本申请根据35U.S.C.§119要求2011年6月2日提交的美国临时申请No.61/492,617和2011年6月17日提交的美国临时申请No.61/498,266的优先权。两篇临时申请的全部内容以引用的方式整体并入本文。
附图简述
图仅是阐述性的,且对本公开的发明的实施不是所必需的。
图1显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03的尺寸排阻色谱(SEC)分析;
图2显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03的SDS-PAGE分析;
图3显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03的温度稳定性;
图4显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03的pH稳定性;
图5显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03在pH8.3时的稳定性;
图6显示DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03的对化学变性的稳定性;
图7显示pH6时hFcRn与固定的DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03之间的相互作用的动力学分析;
图8显示pH7.5时hFcRn与固定的DX-2504、532A-X53-C02和532A-X54-B03之间的相互作用的动力学分析;
图9显示DX2504(SEQIDNO:8)、532A-X53-C02(SEQIDNO:10)和532A-X54-B03(SEQIDNO:11)的序列。
图10显示抗-hFcRnH-CDR3对Fab-310的长度分布。
图11显示表征所选抗-FcRn结合蛋白的一些特性的两个图表。
图12显示TG32B小鼠中抗-FcRn抗体对hIgG分解代谢的影响。
图13显示施用于猕猴的DX-2504和DX-2507的血清浓度。
图14显示施用DX-2504和DX-2507后猕猴中IgG的水平。
发明详述
本文公开的是能结合人FcRn的分离的抗体和其在检测FcRn存在、调节FcRn活性、调节循环IgGs的半衰期/水平,和/或治疗与IgG异常有关的病症,例如自身免疫病症(例如多发性硬化、类风湿性关节炎、狼疮、免疫性血小板减少症、强直性脊柱炎和天疱疮)和炎性病症例如炎症性肠病中的用途。优选地,这些抗-FcRn抗体可以(a)阻断非特异性人IgG/Fc部分与FcRn-Fc相互作用位点的结合;(b)结合人和大鼠FcRn(可溶性和细胞);(c)pH6时结合FcRn和/或(d)不仅仅结合β2Μ。
在正常情况下,FcRn可延长循环IgG的半衰期。结合FcRn的抗体可用于调节FcRn功能,例如通过阻止其和IgG的相互作用。具体而言,阻断FcRn和IgG相互作用的抗体可用于减少IgG分子的半衰期。
一方面,本公开尤其提供了可用于治疗自身免疫病症并减少循环IgG水平的人拮抗性抗-人FcRn抗体。还公开了高亲和力的可溶性Fabs(sFab),其可通过抗原结合结构域进行结合并阻断IgG-Fc和人FcRn或大鼠FcRn之间的相互作用。
定义
术语“结合蛋白”是指可与靶分子相互作用的蛋白。该术语和“配体”可互换使用。“FcRn-结合蛋白”或“FcRn-结合配体”是指可与FcRn相互作用的蛋白,具体而言包括优先和FcRn例如IgG相互作用的蛋白。
如本文所用,术语“抗体”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白。例如,抗体可包括重(H)链可变区(本文缩写成VH)和轻(L)链可变区(本文缩写成VL)。在另一个实施例中,抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原-结合片段(例如单一的链抗体Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和dAb片段)以及完全抗体(全长抗体)。
VH和VL区能进一步被细分成高度可变区,称为“互补性决定区”("CDR"),穿插有更保守的区域,称为“骨架区”("FR")。已经精确定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat,E.A.,等,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242和Chothia,C.等,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,也参见http://www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文采用Kabat定义。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成,从氨基端至羧基端以下列顺序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列。
如本文所用,术语全长抗体的“抗原-结合片段”(或者简单讲"抗体部分",或"片段")是指保留了特异性结合目标靶的能力的全长抗体的一个或多个片段。涵盖在术语全长抗体的"抗原-结合片段"之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段;(ii)F(ab')2片段,包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546);和(vi)分离的保留功能性的互补性决定区(CDR)。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码,但是可以用重组方法通过合成的接头连接它们,该接头能够使它们成为单一蛋白链,其中VL和VH区配对形成称为单链Fv的单价分子(scFv)。参见Bird等,(1988)Science242:423-426;和Huston等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883。
可用包括本领域的技术人员已知的传统技术的任何适当的技术来获得抗体片段。术语“单特异性抗体”是指对特定靶例如表位显示单一的结合特异性和亲和力的抗体。本术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”,如本文所用,该术语是指制备单分子组合物的抗体或其片段。如本文所用,“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
如本文所用,“结合亲和力”是指表观缔合常数或Ka。Ka是解离常数(Kd)的倒数。例如结合蛋白对特定靶分子可具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11M的结合亲和力。相对于第二靶标,结合配体与第一靶标的更高的亲和结合可通过比结合第二靶标的Ka(或更小数值的Kd)更高的结合第一靶标的Ka(或Kd的数值)来显示。在这些情况下,相对于第二靶标(例如第二构象或其类似物的相同蛋白;或第二蛋白),结合蛋白对第一靶标有特异性(例如第一构象或其类似物的蛋白)。结合亲和力的差异(例如对特异性或其它比较)至少是1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500、1000或105倍。
可以通过各种方法,包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱学(例如使用荧光测定)确定结合亲和力。测定结合亲和力的示例性条件是在pH7.2的30℃的PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水)中。这些技术可以用来测量起结合蛋白(或靶标)浓度功能的结合的和游离的结合蛋白的浓度。通过下列等式,结合的结合蛋白的浓度([结合])与游离的结合蛋白的浓度([游离])和靶标上用于结合蛋白的结合位点的浓度有关,其中(N)是每个靶向分子的结合位点数:
[结合]=N·[游离]/((1/Ka)+[游离]).
尽管并不总是有必要精确确定Ka,因为有时足够获得亲和力的定量测量,例如使用如ELISA或FACS分析的方法来确定,与Ka成比例,因此可以用于比较,比如确定是否如2倍高的更高的亲和力以获得亲和力的定量测量,或者例如通过如体外或体内测定的功能测定的活性以获得对亲和力的推断。
术语“同源配体”是指天然存在的FcRn配体,包括其天然存在的变异体(例如剪接变体、天然存在的突变体和亚型)。
“保守性氨基酸替换”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。很多框架和CDR氨基酸残基可包括一个或多个保守性替换。
生物聚合物的共有序列可包括在各种氨基酸之间发生变化的位置。例如在这样的上下文中符号"X"通常是指任何氨基酸(例如任何二十种天然氨基酸或任何十九种非-半胱氨酸氨基酸)。其它允许的氨基酸也可用例如括号和斜杠来表明。例如"(A/W/F/N/Q)"意指丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺在那个特别的位置也被允许。
“有效人”免疫球蛋白可变区是包括足够数量的人框架氨基酸位置以致在正常人中免疫球蛋白可变区不产生免疫原性反应的免疫球蛋白可变区。"有效人"抗体是包括足够数量的人氨基酸位置以致在正常人中抗体不产生免疫原性反应的抗体。
“表位”是指目标化合物上被结合蛋白结合(例如抗体如Fab或全长抗体)的位点。在目标化合物是蛋白的情况下,该位点可完全由氨基酸组分组成,可完全由蛋白的氨基酸的化学修饰组成(例如糖基部分),或由其组合组成。重叠表位包括至少一种常见的氨基酸残基。
两个序列之间“同源性”或“序列同一性”(本文术语可互换使用)的计算如下进行。为了最佳的比较目的比对序列(例如为了最佳比对,可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位,且非同源序列可以不考虑比较目的)。使用GCG软件包的GAP程序的Blosum62评分矩阵将最佳比对确定为最佳分数,空位罚12分,空位延伸罚4分且移码空位罚5分。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当用与第二个序列相应的位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据第一个序列的位置时,然后在那个位置上分子是相同的(如本文所用,氨基酸或核酸"同一性"等同于氨基酸或核酸"同源性")。两个序列同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。
在一个实施方案中,比对用于比较目的的参考序列的长度是参考序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、80%、90%、92%、95%、97%、98%或100%。例如,参考序列可以是免疫球蛋白可变结构域序列的长度。
“人源化”免疫球蛋白可变区是被修饰的以包括足够数量的人框架氨基酸位置以致在正常人中免疫球蛋白可变区不产生免疫原性反应的免疫球蛋白可变区。“人源化”免疫球蛋的描述包括例如US6,407,213和US5,693,762。
如本文所用,术语“在低严格、中等严格、高严格或极高严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。实施杂交反应的指南可见于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6,其以引用的方式并入。该参考文献中水性的和非水性方法,且可使用任一方法。本文提到的特异性杂交条件如下:(1)在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃的低严格杂交条件下,然后用0.2XSSC、0.1%SDS在至少50℃下洗涤两次(低严格条件洗涤温度可增加到55℃);(2)在6XSSC中在约45℃的中等严格杂交条件下,然后用0.2XSSC、0.1%SDS在60℃下洗涤一次或多次;(3)在6XSSC中在约45℃的高严格杂交条件下,然后用0.2XSSC、0.1%SDS在65℃下洗涤一次或多次;和(4)极高严格杂交条件是0.5M磷酸钠、7%SDS在65℃下,然后用0.2XSSC、0.1%SDS在65℃下洗涤一次或多次。极高严格杂交条件(4)是优选的条件且应该使用该条件,除非另外说明。本公开包括和本文描述的核酸或其互补序列等在低、中等、高或极高严格下杂交的核酸、编码本文描述的结合蛋白的核酸。该核酸可以和引用核酸长度相同或在引用核酸长度的30%、20%,或10%之内。该核酸可对应于编码免疫球蛋白可变结构域序列的区域。
相对于本文描述的结合蛋白(例如保守或非必需氨基酸替换),FcRn结合蛋白可以有突变(例如至少1、2或4个,和/或少于15、10、5或3个),对蛋白功能没有实质影响。例如使用Bowie,等(1990)Science247:1306-1310的方法,无论特殊替换耐受与否,即均不会不利地影响生物性质,例如可预测结合活性。
“免疫球蛋白结构域”是指来自免疫球蛋白分子可变或恒定结构域的结构域。免疫球蛋白结构域通常包含由约七条β-链形成的两个β-折叠和保守的二硫键(参见例如A.F.Williams和A.N.Barclay1988Ann.RevImmunol.6:381-405)。
如本文所用,"免疫球蛋白可变结构域序列"是指能形成例如一个或多个CDR区定位于适合抗原结合位点的构象的免疫球蛋白可变结构域结构的氨基酸序列。例如,序列可包括全部或部分天然存在的可变结构域的氨基酸序列。例如序列可省去一个、两个或多个N-或C-末端氨基酸、内部氨基酸;可包括一个或多个***或另外的末端氨基酸;或可包括其它改变。在一个实施方案中,包括免疫球蛋白可变结构域序列的多肽可结合另一个免疫球蛋白可变结构域序列以形成目标结合结构(或“抗原结合位点”),例如优先和FcRn结构相互作用的结构。
抗体的VH或VL链可进一步包括全部或部分重或轻链恒定区,从而分别形成重链或轻链免疫球蛋白链。在一个实施方案中,抗体是两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的四聚体,其中重和轻免疫球蛋白链之间通过例如二硫键连接。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括CL结构域。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合,包括免疫***的各种细胞(例如,效应细胞)和经典互补***的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(和其亚型)完整的免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链类型有κ或λ。在一个实施方案中,抗体是糖基化的。抗体可对抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性起作用。
抗体的一个或多个区可以是人的或有效人的。例如,一个或多个可变区可以是人的或有效人的。例如,一个或多个CDR可以是人的,如HCCDR1、HCCDR2、HCCDR3、LCCDR1、LCCDR2和LCCDR3。每个轻链CDR可以是人的。HCCDR3可以是人的。一个或多个框架区可以是人的,例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。在一个实施方案中,所有的框架区是人的,例如来源于人体细胞,例如,产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中,人序列是生殖细胞序列,例如,由生殖细胞核酸编码。一个或多个恒定区可以是人的或有效人的。在一个实施方案中,抗体的至少70、75、80、85、90、92、95或98%,或全部抗体可以是人的或有效人的。
抗体的全部或部分可由免疫球蛋白基因或其片段编码。示例性人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KDa或214个氨基酸)由NH2-末端可变区基因(约110个氨基酸)和COOH--末端κ或λ恒定区基因编码。同样地,全长免疫球蛋白“重链”(约50KDa或446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和前述的恒定区基因例如γ(约330个氨基酸)其中的另一个编码。
“分离的组合物”是指从能获得分离的组合物的天然样品中的至少一种组分的至少90%移除的组合物。如果目标物种或种群按重量-重量计为至少5、10、25、50、75、80、90、92、95、98或99%纯的,则人工或天然产生的组合物可以为具有“至少一定纯度的组合物”。
