JP2020532976A - 環状一本鎖ｄｎａライブラリーを生成するための新規な方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）ライゲーションを介して一本鎖環状核酸鋳型の配列決定ライブラリーなどのライブラリーを作製および使用する新規な方法である。

Description

本発明は、核酸分析の分野に、より具体的には核酸配列決定のために環状鋳型を調製することに関する。
環状核酸鋳型は、核酸分析において複数の用途を有する。線状核酸は、例えばローリングサークル増幅（ＲＣＡ）による増幅ならびに後続の検出および定量により環状形態に変換される。米国特許第ＲＥ４４２６５号を参照されたい。配列決定における環状鋳型の使用も、当技術分野において公知である。米国特許第７，３０２，１４６号および同第８，１５３，３７５号を参照されたい。現在の配列決定戦略はまた、プライマー結合部位およびバーコードなどの補助配列が鋳型内に導入されることも必要とする。本発明は、配列決定に適した環状核酸鋳型を創出する新規な効率的方法である。本方法は、事実上無制限の長さの鋳型の創出を可能にする。
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸から環状分子を形成する方法であって、ユニバーサル環化配列および標的特異的配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；アンプリコンの鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；ならびに鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状分子を形成するステップを含む方法である。標的核酸は、無細胞性血漿ＤＮＡ、超音波処理ＤＮＡおよび制限酵素消化ＤＮＡから選択されるゲノムの断片を含む場合がある。一部の実施形態では、第１および第２の増幅プライマー上のユニバーサル配列は別個である。第１または第２の増幅プライマーのユニバーサル配列は、配列決定プライマーを含む場合がある。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、配列番号１および２を含む。一部の実施形態では、第１および第２の増幅プライマーの一方だけが、５’−リン酸基を含む。
一部の実施形態では、二本鎖アンプリコンの鎖同士は、ヌクレアーゼ消化または物理的手段により分離される。
一部の実施形態では、環化オリゴヌクレオチドは、捕捉部分に対するリガンドを含む。一部の実施形態では、リガンド−捕捉部分の対は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはオリゴヌクレオチド−相補的捕捉オリゴヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、環化オリゴヌクレオチドは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、環化オリゴヌクレオチドは、２部構成のプライマー中のユニバーサル環化配列と相補的な一本鎖領域を有するＹ型構造である。
一部の実施形態では、本発明は、ユニバーサル環化配列および標的特異的配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させて、ハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；ならびに鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸のライブラリーを形成するステップを含む、配列決定のための環状標的核酸のライブラリーを作製することである。一部の実施形態では、標的核酸は、標的配列とコンジュゲートされたユニバーサルプライマー結合部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む。
一部の実施形態では、本発明は、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法であって、ユニバーサルプライマー結合部位を試料中の標的核酸の末端に付けて、アダプター付加された標的核酸を形成するステップ；ユニバーサルプライマー結合部位と相補的なユニバーサルプライマーおよびユニバーサル環化配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて、アダプター付加された標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させて、ハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸を形成するステップ；試料を、２部構成のプライマーのユニバーサル配列の一方と相補的な配列決定プライマーと接触させるステップ；ならびに核酸ポリメラーゼを用いて配列決定プライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定するステップを含む方法である。一部の実施形態では、ユニバーサルプライミング部位は、ユニバーサルプライミング部位を含むアダプターのライゲーションを介して付けられる。
一部の実施形態では、本発明は、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法であって、標的特異的配列およびユニバーサル環化配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸を形成するステップ；試料を、２部構成のプライマーのユニバーサル配列の一方と相補的な配列決定プライマーと接触させるステップ；ならびに核酸ポリメラーゼを用いて配列決定プライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定するステップを含む方法である。
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸の配列を決定するためのキットであって、ユニバーサル環化配列および標的結合配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマー；２部構成のプライマー中のユニバーサル環化配列と少なくとも部分的に相補的であることにより、２部構成のプライマーを含む鎖の末端同士が、ライゲーション可能な近接状態になり得る環化オリゴヌクレオチドを含むキットである。一部の実施形態では、キットはまた、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む。一部の実施形態では、第１および第２の２部構成の増幅プライマーの一方だけが、５’末端でリン酸化されている。一部の実施形態では、環化オリゴヌクレオチドは、捕捉部分に対するリガンドを含む。一部の実施形態では、環化オリゴヌクレオチドは、２部構成のプライマー中のユニバーサル環化配列と相補的な一本鎖領域を有するＹ型構造である。
