentaría en paralelo. Como el ADN de RCA es eficaz a ~5 ng/pl para la expresión acelular de proteínas, se necesitaron aproximadamente 20 pg de ADN total de RCA para permitir las reacciones individuales de 80 x 25 pl en lugar de 80 pg de ADN plasmídico total. Por tal motivo, el requisito de una menor cantidad de ADN producido por RCA como plantilla para la expresión acelular de una proteína es ventajoso para el aumento del volumen de reacción, la ampliación proporcional de las reacciones con dicho volumen y el control de costes de la plantilla.

Para mejorar el rendimiento proteico de las reacciones de transcripción y traducciónin vitroen extractos acelulares de mamíferos, a menudo se requiere la eliminación de productos de desecho, ya que afectan negativamente a la maquinaria de traducción. Esto se hace convencionalmente con membranas de diálisis. Además, el volumen de reacción de IVTT se aumenta para maximizar la concentración de los componentes dentro del sistema de diálisis. En consecuencia, el ADN de plantilla también se aumenta significativamente para mantener la concentración requerida del ADN de plantilla en el volumen de reacción de IVTT incrementado. Sin embargo, la plantilla de ADN tradicionalmente se pierde en la reacción de IVTT en solución. Para abordar estos problemas y mejorar el rendimiento de las proteínas por IVTT, la plantilla de ADN se puede inmovilizar sobre un sustrato para recuperar la plantilla de ADN de la reacción de IVTT en solución. En algunas realizaciones, la plantilla de ADN inmovilizado se expone al sistema de expresión acelular bajo un flujo continuo de modo que la proteína se produzca de manera continua a partir de la plantilla de ADN inmovilizado.

En una o más realizaciones de la invención, el método comprende además inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario sobre un sustrato. El sustrato usado para inmovilizar la plantilla de ADN concatemérico bicatenario puede seleccionarse entre una partícula magnética, una perla de Sepharose, un sustrato de vidrio, un sustrato polimérico o un sustrato metálico. La partícula magnética puede ser una perla magnética o un impulsor magnético. El sustrato puede ser entero, o parte de él, un tubo de ensayo de vidrio, una placa de Petri, una placa multipocillo, un dispositivo/sistema de microfluídica, un dispositivo/sistema analítico, en donde el ADN concatemérico bicatenario puede estar inmovilizado sobre el sustrato.

El ADN concatemérico bicatenario puede inmovilizarse sobre el sustrato mediante diversos métodos. Por ejemplo, en una realización, el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido biotinilado. En tales realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario puede inmovilizarse sobre un sustrato recubierto de estreptavidina mediante la interacción entre la biotina y la estreptavidina. La etapa de inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario sobre el sustrato recubierto de estreptavidina se realiza antes de poner en contacto el ADN concatemérico bicatenario con el sistema de expresión acelular eucariótico. Después de inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario sobre el sustrato, se le añade el sistema de expresión acelular eucariótico de proteínas al ADN concatemérico bicatenario inmovilizado, que funciona como plantilla para la expresión acelular de proteínasin vitro.El ejemplo 4 demuestra claramente la expresión acelular de un ADN producido por RCA generado a partir de minicírculos de ADN (véase la figura 2) y posteriormente inmovilizado sobre perlas de estreptavidina, en donde el ADN producido por RCA estaba biotinilado. En este ejemplo, el producto de RCA se inmoviliza sobre perlas de estreptavidina.

En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además recuperar el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado de la mezcla de reacción que comprende el sistema de expresión eucariótico después de expresar la proteínain vitro.En tales realizaciones, después de expresar la proteína, la mezcla que contiene la proteína deseada expresada y el sistema de expresión acelular eucariótico restante se puede transferir a un recipiente diferente. El ADN concatemérico bicatenario inmovilizado puede lavarse (por ejemplo, usando un tampón de lavado) antes de su uso posterior en una reacción de IVTT posterior.

En una o más realizaciones de la invención, el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado recuperado puede reutilizarse en uno o más sistemas de expresión acelulares posteriores. El ADN concatemérico bicatenario inmovilizado recuperado se puede reutilizar con o sin una o más etapas de lavado para eliminar cualquier impureza arrastrada desde el sistema de expresión acelular anterior.

En algunas realizaciones de la invención, cada una de la pluralidad de secuencias repetidas en tándem del ADN concatemérico bicatenario comprende una secuencia para expresión que comprende un promotor, un CITE y un ORF, en donde el CITE comprende un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), un elemento potenciador de la traducción (TEE), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el ADN producido por RCA empleado como plantilla de ADN concatemérico bicatenario comprende una secuencia IRES como CITE. Se pueden emplear como CITE numerosos ejemplos de secuencias IRES o TEE adecuadas conocidas en la técnica, incluidas las procedentes de virus o secuencias nativas dentro de organismos vivos. La presencia de la secuencia IRES impulsa la traducción eficiente en un sistema de expresión acelular eucariótico incluso cuando la concentración del ADN producido por RCA es significativamente menor en comparación con la de un ADN plasmídico (como se muestra en la figura 1). El plegamiento del ARN de los elementos IRES puede afectar a la regulación de la eficiencia traduccional. En algunas realizaciones, para una traducción eficiente, los componentes del sistema de expresión acelular de proteínas, como el lisado de células HeLa, se optimizan de manera que garantice el plegamiento eficaz del ARN de los elementos IRES.

La secuencia para expresión comprende uno o más ORF, en donde cada uno de los ORF incluye secuencias de inicio de la traducción y secuencias de terminación de la traducción. En determinadas realizaciones, un ORF comprende una secuencia con los codones optimizados, una secuencia de identificación para la purificación, una secuencia peptídica amino-terminal fusionada derivada de un IRES para un reconocimiento mejorado de los ribosomas, un sitio de escisión para proteasas, un péptido señal o sus combinaciones. La secuencia de identificación para la purificación se puede emplear para la purificación de la proteína expresada. En una o más realizaciones, el ORF de la secuencia para expresión en cada una de la pluralidad de secuencias repetidas en tándem del ADN concatemérico bicatenario comprende una secuencia con los codones optimizados para mejorar la traducción. Para generar una secuencia con los codones optimizados, el sesgo de codones, la preferencia de codones contextual y/o la preferencia de cada codón son algunos de los factores que se suelen considerar.

La secuencia con los codones optimizados del ORF mejora la velocidad o calidad de traducción de la secuencia para expresión en el ADN producido por RCA. La optimización de codones generalmente mejora la expresión de proteínas al aumentar la estabilidad del ARNm o la eficiencia traduccional de un gen de interés. La funcionalidad de un gen también puede incrementarse optimizando el uso de codones dentro del gen diseñado a medida. En algunas realizaciones de optimización de codones, un codón de baja frecuencia en una especie puede reemplazarse por un codón de alta frecuencia. Por ejemplo, un codón UUA de baja frecuencia puede sustituirse por un codón CUG de alta frecuencia para la leucina. En realizaciones adicionales de optimización de codones, se puede usar un codón que reconozcan los ARNt que están altamente cargados cuando faltan aminoácidos. La optimización de codones puede aumentar la estabilidad del ARNm y, por tanto, modificar la velocidad de traducción o plegamiento de las proteínas. Además, la optimización de codones puede personalizar el control transcripcional y traduccional, modificar los sitios de unión a ribosomas o estabilizar los sitios de degradación del ARNm.

