JP2020511117A5 - - Google Patents
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ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
抗体重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および抗体軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、HCVRおよびLCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のHCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドである、重鎖(HC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のLCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドである、軽鎖(LC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)前記HCストランドを前記LCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目2)
前記HCエレメントが、重鎖可変領域配列(HCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記LCエレメントが、軽鎖可変領域配列(LCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記核酸配列が、発現した時、前記HCエレメントおよび前記LCエレメントが、in vitro、ex vivo、またはin vivoで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下:
a)以下:
(i)前記細胞由来の前記HCVRをコードする第1のmRNAに相補的であるストランドを含む第1の二本鎖cDNA(ds cDNA);および
(ii)前記細胞由来の前記LCVRをコードし、捕捉支持体を生成する第2のmRNAに相補的なストランドを含む第2のds cDNA、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
b)前記第1および前記第2のds cDNAの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下:
前記細胞由来の前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のHC ds cDNA、および
前記細胞由来の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のLC ds cDNA
を産生する、ステップ
を含む、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記捕捉支持体が、ビーズ、およびcDNAと結合する部分を含む、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記隔離された産生反応部位が、前記第1および前記第2のmRNAから、前記細胞の前記HCVRの前記HCエレメント、をコードするセグメントを含む第1のds cDNA、および前記細胞の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む第2のds cDNAを産生するのに適した試薬混合物を含む、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記第1のds cDNAおよび前記第2のds cDNAが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも1つが、第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させる、項目5〜7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記ヌクレオチド修飾が、2個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記プライマーの少なくとも1つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項目8〜10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記HC ds cDNAが、5’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記LC ds cDNAが5’オーバーハングおよび平滑末端を含む、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記HCストランドおよび前記LCストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記HCおよびLCストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目1〜13のいずれかに記載の方法。
(項目15)
前記HCストランドおよび前記LCストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記HCストランドと前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成する、項目1〜14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記スプリントオリゴヌクレオチドが、DNA合成を阻害する修飾を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、mRNAを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
a)i)細胞;ならびに
ii)前記細胞由来のHCVRをコードする第1のmRNAおよび前記細胞由来のLCVRをコードする第2のmRNAを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ;ならびに
b)前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第1のmRNAおよび前記第2のmRNAと結合させて、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含む、項目1〜16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
ポリ(dA)またはポリ(dT)オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項目1〜18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む、項目1〜19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む、項目1〜20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記核酸配列を発現して、前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメント、および前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項目1〜21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記ポリペプチドを抗原と接触させ、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目1〜23のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含み、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のHCエレメントおよびLCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目25)
前記ライブラリーが、以下:
a)前記複数個の固有メンバーが、少なくとも10 4 個、10 5 個、10 6 個、10 7 個、10 8 個、または10 9 個の固有メンバーを含む、
b)前記複数個の固有メンバーが、10 4 〜10 9 個、10 4 〜10 8 個、10 4 〜10 7 個、10 4 〜10 6 個、10 4 〜10 5 個、10 8 〜10 9 個、10 7 〜10 9 個、10 6 〜10 9 個、10 5 〜10 9 個、10 5 〜10 8 個、10 6 〜10 7 個、10 4 〜10 5 個、10 5 〜10 6 個、10 6 〜10 7 個、10 7 〜10 8 個、または10 8 〜10 9 個の固有メンバーを含む、
c)前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、固有メンバーである、または d)前記ライブラリーにおけるメンバーの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの1つ、2つ、3つまたは全てを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
項目25に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目27)
前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項目26に記載のライブラリー。
(項目28)
a)項目26または27に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目29)
前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
T細胞受容体(TCR)α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびTCRβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、ACVRおよびBCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のACVRのACエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖cDNA(AC ds cDNA)のストランドである、α鎖(AC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のBCVRのBCエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖cDNA(BC ds cDNA)のストランドである、β鎖(BC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)ACストランドをBCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のBCVRまたはACVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目31)
前記核酸配列が、発現した時、前記ACエレメントおよび前記BCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目31に記載の方法。
(項目33)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目30〜32のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含み、前記ACVRおよび前記BCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のACエレメントおよびBCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目34)
項目33に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目35)
a)項目34に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目36)
TCRγ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびTCRδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、GCVRおよびDCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のGCVRのGCエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖cDNA(GC ds cDNA)のストランドである、γ鎖(GC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のDCVRのDCエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖cDNA(DC ds cDNA)のストランドである、δ鎖(DC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)GCストランドをDCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のDCVRまたはGCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目37)
前記核酸配列が、発現した時、前記GCエレメントおよび前記DCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目36または37に記載の方法。
(項目39)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目36〜38のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含み、前記GCVRおよび前記DCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のGCエレメントおよびDCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目40)