環化方法の全体的なスキームを示す図である。 環化方法の詳細なスキームを示す図である。 様々な条件下での一本鎖環状ＤＮＡの収量を示す図である。 一本鎖ＤＮＡライブラリーの配列決定の結果を示す図である。
定義
以下の定義は、本開示の理解を助けるものである。
「試料」という用語は、標的核酸を含有するまたは含有すると推定される任意の組成物を指す。これは、個体、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、器官および腫瘍から単離された組織または液体の試料、ならびにまた、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）およびそれから単離された核酸を含む、個体から採取された細胞から樹立されたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物の試料を含む。試料はまた、無細胞性ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞性血液画分などの無細胞材料を含む場合がある。
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのそれらの下位区分を含む、ヌクレオチドのポリマー（例えば、天然および非天然の両方のリボヌクレオチドおよびデオキシリボクレオチド）を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖の場合があり、一般的に５’−３’ホスホジエステル結合を含有するとはいえ、場合によりヌクレオチド類似体は、他の結合を有する場合がある。核酸は、天然塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）ばかりでなく、非天然塩基も含む場合がある。非天然塩基のいくつかの例には、例えば、Ｓｅｅｌａら、（１９９９年）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８２：１６４０に記載されたものが挙げられる。非天然塩基は、例えば、核酸二重鎖の安定性を増大させる、ヌクレアーゼ消化を阻害する、またはプライマー伸長もしくは鎖重合を遮断する、特定の機能を有する場合がある。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６つのヌクレオチドまたは約１５〜５０個のヌクレオチドから構成される場合がある。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９；Ｂｒｏｗｎら（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５〜３１９１に記載されたような直接化学合成を含む方法によって調製される。
「プライマー」という用語は、標的核酸中の配列（「プライマー結合部位」）とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドであって、核酸の相補鎖に沿った合成の開始点として、このような合成に適した条件で作用することが可能な一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
「アダプター」という用語は、別の配列に追加的な性質を移入するようにヌクレオチド配列に付加される場合がある当該ヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、典型的には一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有する場合がある、オリゴヌクレオチドである。
「ライゲーション」という用語は、ある分子の５’−リン酸基が別の分子の３’−ヒドロキシル基と反応する、２つの核酸鎖をつなぐ縮合反応を指す。ライゲーションは、典型的にはリガーゼまたはトポイソメラーゼによって触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖をつないで１つの一本鎖分子を創出する場合がある。ライゲーションはまた、それぞれ二本鎖分子に属する２つの鎖をつなぎ、したがって２つの二本鎖分子をつなぐ場合がある。ライゲーションはまた、二本鎖分子の両方の鎖を別の二本鎖分子の両方の鎖とつなぎ、したがって２つの二本鎖分子をつなぐ場合がある。ライゲーションはまた、二本鎖分子内の鎖の２つの末端をつなぎ、したがって二本鎖中のニックを修復する場合がある。
「バーコード」という用語は、検出および同定できる核酸配列を指す。バーコードは、様々な核酸内に組み込むことができる。バーコードは、例えば、２、５、２０ヌクレオチドと十分に長いことにより、試料中で、バーコードを組み込んでいる核酸をバーコードにより識別または群分けすることができる。
「多重識別子」または「ＭＩＤ」という用語は、標的核酸の起源（例えば、核酸が由来する試料）を同定するバーコードを指す。同じ試料からのすべてまたは実質的にすべての標的核酸は、同じＭＩＤを共有する。異なる起源または試料からの標的核酸を混合し、同時に配列決定することができる。ＭＩＤを使用して、配列のリードを標的核酸の起源となる個別の試料に割り当てることができる。
「ユニーク分子識別子」または「ＵＩＤ」という用語は、バーコードが付けられた核酸を同定する当該バーコードを指す。同じ試料からのすべてまたは実質的にすべての標的核酸は、異なるＵＩＤを有する。同じ起源標的核酸に由来する子孫（例えば、アンプリコン）のすべてまたは実質的にすべては、同じＵＩＤを共有する。
「ユニバーサルプライマー」および「ユニバーサルプライミング結合部位」または「ユニバーサルプライミング部位」という用語は、異なる標的核酸に（典型的にはそれへのｉｎ ｖｉｔｒｏ付加により）存在するプライマーおよびプライマー結合部位を指す。ユニバーサルプライミング部位は、アダプターを使用して、または５’部分にユニバーサルプライミング部位を有する標的特異的（非ユニバーサル）プライマーを使用して、複数の標的核酸に付加される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位と結合し、この部位からのプライマー伸長を指示することができる。