En algunas realizaciones de la invención, el ORF puede incluir una secuencia de identificación para la purificación de la proteína expresada. La secuencia de identificación puede ser una etiqueta de afinidad, una secuencia de reconocimiento para la escisión por proteasas o sus combinaciones. La etiqueta de afinidad se puede utilizar para purificar y detectar con rapidez las proteínas recombinantes. La etiqueta de afinidad puede incluir una etiqueta de polihistidinas (his6) (SEQ ID n.° 8), etiqueta de glutatión S-transferasa (GST), hemaglutinina (HA), myc (derivado del producto del genc-myc),FLAG (que consiste en ocho aminoácidos ácidos Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID n.° 9) que incluye un sitio de escisión para la enterocinasa) o sus combinaciones. Aunque las etiquetas fusionadas ayudan a una rápida purificación o detección de la proteína deseada, las etiquetas pueden no considerarse como elementos permanentes o dominios de las proteínas recombinantes. Por lo tanto, a menudo es necesaria la eliminación de la etiqueta fusionada para estudios altamente analíticos de la estructura y función de las proteínas recombinantes. La etiqueta para la purificación se puede eliminar de la proteína usando otro tipo de etiqueta, tal como una etiqueta para escisión por proteasas. La etiqueta para escisión por proteasas se puede usar para escindir un enlace peptídico concreto dentro de una proteína o secuencia peptídica específica. La etiqueta para escisión por proteasas puede incluir, por ejemplo, la etiqueta para la proteasa PreScission (GE Healthcare) o la etiqueta para la proteasa trombina (GE Healthcare).

En una o más realizaciones de la invención, cada una de la pluralidad de secuencias repetidas en tándem incluye además una secuencia de poliA, una secuencia intrónica, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia aislante o sus combinaciones. En algunas realizaciones, cada una de las secuencias repetidas en tándem incluye además una secuencia de terminación de la transcripción y un sitio de poliadenilación, en donde la secuencia de terminación de la transcripción y los sitios de poliadenilación se suelen situar en el extremo 3' de un gen en una plantilla de ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción proporcionan señales en el ARNm recién sintetizado para iniciar el proceso de liberación del ARNm del complejo transcripcional, lo que también puede ayudar a la traducción eficaz del producto proteico deseado.

Los efectos de una terminación ineficaz de la transcripción en un producto de RCA derivado de un minicírculo son en gran medida intrascendentes en comparación con un producto de RCA derivado de un ADN plasmídico. En algunos casos, el ADN plasmídico que contiene un gen de interés debe digerirse con una enzima de restricción para crear una rotura bicatenaria del ADN inmediatamente después del gen para evitar que la transcripción prosiga más allá de ese punto cuando el producto de RCA se deriva del plásmido. Si se desbordara la transcripción, se transcribirían las otras secciones del plásmido que contienen muchas secuencias codificantes y no codificantes (incluidas las secuencias para el origen de replicación, selección de antibióticos y secuencias accesorias que se utilizan para la selección, detección y/o propagación del plásmido en una célula hospedadora). El producto de RCA derivado del ADN plasmídico, cuando se usa en un estado no digerido, puede producir especies de ARNm no deseadas, mediante su transcripción completa, que corre el riesgo de producir proteínas contaminantes junto con (o en mayor cantidad que) la proteína de interés. Sin embargo, una terminación deficiente de la transcripción en un producto de RCA derivado de un minicírculo aún puede generar el ARNm deseado. En consecuencia, el rendimiento de proteína acelular es mejor a partir de un producto de RCA derivado de un minicírculo de ADN en comparación con un producto de RCA derivado de un plásmido o de un ADN plasmídico amplificado por PCR. Se observan unos beneficios de expresión similares incluso cuando el producto de RCA derivado de un minicírculo de ADN carece por completo de secuencias de terminación de la transcripción, lo cual es un resultado inesperado. Estos productos de RCA mejoran la expresión acelular de proteínas al generar repeticiones en tándem de especies de ARNm cistrónico, en donde cada cistrón del ARNm comprende el gen diana deseado. Las repeticiones en tándem del cistrón pueden a su vez mejorar la estabilidad del ARNm, en particular cuando las señales de terminación de la transcripción están ausentes, y contribuyen a un mayor flujo de traducción del producto proteico deseado.

En una o más realizaciones de métodos de la invención para la transcripción y traducciónin vitro,el método incluye los etapas de proporcionar un ADN circular, generar un ADN concatemérico bicatenario por medio de la RCA del ADN circular y poner en contacto el ADN concatemérico bicatenario generado con un sistema de expresión acelular eucarióticoin vitropara expresar una proteína a partir del ADN concatemérico bicatenario mediante transcripción y traducción. La concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/gl a 35 ng/gl. En algunas realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario se purifica antes de ponerlo en contacto con un sistema de expresión acelular eucariótico. El minicírculo de ADN puede generarse mediante una ligación intramolecular de una plantilla de ADN bicatenario. En una o más realizaciones, el ADN bicatenario producido por RCA, generado a partir de un minicírculo de ADN, puede ser un concatémero lineal o ramificado.

En algunas realizaciones de la invención, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario producido por RCA generado a partir del ADN circular está en un intervalo de aproximadamente 0,5 a 20 ng/gl. En algunas otras realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario producido por RCA generado a partir de un ADN circular en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 3 ng/gl a aproximadamente 7 ng/gl. En determinadas realizaciones, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario producido por RCA generado a partir de ADN circular en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de aproximadamente 5 ng/gl a aproximadamente 7 ng/gl. En una realización ejemplar, la concentración final del ADN concatemérico bicatenario producido por RCA generado a partir de círculos de ADN en el sistema de expresión acelular eucariótico es de aproximadamente 5 ng/gl. En el ejemplo 3, en las figuras 2 y 3 se muestra que el requerimiento de ADN producido por RCA generado a partir de un ADN circular es de 4 a 8 veces menor que el ADN plasmídico para la expresión de la proteína deseada en el lisado acelular eucariótico.

El ADN bicatenario producido por RCA utilizado para la reacción de IVTT, generado a partir de un minicírculo de ADN, puede ser un concatémero lineal o ramificado. El minicírculo de ADN consiste esencialmente en una secuencia para expresión minimalista que consiste esencialmente en un promotor, un elemento de traducción independiente de la caperuza y un ORF. Por tanto, el concatémero lineal o ramificado (ADN bicatenario producido por RCA) generado a partir del minicírculo de ADN consiste esencialmente en repeticiones en tándem de una secuencia para expresión minimalista. El ORF de la secuencia para expresión minimalista es una secuencia de ácido nucleico que contiene un gen particular de interés. La secuencia para expresión minimalista también puede contener secuencias o elementos genéticos mínimos que se necesitan para la expresión (por ejemplo, una secuencia potenciadora) del gen de interés particular.

En una o más realizaciones de la invención, el ORF de la secuencia para expresión minimalista comprende una secuencia con los codones optimizados, una secuencia de identificación para purificación, un sitio de escisión de proteasa o sus combinaciones. Para generar una secuencia con los codones optimizados, el sesgo de codones, la preferencia de codones contextual y/o la preferencia de cada codón son los factores que se suelen considerar. Como se señaló, en algunas realizaciones, la secuencia para expresión minimalista consiste además esencialmente en una secuencia de terminación de la transcripción.

El elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) del minicírculo de ADN comprende un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), un elemento potenciador de la traducción (TEE) o una combinación de los mismos. La secuencia para expresión minimalista puede contener además una secuencia aislante, una secuencia de poliA, una secuencia de terminación transcripcional o una combinación de las mismas. Además, puede contener secuencias que no afecten materialmente a la transcripción y/o traducciónin vitrodel ADN concatemérico bicatenario producido por RCA. Por ejemplo, puede incluir además secuencias tales como una secuencia potenciadora de la traducción, una secuencia aislante, una secuencia intrónica o una secuencia de terminación de la transcripción. Sin embargo, la secuencia para expresión minimalista y el producto bicatenario resultante de la RCA no incluyen ninguna secuencia adicional que pueda afectar negativamente a la transcripción y traducciónin vitrodel producto de RCA.

Se pueden emplear numerosos ejemplos de promotores adecuados conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras de la ARN polimerasa de T7. Asimismo, se conocen en la técnica numerosos ejemplos de sitios de unión del ribosoma adecuados, incluidos, por ejemplo, sitios internos de entrada del ribosoma (IRES), secuencias de poliA, líderes de la traducción independientes de la especie (SITS), secuencias de consenso de Kozak y secuencias de Shine-Dalgarno. La secuencia aislante generalmente mejora la eficacia de la unión del ribosoma o del inicio de la traducción. En la técnica existen numerosos ejemplos de secuencias aislantes adecuadas, incluidas, por ejemplo, las secuencias que codifican el extremo N traducido de ORF con IRES nativos o secuencias de polihistidina. La secuencia para expresión minimalista puede incluir además una secuencia prepromotora, una secuencia para la escisión por proteasas o la escisión de nucleótidos, una secuencia para la purificación de proteínas o sus combinaciones. La secuencia para expresión minimalista se selecciona de manera que no contenga ninguna secuencia que obstaculice ni inhiba la transcripción ni la traducción del producto proteico deseado o que de otro modo haga más engorrosa la producción de proteínas.

La secuencia para expresión minimalista carece de secuencias superfluas que sean necesarias para la propagación de un plásmido en una célula hospedadora. Por ejemplo, el producto de RCA excluye cualquier secuencia superflua, tal como un origen de replicación, un gen de selección de antibióticos o cualquier otra secuencia accesoria que se requiera para la clonación, selección, detección y/o replicación en una célula hospedadora. La presencia de tales secuencias superfluas en el producto de RCA afectaría materialmente a la transcripción y/o a la traducción en la expresión acelular de una proteína. Las "secuencias superfluas" incluyen las secuencias que no son necesarias para codificar o expresar una proteína deseada. Las secuencias superfluas pueden incluir las secuencias accesorias que se usan para la selección, detección y/o propagación de un plásmido en una célula hospedadora, tal comolacZ,pgalactosidasa. Las secuencias superfluas pueden incluir secuencias para el origen de replicación, gen de selección con antibióticos, sitios de restricción adecuados para la inserción de un gen, tales como los multisitios de clonación, o sus combinaciones. La secuencia superflua puede comprender además cualquier otra secuencia requerida para la clonación en una célula hospedora o la detección en una célula hospedadora.

La secuencia del ADN concatemérico bicatenario producido por RCA puede comprender un nucleótido con fosforotioato, un nucleótido biotinilado o una combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, el ADN concatemérico bicatenario producido por RCA que consiste esencialmente en repeticiones en tándem de una secuencia para expresión minimalista comprende un nucleótido biotinilado. En tales realizaciones, el método incluye además inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario que incluye un nucleótido biotinilado sobre un sustrato antes de contener el ADN concatemérico bicatenario con el sistema de expresión acelular eucariótico, en donde el sustrato es un sustrato recubierto con estreptavidina. El método incluye además recuperar el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado del sistema de expresión acelular eucariótico después de expresarin vitrola proteína a partir del ADN concatemérico bicatenario. El método incluye además la reutilización de la plantilla de ADN concatemérico bicatenario recuperado que consiste esencialmente en repeticiones en tándem de una secuencia para expresión minimalista para las reacciones de IVTT posteriores.

Las ARN polimerasas utilizadas en las reacciones acelulares de transcripción (por ejemplo, la ARN polimerasa de T7) generalmente requieren secuencias promotoras de ADN bicatenario para una unión eficaz a las secuencias codificantes de ADN. La unión eficaz de la ARN polimerasa a la secuencia promotora del ADN bicatenario inicia una transcripción eficaz. Por lo tanto, se desean unas condiciones de reacción de RCA que promuevan la generación de productos bicatenarios por RCA para una transcripción y traducciónin vitroeficaces.

En algunas realizaciones de la invención, el ADN concatemérico bicatenario generado debe limpiarse antes de entrar en contacto con el sistema de expresión acelular eucariótico. En algunas realizaciones, el ADN producido por RCA se puede separar (por ejemplo, mediante precipitación) para eliminar del medio de reacción las sales o cualquier otro contaminante, tal como cebadores o ADN fragmentado más pequeño, antes de proceder a la expresión acelular usando un extracto de células eucariotas. En algunas realizaciones, el ADN bicatenario producido por RCA se proporciona al sistema de expresión acelular sin ningún procesamiento adicional. Por ejemplo, el ADN producido por RCA se puede añadir al sistema acelular directamente después de la amplificación sin ninguna digestión de restricción adicional.

La secuencia para expresión minimalista incluye una secuencia promotora, presente delante (5') del gen de interés que se va a transcribir. Las ARN polimerasas dependientes de ADN se unen a la región promotora del ADN bicatenario para iniciar la transcripción del gen. En la técnica se conocen una variedad de ARN polimerasas adecuadas e incluyen las que tienen una sola subunidad (por ejemplo, las de bacteriófagos como T3 y T7, y mitocondrias), así como las ARN polimerasas multidominio procedentes de bacterias y eucariotas. La ARN polimerasa puede requerir además otros cofactores proteicos para una transcripción eficiente.

En algunas realizaciones de la invención de la reacción de transcripción y traducción acelulares, se extrae de las células una maquinaria transcripcional/traduccional biomolecular y se utiliza para la traducciónin vitro.Este extracto acelular proporciona la composición, la proporción de enzimas y los componentes básicos necesarios para la transcripción y la traducción. Los ARNm sintetizados mediante transcripción se expresan en una reacción de traducción, que produce la proteína deseada en el extracto acelular. En la reacción de expresiónin vitro, la síntesis de proteínas se produce en un extracto acelular en lugar del interior de las células cultivadas (el material extraído de las células puede denominarse en la presente memoria "extracto acelular" o "extracto celular" que no contiene células intactas). El extracto celular contiene generalmente los componentes citosólicos y de orgánulos de la célula. El extracto acelular puede suministrar todas o la mayoría de las moléculas necesarias para la transcripción y traducción acelulares, tales como ribosomas, factores de traducción, ARNt y aminoácidos, cofactores enzimáticos y una fuente de energía, y componentes celulares esenciales para el plegamiento de las proteínas. En la reacción de expresiónin vitrode proteínas, la síntesis de proteínas se produce en un extracto acelular en lugar de dentro de las células cultivadas intactas.