項目39に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目41)
a)項目40に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目42)
a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;ならびに b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド、
c)第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のLCVRまたはHCVRをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位。
(項目43)
前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目42に記載の隔離された産生反応部位。
(項目44)
第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第1のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチド。
(項目45)
前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはPEGスペーサーである、項目44に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目46)
a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;
b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド;ならびに
c)前記HCストランドおよび前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、隔離された連結反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、前記HCストランドおよび前記LCストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位。
(項目47)
リガーゼをさらに含む、項目46に記載の隔離された連結反応部位。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
抗体重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および抗体軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、HCVRおよびLCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のHCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドである、重鎖(HC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のLCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドである、軽鎖(LC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)前記HCストランドを前記LCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目2)
前記HCエレメントが、重鎖可変領域配列(HCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記LCエレメントが、軽鎖可変領域配列(LCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記核酸配列が、発現した時、前記HCエレメントおよび前記LCエレメントが、in vitro、ex vivo、またはin vivoで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下:
a)以下:
(i)前記細胞由来の前記HCVRをコードする第1のmRNAに相補的であるストランドを含む第1の二本鎖cDNA(ds cDNA);および
(ii)前記細胞由来の前記LCVRをコードし、捕捉支持体を生成する第2のmRNAに相補的なストランドを含む第2のds cDNA、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
b)前記第1および前記第2のds cDNAの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下:
前記細胞由来の前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のHC ds cDNA、および
前記細胞由来の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のLC ds cDNA
を産生する、ステップ
を含む、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記捕捉支持体が、ビーズ、およびcDNAと結合する部分を含む、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記隔離された産生反応部位が、前記第1および前記第2のmRNAから、前記細胞の前記HCVRの前記HCエレメント、をコードするセグメントを含む第1のds cDNA、および前記細胞の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む第2のds cDNAを産生するのに適した試薬混合物を含む、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記第1のds cDNAおよび前記第2のds cDNAが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも1つが、第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させる、項目5〜7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記ヌクレオチド修飾が、2個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記プライマーの少なくとも1つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項目8〜10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記HC ds cDNAが、5’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記LC ds cDNAが5’オーバーハングおよび平滑末端を含む、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記HCストランドおよび前記LCストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記HCおよびLCストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目1〜13のいずれかに記載の方法。
(項目15)
前記HCストランドおよび前記LCストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記HCストランドと前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成する、項目1〜14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記スプリントオリゴヌクレオチドが、DNA合成を阻害する修飾を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、mRNAを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
a)i)細胞;ならびに
ii)前記細胞由来のHCVRをコードする第1のmRNAおよび前記細胞由来のLCVRをコードする第2のmRNAを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ;ならびに
b)前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第1のmRNAおよび前記第2のmRNAと結合させて、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含む、項目1〜16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
ポリ(dA)またはポリ(dT)オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項目1〜18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む、項目1〜19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む、項目1〜20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記核酸配列を発現して、前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメント、および前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項目1〜21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記ポリペプチドを抗原と接触させ、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目1〜23のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含み、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のHCエレメントおよびLCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目25)
前記ライブラリーが、以下:
a)前記複数個の固有メンバーが、少なくとも10 4 個、10 5 個、10 6 個、10 7 個、10 8 個、または10 9 個の固有メンバーを含む、
b)前記複数個の固有メンバーが、10 4 〜10 9 個、10 4 〜10 8 個、10 4 〜10 7 個、10 4 〜10 6 個、10 4 〜10 5 個、10 8 〜10 9 個、10 7 〜10 9 個、10 6 〜10 9 個、10 5 〜10 9 個、10 5 〜10 8 個、10 6 〜10 7 個、10 4 〜10 5 個、10 5 〜10 6 個、10 6 〜10 7 個、10 7 〜10 8 個、または10 8 〜10 9 個の固有メンバーを含む、
c)前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、固有メンバーである、または d)前記ライブラリーにおけるメンバーの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの1つ、2つ、3つまたは全てを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
項目25に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目27)
前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項目26に記載のライブラリー。
(項目28)
a)項目26または27に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目29)
前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
T細胞受容体(TCR)α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびTCRβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、ACVRおよびBCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のACVRのACエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖cDNA(AC ds cDNA)のストランドである、α鎖(AC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のBCVRのBCエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖cDNA(BC ds cDNA)のストランドである、β鎖(BC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)ACストランドをBCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のBCVRまたはACVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目31)
前記核酸配列が、発現した時、前記ACエレメントおよび前記BCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目31に記載の方法。
(項目33)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目30〜32のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含み、前記ACVRおよび前記BCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のACエレメントおよびBCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目34)
項目33に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目35)
a)項目34に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目36)
