JP2020530997A - キメラ抗原受容体媒介性細胞標的化 - Google Patents

キメラ抗原受容体媒介性細胞標的化 Download PDF

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Abstract

細胞を、細胞生存能力を保存することができる条件で少なくとも１つのＤＮＡ結合性ドメインおよび切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む操作されたヌクレアーゼを使用してＣＡＲを発現するように操作するための方法および組成物であって、細胞がまた、不活化されたＴＣＲ、ＨＰＲＴ、ＰＤ１、ＣＩＳＨおよび／またはＨＬＡ遺伝子も含む、方法および組成物が本明細書に開示される。ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む細胞および／またはヌクレアーゼを含む細胞もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それらの開示全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる２０１７年８月８日に出願された米国仮出願第６２／５４２，５１１号；２０１７年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／５８１，２９０号；２０１８年１月３日に出願された米国仮出願第６２／６１３，２５８号および２０１８年４月４日に出願された米国仮出願第６２／６５２，６７２号の利益を主張するものである。
技術分野
本開示は、リンパ球および幹細胞を含めたヒト細胞のゲノム改変の分野に存する。
背景
遺伝子治療には、ヒト治療法の新時代のための非常に大きな潜在性がある。これらの方法体系により、標準の医療行為では対処不可能であった状態を処置することが可能になる。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊または矯正、および導入遺伝子と融合した特定の外因性プロモーターによってまたはゲノムへの挿入部位に見いだされる内因性プロモーターによってのいずれかで調節することができる発現可能な導入遺伝子の挿入、ならびにエピソームベクター系による導入遺伝子の発現などの、ゲノム編集技法の多くの変形形態を含み得る。
この技術のあらゆる実際のインプリメンテーションのために克服しなければならない障害の例は導入遺伝子の送達および挿入である。例えば、種々の遺伝子送達方法が治療的使用のために潜在的に利用可能であるが、これらの全てに、安全性、耐久性および発現のレベルの間の実質的な兼ね合いが伴う。導入遺伝子をエピソームとしてもたらす方法（例えば、基本的なアデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびプラスミドに基づく系）は、概して安全であり、高い初期発現レベルを得ることができるが、これらの方法は、強固なエピソームの複製を欠き、これにより、有糸***が活発な組織における発現の持続時間が限定される可能性がある。対照的に、所望の導入遺伝子のランダムな組込みをもたらす送達方法（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）の組込み）では、より長続きする発現がもたらされるが、ランダムな挿入の非標的化性に起因して、レシピエント細胞における制御されない成長が惹起される可能性があり、ランダムに組み込まれた導入遺伝子カセットの付近での癌遺伝子の活性化による悪性腫瘍が潜在的に導かれる。さらに、導入遺伝子の組込みでは複製に駆動される喪失が回避されるが、導入遺伝子と融合した外因性プロモーターの最終的なサイレンシングは防止されない。経時的に、そのようなサイレンシングにより、大多数の非特異的挿入事象について導入遺伝子発現の低減が生じる。さらに、あらゆる標的細胞において導入遺伝子の組込みがまれに起こり、これにより、所望の治療効果を実現するための十分に高い目的の導入遺伝子の発現レベルを実現することが難しくなり得る。
近年、選択されたゲノム遺伝子座への偏向挿入のために部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ガイド特異的切断のための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）など）を用いた切断を使用する、導入遺伝子の組込みのための新しい戦略が開発された。例えば、その開示が、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により組み込まれる、米国特許第９，９３７，２０７号；同第９，８７３，８９４号；同第９，５６７，５７３号；同第９，３９４，５４５号；同第９，２５５，２５０号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２０１７／０２１１０７５号；同第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／００２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号および同第２０１３／０１７７９６０号および同第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。さらに、標的化ヌクレアーゼは、ゲノム編集および遺伝子治療における使用の潜在性も有し得るＡｒｇｏｎａｕｔｅ系（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）： ２５８−２６１を参照されたい）に基づいて開発されている。導入遺伝子を組み込むためのこのヌクレアーゼ媒介性手法では、遺伝子サイレンシングまたは近くの癌遺伝子の活性化のリスクを最小にするための正確な導入遺伝子の位置付けが可能になるので、古典的な組込み手法と比較して、導入遺伝子発現の改善、安全性の増大および発現の耐久性の見込みがもたらされる。
ＡＣＴＲ（抗体とカップリングしたＴ細胞受容体）は、外因的に供給された抗体に結合することができる、操作されたＴ細胞構成成分である。抗体のＡＣＴＲ構成成分への結合により、Ｔ細胞が抗体によって認識される抗原と相互作用するように武装され、その抗原に遭遇した時に、Ｔ細胞を含むＡＣＴＲが抗原と相互作用するように誘発される（米国特許出願公開第２０１５０１３９９４３号を参照されたい）。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の選択的活性化の必須部分である。抗体といくつかの類似点を有し、ＴＣＲの抗原認識部分は、一般には２つの鎖、αおよびβで構成され、これらは共アセンブルしてヘテロ二量体を形成している。ＴＣＲアルファおよびベータ複合体をコードする単一の遺伝子がまとめられる様式に抗体との類似点がある。ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）およびベータ（ＴＣＲβ）鎖はそれぞれ２つの領域、Ｃ末端定常領域およびＮ末端可変領域で構成される。ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖をコードするゲノム遺伝子座は、ＴＣＲα遺伝子が定常領域（多くの場合ＴＲＡＣと称される）に加えてＶセグメントおよびＪセグメントを含み、β鎖遺伝子座がＶセグメントおよびＪセグメントに加えてＤセグメントを含むという点で抗体をコードする遺伝子座と似ている。ＴＣＲβ遺伝子座に関しては、選択プロセスの間に選択されるさらに２つの異なる定常領域が存在する。Ｔ細胞発達の間に、各Ｔ細胞が相補性決定領域（ＣＤＲ）と称されるアルファ鎖およびベータ鎖内の独特のＴＣＲ可変部分を含み、本体がそれらの独特のＣＤＲに起因してＴ細胞の大きなレパートリーを有し、抗原提示細胞によってディスプレイされる独特の抗原と相互作用することができるように種々のセグメントが組み換えられる。ＴＣＲαまたはβ遺伝子再構成が起こったら、第２の対応するＴＣＲαまたはＴＣＲβの発現が抑止され、その結果、各Ｔ細胞が、「抗原受容体対立遺伝子排除」と称されるプロセスで１つの独特のＴＣＲ構造のみを発現する（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ， （２０１０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８５： ３８０１−３８０８を参照されたい）。
Ｔ細胞活性化の間に、ＴＣＲは、抗原提示細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）上にペプチドとしてディスプレイされた抗原と相互作用する。ＴＣＲによる抗原−ＭＨＣ複合体の認識により、Ｔ細胞刺激が導かれ、今度はそれにより、メモリーリンパ球およびエフェクターリンパ球におけるＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の両方の分化が導かれる。次いで、これらの細胞がクローン様式で増大して、全Ｔ細胞集団内に、１つの特定の抗原と反応することができる活性化された亜集団がもたらされる。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体とも称される。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、３つのサブグループ：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分けられる。クラスＩ ＭＨＣ分子はβ２サブユニットを有し、したがって、ＣＤ８補助受容体だけが認識することができる。ＭＨＣ Ｉ分子は、３つのドメイン−α１、α２、およびα３で構成されるα鎖として存在する。α１は、非ＭＨＣ分子β２ミクログロブリン（ヒト１５番染色体上にコードされる。Ｂ２Ｍと略される）の単位に基づく。α３ドメインは、膜貫通型であり、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞膜に繋留する。提示されるペプチドは、α１／α２ヘテロ二量体（２つの同一でないサブユニットで構成される分子）の中心的な領域内のペプチド結合性溝の底に保持される。遺伝子によりコードされ、発現される、ペプチド結合性溝の底の残基の配列であるアミノ酸の配列により、それが結合する特定のペプチド残基が決定される。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の一部である特殊化した細胞である。ＮＫ細胞は、体内に見いだされるリンパ球の３つの型：Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のうちの１つである。これらの細胞は、体内の腫瘍細胞ならびに細菌感染およびウイルス感染細胞の死滅において主要な役割を果たす。例えば、米国特許出願公開第２０１４０３０１９９０号を参照されたい。それらの細胞傷害能力は、２つの優勢な経路によって主に媒介される。膜破壊タンパク質、パーフォリン、および構造的に関連するセリンプロテアーゼのファミリー、グランザイムがエキソサイトーシスによって分泌され、これらが共同で標的細胞のアポトーシスを誘導する。第２の経路では、カスパーゼ依存性アポトーシスをもたらす標的細胞上の細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ／ＣＤ９５）とＦａｓＬなどのそれらの等価のリガンド、およびＮＫ細胞上の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）との会合を伴うカスパーゼ依存性アポトーシスが起こる。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も、ＩｇＧ低親和性Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現するので、同じくＮＫ細胞による腫瘍細胞の死滅の機構になり得る（Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ （２０１５） Ｈｅｍａｔ／Ｏｎｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ ８ （２）： ４７−５５）。
ＮＫ細胞機能は、細胞表面上に発現される広範囲の受容体によって調節される。これらの受容体は、天然では阻害性または活性化性のいずれかである。阻害性受容体のファミリーは、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）またはＩｇ様受容体（ＣＤ１５８）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ）および白血球阻害性受容体（ＬＩＲ１、ＬＡＩＲ−１）からなる。活性化受容体は、天然の細胞傷害性受容体（ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４）、Ｃ型レクチン受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ｃ）、およびＩｇ様受容体（２Ｂ４）である。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、活性化シグナルと阻害性のシグナルの間の平衡によって密接に制御されるが、阻害性シグナル伝達は、活性化よりも優勢のシグナルであり得る。阻害性ＮＫ細胞受容体は、自己ＭＨＣクラスＩ分子を認識し、これによりＮＫ細胞活性化が妨げられ、これにより、自己寛容および宿主細胞死滅の防止が説明される。ＮＫ細胞が、自己ＭＨＣクラスＩ分子（「ＨＬＡ−Ｉ」）を欠く細胞に遭遇した時に活性化され得ることも示されている。ＨＬＡ−Ｉ結合性阻害性受容体（例えば、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＩＬＴ２、およびＬＩＲ１）の発現により、ＮＫ細胞の正常な細胞に対する寛容性がもたらされる。ＮＫ細胞は、通常、表面ＨＬＡ−Ｉ分子の下方制御を示す異常な細胞を攻撃し、これは「自己性喪失認識」と称される。しかし、「自己性喪失」の結果、ＨＬＡ−Ｉを欠く細胞を溶解する許可されたＮＫ細胞の影響を受けやすくなる（Ｃｒｕｘ ａｎｄ Ｅｌａｈｉ （２０１７） Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８： ８３２）。
ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｉｂクラスとも称されるＨＬＡ非古典的クラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、それぞれＨＬＡ−Ｅ遺伝子またはＨＬＡ−Ｇ遺伝子によってコードされる重鎖と、ベータ２ミクログロブリン−Ｂ２Ｍによってコードされる軽鎖とからなるヘテロ二量体である。ヒトＨＬＡ−Ｅは、多型が限定されていることおよびその古典的パラログよりも細胞表面発現が低いことを特徴とする非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。ＨＬＡ−Ｅハプロタイプは、ＨＬＡ−Ｅ＊０１０１（ＥＲまたはＨＬＡ−Ｅ０１０１とも称される）を含み、これは、ＨＬＡ−Ｅ＊０１０３（ＥＧまたはＨＬＡ−Ｅ０１０３とも称される）とは１アミノ酸位のみが異なる、すなわち、ＨＬＡ−Ｅ０１０１の１０７位のアルギニンがＨＬＡ−Ｅ０１０３ではグリシンに置き換えられている（Ｃｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６８ （１）： ２９−４１）。２０１７年時点で、５２種のＨＬＡ−Ｇ対立遺伝子／ハプロタイプがＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ／ヒト主要組織適合性遺伝子複合体（ＩＭＧＴ／ＨＬＡ）データベース（リリース３．２３．０）によって公式に認められた。ＨＬＡ−Ｇコード領域内の一塩基多型（ＳＮＰ）の大部分は、コードする同義の突然変異またはイントロンバリアントのいずれかである。ＩＭＧＴ／ＨＬＡによって公式に認められた５２種の対立遺伝子のうち、１３種の対立遺伝子のみが４種の異なるＨＬＡ−Ｇ全長分子をコードし、世界中で頻繁に観察されている（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ Ｏｐｅｎ Ｊ． ２ （１）： １−９． ｄｏｉ： １０．１７１４０／ＡＮＴ−ＰＯＪ−２−１０６）。最も一般的なＨＬＡ−Ｇ対立遺伝子（多くの場合、野生型と称される）のうちの１つはＨＬＡ−Ｇ＊０１：０１対立遺伝子である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｉｎｔ Ｊ． Ｃｉｒｃｕｍｐｏｌａｒ Ｈｅａｌｔｈ ７２． ｄｏｉ： １０．３４０２／ｉｊｃｈ．ｖｙ２ｉ０．２１３５０）。
ＨＬＡ−Ｅは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）による細胞認識において非常に特殊化された役割を有する。ＮＫ細胞は、ヘテロ二量体阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ／Ｃを使用してＨＬＡ−Ｅ＋ペプチド複合体を認識する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂが会合すると、ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する阻害作用が生じて細胞溶解が防止されるが、ＨＬＡ−ＥのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃへの結合により、ＮＫ細胞活性化がもたらされる。この相互作用により、抗ウイルス応答におけるＮＫ細胞サブセットの増大が誘発されることが示されている。ヒト白血球抗原−Ｅは、広範な組織分布を有するが全てのＭＨＣ−クラスＩ分子の中で多型性が最小である非古典的ＨＬＡ−Ｉｂである。ヒト白血球抗原−Ｅは、腫瘍における低酸素およびグルコース欠乏などの微小環境ストレスによって上方制御されるが、ＨＬＡ−Ｉａ分子よりも低い率で転写される（ＣｒｕｘおよびＥｌａｈｉ、ｉｂｉｄ）。
ＨＬＡ−Ｇは、一般には胎児由来胎盤細胞膜上に発現され、妊娠時の免疫寛容において役割を果たし得る。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子と非常に類似しているが、ＨＬＡ−Ｇによってコードされるタンパク質は、細胞内セグメントの大部分を欠くという点で他の３種の遺伝子の産物とは異なる。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子座に特異的なプローブおよびプライマーを使用したノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、この遺伝子が種々の細胞および成体組織ならびに胎児組織において転写されることが実証された（Ｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎ． ４１： ７９−８６， １９９４）。大多数の組織において、ｍＲＮＡレベルは同じ組織における古典的クラスＩ遺伝子のレベルよりも数桁低かった。ＨＬＡ−Ｇ一次転写産物の代替スプライシングは、組織間で異なり、組織特異的に制御することができる。ＨＬＡ−Ｇは、ＮＫ細胞阻害性受容体ＫＩＲ２ＤＬ４のリガンドであり、したがって、栄養膜細胞によりこのＨＬＡが発現されることにより、理論的には、栄養膜細胞がＮＫ細胞媒介性死亡から防御される。
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、送達された細胞により患者のがんを攻撃し、一掃するために、腫瘍に特異的な免疫細胞を患者に送達することに基づく、開発途上のがん治療の形態である。ＡＣＴは、患者の独自の腫瘍塊から単離し、患者に再度注入し戻すためにｅｘ ｖｉｖｏで増大させたＴ細胞である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用を伴い得る。この手法は、転移性黒色腫の処置において有望であり、１つの研究では、＞５０％の長期奏効率が観察された（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １７ （１３）： ４５５０を参照されたい）。ＴＩＬは、腫瘍に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する患者独自の細胞が混在するセットであるので、細胞の有望な供給源である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １８ （２）： １６０）。他の手法は、患者の血液から単離されたＴ細胞を、何らかによって腫瘍に対して応答性になるように操作されるように編集することを伴う（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３ （９５）： ９５ｒａ７３）。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞が細胞表面上に発現される特異的な分子標的にターゲティングされるように設計された、操作された分子である。最も基本的な形態では、ＣＡＲは、細胞の外側で発現される特異性ドメインと細胞の内側のシグナル伝達経路がカップリングし、したがって、特異性ドメインがその標的と相互作用すると、細胞が活性化されるように細胞に導入される受容体である。多くの場合、ＣＡＲは、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などの抗原特異的ドメインまたはいくつかの他の型の受容体（例えば、サイトカイン受容体）が免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）および他の共刺激ドメインなどのシグナル伝達ドメインと融合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的ドメインを模倣することにより作製される。これらの構築物をＴ細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入し、したがって、Ｔ細胞を患者に再導入した時に、そのＴ細胞が標的抗原を発現する細胞の存在下で活性化され、その結果、活性化されたＴ細胞による標的とされた細胞に対するＭＨＣ非依存的な攻撃がもたらされる（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０： ２９４−３１１を参照されたい）。ゲノムの恒久的な改変をもたらすレトロウイルスベクター方法およびレンチウイルスベクター方法から、一過性の遺伝子発現を導くＲＮＡに基づく方法まで、種々の方式のＴ細胞への遺伝子移入を使用することができる。レトロウイルスまたはレンチウイルスによる手法には、長期間にわたる遺伝子発現、したがって、操作されたＴ細胞の単回注入による長期間にわたる疾患管理の潜在性（これらのＴ細胞が持続する場合）という利点がある。恒久的な改変の不都合は、持続的なオンターゲット毒性および遺伝子挿入の結果、近くの癌遺伝子の制御不全が生じる場合の形質転換の理論的なリスクである。メッセンジャーＲＮＡを使用した遺伝子移入では、ゲノムへの組込みを伴わない一過性発現がもたらされ、これにより、ランダムな組込みによる形質転換の心配が全く不要になる。エレクトロポレーションによるＲＮＡ挿入によって操作されたＴ細胞は、顕著な複製に関わる能力を有し、実質的な腫瘍反応を生じることができる。しかし、発現は一般には７日間またはそれ未満続き、したがって、長期間にわたる疾患管理は、それでも可能ではあるが、そのためにはこの手法を用いた多数回の注入が必要になり得る（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｂｌｏｏｄ １２５ （２６）： ４０１７−４０２３）。
操作されたＴＣＲまたはＣＡＲを用いてｅｘ ｖｉｖｏで変更されたＴ細胞を使用した養子細胞療法は、いくつかの疾患の型に対して有望な臨床的手法である。例えば、がんおよび標的とされるそれらの抗原として、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽細胞腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ１９およびＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、神経膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病）またはＣＬＬおよび急性リンパ性白血病またはＡＬＬ（どちらもＣＤ１９）が挙げられる。ＨＩＶなどのウイルスを有する細胞を攻撃するためのウイルス特異的ＣＡＲが開発されてきた。例えば、ＨＩＶを処置するためのＧｐ１００に特異的なＣＡＲを使用した臨床試験が開始され（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ， ｉｂｉｄ）、ＣＬＬを処置するため（Ｍａｕｄｅ （２０１５）ｉｂｉｄ）（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１１）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ３ （９５）： ９５ｒａ７３、およびＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．（２０１３） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１０ （５）： ２６７−２７６を参照されたい）、ならびにＡＬＬを処置するため（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３７１（１６）： １５０７−１５１７およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ ．（２０１５）Ｌａｎｃｅｔ ３８５ （９９６７）： ５１７−５２８を参照されたい）のＣＤ１９特異的ＣＡＲを使用したいくつかの試験が進行中である。
養子細胞療法の最近の成功にもかかわらず、依然として、この技法の広範にわたる採用の前に克服すべき著しい障害がいくつか存在する。例えば、注入された同種異系（ドナー由来）の操作されたＴ細胞上の内因性αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、レシピエントにおける主要組織適合性抗原およびマイナー組織適合性抗原を認識し、その結果、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が導かれる恐れがある。結果として、大多数の現行の臨床試験は、養子移入後にＴＣＲに媒介性される正常組織の有害な認識を防止するために、自己ＣＡＲ＋Ｔ細胞（発現されたＣＡＲコード配列を含むＴ細胞）を注入し、免疫寛容に依拠する。この手法により、ＣＤ１９＋悪性腫瘍の標的化の最初の臨床的成功が実現されたが、患者に特異的なＴ細胞製品を製造するための時間および費用により限定されている（Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ｂｌｏｏｄ １１９： ５６９７−５７０５）。これらの操作されたＴ細胞を用いて患者を処置することにおいて生じている別の問題は、患者が最初にその腫瘍が一掃されたことが見いだされたが、標的化された抗原が下方制御された腫瘍細胞で結局再発する再発の１つ、いわゆる「免疫エスケープ」である（Ｓｏｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓ ５ （１２）： １２８２−１２９５およびＧａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｂｌｏｏｄ； １２７ （２０）： ２４０６−２４１０）。
米国特許第９，９３７，２０７号明細書 米国特許第９，８７３，８９４号明細書 米国特許第９，５６７，５７３号明細書 米国特許第９，３９４，５４５号明細書 米国特許第９，２５５，２５０号明細書 米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書 米国特許第８，９４５，８６８号明細書 米国特許第８，７０３，４８９号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０２１１０７５号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書 米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書 米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書 米国特許出願公開第２０１５０１３９９４３号明細書
Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）： ２５８−２６１ Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ， （２０１０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８５： ３８０１−３８０８ Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ （２０１５） Ｈｅｍａｔ／Ｏｎｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ ８ （２）： ４７−５５ Ｃｒｕｘ ａｎｄ Ｅｌａｈｉ （２０１７） Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８： ８３２ Ｃｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６８ （１）： ２９−４１ Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ Ｏｐｅｎ Ｊ． ２ （１）： １−９． ｄｏｉ： １０．１７１４０／ＡＮＴ−ＰＯＪ−２−１０６ Ｍｅｔｃａｌｆｅ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｉｎｔ Ｊ． Ｃｉｒｃｕｍｐｏｌａｒ Ｈｅａｌｔｈ ７２． ｄｏｉ： １０．３４０２／ｉｊｃｈ．ｖｙ２ｉ０．２１３５０ Ｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎ． ４１： ７９−８６， １９９４ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １７ （１３）： ４５５０ Ｗｕ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １８ （２）： １６０ Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３ （９５）： ９５ｒａ７３ Ｃｈｉｃａｙｂａｍ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０： ２９４−３１１ Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｂｌｏｏｄ １２５ （２６）： ４０１７−４０２３ Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１１）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ３ （９５）： ９５ｒａ７３ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．（２０１３） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１０ （５）： ２６７−２７６ Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３７１（１６）： １５０７−１５１７ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ．（２０１５）Ｌａｎｃｅｔ ３８５ （９９６７）： ５１７−５２８ Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ｂｌｏｏｄ １１９： ５６９７−５７０５ Ｓｏｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓ ５ （１２）： １２８２−１２９５ Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｂｌｏｏｄ； １２７ （２０）： ２４０６−２４１０
したがって、養子細胞療法を使用することによって実証された潜在性にもかかわらず、武装されたＴ細胞の効率および特異性を増大させるために使用することができる方法および組成物が依然として必要とされている。具体的には、ＣＡＲおよび操作されたＴＣＲを含む抗原特異的複合体を安全に導入し、発現を持続させるための方法が必要とされている。さらに、処置される各患者に対して改変細胞を開発することを必要とせずに多数の患者を処置するために使用することができる、患者の免疫系（例えば、ＨＬＡ複合体）によって認識されるマーカーを欠く普遍的な操作されたＴ細胞を開発するための方法が必要とされている。
要旨
操作されたＴ細胞にキメラ抗原受容体を導入するための組成物および方法が本明細書に開示される。提示される方法は、１つまたは複数のＣＡＲ（単数または複数）の１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子への標的化組込み（ＣＡＲ＋細胞とも称される）を含めた、１つまたは複数のドナー導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ（単数または複数））をコードする遺伝子の細胞への標的化導入を含む。したがって、得られる本発明の細胞は、選択された抗原（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１７１、ＣＤ１９）、および／またはＩＬ１３Ｒα２に特異的な１つまたは複数のＣＡＲ（単数または複数）を含み、また、機能的な内因性ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ複合体を欠く。一部の実施形態では、細胞を別の遺伝子座（例えば、ＣＩＳＨまたはＰＤ１などのチェックポイント遺伝子）において、得られる細胞がＴＣＲ、Ｂ２Ｍおよび任意の数の他の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ）遺伝子における編集を含み、その結果、細胞がネイティブなＴＣＲ、ＨＬＡ複合体を欠き、そしてＣＩＳＨチェックポイント遺伝子などの追加的な遺伝子のノックアウトを生じ、そしてドナー導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）を含むようにさらに改変する。これらの細胞は、標的抗原を有する他の細胞を排除するために有用である。好ましい実施形態では、操作されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を養子細胞療法のために調製する。一部の実施形態では、操作されたＣＡＲ＋Ｔ細胞は、改変されたＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現し、それにより、ＮＫ媒介性死滅をエスケープすることが可能になる。さらに、操作されたＴ細胞の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで分析する目的で、抗原を無関連の細胞型において発現させるための方法および組成物が本明細書で提供される。
一態様では、遺伝子改変Ｔ細胞（およびこれらの遺伝子改変Ｔ細胞を複数含むＴ細胞の集団）が本明細書で提供され、遺伝子改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドならびにベータ２−ミクロ−グロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質とＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＴ細胞受容体−α（ＴＣＲＡ）遺伝子に組み込まれている。ある特定の実施形態では、細胞において１つまたは複数の追加的な遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子および／または１つまたは複数の免疫チェックポイント遺伝子（例えば、ＰＤ１、ＣＩＳＨなど）が不活化されている。本明細書に記載のＴ細胞のいずれかでは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは、自己切断性ペプチド（例えば、２Ａペプチド、「Ｐ２Ａ」または「Ｐ２Ａペプチド」とも称される）によって連結されていてよい。さらに、ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ−またはＨＬＡ−Ｇをコードする配列の間にリンカーをコードする配列（例えば、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピーまたはそれよりも多くのコピーのＧ４Ｓリンカー）をさらに含む。
本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞を作製する方法であって、単離されたＴ細胞内のＴＣＲ−α遺伝子をＴＣＲ−α遺伝子内の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含むヌクレアーゼを使用して切断するステップと、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のドナーをＴ細胞に第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが切断されたＴＣＲ−α遺伝子に組み込まれるように導入するステップとを含む方法も提供される。ある特定の実施形態では、ドナーは、自己切断性２Ａペプチドによって連結された第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。さらに、ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ−またはＨＬＡ−Ｇをコードする配列の間にリンカーをコードする配列（例えば、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピーまたはそれよりも多くのコピーのＧ４Ｓリンカー）をさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかでは、１つまたは複数のドナーは、以下の１つまたは複数をさらに含み得る：（１）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを挟む相同アーム（ＴＣＲ−α遺伝子に対する）；（２）第１のポリヌクレオチドおよび／もしくは第２のポリヌクレオチドの発現を駆動する１つもしくは複数のプロモーター；（３）１つもしくは複数のＴＣＲ−αエンハンサー配列；（４）３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）および／もしくは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；（５）ＷＰＲＥ配列（例えば、３’ＵＴＲ内）；ならびに／または（５）アフリカツメガエルベータグロビン遺伝子由来の配列（例えば、５’ＵＴＲ内）。
別の態様では、１つまたは複数の外因性ＣＡＲ（単数または複数）を、例えば内因性遺伝子を含めた細胞のゲノム内へのＣＡＲ遺伝子の部位特異的組込み後に発現する、単離された細胞（例えば、リンパ系細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、ＭＳＣまたはＨＳＣ）、または前駆細胞を含めた哺乳動物細胞などの真核細胞）が本明細書に記載される。一部の実施形態では、ＣＡＲをＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲＡおよび／もしくはＴＲＢＣ）に、ならびに／または、必要に応じてチェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＰＤ１など）および／もしくはＢ２Ｍ遺伝子に、本明細書に記載の通りまたは当技術分野で公知の通りこれらの遺伝子にターゲティングされたヌクレアーゼを使用して挿入する。さらなる実施形態では、ＣＡＲをＴＣＲＡ遺伝子に挿入し、他の実施形態では、ＣＡＲをＴＲＢＣ遺伝子に挿入する。一部の実施形態では、ＣＡＲをＢ２Ｍ遺伝子に挿入し、他の実施形態では、ＣＡＲをＴＣＲ遺伝子に加えてチェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＰＤ１など）遺伝子に挿入する。この方法によって作出される細胞では、ＣＡＲをコードする遺伝子の導入により、内因性ＴＣＲ、チェックポイント（例えば、ＣＩＳＨ）および／またはＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトがもたらされ、また、機能的な内因性ＴＣＲもしくはＨＬＡ複合体の形成のノックアウトおよび／またはチェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ）のノックアウトがもたらされる。記載されている細胞のいずれかでは、ＣＡＲをＢ２Ｍ遺伝子に組み込む場合、細胞内の１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子を細胞内で不活化して（例えば、ヌクレアーゼ媒介性不活化によって）、多数の遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子および１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子およびチェックポイント（例えば、ＣＩＳＨ）遺伝子）のノックアウトを創出することができる。同様に、ＣＡＲをＴＣＲ遺伝子に組み込む場合、１つまたは複数の異なるＴＣＲ遺伝子、チェックポイント（例えば、ＣＩＳＨ）および／またはＢ２Ｍ遺伝子を細胞内で不活化して（例えば、ヌクレアーゼ媒介性不活化によって）、多数の遺伝子（例えば、１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子）のノックアウトを創出することができる。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞（Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードする細胞に例えばＴＣＲ（ＴＣＲＡ）遺伝子にＣＡＲと一緒に挿入された、変更されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ遺伝子（導入遺伝子）をさらに含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ遺伝子（例えば、外因性導入遺伝子）を操作された細胞にＣＡＲ遺伝子と共導入する。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を、ＣＡＲ遺伝子を導入する前または導入した後に導入する。さらなる実施形態では、導入遺伝子は、リンカーをコードする配列と融合し、リンカーをコードする配列が今度はＢ２Ｍ遺伝子配列と融合したＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ遺伝子配列（すなわち、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ−コード配列、リンカーおよびＢ２Ｍ−コード配列を含む導入遺伝子）を含み、したがって、Ｂ２Ｍ遺伝子がＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ遺伝子を有するオープンリーディングフレームの一部であり、その結果、発現されると導入遺伝子から発現されたＢ２Ｍと安定なＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を形成することができるような、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体をコードする。この実施形態では、リンカーの存在に起因して、Ｂ２Ｍサブユニットは、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇタンパク質のみと会合して細胞表面に安定なＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を形成することができ、他のいかなるＨＬＡ複合体とも会合することはできない。さらに別の実施形態では、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ−リンカー−Ｂ２Ｍ導入遺伝子を目的のＣＡＲをコードする配列と連結し、ここで、構築物は、ＣＡＲ遺伝子とＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ−リンカー−Ｂ２Ｍ構築物の間に２Ａ自己切断性ペプチド配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、このＣＡＲ−ＨＬＡ−ＧまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ複合体は、相同アームも含み、したがって、この複合体は、ゲノムの指定の部位に組み込むことができる。一部の実施形態では、組込みの部位により、組込みの部位の内因性プロモーターによって駆動される転写が引き起こされる、またはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥもしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ構築物を同じく組み込まれるプロモーターに連結することができ、したがって、発現構築物はゲノムに組み込まれるが、異種プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、エピソーム（例えば、ｃＤＮＡ）核酸からの発現を可能にするために、ＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ複合体（導入遺伝子）をプロモーターに作動可能に連結する。これらに限定されないが、ＷＰＲＥおよび／またはＴＣＲａエンハンサー配列を含めた追加的な配列もドナー構築物に含めることができる。さらなる実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。さらに、これらの発現構築物のいずれかは、ＡＡＶ粒子へのパッケージングを可能にするために、ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含んでよい。一部の例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９または任意の他の型のＡＡＶである。
