JP2020527274A - 蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
蛍光画像の蛍光強度確定方法であって、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得し、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定し、
前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う、ことを含むことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定方法。
上記技術案によれば、本発明の実施例で提供される蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステムは、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うことで、蛍光画像を取得し、蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことで、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値、最大階調値、平均階調値、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値を算出して、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う。フロークラスタリング分析ソフトウェアに入力するか実行することで分析し、フロー分析法に対応し類似する結果を得ることができる。
このステップにおいて、まず、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して画像クラスフロー蛍光検出を行うことで、ターゲットサンプルの蛍光画像を取得する。
ターゲットサンプルの蛍光画像を得た後、さらに、インテリジェント認識システムを採用して前記蛍光画像に対して画像処理および分析を行うことで、前記蛍光画像に含まれる各細胞(検出ターゲット)の蛍光画像領域を取得してもよく、具体的に、画像処理および分析プロセスにおいて蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことで、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得することが可能である。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、前記累積蛍光階調値は単一検出ターゲットの蛍光画像領域内の全部の画素階調値の合計である。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出して、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、前記最大階調値は、単一検出ターゲットの蛍光画像領域のうち階調値が最も高い画素ドットの階調値である。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出して、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、前記平均階調値は、単一検出ターゲットの蛍光画像領域内の全部の画素ドットの平均値である。
このステップにおいて、各検出ターゲットの明視野画像を取得し、前記明視野画像に対してデータ分析を行うことで、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定する。
このステップにおいて、前記累積階調値を累積蛍光強度値として、前記最大階調値を最大蛍光強度値として、前記平均階調値を平均蛍光強度値として、前記明視野画像領域の直径値を検出ターゲットのサイズ値とし、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値を採用して、フロークラスタリング分析を行うことで、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値の一つまたは複数に対応する蛍光検出波形図を生成し、生成した蛍光検出波形図を、直接に通常のフロー分析法を採用して得られた蛍光検出波形図と比較し、比較結果に従って、フロークラスタリング分析における検出ターゲットのサイズ値を調整することが可能であり、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値の重み値を採用することにより、検出結果が従来の通常のフロー分析法を採用して得られた蛍光検出波形により近くなるようにし、検出結果の正確性を向上させる。
このステップにおいて、まず、蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行って、蛍光画像内の孤立したノイズポイントを除去し、画像のエッジを平滑化し、後続の境界の抽出と確定を容易にする。
このステップにおいて、フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行い、主に、フィルタリングされた蛍光画像に対応する階調画像を利用して、蛍光画像の勾配特徴を算出し、勾配エッジの強弱に従って、背景ターゲットから認識待ち前景ターゲット領域を分離する。
このステップにおいて、ステップS202の前景検出領域に対してターゲット抽出を行い、エッジのトラッキングを利用して、認識待ち前景ターゲット領域を連結領域の属性に従って、一つずつマーキングし、エッジの位置を記録する。
具体的に、このステップにおいて、明視野撮像された明視野画像について、背景ターゲットから前景を分離し、具体的な方法は、明視野画像に対して階調化、輝度均一化、画像強調、二値化操作を行い、背景ターゲットから前景の検出ターゲット画像を抽出し、上記した抽出された前景の検出ターゲット画像は多数凝集する場合などがあるため、複数の検出ターゲット画像が重なり、検出ターゲット画像を分離する必要があり、単一検出ターゲット画像を取得し、単一検出ターゲット画像のエッジを求め、エッジ情報を記録する。
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルの蛍光画像を採集して得て、得られたターゲットサンプルの蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの明視野画像を採集して得ることである。
ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うための顕微鏡蛍光イメージングシステム100と、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得するためのインテリジェント認識システム200と、
データ処理システム300とを含み、
前記データ処理システム300は、第1の算出ユニット310、第2の算出ユニット320、第3の算出ユニット330、第4の算出ユニット340、及びフロークラスタリング分析ユニット350を含み、
前記第1の算出ユニット310は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
前記第2の算出ユニット320は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、
前記第3の算出ユニット330は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
前記第4の算出ユニット340は、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数とし、
前記フロークラスタリング分析ユニット350は、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う。
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行うためのフィルタリングユニットと、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行うための勾配検出ユニットと、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行うための前景抽出ユニットと、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得するための分割ユニットとを含む。
前記インテリジェント認識システム200は、明視野細胞分離システムをさらに含むことができ、前記明視野細胞分離システムは、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離し、明視野画像における各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得するための明視野認識ユニットと、
前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、空であると、蛍光ターゲットに蛍光ターゲット動作をトリガーするためのトリガー信号を出力するための明視野細胞分離ユニットとを含む。
前記インテリジェント認識システム300は、蛍光ターゲット抽出ユニット及び明視野細胞分離システムを含み、本実施例も蛍光ターゲット及び明視野細胞分離システムを含むが、両者の作動タイミングは上記実施例における蛍光ターゲット及び明視野細胞分離システムの作動タイミングと異なり、具体的には、以下の通りである。