在FcRn或其部分的模拟构象的语境中,术语“模拟”是指相对于天然存在的FcRn或其部分对至少一个特定构象具有偏向的经修饰的FcRn。
“非必需”氨基酸残基是可以改变自结合剂例如抗体的野生型序列的残基而未破坏或未实质性改变生物学活性,然而"必需"氨基酸残基会导致这样的变化。
如本文所用,短语“肠胃外施用”和“经胃肠外施用”意指除肠内和局部施用之外的施用模型,通常经注射,且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。
术语“多肽”或“肽”(可互换使用)是指由肽键连接的三个或多个氨基酸的聚合物,例如长度介于3和30个氨基酸之间、12和60个氨基酸之间,或30和300个氨基酸之间,或超过300个氨基酸。多肽可包括一种或多种非天然氨基酸。通常多肽只包括天然氨基酸。“蛋白质”可包括一条或多条多肽链。因此术语“蛋白质”涵盖多肽。蛋白质或多肽还可包括一种或多种修饰,例如糖基化、酰胺化、磷酸化、亚硝基化,等等。术语"小肽"可用于描述长度介于3和30个氨基酸之间的多肽,例如长度介于8和24个氨基酸之间。
“预防有效量”是指有效量、剂量且有必要长期,以获得期望的预防结果。通常,因为治疗剂量用于疾病之前或者早期的受试者,预防有效量将少于治疗有效量。
如本文所用,本文使用的术语“实质上同一的”(或“实质上同源的”)是指包含足够数量的相同的或等效的(例如有类似侧链,例如保守氨基酸替换)氨基酸残基或核苷酸的第一个氨基酸或核酸序列与第二个氨基酸或核酸序列以使第一个和第二个氨基酸核酸序列具有(或编码蛋白质具有)相似的活性,例如结合活性、结合偏好或生物学活性。就抗体而言,第二抗体相对于相同的抗原具有相同的特异性并且具具有至少50%的亲和力。
与本文公开的序列相似或同源的序列(例如,至少约85%序列同一性)也是本应用的一部分。在一些实施方案中,序列同一性可以是约85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。此外,当核酸片段在所选杂交条件(例如高严格杂交条件)下与互补链杂交时,存在实质同一性。核酸可存在于全部细胞、细胞裂解物或在部分纯化或基本上纯的形式中。
统计显著性可由任何领域已知的方法来确定。示例性统计测验包括:斯氏T检验、MannWhitneyU非参数检验和Wilcoxon非参数统计检验。一些统计显著性关系的P值小于0.05或0.02。特定结合蛋白可例如在特异性或结合方面表现出统计学显著的差异(例如P值<0.05或0.02)。例如表示两种状态间可区别的定性或定量差异的术语“诱导”、“抑制”、“加强”、“提高”、“增加”、“减少”等,可以指例如统计学显著性差异的两种状态间的差异。
相对于未治疗的受试者,“治疗有效量”可将可测量的参数,例如循环IgG抗体的水平调节到统计上显著的程度或调节至少约20%、至少约40%、至少约60%、或至少约80%,。在预测人自身免疫病症功效的动物模型***中可以评估化合物调节可测量的参数例如自身免疫性的能力。可选地,通过检测化合物调节体外参数的能力,例如通过对有经验的从业者已知的测定来评估组合物的这种性质。
本发明的其它特征和优点将通过下列详细描述和权利要求而变得更加明显。本发明的实施方案可包括本文描述的特征的任何组合。术语"实施方案"决不排除本文公开的一个或多个其它特征。
FcRn序列
下列是人FcRnα链氨基酸序列和大鼠FcRnα链氨基酸序列的序列比对。示例性FcRn蛋白可包括这两个序列之一或其片段,例如不具有信号序列的片段:
下列是人β2微球蛋白氨基酸序列和大鼠β2微球蛋白氨基酸序列的序列比对。示例性FcRn蛋白可包括这两序列之一或其片段,例如不具有信号序列的片段:
编码FcRn蛋白α链的示例性核酸序列可包括下列序列:
FcRnα核苷酸序列(智人):
GTTCTTCAGGTACGAGGAGGGCATTGTTGTCAGTCTGGACCGAGCCCGCAGAGCCCCTCCTCGGCGTCCTGGTCCCGGCCGTGCCCGCGGTGTCCCGGGAGGAAGGGGCGGGCCGGGGGTCGGGAGGAGTCACGTGCCCCCTCCCGCCCCAGGTCGTCCTCTCAGCATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCTCTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCGCAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCCTCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTTCTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACAATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCCTGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGAGAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAAGGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAAGGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGGGCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCAAGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATGAATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCCCGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCAGCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTGCTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGCACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGCCCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGCAGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTCCTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCTGCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGACTTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCTCGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACCACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCGCAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAAGTCCTCCGTGCTCGTGGTGGGAATCGTCATCGGTGTCTTGCTACTCACGGCAGCGGCTGTAGGAGGAGCTCTGTTGTGGAGAAGGATGAGGAGTGGGCTGCCAGCCCCTTGGATCTCCCTTCGTGGAGACGACACCGGGGTCCTCCTGCCCACCCCAGGGGAGGCCCAGGATGCTGATTTGAAGGATGTAAATGTGATTCCAGCCACCGCCTGACCATCCGCCATTCCGACTGCTAAAAGCGAATGTAGTCAGGCCCCTTTCATGCTGTGAGACCTCCTGGAACACTGGCATCTCTGAGCCTCCAGAAGGGGTTCTGGGCCTAGTTGTCCTCCCTCTGGAGCCCCGTCCTGTGGTCTGCCTCAGTTTCCCCTCCTAATACATATGGCTGTTTTCCACCTCGATAATATAACACGAGTTTGGGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO:5)
示例性人FcRn(胞外域)核酸序列加GPIDNA序列(小写粗体)在下面示出。
ATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCTCTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCGCAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCCTCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTTCTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACAATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCCTGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGAGAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAAGGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAAGGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGGGCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCAAGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATGAATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCCCGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCAGCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTGCTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGCACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGCCCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGCAGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTCCTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCTGCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGACTTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCTCGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACCACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCGCAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAAGTCCTCC (SEQIDNO:6)
编码β-2-微球蛋白(β2M)的示例性核酸序列可包括下列序列:
β-2-微球蛋白(B2M)核苷酸(智人):
AATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAAGCAGCATCATGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTGGATTGGATGAATTCCAAATTCTGCTTGCTTGCTTTTTAATATTGATATGCTTATACACTTACACTTTATGCACAAAATGTAGGGTTATAATAATGTTAACATGGACATGATCTTCTTTATAATTCTACTTTGAGTGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCTGAGCAGGTTGCTCCACAGGTAGCTCTAGGAGGGCTGGCAACTTAGAGGTGGGGAGCAGAGAATTCTCTTATCCAACATCAACATCTTGGTCAGATTTGAACTCTTCAATCTCTTGCACTCAAAGCTTGTTAAGATAGTTAAGCGTGCATAAGTTAACTTCCAATTTACATACTCTGCTTAGAATTTGGGGGAAAATTTAGAAATATAATTGACAGGATTATTGGAAATTTGTTATAATGAATGAAACATTTTGTCATATAAGATTCATATTTACTTCTTATACATTTGATAAAGTAAGGCATGGTTGTGGTTAATCTGGTTTATTTTTGTTCCACAAGTTAAATAAATCATAAAACTTGATGTGTTATCTCTTA(SEQIDNO:7)
FcRn结合抗体
DX2504是在WO2009/131702和US-2009-0324614-A1中描述的FcRn结合抗体。WO2009/131702和US-2009-0324614-A1通过引用整体并入本应用。使用FcRn多肽或细胞表达的FcRn作为靶标,通过结合单克隆抗体技术和噬菌体展示实验产生DX2504。此外,DX2504序列的种系有较低的免疫原性。DX2504轻链和重链的序列如下所示:
轻链可变区(SEQIDNO:8):
轻链全长(SEQIDNO:16;CL下划线):
SALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSQRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTV AWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
重链可变区(SEQIDNO:9):
重链全长(SEQIDNO:17;CH下划线)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGQTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
除了结合FcRn、DX2504或前体抗体,已显示阻断IgG-Fc结合FcRn表达的细胞上(WO2009/131702实施例21)。此外,向Tg32B小鼠(其中鼠FcRn被人FcRn代替)施用DX2504,降低了预先施用于小鼠的人IgG的水平(WO2009/131702实施例27)。而且,对猕猴施用DX2504导致了IgG血清水平的降低(WO2009/131702实施例27)。
本文中意外地发现当与DX2504比较时,改变轻链的CDR3(例如本文描述的半胱氨酸突变体)或DX2504的重链恒定区(例如本文描述的缺失突变体体)导致FcRn结合抗体性质改善。这一发现至少在某种程度上是意外的,因为通常已经过这样多轮序列优化的抗体,例如DX2504,不能进一步通过引入另外的突变而容易被优化。
半胱氨酸突变体
本文描述的DX2504的半胱氨酸突变体在至少一个CDR3的第一位缺少半胱氨酸残基,例如,DX2504的VLCDR3的第一位被另一个氨基酸残基例如丙氨酸、丝氨酸或其保守的替换而代替。示例性半胱氨酸突变体包括但不限于532A-X53-C02(具有如SEQIDNO:10示出的VL)和532A-X53-B03(具有如SEQIDNO:11示出的VL)。这样的突变保留了FcRn-结合活性,例如以小于10nM的解离常数(KD)结合人FcRn,可通过常规方法来确定。在一些实施例中,半胱氨酸突变体包含两条VL链,其中之一或两者在VLCDR3区的第一位均不具有半胱氨酸。
本文描述的半胱氨酸突变体可包含VL链,其中CDR1、CDR2和CDR3与DX2504的VLCDR1和VLCDR2(SEQID分别为NO:14和15;与在532A-X53-C02或532A-X53-B03中的同一)以及DX2504的改变的VLCDR3(SEQIDNO:12或13,532A-X53-C02或532A-X53-B03的VLCDR3)具有至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%或95%)的序列同一性。在一些实施方案中,一个或多个VLCDR与对应532A-X53-C02或532A-X53-B03的CDR具有至少70%的序列同一性。例如,半胱氨酸突变体在VLCDR3区与序列SSYAGSGIYV(SEQIDNO:12)或ASYAGSGIYV(SEQIDNO:13)具有至少70%的同源性(至少75%、80%、85%、90%或95%)。