より一般的には、「ユニバーサル」という用語は、任意の標的核酸に付加することができ、標的核酸配列とは無関係にその機能を果たすことができる、核酸分子（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）を指す。ユニバーサル分子は、相補鎖とハイブリダイズすることによりその機能を果たす場合があり、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位に対するユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマー配列に対するユニバーサル環化オリゴヌクレオチドである。
本明細書に使用される「標的配列」、「標的核酸」または「標的」という用語は、検出または分析すべき試料中の核酸配列の一部を指す。標的という用語は、標的配列のすべての変異体、例えば１つまたは複数の突然変異体および野生型変異体を含む。
「配列決定」という用語は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定する任意の方法を指す。
本発明は、核酸配列決定などの下流の分析のための環状標的核酸分子およびこのような分子のライブラリーを作製する方法である。図１に示すように、本方法は、核酸分子を環化するためのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。第１に、核酸分子は、各末端に付加されたユニバーサル配列を有する。次いで、各末端にユニバーサル配列を有する核酸が一本鎖にされ、ユニバーサル配列の少なくとも一部と相補的なプローブと接触される。プローブをハイブリダイズして、一本鎖環状（ｓｓｃＤＮＡ）分子の環化および形成を可能にする。
本方法は、既存の環化方法、例えば、ＵＳＲＥ４４２６５およびＵＳ２０１２００３６５７と比べて利点を有する。その方法と対照的に、本方法は、標的配列に付いたユニバーサル環化配列を使用する。本方法は、制限部位の存在を保証するために、標的分子の末端の間に挿入された、複数の制限部位を含有する非標的オリゴヌクレオチドを使用しない（ＵＳＲＥ４４２６５の図２参照）。配列決定プライマー結合部位を含有する「ベクター」オリゴヌクレオチドが使用されるＵＳ２０１２００３６５７（その中の図１Ａ参照）では、同じ戦略が使用される。本発明は、補助オリゴヌクレオチドとの分子間ライゲーションの代わりに、より効率的な分子内環化を使用する。
本発明は、試料中の標的核酸を検出するステップを含む。一部の実施形態では、試料は、対象または患者に由来する。一部の実施形態では、試料は、対象または患者から、例えば生検により得られた固形組織または固形腫瘍の断片を含む場合がある。試料はまた、体液（例えば、尿、喀痰、血清、血漿もしくはリンパ、唾液、喀痰、汗、涙液、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、および／または糞便試料）を含む場合がある。試料は、腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含む場合がある。一部の実施形態では、試料、特に液体試料は、無細胞性腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡを含む無細胞性ＤＮＡまたはＲＮＡなどの無細胞材料を含む場合がある。一部の実施形態では、試料は、無細胞性試料、例えば、無細胞性腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞性血液由来試料である。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、感染病原体または感染病原体に由来する核酸を含有するまたは含有する疑いがある培養物または培養上清である。一部の実施形態では、感染病原体は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。
標的核酸は、試料中に存在し得る目的の核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片である。他の実施形態では、標的核酸は、遺伝子変異体、例えば、一塩基多型もしくは一塩基変異体（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む多型、または例えば遺伝子融合を結果としてもたらす遺伝子再配列を含有する。一部の実施形態では、標的核酸は、バイオマーカーを含む。他の実施形態では、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり、例えば、病原生物または病原生物の特徴、例えば薬物感受性もしくは薬物耐性の同定を助ける。なお他の実施形態では、標的核酸は、ヒト対象の特徴、例えば対象の独特のＨＬＡまたはＫＩＲ遺伝子型を定義するＨＬＡまたはＫＩＲ配列である。なお他の実施形態では、試料中のすべての配列は、例えばショットガンゲノム配列決定での標的核酸である。
本発明の実施形態では、二本鎖標的核酸は、本発明の鋳型構成に変換される。一部の実施形態では、標的核酸は、自然界で一本鎖形態（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）で存在する。一本鎖標的核酸は、二本鎖形態に変換されて、請求された方法のさらなるステップを可能にする。
より長い標的核酸は、断片化される場合があるとはいえ、一部の適用では、より長いリードを達成するためにより長い標的核酸が望ましい場合がある。一部の実施形態では、標的核酸は、自然に断片化され、例えば、保存された試料中に見出されるＤＮＡのような循環無細胞性ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学分解ＤＮＡである。他の実施形態では、標的核酸は、例えば超音波処理などの物理的手段によって、またはエンドヌクレアーゼ消化、例えば制限酵素消化によってｉｎ ｖｉｔｒｏで断片化される。
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸を増幅するステップを含む方法である。増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または任意の他の方法であり得る。様々なＰＣＲ条件が、ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、およびＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の１４章；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、およびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０年）．に記載されている。