Tal como se señaló, en algunas realizaciones de la invención, el sistema de expresión acelular comprende un extracto de células eucariotas, en donde el extracto celular procede de un organismo unicelular (por ejemplo, protozoos, células de levadura, células de insecto) u organismo multicelular (por ejemplo, células de insecto, células de mamífero, incluidas las células humanas). El extracto de células eucariotas adecuado incluye, entre otros, lisados de reticulocitos de conejo (RRL), extractos de germen de trigo, lisados de células de insecto (tales como SF9 o SF21), lisados de mamíferos (tales como CHO), lisados de humano (tales como HeLa), o lisado de protozoos (comoLeishmania).

El ARNm derivado del ADN producido por RCA se puede añadir al extracto de células eucariotas, o producir dentro de él. La plantilla de ADN utilizada para la reacción de RCA puede ser un ADN sintético o un ADN natural. La plantilla de ADN puede ser una plantilla de ADN circular. En una realización de ejemplo, la circularización de una plantilla de ácido nucleico lineal se logra mediante una reacción enzimática, por ejemplo, mediante incubación con una enzima de ligación, tal como la ADN ligasa. En algunas realizaciones, la plantilla de minicírculo de ADN incluye una secuencia para expresión minimalista. El producto de RCA utilizado para la transcripción y traducciónin vitropuede estar intacto y no degradado.

La reacción de amplificación por círculo rodante a menudo emplea reactivos tal como un cebador, una polimerasa y nucleótidos libres (dNTP). En algunas realizaciones, la RCA se puede realizar poniendo en contacto un minicírculo de ADN bicatenario con una solución de cebador que comprende una mezcla de cebadores aleatoria para formar un complejo entre el cebador y la plantilla de ácido nucleico; poner en contacto el complejo de la plantilla de ácido nucleico-cebador con una ADN polimerasa y trifosfatos de desoxirribonucleósidos; y amplificar la plantilla de ácido nucleico. La polimerasa de ácido nucleico que se emplea en la reacción de amplificación puede ser una polimerasa de ácido nucleico correctora. La RCA se puede realizar utilizando cualquiera de las polimerasas de desplazamiento de hebra de ADN que se conocen en la técnica, incluida, entre otras, una ADN polimerasa de 029. La mezcla de reacción de amplificación puede incluir además otros reactivos, tales como tampones de reacción de amplificación adecuados.

En algunas realizaciones de la invención, cada uno de los reactivos utilizados en la reacción de amplificación de ácidos nucleicos se puede tratar previamente para eliminar cualquier ácido nucleico contaminante. En algunas realizaciones, el pretratamiento de los reactivos incluye incubar los reactivos en presencia de radiación ultravioleta. En algunas otras realizaciones, los reactivos se descontaminan incubando los reactivos en presencia de una nucleasa y su cofactor (por ejemplo, un ion metálico). Las nucleasas adecuadas incluyen, entre otras, exonucleasas tales como la exonucleasa I o la exonucleasa III. En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de corrección utilizadas para la reacción de amplificación de ADN se pueden descontaminar incubando con un ion metálico divalente (por ejemplo, iones de magnesio o manganeso) en ausencia de dNTP.

La reacción de RCA se puede realizar usando una mezcla de cebadores aleatoria. En algunas realizaciones, se usan cebadores específicos para la reacción de RCA. También pueden usarse secuencias cebadoras que comprenden uno o más análogos de nucleótidos. En una o más realizaciones, la RCA se realiza con una mezcla de cebadores aleatorios que comprenden un análogo de nucleótido. En algunas realizaciones, la RCA se realiza con dNTP que contienen un análogo de nucleótido. El análogo de nucleótido puede ser una inosina, un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de ácido peptidonucleico (PNA), un nucleótido tioado, 2-aminodesoxiadenosina, 2-tiodesoxitimidina, un nucleótido policatiónico, ácido nucleico Zip (ZNA), nucleótido modificado policatiónico, o sus combinaciones. En una o más realizaciones, la mezcla de cebadores aleatorios tiene una secuencia N+N(atN)(atN)(atN)*N (SEQ ID n.° 6) (cebador hexamérico AT). En algunas realizaciones, se emplean cebadores resistentes a nucleasas (por ejemplo, secuencias de cebadores que comprenden grupos fosforotioato en las posiciones apropiadas) para las reacciones de amplificación (por ejemplo, NNNN*N*N). En algunas realizaciones, la amplificación de los minicírculos de ADN emplea hexámeros aleatorios o un cebador hexamérico, N+N(atN)(atN)(atN)*N (SEQ ID n.° 6) (cebador hexamérico AT).

Durante la reacción de amplificación, la plantilla de ADN, por ejemplo, un minicírculo de ADN que consiste esencialmente en una secuencia para expresión minimalista, se replica mediante una polimerasa en presencia de trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dNTP) o sus homólogos modificados. Los nucleótidos libres empleados en la amplificación de plantillas de ácidos nucleicos pueden incluir nucleótidos naturales (por ejemplo, dATP, dGTP, dCTP o dTTP) o sus análogos modificados. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se complementa con dNTP tioados. Los dNTP tioados pueden incluir, entre otros, a-S-dGTP, a-S-dCTP, a-S-dATP y a-S-dTTP. Los dNTP tioados tales como a-S-dATP o a-S-dTTP se pueden agregar a la mezcla de dNTP para la incorporación aleatoria de las bases tioadas en el producto de RCA.

En algunas realizaciones de la invención, la RCA se realiza con una concentración final de dNTP en un margen de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 mM. En una o más realizaciones de reacciones de RCA, la concentración de dNTP es inferior a 10 mM. En estas realizaciones, la concentración de dNTP se mantiene por debajo de 10 mM para evitar la formación de hidrogeles a partir del producto de RCA y para permanecer a una concentración inferior o igual a la cantidad de cationes divalentes (por ejemplo, Mg2+) presentes en el tampón de reacción. La formación de hidrogeles puede ocurrir después de la amplificación en presencia de una alta concentración de dNTP, lo que puede complicar aún más la manipulación posterior, como el pipeteo y el procesamiento del producto de RCA. Se puede observar la formación de hidrogel cuando se utiliza una concentración de dNTP de 50 mM o más en la reacción de RCA.

La RCA se puede realizar con los kits de amplificación de RCA disponibles comercialmente, tales como el kit de amplificación illustra™ TempliPhi™ (GE Healthcare). La amplificación por círculo rodante TempliPhi emplea cebadores aleatorios modificados, que proporcionan mayor sensibilidad y equilibrio de amplificación. En algunas realizaciones, se usan cebadores resistentes a nucleasas para la reacción de RCA. Dado que se requiere una alta concentración de ADN de plantilla para el presente método de transcripción y traducciónin vitro,se puede lograr una amplificación de ADN más equilibrada con una cinética más rápida y un mayor rendimiento utilizando la RCA.