在其它实施方案中,半胱氨酸突变体的VLCDR的组合与532A-X53-C02或532A-X53-B03的组合具有至少70%的序列同一性。例如在CDR1、CDR2和CDR3区与参考CDR序列具有至少90%同源性的抗体是指在结合的CDR1、CDR2和CDR3区每10个氨基酸中至少有9个与在532A-X53-C02结合的CDR1、CDR2和CDR3区发现的氨基酸相同的抗体。
可选地,与序列SSYAGSGIYV(SEQIDNO:12)或ASYAGSGIYV(SEQIDNO:13)相比,在VLCDR3区抗体可有多达1个、多达2个、多达3个、多达4个或多达5个的氨基酸替换。在一些实施方案中,与DX2504的CDR3区相比,在VLCDR3区半胱氨酸突变体可包含多达3个替换。一个或多个氨基酸替换可以是保守的氨基酸替换。
而且,与532A-X53-C02或532A-X53-B03的CDR1、CDR2和CDR3区序列相比,在CDR1、CDR2和CDR3区半胱氨酸突变体的抗体可有多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个或多达15个氨基酸替换。在一些实施方案中,在VLCDR1、CDR2和CDR3区它们可总共包含多达10个替换。在一个实施例中,一个或多个氨基酸替换是保守的氨基酸替换。
在一些实施方案中,半胱氨酸突变体包含与532A-X53-C02的VL序列(SEQIDNO:10)或532A-X53-B03的VL序列(SEQIDNO:11)具有至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%)序列同一性的VL链。在一个实施例中,半胱氨酸突变体包含与532A-X53-C02或532A-X53-B03相同的VLCDR3区,并且任选地,与两个示例性突变体相同的VLCDR1和CDR2区。
确定两个氨基酸序列的"百分比同一性"可用Karlin和Altschul算法Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990,按照Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993修改。此类算法并入Altschul,等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序来进行,分数=50,字长=3以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。如在Altschul等,NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402,1997中描述的,在存在于两个序列的空位处可使用空位(Gapped)BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序,可用各自程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。
在一些实施方案中,与上述及下文实施例1中描述的两个示例性突变体相比,本文描述的半胱氨酸突变体可包含框架区(FR)内的一个或多个突变(例如保守的氨基酸替换)。如在本领域已知,在FR区内的突变不太可能会影响抗体的抗原-结合活性。在其它实施方案中,与532A-X53-C02或532A-X53-B03相比在一个或多个CDR区内,本文描述的半胱氨酸突变体可包含一个或多个突变(例如1、2或3个诸如保守的氨基酸替换的突变)。优选地,这类突变体保留了与亲本相同的负责抗原结合的区/残基,例如CDR内的相同的特异性决定残基。
一般而言,半胱氨酸残基提供独特性质的蛋白质,因为半胱氨酸残基能形成共价键和其它半胱氨酸。半胱氨酸突变经常导致蛋白质具有显著地改变的性质。因此意外的是,通过尺寸排阻色谱(图1)和SDS-PAGE分析(图2)测量发现轻链CDR3上半胱氨酸突变成丝氨酸(C54-C02)或丙氨酸(X54-B03)的抗体比DX-2504更有同源性。还意外的是,关于单体IgG物类的百分比,在37℃下孵育,孵育超过30天(图3)或随后在pH8.3下孵育15天(图4),半胱氨酸突变体将更稳定。抗体的CDR突变往往会减少抗原结合的亲和力。因此,DX-2504轻链的CDR3中半胱氨酸的突变没有影响抗原结合的亲和力更是意料之外的(图7和8)。
上述任何半胱氨酸突变体还可进一步包含重链可变区(VH),该VH包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3区。VH可以和DX2504(SEQIDNO:9)的或其功能性变体相同。在一些实施方案中,功能性变体中的VHCDR与DX2504(SEQIDNOs:22、23和24)的具有至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%或95%)的序列同一性。在一个实施例中,一个或多个VHCDR与对应的DX2504的VHCDR(s)具有至少70%的序列同一性,例如在VHCDR3区与序列LAIGDSY(SEQIDNO:24)具有至少70%的同源性(至少75%、80%、85%、90%或95%)。
在另一个实施例中,功能性变体的VHCDR组合与DX2504的组合具有至少70%的序列同一性。例如在CDR1、CDR2和CDR3区与参考CDR序列具有至少90%同源性的抗体是指在结合的CDR1、CDR2和CDR3区每10个氨基酸中至少有9个与在DX2504结合的CDR1、CDR2和CDR3区发现的氨基酸相同的抗体。
可选地,与DX2504的CDR3序列(LAIGDSY;SEQIDNO:24)相比,在CDR3区功能性突变体可包含多达1个、多达2个、多达3个、多达4个或多达5个氨基酸替换。在一些实施方案中,与DX2504的CDR3区相比,在VHCDR3区功能性变体包括多达3个替换。在一个实施例中,一个或多个氨基酸替换是保守的氨基酸替换。
而且,与DX2504的CDR1、CDR2和CDR3区序列相比,在CDR1、CDR2和CDR3区功能性变体可包含多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个、多达11个、多达12个、多达13个、多达14个或多达15个氨基酸替换。在一些实施方案中,在VHCDR1、CDR2和CDR3区它们总共包含多达10个替换。在一个实施例中,一个或多个氨基酸替换是保守的氨基酸替换。
在一些实施方案中,功能性变体包含与DX2504的VH序列(SEQIDNO:9)具有至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%)的序列同一性的VH链。在一个实施例中,功能性变体包含与DX2504相同的VHCDR3区,并且任选地,与DX2504相同的VHCDR1和CDR2区。
当需要时,在DX2504的框架区(FRs)内如本文描述的DX2504重链的功能性变体可包含一个或多个突变(例如保守的氨基酸替换)(参见上述)。如在本领域已知,在FR区内的突变不可能影响抗体的抗原结合活性。在其它实施方案中,与DX2504相比,在一个或多个CDR区内本文描述的半胱氨酸突变体可包含一个或多个突变(例如1、2或3种如保守的氨基酸替换的突变)。优选地,此类变体保留了与亲本相同的负责抗原结合的区/残基,例如在CDR内相同的特异性决定残基。
在一个实施例中,本文描述的DX2504半胱氨酸突变体包含与532A-X53-C02或532A-X53-B03具有至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%或95%)同源性的轻链和包含与DX2504具有相同CDR的重链(例如与DX2504相同的重链可变区)。在另一个实施例中,突变包含与532A-X53-C02或532A-X53-B03相同的VL和与DX2504相同的VH。
缺失突变体
已意外地发现,在动物模型中与DX2504相比,DX2504重链C-末端赖氨酸残基的缺失导致抗-FcRn抗体(DX2507)具有增加的抗体保留和IgG的较高程度地减少(图13和14)。
因此,本文还描述了与DX2504重链相比,重链缺少C-末端赖氨酸残基的缺失突变体。更具体地,本文描述的缺失突变体的重链另外与DX2504的重链(SEQIDNO:17)相同或者与上述除了与DX2504重链(SEQIDNO:17)C-末端赖氨酸残基相对应的氨基酸残基缺失的任何DX2504功能性变体的重链相同。这种重链的一个实例是下面实施例2描述的DX2507(SEQIDNO:19)。
上述的缺失突变体可进一步包含轻链,该轻链包含DX2504的VL区或本文描述的任何半胱氨酸突变体的VL区。
在一些实施例中,缺失突变体包含包含与DX2504、532A-X53-C02或532A-X53-B03相同的VLCDR(例如与DX2504、532A-X53-C02或532A-X53-B03相同的VL)的轻链、包含与DX2504相同的VHCDR(例如与DX2504相同的VH)的重链以及在与DX2504重链C-末端赖氨酸残基对应的位置具有缺失的重链恒定区。
本文描述的任何半胱氨酸和缺失突变体可以小于10nM的解离常数(KD)结合人FcRn。
除了有本文描述的氨基酸序列之外,本文描述的抗-FcRn抗体可具有任何结构性框架。因此,例如上述的CDR1、CDR2和CDR3区可嵌入"传统的"抗体框架,或可嵌入scFv或Fab框架。本文描述的抗-FcRn抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段,例如Fab、F(ab)'2、Fv或ScFv抗体。它可能是非-人抗体例如鼠抗体(例如由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体)、嵌合抗体或人源化抗体。
在本公开的范围内还有包含编码本文描述的任何抗-FcRn抗体VH和/或VL的核苷酸序列的核酸(例如任何半胱氨酸突变体或任何上述缺失突变体)。这些核酸序列能***到表达载体中,通过重组技术该载体能被引入合适的宿主细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)用于产生抗-FcRn抗体。
制备小鼠单克隆抗体的方法
已经描述了制备单克隆抗体的方法(Harlow等,AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1988))。在一些情况下,作为第一步,将啮齿类动物例如小鼠用抗原性多肽免疫以产生抗体反应。因为FcRn的表达无所不在并且展示物种间的高度同源性,多肽没有成功在产生高亲和力的FcRn特异性单克隆抗体或FcRn单克隆封闭抗体。为解决这个问题,可进行DNA接种(Castagliola等,J.Immunology160:1458(1998))。DNA接种涉及免疫啮齿类动物,例如有编码FcRn或其片段的cDNA构建体的小鼠。免疫可以施用肌内、腹腔内、皮下、静脉内、皮内或直接施用到***。在一个实施方案中,免疫肌内施用。DNA接种可和佐剂施用,例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。DNA接种可伴随施用心脏毒素以增加抗体滴度。施用心脏毒素引起细胞死亡和促进细胞摄取施用的DNA疫苗的细胞再生。心脏毒素还能增加导致更加强劲的免疫反应的炎症。
抗体分泌细胞(B细胞)分离自啮齿类动物。通常B细胞分离自啮齿类动物脾脏并且和骨髓瘤细胞系融合。骨髓瘤细胞系是不能产生抗体的永生细胞系。骨髓瘤细胞系可选自但不限于P3-X63Ag8、X63Ag8.653、Sp2/0-Agl4、FO、NSI/1-Ag4-1、NSO/1、FOX-NY、Y3-Ag1.2.3、YB2/0和IR983F。
脾细胞和骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。通过用聚乙二醇混合两种细胞型适当一段时间(例如五分钟)来介导融合。形成的杂交瘤在细胞培养中生长,用适当选择培养基(例如HAT)且筛选它们产生对FcRn的单克隆抗体的能力。用已知的免疫学技术例如ELISA来筛选。
制备FcRn特异性单克隆抗体的另外方法是用可溶性人FcRn免疫转基因FcRn敲除小鼠,参见PCT申请WO02/43658。WO02/43658描述了基因组的内源性FcRn基因上包含纯合破坏的转基因小鼠,其中所述纯合破坏阻止了功能性FcRn蛋白质的表达。本发明的单克隆抗体不在基因组的内源性FcRn基因上包含纯合破坏的转基因小鼠中制备,其中所述纯合破坏阻止了功能性FcRn蛋白质的表达。本发明的单克隆抗体不包含来自基因组的内源性FcRn基因上包含纯合破坏的转基因小鼠的B细胞,其中所述纯合破坏阻止了功能性FcRn蛋白质的表达。
人源化抗-FcRn抗体展示文库
展示文库可用于鉴定结合FcRn的抗体。展示文库是实体的收集;每个实体包括可及的多肽组分和编码或鉴定多肽组分的可收回的组分。多肽组分是不同的以便代表不同的氨基酸序列。多肽组分可以是任何长度,例如从3个氨基酸至超过300个氨基酸。在选择中,用FcRn探测文库每个成员的多肽组分,并且如果多肽组分结合FcRn上,通常通过支持物保留鉴定展示文库。此外,展示文库实体可包括不止一个多肽组分,例如sFab的两条多肽链。
保留的展示文库成员从支持物中回收并分析。在相似或不相似的条件下分析可包括扩大和随后的选择。例如积极和负选择可以交替。分析还可包括决定多肽组分的氨基酸序列和详细表征的多肽组分的纯化。
多种形式可用于展示文库。实施例包括以下。
噬菌体展示。一种形式利用病毒,特别是噬菌体。这种形式被称为"噬菌体展示"。蛋白质组分通常共价结合噬菌体外壳蛋白上。连接由编码融合到外壳蛋白的组分的核酸的翻译引起。连接可包括柔性肽接头、蛋白酶位点或由终止密码子的抑制导致的氨基酸合并。噬菌体展示描述例如在U.S.5,223,409;Smith(1985)Science228:1315-1317;WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;WO93/01288;WO92/01047;WO92/09690;WO90/02809;deHaard等,(1999)J.Biol.Chem274:18218-30;Hoogenboom等,(1998)Immunotechnology4:1-20;Hoogenboom等,(2000)ImmunolToday2:371-8;Fuchs等,(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等,(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse等,(1989)Science246:1275-1281;Griffiths等,(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等,(1992)JMolBiol226:889-896;Clackson等,(1991)Nature352:624-628;Gram等,(1992)PNAS89:3576-3580;Garrard等,(1991)Bio/Technology9:1373-1377;和Hoogenboom等,(1991)NucAcidRes19:4133-4137。
已为丝状噬菌体(噬菌体f1、fd和M13)以及其它噬菌体开发了噬菌体展示***。丝状噬菌体展示***通常使用融合到例如基因III蛋白和基因VIII蛋白的次要外壳蛋白上和主要外壳蛋白上,但也可使用与其它外壳蛋白例如基因VI蛋白、基因VII蛋白、基因IX蛋白或其结构域的融合(参见例如WO00/71694)。在一个实施方案中,融合到例如锚定结构域或"残端(stump)"的基因III蛋白的结构域上(参见例如美国专利No.5,658,727,描述基因III蛋白锚定结构域)。还可能的是用非-肽连接生理上联系展示到外壳的蛋白质。
用标准的噬菌体制备方法例如来自生长培养基的PEG沉淀可生长和收获噬菌体展示蛋白质组分。选择单独展示噬菌体之后,编码选择的蛋白质组分的核酸能分离自感染所选择的噬菌体的细胞或分离自扩增后的噬菌体本身。可挑取单独的克隆或菌斑,分离核酸并测序。
其它展示形式。其它展示形式包括基于细胞的展示(参见例如WO03/029456)、蛋白质-核酸融合(参见例如US6,207,446)和核糖体展示(参见例如Mattheakis等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022andHanes等,(2000)NatBiotechnol.18:1287-92;Hanes等,(2000)MethodsEnzymol.328:404-30;和Schaffitzel等,(1999)JImmunolMethods.231(1-2):119-35)。