増幅は、二本鎖アンプリコンを生成するためにユニバーサル環化配列および標的特異的配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを利用する場合がある（図２）。一部の実施形態では、所定の標的または標的核酸の群が問い合わされている。このような実施形態では、標的特異的増幅プライマーが使用される場合がある。プライマーは、プライマーの３’部分の標的特異的配列および５’部分のユニバーサル配列から構成される２部構成の構造を有する場合がある。典型的には、標的特異的プライマーは、異なるオリゴヌクレオチドの対、例えばフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用される。後続のステップのために、本方法の後続のステップにおいて相補鎖（すなわち、（＋）鎖および（−）鎖）を識別するために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’部分に異なるユニバーサル配列を付加することができる。一部の実施形態では、２部構成のプライマーのユニバーサル配列は、配列決定プライマー結合部位を含む。
増幅はまた、標的配列にコンジュゲートされたユニバーサルプライマー結合部位を含むユニバーサルアダプター配列を利用する場合がある。他の実施形態では、複数の標的核酸は、試料、例えば、１つまたは複数の未知の病原生物を含有する疑いのある試料中に存在する、例えば全ゲノムまたはすべての核酸が問い合わされている。このような実施形態では、標的特異的プライマーは、有利ではなく、ユニバーサルプライマーが使用される。このような実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位が、例えばユニバーサルプライマー結合部位配列を含有するアダプター分子のライゲーションにより付加される。典型的には、このようなアダプターは、標的核酸の配列とは無関係に、例えばライゲーションにより付加される。このような実施形態では、標的核酸は、各末端に同じアダプター分子を受け入れる。結果として生じたアダプター付加された標的核酸の鎖を識別するために、アダプターは、Ｙ−構造を有する場合がある。例えば、米国特許第８，０５３，１９２号、同第８，１８２，９８９号および同第８，８２２，１５０号を参照されたい。
本発明の一部の実施形態では、アダプター分子は標的核酸にライゲーションされる。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたはより効率的な付着末端ライゲーションであり得る。標的核酸またはアダプターは、鎖充填（ｓｔｒａｎｄ−ｆｉｌｌｉｎｇ）によって、すなわちＤＮＡポリメラーゼにより３’末端を伸長して５’オーバーハングを除去することによって、平滑末端にされる場合がある。一部の実施形態では、平滑末端にされたアダプターおよび標的核酸は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼによってアダプターの３’末端に単一のヌクレオチドを付加し、標的核酸の３’末端に単一の相補的ヌクレオチドを付加することにより付着性にされる場合がある。なお他の実施形態では、アダプターおよび標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって付着末端（オーバーハング）を獲得する場合がある。制限酵素認識部位を含有することが分かっている公知の標的配列について、後者の選択肢の方が有利である。上記実施形態のそれぞれでは、アダプター分子は、さらに下に記載される合成アダプターオリゴヌクレオチドの設計により所望の末端（平滑、一塩基伸長または多塩基オーバーハング）を獲得する場合がある。一部の実施形態では、ライゲーションを達成するために他の酵素的ステップが必要とされる場合がある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、標的核酸分子およびアダプター分子に５’−ホスフェートを付加する場合がある。
一部の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成された人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、所望の二次構造を有することが分かっている、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成された天然配列である。なお他の実施形態では、アダプター分子は、単離された天然分子または単離された非天然分子である。
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸へのバーコードの導入を含む。個別の分子の配列決定は、典型的には、例えば米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、および同第８，７２２，３６８号に記載されたように分子バーコードを必要とする。ユニーク分子バーコードは、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏ操作の最初期ステップの間に患者の試料などの試料中の各分子に付加される短い人工配列である。バーコードは、分子およびその子孫をマーキングする。ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）は、複数の用途を有する。バーコードは、試料中のそれぞれ個別の核酸分子を追跡して、例えば、生検なしにがんを検出およびモニタリングするために患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在および量を評価することを可能にする。ユニーク分子バーコードはまた、配列決定の誤差補正のために使用することができる。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードでマーキングされ、バーコードを付けられたファミリーを形成する。バーコードを付けられたファミリーのすべてのメンバーにより共有されない配列における変動は、アーチファクトであり真の突然変異ではないと見なされる。バーコードはまた、ファミリー全体が元の試料中の単一の分子を表すため、位置の重複排除および標的の定量化のために使用することができる。米国特許出願第１４／２０９，８０７号および同第１４／７７４，５１８号を参照されたい。