Se pueden usar diversos métodos para preparar una plantilla de minicírculo de ADN para usar con los métodos de la invención. En algunas realizaciones, se puede circularizar una plantilla de ADN lineal para generar una plantilla de minicírculo de ADN. En una realización de ejemplo, la circularización de la plantilla de ADN lineal se puede efectuar mediante una reacción enzimática, por ejemplo, mediante incubación con una enzima de ligación tal como la ADN ligasa. En algunas realizaciones, los extremos terminales de la plantilla de ADN lineal se hibridan con una secuencia de ácido nucleico de modo que los extremos terminales estén muy próximos. La incubación con una enzima de ligación puede entonces efectuar la circularización de la plantilla de ADN lineal hibridada para generar un minicírculo de ADN. También se puede generar una plantilla de minicírculo de ADN adecuada mediante amplificación por PCR de una porción de un ADN más grande (por ejemplo, un ADN genómico o un ADN de una genoteca de ADN) usando cebadores de PCR apropiados, seguido de la circularización del producto de PCR. El minicírculo de ADN también puede generarse mediante síntesis química de oligonucleótidos lineales adecuados seguida de la circularización del oligonucleótido sintetizado. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos lineales sintetizados pueden consistir esencialmente en una secuencia para expresión minimalista y lograr la circularización mediante la ADN ligasa para generar un minicírculo de ADN.

Uno o más de los métodos pueden comprender además etapas de purificación, análisis y/o cuantificación de los minicírculos de ADN. El aislamiento o la purificación de los minicírculos de ADN bicatenario y/o la eliminación de los contaminantes, tales como enzimas o formas no ligadas de ADN, se pueden realizar antes de la reacción de amplificación. Se puede emplear cualquier técnica adecuada que se utilice para la purificación, análisis o cuantificación de ácidos nucleicos. Los ejemplos no limitantes incluyen precipitación, filtración, captura por afinidad, electroforesis en gel, secuenciación o análisis por HPLC. Por ejemplo, la purificación de los ácidos nucleicos circulares se puede lograr mediante la captura por afinidad. En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender además el procesamiento del minicírculo de ADN generado. El posprocesamiento del minicírculo de ADN generado puede variar según el uso previsto.

EJEMPLOS:

A menos que se especifique lo contrario, los ingredientes descritos en los ejemplos están disponibles comercialmente de los proveedores químicos habituales. Algunas abreviaturas utilizadas en la sección de ejemplos se amplían de la siguiente manera: "mg": miligramos; "ng": nanogramos; "pg": picogramos; "fg": femtogramos; "ml": mililitros; "mg/ml": miligramos por mililitro; "mM": milimolar; "mmol": milimoles; "pM": picomolar; "pmol": picomoles; "pl": microlitros; "min": minutos y "h": horas.

Materiales: los kits de IVT acoplada en 1 etapa que utilizan lisados humanos y de CHO, el vector de control pCFE-GFP y el kit de ensayo de ADN bicatenario Quant-IT PicoGreen® se adquirieron a ThermoFisher, Waltham, MA, EE. UU. Los filtros de centrifugación MICROCON® y las perlas magnéticas de estreptavidina se adquirieron a Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU. La enzima PstI se adquirió a New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU. El generador de imágenes de modo variable Typhoon se obtuvo de GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU. El lector de microplacas SpectraMax M5 era de Molecular Devices, LLC.

Ejemplo 1: Generación de un ADN producido por RCA

El ADN producido por RCA se generó a partir de una plantilla de ADN circular (ya sea un control positivo de plásmido, por ejemplo, pCFE-GFP, o a partir de un minicírculo de ADN que tiene una secuencia para expresión minimalista) mediante una reacción de RCA. El control positivo del plásmido, pCFE-GFP se adquirió como parte del kit de IVT acoplada de humanos de 1 etapa. Este plásmido purificado comprende sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) del virus de la encefelomiocarditis (EMCV) y codifica la proteína TurboGFP.

Generación de un minicírculo de ADN:

Se diseñaron secuencias de expresión minimalistas para EGFPin silicoy se sintetizaronin vitro.Las secuencias de expresión minimalistas contenían principalmente un promotor de T7 y una secuencia 1 (primera posición de ribosa de la región 5' no traducida del ARNm resultante) seguida de una secuencia IRES fusionada a la región codificante de EGFP. Se incluyeron una variedad de parámetros codificantes y no codificantes adicionales durante el diseño de la secuencia para expresión minimalista, incluidas las secuencias prepromotoras de T7, horquillas del promotor ^10 de T7, elementos potenciadores de la traducción (TEE), secuencias de unión del ribosoma, secuencias aislantes para mejorar la fijación del ribosoma, secuencias aislantes para mejorar el inicio del ribosoma, secuencias de terminación de la transcripción de T7, secuencias de poliadenilación, secuencias líder de péptidos o sitios de escisión de proteasas. A la secuencia para expresión minimalista puede optimizársele además el uso de codones. Una secuencia para expresión minimalista representativa aparece como SEQ ID n.° 5 (tabla 3). La secuencia para expresión minimalista de SEQ ID n.° 5 comprende secuencialmente el promotor de T7, el IRES del EMCV, el codón de inicio de la traducción, el extremo amino traducido del ORF de la poliproteína del EMCV (fusionada con EGFP, que tiene los codones optimizados), los codones de parada de la traducción, la secuencia de poliA y la secuencia terminadora de la transcripción de T7.

Tabla 3: lista de secuencias de ADN

Se sintetizó ADN bicatenario lineal usando un sintetizador de ADN (Integrated DNA Technologies, Inc.) con sitios de restricción únicos en los extremos 5' y 3' (BamHI y BglII, respectivamente). Para crear el minicírculo de ADN, el ADN bicatenario se digirió con ambas endonucleasas para producir extremos protuberantes complementarios que pueden pegarse. Este ADN digerido se ligó con la ADN ligasa de T4. Las etapas de digestión de restricción y ligación se llevaron a cabo de manera secuencial o bien simultánea (por ejemplo, en el mismo tubo) con mezclas de reacción que comprendían 20 U de BamHI, 10 U de BglII, 400 U de ligasa de T4, 1 mM de ATP, 100 gg/ml de seroalbúmina bovina (BSA), NaCl a 100 mM, MgCl<2>a 10 mM, Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5 y ditiotreitol (DTT) a 10 mM. Todos los productos de ligación (minicírculo de ADN) se trataron posteriormente con exonucleasa I y exonucleasa III para digerir los fragmentos de ADN lineal restantes. Las exonucleasas se inactivaron por calor incubando los productos de ligación a 80 °C durante 20 min. Después de la inactivación por calor de las exonucleasas, se desnaturalizaron 10 gl (10 ng de ADN circular) de la reacción de ligación completa y luego se emplearon directamente (sin ninguna purificación intermedia) para reacciones de RCA isotérmicas usando la ADN polimerasa de ^29.