支架。用于展示的支架可包括:抗体(例如Fab片段、单链Fv分子(scFV)、单结构域抗体、骆驼科动物抗体和骆驼科化的抗体);T-细胞受体;MHC蛋白;细胞外结构域(例如纤连蛋白III型重复、EGF重复);蛋白酶抑制剂(例如Kunitz结构域、大肠杆菌素、BPTI等);TPR重复;三叶草结构;锌指结构域;DNA-结合蛋白;特别是单体DNA结合蛋白;RNA结合蛋白;酶例如蛋白酶(特别是灭活的蛋白酶)、RNA酶;分子伴侣例如硫氧还蛋白和热击蛋白;细胞内信号结构域(例如SH2和SH3结构域);线性约束肽;和线性肽底物。展示文库可包括合成的和/或天然的多样性。参见例如US2004-0005709。
展示技术还可用于获得结合靶标特殊表位的抗体。这可以例如通过使用竞争缺少特殊表位的非靶向分子或在例如丙氨酸的表位内突变来实现。这些非靶向分子可用于如下所述负选择程序,如当展示文库结合靶标时竞争分子,或如洗脱试剂前,例如在洗涤溶液中为捕获对靶标没有特异性的分离的展示文库成员。
迭代选择。在一个实施方案中,展示文库技术用于迭代模型。第一个展示文库用于鉴定结合靶标的一种或多种抗体。然后用诱变的方法使这些鉴定的抗体发生变化以形成第二个展示文库。然后从第二个文库选择较高亲和力的抗体,例如通过使用更高严格或更加竞争性的结合和洗涤条件。
在一些实施方式中,诱变靶向到已知的区或可能在结合界面。就抗体而言,诱变可被引导至本文描述的重链或轻链的CDR区。另外,诱变可被引导至接近或邻近CDR的框架区。就抗体而言,诱变还可被引导至一个或几个CDR,例如以形成精确的阶梯式改善。示例性诱变技术包括:易错PCR、重组、DNA改组、定点诱变和盒式诱变。
在迭代选择的一个实施例中,本文描述的方法用于从展示文库中第一次鉴定抗体,其以至少最小的靶标结合特异性或最小活性结合FcRn,例如小于1nM、10nM或100nM结合的平衡解离常数。编码最初鉴定的抗体的核酸序列用作引入变异的模板核酸,例如以鉴定相对于最初抗体有增强的性质(例如结合亲和力、动力学或稳定性)的第二抗体。
解离速率选择。因为慢解离速率可预示高亲和力,特别是关于抗体与其靶标之间的相互作用,所以本文描述的方法可用于对靶标结合的相互作用以期望的动力学解离速率(例如减少的)来分离抗体。
为了从展示文库中选择低解离的抗体,文库与固定的靶标接触。然后用移除非特异性或弱结合的生物分子的第一溶液洗涤固定的靶标。用第二溶液洗脱结合抗体,该溶液包括饱和量的游离靶标或竞争单克隆抗体的特异性高亲和力的靶标,即没有附接到颗粒的靶标的复制物。游离靶标结合从靶标解离的生物分子上。通过相对于很多更低浓度的固定靶标的饱和量的游离靶标有效阻止了重结合。
第二溶液可具有大体上生理学的或严格的溶液条件。通常,第二溶液的溶液条件与第一溶液的溶液条件相同。按按时间顺序收集第二溶液的级分以区分早晚级分。比早级分的生物分子较晚的级分包括从靶标以较低速率解离的生物分子。
另外,还可能恢复甚至在延长孵育后仍结合靶标的展示文库成员。这些可在使用离液条件时被解离或附接到靶标时被扩增。例如结合靶标的噬菌体可以和细菌细胞接触。
特异性的选择或筛选。本文描述的展示文库筛选方法可包括弃去结合非靶分子的展示文库成员的选择或筛选过程。非靶分子的实例包括磁珠上的链霉亲和素、例如牛血清白蛋白的阻断剂、脱脂牛奶、任何捕获的或靶标固定的单克隆抗体或不表达人FcRn靶标的非转染细胞。
在一个实施方式中,所谓的"负选择"步骤用于区别靶标和相关的非靶分子以及相关的但是不同的非靶分子。展示文库或其池与非靶分子接触。收集不结合非靶标的样品成员并用于随后结合靶分子的选择或甚至用于随后的负选择。负选择步骤可在选择结合靶分子的文库成员之前或之后。
在另一个实施方式中,采用筛选步骤。展示文库成员被分离用于结合靶分子后,测试每个分离的文库成员结合非靶分子的能力(例如以上所列的非靶标)。例如可用高通量ELISA筛选以获得这个数据。ELISA筛选还可用于获得每个文库成员结合靶标以及相关靶标或靶标亚单位(例如大鼠FcRn;β2微球蛋白)的跨物种反应性的定量数据,并且还在例如pH6或pH7.5的不同条件下。比较非靶和靶结合数据(例如使用计算机和软件)以鉴定特异性结合靶标的文库成员。
其它表达文库
蛋白收集的其它类型(例如表达文库)可用于鉴定有特殊性质的蛋白质(例如结合FcRn的能力和/或调节FcRn的能力),包括例如抗体的蛋白质阵列(参见例如DeWildt等,(2000)Nat.Biotechnol.18:989-994)、λgt11文库、两个杂交文库等。
抗体文库
在一个实施方案中,文库显示了多样性的多肽池,其中每个池包括免疫球蛋白结构域,例如免疫球蛋白可变结构域。展示文库特别有用,例如用于鉴定识别人抗原的人或"人源化"抗体。这样的抗体可用于治疗学,以治疗例如自身免疫病症的人病症。因为抗体的恒定区和框架区是人的,所以这些治疗性抗体可避免自身被识别和标靶为抗原。恒定区还可被优化以募集人免疫***的效应子功能。体外展示选择过程克服了正常人免疫***的无能以产生抗自身抗原的抗体。
典型的抗体展示文库显示了包括VH结构域和VL结构域的多肽。"免疫球蛋白结构域"是指来自免疫球蛋白分子的可变或恒定结构域的结构域。免疫球蛋白结构域通常包含两个由约七个β-链形成的β-折叠和保守的二硫键(参见例如A.F.Williams和A.N.Barclay,1988,Ann.Rev.Immunol.6:381-405)。展示文库可用Fab片段(例如用两条多肽链)或单链Fv(例如用单一多肽链)以展示抗体。也可用其它形式。
如在Fab和其它形式的情况下,展示的抗体可包括一个或多个恒定区作为轻链和/或重链的一部分。在一个实施方案中,每个链包括一个恒定区,例如,如在Fab的情况下。在其它实施方案中,展示了另外的恒定区。
通过很多过程可构建抗体文库(参见例如deHaard等,1999,J.Biol.Chem.274:18218-30;Hoogenboom等,1998,Immunotechnology4:1-20;和Hoogenboom等,2000,Immunol.Today21:371-378。另外,每个过程的元件可用其它过程的那些来结合。可用这些过程以使变异引入到单一的免疫球蛋白结构域(例如VH或VL)或引入到多个免疫球蛋白结构域(例如VH和VL)。参考重链和轻链可变结构域之一或二者的区,变异可引入到免疫球蛋白可变结构域,例如一个或多个CDRl、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的区。在一个实施方案中,变异引入到给定的可变结构域的所有三个CDR中。在另一个实施方案中,变异引入到CDR1和CDR2,例如重链可变结构域的。任何结合是可行的。在一种方法中,通过将不同的编码CDR的寡核苷酸***到核酸的相应区来构建抗体文库。可用单体核苷酸或三核苷酸合成寡核苷酸。例如Knappik等,2000,J.Mol.Biol.296:57-86描述了用三核苷酸合成来构建编码寡核苷酸的CDR且有设计的限制性位点的模板来接受寡核苷酸的方法。
在另一种方法中,用FcRn免疫动物例如啮齿类动物。将动物任选地用抗原激发以进一步刺激反应。然后从动物中分离脾脏细胞并且扩增和克隆编码VH和/或VL结构域的核酸以在展示文库中表达。
在又一种方法中,抗体文库构建自首次用于实验的种系免疫球蛋白基因扩增的核酸。扩增的核酸包括编码VH和/或VL结构域的核酸。编码免疫球蛋白的核酸来源如下所述。扩增可包括PCR,例如用退火至保守的恒定区的引物或另外的扩增方法。
编码免疫球蛋白结构域的核酸可获自例如人、灵长类、小鼠、兔子、骆驼、美洲驼或啮齿类动物的免疫细胞。在一个实施例中,选择特殊性质的细胞。可选择不同成熟阶段的B细胞。在另一个实施例中,B细胞是首次用于实验的。
在一个实施方案中,荧光激活细胞分选(FACS)用于分选表达表面结合的IgM、IgD或IgG分子的B细胞。另外,可分离表达不同的同种型IgG的B细胞。在另一个实施方案中,体内培养B或T细胞。例如通过用培养层细胞培养或通过添加有丝***原或其它调节试剂,如CD40或CD40配体或CD20的抗体、豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯、细菌脂多糖、伴刀豆球蛋白A、植物凝集素或美洲商陆有丝***原以体内刺激细胞。
在又一个实施方案中,细胞分离自有自身免疫病症的受试者,例如***性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、血管炎、Sjogren综合症、***性硬化或抗磷脂综合症。受试者可以是人或动物,例如人疾病的动物模型或有类似病症的动物。在又一个实施方案中,细胞分离自包括人免疫球蛋白基因座的转基因非人动物。
在一个实施方案中,细胞激活了躯体的高突变程序。刺激细胞经历免疫球蛋白基因的躯体诱变,例如通过用抗免疫球蛋白、抗CD40和抗CD38抗体(参见例如Bergthorsdottir等2001,J.Immunol.166:2228)治疗。在一个实施方案中,细胞是首次用于实验的。
通过下列示例性方法,编码免疫球蛋白可变结构域的核酸可分离自天然谱系。首先RNA分离自免疫细胞。分离全长(即加帽的)mRNA(例如通过用小牛肠磷酸酶降解未加帽的RNA)。然后用烟草酸焦磷酸酶将帽移除并且用反转录产生cDNA。
第一条(反义)链的反转录可用任何合适的引物以任何方式进行。参见例如deHaard等,1999,J.Biol.Chem.274:18218-30。引物结合区可以是恒定的在不同的免疫球蛋白之间,例如为了反转录不同的同种型免疫球蛋白。对特殊的同种型免疫球蛋白,引物结合区也可以是特异性的。通常引物对编码至少一个CDR的序列的3'区是特异性的。在一个实施方案中,可使用多-dT引物(且对重链基因可以是优选的)。
合成序列可与反转录链的3'-端连接。反转录后在PCR扩增期间,合成序列可用作引物结合位点以结合正向引物。合成序列的使用可排除用不同正向引物池以全面捕获可获得的多样性的需要。
然后扩增可变结构域编码基因,例如用一轮或多轮。如果用多轮,可用巢式引物以增加保真度。然后将扩增的核酸克隆到展示文库载体。
二次筛选方法
选择结合靶标的候选文库成员后,可进一步分析每个候选文库成员,例如进一步表征其结合靶标的性质。每个候选文库成员可经历一个或多个二次筛选测定。可测定结合性质、催化性质、抑制性质、生理学性质(例如细胞毒性、肾脏清除率、免疫原性)、结构性质(例如稳定性、构象、齐聚反应状态)或另外的功能化性质。相同的测定可反复使用,但需用变化的条件,例如以测定pH、离子或热敏感性。
适当时,测定可直接用展示文库成员,产生自编码所选多肽的核酸的重组多肽,或基于所选多肽的序列合成的合成肽。结合性质的典型测定包括以下。
ELISA。用ELISA还可筛选选自表达文库的抗体的结合性质。例如每个抗体接触底面涂覆靶标的微量滴定板,例如靶标的限制量。用缓冲液洗涤该板以移除非特异性结合的多肽。然后通过用能识别测试抗体的抗体探测该板以确定结合板上的抗体的量,例如抗体的标签或恒定部分。探测抗体连接到酶上,例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(HRP),当提供适当的底物时其产生比色产物。
就展示文库的抗体而言,可从细胞中纯化抗体或用展示文库形式测定,例如融合到丝状噬菌体外壳上。在ELISA的另一个版本中,每个选自表达文库的抗体用于涂覆微量滴定板的不同的孔。然后用恒定的靶标分子查询每个孔进行ELISA。
同源结合测定。候选抗体和靶标的结合相互作用可用同源测定进行分析,即加入所有的测定组分后,不需要另外的液体操作。例如荧光共振能量转移(FRET)可用作同源测定(参见例如Lakowicz等,美国专利No.5,631,169;Stavrianopoulos等,美国专利No.4,868,103)。如果第二个分子和第一个分子接近,选择第一个分子(例如在级分中鉴定的分子)上的荧光标记以使其发射的荧光能量能被第二个分子(例如靶标)上的荧光标记吸收。当吸收转移的能量时,第二个分子的荧光标记发出荧光。因为标记物之间的能量转移效率和分开分子的距离相关,所以可对分子间的空间关系进行评估。在结合发生在分子之间的情况下,测定中“受体”分子标记的荧光发射应该最大化。通过对本领域熟知的标准荧光检测手段(例如用荧光计)可方便地测量被配置以通过FRET检测的结合事件。通过滴定第一或第二结合分子的量,可产生结合曲线以估计平衡结合常数。
另一个同源性测定的实例是ALPHASCREENTM(PackardBioscience,MeridenCT)。ALPHASCREENTM使用两个标记的珠。当被激光激发时,一个珠产生单峰氧。当单峰氧从第一个珠扩散并和它碰撞时,另一个珠产生光信号。信号只产生在两个珠接近时。一个珠可附接到展示文库成员,另一个珠可附接到靶标。测量信号以确定结合程度。
当候选多肽附接到展示文库媒介物例如噬菌体时可进行同源测定。
表面等离子体共振(SPR)。分离自表达文库和靶标的分子的结合相互作用可用SPR进行分析。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用,没有标记任何相互作用物。BIA芯片结合表面质量的变化(预示结合事件)导致接近表面的光折射指数的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)。折射率的改变引起可探测的信号,其作为生物分子间实时反应的指示而被测量。描述了使用SPR的方法,例如在美国专利No.5,641,640;Raether,1988,SurfacePlasmonsSpringerVerlag;Sjolander和Urbaniczky,1991,Anal.Chem.63:2338-2345;Szabo等,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和BIAcoreInternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的在线资源。
来自SPR的信息可用来提供生物分子结合靶标的平衡解离常数(Kd)和动力学参数包括Kon和Koff的精确和定量的测量。这些数据可用来比较不同的生物分子。例如可比较从表达文库中选择的蛋白以鉴定对靶标有高亲和力或有低Koff的蛋白。这种信息还可用于开发结构活性关系(SAR)。例如亲本蛋白质成熟形式的动力学和平衡结合参数可与亲本蛋白质的参数进行比较。可鉴定给定位置变化的氨基酸,其与特殊的结合参数例如高亲和力和低Koff相关联。这种信息可与结构模型相结合(例如用同源性模型、能量最小化或通过x-射线晶体学或NMR的结构测定)。因此,对蛋白质和其靶标间物理相互作用的理解可得到阐述并且用于指导其它设计过程。
细胞测定。候选抗体的文库(例如由展示文库或另外的预先鉴定的)可用于筛选细胞上的靶标结合,其瞬时或稳定表达并展示细胞表面的目标靶标。例如,靶标可包括载体核酸序列,该序列包括仅编码多肽的细胞外部分的片段,以使嵌合靶标多肽在细胞内产生、从细胞分泌或通过锚定例如与膜锚定蛋白如Fc融合以附接到细胞表面。细胞表面表达的靶标可用于筛选结合FcRn并阻止IgG-Fc结合的抗体。例如非特异性人IgG-Fc能被荧光标记,并且在没有拮抗性抗体存在下用流式细胞仪通过荧光强度的变化检测其与FcRn的结合,例如FACS机器。
获得FcRn-结合抗体的其它方法
除了使用展示文库外,可用其它方法获得FcRn-结合抗体。例如在非人动物例如啮齿类动物中FcRn蛋白或其区域可用作抗原。
在一个实施方案中,非人动物包括至少人免疫球蛋白基因的一部分。例如,在小鼠抗体产生中可用人Ig基因座的大片段设计小鼠链缺陷。用杂交瘤技术,可制备和选择获自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体(Mabs)。参见例如XENOMOUSETTM,Green等,1994,Nat.Gen.7:13-21;U.S.2003-0070185、公布于1996年10月31日的WO96/34096和提交于1996年4月29日的PCT申请No.PCT/US96/05928。
在一个实施方案中,单克隆抗体获自非人动物,然后被修饰,例如人源化或去免疫。Winter描述了可用于制备人源化抗体的CDR移植方法(美国专利申请GB2188638A提交于1987年3月26日;美国专利No.5,225,539。特定人抗体的所有CDR可被非人CDR的至少一部分代替或只有一些CDR可被非人CDR代替。仅需要代替人源化抗体结合预定的抗原所需要的CDR数量。
人源化抗体可通过代替Fv可变区序列而产生,该区不直接参与抗原与来自人Fv可变区的等效序列结合。通过Morrison,S.L.,1985,Science229:1202-1207,通过Oi等,1986,BioTechniques4:214,和通过Queen等,美国专利No.5,585,089、US5,693,761和US5,693,762提供了产生人源化抗体的一般方法。这些方法包括分离、操作和表达来自至少一条重链或轻链的编码所有或部分免疫球蛋白的Fv可变区的核酸序列。这些核酸的来源对本领域技术人员而言是熟知的,且如上所述例如可获自产生预定靶标的抗体的杂交瘤。然后将编码人源化抗体或其片段的重组DNA克隆到适当的表达载体。