一部の態様では、ＴＣＲ遺伝子をＴＣＲＡ遺伝子のエクソンｃ２の改変によってモジュレートする。Ｂ２Ｍ遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１の改変によってモジュレートする。ある特定の実施形態では、改変は、表１の標的部位に示されている１２〜２５（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の標的部位を含む）もしくはそれよりも多くのヌクレオチドを含む配列内における、かつ／もしくはそれに隣接する、表１に示されている標的部位（配列番号１および２；配列番号３および４、配列番号５および６；配列番号３９および４０；配列番号５０および５１）内における、かつ／もしくはそれに隣接する；表１に示されている標的部位（配列番号１〜６、３９、４０、５０もしくは５１）の両側の（ゲノム配列を挟む）１〜５塩基対内、１〜１０塩基対内もしくは１〜２０塩基対内における；またはＴＣＲＡ ＺＦＮ対についてはＴＴＧＡＡＡ内、もしくはＢ２Ｍ ＺＦＮ対についてはＧＣＣＴＴＡ内におけるものである。その代わりに、またはそれに加えて、改変は、本明細書に記載の対の標的部位の間の配列（例えば、ゲノム配列）（例えば、ＴＣＲＡ遺伝子における５５２６６の標的部位と５３８５３の標的部位の間（配列番号１と配列番号２の間）もしくは６８８１３の標的部位と６８８１２の標的部位の間（配列番号３９と配列番号４０の間）；ならびに／またはＢ２Ｍ遺伝子における５７０７１の標的部位と５７５３１の標的部位の間（配列番号３と配列番号４の間）；ＣＩＳＨ遺伝子における５９４８８の標的部位と５９４８９の標的部位（配列番号５０および配列番号５１）を含めた、表１に示されているヌクレアーゼ対の標的部位に行うこともできる。追加的な実施形態では、ＨＰＲＴ遺伝子における３７７０６の標的部位と４８４０７の標的部位の間（配列番号５と６の間）に追加的なゲノム改変を行う。遺伝子改変は、機能的ドメイン（例えば、転写制御ドメイン、ヌクレアーゼドメイン）と、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメイン（単数または複数）、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよびｓｇ ＲＮＡ ＤＮＡ結合性ドメインを含めたＤＮＡ結合性ドメインとを含む外因性融合分子の細胞への導入によって行うことができる。改変細胞としては、これらに限定されないが、（ｉ）表１に示されている標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインおよび転写制御ドメインを含む外因性転写因子を含み、転写因子によりＢ２Ｍおよび／もしくはＴＣＲＡ遺伝子発現がモジュレートされる細胞、ならびに／または（ｉｉ）表１に示されている標的部位の１つまたは複数にまたはその付近に（その内部に、その間にまたはそれに隣接して）；表１に示されている標的部位の両側の（ゲノム配列を挟む）１〜５塩基対内、１〜１０塩基対内または１〜２０塩基対内に；もしくはＴＣＲＡについてはＴＴＧＡＡＡ内、もしくはＢ２ＭについてはＧＣＣＴＴＱ内に；ならびに／または本明細書に記載の対の標的部位（例えば、表１に示されているヌクレアーゼ対の標的部位）の間に挿入および／または欠失を含む細胞を挙げることができる。細胞は、さらなる改変、例えば、追加的な不活化されたＴＣＲもしくはＢ２Ｍ遺伝子、不活化されたＨＬＡ遺伝子、ＣＩＳＨ、ＰＤ１および／もしくはＣＴＬＡ４遺伝子ならびに／または抗体とカップリングしたＴ細胞受容体（ＡＣＴＲ）をコードする導入遺伝子ならびに／またはＣＡＲをコードする導入遺伝子、ならびに／または抗体をコードする導入遺伝子を含み得る。細胞はまた、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体のための発現構築物も含み得る。本明細書に記載の任意の細胞を含む医薬組成物ならびに細胞および医薬組成物を対象における障害（例えば、がん）を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ治療において使用する方法も提供される。
したがって、一態様では、ＣＡＲをコードする遺伝子の組込みに加えて、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされる（例えば、活性化される、抑止されるまたは不活化される）遺伝子改変細胞が本明細書に記載される。一部の実施形態では、細胞は、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体も含む。好ましい実施形態では、ＴＣＲＡ遺伝子のエクソンｃ２がモジュレートされ、かつ／またはＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１がモジュレートされる。モジュレーションは、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子に結合し、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ発現を制御する外因性分子（例えば、ＤＮＡ結合性ドメインおよび転写活性化もしくは抑止ドメインを含む操作された転写因子）によるものであってよく、かつ／または、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子の配列改変（例えば、ＴＣＲもしくはＢ２Ｍ遺伝子を切断し、挿入および／もしくは欠失によって遺伝子配列を改変するヌクレアーゼを使用する）によるものであってよい。一部の実施形態では、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子および必要に応じて免疫チェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ（表１のヌクレアーゼ）、ＰＤ１（米国特許第８，５６３，３１４号）、ＣＴＬＡ−４など）などの追加的な遺伝子のノックアウトを引き起こすために操作されたヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を含む細胞が記載される。他の実施形態では、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされるように１つまたは複数の操作された転写因子（ＴＦ）を含む細胞が記載される。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされる細胞であって、少なくとも１つの外因性導入遺伝子ならびに／または少なくとも１つの内因性遺伝子（例えば、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）もしくはＴＣＲ遺伝子、および／もしくはＰＤ１および／もしくはＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイント遺伝子）の追加的なノックアウトまたはこれらの組合せを含むようにさらに操作されている細胞がさらに記載される。外因性導入遺伝子（単数または複数）をＴＣＲまたはＢ２Ｍ遺伝子に組み込むことができ（例えば、ＴＣＲまたはＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトする場合）、また、これらに限定されないが、チェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＰＤ１）またはセーフハーバー遺伝子などの非ＴＣＲまたは非Ｂ２Ｍ遺伝子を含めた１つまたは複数の遺伝子に組み込むこともできる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＣＡＲ導入遺伝子（例えば、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子ならびにセーフハーバー遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、アルブミン、ＨＰＲＴなど）に組み込む。同じまたは異なるＣＡＲ導入遺伝子を同じまたは異なる遺伝子座に組み込むことができる。ＴＲＡＣ遺伝子に加えて１つまたは複数のＣＡＲを１つまたは複数のセーフハーバー遺伝子に組み込む実施形態では、ＣＩＳＨおよび／またはＢ２Ｍも不活化することが好ましい（例えば、挿入および／または欠失によるヌクレアーゼ媒介性不活化によって）。一部の場合では、外因性導入遺伝子は、ＡＣＴＲをコードする。導入遺伝子構築物をＨＤＲに駆動されるプロセスまたはＮＨＥＪに駆動されるプロセスのいずれかによって挿入することができる。一部の態様では、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ発現がモジュレートされる、ＣＡＲを含む細胞は、少なくとも外因性ＡＣＴＲを含む。ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍモジュレーターを含む細胞のいくつかは、１つまたは複数のチェックポイント阻害遺伝子のノックアウトをさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子は、ＣＩＳＨであり（以下の表１および米国仮特許出願第６２／５８３，７２４号を参照されたい）、他の実施形態では、チェックポイント阻害遺伝子は、ＰＤ１である（米国特許第８，５６３，３１４号を参照されたい）。他の実施形態では、チェックポイント阻害因子は、ＣＴＬＡ４である。例えば、米国特許第９，５９７，３５７号を参照されたい。別の態様では、ＣＡＲを含む、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍがモジュレートされる細胞は、ＰＤ１ノックアウトおよび／またはＣＴＬＡ４ノックアウトおよび／またはＣＩＳＨノックアウトをさらに含む（以下の表１）。一部の実施形態では、モジュレートされるＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、これは、この遺伝子の定常領域（ＴＣＲβ定常領域、またはＴＲＢＣ）の標的化切断によって実現される。ある特定の実施形態では、モジュレートされるＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲα（ＴＣＲＡ）をコードする遺伝子である。さらなる実施形態では、挿入は、ＴＣＲα遺伝子の定常領域（本明細書では「ＴＲＡＣ」配列と称される）の標的化切断を含めた、ＴＣＲα遺伝子の定常領域の標的化切断によって実現される。一部の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子改変細胞を、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子（表１に開示されている標的化部位）、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、またはＴＡＰ遺伝子、またはこれらの任意の組合せにおいてさらに改変する。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＩＩＴＡの制御因子（米国特許第８，９４５，８６８号を参照されたい）も改変する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲを含む細胞は、ＴＣＲＡ遺伝子に対する改変（例えば、欠失および／または挿入、ＴＣＲ発現を抑止するように操作されたＴＦの結合）（例えば、エクソンｃ２の改変）をさらに含む。ある特定の実施形態では、改変は、表１に示されている標的部位（配列番号１または２）のいずれか内における、かつ／もしくはそれに隣接する、かつ／または対の標的部位（例えば、表１に示されているヌクレアーゼ対の標的部位）の間における、これらの配列のいずれか内および／またはＴＣＲＡ遺伝子においてこれらの配列に挟まれた遺伝子（ゲノム）配列の１〜５０塩基対（その間の任意の値、例えば１〜５塩基対、１〜１０塩基対または１〜２０塩基対などを含む）内の１つまたは複数のヌクレオチドに対する結合、切断、挿入および／または欠失による改変を含めたものである。ある特定の実施形態では、細胞は、以下の１つまたは複数の配列内の改変（結合、切断、挿入および／または欠失）を含む：ＴＣＲＡ遺伝子（例えば、エクソンｃ２）内のＴＴＧＡＡＡまたはＢ２Ｍ遺伝子（例えば、エクソン１）内のＧＣＣＴＴＡ。ある特定の実施形態では、改変は、本明細書に記載の操作されたＴＦを、ＴＣＲＡ遺伝子発現がモジュレートされる、例えば、抑止または活性化されるように結合させることを含む。他の実施形態では、改変は、これらに限定されないが、上流、下流および／もしくは切断の部位（単数または複数）および／もしくは結合性部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の配列に対する改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜１００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜５０塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）（例えば、１〜５塩基対、１〜１０塩基対、１〜２０塩基対もしくはそれよりも多くの塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合性部位および／もしくは切断部位内の１つもしくは複数の塩基対に対する改変を含めた、ヌクレアーゼ（単数または複数）結合性（標的）部位および／もしくは切断部位（単数または複数）もしくはその付近の遺伝子改変（ヌクレオチド配列の変更）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号１および配列番号２および／もしくは配列番号３９および４０のいずれか内、その周囲もしくはその間のＴＣＲＡ遺伝子配列の標的部位もしくはその付近（例えば、１〜３００塩基対、１〜５０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対もしくはその間の任意の数の塩基対）ならびに／または対の標的部位（例えば、表１）の間におけるものである。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号１および配列番号２、配列番号３９および４０に示されている配列の１つもしくは複数に隣接するＴＣＲＡ遺伝子の改変またはＴＣＲＡ遺伝子（例えば、エクソンｃ２）のＴＴＧＡＡＡ内の改変、例えば、これらの配列の１つまたは複数に対する１つまたは複数の塩基対の改変を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、対の標的部位の間におけるものである（二量体を使用して標的を切断する場合）。ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、任意の長さの非コード配列および／または任意の長さの導入遺伝子の挿入および／または１塩基対から１０００ｋｂを超えるまで（もしくはこれらに限定されないが１〜１００塩基対、１〜５０塩基対、１〜３０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対を含めた、その間の任意の値）の欠失を含めた任意の数の塩基対の挿入および／または欠失を含み得る。
ある特定の実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の表１に示されている標的部位（配列番号３および配列番号４）のいずれか内のものである、かつ／もしくはそれに隣接するものである、かつ／または、Ｂ２Ｍ遺伝子の対の標的部位（例えば、表１に示されているヌクレアーゼ対の標的部位）の間における、これらの配列のいずれか内および／またはＢ２Ｍ遺伝子内のこれらの配列に挟まれた遺伝子（ゲノム）配列の１〜５０塩基対（その間の任意の値、例えば１〜５塩基対、１〜１０塩基対または１〜２０塩基対などを含む）内の１つまたは複数のヌクレオチドに対する結合、切断、挿入および／または欠失による改変を含めたものである（例えば、エクソン１の改変）。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１内のＧＣＣＴＴＡ内に改変（結合、切断、挿入および／または欠失）を含む。ある特定の実施形態では、改変は、本明細書に記載の操作されたＴＦを、Ｂ２Ｍ遺伝子発現がモジュレートされる、例えば、抑止または活性化されるように結合させることを含む。他の実施形態では、改変は、これらに限定されないが、上流、下流および／もしくは切断の部位（単数または複数）および／もしくは結合性部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の配列に対する改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜１００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜５０塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）（例えば、１〜５塩基対、１〜１０塩基対、１〜２０塩基対もしくはそれよりも多くの塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合性部位および／もしくは切断部位内の１つもしくは複数の塩基対に対する改変を含めた、ヌクレアーゼ（単数または複数）結合性（標的）部位および／または切断部位（単数または複数）またはその付近の遺伝子改変（ヌクレオチド配列の変更）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号３および配列番号４のいずれか内、その周囲またはその間のＢ２Ｍ遺伝子配列の標的部位もしくはその付近（例えば、１〜３００塩基対、１〜５０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対もしくはその間の任意の数の塩基対）ならびに／または対の標的部位（例えば、表１）の間におけるものである。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号３および配列番号４に示されている配列の１つまたは複数内のＢ２Ｍ遺伝子の改変、またはＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１内のＧＣＣＴＴＡ内の改変、例えば、これらの配列の１つまたは複数に対する１つまたは複数の塩基対の改変を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、対の標的部位の間におけるものである（二量体を使用して標的を切断する場合）。ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、任意の長さの非コード配列および／または任意の長さの導入遺伝子の挿入および／または１塩基対から１０００ｋｂを超えるまで（もしくはこれらに限定されないが１〜１００塩基対、１〜５０塩基対、１〜３０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対を含めた、その間の任意の値）の欠失を含めた任意の数の塩基対の挿入および／または欠失を含み得る。
ある特定の実施形態では、改変は、ＨＰＲＴ遺伝子の表１に示されている標的部位（配列番号５および配列番号６）のいずれか内のものである、かつ／もしくはそれに隣接するものである、かつ／またはＨＰＲＴ遺伝子の対の標的部位（例えば、表１に示されているヌクレアーゼ対の標的部位）の間における、これらの配列のいずれか内および／またはＢ２Ｍ遺伝子内のこれらの配列に挟まれた遺伝子（ゲノム）配列の１〜５０塩基対（その間の任意の値、例えば１〜５塩基対、１〜１０塩基対または１〜２０塩基対などを含む）内の１つまたは複数のヌクレオチドに対する結合、切断、挿入および／または欠失による改変を含めたものである（例えば、イントロン１の改変）。ある特定の実施形態では、細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子が転写されなくなるようなイントロン１への挿入を含む。ＨＰＲＴ遺伝子に挿入された導入遺伝子の発現は、内因性ＨＰＲＴプロモーターによって駆動することもでき、外因性プロモーターを含めることもできる。他の実施形態では、改変は、これらに限定されないが、上流、下流および／もしくは切断の部位（単数または複数）および／もしくは結合性部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の配列に対する改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜１００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜５０塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）（例えば、１〜５塩基対、１〜１０塩基対、１〜２０塩基対またはそれよりも多くの塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合性部位および／もしくは切断部位内の１つもしくは複数の塩基対に対する改変を含めた、ヌクレアーゼ（単数または複数）結合性（標的）部位および／または切断部位（単数または複数）またはその付近の遺伝子改変（ヌクレオチド配列の変更）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号３および配列番号４のいずれか内、その周囲またはその間のＢ２Ｍ遺伝子配列の標的配列もしくはその付近（例えば、１〜３００塩基対、１〜５０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対もしくはその間の任意の数の塩基対）および／または対の標的部位（例えば、表１）の間におけるものである。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号３および配列番号４に示されている配列の１つまたは複数内のＢ２Ｍ遺伝子の改変、またはＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１内のＧＣＣＴＴＡ内の改変、例えば、これらの配列の１つまたは複数に対する１つまたは複数の塩基対の改変を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、対の標的部位の間におけるものである（二量体を使用して標的を切断する場合）。ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、任意の長さの非コード配列および／または任意の長さの導入遺伝子の挿入および／または１塩基対から１０００ｋｂを超えるまで（もしくはこれらに限定されないが１〜１００塩基対、１〜５０塩基対、１〜３０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対を含めた、その間の任意の値）の欠失を含めた任意の数の塩基対の挿入および／または欠失を含み得る。
ある特定の実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子も、表１に示されているＣＩＳＨ標的部位（配列番号５０および配列番号５１）のいずれかに結合するヌクレアーゼを使用して改変する（例えば、組込みを伴うまたは伴わない不活化）。ある特定の実施形態では、改変は、ＣＩＳＨ遺伝子が転写されなくなるようなまたは突然変異転写物がナンセンス媒介性減衰に供されるような挿入および／または欠失を含む。ＣＩＳＨ遺伝子に挿入された１つまたは複数の導入遺伝子の発現は、内因性ＣＩＳＨプロモーターによって駆動することもでき、外因性プロモーターを含めることもできる。他の実施形態では、改変は、これらに限定されないが、上流、下流および／もしくは切断の部位（単数または複数）および／もしくは結合性部位の１つもしくは複数の塩基対を含む１〜３００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の配列に対する改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜１００塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）以内の改変；結合性部位および／もしくは切断部位（単数または複数）を含むおよび／もしくは当該部位の両側の１〜５０塩基対（もしくはその間の任意の数の塩基対）（例えば、１〜５塩基対、１〜１０塩基対、１〜２０塩基対またはそれよりも多くの塩基対）以内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合性部位および／もしくは切断部位内の１つもしくは複数の塩基対に対する改変を含めた、ヌクレアーゼ（単数または複数）結合性（標的）部位および／もしくは切断部位（単数または複数）もしくはその付近の遺伝子改変（ヌクレオチド配列の変更）である。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号５０および配列番号５１のいずれか内、その周囲またはその間のＣＩＳＨ遺伝子配列の標的配列もしくはその付近（例えば、１〜３００塩基対、１〜５０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対もしくはその間の任意の数の塩基対）および／または対の標的部位（例えば、表１）の間におけるものである。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、対の標的部位の間におけるものである（二量体を使用して標的を切断する場合）。ヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、任意の長さの非コード配列および／または任意の長さの導入遺伝子の挿入および／または１塩基対から１０００ｋｂを超えるまで（もしくはこれらに限定されないが１〜１００塩基対、１〜５０塩基対、１〜３０塩基対、１〜２０塩基対、１〜１０塩基対もしくは１〜５塩基対を含めた、その間の任意の値）の欠失を含めた任意の数の塩基対の挿入および／または欠失を含み得る。
本発明のＣＡＲ＋改変細胞は、リンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞）、幹／前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（例えば、ヒトＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または造血幹細胞（ＨＳＣ）などの非ヒト哺乳動物およびヒト細胞を含めた真核細胞であり得る。ＣＡＲ＋改変細胞はまた、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体も発現するように必要に応じて改変することができる。幹細胞は、全能性であっても多能性（例えば、多能性骨髄系またはリンパ系幹細胞であるＨＳＣなどの部分的に分化したもの）であってもよい。他の実施形態では、本発明は、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ発現についてヌル遺伝子型を有するＣＡＲ＋細胞を作出する方法を提供する。次いで、本明細書に記載のＣＡＲ＋改変幹細胞（ＴＣＲＡおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子座において改変されたもの、必要に応じて、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇを発現するもの）のいずれかを分化させて、ＴＣＲＡおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子発現が改変された、本明細書に記載の幹細胞に由来する分化した（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞を生成することができる。ある特定の実施形態では、細胞の少なくとも２０％（または２０％から１００％の間の任意のパーセンテージ）、好ましくは少なくとも５０％（または５０％から１００％の間の任意のパーセンテージ）、なおより好ましくは少なくとも６０％（または６０％から１００％の間の任意のパーセンテージ）、およびなおより好ましくは少なくとも７０％〜１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）がＣＡＲ＋改変されたものである、本明細書に記載のＣＡＲ＋改変細胞の集団が本明細書に記載される。
別の態様では、本明細書に記載の組成物（ＣＡＲ＋改変細胞、必要に応じて、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現するもの）および方法を、例えば、障害の処置または防止または好転において使用することができる。方法は、一般には、（ａ）ＣＡＲをコードする導入遺伝子を細胞に、単離された細胞（例えば、Ｔ細胞またはリンパ球）内の内因性ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子をヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ）もしくは操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼ系を使用して切断することによって組込み、その結果、ＴＣＲ遺伝子を不活化もしくは下方制御すること、ならびに（ｂ）細胞を対象に導入し、それにより、障害を処置または防止することを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする遺伝子またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物をＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）に特異的に組み込み、その結果、ＴＣＲＢの発現を不活化する。一部の実施形態では、不活化は、この遺伝子の定常領域（ＴＣＲβ定常領域、またはＴＲＢＣ）の標的化切断およびＣＡＲの組込みによって実現される。好ましい実施形態では、ＣＡＲをコードする遺伝子またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物をＴＣＲα（ＴＣＲＡ）に組み込み、その結果、ＴＣＲＡを不活化する。さらに好ましい実施形態では、不活化は、この遺伝子の定常領域（ＴＣＲα定常領域、またはＴＲＡＣと略される）の標的化切断によって実現される。一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする遺伝子をＢ２Ｍに特異的に組み込み、その結果、Ｂ２Ｍの発現を不活化する。一部の実施形態では、ＣＡＲ＋細胞は、遺伝子を下方モジュレートする操作された転写因子をさらに含む。さらなる実施形態では、転写因子は、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ−ＴＦである。一部の実施形態では、これらに限定されないが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、ＰＤ１遺伝子および／またはＣＴＬＡ４遺伝子を含めたさらなる遺伝子をモジュレートする。
一部の実施形態では、追加的な遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＣＩＳＨおよび／もしくはＣＴＬＡ４がモジュレート（ノックアウト）され、かつ／または１つもしくは複数の治療用導入遺伝子が細胞内に存在する（エピソーム、ランダムに組み込まれたものまたはヌクレアーゼ媒介性組込みなどの標的化組込みによって組み込まれたもの）。治療用導入遺伝子の性質は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の死滅活性を促進するもの、または改変Ｔ細胞自体に対する死滅切り換えとしての機能を果たすものであってよい（いわゆる「スマート」ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ （２０１７） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＤＯＩ １０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０１６０７４８５を参照されたい）。一部の実施形態では、導入遺伝子は自殺遺伝子であり、したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞の死を引き起こす遺伝子が活性化される。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、通常は抗腫瘍作用を欠く抗ウイルス薬であるガンシクロビルを、ＤＮＡ複製に干渉し、細胞アポトーシスをもたらす毒性化合物に代謝することができるチミジンキナーゼ酵素をコードするＨＳＶ−ＴＫ遺伝子；５−フルオロシトシン（抗真菌性を有する）を５−フルオロウラシルに変換するシトシンデアミナーゼ遺伝子（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子ともカップリングされる）；ＣＢ１９５４（［５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド］）を毒性化合物である４−ヒドロキシルアミンに変換するニトロレダクターゼ遺伝子；およびイホスファミドをアクロレン（ナイトロジェンマスタード）（Ｒｏｕａｎｅｔ ｅｔ ａｌ （２０１７）、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ， １８ （６）： １２３１）または誘導性カスパーゼ−９（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ （２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５： ２５４）に変換するシトクロムＰ４５０遺伝子である。さらなる実施形態では、導入遺伝子は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および／または神経毒性などの重症の副作用および／または毒性を鎮める因子をコードする（例えば、ＩＬ６を標的とするｓｃＦｖ構築物または分泌可能なＩＬ−１２構築物−例えば、第４世代「ＴＲＵＣＫ」（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， （２０１４） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２５７ （１）： ８３−９０）。
転写因子（単数または複数）および／またはヌクレアーゼ（単数または複数）は、細胞または周囲の培養培地にｍＲＮＡとして、タンパク質の形態で、および／またはヌクレアーゼ（単数または複数）をコードする核酸配列として導入することができる。ある特定の実施形態では、対象に導入される単離されたＣＡＲ＋細胞は、追加的なゲノム改変、例えば、外因性配列の組込み（切断されたＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子もしくは異なる遺伝子、例えば、セーフハーバー遺伝子もしくは遺伝子座への）ならびに／または、追加的な遺伝子、例えば１つもしくは複数のＨＬＡ遺伝子の不活化（例えば、ヌクレアーゼ媒介性）をさらに含む。一部の実施形態では、１つのＣＡＲ遺伝子をＴＣＲ遺伝子に挿入し、第２の（同一のまたは同一でない）ＣＡＲ遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子に挿入する。これらの実施形態のどちらにおいても、ＣＡＲ遺伝子は、ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物の一部であり得る。外因性配列またはタンパク質は、ベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、ＬＶ）を介して、またはエレクトロポレーションなどの技法を使用することによって導入することができる。一部の実施形態では、タンパク質を細胞に細胞スクイージングによって導入する（Ｋｏｌｌｍａｎｎｓｐｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７， １０３７２ ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０３７２を参照されたい）。一部の態様では、組成物は、単離された細胞断片および／または分化した（部分的にまたは完全に）細胞を含み得る。
一部の態様では、ＣＡＲ＋細胞を、細胞療法、例えば養子細胞移入のために使用することができる。他の実施形態では、ＣＡＲ＋細胞をＴ細胞移植に使用することができ、ＣＡＲ＋細胞は、他の目的の遺伝子改変（単数または複数）を含有し得る。一態様では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、がんマーカーに特異的なＣＡＲを含有する。別の態様では、挿入されるＣＡＲは、Ｂ細胞悪性腫瘍を含めたＢ細胞に特有のＣＤ１９マーカーに対して特異的である。ＣＡＲのＢ２Ｍ遺伝子への標的化組込みにより、患者を、ＨＬＡを適合させる必要なく処置するための治療用組成物に有用であり、したがって、それを必要とするあらゆる患者に対して「既製の」治療薬として使用することができる「普遍的な」細胞が生成される。ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物の標的化組込みにより、処置された患者の内部でＮＫ媒介性死滅を受けず、したがって、より長い期間にわたって体内で生存することができる「既製の」普遍的な細胞を創出することができる。
一部の実施形態では、ＣＡＲコード配列を標的化組込みによって挿入し、ここで、ＣＡＲドナー配列は、操作されたヌクレアーゼの切断部位を挟む配列に対する相同性を有する挟む相同アームを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲドナー配列またはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇドナー配列は、プロモーターおよび／または他の転写制御配列をさらに含む。他の実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇドナー配列は、プロモーターを欠く。さらなる実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇドナー配列は、別々の細胞外抗原結合性ドメインと細胞内シグナル伝達構成成分を、例えば、ヘテロ二量体形成小分子（ラパマイシン類似体、ＡＰ２１９６７）の存在下でのみＦＫＢＰ−ＦＲＢモジュールを通じてアセンブルすることができる切り換えを含む（Ｗｕ ｅｔ ａｌ （２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３５０ （６２５８）： ａａｂ４０７７を参照されたい）。本明細書に記載のドナー構築物はいずれも、これらに限定されないが、相同アーム（任意の長さ）；ＷＰＲＥ配列および／またはＴＣＲａエンハンサー配列を含めた追加的な配列をさらに含み得る。
別の態様では、ＣＡＲ＋またはＣＡＲ＋、改変ＨＬＡ−Ｇ＋または改変ＨＬＡ Ｅ＋、ＴＣＲまたはＢ２Ｍがモジュレート（改変）されたＴ細胞は、挿入された、抗体とカップリングしたＴ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ドナー配列をさらに含有する。一部の実施形態では、ＡＣＴＲドナー配列をＴＣＲおよび／または遺伝子に挿入して、そのＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現をヌクレアーゼ誘導性切断の後に破壊する。他の実施形態では、ドナー配列をＡＡＶＳ１遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子、アルブミン遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子などの「セーフハーバー」遺伝子座に挿入する。