本発明の一部の実施形態では、２部構成の増幅プライマーは、１つまたは複数のバーコードを含む。他の実施形態では、アダプターは、１つまたは複数のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合されている（多重化されている）場合の試料源を同定するために使用される多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）であり得る。バーコードはまた、それぞれの元の分子およびその子孫を同定するために使用されるユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）として役立つ場合がある。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであり得る。一部の実施形態では、単一のバーコードがＵＩＤおよびＭＩＤの両方として使用される。
一部の実施形態では、それぞれのバーコードは、予め定められた配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。バーコードは、１〜２０ヌクレオチド長であり得る。
一部の実施形態では、本方法は、標的核酸の２つの鎖のうち一方だけを調べる。本発明は、二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップを含む。一部の実施形態では、一方の鎖が分解され、他方の鎖が、本方法の後続のステップのために保持される。一部の実施形態では、アンプリコンは、（例えば、ウイルス性エキソヌクレアーゼ、Ｔ７またはラムダエキソヌクレアーゼによる）エキソヌクレアーゼ処理に供される。一部の実施形態では、プライマーまたはアダプターは、他方の鎖をエキソヌクレアーゼ消化のために特異的に標的化するように５’末端または３’末端保護基（ホスホロチオエートなど）を含むように修飾される場合がある。２つの鎖はまた、物理的手段、すなわち、アルカリ変性または熱変性により分離される場合がある。なお他の実施形態では、所望の鎖は、鎖をアフィニティーリガンドと選択的に結合させることが可能なアフィニティー試薬により捕捉される。一部の実施形態では、プライマーはビオチン化され、鎖は、ストレプトアビジンにより捕捉される。
一部の実施形態では、標的核酸の末端は、リン酸化される。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ、例えば、ラムダエキソヌクレアーゼによる一方の鎖の分解を引き起こすために、一方のプライマーの５’末端は、リン酸化される。他の実施形態では、アダプターの５’末端は、その目的でリン酸化される。アダプター付加された標的分子の単一の５’末端がリン酸化されていることを保証するために、リン酸化アダプターおよび非リン酸化アダプターの混合物（例えば等量混合物）を使用することができる。
他の実施形態では、リン酸化は、後続のライゲーションステップのために必要である。鎖分離ステップに続くプライマー、アダプターまたは一本鎖分子のリン酸化は、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）などのＰＮＫの使用により行うことができる。
一部の実施形態では、本方法は、環化ステップを含む。このステップは、アンプリコンの５’リン酸化された鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド構造を生成することを含み、鎖中のユニバーサル環化配列は、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる。環化オリゴヌクレオチドは、線状オリゴヌクレオチドまたは２つのオリゴヌクレオチドのＹ型組み合わせであり得る。Ｙ型構造は、２部構成のプライマーの中のユニバーサル環化配列と相補的な一本鎖領域を含む。環化オリゴヌクレオチドはまた、アフィニティー試薬によるビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原または捕捉オリゴヌクレオチド−相補的オリゴヌクレオチドなどの捕捉対における捕捉のための捕捉部分を含む場合がある。環化オリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離している場合、または例えば上記の捕捉部分により固体支持体に結合している場合がある。捕捉はまた、ハイブリダイゼーション後または下記のライゲーションステップ後に起こる場合がある。
一部の実施形態では、本発明は、さらに、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状分子を形成することを含むライゲーションステップを含む。鎖の５’末端はリン酸化されており、ライゲーションステップが可能である。
一部の実施形態では、本発明は、過剰のオリゴヌクレオチドまたは非環化アンプリコンを含む可能性がある線状核酸が反応混合物から除去されるエキソヌクレアーゼ消化ステップを含む。最終産物は、配列決定プライマー結合部位を含有する環状ｓｓＤＮＡ鋳型である。
一部の実施形態では、本発明は、環状標的核酸のライブラリーを作製する方法である。本方法は、ユニバーサルプライマーを用いた増幅ステップを含む。ユニバーサルプライマー結合部位が、試料中の核酸に、例えばアダプターライゲーションにより付加されて、アダプター付加された分子のライブラリーを創出する。ライブラリー中の分子は、ユニバーサル配列、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位に挟まれた標的配列を含む。環化オリゴヌクレオチドは、アダプター中に含有される配列と相補的な場合がある。他の実施形態では、アダプターは、ユニバーサルプライマー結合部位だけを含み、ユニバーサルプライマーは、アダプター中に存在しない追加的な配列を導入する。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位および例えば配列決定プライマー結合部位を含む２部構成の増幅プライマーであり得る。次いで、アンプリコンは、上記方法のステップに供されて、一本鎖分子のライブラリーを生成する。