FcRn-结合抗体的修饰还可通过人T细胞表位的特异性缺失或通过公开在WO98/52976和WO00/34317的"去免疫化"方法,该公开的内容通过引用并入本文。简而言之,抗体的重链和轻链可变区可分析于结合MHCII类的肽;这些肽代表了潜在的T-细胞表位(如WO98/52976和WO00/34317所定义的)。对于潜在T-细胞表位的缺失,可应用称作"肽穿线(peptidethreading)"的计算机模型方法,且此外人MHCII类结合肽数据库可用于检索存在于VH和VL序列的基序,如WO98/52976和WO00/34317中所述。这些基序结合任何18种主要的MHCII类DR同种异型,并因此构成了潜在的T细胞表位。检测到的潜在的T-细胞表位可通过代替少量的可变区氨基酸残基或通过单一的氨基酸替换被消除。经常但不是唯一的,可用在人的种系抗体序列位置上共同的氨基酸进行尽可能保守的替换。人种系序列公开于Tomlinson,LA.等,1992,J.Mol.Biol.227:776-798;Cook,G.P.等,1995,Immunol.TodayVol.16(5):237-242;Chothia,D.等,1992,J.Mol.Bio.227:799-817。VBASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列综合的目录(Tomlinson,LA.等,MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK编辑)。鉴定去免疫化变化后,通过诱变或其它合成方法(例如从头合成(denovosynthesis)、盒式代替等)可构建编码VH和VL的核酸。诱变的可变序列可任选地被融合到人恒定区,例如人IgG1或κ恒定区。
在一些情况下,潜在的T细胞表位将包括已知的或预测的对抗体功能重要的残基。例如潜在的T细胞表位通常偏向于CDR。此外,潜在的T细胞表位可发生在对抗体结构和结合重要的框架残基。在一些情况下,消除这些潜在的表位的变化将需要更多的注意力,例如通过制备和测试有和没有变化的链。如有可能,潜在的与CDR重叠的T细胞表位被CDR外的替换消除。在一些情况下,在CDR内的改变是唯一的选择,且此外应该检测有和没有这个替换的变异。在其它情况下,要求移除潜在T细胞表位的替换是在框架内的残基位置,其对抗体结可能是关键的。在这些情况下,应检测有和没有这个替换的变异。因此在一些情况下,为了鉴定最佳的去免疫化抗体,设计将重链和轻链可变区去免疫化的几个变异并且测试不同的重链/轻链组合。然后可通过考虑不同变异与去免疫化程度结合的结合亲和力,即保留在可变区的潜在的T细胞表位的数量而做出最终去免疫化抗体的选择。去免疫化可用于修饰任何抗体,例如包括非人序列的抗体,例如合成抗体、鼠抗体、其它非人单克隆抗体或从展示文库中分离的抗体。
种系抗体。
用于治疗IgG调节的自身免疫疾病的抗体可用于多次施用。可降低治疗性抗体免疫原性的防范包括将框架区的一种或多种非种系氨基酸回复到抗体(尤其是Fab)对应的种系氨基酸(例如只要结合性质大体保留)。
为使抗体可变区与一种或多种种系序列更加相似,可修饰结合FcRn的抗体,例如本文描述的抗体。例如抗体可包括一种、两种、三种或更多的氨基酸替换,如在框架、CDR或恒定区,以使其与参考种系序列更加相似。一个示例性种系方法可包括鉴定与分离的抗体的序列相似的一种或多种种系序列(例如在特殊的库中大多数相似)。突变(在氨基酸水平)可在分离的抗体中进行,或递增或与其它突变结合。例如建立包括编码一些或全部可能的种系突变的序列的核酸文库。然后评估突变抗体,例如鉴定分离的抗体相比有一种或多种另外的种系残基的抗体且其仍有用(例如有功能化活性)。在一个实施方案中,给分离的抗体引入尽可能多的种系残基。
在一个实施方案中,诱变用于在框架和/或恒定区替代或***一个或多个种系残基。例如种系框架和/或恒定区残基可来自与被修饰的非可变区相似的(例如大多数相似)种系序列。诱变后,可评估抗体的活性(例如结合或其它功能化活性)以确定是否种系残基或残基是耐受的(即不消除活性)。相似的诱变可在框架区进行。
选择种系序列可以不同的方式进行。例如如果种系序列满足选择或相似度的预定标准,如至少一定的百分比同一性,如至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%同一性,其可被选择。可用至少2、3、5或10种种系序列进行选择。在CDR1和CDR2的情况下,鉴定相似的种系序列可包括选择一个这样的序列。在CDR3的情况下,鉴定相似的种系序列可包括选择一个这样的序列,但可包括使用两种独自贡献于氨基末端部分和羧基末端部分的种系序列。在其它的实施中,使用多于一个或两个种系序列,例如以形成共有序列。
在一个实施方案中,关于特殊的参考可变结构域序列,例如本文描述的序列,相关的可变结构域序列具有至少30、40、50、60、70、80、90、95或100%的CDR氨基酸位置,其与参考CDR序列的残基不相同,残基与在人种系序列中相应位置的残基相同(即由人种系核酸编码的氨基酸序列)。
在一个实施方案中,关于特殊的参考可变结构域序列,例如本文描述的序列,相关的可变结构域序列具有至少30、50、60、70、80、90或100%的FR区与来自人种系序列的FR序列是相同的,例如与参照可变结构域序列相关的种系序列。
因此,可分离与给定目标抗体有相似活性但与一种或多种种系序列尤其是一种或多种人种系序列更相似的抗体。例如抗体可与CDR之外的区(例如框架区)的种系序列具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同一性。另外,抗体可包括CDR区的至少1、2、3、4或5个种系残基,该种系残基来自与被修饰的可变区相似的(例如大多数相似的)种系序列。主要目标的种系序列是人种系序列。抗体活性(例如结合活性)可在原始抗体的100、10、5、2、0.5、0.1或0.001倍以内。
示例性Vkappa种系参考序列包括:O12/O2、O18/O8、A20、A30、L14、L1、L15、L4/18a、L5/L19、L8、L23、L9、L24、L11、L12、O11/O1、A17、Al、A18、A2、A19/A3、A23、A27、A11、L2/L16、L6、L20、L25、B3、B2、A26/A10和A14。参见例如Tomlinson等,1995,EMBOJ.14(18):4628-3。
可变结构域的种系参考序列可基于有特殊规范结构的序列,例如在H1和H2高变环的1至3级结构。如在Chothia等,1992,J.Mol.Biol.227:799-817;Tomlinson等,1992,J.Mol.Biol.227:776-798);和Tomlinson等,1995,EMBOJ.14(18):4628-38.中提出的,免疫球蛋白可变结构域的高变环的规范结构可由其序列推出。1至3级结构的典型序列包括:DP-1、DP-8、DP-12、DP-2、DP-25、DP-15、DP-7、DP-4、DP-31、DP-32、DP-33、DP-35、DP-40、7-2,hv3005、hv3005f3、DP-46、DP-47、DP-58、DP-49、DP-50、DP-51、DP-53和DP-54。
配体的产生
标准的重组核酸方法可用于表达结合FcRn的抗体。一般地,编码抗体的核酸序列克隆到核酸表载体。当然,如果抗体包括多条多肽链,每条链可被克隆到表达载体,例如在相同的或不同的细胞表达的相同的或不同的载体。
抗体的产生。一些抗体例如Fab可在细菌细胞中产生,例如大肠杆菌细胞。例如如果在展示实体和噬菌体蛋白质(或其片段)之间,Fab被包括抑制性的终止密码子的噬菌体展示载体中的序列编码,载体核酸可被转移至不能抑制终止密码子的细菌细胞。在这种情况下,Fab不融合到基因III蛋白质且被分泌至周质和/或培养基。
抗体还可在真核细胞中产生。在一个实施方案中,抗体(例如scFv的)表达于酵母细胞例如毕赤酵母(Pichia)(参见例如Powers等,2001,J.Immunol.Methods.251:123-35)、汉逊酵母(Hanseula)或酵母属(Saccharomyces)。
在一个实施方案中,抗体在哺乳动物细胞中产生。表达克隆抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞,描述于Urlaub和Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,使用DHFR可选择的标记,例如如描述于Kaufman和Sharp,1982,Mol.Biol.159:601621)、淋巴细胞系,例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞和来自转基因动物的细胞,例如转基因哺乳动物。例如细胞是哺乳动物上皮细胞。
除了编码多样化的免疫球蛋白结构域的核酸序列外,重组表达载体可携带另外的序列,例如调节宿主细胞载体(例如复制的起源)和可选择的标记基因的复制的序列。可选择的标记基因促进对引入载体的宿主细胞的选择(参见例如美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如通常可选择的标记基因赋予已引入载体的宿主细胞以药物例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
在抗体或其抗原结合部分的示例性重组表达***中,通过磷酸钙介导的转染,将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中,每个抗体重链和轻链基因有效地连接至增强子/启动子调控元件(例如来源于SV40、CMV、腺病毒等,例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因,允许选择已用载体转染的用甲氨蝶呤选择/扩增的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链并且完整的抗体从培养基中恢复。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中恢复抗体。例如一些抗体可用蛋白质A或蛋白质G偶联的基质通过亲和层析进行分离。
对包括Fc结构域的抗体,抗体产生***可产生Fc区被糖基化的抗体。例如IgG分子的Fc结构域在CH2结构域的天冬酰胺297处被糖基化。天冬酰胺是双触角型(biantennary-type)寡糖的修饰位点。已显示这种糖基化对由Fcg受体和互补C1q调节的效应子功能是需要的(Burton和Woof,1992,Adv.Immunol.51:1-84;Jefferis等,1998,Immunol.Rev.163:59-76)。在一个实施方案中,Fc结构域产生与使天冬酰胺297对应的残基适当糖基化的哺乳动物表达***。Fc结构域还可包括其它的真核翻译后修饰。
还可通过转基因动物产生抗体。例如美国专利No.5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建出转基因,其其包括乳特异性启动子和编码目标抗体的核酸以及用于分泌的信号序列。由这些转基因哺乳动物的雌性产生乳汁,包括在其中分泌目标抗体。抗体可从乳汁中纯化,或对一些应用而言直接使用。
产生转基因小鼠的一种方法如下。简言之,编码抗体的靶标构建体显微注射到已受精的***的雄性原核中。***注射到假孕的养母子宫中以发育成能成活的幼崽。一些后代包含转基因。
FcRn候选抗体测定***
可在测定中进一步表征FcRn候选抗体以测量体外或体内其对FcRn或其片段的调节活性。例如在测定条件下,FcRn可与底物例如非特异性的IgG或IgG的Fc部分或白蛋白结合,从而允许FcRn和底物反应。在缺少FcRn候选抗体以及存在渐增浓度的FcRn候选抗体下进行测定。50%的FcRn活性(例如结合底物)被候选抗体抑制时,候选抗体的浓度是该抗体的IC50值(抑制浓度50%)或EC50(有效浓度50%)值。在一系列或一组候选抗体中,与那些有高IC50或EC50值的抗体相比,那些有低IC50或EC50值的抗体被认为是FcRn更有效的抑制剂。在一些实施方案中,如在体外对FcRn活性抑制的测定中所测量,抗体具有800nM、400nM、100nM、25nM、5nM、1nM或更低的IC50值。
还可评估候选抗体对FcRn的选择性。例如可测定FcRn候选抗体对FcRn和一组细胞表面受体的效力,例如也用β2Μ结构域的受体,且可确定每个受体蛋白的IC50值或EC50值。在一个实施方案中,显示对FcRn有低IC50值或EC50值且对测试组的其它受体有高IC50值或EC50值的化合物(例如MHCI类分子)被认为对FcRn有选择性。
在不同的pH和温度条件下,表达内源性FcRn的离体内皮细胞或上皮细胞可用于跟踪候选抗体的内吞作用或胞移作用。在各种化学物质存在或不存在的情况下在已知的改变或影响细胞内运输途径的不同条件下,可用下列标记抗体来测量通过FcRn的IgG的胞移或再循环。
可用pH依赖和非依赖的FcRn结合抗体进行大鼠、小鼠或猴子中的药代动力学研究,以确定它们在血清中的半衰期。同样地,可体内评估抗体在免疫调节治疗中的潜在用途或在标记的IgG或标记的IgG的Fc部分存在和不存在的情况下通过注射抗体而作为补救免疫疗法中的保护性影响。在候选抗体存在下,标记的IgG/Fc半衰期的减少是抗体治疗功效的指示。
药物组合物
在另一方面,本公开提供组合物,例如药学上可接受的组合物或药物组合物,其包含FcRn结合抗体。FcRn结合抗体可与药学上可接受的载体一起配制。药物组合物包括治疗组合物和诊断组合物,例如包括体内成像的标记的FcRn结合抗体组合物。
药学上可接受的载体包括任何和全部生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地,载体对静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)是适当的。依赖于施用途径,FcRn结合抗体可包覆在材料中以保护化合物免受酸作用和其它可使化合物失活的自然条件。
药学上可接受的盐是保留亲本化合物的期望的生物活性且不对其赋予不期望的毒物学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等,1977,J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些来源于非毒性无机酸的盐,例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等,以及来源于非毒性无机酸的盐,例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的羧酸、羟基羧酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括那些来源于碱土金属的盐,例如钠、钾、镁、钙等,以及来源于非毒性有机胺的盐,例如Ν,Ν'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
组合物可以是各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型,例如液体溶液(例如可注射的难溶溶液)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。形式可依赖于期望的施用模式和治疗应用。很多组合物是以可注射的非熔溶液形式,例如与那些和抗体用于人注射的相似的组合物。示例性施用模式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一个实施方案中,FcRn结合抗体通过静脉输注或注射而施用。在另一个实施方案中,FcRn结合抗体通过肌肉内或皮下注射而施用。
组合物可配制成溶液、微乳液、分散剂、脂质体或与高药物浓度相配的其它有序的结构。无菌注射溶液可通过将活性化合物以需要的量(即配体)合并到有一种或组合物成分的上述列举的适当溶剂中来制备,根据需要,然后过滤灭菌。一般来讲,分散剂通过将活性化合物合并到包含基本的分散剂介质和需要的其它成分的上述列举的灭菌的媒介物中来制备。在用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情况下,制备方法是真空干燥和冷冻干燥,从其预先灭菌过滤的溶液中生成活性成分的粉末和任何另外期望的成分。例如通过包衣如卵磷脂的使用,通过在分散剂的情况下且通过使用表面活性剂以保持需要的粒度来保持溶液适当的流动性。可通过组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。
可通过本领域已知的各种方法施用FcRn结合抗体,尽管对很多应用而言,施用的路径/模式是注射注射或输注。例如对治疗应用而言,FcRn结合抗体可通过静脉输注以小于30、20、10、5或1mg/min的速率而施用以达到约1至100mg/m2或7至25mg/m2的剂量。施用的路径和/或模式将根据期望的结果而不同。在某些实施方案中,活性化合物可用能保护化合物避免快速释放的载体来制备,例如包括植入物和微胶囊化的递送***的可控的释放配方。可使用生物降解的生物相容性的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸。制备这些配方的很多方法以申请专利或普遍已知。参见例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson编辑,1978,MarcelDekker,Inc.,NewYork.