本明細書に記載の改変細胞（例えば、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子が不活化された、ＣＡＲ＋Ｔ細胞もしくは幹細胞、もしくはＣＡＲ＋、改変ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞もしくは幹細胞もしくはＣＡＲ＋、ＨＬＡ−Ｇ＋Ｔ細胞もしくは幹細胞）を含む医薬組成物、または本明細書に記載のＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子結合性分子（例えば、操作された転写因子および／もしくはヌクレアーゼ）の１つもしくは複数を含む医薬組成物も提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。改変細胞、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子結合性分子（またはこれらの分子をコードするポリヌクレオチド）および／またはこれらの細胞もしくは分子を含む医薬組成物を当技術分野で公知の方法によって、例えば、静脈内注入、肝動脈などの特定の血管への注入によって、または直接組織注射（例えば、筋肉）によって対象に導入する。一部の実施形態では、対象は、組成物を用いて処置することまたは好転させることができる疾患または状態を有する成人ヒトである。他の実施形態では、対象は、小児対象であり、組成物は、疾患または状態（例えば、がん、移植片対宿主病など）を防止する、処置するまたは好転させるために投与される。
一部の態様では、組成物（ＣＡＲまたはＣＡＲおよび改変ＨＬＡ−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇを含むモジュレートされた細胞）は、抗体の抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを含み得る。一部の態様では、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を、状態を防止または処置するために武装させるのに有用である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞に関連するまたはがん関連プロセスに関連する抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ（膵臓腺癌、乳がん、結腸直腸癌）、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＡＩＸ（腎細胞癌（ＲＣＣ））、葉酸結合性抗体、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ（上皮癌、神経膠腫）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（神経膠芽腫）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２（乳がん、卵巣がん、結腸がん；骨肉腫、髄芽腫）ＥＲＢＢ３、ＦＡＰ（悪性胸膜中皮腫）、ＭＥＴ、ＭＳＬＮ（中皮腫、卵巣がん、膵臓腺癌）、Ｉｇκ、ＩＬ−１ＲＡＰ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＲＯＲ１、ＦＲ−ａ（卵巣がん）、ＧＤ２（神経芽細胞腫、黒色腫）、ＧＰＣ３（肝細胞癌）、ＩＬ−１３Ｒα２（神経膠腫）、Ｌ１−ＣＡＭ（神経芽細胞腫、黒色腫、卵巣腺癌）、ＭＵＣ１（精嚢がん）、ＣＡ１２５（上皮性卵巣がん）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＣＡ、ＣＴＡＧ１Ｂ（黒色腫および卵巣がん）、ＰＳＭＡ（前立腺がん（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ））、ＶＥＧＦＲ２、ｃ−ＭＥＴ、ＣＤ１３３（神経膠芽腫、胆管細胞癌（ＣＣＡ））、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、αＶβ３およびα５β１ インテグリン、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６Ｖ、ＣＴＬＡ４、およびエナシン（ｅｎａｓｃｉｎ）などを認識する（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ （２０１２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２： ２７８；Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ （２０１７） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ； ＤＯＩ １０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０１６０７４８５、Ｙｕ ｅｔ ａｌ （２０１７）Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １０： ７８）。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えばＨＩＶ、ＨＣＶなどの感染症に関連する抗原を認識する（例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ （２０１７） Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ． ｐｉｉ： Ｓ１９３１−５２４４ （１７） ３０２３３−５． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｔｒｓｌ．２０１７．０７．００２を参照されたい）。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、ゲノム内に組み込まれた２つまたはそれよりも多くの同一でないＣＡＲ配列を含み得る（例えば、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的）。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺと称されるＣＡＲを含み、ここで、ＦＭＣ６３は抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列であり（米国特許第９，７０１，７５８号を参照されたい）、ＣＤ８ＢＢＺは、ＣＡＲのｓｃＦｖを除く部分（ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン（ＣＤ８）、４１ＢＢ遺伝子由来の共刺激ドメイン（ＢＢ）、ＣＤ３ｚ遺伝子由来の活性化ドメイン（Ｚ））を指す。
転写因子またはヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）は、ＴＣＲＡ遺伝子またはＢ２Ｍ遺伝子内の、本明細書に示されている標的部位のいずれか（例えば、表１、配列番号１〜４に示される）の９、１０、１１、１２またはそれよりも多く（例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多く）のヌクレオチドを含む標的部位に結合し得る。ジンクフィンガータンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多くのジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーが、標的遺伝子内の標的サブサイトに特異的に接触する認識へリックスを有する。ある特定の実施形態では、例えば、表１に示されている通り、ジンクフィンガータンパク質は、４つまたは５つまたは６つのフィンガーを含む（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と称され、Ｎ末端からＣ末端へＦ１〜Ｆ４またはＦ５またはＦ６と順序づけられる）。本明細書に記載のＺＦＰは、ジンクフィンガータンパク質のリン酸接触残基に対する１つまたは複数の突然変異、例えば、米国特許仮出願第６２／３７８，９７８号および同第６２／４４３，９８１号に記載されているｎＲ−５Ｑａｂｃ突然変異体も含み得る。他の実施形態では、単一ガイドＲＮＡまたはＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合性ドメインは、本明細書に記載の標的部位（例えば、表１の配列番号１〜４のいずれかに示されている標的部位）またはこれらの標的部位のいずれか内もしくは対の標的部位の間の１２塩基対もしくはそれよりも多くの塩基対に結合し得る。本明細書に記載のヌクレアーゼ（ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡＤＮＡ結合性ドメインを含む）は、配列番号１〜４のいずれかを含むＴＣＲＡ遺伝子またはＢ２Ｍ遺伝子内に、これらの配列（配列番号１〜４）のいずれか内の改変（挿入および／もしくは欠失）ならびに／または配列番号１〜４に示される標的部位配列を挟むＴＣＲＡ遺伝子配列および／もしくはＢ２Ｍ遺伝子配列に対する改変、例えば、ＴＣＲＡ遺伝子のエクソンｃ２内のＴＴＧＡＡＡ内の改変を含めた遺伝子改変を生じさせることができる。
本明細書に記載のタンパク質はいずれも、切断ドメインおよび／または切断ハーフドメイン（例えば、野生型または操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）をさらに含み得る。したがって、本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼハーフドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）を含み得る。他の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、操作されたヌクレアーゼドメインまたはハーフドメイン、例えば、偏性ヘテロ二量体を形成する操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヌクレアーゼの１つまたは複数のＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインは、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号に記載のリン酸接触突然変異体（例えば、Ｒ４１６Ｓおよび／またはＫ５２５Ｓ）も含み得る。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質、融合分子および／またはその構成成分（例えば、ｓｇＲＮＡまたは他のＤＮＡ結合性ドメイン）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）の一部であってもよく、ｍＲＮＡの形態であってもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチドはいずれも、標的遺伝子（例えば、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、チェックポイントおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子）への標的化挿入のための配列（ドナー、相同アームまたはパッチ配列）も含み得る。さらに別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）または組込みコンピテントもしくは組込み欠損レンチウイルスベクターを含めたレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。したがって、標的遺伝子への標的化組込みのためのヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ）および／またはヌクレアーゼ系（ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓもしくはＴｔａｇｏ）および／またはドナー配列をコードする配列を含むウイルスベクターも本明細書に提供される。一部の実施形態では、ドナー配列およびヌクレアーゼをコードする配列は、異なるベクター上にある。他の実施形態では、ヌクレアーゼをポリペプチドとして供給する。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾されていてよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４−１５７を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい）。一部の態様では、ｍＲＮＡは、酵素的改変によって導入されたキャップを含み得る。酵素的に導入されたキャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含み得る（例えば、Ｓｍｉｅｔａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ， （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５： ３００４を参照されたい）。別の態様では、ｍＲＮＡに化学修飾によってキャップ形成することができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていないヌクレオチドと修飾されたヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許出願公開第２０１２−０１９５９３６号を参照されたい）。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＷＰＲＥエレメントを含み得る（米国特許出願公開第２０１６０３２６５４８号を参照されたい）。一部の実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは、１つまたは複数の突然変異を含み得る（米国特許第７，４１９，８２９号を参照されたい）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、二本鎖である（例えば、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３９：ｅ１４２を参照されたい）。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む単離された細胞を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、幹／前駆細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）からなる群から選択される。さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む細胞または株、すなわち、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍが１つもしくは複数のＺＦＮによって不活化された細胞、ならびに／またはドナーポリヌクレオチド（例えば、ＡＣＴＲおよび／またはＣＡＲ）が細胞のゲノム内に安定に組み込まれた細胞に由来する（例えば、培養下）細胞または細胞株に由来する、ＣＡＲ＋細胞もしくは細胞株またはＣＡＲ＋、改変ＨＬＡ−Ｅ＋および／もしくはＨＬＡ−Ｇ＋細胞もしくは細胞株を提供する。したがって、本明細書に記載の細胞の後裔は、それ自体は本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含まないが、これらの細胞では、ＴＣＲおよび／もしくはＢ２Ｍ遺伝子が不活化されており、かつ／またはドナーポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれ、かつ／もしくは発現されている。
別の態様では、本明細書に記載の細胞に１つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することにより、細胞（例えば、Ｔ細胞）において少なくとも１つのＴＣＲ遺伝子を不活化し、細胞における外因性ＣＡＲの発現をもたらす方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法のいずれかでは、ヌクレアーゼにより、標的化突然変異誘発、細胞内ＤＮＡ配列の欠失を誘導することができ、かつ／または所定の染色体の遺伝子座における標的化組換えを容易にすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼにより、標的遺伝子から１つまたは複数のヌクレオチドが欠失し、かつ／または標的遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入される。一部の実施形態では、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子が、ヌクレアーゼ切断、その後の非相同末端結合によって不活化される。他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列を、例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ（または前記ヌクレアーゼをコードするベクター）を使用して置き換え、ヌクレアーゼによる標的化切断後に「ドナー」配列（例えば、ＣＡＲ）が遺伝子に挿入される。ドナー配列は、ヌクレアーゼベクター内に存在してもよく、別々のベクター（例えば、ＡＡＶ、ＡｄまたはＬＶベクター）内に存在してもよく、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することもできる。本明細書に記載の方法のいずれかでは、ヌクレアーゼ（単数または複数）とドナーを同時投与することもでき、任意の順序で逐次的に投与することもできる。ヌクレアーゼ（単数または複数）および／または１つまたは複数のドナーの投与を繰り返すことができ、例えば、１つもしくは複数のドナー（例えば、１つもしくは複数のＣＡＲ）を、単回のヌクレアーゼ（異なる遺伝子を標的とする１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多くのヌクレアーゼ）の投与の前に、それと一緒に、および／もしくはその後に投与することができる；１つもしくは複数のドナーを、単回ヌクレアーゼ投与の前に、それと一緒に、および／もしくはその後に繰り返し投与することができる；または、１つもしくは複数のドナーを、ヌクレアーゼの繰り返し投与の前に、それと一緒に、および／もしくはその後に繰り返し投与することができる。ある特定の実施形態では、単一編集ステップの方法においてＴＲＡＣ、ＣＩＳＨおよび／またはＢ２Ｍに特異的なヌクレアーゼと１つまたは複数のＣＡＲドナーを同時投与して、多重ノックアウトＣＡＲ発現細胞をもたらす。一部の実施形態では、方法は、１つもしくは複数の追加的な遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＰＤ１もしくはＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイント）の不活化、ならびに／または、これらに限定されないが、１つもしくは複数の導入遺伝子の不活化されたＴＣＲ（および必要に応じてＢ２Ｍ遺伝子などの追加的な遺伝子）への組込みおよび／もしくは１つもしくは複数のセーフハーバー遺伝子への組込みを含めた、１つもしくは複数の導入遺伝子の細胞のゲノムへの組込みをさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法の結果、細胞の少なくとも９０〜１００％（またはその間の任意の値）を含めた少なくとも８０〜１００％（またはその間の任意の値）がノックアウト（単数または複数）および／または組み込まれた導入遺伝子（単数または複数）を含む細胞の集団が生じる。
さらに、本明細書に記載の方法はいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態では、例えば、Ｔ細胞を改変するため、それらのＴ細胞を、対象（例えば、がんを有する対象）を処置するために自己または同種間の状況で治療薬として有用なものにするために、方法をｅｘ ｖｉｖｏで実施する。処置および／または防止することができるがんの非限定的な例としては、肺癌、膵がん、肝がん、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、白血病、卵巣がん、リンパ腫、脳がんなどが挙げられる。
別の態様では、単離された細胞のゲノムに１つまたは複数の導入遺伝子を組み込む方法であって、細胞に、（ａ）１つまたは複数の導入遺伝子を含む１つまたは複数のドナーベクター（例えば、ＡＡＶ、プラスミド、Ａｄ、ｍＲＮＡなど）および（ｂ）少なくとも１つのｍＲＮＡ形態の天然に存在しないヌクレアーゼを導入するステップを含み、少なくとも１つのヌクレアーゼにより、細胞のゲノムが切断され、その結果、１つまたは複数の導入遺伝子が細胞のゲノムに（例えば、１つもしくは複数のＣＡＲ遺伝子（単数または複数）またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物もしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物がＴＣＲまたはＨＬＡ受容体に）組み込まれ、ドナーベクターを、ヌクレアーゼの細胞へのエレクトロポレーションの直前また直後に、単離された細胞およびｍＲＮＡを含むエレクトロポレーション緩衝剤に導入する方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ドナーベクターを、エレクトロポレーション後、細胞を培養培地に移す前に、エレクトロポレーション緩衝剤に導入する。例えば、米国特許出願公開第２０１５０１７４１６９号および同第２０１５０１１０７６２号を参照されたい。当該方法を使用して、ＣＡＲ導入遺伝子（単数または複数）またはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物もしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物を、これらに限定されないが、ＴＣＲ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子および／またはセーフハーバー遺伝子を含めた任意のゲノムの位置に導入する。
図１は、ゲノムバージョンの遺伝子におけるイントロンおよびエクソンの組織化を示すＨＰＲＴ遺伝子およびイントロン１に挿入するためのＣＤ１９を発現する導入遺伝子の設計の描写である。導入遺伝子ドナー構築物は、ＣＤ１９導入遺伝子を挟み、また、スプライスアクセプター（ＳＡ）も有し、したがって、転写物が成熟化すると、ＨＰＲＴのエクソン１がＣＤ１９遺伝子と連結する。この構築物は、ＨＰＲＴのエクソン１とＣＤ１９の間に２Ａ自己切断性部位も含む。ＣＤ１９コード配列の最後にポリＡ配列も存在する。転写され成熟すると、構築物により、ＣＤ１９コード配列のみの最終的な翻訳がもたらされる。挿入されるＣＤ１９導入遺伝子カセットを含む細胞はＨＰＲＴ遺伝子を発現せず、したがって、６−チオグアニン（「６−ＴＧ」）に対して抵抗性であり、これにより、６−ＴＧの存在下で、カセットが挿入された細胞のみを選択することが可能になる。
図２Ａおよび２Ｂは、図１に示されているＣＤ１９発現カセットをトランスフェクトしたＫ５６２細胞におけるＣＤ１９の発現を示すグラフである。ＣＤ１９発現を評価するために、細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲートした、ヒトＣＤ１９細胞外ドメインを標的とする抗体を用いて染色した。陰性対照として、改変されていない（「ナイーブな」）Ｋ５６２細胞を同様に処理し、染色した（図２Ａ）。図２Ｂは、６−ＴＧ選択後のトランスフェクトされたＫ５６２細胞を示し、ほぼ全ての細胞（９８．３％）がＣＤ１９発現について陽性であったことを示す。
図３Ａ〜３Ｃは、Ｔ細胞の標的細胞に対する影響を分析するために使用したＦＡＣＳアッセイからの結果を示すグラフである。ＣＤ１９＋Ｋ５６２（図２に示されている）を改変されていない正常なＫ５６２細胞と１：１の比で混合した。細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）増殖色素を使用して標識し、次いで、Ｔ細胞と共培養した。細胞を３時間共培養し、洗浄し、ＣＤ１９抗体で染色し、次いで、ＣＤ１９＋Ｋ５６２のパーセントをＦＡＣＳによって評価した。Ｔ細胞の不在下では、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）陽性集団（すなわち、ＣＤ１９＋Ｋ５６２）と正常な（ＣＤ１９−）Ｋ５６２は予測通りおよそ５０％：５０％の比を示した（図３Ａ）。ＣＤ１９−ＣＡＲドナーを伴わずにＴＣＲＡ特異的ＺＦＮによって編集したか（図３Ｃ、「対照−ＴＲＡＣ＋標的」）、または処理しなかった（図３Ｂ、「対照−標的＋ＵＴ」）Ｔ細胞と共培養した場合、Ｋ５６２細胞傷害性は観察されなかった。
図４Ａおよび４Ｂは、様々なエフェクター細胞と標的細胞（「Ｅ：Ｔ」比）にわたる、ＣＤ１９抗原を含む細胞の有効な死滅を示す一連のパネルである。前と同様に、標的細胞はＣＤ１９を有するＫ５６２細胞とナイーブなＫ５６２細胞の５０：５０混合物である。図４Ａは、ＣＤ１９−ＣＡＲがＢ２Ｍ遺伝子に組み込まれたＴ細胞を使用した結果を示し、図４Ｂは、ＣＤ１９−ＣＡＲをＴＣＲＡ遺伝子に組み込んだ場合の結果を示す。どちらのデータセットについても、左端のパネルは、標的細胞と比較して２倍量のＴ細胞が存在するＥ：Ｔ比２：１を示し、右端のパネルは、Ｅ：Ｔ比０．１２５：１からの結果を示し、真ん中のパネルは、これら２つの中間のＥ：Ｔ比からの結果を示す。データから、ナイーブな（ＣＤ１９−）Ｋ５６２細胞はＣＤ１９−ＣＡＲを有するＴ細胞によって死滅しないが、ＣＤ１９抗原を有するＫ５６２細胞の死滅は使用するエフェクター細胞の量と相関することが実証される。 図４Ａおよび４Ｂは、様々なエフェクター細胞と標的細胞（「Ｅ：Ｔ」比）にわたる、ＣＤ１９抗原を含む細胞の有効な死滅を示す一連のパネルである。前と同様に、標的細胞はＣＤ１９を有するＫ５６２細胞とナイーブなＫ５６２細胞の５０：５０混合物である。図４Ａは、ＣＤ１９−ＣＡＲがＢ２Ｍ遺伝子に組み込まれたＴ細胞を使用した結果を示し、図４Ｂは、ＣＤ１９−ＣＡＲをＴＣＲＡ遺伝子に組み込んだ場合の結果を示す。どちらのデータセットについても、左端のパネルは、標的細胞と比較して２倍量のＴ細胞が存在するＥ：Ｔ比２：１を示し、右端のパネルは、Ｅ：Ｔ比０．１２５：１からの結果を示し、真ん中のパネルは、これら２つの中間のＥ：Ｔ比からの結果を示す。データから、ナイーブな（ＣＤ１９−）Ｋ５６２細胞はＣＤ１９−ＣＡＲを有するＴ細胞によって死滅しないが、ＣＤ１９抗原を有するＫ５６２細胞の死滅は使用するエフェクター細胞の量と相関することが実証される。
図５は、エフェクター：標的細胞比に応じたＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞のパーセント死滅を示すグラフである。ＴＣＲＡ遺伝子またはＢ２Ｍ遺伝子のいずれかに組み込まれたＣＤ１９−ＣＡＲを含むＴ細胞についての結果がグラフに示されている。データから、いずれの遺伝子への組込みによっても有効なＣＡＲ機能およびＴ細胞活性化がもたらされることが実証される。
図６Ａ〜６Ｆは、細胞表面マーカーまたはＣＤ１９−ＣＡＲの発現のＦＡＣＳ解析を示すプロットである。図６Ａおよび６Ｂは、ＺＦＮ処理していない細胞（図６Ａ）またはＣＤ１９−ＣＡＲドナー処理していない細胞（図６Ｂ）のスキャンを示す。図６Ｃおよび６Ｄは、細胞を、Ｂ２ＭおよびＴＣＲＡを対象とするヌクレアーゼを用いて処理したが、ＣＡＲドナーでは処理しなかった場合の結果を示す。図６Ｃは、ヌクレアーゼによる切断後の結果を示し、細胞の８０％が２重ノックアウト表現型を示すことが実証される。図６Ｅおよび６Ｆは、細胞をヌクレアーゼおよびＴＲＡＣ相同アームを含むＣＤ１９−ＣＡＲドナーの両方で処理した場合の結果を示す。図６Ｆは、細胞の６３．４％がＣＤ１９−ＣＡＲを発現することを示す。
図７は、ＴＲＡＣのヌクレアーゼ媒介性不活化（ノックアウト）後の細胞の遺伝子型および表現型を示すグラフである。示されている通り、細胞の９５％よりも多くが遺伝子型および表現型の不活化を示す。
図８Ａおよび８Ｂは、無処理の細胞（図８Ａ）と比較した、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼで処理したＴ細胞における表面ＣＤ３受容体発現のＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである（図８Ｂ）。示されている通り、無処理の細胞では０．２％が表面ＴＣＲを発現しなかったのと比較して、ヌクレアーゼで処理した細胞の少なくとも９９．５％が表面ＴＣＲを発現しなかった。
図９Ａ〜図９Ｃは、ＴＲＡＣ（図９Ｂ）またはＢ２Ｍ（図９Ｃ）を標的とするヌクレアーゼで処理したＴ細胞における導入遺伝子発現（ＧＦＰ）のＦＡＣＳ解析を示すグラフである。ドナー導入遺伝子を欠くが、ＴＲＡＣ特異的試薬およびＢ２Ｍ特異的試薬の両方で処理した細胞も示されている（図９Ｃ）。示されている通り、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼで処理した細胞の少なくとも９３％で導入遺伝子が発現され、これにより、ＴＲＡＣへの効率的なヌクレアーゼ媒介性組込みが示される。同様に、Ｂ２Ｍ特異的ヌクレアーゼで処理した細胞の少なくとも９０％で導入遺伝子が発現され、これにより、Ｂ２Ｍへの効率的なヌクレアーゼ媒介性組込みが示される。
図１０Ａ〜１０Ｃは、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼ（図１０Ａ）およびＢ２Ｍ−ヌクレアーゼ（図１０Ｂ）ならびにＣＡＲドナー（図１０Ｃ）を用いて処理した健康なドナーＴ細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す、細胞のＦＡＣＳ解析を示す。図１０Ａは、２重ノックアウト、ＣＡＲ導入遺伝子細胞の９４％よりも多くがＣＤ３陰性であった（ＴＲＡＣノックアウトであった）ことを示し、図１０Ｂは、処理した細胞の８８％よりも多くがＨＬＡ陰性であった（Ｂ２Ｍノックアウトであった）ことを示し、図１０Ｃは、２重ノックアウト細胞（ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ）の７６％よりも多くがＣＡＲドナーを発現したことを示す。
図１１は、多重化（多数のノックアウトおよび／または多数の標的化組込み）実験の結果を示すグラフである。この実験では、Ｔ細胞をＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ試薬およびＢ２Ｍ特異的ＺＦＮ試薬で処理し、また、ＺＦＮおよび２つのＡＡＶドナー構築物：ＴＲＡＣ相同アームを含むＧＦＰドナーおよびＢ２Ｍ相同アームを含むＣＤ１９ ＣＡＲドナーでも処理した。データから、どちらのＺＦＮ対もそれらの標的を＞９０％の効率で切断したこと、ならびに、ドナーが、ＧＦＰドナーについては９０％およびＣＤ１９ ＣＡＲドナーについては７７％で組み込まれたことが示される。両方のＺＦＮ対および両方のドナー構築物で処理した細胞については、細胞の６２％よりも多くが４つの編集全てを含んだ（ＴＣＲ ｋ／ｏ、Ｂ２Ｍ ｋ／ｏ、ＧＦＰ＋およびＣＤ１９ ＣＡＲ＋０）。
図１２Ａおよび１２Ｂは、マルチプレックス遺伝子編集を受けた細胞における導入遺伝子ドナーの組込みの結果を示すグラフである。図１２Ａでは、Ｔ細胞をＺＦＮで処理してＢ２Ｍ、ＴＲＡＣおよびＣＩＳＨを特異的にノックアウトした一方、ＧＦＰを発現する導入遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子座への組込みの結果であり、図１２Ｂは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する導入遺伝子を用いて同様に処理したＴ細胞の仮定上の結果を示す。
図１３は、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソンｃ３（配列番号６２）内の「Ｄ」挿入部位におけるＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合導入遺伝子の組込みの部位を示す図である（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７１０６５２８を参照されたい）。ドナー構築物は、ＴＲＡＣ−ＺＦＮ切断部位を挟む配列に対する相同性を有する右側の相同アーム（Ｒ−ＨＡ）および左側の相同アーム（Ｌ−ＨＡ）を含む。融合導入遺伝子の発現はＰＧＫプロモーターによって駆動され、ドナーは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列も含む。
図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合導入遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子への挿入を示すプロットである。図１４Ａは、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ対ＳＢＳ＃６８８７７／ＳＢＳ＃６８８７６を用いた切断の結果を示し、ＴＣＲのＣＤ３サブユニットの存在または非存在によって測定して、ＴＲＡＣ遺伝子が９７％の頻度でノックアウトされたことが実証される（左側のパネル）。同様に、Ｂ２Ｍは、ＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１ ＺＦＮ対により、細胞表面上のＨＬＡ複合体の喪失によって測定して、８１％の頻度でノックアウトされた（右側のパネル）。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ＨＬＡ−ＧおよびＢ２Ｍの両方についての細胞内（図１４Ｂ）および表面（図１４Ｃ）染色を示す（それぞれ左側のパネルおよび右側のパネル）。示されている通り、ＨＬＡ−Ｇは細胞内で高レベルに発現し、ＨＬＡ−Ｂ２Ｍ構築物から発現されたＢ２Ｍは細胞内および細胞の表面上の両方で検出された。 図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合導入遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子への挿入を示すプロットである。図１４Ａは、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ対ＳＢＳ＃６８８７７／ＳＢＳ＃６８８７６を用いた切断の結果を示し、ＴＣＲのＣＤ３サブユニットの存在または非存在によって測定して、ＴＲＡＣ遺伝子が９７％の頻度でノックアウトされたことが実証される（左側のパネル）。同様に、Ｂ２Ｍは、ＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１ ＺＦＮ対により、細胞表面上のＨＬＡ複合体の喪失によって測定して、８１％の頻度でノックアウトされた（右側のパネル）。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ＨＬＡ−ＧおよびＢ２Ｍの両方についての細胞内（図１４Ｂ）および表面（図１４Ｃ）染色を示す（それぞれ左側のパネルおよび右側のパネル）。示されている通り、ＨＬＡ−Ｇは細胞内で高レベルに発現し、ＨＬＡ−Ｂ２Ｍ構築物から発現されたＢ２Ｍは細胞内および細胞の表面上の両方で検出された。
図１５Ａおよび１５Ｂは、示されているＢ２Ｍドナー構築物（ＧＦＰ導入遺伝子）およびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを用いて処理したＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞のＦＡＣＳ解析およびＭｉｓＳｅｑ解析を示す図である。図１５Ａは、ＦＡＣＳ解析を示す；左端のパネルは、ドナーのみ（ヌクレアーゼなし）を示す；左から２番目のパネルは、長い相同アーム（それぞれ約１Ｋｂ）を含み、次世代シーケンシングによって標的化組込み効率を評価するための分子タグ（すなわち、「Ｍｉｓｅｑタグ」）およびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを含まない、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるＧＦＰドナー構築物で処理した細胞を示す；中央のパネルは、短い相同アーム（各アームが２５０ｂｐ）を含み、ＭｉｓｅｑタグおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを含まない、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるＧＦＰドナー構築物で処理した細胞を示す；右から２番目のパネルは、短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を含むドナー構築物で処理した細胞を示す；右端のパネルは、短い相同アームおよびＴＣＲａエンハンサー配列を含むドナー構築物で処理した細胞を示す。図１５Ｂは、１５ＡからのＭｉＳｅｑ分子解析の結果およびフローサイトメトリー発現結果の数量化を示す。 図１５Ａおよび１５Ｂは、示されているＢ２Ｍドナー構築物（ＧＦＰ導入遺伝子）およびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを用いて処理したＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞のＦＡＣＳ解析およびＭｉｓＳｅｑ解析を示す図である。図１５Ａは、ＦＡＣＳ解析を示す；左端のパネルは、ドナーのみ（ヌクレアーゼなし）を示す；左から２番目のパネルは、長い相同アーム（それぞれ約１Ｋｂ）を含み、次世代シーケンシングによって標的化組込み効率を評価するための分子タグ（すなわち、「Ｍｉｓｅｑタグ」）およびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを含まない、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるＧＦＰドナー構築物で処理した細胞を示す；中央のパネルは、短い相同アーム（各アームが２５０ｂｐ）を含み、ＭｉｓｅｑタグおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼを含まない、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるＧＦＰドナー構築物で処理した細胞を示す；右から２番目のパネルは、短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を含むドナー構築物で処理した細胞を示す；右端のパネルは、短い相同アームおよびＴＣＲａエンハンサー配列を含むドナー構築物で処理した細胞を示す。図１５Ｂは、１５ＡからのＭｉＳｅｑ分子解析の結果およびフローサイトメトリー発現結果の数量化を示す。
図１６は、プロモーター配列、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇなど）を挟む相同アーム（例えば、ＴＲＡＣまたはＢ２Ｍに対する）を含む導入遺伝子送達のための例示的なドナーを示す概略図である。含めることができる追加的な構成成分は、エンハンサー配列、ＷＰＲＥ配列、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ、ポリＡ配列などである。
図１７は、示されているＺＦＮおよび／またはドナーのトランスフェクション後のＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ標的遺伝子におけるインデルおよび標的化組込みのＭｉＳｅｑ分子解析の結果を示す表である。試料「０１＿Ｍｏｃｋ」（「１」）は、ニセトランスフェクションを指す；試料「０２＿ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ」（「２」）は、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮのみをトランスフェクトした細胞を指す；試料３「０３＿ｓｉｔｅ＿Ｅ＿４２３＿４９３＿ｈｐＧＫ＿ＧＦＰ−Ｍｉｓｅｑ」（「３」）は、ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。ドナーは、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＴＩのｍｉｓｅｑによる定量化を可能にする「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。試料３では、このドナーを単独で、ＺＦＮを伴わずに添加した。試料「０４ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿４２３＿４９３＿ｈｐＧＫ＿ＧＦＰ−Ｍｉｓｅｑ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびに試料４由来のドナーを含有する。試料「０５ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿ＡＡＶ＿ｈｐＧＫ＿ＧＦＰ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを有するドナーを含有する。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」を含有しない。試料「０６ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿３５０−３９３＿ｈｐＧＫ＿ＧＦＰ−ＷＰＲＥ−Ｍｉｓｅｑ」は、ＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３５０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム、ならびにその後に突然変異ＷＰＲＥエレメントを含有するドナーを含有する試料３由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。試料「０７ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿４２３−３９３＿ｈｐＧＫ＿ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ−Ｍｉｓｅｑ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナーを含有する。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。試料「０８ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿４２３−３９３＿ｈｐＧＫ＿ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ−Ｍｉｓｅｑ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー、ならびにその後に突然変異ＷＰＲＥエレメントを含有する。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。試料「０９ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿３５０−３９３＿ｈｐＧＫ＿ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ−ＷＰＲＥｍ−Ｍｉｓｅｑ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびにＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナーを含有する。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。試料「１０ ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ ｓｉｔｅ＿Ｅ＿３５０−３９３＿ｈｐＧＫ＿ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ−ＷＰＲＥｍ−Ｍｉｓｅｑ」は、試料３由来のＺＦＮ、ならびにＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナーを含有する。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。