一部の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸を核酸配列決定により検出することを含む。試料中のすべての核酸を含む、複数の核酸を本発明の鋳型構成に変換し、配列決定することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される環状分子のライブラリーを核酸配列決定に供することができる。
配列決定は、当技術分野において公知の任意の方法により行うことができる。ハイスループット単一分子配列決定が特に有利である。このような技法の例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ＳＭＲＴを利用するＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）またはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）もしくはＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）により製造されるものなどのナノポア技術を利用するプラットフォーム、および合成による配列決定を含むまたは含まない、任意の他の現存するまたは将来的なＤＮＡ配列決定技術が挙げられる。配列決定ステップは、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用する場合がある。これらのプライマーに対する結合部位は、本明細書に記載されるように、すなわち、アダプターまたは増幅プライマーの一部であることにより、本発明の方法に導入される場合がある。一部の実施形態では、配列決定プラットフォームは、特異的配列決定プライマーを必要とせず、配列決定プライマー結合部位は、環状分子に導入されない。
一部の実施形態では、本発明は、二本鎖標的核酸の配列を決定する方法である。この実施形態では、ライゲーションされた一本鎖環状核酸が、ｓｓＤＮＡ中に存在する配列決定プライマー結合部位と相補的な配列決定プライマーと接触され、核酸ポリメラーゼにより配列決定プライマーが伸長され、それにより標的核酸の配列が決定される。
本発明の方法は、最終産物（一本鎖環状標的核酸分子）中に配列決定プライマー結合部位を含ませることを可能にし、これは、標的分子の直接配列決定をさせる。このような構築により、ｓｓＤＮＡの同じ鎖を複数回配列決定し、したがってコンセンサス配列を生成することが可能である。特に、本発明の方法は、多種多様な標的核酸サイズに適用可能である。一部の実施形態では、標的核酸は、１００塩基対のように短く、１０キロ塩基のように長い。
一部の実施形態では、配列決定ステップは、配列を整列させるステップを含む配列分析を含む。一部の実施形態では、整列は、複数の配列、例えば同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数からコンセンサス配列を決定するために使用される。一部の実施形態では バーコード（ＵＩＤ）は、すべてが同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために使用される。他の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、アーチファクト、すなわち同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する配列のいくつかに存在するがすべてには存在しない変動を除去するために使用される。ＰＣＲの誤差または配列決定の誤差に起因するこのようなアーチファクトは、除去することができる。
一部の実施形態では、試料中の各配列の数は、試料中の各バーコード（ＵＩＤ）を有する配列の相対数を定量することによって定量することができる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一分子を表し、各配列変異体に関連する異なるＵＩＤを計数することで元の試料中の各配列の割合を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列のリード数を決定することができるであろう。一部の実施形態では、該当する数は、正確な定量結果に必要なリード／ＵＩＤ（「配列深度」）である。一部の実施形態では、所望の深度は５〜５０リード／ＵＩＤである。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法を行うためのキットである。キットは、標的結合配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーならびに場合により環化オリゴヌクレオチドと相補的なユニバーサル配列と；２部構成のプライマー中の両方のユニバーサル環化配列と少なくとも部分的に相補的であることにより、２部構成のプライマーを含む鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になり得る環化オリゴヌクレオチドとを含む。キットはまた、ＤＮＡリガーゼ（一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼが使用される）、ポリヌクレオチドキナーゼおよび増幅ポリメラーゼまたは配列決定ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを含む場合がある。ポリメラーゼの非限定的な例には、原核生物ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶおよびＰｏｌ Ｖ）、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。逆転写酵素のファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼの機能性およびＤＮＡと塩基対を形成したＲＮＡを分解するＲＮアーゼＨの機能性の両方を含有する。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、５’−３−エキソヌクレアーゼ活性を有さない。一部の実施形態では、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼおよびその誘導体が使用される。米国特許第５，００１，０５０号、同第５，５７６，２０４号、同第７，８５８７４７号および同第８９２１０８６号を参照されたい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、アンプリコン鎖から３’−Ａオーバーハングを有利に除去する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、平滑末端産物を生成することが可能な、５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する組み換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来高忠実度ＤＮＡポリメラーゼである。Ｆｒｅｙ、Ｂ．およびＳｕｐｐｍａｎ、Ｂ．（１９９５年）．ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ．２、３４〜３５を参照されたい。