在某些实施方案中,抗体可被口服施用,例如用惰性稀释剂或可吸收可食用的载体。化合物(和其它成分,如果期望)可附上硬壳或软壳明胶胶囊剂,被压缩成片剂或直接合并到受试者的饮食中。对于口服治疗施用,化合物可与赋形剂合并并以可吸收的片剂、颊部片剂、含片(troche)、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、干胶片(wafer)等形式使用。为通过除了肠胃外施用之外的方法施用本文公开的化合物,有必要用材料涂覆化合物或辅助施用化合物以防止其失活。
可用本领域已知的医疗装置来施用药物组合物。例如在一个实施方案中,本文公开的药物组合物可用例如无针皮下注射装置、泵或植入物的装置来施用。
在某些实施方案中,可配制FcRn结合抗体以确保体内合适分布。例如血脑屏障(BBB)排除很多高亲水性化合物。例如可用脂质体配制以确保本文公开的治疗化合物穿过BBB(如果期望)。对于制备脂质体的方法可参见例如美国专利No.4,522,811;5,374,548;和5,399,331.。脂质体可包含选择性地运输到特异性细胞或器官的一个或多个部分,因而增强靶向的药物递送(参见例如V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。
调整给药方案以提供最佳的期望的反应(例如治疗反应)。例如可施用单一的大丸剂、随时间多次分剂量施用或根据治疗形式的紧急状态成比例地减少或增加剂量。为方便施用和剂量均匀,制备单位剂型的肠胃外组合物是尤其有优点的。如本文所用的单位剂型是指物理上分离的单位,作为单位剂量适合治疗受试者;经计算每个单位包含预定量的活性化合物,与需要的药学上的载体联合以产生期望的治疗效果。单位剂量的规格可口述并直接取决于(a)活性化合物的独特特性和取得的特殊治疗效果,以及(b)在合成这样的活性化合物以对个体有治疗敏感性的领域中的固有限制。
本文公开的用于治疗上或预防上的抗体有效量的示例性非限制性的范围是0.1-20mg/kg或1-10mg/kg。例如可通过静脉输注施用抗-FcRn抗体,例如以小于30、20、10、5或1mg/min的速率以达到约1至100mg/m2或约5至30mg/m2的剂量。剂量值可随需缓解的病症的类型和严重程度而不同。对于特殊的受试者,根据其个体需要和施用或监督组合物施用的人的职业判断,可随时间而调整特异性给药方案。
本文公开的药物组合物可包括本文公开的FcRn-结合抗体的治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在剂量下并持续一段必要的时间以达到期望的治疗结果的有效的量。组合物的治疗有效量可根据例如疾病状态、年龄、性别、个体体重和个体中引起期望反应的抗体能力的因素而不同。治疗有效量还指其中的组合物的任何毒性或有害影响被其治疗有利影响而超过。
稳定化和保持性
在一个实施方案中,FcRn-结合抗体与在循环中例如在血液、血清、淋巴或其它组织中提高其稳定化和/或保持性的部分物理联系,例如通过至少1.5、2、5、10或50倍。例如FcRn-结合抗体可与聚合物结合,例如大体上非抗原聚合物如聚亚烷基氧化物或聚乙烯氧化物。适当的聚合物将大体上根据重量而发生变化。可使用分子数量平均重量在从约200至约35,000(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)范围的聚合物。例如FcRn-结合抗体可共轭到水溶性聚合物上,例如亲水性聚乙烯聚合物,例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。这些聚合物的非限制性列表包括聚亚烷基氧均聚物,例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇,聚氧乙烯多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物,条件是嵌段共聚物保持其水溶性。
试剂盒
本文描述的FcRn-结合抗体可在试剂盒中提供,例如作为试剂盒的组分。例如试剂盒包括(a)FcRn-结合抗体,例如包含FcRn-结合抗体的组合物,并且任选地(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、市场化的或其它与本文描述的方法和/或本文描述的方法的FcRn-结合抗体的使用有关的材料
试剂盒的信息材料不限于其形式。在一个实施方案中,信息材料可包括化合物的制备、化合物的分子量、浓度、药品有效期、批次或生产地点信息等。在一个实施方案中,信息材料与治疗、预防或诊断本文描述的病症例如自身免疫病症的抗体的使用相关。
在一个实施方案中,信息材料可包括以适当的方式施用FcRn-结合抗体以进行本文描述的方法的说明,例如以适当的剂量、剂型或施用模式(例如本文描述的剂量、剂型或施用模式)。在一个实施方案中,信息材料可包括对适当的受试者施用FcRn-结合抗体的说明,例如人,例如患有或有自身免疫病症(例如类风湿性关节炎或***性红斑狼疮)风险的人。例如材料可包括对有狼疮的患者或有其它自身免疫病症的患者施用FcRn-结合抗体的说明。
试剂盒的信息材料不限于其形式。在很多情况下,信息材料例如说明以印刷的方式提供。例如印刷的文本、图画和/或照片,例如标记的或印刷的页。然而,信息材料还可以其它方式提供,例如计算机可读取的材料、视频记录或声音记录。在一个实施方案中,试剂盒的信息材料是接触信息,例如物理地址、邮件地址、网页或电话号码,其中试剂盒的使用者可获得关于FcRn-结合抗体和/或其在本文描述的方法中的使用的大量信息。信息材料还可以形式的任何组合来提供。
除了FcRn-结合抗体之外,试剂盒的组合物可包括其它成分,例如溶剂或缓冲液、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如苦的拮抗剂或甜味剂)、芳香剂或其它化妆品成分和/或用于治疗本文描述的自身免疫病症例如类风湿性关节炎或***性红斑狼疮的第二种试剂。可选地,试剂盒可包括其它成分,但比FcRn-结合抗体以不同的组合物或容器。在这些实施方案中,试剂盒可包括混合FcRn-结合抗体和其它成分的说明或FcRn-结合抗体与其它成分一起使用的说明。
FcRn-结合抗体可以任何形式提供,例如液体、干燥或冻干形式。优选的是,FcRn-结合抗体是大体上纯的和/或灭菌的。当FcRn-结合抗体以液体溶液提供,液体溶液优选水溶液,优选灭菌的水溶液。当FcRn-结合抗体以干燥形式提供,重构通常是通过添加适当的溶剂。可任选地在试剂盒提供溶剂,例如灭菌的水或缓冲液。
对包含FcRn-结合抗体的组合物,试剂盒可包括一种或多种容器。在一些实施方案中,试剂盒包含单独的容器、分割器或组合物区室以及信息材料。例如,组合物可容纳在瓶、小瓶、或注射器中,且信息材料可容纳在塑料套管或小包中。在其它实施方案中,试剂盒单独的元件容纳在单一的未分开的容器中。例如组合物容纳在瓶、小瓶、或注射器中,其以标签的形式另外附加到信息材料上。在一些实施方案中,试剂盒包括多个(例如包装)单个的容器,每个包含一种或多种FcRn-结合抗体的单位剂型(例如本文描述的剂型)。例如试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包装或泡罩包装,每个包含FcRn-结合抗体单一的单位剂量。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如对湿度或蒸发的变化不渗透)和/或不透光的。
试剂盒任选地包括适合施用组合物的装置,例如注射器、吸入器、移液管、镊子、称量匙、滴管(例如滴眼管)、拭子(例如棉签或木制拭子)或任何这样的递送装置。在一个实施方案中,装置是分配计量的抗体剂量的植入装置。本公开还表征了例如通过结合本文描述的组分提供试剂盒的方法。
治疗
结合FcRn并通过本文描述的和/或本文详述的方法鉴定的抗体有治疗和预防用途。这些抗体可施用于受试者以治疗、防止和/或诊断各种病症包括自身免疫病症或甚至到例如体外或离体培养的细胞。
术语“治疗”是指以统计学上的显著程度或以本领域的技术人员可检测的程度,以有效的数量、方式和/或模式施用疗法以改善病况、症状或与病症有关的参数以阻止病症进展。有效的量、方式和/或模式可根据受试者而变化,且可被调节以适应受试者。受试者可以是人或非人动物例如非人哺乳动物。
FcRn-结合抗体可以治疗有效量而施用,例如向受试者施用单一的或多个剂量,受试者展示出病症例如自身免疫病症(例如类风湿性关节炎或***性红斑狼疮)的症状改善或病症存在或风险的表示参数的改善。
影响身体很多器官或局部器官的示例性病症包括:多发性硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、狼疮和强直性脊柱炎。一些这样的病症在下面讨论。一方面,本发明提供治疗癌症的方法。还有其它可用FcRn-结合抗体治疗的病症包括:硬皮病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)、肺出血肾炎综合征(Goodpasture,ssyndrome)、韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合症、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生性疾病(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特病(Behcet’sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻皮肤炎、慢性疲劳免疫失调综合症(CFIDS)、慢性脱髓鞘性神经炎、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合症、克罗恩氏病、恶性萎缩性丘疹病(Dego'sdisease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、必需混合性冷球蛋白血症、纤维组织肌痛、纤维性肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖糖尿病(I型)、幼年型关节炎、美尼尔氏病、混合性结蒂组织病、重症肌无力、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、副肿瘤天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、结节病、僵人综合征、大动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风。
在一些实施方案中,施用抗FcRn-结合抗体以从血流中移除不需要的治疗性抗体。
在一些实施方案中,施用抗FcRn-结合抗体以抑制抗-HLA抗体水平。在一些实施方案中,抗-HLA抗体的水平被抑制与器官移植有关。
施用FcRn-结合抗体的方法描述于"PharmaceuticalCompositions"。所用分子的合适剂量将依赖于受试者的年龄和体重以及所用的特殊药物。抗体可用作竞争性试剂以抑制或减少不期望的例如天然或病理学试剂和FcRn之间的相互作用。
FcRn-结合抗体可用于将大分子和微分子例如基因递送到细胞到内皮或上皮并仅靶向那些表达FcRn的组织用于基因治疗目的。抗体可用于递送各种细胞毒性药物,包括治疗药物、散发辐射的化合物、起源于植物、真菌或细菌的分子、生物蛋白和其混合物。细胞毒性药物可以是细胞内发挥作用的细胞毒性药物,例如短距离辐射发射体包括例如如本文描述的,短距离高能量α-发射体。
在多肽毒素的情况下,重组核酸技术可用于构建编码抗体和细胞毒素(或其多肽组分)的核酸作为翻译融合。然后重组核酸表达例如在细胞中且分离编码的融合多肽。
可选地,FcRn-结合抗体可偶联到高能量辐射发射体上,例如放射性同位素,如131I、γ-发射体,当定位于位点,其导致几个细胞直径的杀伤。参见例如S.E.Order,"Analysis,Results,andFutureProspectiveoftheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyinCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy,R.W.Baldwin等,(编),pp303316(AcademicPress1985)。其它适当的放射性同位素包括a发射体例如212Bi、213Bi和211At,和b发射体例如186Re和90Y。而且,177Lu也可用作成像和细胞毒素试剂。
使用131I、90Y和177Lu标记的抗体的放射免疫疗法(RIT)处于紧密的临床观察之中。这三个核素的物理特征有显著差异,并且结果为了给目标组织递送最大的辐射剂量,放射性核素的选择是非常关键的。90Y较高的β能量颗粒对体积大的肿瘤可能是好的。131I相对低能量的β颗粒是理想的,但在体内放射性碘化的分子的脱卤作用对内在化抗体是主要的缺点。相比之下,177Lu有低能量的仅0.2至0.3mm范围的β颗粒且给骨髓递送与90Y相比低得多的辐射剂量。此外,由于较长的物理半衰期(与90Y相比),居留时间更高。结果,可施用177Lu标记的试剂的较高活性(更多的mCi量),对骨髓有相对低的辐射剂量。有几个临床研究观察到在各种癌症的治疗中177Lu标记的抗体的使用(MulliganT等,1995,Clin.Cane.Res.1:1447-1454;MeredithRF,等,1996,J.Nucl.Med.37:1491-1496;AlvarezRD,等,1997,Gynecol.Oncol.65:94-101)。