図１８Ａ〜１８Ｄは、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼで処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込み（２重ノックアウトの代わりとして「ＤＫＯ」と称される）ならびにドナーへの標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示す。図１８Ａは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；長い相同アームを含むＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料５）（中央のパネル）；ならびに短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を有するＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料６）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｂは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料７）（中央のパネル）；およびＷＰＲＥ配列を含む短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料８）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｃは、ＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｅドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料９）（上のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｇドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料１０）（下のパネル）における発現結果を示す。図１８Ｄは、ニセトランスフェクション後（図１７、上のパネルの試料１）；ドナーを有さないＤＫＯ細胞（図１７の試料２）（中央のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇドナーを有するＤＫＯ細胞（図１７の左２つのパネルの試料９または右２つのパネルの試料１０）（下のパネル）の結果を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼで処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込み（２重ノックアウトの代わりとして「ＤＫＯ」と称される）ならびにドナーへの標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示す。図１８Ａは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；長い相同アームを含むＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料５）（中央のパネル）；ならびに短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を有するＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料６）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｂは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料７）（中央のパネル）；およびＷＰＲＥ配列を含む短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料８）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｃは、ＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｅドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料９）（上のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｇドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料１０）（下のパネル）における発現結果を示す。図１８Ｄは、ニセトランスフェクション後（図１７、上のパネルの試料１）；ドナーを有さないＤＫＯ細胞（図１７の試料２）（中央のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇドナーを有するＤＫＯ細胞（図１７の左２つのパネルの試料９または右２つのパネルの試料１０）（下のパネル）の結果を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼで処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込み（２重ノックアウトの代わりとして「ＤＫＯ」と称される）ならびにドナーへの標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示す。図１８Ａは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；長い相同アームを含むＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料５）（中央のパネル）；ならびに短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を有するＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料６）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｂは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料７）（中央のパネル）；およびＷＰＲＥ配列を含む短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料８）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｃは、ＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｅドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料９）（上のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｇドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料１０）（下のパネル）における発現結果を示す。図１８Ｄは、ニセトランスフェクション後（図１７、上のパネルの試料１）；ドナーを有さないＤＫＯ細胞（図１７の試料２）（中央のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇドナーを有するＤＫＯ細胞（図１７の左２つのパネルの試料９または右２つのパネルの試料１０）（下のパネル）の結果を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、ＴＲＡＣを標的とするヌクレアーゼおよびＢ２Ｍを標的とするヌクレアーゼで処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込み（２重ノックアウトの代わりとして「ＤＫＯ」と称される）ならびにドナーへの標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示す。図１８Ａは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；長い相同アームを含むＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料５）（中央のパネル）；ならびに短い相同アームおよびＷＰＲＥ配列を有するＧＦＰドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料６）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｂは、ニセトランスフェクション後（上のパネル）；短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料７）（中央のパネル）；およびＷＰＲＥ配列を含む短い相同アームを有するＣＡＲドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料８）（下のパネル）の発現結果を示す。図１８Ｃは、ＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｅドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料９）（上のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−Ｇドナーを使用した標的化組込みを伴うＤＫＯ細胞（図１７の試料１０）（下のパネル）における発現結果を示す。図１８Ｄは、ニセトランスフェクション後（図１７、上のパネルの試料１）；ドナーを有さないＤＫＯ細胞（図１７の試料２）（中央のパネル）；ならびにＣＡＲおよびＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇドナーを有するＤＫＯ細胞（図１７の左２つのパネルの試料９または右２つのパネルの試料１０）（下のパネル）の結果を示す。
図１９は、示されているＺＦＮおよび／またはドナーのトランスフェクション後のインデルのＭｉＳｅｑ分子解析の結果を示す。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞では２重ノックアウト（ＤＫＯと称される）が創出される。試料「０１＿Ｍｏｃｋ」（「１」）は、ニセトランスフェクションを指す；試料「０２＿ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ」（「２」）は、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮのみをトランスフェクトした細胞を指す；試料３「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｇ ｏｎｌｙ」（「３」）は、ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料４「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０１ ｏｎｌｙ」（「４」）は、ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料５「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０３ ｏｎｌｙ」（「５」）は、ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０３導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料６「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｇ」（「６」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料７「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿Ｂ２Ｍ＿Ｇ４Ｓ＿２＿ｎｏＳＰ＿ＨＬＡ＿Ｇ」（「７」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、２コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない。試料８「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿Ｂ２Ｍ＿Ｇ４Ｓ＿２＿ｎｏＳＰ＿ＨＬＡ＿Ｇ」（「８」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない。試料９「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿Ｂ２Ｍ＿Ｇ４Ｓ＿２＿ｎｏＳＰ＿ＨＬＡ＿Ｇ」（「９」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、６コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない。試料１０「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０１」（「１０」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料１１「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０１」（「１１」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０３導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料１２「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿Ｂ２Ｍ＿ｎｏＳＰ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０１」（「１２」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ０１０１の間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｅ０１０１は、シグナルペプチドを含有しない。試料１３「＿ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｈＰＧＫ＿Ｂ２Ｍ ｎｏＳＰ＿ＨＬＡ＿Ｅ０１０３」（「１３」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ０１０１の間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｅ０１０３は、シグナルペプチドを含有しない。試料１４「ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿１０００＿９９２＿ｐｇｋ＿ｇｆｐ」（「１４」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。試料１５「ｐＡＡＶ＿ＴＲＡＣ＿Ｅ＿３５０＿３９３＿ｈＰＧＫ＿ＣＡＲ＿Ｂ２Ｍ＿ＨＬＡ＿Ｇ＿ＷＰＲＥｍ＿Ｍｉｓｅｑ」（「１５」）は、試料２由来のＺＦＮ、ならびにＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナーをトランスフェクトした細胞を指す。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは、「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。
図２０は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ニセトランスフェクション後のＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＧＦＰの発現を示す（図１９の試料１）；中央のパネルは、ＤＫＯ細胞およびドナーなしにおける同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料２）；下のパネルは、およびＧＦＰドナーでも処理したＤＫＯ細胞における発現を示す（図１９の試料１４）。
図２１は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ニセトランスフェクション後の示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ）の発現を示す（図１９の試料１）；中央のパネルは、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ ＤＫＯ細胞およびドナーなしにおける同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料２）；下のパネルは、ＨＬＡ−Ｇドナーのみで処理した細胞における発現を示す（図１９の試料３）。
図２２は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ＨＬＡ−ＧドナーのＤＫＯ細胞へのトランスフェクション後の示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ）の発現を示す（図１９の試料６）；上から２番目のパネルは、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を含むドナーのＤＫＯ細胞へのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料７）；下から２番目のパネルは、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を含むドナーのＤＫＯ細胞へのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料８）；および下のパネルは、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を含むドナーのＤＫＯ細胞へのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料９）。
図２３は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ニセトランスフェクションを示す（ドナーなしまたはＺＦＮ、図１９の試料１）；上から２番目のパネルは、ＤＫＯ細胞における示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅ）の発現を示す（図１９の試料２）；下から２番目のパネルは、ＨＬＡ−Ｅドナーのみのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料４）；下のパネルは、ＨＬＡドナーのみのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料５）。
図２４は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ＨＬＡ−Ｅ０１０１ドナー構築物を有するＤＫＯ細胞における示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅ）の発現を示す（図１９の試料１０）；上から２番目のパネルは、ＨＬＡ−Ｅ０１０３ドナー構築物を有するＤＫＯ細胞における示されているタンパク質の発現を示す（図１９の試料１１）；下から２番目のパネルは、ＤＫＯ細胞におけるＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅドナーのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料１２）；下のパネルは、ＤＫＯ細胞におけるＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅドナーのトランスフェクション後の同じタンパク質の発現を示す（図１９の試料１３）。
図２５は、示されている通り処理した健康なドナーＴ細胞への標的化組込みに関するＦＡＣＳ解析の結果を示す。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ ＺＦＮで処理した細胞は「ＤＫＯ」と称される（２重ノックアウトの代わりとして）。上のパネルは、ニセトランスフェクション後の示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、およびプロテインＬ＝ＣＡＲ）の発現を示す（図１９の試料１）；中央のパネルは、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ ＤＫＯ細胞（図１９の試料２）およびドナーなしにおける同じタンパク質の発現を示す；下のパネルは、ＣＡＲ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇドナーで処理したＤＫＯ細胞における発現を示す（図１９の試料１５）。
図２６は、ＣＡＲ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡＧドナーを有するＤＫＯ細胞における細胞表面上（ＥＣＳと表示されている上のパネル）および細胞内（ＩＣＳと表示されている下のパネル）の示されているタンパク質（ＣＤ３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇ）の発現を評価するＦＡＣＳ解析の結果を示す（図１９の試料１５）。
詳細な説明
１つまたは複数のＣＡＲ、またはＣＡＲおよび改変ＨＬＡ−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇの発現が、ＣＡＲが標的とする抗原を発現する細胞の死滅において有効であるＴ細胞を生成するための組成物および方法が本明細書に開示される。さらに、死滅は、ＣＡＲまたはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｅ発現構築物もしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ発現構築物がＴＣＲ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子に組み込まれた場合に有効である。このように改変された細胞は、ＣＡＲがＴＣＲ遺伝子に組み込まれた結果としてＴＣＲ複合体が欠如することにより、これらのＴ細胞が他の非抗原担持細胞を標的とすることが妨げられると同時に、ＣＡＲがＢ２Ｍに組み込まれることによるＨＬＡ複合体のノックアウトにより、導入された武装されたＴ細胞に対するＨＬＡに基づく免疫応答が排除されるまたは低減するので、例えば養子細胞療法において治療薬として使用することができる。改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現するようにさらに改変された細胞はまた、宿主ＮＫ細胞による死滅も逃れることができる。さらに、他の目的の遺伝子を、ＣＡＲおよび必要に応じて改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇを担持する細胞に挿入することができ、かつ／または他の目的の遺伝子をノックアウトすることができる。
一般
本明細書に開示されている方法の実施、ならびに組成物の調製および使用には、別段の指定のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、コンピュータ化学、細胞培養物、組換えＤＮＡおよび当技術分野の技術の範囲内に入る関連する分野の従来の技法を使用する。これらの技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ， ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ３０４， ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ” （Ｐ．Ｍ． Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． １１９， ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， １９９９を参照されたい。
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションであり、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的に関しては、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定とは解釈されるべきでない。当該用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。当該用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合性の相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限りは、結合相互作用の構成成分の全てが配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性の増大は低Ｋｄと相関する。「非特異的な結合」は、任意の目的の分子（例えば、操作されたヌクレアーゼ）と巨大分子（例えば、ＤＮＡ）との間に生じる標的配列に依存しない非共有結合性の相互作用を指す。
「ＤＮＡ結合性分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。そのようなＤＮＡ結合性分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性分子はヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）であり、他の実施形態では、ＤＮＡ結合性分子はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）のガイドＲＮＡ構成成分である。
「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合により結合することが可能なタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合性タンパク質の場合では、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性タンパク質は、１つよりも多くの型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または結合性ドメイン）は、亜鉛イオンの協調によって構造が安定化される結合性ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを通じてＤＮＡに配列特異的に結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語は、１つのＺＦＮならびに二量体を形成して標的遺伝子を切断するＺＦＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、それぞれがリピート可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を含み、ＴＡＬＥのその同類標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、一般には３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。ＴＡＬＥタンパク質は、リピート単位内の標準的または非標準的ＲＶＤを使用して標的部位に結合するように設計することができる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照されたい。「ＴＡＬＥＮ」という用語は、二量体を形成して標的遺伝子を切断する１つのＴＡＬＥＮならびにＴＡＬＥＮの対（対のメンバーは「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作すること（１つもしくは複数のアミノ酸を変更すること）により、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（リピート可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）もしくはＲＶＤ領域）を操作することにより、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。したがって、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、設計／組成が合理的基準に主に起因する天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計（標準的および非標準的ＲＶＤ）および結合データに関する情報が保存されているデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第９，４５８，２０５号；同第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に見いだされず、その産生はファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的プロセスに主に起因する。例えば、Ｕ．Ｓ．５，７８９，５３８；Ｕ．Ｓ．５，９２５，５２３；Ｕ．Ｓ．６，００７，９８８；Ｕ．Ｓ．６，０１３，４５３；Ｕ．Ｓ．６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。さらに、ＴＡＬＥタンパク質（一般には標的部位に結合するＲＶＤとヌクレオチドの間で１対１の対応を示す）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡをＺＦＰが結合するＺＦＰ標的部位に容易に設計することができる。例えば、米国特許第９，８７３，８９４号および同第８，５８６，５２６号を参照されたい。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ、Ｇ． Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１１， ６５２を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされる構成成分の全てである。
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的に関しては、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の相同組換え修復機構による修復中に起こる、そのような交換の特殊化された形態を指す。このプロセスでは、ヌクレオチド配列相同性が必要であり、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受ける分子）の鋳型修復に使用し、また、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導くので、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な名称で知られている。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ矯正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーを使用する「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。そのような特殊化されたＨＲの結果、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み入れられるような標的分子の配列の変更がもたらされる。
本開示の方法では、本明細書に記載の１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼにより、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内の所定の部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）において二本鎖切断（ＤＳＢ）が創出され、切断領域内のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。ＤＳＢが存在することにより、ドナー配列の組込みが容易になることが示されている。必要に応じて、構築物は、切断領域内のヌクレオチド配列に対する相同性を有する。ドナー配列を物理的に組み込むこともでき、あるいは、ドナーポリヌクレオチドを相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用し、その結果、ヌクレオチド配列の全部または一部をドナーと同様に細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える」または「置換え」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換え（すなわち、情報という意味での配列の置換え）を表すと理解することができ、必ずしも１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的な置換えを必要とするものではない。
本明細書に記載の方法のいずれかでは、追加的なジンクフィンガータンパク質の対を細胞内の追加的な標的部位の追加的な二本鎖切断のために使用することができる。
細胞クロマチン内の目的の領域内の配列の標的化組換えおよび／または置換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列を、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を用いた相同組換えによって変更する。そのような相同組換えは、切断領域と相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン内の二本鎖切断の存在によって刺激される。
本明細書に記載の方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域内のゲノム配列と相同であるが同一ではなく、それにより、相同組換えを刺激して、同一でない配列を目的の領域内に挿入させる配列を含有し得る。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域内の配列と相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列の間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列の間の相同性は、９９％よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同的部分は、目的の領域内には存在しない配列を含有し得、したがって、新しい配列が目的の領域に導入される。これらの例では、非相同配列は、一般に、目的の領域内の配列と相同または同一である５０〜１，０００塩基対（もしくはその間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に挟まれている。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列と非相同的であり、非相同的組換え機構によってゲノム内に挿入される。
本明細書に記載の方法はいずれも、目的の遺伝子（単数または複数）の発現を破壊するドナー配列の標的化組込みによる細胞内の１つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活化のために使用することができる。部分的にまたは完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
さらに、本明細書に記載の標的化組込みの方法を使用して、１つまたは複数の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコードもしくは非コード配列、ならびに１つまたは複数の調節エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生し得る。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、これらに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含めた種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断のどちらも可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断の結果、平滑末端または付着末端のいずれかが生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドを標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用する。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるかまたは異なる）と併せて、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体を形成する切断ハーフドメインの対を指すために互換的に使用される。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；同第８，６２３，６１８号および米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。
「配列」という用語は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、直鎖状であっても、環状であっても分枝状であってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２から１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれを超える任意の整数値）、好ましくは約１００から１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００から５００ヌクレオチドの間の長さであってよい。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めたタンパク質を含む。大多数の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２つずつ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体に応じて長さは変動する）はヌクレオソームコア間に伸びている。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的に関しては、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方の細胞核タンパク質の全ての型を包含するものとする。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含む染色体の全ての収集物である核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、複製性核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のために十分な条件が存在すれば結合性分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。この用語は、任意の配列の連続したまたは連続していない塩基対ならびに「対の」標的部位（例えば、本明細書に記載のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮの対の標的部位）を包含する。ヌクレアーゼの１つまたは複数のＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡ）がそれらのそれぞれの標的部位に結合した後、切断および改変（例えば、ドナーの組込みおよび／またはインデル改変）が、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合性ドメインが結合した配列内、対の標的部位の間、および／または標的部位のいずれかの３’もしくは５’側に隣接して（例えば、１〜５０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくはそれよりも多くの塩基対を含む）もしくはそれよりも多くの塩基対内）を含めた、標的部位またはその付近のどこかで生じ得る。
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にだけ存在する分子は、成体筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショック処理されていない細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不良性内因性分子の機能性バージョンまたは通常機能性内因性分子の機能不良性バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるものなどの低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、もしくは上記の分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体などの巨大分子であってよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状であっても、分枝状であっても環状であってもよく、また、任意の長さであってよい。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，２５５，２５９号を参照されたい。核酸は、２重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに３重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、それらとして、これらに限定されないが、脂質媒介性移行（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含めたリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移行およびウイルスベクター媒介性移行が挙げられる。外因性分子は、内因性分子と同じ型であるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する分子であってよい。例えば、ヒト核酸配列を元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入することができる。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合により連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子の場合もあり、異なる化学種の分子の場合もある。第１の型の融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと１つまたは複数の活性化ドメインの融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、これらに限定されないが、３重鎖形成核酸とポリペプチドの融合物、および副溝結合物質と核酸の融合物が挙げられる。当該用語はまた、ポリヌクレオチド構成成分とポリペプチド構成成分を会合させて機能性分子を形成する系（例えば、単一ガイドＲＮＡと機能性ドメインを会合させて遺伝子発現をモジュレートするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）も含む。