Amplificación por círculo rodante (RCA):

La RCA de una plantilla de ADN circular (por ejemplo, un plásmido o un minicírculo de ADN) produce un concatémero hiperramificado de alto peso molecular con repeticiones en tándem de la secuencia de ADN de entrada. Los reactivos de la RCA, incluidos agua, tampón de reacción, cebadores y la enzima ADN polimerasa, se limpiaron previamente a 30 °C durante 60 min antes de agregar la plantilla de ADN circular (plásmido o minicírculo) o los dNTP para minimizar la amplificación inespecífica. En algunas realizaciones, la mezcla de cebador y nucleótidos que comprende cebador y nucleótidos resistentes a exonucleasas se descontaminó incubando la mezcla de cebador y nucleótidos con una combinación de exonucleasa I, exonucleasa III y una proteína de unión a ADN monocatenario (proteína SSB). En algunas realizaciones, se descontaminó una mezcla de enzimas que contenía una ADN polimerasa que desplaza hebras mediante la incubación con un catión divalente (p. ej., Mg2+) opcionalmente en presencia de una exonucleasa (si la ADN polimerasa utilizada incluía una ADN polimerasa sin corrección de pruebas). Posteriormente se realizó la amplificación de la plantilla de ADN circular utilizando la enzima descontaminada y las mezclas de cebador y nucleótidos. Por ejemplo, una solución de polimerasa que contenía 200 ng de la ADN polimerasa de ^29 se incubó con 0,1 unidades de exonucleasa III en 5 pl de tampón HEPES a 50 mM (pH = 8,0) que contenía KCl a 15 mM, MgCl<2>a 20 mM, Tween-20 al 0,01 % y TCEP a 1 mM. La incubación se realizó a 30°C durante aproximadamente 60 min o bien a 4 °C durante 12 h. La solución de la ADN polimerasa de ^29 descontaminada se transfirió a un baño con hielo y luego se usó en el ensayo de RCA deseado sin inactivación previa de la exonucleasa III.

La amplificación del ADN circular (ya sea el plásmido o el minicírculo de ADN) se realizó con hexámeros aleatorios o cebadores hexaméricos que tenían la secuencia N+N(atN)(atN)(atN)*N (hexámeros AT, SEQ ID n.° 6), en donde "N" representa un nucleótido aleatorio (es decir, N puede ser cualquiera de A, C, G o T/U), "atN" representa cualquiera de 2-amino dA, 2-tío dT, G normal o C normal, un signo más (+) delante de la designación de una letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), y un asterisco (*) delante a una letra denota que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido modificado con fosforotioato. En algunas realizaciones, la amplificación del ADN circular se realizó con hexámeros biotinilados que tienen la secuencia biotina-NNNN*N*N (SEQ ID n.° 7), en donde "N" representa un nucleótido aleatorio (es decir, N puede ser cualquiera de A, C, G o T/U), y un asterisco (*) delante de una letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido modificado con fosforotioato. Para todas las reacciones de RCA, la concentración de dNTP se mantuvo por debajo de 1 mM (normalmente 400-800 pM) para evitar que el ADN producido por RCA amplificado forme hidrogeles, lo que podría complicar la usabilidad posterior del ADN producido por RCA.

Las reacciones de amplificación de ADN se realizaron incubando reactivos de RCA previamente limpiados a 30 °C durante aproximadamente 16 h o 960 min con la plantilla de ADN circular y la mezcla de nucleótidos. Para la amplificación por círculo rodante, la mezcla de reacción de amplificación comprendía cebador a 40 pM, dNTP a 400 pM (400 pM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP); ~ 1 -30 ng de plantilla de ADN circular (ya sea el plásmido o el minicírculo de ADN), 20 ng/pl de la ADN polimerasa de ^29, HEPES a 50 mM (pH = 8,0), KCl a 30 mM, MgCl<2>a 20 mM, PEG-8000 al 2,5 % (p/v), Tween-20 al 0,01 % (v/v) y Tc Ep a 1 mM. Al final de la incubación, la ADN polimerasa de 029 en la mezcla de reacción se inactivó calentando la mezcla de reacción a 65 °C durante 10 min. En algunos ejemplos se complementó con dATP tioado en una proporción de 1:40 (por ejemplo, a-S-dATP a 0,01 mM) con respecto al dATP no tioado dentro de la solución de dNTP.

El ADN producido por RCA se generó a partir del minicírculo de ADN derivado de la SEQ ID n.° 5. Para generar el minicírculo de ADN, la plantilla de ADN de SEQ ID n.° 1 se digirió con BamHI y BglII y se circularizó mediante ligación. Las reacciones de RCA con el plásmido pCFE-GFP y con el minicírculo de ADN se realizaron en tres condiciones de prueba diferentes, (i) usando hexámeros aleatorios y dNTP, (ii) usando cebadores de hexámero AT y dNTP; y (iii) usando hexámeros AT y dNTP mezclados con dATP tioados. Todas las reacciones de RCA comprendían dNTP a 0,4 mM (concentración final de dNTP y, opcionalmente, dATP tioados) y 40 pM de cebador (ya sea hexámero aleatorio, hexámero AT o hexámero biotinilado), excepto que se añadió dATP con fosforotioato en una proporción de 1:40 (p. ej., 0,01 mM de a-S-dATP) en relación con el dATP no tioado para algunas reacciones. Los productos la RCA se cuantificaron con el kit de ensayo de ADN bicatenario Quant-It™ Picogreen® (ThermoFisher Inc.) a partir de un volumen de reacción de RCA total de 100 pl. También se realizó la electroforesis en gel de agarosa de los productos de ADN restringidos y la intensidad de las bandas de electroforesis se comparó con la de estándares que tenían una concentración conocida de ADN.

Ejemplo 2: Expresión del ADN producido por RCA generado a partir de un ADN plasmídico en un extracto acelular eucariótico

El kit de IVT acoplada de humanos de 1 etapa incluye el vector pCFE-GFP como control positivo que contiene los sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) del virus de la encefelomiocarditis (EMCV) y codifica una proteína TurboGFP. Como se sabe que el plegamiento del ARN de la secuencia IRES afecta significativamente la regulación de la eficiencia de la traducción, los componentes dentro del kit de traducción y transcripciónin vitro(IVTT) de 1 etapa se han optimizado para la actividad del IRES del EMCV.

El vector de control pCFE-GFP se amplificó mediante RCA usando cebadores AT (SEQ ID n.° 6) en presencia o ausencia de dATP tioado, como se describe en el ejemplo 1. Los ensayos de transcripción y traducciónin vitroutilizando IVT acoplada en 1 etapa se realizaron según las instrucciones del fabricante. Se añadió un microgramo de ADN producido por RCA, sin ninguna purificación intermedia, al lisado de células Hela (volumen final de 25 pl) y se incubó a 30 °C durante 6 h en un ThermoMixer® de Eppendorf para realizar la transcripción y traducciónin vitro(IVTT) del ADN producido por RCA. La proteína TurboGFP traducida acelularmente se incubó durante la noche a 4 °C antes de la cuantificación de la fluorescencia. A una muestra diluida 4 veces (en PBS) que contenía la proteína TurboGFP generada por IVTT se le midió la fluorescencia utilizando un lector de microplacas SpectraMax M5. La fluorescencia de la proteína TurboGFP acelular activa se midió a 482 nm y se comparó con una proteína fluorescente verde (GFP) purificada como referencia (BioVision, Inc). El rendimiento total de proteína TurboGFP acelular se calculó en unidades de pg/ml. En la figura 1 se muestra que prácticamente no se produjo TurboGFP fluorescente a partir de los productos de RCA cuando se aplicaron directamente al lisado de Hela sin ninguna limpieza o purificación intermedia.