実施例１
ＨＩＶ−Ｂ参照配列からの一本鎖環の形成
試験に使用するＤＮＡ材料は、Ｇｅｎｅｗｉｚに注文した合成プラスミドＤＮＡである。ＨＩＶ−Ｂ参照配列からプラスミドを設計して、クローニング方法のためにベクター骨格ｐＵＣ５７で約３．２ｋｂのｐｏｌ遺伝子領域を標的化した（合計約６．２ｋｂ）。標準的な手順を使用して、プラスミドを大腸菌コンピテントセル内に形質転換し、クローニング、抽出、および精製した。精製プラスミドＤＮＡを制限酵素で線状化し、Ｂｉｏａｎａｌｚｙｅｒを使用して消化後のプラスミドＤＮＡを定量し、ＰＣＲ増幅のために１０８コピー／ｍＬに希釈した。
以下のプライマーを使用した：
配列番号１ ／Ｐ／ＡＡＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＧＧ
配列番号２ ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＧＣＴＡＡＴＧＧ
それぞれが５０ｕＬのＰＣＲ反応物は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ）、フォワードおよびリバース標的特異的プライマーならびに１０６コピーのＨＩＶ Ｇｅｎｅｗｉｚ ＤＮＡ鋳型を含んでいた。
製造業者の忠告に従ってサーマルサイクラーを用いてＰＣＲ増幅を行った。Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＡｎａｌｙｚｅｒまたはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅを使用してオフターゲット産物およびＰＣＲ反応があるかどうかを判定するＰＣＲ ＱＣ評価は効率的であった。ＳＰＲＩビーズを使用してＰＣＲ産物を精製して、過剰のプライマーおよびＰＣＲ試薬を除去した。各ビーズ浄化物をトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に溶離し、エキソヌクレアーゼ反応物への２ｕｇのインプットについての体積量を計算した。
ラムダエキソヌクレアーゼによるエキソヌクレアーゼ反応物は、ラムダエキソヌクレアーゼおよび２ｕｇのｄｓＤＮＡアンプリコンを含んでいた。加熱蓋を備えるサーマルサイクラー中で反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７５℃で１０分間、熱不活性化した。
ワークフローにおける次の反応に備えて産物をＳＰＲＩビーズで精製し、溶離緩衝液３０ｕＬ中に溶離し、Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡキットばかりでなく、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定して、エキソヌクレアーゼ反応の効率を決定した。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化を行った。一本鎖ＤＮＡ鋳型のリン酸化は、ライゲーションを可能にする。
ワークフローにおける次の反応に備えて産物をＳＰＲＩビーズで精製し、溶離緩衝液３０ｕＬ中に溶離し、ＱＣステップの必要なしにライゲーション（環化）反応に直接進んだ。
ＤＮＡリガーゼおよび環化オリゴヌクレオチドによりライゲーションを行った。プライマー配列尾部およびＭ１３尾部に対する相補配列を有する長いプローブを環化のために使用する。
配列番号３ ＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡ
５’リン酸化ｓｓＤＮＡ鋳型を１０ｕｌの２０ｕＭ線状プローブと混合して４９ｕＬの体積とし、環化およびライゲーションを起こさせるためにＴａｑ ＤＮＡリガーゼを添加する。
ワークフローにおける次の反応に備えてライゲーション後の産物をＳＰＲＩビーズで精製し、４５ｕＬの溶離緩衝液中に溶離した。Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡキットを用いてライゲーション後の産物を測定する。
一本鎖環状標的核酸を調製する最終ステップでは、エキソヌクレアーゼＥｘｏ ＩおよびＥｘｏ ＩＩＩの混合物により、またはＥｘｏ ＶＩＩにより線状または非環化核酸を除去した。反応物を３７Ｃで３０分間インキュベートした。
産物をＳＰＲＩビーズで精製し、２０ｕＬの溶離緩衝液中に溶離し、Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡばかりでなくＢｉｏａｎａｌｚｙｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙを用いたＱＣを行って、精製された最終ライブラリーの収量およびサイズを決定した。例示的なｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡライブラリーの収量を図３に示す。
実施例２
一本鎖環状鋳型の配列決定
Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＲＳＩＩ機器（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）を製造業者の説明書に従って用いて、上記の一本鎖環状分子を配列決定した。結果を表１および図４に示す。

Claims (16)

  1. 標的核酸から環状分子を形成する方法であって、
    ａ）ユニバーサル環化配列および標的特異的配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；
    ｂ）二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；
    ｃ）アンプリコンの鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；ならびに