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達に起因してもよく、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達により生じてもよく、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質が生成される。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションも細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は本開示の他の箇所に提示されている。
本開示の目的に関しては、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照されたい）、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を、そのような制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かにかかわらず含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合性部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域を含むが必ずしもこれらに限定されない。
「セーフハーバー」遺伝子座は、宿主細胞に対するいかなる有害作用も伴わずに遺伝子を挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が近隣の遺伝子由来のいかなるリードスルー発現によっても撹乱されないセーフハーバー遺伝子座が最も有益である。ヌクレアーゼ（単数または複数）によって標的とされるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号；および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生じるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」または「改変」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、外因性分子（例えば、操作された転写因子）の結合を介した遺伝子の改変によるものを含めた、遺伝子活性化および遺伝子抑止を挙げることができる。モジュレーションは、ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活化、ランダム突然変異）を介した遺伝子配列の改変によって実現することもできる。遺伝子不活化は、本明細書に記載の改変されていない細胞と比較した、遺伝子発現のあらゆる低減を指す。したがって、遺伝子不活化は、部分的または完全なものであり得る。
「目的の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子内または遺伝子に隣接する遺伝子または非コード配列などの、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えを目的とするものであり得る。目的の領域は、例えば、染色体内、エピソーム内、細胞小器官のゲノム内（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム内に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内、または非転写領域内のコード領域の上流または下流にあり得る。目的の領域は、一ヌクレオチド対ほど小さい場合もあり、２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対に至る場合もある。
「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
「作動的な連結」および「作動的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つまたはそれよりも多くの構成成分（配列エレメントなど）が近位にあり、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分のうちの少なくとも１つが、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が認められるように構成成分が配置されていることに関して互換的に使用される。実例として、プロモーターなどの転写制御配列は、１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して転写制御配列によりコード配列の転写のレベルが調節される場合、コード配列に作動的に連結している。転写制御配列は、一般に、コード配列とシスで作動的に連結しているが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、連続していないにもかかわらず、コード配列に作動的に連結した転写制御配列である。
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結した」という用語は、構成成分のそれぞれが、他の構成成分と連結した状態で、そのように連結していない場合と同じ機能を発揮するという事実を指し得る。例えば、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が活性化ドメインと融合した融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合性ドメインと活性化ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合、作動的に連結している。ＤＮＡ結合性ドメインが切断ドメインと融合した融合ポリペプチドの場合、ＤＮＡ結合性ドメインと切断ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、切断ドメインが標的部位の付近のＤＮＡを切断することができる場合、作動的に連結している。同様に、ＤＮＡ結合性ドメインが活性化または抑止ドメインと融合した融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合性ドメインと活性化または抑止ドメインは、融合ポリペプチドとして、ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合性部位に結合することができると同時に、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるまたは抑止ドメインが遺伝子発現を下方制御することができる場合、作動的に連結している。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能性断片」は、配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、それでもなお全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性断片は、対応するネイティブな分子より多くの、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、かつ／または、１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法が周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合法、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質の別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは補完により、遺伝学的に、および生化学的の両方で決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移行することができる。一般には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を方向付けることができ、遺伝子配列を標的細胞に移行することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを包含する。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずではないが好ましくは常套的なアッセイで容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、呈色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに細胞成長および／または遺伝子増幅の増強を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとして、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結させることができるレポーターをコードする配列を含む。
「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物を指す。したがって、「対象」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象は、障害を有する対象または障害が発生するリスクがある対象を含む。
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書で使用される場合、症状の重症度および／または発生頻度の低減、症状および／または根本原因の排除、症状および／またはそれらの根本原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または修復を指す。がんおよび移植片対宿主病は、本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置することができる状態の非限定的な例である。したがって、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、
（ｉ）哺乳動物において、特にそのような哺乳動物に状態の素因があるが今のところはまだそれを有すると診断されていない場合に、疾患または状態が生じるのを防止すること；
（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害する、すなわち、その発症を阻止すること；
（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を軽減する、すなわち、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと；または
（ｉｖ）疾患または状態に起因する症状を軽減する、すなわち、根源の疾患または状態には対処せずに疼痛を軽減すること
を含む。
本明細書で使用される場合、「疾患」および「状態」という用語は、互換的に使用される場合もあり、特定の疾病または状態に既知の原因物質がなく（したがって、まだ病因が解明されていない）、したがって、まだ疾患としてではなく、望ましくない状態または症候群としか認識されず、程度の差はあるが特定の症状のセットが臨床医によって同定されているという点で異なる場合もある。
「医薬組成物」は、本発明の化合物と、生物活性のある化合物の哺乳動物、例えばヒトへの送達に関して当技術分野において一般に認められている媒体との製剤を指す。そのような媒体は、そのための全ての薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
「有効量」または「治療有効量」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与した場合に哺乳動物、好ましくはヒトにおける処置をもたらすために十分である、本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の組成物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与の様式、ならびに処置される哺乳動物の年齢に応じて変動するが、当業者が独自の知見および本開示を考慮して常套的に決定することができる。
ＤＮＡ結合性ドメイン
ＨＬＡ遺伝子もしくはＨＬＡ制御因子、またはＴＣＲ遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４など）および／または追加的な遺伝子（例えば、セーフハーバー）を含む任意の遺伝子内の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。これらに限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合性部分（ｓｇＲＮＡ）、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合性ドメインを含めた任意のＤＮＡ結合性ドメインを本明細書に開示される組成物および方法に使用することができる。ＤＮＡ結合性ドメインは、これらに限定されないが、本明細書に開示される標的部位のいずれか（例えば、表１に示されている１２〜２０またはそれよりも多くの連続したまたは連続していない塩基対の標的部位）に示される１２ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドの標的配列を含めた遺伝子内の任意の標的配列に結合し得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ制御遺伝子内の標的部位に（配列特異的に）結合し、ＴＣＲ遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインはＴＣＲＡ内の標的部位に結合し、他の実施形態では、ジンクフィンガーはＴＲＢＣ内の標的部位に結合する。他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の標的部位に配列特異的に結合し、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現をモジュレートする。さらに別の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＣＩＳＨ（例えば、表１に示されている標的部位）またはＰＤ１遺伝子（例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に示されている標的部位）などの免疫チェックポイント遺伝子に配列特異的に結合する。多数の遺伝子を同時に改変するために多数のＤＮＡ結合性ドメイン（同じまたは異なる遺伝子に結合する）を一緒に使用することができる（例えば、多数のヌクレアーゼ媒介性ノックアウトおよび／またはドナーの標的化組込みによる多重化）。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質は、選択される標的部位に結合するように操作されているという点で天然に存在しないことが好ましい。例えば、全てそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＢｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
操作されたジンクフィンガー結合性ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。操作する方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々の型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースであって、各トリプレットまたはクワドルプレットヌクレオチド配列が特定のトリプレットまたはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられるデータベースを使用することを含む。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含めた例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し構築するためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６において詳細に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ制御遺伝子内の標的部位に結合する（配列特異的に）操作されたジンクフィンガータンパク質であり、ＴＣＲ遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質はＴＣＲＡ内の標的部位に結合し、他の実施形態では、ジンクフィンガーはＴＲＢＣ内の標的部位に結合する。他の実施形態では、操作されたジンクフィンガータンパク質のＤＮＡ結合性ドメインは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の標的部位に配列特異的に結合し、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現をモジュレートする。さらに別の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＣＩＳＨ遺伝子またはＰＤ１遺伝子などの免疫チェックポイント遺伝子に配列特異的に結合する。
通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのいくつかは、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、一般には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、一般には、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ＺＦＰは、転写活性化または抑止ドメインであり得る１つまたは複数の制御ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。ＺＦＰは、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号に記載されている通り、骨格領域への改変をさらに含み得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
他の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６： １５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６： １５０１を参照されたい）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ （２００７） Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３（１３）： ４３７９−４３８４）；米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号および同第２０１１０１４５９４０号を参照されたい）に由来するものと同様のＴＡＬエフェクター由来の操作されたドメインを含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５種よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注射する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注射されたタンパク質としては、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８： １２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬＥは、タンデムリピートの集中ドメインを含有し、各リピートが、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要であるおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、ＴＡＬＥは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説に関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ， ｅｔ ａｌ （２００６） Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）： ２５６−２７２を参照されたい）。さらに、植物病原性の細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂｉｏｖａｒ １ ｓｔｒａｉｎ ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ ４ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であるｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ （２００７） Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）： ４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメイン内の１，５７５ｂｐの欠失により異なる。しかし、どちらの遺伝子産物もＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質との４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピート内に見いだされる配列に依存する。リピートされた配列は、およそ１０２塩基対を含み、リピートは、一般には、互いと９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ）。リピートの多型は、通常、１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性とＴＡＬ−エフェクターの標的配列の連続したヌクレオチドの同一性の間には１対１の対応があると思われる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１および Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識についての天然のコードは、１２位および１３位のＨＤ配列（リピート可変二残基またはＲＶＤ）によりシトシン（Ｃ）への結合が導かれ、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用し、植物細胞における非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製するために、新しい組合せおよび数のリピートを有するタンパク質にアセンブルされている（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインと連結して、非定型的ＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含めたＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）がもたらされている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは単量体で活性であり、活性のための二量体形成を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ： １−１３， ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｃｏｍｐａｃｔ ＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインとＴｅｖＩヌクレアーゼドメインが連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を創出し得る（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ４：１７６２ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照されたい）。さらに、ヌクレアーゼドメインもＤＮＡ結合機能性を示す場合がある。任意のＴＡＬＥＮを１つまたは複数のメガＴＡＬＥを有する追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）と組み合わせて使用することができる。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＤＮＡに結合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含め、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第９，８７３，８９４号；および同第８，６９７，３５９号、米国特許出願公開第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ））遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３： １５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０： ４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １： ７；Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １： ｅ６０）によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列が構成される。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングできる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断が４つの逐次的なステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により、機能性ドメイン（例えば、Ｃａｓなどのヌクレアーゼ）が標的ＤＮＡにｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対合を介して方向付けられる。最後に、Ｃａｓ９により標的ＤＮＡの切断が媒介されて、プロトスペーサー内の二本鎖切断が創出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおいて、異質ＤＮＡ配列がＣＲＩＳＰＲアレイに挿入されて、今後の攻撃が防止されるステップと、（ｉｉ）関連するタンパク質が発現され、ならびにアレイが発現およびプロセシングされるステップと、その後の（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性干渉ステップとで構成される。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。ネイティブな配列のポリペプチドの「機能性誘導体」は、ネイティブな配列のポリペプチドと共通する定性的な生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」は、これらに限定されないが、ネイティブな配列の断片、ならびに、対応するネイティブな配列のポリペプチドと共通する生物活性を有するのであれば、ネイティブな配列のポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。本明細書において意図されている生物活性は、機能性誘導体のＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性の修飾物の両方、および誘導体Ｃａｓタンパク質などのその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体またはその断片としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合物、共有結合性の修飾物またはその断片が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成することができるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって入手可能である。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよく、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または、内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介して送達するための小さなＣａｓ９オルソログである（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｎａｔｕｒｅ ５１０， ｐ． １８６）。したがって、ＤＮＡ結合性ドメインは、表１に示されている標的部位または少なくとも９ヌクレオチドに結合するｓｇＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ；Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄを参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、標的ＲＮＡを、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック塩基対合を介して認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖切断的に切断する（Ｖｏｇｅｌ （２０１４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４：９７２−９７３）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合、ウイルス）ＤＮＡを検出し、除去するように機能する可能性がある（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ １９， ４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ５１， ５９４；Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。
最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ｉｂｉｄ）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔのいずれかの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体をＤＮＡの第三者分子内のワトソン・クリック相補ＤＮＡ配列に結合するように方向付ける働きをする。これらのガイドＤＮＡ内の配列情報により標的ＤＮＡが同定されたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体により標的ＤＮＡが切断される。そのような機構は、標的ＤＮＡに結合している間のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（Ｇ． Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は同様の性質を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ． ｉｂｉｄ）。
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質にローディングすることができる（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ｉｂｉｄ．）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向付けられるので、したがって、外因性の、研究者に指定されたガイドＤＮＡを用いて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体によりＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断が相補的な研究者に指定された標的ＤＮＡに方向付けられる。このように、ＤＮＡにおける標的化二本鎖切断を創出することができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物体由来のオルソロガスＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化切断が可能になる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断に関しては、哺乳動物細胞における発現に対してコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンの使用が好ましいと思われる。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドと融合している場合、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。さらに、３７℃における活性が改善されるように突然変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断を使用して、ＤＮＡ切断の活用に関する当技術分野における標準の技法を使用した遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子矯正、標的化遺伝子欠失を含めた多数の転帰に影響を及ぼすことができる。したがって、本明細書に記載の細胞への結合およびその改変（例えば、挿入および／または欠失による発現のモジュレーションおよび／または遺伝子改変）のために任意のＤＮＡ結合性ドメインを使用することができる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子（単数または複数）の改変をもたらす分子（単数または複数）のＤＮＡ結合性ドメイン（単数または複数）は、表１に示されている標的部位の少なくとも９ヌクレオチドを含む標的部位に結合する。
融合分子
本明細書に記載の異種性制御（機能性）ドメイン（またはその機能性断片）に関連するＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分）を含む融合分子も提供される。一般的なドメインとして、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再構成酵素およびそれらの関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよび脱アセチル化酵素）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連する因子および修飾因子が挙げられる。そのような融合分子は、本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメインおよび転写制御ドメインを含む転写因子ならびにＤＮＡ結合性ドメインおよび１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含むヌクレアーゼを含む。
活性化（転写活性化ドメイン）を実現するための適切なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ５９５２−５９６２ （１９９７）を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：３７３−３８３ （１９９８）を参照されたい）；核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｒｉｋ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：５６１０−５６１８ （１９９８）およびＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７−２９４２ （１９９７））；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：３−２８ （１９９８））、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能性ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） ＥＭＢＯ Ｊ． １８， ６４３９−６４４７）が挙げられる。追加的な例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１， ４９６１−４９６８ （１９９２））ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２３：２５５−２７５；Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１； Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ （１９９９） Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ． ４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６９：３−１２；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２５：２７７−２８３；およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ９：４９９−５０４を参照されたい。追加的な例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、ＡＲＦ−６、ＡＲＦ−７、およびＡＲＦ−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７−９９；Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５：２９８−３０９；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２：１−８；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４１：３３−４４；およびＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。
ＤＮＡ結合性ドメインと機能性ドメインの間での融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成においては、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能性ドメインとして適切であることは当業者には明らかになろう。活性化複合体および／または活性化活性（例えばヒストンアセチル化など）を標的遺伝子に動員することができる本質的に任意の分子が融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能的ドメインとしての使用に適したインスレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合性ドメインタンパク質などのクロマチンリモデリングタンパク質は、例えば、米国特許第７，０５３，２６４号に記載されている。
例示的な抑止ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：３３８−３４２を参照されたい。追加的な例示的な抑止ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１；およびＷｕ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２：１９−２７を参照されたい。
融合分子は、当業者に周知のクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑止ドメイン）に関連するＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）を含む。融合分子はまた、必要に応じて、核局在化シグナル（例えばＳＶ４０ミディアムＴ−抗原に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび赤血球凝集素など）も含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳の読み枠が融合物の構成成分の間で保存されるように設計する。
一方の機能性ドメイン（またはその機能性断片）のポリペプチド構成成分と他方の非タンパク質ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合物質、核酸）の間の融合物は、当業者に公知の生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ） Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合物質とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物は、Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３９３０−３９３５に記載されている。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡは機能的ドメインと会合して活性な転写制御因子およびヌクレアーゼを形成する。
ある特定の実施形態では、標的部位は、細胞クロマチンの到達可能な領域内に存在する。到達可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および同第７，９２３，５４２号に記載されている通り決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能な領域内に存在しない場合、１つまたは複数の到達可能な領域を米国特許第７，７８５，７９２号および同第８，０７１，３７０号に記載されている通り生成することができる。追加的な実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合性ドメインは、その標的部位が到達可能な領域内にあるか否かにかかわらず細胞クロマチンに結合することができる。例えば、そのようなＤＮＡ結合性ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することができる。この型の「パイオニア」ＤＮＡ結合性ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体において、および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）において見いだされる（Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２７０；Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｃｅｌｌ ６０：７１９−７３１；およびＣｉｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ． １７：２４４−２５４）。