治疗自身免疫的治疗方法的使用有有许多益处。因为抗体特异性识别FcRn,其它组织是备用的且高水平的试剂被直接递送到需要治疗的位点。可有效监控治疗的临床参数。可选地,这些参数可用于指示何时应采用这种治疗。
FcRn-结合抗体可与一种或多种存在的形式联合施用以治疗自身免疫病症,包括但不限于:静脉Ig治疗、非甾体抗炎药物(NSAID)和皮质类固醇;抗炎治疗例如环孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制类似物,例如环孢菌素A、环孢菌素G、FK-506、雷帕霉素、40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素等;环磷酰胺;咪唑硫嘌呤;甲氨蝶呤;布喹那;FTY720;来氟米特;咪唑立宾;霉酚酸;霉酚酸酯;15-去氧精胍菌素;免疫抑制单克隆抗体,例如白细胞受体的单克隆抗体,例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45或CD58或其配体;或其它免疫调节化合物,例如CTLA4Ig,或其它粘附分子抑制剂,例如mAbs或低分子量抑制剂包括选择拮抗剂和VLA-4拮抗剂。这些组合疗法可以是部分免疫调节方案或治疗方案或阻止同种或异种移植的急性和慢性排斥、炎症病症或自身免疫病症。
多发性硬化
多发性硬化(MS)是以炎症和髓鞘的缺失为特征的中枢神经***疾病。
通过诊断MS的研讨通过诊断MS的临床确立诊断的建立标准鉴定有MS的患者(Poser等,Ann.Neurol.13:227,1983)。还可通过两次发作的迹象和脑脊髓液体中IgG的寡克隆带或通过结合发作、两个病灶的临床迹象和脑脊髓液体中IgG的寡克隆带来诊断MS。McDonald标准也可用于诊断MS。McDonald等,(2001)Recommendeddiagnosticcriteriaformultiplesclerosis:guidelinesfromtheInternationalPanelontheDiagnosisofMultipleSclerosis,AnnNeurol50:121-127。McDonald标准包括在没有多次临床发作的情况下,使用CNS缺损随时间的MRI迹象以用于诊断MS。
多发性硬化的有效治疗可以几种不同的方式进行评估。下列参数可用于测量治疗效力。两种示例性标准包括:EDSS(残疾状态扩展评分)以及MRI恶化的表现(磁共振成像)。EDSS是由于MS将临床缺损分级的手段(Kurtzke,Neurology33:1444,1983)。用八种功能化的***评估神经功能缺损的类型和严重程度。简言之,治疗前用下列***评估患者的缺损:椎体、小脑、脑干、感觉、肠和膀胱、视觉、大脑和其它。下列按限定的间隔来进行。规模在0(正常)至10(归因于MS的死亡)的范围。一个完整步骤的减少可指示治疗有效(Kurtzke,Ann.Neurol.36:573-79,1994)。
与可用本文描述的方法进行治疗的多发性硬化有关的典型症状可包括:视神经炎、复视、眼球震颤、眼部测距不准、核间眼肌麻痹、运动和声音光幻视、瞳孔传入障碍、麻痹性痴呆、单肢轻瘫、下肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、瘫痪、截瘫、偏瘫、四肢瘫痪、四肢麻痹、痉挛状态、构音障碍、肌肉萎缩、痉挛、抽筋、肌张力减退、阵挛、肌阵挛、肌纤维颤搐、不宁腿综合症、足下垂、机能失调反应、感觉异常、麻醉、神经痛、神经性和神经源性疼痛、莱尔米特氏(L'Hermitte's)体征、本体感觉障碍、三叉神经痛、共济失调、意向震颤、测距不准、前庭共济失调、眩晕、演讲共济失调、肌张力障碍、轮替运动障碍、频繁排尿、膀胱痉挛状态、弛缓性膀胱、逼尿肌-***协同失调、男性***功能障碍、性快感缺乏、性冷感、便秘、粪便紧迫性、大便失禁、抑郁、认知功能障碍、痴呆、情绪波动、情绪不稳定性、兴奋、双相情感障碍综合症、焦虑、失语症、语言障碍、疲劳、乌托夫症状(uhthoff'ssymptom)、胃食管反流和睡眠障碍。
除了或在人研究之前,动物模型可用于评估使用两种试剂的功效。多发性硬化的典型动物模型是例如(Tuohy等,(J.Immunol.(1988)141:1126-1130),Sobel等,(J.Immunol.(1984)132:2393-2401)中所述实验性自身免疫脑炎(EAE)小鼠模型和Traugott(CellImmunol.(1989)119:114-129)。在EAE感应之前可给小鼠施用本文描述的第一种和第二种试剂,然后评估小鼠的特征标准以确定在模型中使用两种试剂的功效。
炎性肠道疾病
炎性肠道疾病(IBD)一般包括慢性、复发肠炎。IBD是指两种不同的病症,克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)。IBD的临床症状包括:间歇性直肠出血、腹部痉挛疼痛、体重下降和腹泻。临床指标例如溃疡性结肠炎的临床活性指标还可用于监测IBD。另外参见Walmsley等,Gut.1998Jul;43(l):29-32和Jowett等,(2003)ScandJGastroenterol.38(2):164-71。FcRn-结合抗体可用于改善IBD的至少一种症状或改善IBD的临床指标。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎是引起疼痛、肿胀、僵硬和关节功能丧失的自身免疫炎性疾病。类风湿性关节炎经常提呈匀称的模式。疾病可影响腕关节和最靠近手的指关节。它还可影响关节之外的身体的其它部分。此外,患有类风湿性关节炎的人可能有疲劳、偶尔发烧和一般的不舒服。诊断类风湿性关节炎的积极因素包括"类风湿因子"血液抗体和瓜氨酸抗体。FcRn-结合抗体在治疗、防止或缓解类风湿性关节炎或类风湿性关节炎的一种或多种症状中是有用的。
狼疮
***性红斑狼疮(SLE)是导致各种身体组织炎症和损害的自身免疫病症。SLE可通过指导对抗其自身DNA的自身抗体来调节。狼疮可影响身体的很多部分,包括关节、皮肤、肾脏、心脏、肺、血管和大脑。虽然可提呈各种症状,最普遍的一些包括极度疲劳、关节疼痛或肿胀(关节炎)、原因不明的发热、皮疹、和肾脏问题。狼疮的典型症状包括关节疼痛或肿胀、不明原因的发热和极度疲劳。特有的红色皮疹可能出现在鼻子和脸颊。皮疹还可能出现在脸上和耳朵、上臂、肩膀、胸部和手。狼疮的其它症状包括胸痛、头发丧失、贫血、口腔溃疡和来自冷和压力的苍白或紫的手指和脚趾。也有些人经历头痛、眩晕、抑郁、困惑或癫痫发作。SLE诊断的积极因素包括循环的抗核抗体、抗DNA抗体和抗-Sm抗体。FcRn-结合抗体可用于治疗、防止或缓解SLE或SLE的一种或多种症状。如本文所用的狼疮包括皮肤狼疮和肾炎狼疮。
免疫性血小板減少症(ITP)
ITP是增加***血小板破坏的疾病,其中患者生成结合特异性的血小板膜蛋白的抗体。抗血小板抗体使血小板接受调理素作用,导致了巨噬细胞的破坏。治疗ITP的尝试通常涉及抑制引起血小板水平增加的免疫***。FcRn-结合抗体可可用于治疗、阻止或缓解ITP或其一种或多种症状。
强直性脊柱炎
强直性脊柱炎是不仅影响脊柱,还可在骨骼和关节周围的肌腱和韧带发炎导致疼痛和僵硬时影响髋部、肩膀和膝盖的自身免疫病症。强直性脊柱炎倾向于影响后***和成年早期的人。FcRn-结合抗体可用于治疗、防止或缓解强直性脊柱炎或其一种或多种症状。
天疱疮
天疱疮是影响黏膜和皮肤的自身免疫病症。病症以产生对桥粒芯蛋白的自身抗体为特征。桥粒芯蛋白是钙粘素家族的蛋白质且涉及将细胞互相连接的细胞桥粒的形成。可将天疱疮分类为三种类型之一:寻常天疱疮,病症最普遍的形式,其中自身抗体靶向桥粒芯蛋白3。落叶型天疱疮产生对桥粒芯蛋白1的自身抗体。第三种类型且最不普遍的病症是副肿瘤天疱疮,其中自身抗体靶向与癌症例如淋巴瘤有关的桥粒斑蛋白。通常通过皮肤科医生对皮肤外观且遵照对桥粒芯蛋白自身抗体的检测来诊断病症。治疗方法包括施用类固醇和/或施用CD20抗体例如利妥昔单抗(Rituxan)。
癌症
如本文所用的"癌症"是指细胞不可控制地生长,其干涉了身体器官和***的正常功能。癌症从它们起源的位置迁移并种植在可通过受影响的器官功能性的恶化最终导致受试者死亡的至关重要的器官。癌是产生于上皮细胞并包括腺瘤和鳞状细胞癌的恶性癌症。肉瘤是连接或支持组织的癌症并包括骨肉瘤、软骨肉瘤和胃肠道间质瘤。造血癌症例如白血病,能胜过受试者正常的造血隔间,从而导致造血失败(以贫血、血小板减少和嗜中性白血球减少症的形式)最后引起死亡。本领域的普通技术人员可将癌症分为肉瘤、癌或造血癌症。
如本文所用,癌症包括下列类型的癌症:乳腺癌、胆汁束癌、膀胱癌、脑癌包括恶性胶质瘤和成神经细胞瘤、***、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、血液肿瘤包括急性淋巴细胞和粒细胞性白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、毛细胞白血病、铬骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、AIDS-相关的白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤、上皮内肿瘤包括博文氏病和佩吉特氏疾病、肝癌、肺癌、淋巴瘤包括何杰金氏病和淋巴细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、口腔癌包括鳞状细胞癌、卵巢癌(包括那些来源于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间叶细胞)、胰腺癌、***癌、直肠癌、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)、皮肤癌包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、嗜碱性粒细胞癌、和鳞状细胞癌、睾丸癌包括例如***瘤和非***瘤(畸胎瘤、绒膜癌)的胚肿瘤、间质肿瘤、和生殖细胞肿瘤、甲状腺癌包括甲状腺腺癌和髓癌、和肾癌包括腺癌和肾母细胞瘤。其它癌症将被本领域的普通技术人员所熟知。
胎儿治疗
FcRn介导母体IgG跨过上皮细胞障碍运输到胎儿。本文描述的抗体可用于递送大分子药物例如抗生素和/或小分子到子宫的胎儿。胎儿可能患需要治疗的病况或病症(例如肠感染或代谢病症)。用于治疗病况或病症的药物或分子可共轭到FcRn-结合抗体并施用于子宫中的胎儿需要治疗的孕妇。共轭的FcRn-结合抗体结合FcRn并且从而经过胎盘被运输到胎儿。胎儿接受药物或分子治疗。
免疫吸附
在一些实施方案中,本发明提供了从个体中移除不需要的治疗性抗体的方法。在一些实施方案中,不需要的治疗性抗体是IgG抗体。在一些实施方案中,不需要的治疗性抗体是抗VLA4抗体例如那他珠单抗(Tysabri,BiogenIdec/Elan)、依法珠单抗(Raptiva,Genentech)、贝伐珠单抗(Avastin,Genentech)和Fc融合蛋白例如依那西普(Enbrel,Amgen/Wyeth)。那他珠单抗单克隆抗体治疗和进行性多灶性白质脑病(PML)有关。治疗性抗体从血流和/或身体其它部位的消耗可改变PML的进展。
在一些实施方案中,本文提出的治疗方法可与方法结合以从受试者的血流中移除或部分移除治疗性抗体。在一些实施方案中,本文提出的抗-FcRn抗体可与能结合治疗性抗体的捕获蛋白结合,结合导致治疗性抗体血流清除率的增加。在一些实施方案中,从受试者的血流中移除或部分移除治疗性抗体的方法是血浆交换(PLEX)。在一些实施方案中,抗-FcRn抗体可施用于经历血浆交换的受试者。在一些实施方案中,抗-FcRn抗体在血浆交换过程中可用作FcRn的免疫吸附剂。
在血浆交换(也称血液成分分离或血浆去除法)中,血液取自身体并且通过细胞分离器从血液中移除包含不需要的试剂例如胆固醇或治疗性抗体的血浆。血液可从机体分批移除或者它可以连续流的模式移除,且后者考虑到处理过的血液再引入到身体。弃去包含不需要的试剂的移除的血浆并且患者可接受捐赠的血浆或加入蛋白质作为回报的生理盐水。在一些实施方案中,为从血液中移除不需要的试剂,可能需要多轮血浆交换以使血液中不需要的试剂的水平降到可接受的水平。在一些实施方案中,血液“被过滤”且在将血液返回患者之前移除不需要的试剂。血浆交换的方法对本领域的技术人员是已知的,并在例如US6,960,178中描述。
已显示血浆交换减少了受试者的血液中治疗性抗体的水平并且恢复动态平衡(参见例如Khatri等,2009;Neurology72:402-409)。