    ｄ）鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状分子を形成するステップ
    を含む方法。
  2. 標的核酸が、無細胞性血漿ＤＮＡ、超音波処理ＤＮＡおよび制限酵素消化ＤＮＡから選択されるゲノムの断片を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 第１および第２の増幅プライマー上のユニバーサル配列が別個である、請求項１に記載の方法。
  4. 第１または第２の増幅プライマーのユニバーサル配列が、配列決定プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 第１および第２の増幅プライマーの一方だけが、５’−リン酸基を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 二本鎖アンプリコンの鎖同士が、ヌクレアーゼ消化により分離される、請求項１に記載の方法。
  7. 二本鎖アンプリコンの鎖同士が、物理的手段により分離される、請求項１に記載の方法。
  8. 環化オリゴヌクレオチドが、捕捉部分に対するリガンドを含む、請求項１に記載の方法。
  9. リガンド−捕捉部分の対が、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはオリゴヌクレオチド−相補性捕捉オリゴヌクレオチドから選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 環化オリゴヌクレオチドが、２部構成のプライマー中のユニバーサル環化配列と相補的な一本鎖領域を有するＹ型構造である、請求項１に記載の方法。
  11. 配列決定のための環状標的核酸のライブラリーを作製する方法であって、
    ａ）ユニバーサル環化配列および標的特異的配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；
    ｂ）二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；
    ｃ）鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させて、ハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；ならびに
    ｄ）鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸のライブラリーを形成するステップ
    を含む方法。
  12. 標的核酸が、標的配列とコンジュゲートされたユニバーサルプライマー結合部位を含むユニバーサルアダプター配列を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法であって、
    ａ）ユニバーサルプライマー結合部位を試料中の標的核酸の末端に付けて、アダプター付加された標的核酸を形成するステップ；
    ｂ）ユニバーサルプライマー結合部位と相補的なユニバーサルプライマーおよびユニバーサル環化配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて、アダプター付加された標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；
    ｃ）二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；
    ｄ）鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させて、ハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が、環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；
    ｅ）鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸を形成するステップ；
    ｆ）試料を、２部構成のプライマーのユニバーサル配列の一方と相補的な配列決定プライマーと接触させるステップ；ならびに
    ｇ）核酸ポリメラーゼを用いて配列決定プライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定するステップ
    を含む方法。
  14. ユニバーサルプライミング部位が、ユニバーサルプライミング部位を含むアダプターのライゲーションを介して付けられる、請求項１３に記載の方法。
  15. 試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法であって、
    ａ）標的特異的配列およびユニバーサル環化配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅して、二本鎖アンプリコンを生成するステップ；
    ｂ）二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップ；
    ｃ）鎖を環化オリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド構造を生成するステップであって、鎖中のユニバーサル環化配列が環化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより、各鎖の末端同士がライゲーション可能な近接状態になる、ステップ；
    ｄ）鎖の末端同士をライゲーションし、それにより環状標的核酸を形成するステップ；
    ｅ）試料を、２部構成のプライマーのユニバーサル配列の一方と相補的な配列決定プライマーと接触させるステップ；ならびに
    ｆ）核酸ポリメラーゼを用いて配列決定プライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定するステップ
    を含む方法。
  16. 標的核酸の配列を決定するためのキットであって、
    ａ）ユニバーサル環化配列および標的結合配列を含む第１および第２の２部構成の増幅プライマー；
    ｂ）２部構成のプライマー中のユニバーサル環化配列と少なくとも部分的に相補的であることにより、２部構成のプライマーを含む鎖の末端同士が、ライゲーション可能な近接状態になり得る環化オリゴヌクレオチド
    を含むキット。
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