融合分子は、当業者には公知の通り、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
融合分子の機能性構成成分／ドメインは、融合分子が標的配列にＤＮＡ結合性ドメインを介して結合すると遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる種々の異なる構成成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能性構成成分としては、これらに限定されないが、活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーなどの種々の転写因子ドメインを挙げることができる。
追加的な例示的な機能的ドメインは、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号および同第６，９３３，１１３号において開示されている。
外因性小分子またはリガンドによって制御される機能的ドメインも選択することができる。例えば、機能性ドメインの活性なコンフォメーションが外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でのみ想定される場合、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を使用することができる（例えば、ＵＳ２００９０１３６４６５を参照されたい）。したがって、ＺＦＰを調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結することができ、得られるＺＦＰ−ＴＦの活性は外部リガンドにより調節される。
ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、融合分子は、切断（ヌクレアーゼ）ドメインに関連するＤＮＡ結合性ドメインを含む。したがって、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたヌクレアーゼを使用して実現することができる。操作されたヌクレアーゼの技術は、天然に存在するＤＮＡ結合性タンパク質を操作することに基づく。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼを、調整されたＤＮＡ結合特異性を用いて操作することが記載されている。Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（２０）：ｅ１７８；Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５５：４４３−４５８。さらに、ＺＦＰを操作することも記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第７，１６３，８２４号；および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
さらに、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ−その意図された核酸標的をその操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合性ドメインを通じて認識し、ヌクレアーゼ活性によりＤＮＡをＤＮＡ結合性部位の付近でカットさせることができる機能性実体を創出するためにＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥがヌクレアーゼドメインと融合され得る。
したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、広範に適用可能であり、任意の目的のヌクレアーゼを伴い得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合性および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；異種性切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン）を含み得る、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインを、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、同類の結合性部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。
本明細書に記載のヌクレアーゼのいずれかでは、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよびＴＡＬＥＮとも称されるヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含み得る。これらのＴＡＬＥＮタンパク質を使用者に選択された標的配列との頑強な部位特異的相互作用のために操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは単量体で活性であり、活性のための二量体形成を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ： １−１３， ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照されたい）。さらに、ヌクレアーゼドメインもＤＮＡ結合機能性を示す場合がある。
さらに別の実施形態では、ヌクレアーゼは、ｃｏｍｐａｃｔ ＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインとＴｅｖＩヌクレアーゼドメインを連結する単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖切断を創出し得る（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ （２０１３） Ｎａｔ Ｃｏｍｍ： １−８ ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照されたい）。任意のＴＡＬＥＮを追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））または他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用することができる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、切断活性を示すメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその一部を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号６３として開示されている「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）、「、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに群分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号６３として開示されている「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）に由来する、天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合性ドメインは、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム改変を促進するために使用されているが、この手法は、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Ｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｏｎ． ２５５： ８８−９３）または認識配列が導入されている予め操作されたゲノム（Ｒｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４： ８０９６−１０６；Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． １３３： ９５６−６５；Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ５０５５−６０；Ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １６： １５６８−８１；Ｇｏｕｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００６）， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ８（５）：６１６−６２２）のいずれかの改変に限られている。したがって、メガヌクレアーゼを医学的にまたはバイオテクノロジー的に関連する部位において新規の結合特異性を示すように操作する試みがなされている（Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３： ９６７−７３；Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００４）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４２：３１−４１；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号；同第２００６０２０６９４９号；同第２００６０１５３８２６号；同第２００６００７８５５２号；および同第２００４０００２０９２号）。さらに、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは操作されたＤＮＡ結合性ドメインを異種性ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結することができ、かつ／または、メガヌクレアーゼ由来の切断ドメインを異種ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結することができる。
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン−ヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子内の標的部位に結合するように操作されたＤＮＡ結合性ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン）および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載の制限ヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼに由来する）を含む。
上で詳細に記載されている通り、ジンクフィンガー結合性ドメインおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインを、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合性ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作する方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々の型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースであって、各トリプレットまたはクワドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥリピート単位の１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられるデータベースを使用することを含む。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
標的部位の選択；ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計し、構築するための方法は、当業者に公知であり、それらの全体が本明細書において参照により組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号において詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質を、例えば、５アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適切なリンカー配列を使用して連結することができる。６アミノ酸またはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関しては、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，７７２，４５３号も参照されたい。
したがって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合性ドメインおよび任意のヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含み得る。上記の通り、切断ドメインは、ＤＮＡ結合性ドメイン、例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン由来の切断ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して異種性であり得る。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加的な酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能性断片）の１つまたは複数を切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
同様に、切断ハーフドメインは、上記の通り、切断活性のために二量体形成を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよく、各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合により、切断ハーフドメインが互いに、切断ハーフドメインが例えば二量体形成によって機能性切断ドメインを形成することを可能にする空間的配向に置かれるように、互いに対して配置されることが好ましい。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の端付近は５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド隔てられている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位間に介在してよい（例えば、２から５０ヌクレオチド対まで、またはそれよりも多く）。一般に、切断の部位は標的部位間に位置するが、切断部位から１〜５０塩基対（または１〜５塩基対、１〜１０塩基対、および１〜２０塩基対を含めた、その間の任意の値）、１〜１００塩基対（またはその間の任意の値）、１００〜５００塩基対（またはその間の任意の値）、５００〜１０００塩基対（またはその間の任意の値）、またはさらには１ｋｂよりも大きくを含め、切断部位から１キロベースまたはそれよりも大きく離れても位置し得る。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位において）、ＤＮＡを結合部位またはその付近で切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から出た部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおけるＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていてもされていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合性ドメインを含む。
切断ドメインが結合性ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的に関しては、開示される融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞の配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換えに関しては、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒として活性な切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合性ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一ポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更に関するパラメーターは本開示の他の箇所に提示されている。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体を形成（例えば、二量体を形成）して機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってよい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加的な制限酵素は、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらは本開示により意図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１：４１８−４２０を参照されたい。
ある特定の実施形態では、例えば、その全ての開示全体が本明細書において参照により組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号に記載されている通り、切断ドメインはホモ二量体形成を最小限にするまたは防止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体形成ドメイン突然変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体形成に影響を及ぼすための標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインとして、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対が挙げられる。
したがって、一実施形態では、４９０位の突然変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ；５３８位の突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ；４８６位の突然変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ；４９９位の突然変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインを、１つの切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される操作された切断ハーフドメインを作出することによって、および別の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される操作された切断ハーフドメインを作出することによって調製した。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または消失した偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、その開示全体があらゆる目的に関して参照によって組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと相対的に番号付けされた）における突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられた突然変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、その開示全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異を含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ， （２０１０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４００（１）：９６−１０７を参照されたい）。
あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「分割酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を使用し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて核酸標的部位でアセンブルすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。そのような分割酵素の構成成分を別々の発現構築物上で発現させることもでき、１つのオープンリーディングフレームに連結することもでき、その場合、個々の構成成分は、例えば、自己切断性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離されている。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合性ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合性ドメインのドメインであってよい。
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）を、使用前に、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されている通り、酵母に基づく染色体系において活性についてスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３： １５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０： ４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １： ７；Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １： ｅ６０）によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列が構成される。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングできる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断が４つの逐次的なステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡにｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対合を介して方向付けられる。最後に、Ｃａｓ９により標的ＤＮＡの切断が媒介されて、プロトスペーサー内の二本鎖切断が創出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおいて、異質ＤＮＡ配列がＣＲＩＳＰＲアレイに挿入されて、今後の攻撃が防止されるステップと、（ｉｉ）関連するタンパク質が発現され、ならびにアレイが発現およびプロセシングされるステップと、その後の（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性干渉ステップとで構成される。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。ネイティブな配列のポリペプチドの「機能性誘導体」は、ネイティブな配列のポリペプチドと共通する定性的な生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」は、これらに限定されないが、ネイティブな配列の断片、ならびに、対応するネイティブな配列のポリペプチドと共通する生物活性を有するのであれば、ネイティブな配列のポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。本明細書において意図されている生物活性は、機能性誘導体のＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性の修飾物の両方、およびその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体またはその断片としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合物、共有結合性の修飾物またはその断片が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成することができるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって入手可能である。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよく、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または、内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
ＴＣＲ遺伝子および他の遺伝子を標的とする例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。ヌクレアーゼ（単数または複数）により、標的部位内に１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖カットを生じさせることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３２（６）：５７７−５８２を参照されたい。触媒として不活性な切断ドメインは、触媒として活性なドメインと組み合わせることで、一本鎖カットを生じさせるニッカーゼとして作用し得る。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域内に二本鎖カットを生じさせることができる。追加的なニッカーゼも当技術分野で公知である、例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４４（２）：ｅ１１． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８． Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｏｃｔ １９。
標的部位
上に詳細に記載されている通り、ＤＮＡ結合性ドメインは、選択された任意の配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合性ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合性ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。
本明細書に記載のヌクレアーゼは、ＴＣＲ遺伝子またはＢ２Ｍ遺伝子の、例えば、表１に示されている少なくとも９ヌクレオチド（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１またはそれよりも多くの連続したまたは連続していない）標的部位を標的とする。したがって、本明細書に記載の組成物は、ＴＣＲ遺伝子が、ＴＣＲＡ遺伝子のエクソンｃ２において改変されている（例えば、ＣＡＲもしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥもしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子の挿入を含めた挿入および／もしくは欠失によって）：Ｂ２Ｍ遺伝子が、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１で改変されている（例えば、ＣＡＲ導入遺伝子の挿入を含めた挿入および／もしくは欠失によって）；かつ／またはＨＰＲＴ遺伝子が改変されている（例えば、ＣＡＲもしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−ＥもしくはＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子の挿入を含めた挿入および／または欠失によって）、細胞を含む。改変は、標的部位内におけるものであってもよく、あるいは、標的部位の３’または５’末端に隣接していてもよい（例えば、１〜５ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチドまたは１〜２０ヌクレオチド以内）。さらに別の実施形態では、改変は、表１の対の標的部位の間のものであってよい。
ドナー
本明細書に記載の通りヌクレアーゼ媒介性切断後に任意のドナーをゲノムに挿入して組み込むことができる。ドナーは、１つもしくは複数のコード配列（例えば、ＣＡＲ）；１つもしくは複数のＲＮＡ（ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなど）；１つまたは複数の非コード配列；および／または他の配列を含み得る。ドナー構築物は、ｍＲＮＡ形態で、または本明細書に記載のウイルスまたは非ウイルスＤＮＡベクターを使用して細胞または対象に送達することができる。ある特定の実施形態では、ドナーをｍＲＮＡ形態で送達する、または、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０ならびに／またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのシュードタイピングされたＡＡＶを含めた１つまたは複数のＡＡＶベクターで運ぶ。
ある特定の実施形態では、ドナーは、これらに限定されないが、１つまたは複数のＣＡＲをコードする配列；ならびに１つまたは複数のＢ２Ｍコード配列；１つまたは複数のＨＬＡ−Ｇおよび／またはＨＬＡ−Ｅコード配列；１つまたは複数のレポーター（例えば、ＧＦＰ）などを含めた１つまたは複数の導入遺伝子を含む。
ＣＡＲをコードする配列（ＣＡＲ陽性（＋）Ｔ細胞を作製するため）は、共刺激ドメインおよび活性化ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分と連結した特定の腫瘍抗原に対する特異性を有する細胞外単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。共刺激ドメインは、例えばＣＤ２８に由来するものであってよく、活性化ドメインは、例えばＣＤ３−ゼータに由来するものであってよい。ＣＡＲ導入遺伝子は、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの共刺激ドメインを含み得る。ＣＡＲ ｓｃＦｖは、例えば、全ての正常なＢ細胞、ならびにこれらに限定されないが、ＮＨＬ、ＣＬＬ、および非Ｔ細胞ＡＬＬを含めたＢ細胞悪性腫瘍を含めたＢ細胞系列の細胞によって発現される膜貫通タンパク質であるＣＤ１９を標的とするように設計することができる。例えば、米国特許第９，８５５，２９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺと称されるＣＡＲを含み、ここで、ＦＭＣ６３は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列であり（米国特許第９，７０１，７５８号を参照されたい）、ＣＤ８ＢＢＺは、ＣＡＲのｓｃＦｖ以外の部分（ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン（ＣＤ８）、４１ＢＢ遺伝子由来の共刺激ドメイン（ＢＢ）、ＣＤ３ｚ遺伝子由来の活性化ドメイン（Ｚ））を指す。
これらに限定されないが、その対立遺伝子バリアントおよび／または機能性断片を含めた任意のＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇをコードする配列を本明細書に記載の組成物および方法に使用することができる。ある特定の実施形態では、２つの主要なＨＬＡ−Ｅ対立遺伝子バリアント：ＨＬＡ−Ｅ＊０１０１（本明細書ではＥＲまたはＨＬＡ−Ｅ０１０１とも称される）またはＨＬＡ−Ｅ＊０１０３（本明細書ではＥＧまたはＨＬＡ−Ｅ０１０３とも称される）のうちの一方をコードする配列を含む導入遺伝子が使用される。ＨＬＡ−Ｅ０１０１およびＨＬＡ−Ｅ０１０３は、１アミノ酸位だけが異なり、ＨＬＡ−Ｅ０１０１の１０７位のアルギニンがＨＬＡ−Ｅ０１０３ではグリシンに置き換えられている（Ｃｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ）。別の実施形態では、ドナーは、融合タンパク質、例えば、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇおよび／またはＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ融合タンパク質を含む。融合タンパク質をコードする導入遺伝子の構成成分は、これらに限定されないが、ＨＬＡ−Ｇおよび／もしくはＨＬＡ−Ｅ遺伝子配列の前にＢ２Ｍ遺伝子配列；またはＢ２Ｍ遺伝子配列の前にＨＬＡ−Ｇおよび／もしくはＨＬＡ−Ｅ遺伝子配列を含めた任意の順序であってよい。
例として、ＣＡＲ配列、Ｂ２Ｍ配列、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ配列に対して１つのドナー（例えば、配列の１つまたは複数の間に自己切断性２Ａペプチドおよび／またはリンカーを伴って）を含め、１つまたは複数のドナーを使用して導入遺伝子を導入することができる。ある特定の実施形態では、ドナーは、ＣＡＲをコードする配列（単数または複数）とＢ２Ｍ／ＨＬＡ−ＧまたはＥをコードする配列（例えば、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ／Ｅ融合タンパク質をコードする配列）の間に２Ａ配列を含む。あるいは、ＣＡＲ配列に対して１つのドナー、ならびにＢ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ遺伝子に対して１つまたは複数の別のドナー、例えば、第１のＣＡＲドナーと、Ｂ２Ｍ／ＨＬＡ−Ｅ／Ｇ融合タンパク質に対する第２のドナー（１つまたは複数のＣＡＲ配列もさらに含み得る）を使用することができる。ある特定の実施形態では、ドナーは、ＣＡＲならびにＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＧ融合タンパク質をコードし、ＣＡＲと融合タンパク質の間に自己切断性２Ａペプチドを伴い、さらに、融合タンパク質のタンパク質コード配列間に１つまたは複数のリンカー（例えば、１、２、３、４、５、６またはそれよりも多くのＧＳ４リンカー）を伴う導入遺伝子を含む。
本明細書に記載のドナーはいずれも、任意の長さの相同アーム（ヌクレアーゼが標的とする遺伝子に対するもの）を含み得る。例えば、米国特許第８，８２２，２２１号；同第７，９７２．８５４号を参照されたい。「長い相同アーム」は約１Ｋｂの長さであり、「短い相同アーム」は約２５０ｂｐから７５０ｂｐまでの長さいずれかである。
さらに、ドナーはいずれも、これらに限定されないが、相同アーム；１つまたは複数の導入遺伝子（その発現が同じまたは異なる調節エレメントによって駆動される）、例えば、レポーター、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｅおよび／または１つまたは複数のＣＡＲなど；ならびに、１つもしくは複数の構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーター（例えば、ＰＧＫ）、１つもしくは複数のエンハンサー配列（例えば、ＴＣＲエンハンサー配列）；２Ａ配列；ポリアデニル化シグナル（単数または複数）；ＩＲＥＳ配列、５’ＵＴＲおよび／もしくは３’ＵＴＲ領域；および／または１つもしくは複数の（Ｇ４Ｓ）４リンカーなどの追加的な配列を含めた構成成分の任意の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｘｅｎｏｐｕｓベータグロビン配列（例えば、５’ＵＴＲに）。
ドナーはいずれも、ＷＰＲＥ配列を含み得る。任意のＷＰＲＥ配列を本発明の実施に使用することができる。適切な配列の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１６０３２６５４８号および米国特許第６，１３６，５９７号；同第６，２８４，４６９号；同第６，３１２，９１２号；および同第６，２８７，８１４号に開示されている。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、野生型と比較して突然変異を含む。例えば、米国特許第７，４１９，８２９号およびＺａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ ．（２００９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：６０５−６１９ ｏｒ ａ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ）を参照されたい。同じまたは異なるＷＰＲＥ配列の１つまたは複数を使用することもできる。ＷＰＲＥは、ドナーの３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲにあってよい。ある特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、
を含む。
さらに、ドナーは、ＴＣＲａエンハンサー配列を含めた１つまたは複数のＴ細胞受容体エンハンサーを含み得る。例えば、Ｈｏ ＆ Ｌｅｉｄｅｎ （１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０ （９）： ４７２０−４７２７；Ｋａｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ ．（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ２２０４−２２０８を参照されたい。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体エンハンサーは、配列：
を含む。他の実施形態では、ＴＣＲαエンハンサー配列は、以下の通りである：
したがって、ドナーの非限定的な例として、
（１）以下の配列：それぞれサイズが約１Ｋｂの相同アーム（Ｂ２Ｍに対するもの）に挟まれた導入遺伝子（ＧＦＰ、ＣＡＲなど）に作動可能に連結したＰＧＫプロモーター配列を含む長い相同アーム（長いアーム）を有するドナー；
（２）以下：それぞれサイズが２５０ｂｐの相同アーム（Ｂ２Ｍに対するもの）に挟まれた導入遺伝子に作動可能に連結したＰＧＫプロモーター配列を含む、短い相同アーム（短いアーム）を有するドナー；
（３）３’ＵＴＲにＷＰＲＥ配列、例えば、
を含むＷＰＲＥ配列をさらに含む（２）のドナー；
（４）ＰＧＫプロモーターの上流のＴ細胞エンハンサー配列、例えば、以下の配列：
をさらに含む（２）のドナー；または
（５）ＴＣＲαエンハンサー配列、例えば、以下の配列：
をさらに含む（２）のドナー；
（６）Ｘｅｎｏｐｕｓベータグロビン遺伝子の５’非翻訳領域由来の配列、必要に応じて以下の配列：
をさらに含む（２）のドナー
（７）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＣＡＲ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ）を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する短い相同アーム（４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム）を含有するドナー。ドナーは、必要に応じてＴＲＡＣ遺伝子座へのＴＩのｍｉｓｅｑによる定量化を可能にする「ｍｉｓｅｑタグ」も含む；
（８）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＣＡＲ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ）を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する長い相同アーム（１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアーム）を有するドナー。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」を含まない；
（９）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＣＡＲ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ）および突然変異ＷＰＲＥエレメント（導入遺伝子の後）を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する短い相同アーム（３５０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム）を有するドナー。ドナーは必要に応じて「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（１０）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する短い相同アーム（４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム）を含有するドナー。ドナーは、必要に応じてＴＲＡＣ遺伝子座へのＴＩのｍｉｓｅｑによる定量化を可能にする「ｍｉｓｅｑタグ」も含む；
（１１）導入遺伝子配列の後にＷＰＲＥ配列をさらに含む（１０）のドナー；
（１２）Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する短い相同アーム（３６０ｂｐおよび３９３ｂｐの右側のアーム）を有するドナー。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、その後に突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは必要に応じて「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（１３）ＨＬＡ−ＥがＨＬＡ−Ｇで置き換えられている（１２）のドナー；
（１４）ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇの両方を含む（１３）のドナー；