Dado que los componentes de la reacción de RCA podrían inhibir la traducción mediada por IRES de la IVTT para eliminar los componentes de la reacción de RCA, el ADN producido por RCA se precipitó con la adición de 0,04 volúmenes de EDTA a 500 mM y 0,1 volúmenes de acetato de amonio a 7,5 M y se mezcló mediante agitación vorticial. A la mezcla se le añadieron 3,5 volúmenes de etanol al 95 % (a temperatura ambiente, 25 °C) y se volvió a mezclar antes de sedimentar el ADN producido por RCA a 20000g a temperatura ambiente en una microcentrífuga durante 20 min. El sobrenadante se retiró cuidadosamente del tubo utilizando una pipeta sin tocar el sedimento de ADN. Luego se añadieron al sedimento aproximadamente 200 pl de etanol al 70 % (temperatura ambiente), se sometió a agitación vorticial para mezclar y se volvió a centrifugar a 20000g durante 5 min. El sobrenadante se eliminó con cuidado sin tocar el sedimento. Después de volver a centrifugar el sedimento de ADN en una microcentrífuga a una velocidad de 20 000g durante 3 min, se eliminaron los últimos restos de etanol (teniendo cuidado de evitar un secado excesivo, que podría hacer que el ADN de la RCA sea insoluble). Luego, el sedimento de ADN se resuspendió a 0,1 M en el tampón TE (Tris a 10 mM, pH 7,5, EDTA a 0,1 mM) y se almacenó a 4 °C antes de su uso en reacciones de expresión acelulares.

Posteriormente se determinó la expresión de proteínas acelulares utilizando ADN de RCA purificado utilizando un lisado de células Hela. Se añadió un microgramo de ADN de RCA purificado al lisado de células Hela y se realizó el ensayo de IVTT utilizando el kit de IVT acoplada de humanos en 1 etapa según el protocolo del fabricante. En la figura 1 se muestra que el rendimiento de la proteína TurboGFP a partir del ADN producido por RCA fue comparativamente menor que el del ADN plasmídico cuando se usó 1 pg de ADN de RCA para la reacción de IVTT. La aplicación de ADN producido por RCA a una concentración 2 o 3 veces mayor en la reacción de IVTT (2 pg y 3 pg) dio como resultado rendimientos aún más bajos de proteína TurboGFP (como se muestra en la figura 1). Cuando el ADN de RCA se diluyó 2x, 4x y 8x (500-125 ng) en relación con una concentración sugerida por el kit de IVT acoplada de humano en 1 etapa y se usó para la IVTT, se observó un mayor rendimiento de proteína TurboGFP acelular, lo que se presenta en la figura 1. Como el volumen total de reacción de IVTT fue de 25 pl, la concentración final de ADN de plantilla de RCA estaba en un margen entre 5 y 20 ng/pl. Los resultados de la expresión acelular fueron comparables entre el ADN producido por RCA tioado y no tioado. Por el contrario, cuando se utilizó ADN plasmídico como plantilla, tras la dilución del ADN plasmídico, el rendimiento de expresión de proteínas acelulares disminuyó en la IVTT. Por ejemplo, 0,5 pg de plantilla de ADN plasmídico (dilución 2x) produjeron menos proteína TurboGFP que con 1 pg de ADN plasmídico, tal como se muestra en la figura 1.

Ejemplo 3: Expresión acelular de proteínas usando ADN producido por RCA generado a partir del minicírculo de ADN

Los datos del ejemplo 2 (figura 1) mostraron que cuando se usó el ADN producido por RCA como plantilla para el ensayo de IVTT con el lisado de células HeLa, se requirió una concentración de 4 a 8 veces menor del ADN producido por RCA para la expresión óptima de proteínas en comparación con el ADN plasmídico. Esta observación se reconfirmó mediante el uso de un producto de ADN de RCA generado a partir de un minicírculo de ADN para las reacciones por IVTT. El ADN producido por RCA generado a partir de la plantilla de minicírculo de ADN se preparó y se utilizó para comparar la expresión de proteínas mediante la IVTT. Se ligó una secuencia de ADN (SEQ ID n.° 5) que codifica una proteína EGFP para formar un minicírculo y se amplificó mediante RCA usando cebadores AT en presencia de dATP tioado, como se describe en el ejemplo 1. El ADN producido por RCA se diluyó en serie para generar muestras del ADN producido por RCA con diferentes concentraciones. Se agregaron diferentes concentraciones del ADN producido por RCA a 25 pl de mezcla de reacción de IVT acoplada de humano en 1 etapa y se incubaron a 30 °C durante 6 h en un ThermoMixer de Eppendorf con agitación suave a 300 rpm. El producto de IVTT generado, una proteína EGFP acelular, se dejó plegar durante la noche a 4 °C antes del análisis de fluorescencia. Se separaron aproximadamente 4 pl del producto de IVTT mediante SDS-PAGE (figura 3) y se detectó la proteína fluorescente nativa en el gel usando un generador de imágenes de modo variable Typhoon a 488 nm (GE Healthcare). En la figura 4 se muestra que aproximadamente 125 ng del ADN producido por RCA produjeron una expresión acelular máxima de EGFP en el lisado de células HeLa, lo que es consecuente con los resultados del ejemplo 2 usando el ADN producido por RCA generado a partir de la plantilla de ADN plasmídico. Se observó una distribución gaussiana entre los rendimientos de expresión del ADN producido por RCA como se muestra en la figura 4. En consecuencia, en la figura 4 se ilustra que se generaron cantidades casi equivalentes de proteína a partir de 0,5 a 1 microgramos de ADN de RCA de entrada y de 8 a 16 nanogramos de ADN de RCA de entrada. Además, en la figura 4 se muestra que la expresión acelular de la proteína fue casi la misma incluso cuando la diferencia entre la cantidad de ADN de RCA de entrada (tal como la entrada de 0,5 microgramos y 16 nanogramos) era de más del 96 %. Para fines de control, se sintetizó la proteína TurboGFP a partir de 1 microgramo de plásmido pCFE-GFP (según las instrucciones del fabricante del kit) para comparar la producción de fluorescencia relativa. En resumen, en las figuras 3 y 4 se muestra que se necesita de 4 a 8 veces menos ADN producido por RCA generado a partir de una plantilla circular (construcción de minicírculo de ADN de la figura 2) del ADN plasmídico para la expresión proteica deseada en el lisado acelular eucariótico.

Ejemplo 4: Expresión acelular a partir de ADN producido por RCA conjugado con perlas magnéticas generado a partir de minicírculos de ADN