通过用结合IgG的Fc区并从血流中移除IgG的捕获蛋白葡萄球菌蛋白A接触血液,可从血液、血浆或血清中移除基于IgG的治疗性抗体(例如那他珠单抗)。其它获质可用于不同的同种型抗体。在一些实施方案中,在血浆交换过程中抗-FcRn抗体可用作捕获蛋白,导致FcRn从血流中移除,从而增加"游离的"治疗性抗体的量。作为结果的"游离的"治疗性抗体在治疗前比现在的抗体将有较短的半衰期,和/或可用不同的捕获蛋白(例如蛋白A)更容易地从血液中移除。在一些实施方案中,抗-FcRn抗体在血浆交换过程中或之前施用于患者。在一些实施方案中,FcRn抗体可以是固定的并且以柱形式使用,导致结合FcRn。在一些实施方案中,用固定的抗-FcRn抗体和固定的蛋白A接触包含治疗性抗体的患者的血液。
在一些实施方案中,对于已经施用并且已表现出不利影响的治疗性抗体,本文提出的抗-FcRn抗体用于"援救"治疗。在一些实施方案中,抗-FcRn抗体可用作血浆交换的替代物。施用抗FcRn可实现治疗性抗体的消耗,没有与血浆去除法和血浆交换相关的风险,例如血管通路、柠檬酸治疗和捐赠血浆来源。
人白细胞抗原
人白细胞抗原(HLA)在细胞外提呈肽和抗原,随后被T-细胞识别,其反过来激活B细胞。可用的HLA基因组对每个人是独特的。任何展示“非自身”HLA的细胞将导致免疫反应的感应。一般地,“非自身”HLA与自身HLA越不同,免疫反应越强。例如,在器官移植的情况下,有相似HLA基因的受试者优选地将免疫反应最小化。已发现,捐赠-特异性HLA抗体与肾、心脏、肺和肝移植的移植失败有关。
在一些实施方案中,本发明提供降低个体内“非自身”HLA抗体水平的方法。降低“非自身”HLA抗体水平可导致免疫反应的抑制,例如在器官移植期间。在一些实施方案中,将抗FcRn抗体施用于将经历器官移植的人。在一些实施方案中,将抗FcRn抗体施用于正在经历器官移植的人。在一些实施方案中,将抗FcRn抗体施用于已经接受器官移植的人。测量HLA抗体水平的测定对本领域是熟知的。
诊断用途
结合FcRn且通过本文描述的和/或本文详述的方法鉴定的抗体在体外和体内有诊断用途。
一方面,本公开提供诊断方法用以检测体外或体内FcRn的存在(例如受试者体内成像)。该方法可包括将FcRn定位于例如胞内体的亚细胞位置。该方法可包括:(i)使样品与FcRn-结合抗体接触;和(ii)检测FcRn-结合抗体和样品间复合物的形成。该方法还可包括用抗体接触参照样品(例如对照样品),并确定与参照样品与抗体形成的复合物相比,抗体和样品间复合物的形成程度。与对照样品或受试者相比,样品或受试者中复合物形成中的变化例如统计学显著性变化可象征样品中FcRn的存在。
另外的示例性方法包括:(i)向受试者施用FcRn-结合抗体;和(iii)检测FcRn-结合抗体和受试者之间复合物的形成。检测可包括确定复合物形成的位置或时间。
可用可检测的底物直接或间接标记FcRn-结合抗体以促进结合的或未结合的抗体的检测。适当的检测底物包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
可通过测量或显现结合FcRn的抗体或未结合的抗体来检测FcRn-结合抗体和FcRn之间复合物的形成。可用传统的检测测定,例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或免疫组化。进一步标记FcRn-结合抗体,利用可检测的底物标记的标准和未标记的FcRn-结合抗体,通过竞争免疫测定可测定样品中FcRn的存在。在本测定的一个实施例中,生物样品、标记的标准和FcRn-结合抗体结合一起,且确定结合未标记的抗体上的标记的标准的量。样品中FcRn的量与结合FcRn-结合抗体的标记的标准的量成反比。
可制备荧光和发光标记的抗体。因为抗体和其它蛋白质吸收波长多达约310nm的光,荧光部分应该选择吸收波长大致在310nm以上且优选地在400nm以上。各种合适的荧光剂和发光剂描述于Stryer,1968,Science162:526和Brand,L.等,1972,Annu.Rev.Biochem.41:843868。通过传统的程序例如那些公开于美国专利No.3,940,475、4,289,747和4,376,110,可用荧光发光基团标记抗体。具有许多期望性质的一个荧光基团是包括荧光素和罗丹明的呫吨染料。荧光化合物的另一个基团是萘胺。一旦用荧光团或发光团标记,抗体可用于检测样品中FcRn的存在和位置,例如用荧光显微镜(例如共焦或反卷积显微镜)。
组织学分析。使用本文描述的抗体进行免疫组化。例如可用标记合成抗体(例如纯化或表位标签),或用可检测的标记,例如通过偶联标记或标记结合基团。例如螯合剂可附接到抗体上。然后抗体接触组织学制剂,例如显微镜载片上的组织的固定部分。孵育结合后,洗涤制剂以移除未结合的抗体。然后分析制剂,例如用显微镜以鉴定是否抗体结合制剂上。
当然,在结合时抗体可不被标记。结合和洗涤后,标记抗体以使其可检测。
蛋白质测定。在蛋白质阵列中,FcRn-结合抗体也可被固定。蛋白质阵列可用作诊断工具,例如为筛选医学样品(例如分离的细胞、血液、血清、活检物等)。当然,蛋白质阵列还可包括其它配体,例如结合FcRn或其它靶分子的配体。
产生多肽阵列的方法描述于例如DeWildt等,2000,Nat.Biotechnol.18:989-994;Lueking等,1999,Anal.Biochem.270:103-111;Ge,2000,NucleicAcidsRes.28,e3,I-VII;MacBeath和Schreiber,2000,Science289:1760-1763;WO01/40803和WO99/51773A1。阵列的多肽可高速点样,例如用可商购获得的机器人器械,例如来自GeneticMicroSystems或BioRobotics。阵列底物可以是例如硝化纤维、塑料、玻璃例如表面修饰的玻璃。阵列还可包括多孔矩阵,例如丙烯酰胺、琼脂糖或另外的聚合物。
例如,阵列可以是抗体阵列,例如在DeWildt,supra中描述的。产生抗体的细胞可以阵列的形式生长在滤器上。在细胞的位置诱导抗体产生且表达的多肽固定于滤器。抗体阵列可用标记的靶标接触以确定靶标到每个固定的抗体的结合程度。关于阵列每个地址结合程度的信息可储存成特征,例如在计算机数据库中。抗体阵列可复制产生并可用于比较例如靶标的和非靶标的结合特征。
FACS(荧光激活细胞分选)。FcRn-结合抗体可用于标记细胞,例如样品中的细胞(例如患者样品)。抗体也附接(或可附接到)到荧光化合物上。然后可用荧光激活细胞分选仪分选细胞(例如使用可从BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJoseCA获得的分选仪;还参见美国专利No.5,627,037、5,030,002和5,137,809)。当细胞穿过分选仪,激光束激发荧光化合物同时检测器计数穿过的细胞并通过检测荧光确定是否荧光化合物附接到细胞。结合每个细胞的标记量可被定量和分析以表征样品。
分选仪还可使细胞转向并从那些没有被抗体结合的细胞中分离被抗体结合的细胞。可培养和/或表征分离的细胞。
体内成像。还被表征的是检测体内表达FcRn的组织的存在的方法。该方法包括(i)向受试者(例如有自身免疫病症的患者)施用共轭到可检测标记物的抗-FcRn抗体;(ii)使受试者暴露于检测上述可检测的标记物到表达FcRn的组织或细胞的方法。例如使受试者成像,例如通过NMR或其它层析成像方法。
对诊断成像有用的标记的实例包括放射性同位素标记,例如131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C和188Rh,荧光标记例如荧光素和罗丹明,核磁共振活性标记,通过正电子发射断层摄影术("PET")扫描仪检测的正电子发射同位素,化学发光物例如荧光素和酶标记物例如过氧化物酶或磷酸酶。可应用短距离辐射发射体,例如通过短距离检测器探针可检测到的同位素。用已知的技术可用这样的试剂标记抗体。例如与放射性标记的抗体有关的技术可参见Wensel和Meares,1983,RadioimmunoimagingandRadioimmunotherapy,Elsevier,NewYork以及D.Colcher等,1986,Meth.Enzymol.121:802816。
放射性标记的抗体还可用作体外诊断测试。同位素标记的抗体的特异活性依赖于半衰期、放射性标记的同位素纯度和标记如何与抗体合并。
普遍已知用放射性同位素(例如14C、3H、35S、125I、32P、131I)标记多肽的程序。例如氚标记的程序描述于美国专利No.4,302,438。碘化的、氚标记的和35S标记的程序,例如适用于鼠单克隆抗体,例如通过Goding,J.W.(Monoclonalantibodies:principlesandpractice:productionandapplicationofmonoclonalantibodiesincellbiology,biochemistry,andimmunology第2版,London;Orlando:AcademicPress,1986.第124-126页)进行描述,且本文引用参考文献。碘化多肽例如抗体的其它程序由Hunter和Greenwood,1962,Nature144:945,David等,1974,Biochemistry13:10141021,和美国专利No.3,867,517和4,376,110描述。在成像中有用的放射性标记的元件包括例如123I、131I、111In和99mTc。碘化抗体的程序描述于Greenwood,F.等1963,Biochem.J.89:114123;Marchalonis,J.,1969,Biochem.J.113:299305;和Morrison,M.等,1971,Immunochemistry289297。99mTc标记的程序描述于Rhodes,B.等,inBurchiel,S.等(编),TumorImaging:TheRadioimmunochemicalDetectionofCancer,NewYork:Masson111123(1982),且本文引用参考文献。适合111In标记抗体的程序描述于Hnatowich,D.J.等,1983,J.Immunol.Methods,65:147157,Hnatowich,D.等,1984,J.AppliedRadiation,35:554557,和Buckley,R.G.等,1984,F.E.B.S.166:202204。
在放射性标记的抗体的情况下,抗体施用于患者,定位于细胞承受着与抗体反应的抗原,且用已知的技术例如放射性核素扫描,用例如γ照相机或发射断层摄影术,抗体在体内被检测或"被成像"。参见例如A.R.Bradwell等,"DevelopmentsinAntibodyImaging",MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy,R.W.Baldwin等,(编),第65-85页(AcademicPress1985)。可选地,正电子发射断层照相术扫描仪,例如位于布鲁克海文国家实验室指定的PetVI,可用在放射性同位素标记发射正电子处(例如11C、18F、15O和13N)。
MRI对比剂。磁共振成像(MRI)使用NMR以显现活的受试者的内部特征,且对预后、诊断、治疗和手术是有用的。没有放射性示踪化合物时使用MRI有明显益处。一些MRI技术概括于EP-A-0502814中。一般地,在不同环境下,与水质子弛豫时间常数T1和T2相关的差异用于产生图像。然而这些差异不足以提供急剧的高分辨率图像。
这些弛豫时间常数的差异可通过对比试剂来增强。这些对比试剂的实例包括许多磁性试剂、顺磁性试剂(主要改变T1)和铁磁性或超顺磁性(主要改变T2反应)。螯合物(例如EDTA、DTPA和NTA螯合物)可用于附着(并减小毒性)一些顺磁性物质(例如Fe+3、Mn+2、Gd+3)。其它试剂可以颗粒形式,例如直径小于10mm至约10nM)。颗粒可有铁磁性、反铁磁性或超顺磁性的性质。颗粒可包括例如磁铁矿(Fe3O4)、γ-Fe2O3、铁氧体和其它转换元件的磁性矿物质化合物。磁性颗粒可包括有和没有非磁性物质的一种或多种磁性晶体。非磁性物质可包括合成或天然聚合物(例如琼脂糖、右旋糖酐、糊精、淀粉等。
还可用指示的基团标记FcRn-结合抗体,所述基团包含NMR活性19F原子或多个此类原子,因为(i)大体上所有天然的丰富的氟原子是19F同位素,且因此大体上所有氟包含化合物是NMR活性的;(ii)很多化学上有活性的多氟化合物例如三氟醋酸酐可以低价格商业购得;和(iii)已发现很多氟化的化合物医学上人用可接受,例如全氟化的聚醚作为血红蛋白代替品用于携带氧气。允许这样的孵育时间后,用装置(例如描述于Pykett,1982,Sci.Am.246:7888中的装置之一)实施全身MRI,以对表达FcRn的组织进行定位和成像。
本公开还表征了试剂盒,其包含结合FcRn的抗体并用于诊断使用说明,例如使用FcRn-结合抗体或其抗原结合片段以体外检测FcRn,例如在样品中,例如来自有自身免疫病症的患者的活检物或细胞,例如通过成像受试者。试剂盒可进一步包含至少一个另外的试剂,例如标记或另外的诊断试剂。为体内使用抗体可配制成药物组合物。
本发明通过下列实施例进一步阐述,其决不应该被翻译作为进一步的限制。本申请通篇引用的所有参考文献的全部内容(包括参考文献、授权的专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)在此通过引用并入本文,特别是对上文引用的教导。