（１５）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する長い相同アーム（例えば、１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアーム）を有するドナー；
（１６）ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子がＨＬＡ−Ｅ導入遺伝子（例えば、ＨＬＡ Ｅ０１０１またはＥ０１０３（Ｃｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ））で置き換えられている（１５）のドナー；
（１７）ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子をさらに含む（１５）のドナー；
（１８）ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子と連結したＢ２Ｍをコードする配列をさらに含み、必要に応じて、導入遺伝子のいずれかの間（例えば、Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間；Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅの間；Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅの間；ＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−Ｅの間など）に１、２、３、４、５、６またはそれよりも多くのコピーのＧ４Ｓペプチドを有するリンカーを介する、（１５）〜（１７）のいずれかのドナー；
（１９）必要に応じて導入遺伝子の１つまたは複数（例えば、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅ／ＧまたはＢ２Ｍのみ、例えば、ＨＬＡ−Ｇの単一のペプチドを含まないドナー）の前にシグナルペプチドをさらに含む、（１５）〜（１８）のいずれかのドナー；
（２０）必要に応じてＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇおよび／またはＨＬＡ−Ｅを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＣＡＲ導入遺伝子（例えば、ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ）をさらに含む、（１５）〜（１９）のいずれかのドナー；ならびに
（２１）突然変異ＷＰＲＥエレメントおよび必要に応じてｍｉｓｅｑタグをさらに含む（２０）のドナー。
送達
タンパク質（例えば、転写因子、ヌクレアーゼ、ＴＣＲおよびＣＡＲ分子）、ポリヌクレオチドならびに／または本明細書に記載のタンパク質および／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質および／またはｍＲＮＡ構成成分の注射によるものを含めた任意の適切な手段によって標的細胞に送達することができる。一部の態様では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーをｍＲＮＡとして送達し、導入遺伝子をウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子などの他のモダリティを介して送達する。例えば、米国特許第２０１４０３３５０６３号を参照されたい。一部の実施形態では、タンパク質を細胞に細胞スクイージングによって導入する（Ｋｏｌｌｍａｎｎｓｐｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ７， １０３７２ ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ １０３７２を参照されたい）。
適切な細胞としては、これらに限定されないが、真核細胞および／または細胞株ならびに原核細胞および／または細胞株が挙げられる。そのような細胞から生成されるそのような細胞または細胞株の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。適切な細胞としては、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞などの幹細胞も挙げられる。
本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、その全ての開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
本明細書に記載のＤＮＡ結合性ドメインおよびこれらのＤＮＡ結合性ドメインを含む融合タンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。さらに、追加的な核酸（例えば、ドナー）もこれらのベクターによって送達することができる。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターはいずれも、１つもしくは複数のＤＮＡ結合性タンパク質をコードする配列および／または必要に応じて追加的な核酸を含み得ることが明らかになろう。したがって、本明細書に記載の１つまたは複数のＤＮＡ結合性タンパク質、および必要に応じて追加的なＤＮＡを細胞に導入する場合、これらを同じベクターで運ぶこともでき、異なるベクターで運ぶこともできる。多数のベクターを使用する場合、各ベクターが、１つまたは多数のＤＮＡ結合性タンパク質および所望の追加的な核酸をコードする配列を含んでよい。
操作されたＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するため、ならびに所望の追加的なヌクレオチド配列を共導入するために、従来のウイルスに基づく遺伝子移入法およびウイルスに基づくものではない遺伝子移入法を使用することができる。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞に核酸（例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質および／またはドナーをコードする）を投与するために使用することもできる。ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療への使用のために核酸を投与する。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソーム、脂質ナノ粒子またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、エピソーム性または細胞への送達後に組み込まれるゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３ （１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７ （１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６ （１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０ （１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４ （１９８８）；Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６ （１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４ （１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ．） （１９９５）； およびＹｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６ （１９９４）を参照されたい。
核酸の非ウイルス性送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、微量注射、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、および作用物質により増強されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションを核酸の送達のために使用することもできる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸をｍＲＮＡとして送達する。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させるために、キャップ形成されたｍＲＮＡを使用することも好ましい。ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ））キャップまたはそのバリアントが特に好ましい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。
追加的な例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃにより提供されるものが挙げられる（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６、ＵＳ４，９４６，７８７；およびＵＳ４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞への送達（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織への送達（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）であり得る。
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０ （１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１−２９７ （１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２−３８９ （１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７−６５４ （１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２ （１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７−４８２０ （１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体によりＥＤＶが標的細胞表面に運ばれ、次いで、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞内に入ったら、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７） ｐ． ６４３を参照されたい）。
操作されたＤＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸、および／または所望のドナー（例えば、ＣＡＲまたはＡＣＴＲ）を送達するための、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用では、体内の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与することもでき（ｉｎ ｖｉｖｏ）、ウイルスベクターを使用して細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで処理することができ、改変された細胞を患者に投与する（ｅｘ ｖｉｖｏ）。核酸を送達するための従来のウイルスに基づく系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子移入法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされる。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み入れ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非***細胞に形質導入または感染することができ、一般には高ウイルス力価を生じさせるレトロウイルスベクターである。レトロウイルスによる遺伝子移入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復で構成される。最小のシス作用性ＬＴＲがベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、これらを、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子発現をもたらすために使用する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびこれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１−２７３９ （１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５−１６４０ （１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８−５９ （１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４−２３７８ （１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０−２２２４ （１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターでは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、また、細胞***が必要ない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で多量に作出することができる。また、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入する（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７ （１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１ （１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１ （１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０ （１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１ （１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０ （１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２−３８２８ （１９８９）を含めたいくつかの刊行物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクター手法が臨床試験における遺伝子移入のために現在利用可能であり、これらは、欠陥ベクターを、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって補完して形質導入剤を生成することを伴う手法を利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５ （１９９５）；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：１０１７−１０２ （１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：２２ １２１３３−１２１３８ （１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０ （１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターに関して５０％またはそれよりも高い形質導入効率が観察されている（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４（１）：１０−２０ （１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：１１１−２ （１９９７））。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。ベクターは全て、導入遺伝子発現カセットを挟むＡＡＶ １４５ｂｐ末端逆位配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達がこのベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３ （１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８−５５ （１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含めた他のＡＡＶ血清型ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのシュードタイピングされたＡＡＶを本発明に従って使用することもできる。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で作出することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。大多数のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子によりＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子が置き換えられるように操作される；その後、複製欠陥性ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において繁殖させる。Ａｄベクターにより、肝臓、腎臓および筋肉において見いだされるものなどの非***性の分化細胞を含めた多数の型の組織にｉｎ ｖｉｖｏにおいて形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬容量を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例では、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療が伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−９ （１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０ （１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７ １０８３−１０８９ （１９９８）；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２０５−１８ （１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５９７−６１３ （１９９７）；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：５０７−５１３ （１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１０８３−１０８９ （１９９８）が挙げられる。
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するためにパッケージング細胞を使用する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、一般には、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は発現させるタンパク質をコードする発現カセットで置き換える。欠如したウイルスの機能はパッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、一般には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡを、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびキャップをコードするヘルパープラスミドを含有するがＩＴＲ配列を欠く細胞株にパッケージングにする。細胞株にヘルパーとしてアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスにより、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現が促進される。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠くので有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスのコンタミネーションは、例えば、アデノウイルスの感受性がＡＡＶよりも高い加熱処理によって低減することができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して製造することができる（例えば、米国特許第６，７２３，５５１号および同第７，２７１，００２号を参照されたい）。
２９３またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、一般には、ウイルスを産生する細胞の成長、その後、細胞の上清からのウイルス粒子の収集または細胞の溶解と粗溶解物からのウイルスの収集を伴う。次いで、ＡＡＶを、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、米国特許第７，４１９，８１７号および同第６，９８９，２６４号を参照されたい）、イオン交換クロマトグラフィーとＣｓＣｌ密度遠心分離（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、イムノアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＷＯ２０１６１２８４０８）またはＡＶＢセファロースを使用した精製（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含めた当技術分野で公知の方法によって精製する。
多くの遺伝子治療の適用では、遺伝子治療ベクターが高い程度の特異性で特定の組織型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、リガンドをウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１ （１９９５））では、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告されている。この原理を、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージを、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作することができる。上記の説明は主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを、特定の標的細胞による取り込みに有利な特定の取り込み配列を含有するように操作することができる。
遺伝子治療ベクターは、個々の患者に、下記の通り、一般には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所的適用によって投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または普遍的なドナー造血幹細胞などの細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達することができ、その後、通常はベクターが組み入れられた細胞を選択した後、細胞を患者に再度埋め込む。
診断、研究、移植のため、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物体への再注入による）のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションは当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞を対象の生物体から単離し、ＤＮＡ結合性タンパク質の核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、対象の生物体（例えば、患者）に再注入する。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適した種々の細胞型が当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ （３ｒｄ ｅｄ． １９９４））およびどのように細胞を患者から単離し、培養するかの考察に関してそこで引用されている参考文献を参照されたい）。
一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏ手順に幹細胞を使用する。幹細胞を使用することの利点は、幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて他の細胞型に分化させることもでき、哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入することもでき、そこで幹細胞が骨髄に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）を参照されたい）。
公知の方法を使用して幹細胞を形質導入および分化のために単離する。例えば、骨髄細胞をＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの望ましくない細胞に結合する抗体でパニングすることによって骨髄細胞から幹細胞を単離する（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）を参照されたい）。
一部の実施形態では、改変された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対して抵抗性にした神経幹細胞であって、本発明のＺＦＰ ＴＦも含有する幹細胞を治療用組成物として使用することができる。アポトーシスに対する抵抗性は、例えば、幹細胞またはさらに例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを使用してカスパーゼを破壊した幹細胞においてＢＡＸおよび／またはＢＡＫをＢＡＸ特異的ＺＦＮまたはＢＡＫ特異的ＺＦＮを使用してノックアウトすることによって生じさせることができる（米国特許出願公開第２０１００００３７５６号を参照されたい）。これらの細胞に、ＴＣＲを制御することが公知であるＺＦＰ ＴＦをトランスフェクトすることができる。
治療用ＤＮＡ結合性タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）をｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞の形質導入のために生物体に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションを含めた、分子を導入し、最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のいずれかによるものである。そのような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、また、特定の組成物を投与するために１つよりも多くの経路を使用することができるが、多くの場合、特定の経路により、別の経路よりも早急かつ有効な反応がもたらされ得る。
ＤＮＡを造血幹細胞に導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号において開示されている。導入遺伝子を造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞に導入するのに有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するのに適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物の投与に使用される特定の方法によって一部決定される。したがって、下記の通り、利用可能な多種多様な適切な医薬組成物の製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８９を参照されたい）。
上記の通り、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌の細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞ならびに任意の型のＴ細胞および幹細胞を含めたヒト細胞を含めた任意の細胞型において使用することができる。タンパク質発現のための適切な細胞株は、当業者に公知であり、それらとして、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。これらの細胞株の後代、バリアントおよび誘導体を使用することもできる。
適用
開示された組成物および方法は、これらに限定されないが、治療および研究への適用を含めた、細胞上の特異的な表面抗原に応答するＴ細胞（武装されたＴ細胞）を生成することが望まれるあらゆる適用のために使用することができる。
例えば、開示された組成物をｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏ（細胞療法）で使用して、養子細胞療法のために１つまたは複数の外因性ＣＡＲ、外因性ＴＣＲ、または他のがん特異的受容体分子を発現するように改変されたＴ細胞における機能的内因性ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ複合体の発現を破壊し、それにより、がんを処置および／または防止することができる。さらに、そのような状況では、細胞内の機能的ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現の抑止を排除すること、または健康な非標的化組織（すなわち、移植片対宿主応答）との望ましくない交差反応のリスクを実質的に低下させることができる。さらに、細胞が改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現するように改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を含めることにより、宿主ＮＫ細胞による死滅の回避を助けることができる。したがって、ＣＡＲを必要に応じて改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体と共に含む普遍的なドナーＴ細胞を生成することができ、したがって、これらの普遍的な細胞を、それを必要とするあらゆる患者にもたらすことができる。
さらに、操作された、ＣＡＲを含むＴ細胞は、養子細胞療法に有用であり得る追加的な導入遺伝子を含み得る。例えば、これらの細胞は、自殺遺伝子の発現が活性化されると操作されたＴ細胞のアポトーシスを引き起こすように外因性シグナルによって制御される自殺遺伝子を含み得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １０： ５３）。ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌの過剰発現もＣＡＲ−Ｔの効力に有益であることが示されている（Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ （２０１５） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２３： ７６９−７８を参照されたい）。現在、いくつかのグループにより、ＩＬ−１２分泌とＣＡＲ発現を組み合わせた「第４世代」ＣＡＲ Ｔ細胞が考案されている。Ｋｏｎｅｒｕ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２０１５）； ４： ｅ９９４４４６）は、いわゆる「普遍的なサイトカイン媒介性死滅に向け直されたＴ細胞」（ＴＲＵＣＫ）を使用して直向性卵巣腫瘍移植モデルにおける卵巣がんを処置した。
他の導入遺伝子は、他の目的の抗原または改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇを発現する導入遺伝子に特異的である追加的なＣＡＲ配列を含み得る。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の養子移入には進行したＢ細胞悪性腫瘍に対する注目すべき治癒的潜在性があることが示されているが、多数の試験により、ＣＤ１９陰性白血病細胞の出現に起因する患者の再発が報告されている。したがって、一方がＣＤ１９に対して特異的であり、他方がＣＤ２０に特異的である２つのＣＡＲを使用し、かつ、必要に応じて、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現させることにより、再発を防止することができる。さらに、２つの別々のＣＡＲ構築物を使用するのではなく、ＣＡＲ導入遺伝子自体に、ＣＤ１９とＣＤ２０の両方を認識することができる二重特異性ＣＡＲをコードさせることができる（Ｚａｈ ｅｔ ａｌ （２０１６） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ， ４ （６）： ４９８−５０８）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲで武装し、必要に応じて、改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を含むＴ細胞には、Ｂ細胞リンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍ならびにＡＬＬ、ＡＭＬおよびＮＨＬなどの他の血液がんを処置するための治療的使用の可能性がある（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒａｃｉｌａ （１９９５） Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． １８ （５−６）： ３８５−９７）。ＣＡＲで武装されたＴ細胞を使用して標的化することができる他のがんとしては、悪性神経膠腫（臨床試験識別子：ＮＣＴ０１４５４５９６を参照されたい）、頭頸部の扁平上皮細胞がん（ＳＣＣＨＮ）（臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８１８３２３を参照されたい）、神経芽細胞腫（臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８２２６５２を参照されたい）、悪性胸膜中皮腫（臨床試験識別子：ＮＣＴ０１７２２１４９を参照されたい）、進行した肉腫（臨床試験識別子：ＮＣＴ００９０２０４４を参照されたい）、腎癌（Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， （２０１４） Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２０ （２）： １５１−１５５）が挙げられる。したがって、本明細書に記載の組成物および方法は、これらに限定されないが、卵巣がん、脳がん、前立腺がん、肝がん、腎がん、白血病、リンパ腫、脊髄がんおよびＣＮＳなどを含めた任意のがんを処置するために使用することができる。
ＣＡＲを用いて潜在的に標的化するための治療的価値がある他の抗原としては、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合性抗体、葉酸受容体ＦＲ−α、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３、ＦＡＰ、ＭＥＴ、Ｉｇκ、ＩＬ−１ＲＡＰ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＲＯＲ１、ＦＲ−ａ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ−１３Ｒａ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、ｃ−ＭＥＴ、ＣＤ１３３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、αＶβ３およびα５β１ インテグリン、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１６Ｖ、ＣＴＬＡ４、およびエナシンなどの腫瘍細胞に関連するまたはがん関連プロセスに関連する他の抗原が挙げられる。
本明細書に開示される方法および組成物の他の潜在的適用としては、他の目的の遺伝子をモジュレートすることなどの追加的な工学的操作方法が挙げられる。これらの他の遺伝子としては、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４などのチェックポイント阻害遺伝子が挙げられ、ここで、これらの遺伝子のノックアウトにより、Ｔ細胞応答の腫瘍媒介性抑制を防止することができる。さらに、目的のＣＡＲのＴＣＲ関連遺伝子への挿入を含むＴ細胞をさらに操作してＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトすることができ、Ｂ２Ｍ遺伝子に組み込まれたＣＡＲを含むＴ細胞をさらに操作して、ＴＣＲ関連遺伝子をノックアウトすることができる。これらの改変Ｔ細胞には改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体も含めることができ、したがって、操作されたＴ細胞は、宿主ＮＫ細胞による死滅を回避することができる。これらの追加的な突然変異は、「既製の」適用のための普遍的なＴ細胞の創出に有用であり得る。
方法および組成物は、幹細胞組成物も含み、ここで、幹細胞内のＴＣＲＡ遺伝子および／またはＴＣＲＢ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子がモジュレート（改変）されており、当該細胞は、１つまたは複数のＣＡＲをさらに含む。例えば、ＴＣＲノックアウトまたはノックダウンによりモジュレートされた同種異系造血幹細胞をＨＬＡ適合患者に骨髄アブレーション後に導入することができる。これらの変更されたＣＡＲを含むＨＳＣにより、患者の再コロニー形成が可能になるが、潜在的なＧｖＨＤは引き起こされない。導入される細胞はまた、根源の疾患を処置するためのその後の治療中に役立つ他の変更（例えば、化学療法抵抗性）も有してよい。改変されたＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を必要に応じて含むＴＣＲおよび／またはＨＬＡヌル細胞は外傷患者の緊急治療室の状況での「既製の」治療として使用することもできる。
本発明の方法および組成物は、ＴＣＲおよび関連する障害のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば、動物モデルの設計およびインプリメンテーションのためにも有用であり、これにより、これらの障害の研究が可能になる。
本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示は明瞭さおよび理解のために例証および例としてある程度詳細に提示されているが、本開示の主旨または範囲から逸脱することなく種々の変化および改変を実施できることが当業者には明らかになるであろう。したがって、前述の開示および以下の実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。特に、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合性ドメインを用いて例示しているが、これらに限定されないが、ＴＡＬ−エフェクタードメインＤＮＡ結合性ドメイン、ｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のもの）および／またはＴｔａｇｏ ＤＮＡ結合性ドメイン、下に例示されている標的部位の１２〜２５ヌクレオチドに結合する任意のＤＮＡ結合性ドメインを含めた任意のＤＮＡ結合性ドメインを標的化改変のために使用することができる。
（実施例１）
ヌクレアーゼの設計
ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ、Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮ、ＣＩＳＨ特異的ＺＦＮ、ＰＤ１特異的ＺＦＮ、ＣＴＬＡ−４およびＨＰＲＴ特異的ＺＦＮを、基本的にＵｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５ （７０４２）： ６４６−６５１， Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｎｏｖ； ２５ （１１）： １２９８−３０６、および米国特許出願公開第２０１５０１６４９５４号、同第２０１４０３０１９９０号および米国特許第８，５６３，３１４号、同第８，９５６，８２８号、同第９，４０２，８７９号および同第９，５９７，３５７号；ならびに米国特許出願第６２／５８３，７２４号に記載されている通り、二本鎖ＤＮＡ切断の部位特異的導入が可能になるように設計し、構築した。これらの遺伝子および他の遺伝子の結合および改変のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡに関しては米国特許第９，８７３，８９４号も参照されたい。さらに、例示的なＺＦＮ対の認識ヘリックスならびに標的配列は以下の表１に示されている。ジンクフィンガー設計の標的部位が最初の列に示されている。ＺＦＰ認識ヘリックスによって標的化される標的部位内のヌクレオチドが大文字で示されており、非標的化ヌクレオチドが小文字で示されている。ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮに関しては、米国特許出願第１６／００９，９７５号も参照されたい。Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮに関しては、米国特許出願公開第２０１７０１７３０８０号も参照されたい。ＣＩＳＨ特異的ＺＦＮに関しては、米国仮特許出願第６２／５８３，７２４号を参照されたい。