Se conjugó un ADN biotinilado producido por RCA generado a partir de la secuencia del minicírculo de ADN (SEQ ID n.° 5) del ejemplo 3 con perlas de estreptavidina, y se usó para la transcripción y traducciónin vitroen extracto de células HeLa. El minicírculo de ADN (SEQ ID n.° 5) se amplificó por RCA usando un cebador hexamérico biotinilado (SEQ ID n.° 7) o un cebador AT hexamérico no biotinilado (SEQ ID n.° 6), y los productos de la amplificación resultante se cuantificaron mediante el ensayo con PicoGreen. En algunas realizaciones, el producto de RCA en bruto resultante se purificó previamente usando filtros de centrifugación MICROCON para eliminar el exceso de cebadores hexaméricos biotinilados antes de la conjugación de las perlas. Se mezcló ADN producido por RCA en bruto o purificado con perlas de estreptavidina para lograr el potencial de capturar aproximadamente 24 ng o 50 ng del ADN producido por RCA por microlitro de perlas. Las cantidades relativas del ADN producido por RCA conjugado en las perlas de estreptavidina se confirmaron digiriendo las perlas de estreptavidina con PstI y cuantificando la cantidad de ADN liberado mediante el ensayo con PicoGreen. Los resultados cuantitativos de un protocolo representativo de preparación de perlas se presentan en la tabla 3. Después de un lavado intenso de las perlas en PBS usando un imán para la recogida, se transfirió un volumen fijo (2,8 pl) de perlas a las reacciones de IVT acoplada de humano en 1 etapa (25 pl) y la traducción acelular de EGFP se comparó mediante fluorescencia nativa en geles de SDS-PAGE (figura 5). Se obtuvieron imágenes de la fluorescencia de EGFP (en gel) utilizando un generador de imágenes de modo variable Typhoon a 488 nm. En la figura 5 se muestra que se produjo eficazmente la EGFP fluorescente a partir del ADN producido por RCA generado a partir del minicírculo de ADN cuando se capturó en las perlas de estreptavidina mediante acoplamiento de biotina-estreptavidina a una concentración de plantilla estimada de 5 ng por microlitro de mezcla de reacción de IVTT. El ADN biotinilado producido por RCA se acopló eficazmente a las perlas de estreptavidina sin ningún requisito de purificación intermedia. Como se esperaba, se observó poca o ninguna expresión acelular de EGFP usando las perlas incubadas con el cebador AT no biotinilado. El uso de filtros MICROCON para eliminar el exceso de cebador hexamérico contribuyó a una mayor expresión inespecífica (véase el carril 3, figura 5) en comparación con el procedimiento de preparación en bruto (véase el carril 2, figura 5). Para fines de control, se sintetizó TurboGFP a partir de 1 microgramo de ADN plasmídico de pCFE-GFP (según las instrucciones del fabricante del kit) para comparar la producción de fluorescencia relativa.

Tabla 3: Estimación cuantitativa de la preparación de perlas con ADN producido por RCA antes de la expresión acelular

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la transcripción y traducciónin vitro, que comprende:

poner en contacto un ADN concatemérico bicatenario con un sistema de expresión acelular eucariótico, en donde el ADN concatemérico bicatenario comprende una pluralidad de secuencias repetidas en tándem, y en donde cada una de las secuencias repetidas en tándem comprende una secuencia para expresión que comprende un promotor, un elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) y un marco abierto de lectura; y expresar una proteínain vitroa partir del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico,

en donde una concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 0,1 ng/pl a 35 ng/pl

2. El método según la reivindicación 1, en donde la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 0,5 ng/pl a 20 ng/pl.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 2 ng/pl a 10 ng/pl.

4. El método según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 3 ng/pl a 7 ng/pl.

5. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) comprende un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), un elemento potenciador de la traducción (TEE), o una combinación de los mismos.

6. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el marco abierto de lectura comprende una secuencia con los codones optimizados para mejorar la traducción.

7. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el marco abierto de lectura comprende una secuencia de identificación para la purificación de la proteína expresada, una secuencia peptídica aminoterminal fusionada procedente de un IRES para un reconocimiento mejorado de los ribosomas, o una combinación de las mismas.

8. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia para expresión comprende además una secuencia de poliA, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia aislante o una combinación de las mismas.

9. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario sobre un sustrato antes de poner en contacto el ADN concatemérico bicatenario con el sistema de expresión acelular eucariótico.

10. El método según la reivindicación 9, que comprende además recuperar del sistema de expresión acelular eucariótico el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado en el sustrato después de expresar la proteínain vitro,y reutilizar el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado recuperado del sustrato para una posterior reacción de transcripción y traducciónin vitro.

11. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el ADN concatemérico bicatenario es un ADN producido por amplificación por círculo rodante (RCA).

12. El método según una o más de las reivindicaciones anteriores, en donde el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido biotinilado, un nucleótido con fosforotioato, un nucleótido que contiene inosina, un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de ácido peptidonucleico (PNA), 2-aminodesoxiadenosina, 2-tiodesoxitimidina, un nucleótido policatiónico o una combinación de los mismos.

13. Un método para la transcripción y traducciónin vitro,que comprende:

proporcionar un minicírculo de ADN,

generar un ADN concatemérico bicatenario mediante amplificación por círculo rodante del minicírculo de ADN; y poner en contacto el ADN concatemérico bicatenario generado con un sistema de expresión acelular eucarióticoin vitropara expresar una proteína a partir del ADN concatemérico bicatenario mediante transcripción y traducción,

14. El método según la reivindicación 13, en donde el minicírculo de ADN consiste esencialmente en una secuencia para expresión minimalista que consiste esencialmente en un promotor, un elemento de traducción independiente de la caperuza y un marco abierto de lectura.

15. El método según la reivindicación 14, en donde la secuencia para expresión minimalista carece de las secuencias superfluas que son necesarias para la propagación de un plásmido en una célula hospedadora.

16. El método según la reivindicación 13 o 14, en donde el elemento de traducción independiente de la caperuza (CITE) comprende un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), un elemento potenciador de la traducción (TEE) o una combinación de los mismos.

17. El método según la reivindicación 14, 15 o 16, en donde la secuencia para expresión minimalista consiste además esencialmente en una secuencia aislante, una secuencia de poliA, una secuencia de terminación transcripcional o una combinación de las mismas.

18. El método según una o más de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el marco abierto de lectura comprende una secuencia con los codones optimizados para mejorar la traducción, una secuencia de identificación para la purificación de la proteína expresada, una secuencia peptídica aminoterminal fusionada procedente de un IRES para mejorar el reconocimiento de los ribosomas, o una combinación de los mismos.

19. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 18, en donde la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 0,5 a 20 ng/gl.

20. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 19, en donde la concentración final del ADN concatemérico bicatenario en el sistema de expresión acelular eucariótico está en un margen de 3 ng/gl a 7 ng/gl.

21. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 20, en donde el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido modificado, un análogo de nucleótido o una combinación de los mismos.

22. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 21, en donde el ADN concatemérico bicatenario comprende un nucleótido con fosforotioato, un nucleótido biotinilado, un nucleótido que contiene inosina, un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de ácido peptidonucleico (PNA), 2-aminodesoxiadenosina, 2-tiodesoxitimidina, un nucleótido policatiónico o una combinación de los mismos.

23. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 22, que comprende además inmovilizar el ADN concatemérico bicatenario sobre un sustrato antes de contener el ADN concatemérico bicatenario con el sistema de expresión acelular eucariótico.

24. El método según la reivindicación 23, que comprende además recuperar del sistema de expresión acelular eucariótico el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado en el sustrato después de expresar la proteínain vitro; y reutilizar el ADN concatemérico bicatenario inmovilizado recuperado del sustrato para una posterior reacción de transcripción y traducciónin vitro.

25. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 24, en donde la amplificación por círculo rodante se realiza usando una concentración final de trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) y a-tío-dNTP opcionales, en un margen de 10 gM a 10 mM.

26. El método según una o más de las reivindicaciones 13 a 25, en donde la amplificación por círculo rodante se realiza con una mezcla de cebadores aleatorios que comprende un análogo de nucleótido.

27. El método según la reivindicación 26, en donde la mezcla de cebadores aleatorios tiene una secuencia N+N(atN)(atN)(atN)*N (SEQ ID n.° 6) o 5'-biotina-NNNN*N*N (SEQ ID n.° 7), en donde N representa ácidos nucleicos bloqueados, atN significa 2-amino dA, o 2-tío dT, o G o C, y * representa un enlace de tipo fosforotioato.