本実施例において、前記蛍光ターゲットは、得られた細胞の蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムがターゲットサンプルの明視野画像採集して、前記明視野細胞分離システムにトリガー信号を出力するように制御するための判断ユニットをさらに含む。
Claims (10)
- 蛍光画像の蛍光強度確定方法であって、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得し、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルス値で表される最大蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定し、
前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う、ことを含むことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定方法。 - 前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいてフロークラスタリング分析を行うことは、
予め設定されたマッピングテーブルに従って、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値にそれぞれ対応する累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズを検索し、テーブルを検索して得られた累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値に基づいてフロークラスタリング分析を行うことを含むことを特徴とする請求項1に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。 - 蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことは、
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行い、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行い、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行い、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得することを含むことを特徴とする請求項1に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。 - 前記した顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得することは、具体的に、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像及び明視野画像を採集して得ることであり、前記した蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行う前に、さらに、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離し、明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得し、
蛍光画像を認識し、前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、
前記蛍光画像のうち明視野画像の検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であると、蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行い、後続の操作を実行する、ことを含むことを特徴とする請求項3に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。 - 顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像及び明視野画像を採集して得ることは、具体的に、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像を採集して得て、得られたターゲットサンプルの蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの明視野画像を採集して得ることであることを特徴とする請求項4に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。 - 蛍光画像の蛍光強度確定システムであって、
ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うための顕微鏡蛍光イメージングシステムと、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得するためのインテリジェント認識システムと、
データ処理システムとを含み、
前記データ処理システムは、第1の算出ユニット、第2の算出ユニット、第3の算出ユニット、第4の算出ユニット、及びフロークラスタリング分析ユニットを含み、
前記第1の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
前記第2の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルス値で表される最大蛍光強度値とし、
前記第3の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
前記第4の算出ユニットは、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定し、
前記フロークラスタリング分析ユニットは、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行うことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定システム。 - 前記フロークラスタリング分析ユニットは、具体的に、予め設定されたマッピングテーブルに従って、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値及び明視野の直径値にそれぞれ対応する累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値を検索して、テーブルを検索して得られた累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値に基づいて、フロークラスタリング分析を行うことを特徴とする請求項6に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
- インテリジェント認識システムは、少なくとも蛍光ターゲット抽出ユニットを含み、前記蛍光ターゲット抽出ユニットは、
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行うためのフィルタリングユニットと、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行うための勾配検出ユニットと、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行うための前景抽出ユニットと、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得するための分割ユニットとを含むことを特徴とする請求項1に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。 - 前記顕微鏡蛍光イメージングシステムは、さらに、ターゲットサンプルの明視野画像を採集し、
前記インテリジェント認識システムは、明視野細胞分離システムをさらに含み、前記明視野細胞分離システムは、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離することで、明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得するための明視野認識ユニットと、
前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、空であると、蛍光ターゲットに蛍光ターゲットの動作をトリガーするためのトリガー信号を出力するための明視野細胞分離ユニットとを含むことを特徴とする請求項8に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。 - 前記蛍光ターゲット分離システムは、得られた細胞の蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムがターゲットサンプルの明視野画像を採集して、前記明視野細胞分離システムにトリガー信号を出力するように制御するための判断ユニットをさらに含むことを特徴とする請求項9に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
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