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインを接合するために使用するリンカーも示されている（米国特許出願公開第２０１５０１３２２６９号を参照されたい）。例えば、ドメインリンカーＬ０のアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合性ドメイン−ＱＬＶＫＳ−ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（配列番号５）である。同様に、ドメインリンカーＮ７ａのアミノ酸配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン−ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ−ＤＮＡ結合性ドメイン（配列番号３７）であり、Ｎ７ｃは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン−ＳＧＡＩＲＣＨＤＥＦＷＦ−ＤＮＡ結合性ドメイン（配列番号３８）である。適切な場合には、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号に記載されているジンクフィンガー骨格に対する改変も示されている。表１に使用されている表示法では、「Ｑｍ５」は、示されているフィンガーのマイナス５位（−１〜＋６の番号が付されたヘリックスに対して）において、この位置のアルギニンがグルタミン（Ｑ）に置き換えられていることを意味し、「Ｑｍ１４」は、マイナス１４位に通常存在するアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）で置き換えられていることを意味する。ｎＱｍ５における「ｎ」という略語は、突然変異が、５または６フィンガータンパク質を築くのに使用された２つのフィンガーモジュールのＮ末端フィンガーに存在することを意味する。「なし」は、認識ヘリックス領域外に変化がないことを示す。
全てのＺＦＮを試験し、それらの標的部位に結合することが見いだされ、ヌクレアーゼとして活性であることが見いだされた。
本明細書に記載のＺＦＰは、ジンクフィンガータンパク質のリン酸接触残基および／またはＦｏｋＩドメインに対する１つまたは複数の突然変異、例えば、米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号に記載されているｎＲ−５Ｑａｂｃ突然変異体（ＺＦＰ骨格に対するもの）および／またはＲ４１６Ｓおよび／またはＫ５２５Ｓ突然変異体（ＦｏｋＩに対するもの）も含み得る。例えば、ＺＦＮ ＳＢＳ＃６８８１２およびＳＢＳ＃６８８１３はどちらも、ＤＮＡ骨格との非特異的リン酸接触を低減するためにＺＦＰ骨格およびＦｏｋＩドメインに突然変異を含み、当該突然変異は表１に示されている。
したがって、本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰを含むヌクレアーゼ）は、それらの標的部位に結合し、ＴＣＲＡ遺伝子を切断し、それにより、配列番号１〜２のいずれかを含むＴＣＲＡ遺伝子内に遺伝子改変を、これらの配列のいずれか内および／もしくはそれに隣接した（例えば、配列番号１〜２のいずれかに示されている標的配列；および／もしくは対の標的部位の間）改変（挿入および／もしくは欠失）ならびに／またはエクソン２のＴＴＧＡＡＡ内の改変を含め、生じさせる。本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰを含むヌクレアーゼ）は、それらの標的部位に結合し、Ｂ２Ｍ遺伝子を切断し、それにより、配列番号３〜４のいずれかを含むＢ２Ｍ遺伝子内に遺伝子改変を、これらの配列のいずれか内および／もしくはそれに隣接した（例えば、配列番号３〜４のいずれかに示されている標的配列；および／もしくは対の標的部位の間）改変（挿入および／もしくは欠失）ならびに／またはエクソン１のＧＣＣＴＴＡ内の改変を含め、生じさせる。本明細書に記載のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰを含むヌクレアーゼ）は、それらの標的部位に結合し、ＨＰＲＴ遺伝子を切断し、それにより、配列番号５〜６のいずれかを含むＨＰＲＴ遺伝子内の遺伝子改変（例えば、ＣＡＲをコードする導入遺伝子の挿入）を、これらの配列のいずれか内および／もしくはそれに隣接した（例えば、配列番号５または６のいずれかに示されている標的配列；および／もしくは対の標的部位の間）改変（挿入および／もしくは欠失）、ならびに／または、導入遺伝子が内因性ＨＰＲＴプロモーターから発現される（しかしＨＰＲＴ遺伝子は発現されない）改変を含めたイントロン１内の改変を含め、生じさせる。図１を参照されたい。
さらに、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＺＦＰ）は全てそれらの標的部位に結合し、これらの標的部位（表１に示されている１２またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さの標的配列である標的部位）を認識するＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓＲＮＡ ＤＮＡ結合性ドメインをまた、１つまたは複数の転写制御ドメインと関連する場合、活性な操作された転写因子内に製剤化した。
（実施例２）
ＣＤ１９を有するＫ５６２細胞の構築
簡単に述べると、正常なＫ５６２細胞を、１０％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ培地で培養し、次いで、Ａｍａｘａエレクトロポレーションデバイスにおいて、５０μｇ／ｍＬの、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動されるヒトＣＤ１９発現カセット（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９３０、コドン最適化されたもの）およびＨＰＲＴ遺伝子内のＺＦＮカット部位を挟む相同アームを含有するプラスミドに加えて、４０μｇ／ｍＬの、ヒトＨＰＲＴ遺伝子のイントロン１を標的とするＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ（３７７０６／４８４０７）をコードするｍＲＮＡの存在下でエレクトロポレーションを行った。細胞を、エレクトロポレーション後培地中で終夜回復させ、次いで、６−チオグアニン（６−ＴＧ）を６μＭの濃度で添加し、細胞を２７日間培養した。ＣＤ１９発現を評価するために、細胞を、ヒトＣＤ１９細胞外ドメインを標的とする、ＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲートした抗体で染色した。陰性対照として、改変されていない（「ナイーブな」）Ｋ５６２を同様に培養し、染色した。結果（図２）から、ＣＤ１９導入遺伝子を受けた細胞のみが抗体で染色されたことが示される。
（実施例３）
ＣＤ１９−ＣＡＲ Ｔ細胞による抗原特異的細胞死滅
次に、ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットのいずれか（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ （２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２ （７）： ６８９−７０２）がＴＣＲＡ遺伝子座またはＢ２Ｍ遺伝子座に標的化挿入された細胞を生成するために実験を実施した。ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ対ＳＢＳ＃５５２６６／ＳＢＳ＃５３８５３またはＢ２Ｍ対ＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１（全て表１に示されている）をｍＲＮＡとして、相同性指向標的化挿入を可能にするためにＴＲＡＣまたはＢ２Ｍ切断遺伝子座に対する相同アームに挟まれた導入遺伝子発現カセット（ＧＦＰまたはＣＤ１９−ＣＡＲ）をコードするＡＡＶ６ベクターと一緒に、Ｔ細胞またはＫ５６２細胞にエレクトロポレーションによって導入した。
簡単に述べると、１：１の比のＣＤ４：ＣＤ８ヒトＴ細胞を解凍し、ＣＤ３／２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用い（細胞：ビーズ比１：３）、Ｘ−ｖｉｖｏ１５ Ｔ細胞培養培地中で活性化させた（０日目）。３日間培養した後（３日目）、細胞を、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション緩衝剤中、ＺＦＮ ｍＲＮＡ（ＴＣＲＡまたはＢ２Ｍ ＺＦＮ）の存在下で１ｍＬ当たり細胞３×１０７個まで濃縮し、Ｍａｘｃｙｔｅデバイスを使用してエレクトロポレーションした。次いで、濃縮され、エレクトロポレーションされた細胞を組織培養ウェルに入れ、濃縮された細胞に、導入遺伝子ドナーを含むＡＡＶ６ベクターを対応する遺伝子座様式で添加した（例えば、ＴＣＲＡ相同アームを有するＡＡＶ６ドナーベクターをＴＣＲＡ ＺＦＮで処理した細胞に添加した）。導入遺伝子発現カセットは、切断部位特異的（ＴＣＲＡまたはＢ２Ｍ）相同アーム（ＨＡ）、ｈＰＧＫプロモーターにより駆動される導入遺伝子（ＧＦＰまたはＣＤ１９ ＣＡＲのいずれか）、およびＢＧＨポリＡ配列で構成された。ＡＡＶ６ベクターの添加後、細胞を３７℃で２０分にわたって回復させた。次いで、細胞を培養培地中に１ｍＬ当たり細胞３×１０６個まで希釈し、３０℃で終夜培養した（米国特許出願公開第２０１７０１３７８４５号を参照されたい）。翌朝、細胞を追加的な培養培地中に１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈した。以下のＺＦＮとドナーの組合せを含む細胞集団を作製した：
（ａ）移入なし：ＺＦＮ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションもＡＡＶ６ドナーの添加もしていない細胞；
（ｂ）Ｂ２Ｍ ＺＦＮ ｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ドナーは添加していない細胞；
（ｃ）ＴＣＲＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡのみをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ドナーは添加していない細胞；
（ｄ）Ｂ２Ｍ ＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ Ｂ２Ｍ ＨＡ；ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＢＧＨポリＡドナーを添加した細胞；
（ｅ）ＴＣＲＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ ＴＣＲＡ ＨＡ；ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＢＧＨポリＡドナーを添加した細胞；
（ｆ）Ｂ２Ｍ ＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ Ｂ２Ｍ ＨＡ；ｈＰＧＫ−ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ（ＣＤ１９ ＣＡＲ）−ＢＧＨポリＡドナーを添加した細胞；
（ｅ）ＴＣＲＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ ＴＣＲＡ ＨＡ；ｈＰＧＫ−ＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ（ＣＤ１９ ＣＡＲ）−ＢＧＨポリＡドナーを添加した細胞。
上記の通り、上の略語は以下を指す：ＨＡ＝相同アーム；Ｂ２Ｍ＝Ｂ２Ｍ遺伝子；ＰＧＫ＝ＰＧＫプロモーター；ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリＡ配列；ＦＭＣ６３は、ＮＣＩからの抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列である（米国特許第９，７０１，７５８号を参照されたい）；ＣＤ８ＢＢＺは、ＣＡＲのｓｃＦｖ以外の部分を指す＝ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン（ＣＤ８）、４１ＢＢ遺伝子由来の共刺激ドメイン（ＢＢ）、ＣＤ３ｚ遺伝子由来の活性化ドメイン（Ｚ）。
全ての実験を、エレクトロポレーション中の細胞密度１ｍｌ当たり細胞３×１０７個で行った。翌日（４日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈し、３７℃の培養に移した。３日後（７日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで再度希釈した。培養下に置いてさらに３日後、および７日後（それぞれ１０日目および１４日目）に、細胞をＦＡＣＳＭｉＳｅｑ解析のために回収した（１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈した）。データを以下の表２に示す。
次に、機能活性を測定した。まず、実施例２からのＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞と混合したナイーブなＫ５６２細胞を使用して５０：５０混合物を作製した。この混合物を、トランスフェクトしていないＴ細胞またはＴＣＲＡノックアウトＴ細胞のいずれかで処理した。図３に結果が示されており、図３Ａ〜３Ｃは、ナイーブなＴ細胞で処理した、またはＴＣＲＡノックアウトＴ細胞で処理した混合物単独を示す。細胞をＣＤ１９特異的抗体で染色し、Ｋ５６２細胞の集団はいずれも、添加されたＴ細胞による影響を受けなかった。
次に、標的細胞の同様の５０：５０混合物を、Ｂ２Ｍ遺伝子座またはＴＣＲＡ遺伝子座のいずれかに挿入された、ＣＡＲ導入遺伝子を担持するＴ細胞で処理した。ナイーブなＫ５６２標的およびＣＤ１９＋Ｋ５６２標的の集団を２：１エフェクター：標的から０．１２５エフェクター：標的までの様々なエフェクター：標的細胞比で処理した。結果から、ＣＡＲのＢ２Ｍ遺伝子またはＴＣＲＡ遺伝子のいずれへの挿入でも、機能的ＣＡＲの発現がもたらされることが示された（４Ａと４Ｂを比較されたい）。どちらのＣＡＲ−Ｔ細胞集団についても、エフェクター：標的比２：１でＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞のほぼ全てが死滅した（それぞれ０．４％および０．１％のＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子またはＴＣＲＡ遺伝子にＣＡＲが挿入されたＴ細胞での処理後に残存した）。
最後に、エフェクター：標的細胞比に応じた残存するＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞のパーセントのプロットを作成し（図５）、これにより、どちらの型のＣＡＲ−Ｔ細胞も、標的化された抗原を発現する細胞の死滅に関して活性かつ有効であることが実証される。
第２の実験を上記の通り行い、ここで、実験条件は、細胞をＴＣＲＡおよびＢ２Ｍの両方に特異的なＺＦＮ対で処理したこと（２重ノックアウト）およびＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子ドナーがＴＣＲＡ特異的相同アームを含んだこと以外は同じであった。データを以下の表３、および図６に示す。
第３の実験を上記の通り行い、ここでは、ＴＲＡＣ特異的ヌクレアーゼで処理したＴ細胞の遺伝子型および表現型も、様々な用量のＴＲＡＣヌクレアーゼの投与後に評価した。図７および表４に示されている通り、ヌクレアーゼ媒介性ＴＲＡＣ改変により、ＴＲＡＣノックアウト遺伝子型（ＴＲＡＣインデル）および表現型（ＣＤ３陰性）を有する細胞が＞９５％でもたらされた。
さらに、図８に示されている通り、ＦＡＣＳ解析により、ＴＲＡＣのヌクレアーゼ媒介性不活化（ノックアウト）により、選択を伴わずに少なくとも９９．５％の表面ＴＣＲ（ＣＤ３）の消失が一貫して実現されることが示された。同様に、図９に示されている通り、ＴＲＡＣ（左側のパネル）またはＢ２Ｍ（右側のパネル）にこれらの遺伝子の特異的なヌクレアーゼによる切断によって組み込まれた導入遺伝子（ＧＦＰ）により、ＦＡＣＳ解析によって決定された通り高度に効率的な導入遺伝子発現がもたらされた（ＴＲＡＣでは９３％およびＢ２Ｍでは９１％）。この実験では、ドナーの不在下で、細胞の９３％がＴＲＡＣ遺伝子座およびＢ２Ｍ遺伝子座の両方でノックアウトが起こった。
健康なドナーＴ細胞をまた、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍヌクレアーゼ（これらの遺伝子を不活化するため）と、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするＣＡＲ（ＣＤ１９）導入遺伝子（相同アーム）を含むＡＡＶドナーを組み合わせて単一のステップで処理した（ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍならびにドナーを同時投与した）。図１０に示されている通り、高度に効率的なＣＡＲ発現（細胞の＞７５％）およびＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍノックアウト（それぞれ＞９４％および＞８８％）が単一の編集ステップで実現された。
第４の実験のセットを行って、ＧＦＰドナーおよび／またはＣＤ１９ ＣＡＲの挿入と組み合わせて、Ｔ細胞における多数の遺伝子座の「マルチプレックス」ノックアウトの効率を評価した。第１の実験では、ＴＲＡＣ（ＳＢＳ６８８１２／ＳＢＳ６８８１３を使用する）およびＢ２Ｍ（ＳＢＳ５７０７１／ＳＢＳ５７５３１を使用する）における切断による２つのドナー導入遺伝子の組込みの効率を試験した。この実験では、ＣＤ１９ ＣＡＲドナーはＴＲＡＣ相同アームを含み、ＡＡＶ形質導入によって細胞に導入された。ＧＦＰドナーはＢ２Ｍ相同アームを含み、同じくＡＡＶ形質導入によって細胞に導入された。
図１１に示されている通り、標的遺伝子は９０％を超える効率で切断され、ドナーを添加した場合、ＧＦＰドナーについては９０％で、およびＣＤ１９ ＣＡＲドナーについては７７％で標的化組込みが起こった。ＣＤ１９ ＣＡＲ組込みの結果は、ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子のみを使用した図１０Ｃに示されている結果と一致した。したがって、切断されたＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＤ１９ ＣＡＲの組込み効率は、切断されたＢ２Ｍ遺伝子座におけるＧＦＰ導入遺伝子の同時組込みによる影響を受けず、逆もまた同じであった。
さらなる実験において、ＳＢＳ６８８１２／ＳＢＳ６８８１３ ＴＲＡＣ試薬およびＳＢＳ５７０７１／ＳＢＳ５７５３１ Ｂ２Ｍ ＺＦＮ試薬を使用した。ＣＩＳＨ遺伝子座（チェックポイント遺伝子、米国仮出願第６２／５８３，７２４号を参照されたい）を標的とするＺＦＮ試薬の第３のセット（ＳＢＳ５９４８８／ＳＢＳ５９４８９）も上の表１に記載の通り使用した。
上記の方法においてＣＩＳＨ特異的試薬をＴＲＡＣ特異的ＺＦＮおよびＢ２Ｍ特異的ＺＦＮと組み合わせて使用した。種々のＺＦＮ対に加えて、細胞をＡＡＶ−ＧＦＰドナーでも処理し、得られたノックアウトおよび組込みデータを図１２Ａに示す。ＴＲＡＣ相同アームを含むＧＦＰドナーおよび多数の異なるヌクレアーゼで処理した細胞について、ノックアウトおよびドナーの組込みデータを以下の表５に示す。前の実験で生じたＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子ドナー効率データ（図１１に示されている）を使用して予想されるＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子座への組込みの効率を推定し、この推定データを図１２Ｂおよび表５に示す。
したがって、本明細書で示されているように、本明細書に記載の方法を使用してＣＡＲ＋改変細胞が高率で得られる。
（実施例４）
細胞をＣＡＲならびに改変ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを発現するように操作すること
ＣＤ１９ ＣＡＲならびに改変ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ複合体を発現する細胞を実施例３に記載されている方法に従って作出した。簡単に述べると、ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ対ＳＢＳ＃５５２６６／ＳＢＳ＃５３８５３またはＢ２Ｍ対ＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１（全て表１に示されている）をｍＲＮＡとして、相同性指向標的化挿入を可能にするためにＴＲＡＣまたはＢ２Ｍ切断遺伝子座のいずれかに対する相同アームに挟まれた導入遺伝子発現カセット（ＧＦＰまたはＣＤ１９−ＣＡＲまたはＣＤ１９−ＨＬＡ−ＥおよびＣＤ１９−ＨＬＡ−Ｇの一方または両方）をコードするＡＡＶ６ベクターと一緒に、Ｔ細胞にエレクトロポレーションによって導入する。
細胞を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現およびＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ発現について、ＦＡＣＳ解析およびこれら２つの細胞表面タンパク質に特異的な標識された抗体を使用して特徴付ける。ＦＡＣＳ解析により、細胞がＣＤ１９特異的ＣＡＲと改変ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ複合体の両方を発現することが実証される。ＣＤ１９特異的ＣＡＲの活性を上記の通り測定し、細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ媒介性死滅できることが見いだされる。細胞をさらにアッセイに供して、当技術分野で公知の方法（例えば、クロムの放出アッセイなど）を使用してＮＫ細胞による細胞の死滅をモニタリングする。ＣＤ１９ ＣＡＲおよび改変ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を含む細胞は、改変ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ複合体を欠く細胞よりもＮＫ媒介性死滅に対して抵抗性である。
ＴＲＡＣ遺伝子座およびＢ２Ｍ遺伝子座のタンパク質コード領域を標的とするＺＦＮ対を使用した（ＴＲＡＣに対してはＳＢＳ＃６８８７７／ＳＢＳ＃６８８７６およびＢ２Ｍに対してはＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１）。簡単に述べると、１：１の比のＣＤ４：ＣＤ８ヒトＴ細胞を解凍し、Ｘ−ｖｉｖｏ１５ Ｔ細胞培養培地中、ＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：３細胞：ビーズ比）を用いて活性化した（０日目）。３日間培養した後（３日目）、細胞を、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション緩衝剤中、ＺＦＮ ｍＲＮＡの存在下で１ｍＬ当たり細胞３×１０７個まで濃縮し、次いで、Ｍａｘｃｙｔｅデバイスを使用してエレクトロポレーションした。次いで、濃縮し、エレクトロポレーションした細胞を組織培養ウェルに入れ、次いで、導入遺伝子ドナーを含有するＡＡＶ６を濃縮された細胞に添加し、それを回復させ、３７℃で２０分インキュベートした。次いで、細胞を培養培地中に１ｍＬ当たり細胞３×１０６個まで希釈し、３０℃で終夜培養した。翌朝、細胞を追加的な培養培地中に１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈した。
以下に群を説明する（全てのＺＦＮをＺＦＮ毎に６０μｇ／ｍＬのｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、ＡＡＶ６ドナーを細胞当たり１×１０５個のウイルスゲノムで添加した）。ＡＡＶ Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合導入遺伝子は、ＰＧＫプロモーターによって駆動され、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合導入遺伝子を発現するＴＲＡＣ相同アームを有するものであった。簡単に述べると、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子は、リーダーシグナルペプチド配列を含むが末端の終止コドンを欠く全長Ｂ２Ｍ遺伝子、その後に（Ｇ４Ｓ）４リンカー、その後にリーダーシグナルペプチドがない全長ＨＬＡ−Ｇ＊０１：０１配列を含む。合成前にＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合カセット全体をコドン最適化した（図１３）。
実験を米国特許出願公開第２０１７０１３７８４５号に記載されているプロトコールを使用し、１ｍＬ当たり細胞３×１０７個の細胞密度で行い、エレクトロポレーション後に３０℃で終夜培養して低温ショック処理した。翌日（４日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈し、３７℃の培養に移した。３日後（７日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで再度希釈した。１０日目に、細胞をＦＡＣＳ解析のために回収した（１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈した）。
ＦＡＣＳ解析に関しては、調査される各細胞表面抗原に特異的な蛍光色素とコンジュゲートした抗体を含有する染色緩衝剤（１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３を伴うＰＢＳ）１００μＬ中で細胞表面染色を実施した。以下の表６に詳述するパネル１またはパネル２仕様に従って抗体カクテルを作製した。いずれかの抗体カクテルに再懸濁させた細胞を暗所で３０分インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターでデータを取得した。
細胞内染色に関しては、細胞をまずＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）溶液１００μＬに再懸濁させ、４℃で２０分インキュベートした。１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で細胞を２回洗浄した後、固定した細胞をいずれかの抗体カクテルに暗所で３０分にわたって再懸濁させた。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液で２回洗浄した後、血球計算器でデータを取得した。
図１４に示されている通り、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質は、内因性Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣ遺伝子座の発現を欠くＴ細胞の細胞内および表面上に明確に発現された。図１４Ａは、ＺＦＮ媒介性ＴＲＡＣ ＫＯにより、表面ＣＤ３発現の９７％の消失が実現され（左側のパネル）、Ｂ２Ｍ ＫＯにより、表面ＨＬＡクラス−Ｉ分子の８１％の消失が実現される（ＨＬＡ−ＡＢＣ、右側のパネル）ことをフローサイトメトリーによって例示する。薄い灰色のピークは、ニセまたは無処理のＴ細胞に対応し、濃い灰色のピークは、ＺＦＮで処理した細胞に対応する。２重ＫＯ Ｔ細胞に上記のＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を発現するＡＡＶ６ドナーによって形質導入した。図１４Ｂおよび１４Ｃは、ＴＲＡＣ遺伝子座への標的化組込みのために融合Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を発現するＡＡＶ６ドナーを形質導入した２重ＫＯ Ｔ細胞における上首尾のＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇの発現を例示する。具体的には、ＨＬＡ−ＧはＴ細胞上に天然には発現されないので、１４Ｂおよび１４Ｃにおける明確なＨＬＡ−Ｇの濃い灰色のピークから、細胞内および細胞表面上の両方における明確なＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子の組込みおよびその発現が実証された（左側のパネル）。薄い灰色のピークは、ＣＤ３およびＢ２Ｍについて２重ＫＯであるがＡＡＶドナーで形質導入されていない細胞に対応する。Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子の発現は、１４Ｂおよび１４Ｃ、右側のパネルにおける明確なＢ２Ｍの薄い灰色のピークによってさらに裏付けられ、ここで、Ｂ２Ｍは、内因性Ｂ２Ｍを欠く細胞へのＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ構築物の組込みに起因して発現され、シグナルが細胞内および細胞表面上の両方で検出される。濃い灰色のピークは、Ｂ２Ｍ発現を欠く細胞である。
したがって、細胞の効率的なヌクレアーゼ媒介性改変が実現された。
（実施例５）
標的化組込み
Ａ．Ｂ２Ｍ
Ｂ２Ｍ遺伝子座のタンパク質コード領域を標的とするＢ２Ｍ標的化ＺＦＮ対ＳＢＳ＃５７０７１／ＳＢＳ＃５７５３１を以下の通り種々のドナー構築物の標的化組込みのために使用した。簡単に述べると、１：１の比のＣＤ４：ＣＤ８ヒトＴ細胞を解凍し、ＩＬ２を含むＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５ Ｔ細胞培養培地中、ＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：３細胞：ビーズ比）で活性化（０日目、Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）した。３日間培養した後（３日目）、細胞を、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション緩衝剤中、ＺＦＮ ｍＲＮＡの存在下で１ｍＬ当たり細胞３×１０７個まで濃縮し、次いで、Ｍａｘｃｙｔｅデバイスを使用してエレクトロポレーションした。次いで、濃縮し、エレクトロポレーションした細胞を組織培養ウェルに入れ、次いで、導入遺伝子ドナーを含有するＡＡＶ６を濃縮された細胞に添加し、それを回復させ、３７℃で２０分インキュベートした。使用したドナー構築物は以下の通りであった：
（１）以下の配列：それぞれサイズが１Ｋｂの相同アーム（Ｂ２Ｍに対するもの）に挟まれたＧＦＰ導入遺伝子に作動可能に連結したＰＧＫプロモーター配列を含む、長い相同アーム（長いアーム）を有するドナー；
（２）以下：それぞれサイズが２５０ｂｐの相同アーム（Ｂ２Ｍに対するもの）に挟まれたＧＦＰ導入遺伝子に作動可能に連結したＰＧＫプロモーター配列を含む、短い相同アーム（短いアーム）を有するドナー；
（３）３’ＵＴＲにＷＰＲＥ配列をさらに含み、ＷＰＲＥ配列が、
を含む（２）のドナー；
（４）ＰＧＫプロモーターの上流に以下：
のＴ細胞エンハンサー配列をさらに含む（２）のドナー；または
（５）以下：
のＴＣＲαエンハンサー配列をさらに含む（２）のドナー；
（６）Ｘｅｎｏｐｕｓベータグロビン遺伝子の５’非翻訳領域からの配列：
をさらに含む（２）のドナー
次いで、細胞を培養培地中に１ｍＬ当たり細胞３×１０６個まで希釈し、３０℃で終夜培養した。
全てのＺＦＮをＺＦＮ毎に６０μｇ／ｍＬのｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、全てのＡＡＶ６ドナーを細胞当たり１×１０５個のウイルスゲノムで添加した。全ての実験を、米国特許出願公開第２０１７０１３７８４５号に記載されているプロトコール（極度の低温ショック）を使用し、１ｍｌ当たり細胞３×１０７個の細胞密度で行い、エレクトロポレーション後に３０℃で終夜培養して低温ショック処理した。
翌日（４日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈し、３７℃の培養に移した。３日後（７日目）、細胞を１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで再度希釈した。培養下に置いてさらに３日後、および７日後（それぞれ１０日目および１４日目）に、細胞をＦＡＣＳＭｉＳｅｑ解析のために回収した（１ｍＬ当たり細胞０．５×１０６個まで希釈した）。
図１５ＡおよびＢに示されている通り、ＧＦＰ発現から、標的組込みが上首尾であり、本明細書に開示される通りＺＦＮ標的部位内にＢ２Ｍゲノム改変（インデルおよびＴＩ）を含む遺伝子改変細胞を得たことが示された。
最も高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、エンハンサーを含有する構築物内に存在し、これは、短い相同アームを含有する標準の構築物と比較して６５％の改善を示した。
Ｂ．ドナーのＢ２Ｍ／ＴＲＡＣ２重ノックアウト細胞への標的化組込み
さらに、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子の組込みを含めた、導入遺伝子が組み込まれたＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ２重ノックアウト（ＤＫＯ）を生成するために、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣ ＺＦＮおよび種々のドナーの両方を使用した実験も上記の通り実施した（１０％ヒト血清およびＩＬ−２を伴うＲＰＭＩを培養培地として使用した以外）。ドナーは、以下の通り、上で図１７および１９の説明において詳細に記載されている：
（１）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー。ドナーは、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＴＩのｍｉｓｅｑによる定量化を可能にする「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。
（２）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを有するドナー。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」を含有しない；
（３）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３５０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム、ならびにその後に突然変異ＷＰＲＥエレメントを含有するドナー。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（４）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（５）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する４２３ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアーム、ならびにその後に突然変異ＷＰＲＥエレメントを含有するドナー。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（６）Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（７）Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する；
（８）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（９）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１０）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０３導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１１）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１２）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、２コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない；ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない；
（１３）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｇ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｇの間のリンカーは、６コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｇは、シグナルペプチドを含有しない；
（１４）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１５）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＨＬＡ−Ｅ０１０３導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１６）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ０１０１の間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｅ０１０１は、シグナルペプチドを含有しない（Ｃｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ， ｉｂｉｄ）；
（１７）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動される連結したＢ２Ｍ ＨＬＡ−Ｅ０１０１導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー。Ｂ２ＭとＨＬＡ−Ｅ０１０１の間のリンカーは、４コピーのＧ４Ｓペプチドを含有する。ＨＬＡ−Ｅ０１０３は、シグナルペプチドを含有しない；
（１８）ｈＰＧＫプロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する１０００ｂｐの左側のアームおよび９９２ｂｐの右側のアームを含有するドナー；
（１９）Ｂ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇを発現する融合タンパク質と自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結したＦＭＣ６３−ＣＤ８ＢＢＺ ＣＡＲ導入遺伝子を挟むＴＲＡＣ Ｅ部位に対する相同性を有する３６０ｂｐの左側のアームおよび３９３ｂｐの右側のアームを含有するドナー。導入遺伝子はｈＰＧＫプロモーターによって駆動され、また、後ろに突然変異ＷＰＲＥエレメントが続く。ドナーは、「ｍｉｓｅｑタグ」も含有する。
示されている例示的なドナーを使用した結果が図１７および１９に示されており、ヌクレアーゼ媒介性標的化組込みによりドナーの導入遺伝子が効率的に組み込まれた。図１８は、図１７に示されている通り、示されている試料のフローサイトメトリーの結果を示す。図２０〜２６は、示されているドナーについての結果を示す（図１９）。
示されている通り、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質も発現するＣＡＲ＋細胞（ＴＣＲ遺伝子を標的とする）を含め、標的化組込みにより、タンパク質発現がもたらされた。
本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示は、理解を明瞭にするために例証および実施例として一部の詳細が提示されているが、本開示の主旨または範囲から逸脱することなく種々の変化および改変を行うことができることが当業者には明らかになろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。

Claims (13)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドならびにベータ２−ミクロ−グロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質とＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含む単離された遺伝子改変Ｔ細胞であって、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体−アルファ（ＴＣＲＡ）遺伝子に組み込まれている、単離された遺伝子改変Ｔ細胞。
  2. 内因性Ｂ２Ｍ遺伝子が不活化されている、請求項１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  3. 免疫チェックポイント遺伝子が不活化されている、請求項１または２に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  4. 前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが、自己切断性Ｐ２Ａペプチドによって連結している、請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  5. 前記第２のポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍをコードする配列とＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇをコードする配列の間のリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  6. 前記リンカーが、１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピーまたは６コピーのＧ４Ｓを含む、請求項４に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
  7. 請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変Ｔ細胞を作製する方法であって、
    前記単離されたＴ細胞内のＴＣＲ−α遺伝子をＴＣＲ−α遺伝子内の標的部位に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含むヌクレアーゼを使用して切断するステップと、
    前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のドナーを前記Ｔ細胞に前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが前記切断されたＴＣＲ−α遺伝子に組み込まれるように導入するステップと
    を含む方法。
  8. 前記ドナーが、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを挟む前記ＴＣＲ−α遺伝子に対する相同アームをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ドナーが、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記ドナーが、ＴＣＲ−αエンハンサー配列をさらに含む、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ドナーが、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）および５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記３’ＵＴＲが、ＷＰＲＥ配列をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記５’ＵＴＲが、Ｘｅｎｏｐｕｓベータグロビン遺伝子由来の配列をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
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