TCRγ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびTCRδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、GCVRおよびDCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のGCVRのGCエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖cDNA(GC ds cDNA)のストランドである、γ鎖(GC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のDCVRのDCエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖cDNA(DC ds cDNA)のストランドである、δ鎖(DC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)GCストランドをDCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のDCVRまたはGCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
(項目37)
前記核酸配列が、発現した時、前記GCエレメントおよび前記DCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目36または37に記載の方法。
(項目39)
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目36〜38のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含み、前記GCVRおよび前記DCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のGCエレメントおよびDCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
(項目40)
項目39に記載の方法により作製されたライブラリー。
(項目41)
a)項目40に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
(項目42)
a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;ならびに b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド、
c)第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のLCVRまたはHCVRをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位。
(項目43)
前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目42に記載の隔離された産生反応部位。
(項目44)
第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第1のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチド。
(項目45)
前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはPEGスペーサーである、項目44に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目46)
a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;
b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド;ならびに
c)前記HCストランドおよび前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、隔離された連結反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、前記HCストランドおよび前記LCストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位。
(項目47)
リガーゼをさらに含む、項目46に記載の隔離された連結反応部位。
Claims (25)
- 抗体重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および抗体軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、HCVRおよびLCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のHCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドである、重鎖(HC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のLCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドである、軽鎖(LC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)前記HCストランドを前記LCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。 - (i)前記HCエレメントが、重鎖可変領域配列(HCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、
(ii)前記LCエレメントが、軽鎖可変領域配列(LCVRS)またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、かつ/または
(iii)前記核酸配列が、発現した時、前記HCエレメントおよび前記LCエレメントが、in vitro、ex vivo、またはin vivoで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、
請求項1に記載の方法。 - 前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下:
a)以下:
(i)前記細胞由来の前記HCVRをコードする第1のmRNAに相補的であるストランドを含む第1の二本鎖cDNA(ds cDNA);および
(ii)前記細胞由来の前記LCVRをコードし、捕捉支持体を生成する第2のmRNAに相補的なストランドを含む第2のds cDNA、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
b)前記第1および前記第2のds cDNAの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下:
前記細胞由来の前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のHC ds cDNA、および
前記細胞由来の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む複数個のLC ds cDNA
を産生する、ステップ
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記捕捉支持体が、ビーズ、およびcDNAと結合する部分を含む、かつ/または前記隔離された産生反応部位が、前記第1および前記第2のmRNAから、前記細胞の前記HCVRの前記HCエレメント、をコードするセグメントを含む第1のds cDNA、および前記細胞の前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含む第2のds cDNAを産生するのに適した試薬混合物を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記第1のds cDNAおよび前記第2のds cDNAが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも1つが、第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させ、
必要に応じて、
(i)前記ヌクレオチド修飾が、2個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、
(ii)前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、
(iii)前記プライマーの少なくとも1つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、
請求項3または4に記載の方法。 - (i)前記HC ds cDNAが、5’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記LC ds cDNAが5’オーバーハングおよび平滑末端を含む、
(ii)前記HCストランドおよび前記LCストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記HCおよびLCストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、
(iii)前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、かつ/または
(iv)前記HCストランドおよび前記LCストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記HCストランドと前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成し、必要に応じて、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、DNA合成を阻害する修飾を含む、
請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、mRNAを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
a)i)細胞;ならびに
ii)前記細胞由来のHCVRをコードする第1のmRNAおよび前記細胞由来のLCVRをコードする第2のmRNAを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ;ならびに
b)前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第1のmRNAおよび前記第2のmRNAと結合させて、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含み、
必要に応じて、ポリ(dA)またはポリ(dT)オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記mRNAを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - (i)前記核酸配列を増幅するステップ、
(ii)前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップ、および/または
(iii)核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップ
をさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 前記核酸配列を発現して、前記HCVRの前記HCエレメントをコードするセグメント、および前記LCVRの前記LCエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含み、
必要に応じて、前記ポリペプチドは抗原とともにあり、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域(HCVR)の重鎖エレメント(HCエレメント)および軽鎖可変領域(LCVR)の軽鎖エレメント(LCエレメント)をコードする配列を含み、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のHCエレメントおよびLCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製し、
必要に応じて、前記ライブラリーが、以下:
a)前記複数個の固有メンバーが、少なくとも10 4 個、10 5 個、10 6 個、10 7 個、10 8 個、または10 9 個の固有メンバーを含む、
b)前記複数個の固有メンバーが、10 4 〜10 9 個、10 4 〜10 8 個、10 4 〜10 7 個、10 4 〜10 6 個、10 4 〜10 5 個、10 8 〜10 9 個、10 7 〜10 9 個、10 6 〜10 9 個、10 5 〜10 9 個、10 5 〜10 8 個、10 6 〜10 7 個、10 4 〜10 5 個、10 5 〜10 6 個、10 6 〜10 7 個、10 7 〜10 8 個、または10 8 〜10 9 個の固有メンバーを含む、
c)前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、固有メンバーである、または d)前記ライブラリーにおけるメンバーの20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの1つ、2つ、3つまたは全てを含む、
方法。 - 請求項10に記載の方法により作製されたライブラリーであって、必要に応じて、前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、ライブラリー。
- a)請求項11に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法であって、
必要に応じて、前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、方法。 - T細胞受容体(TCR)α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびTCRβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、ACVRおよびBCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のACVRのACエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖cDNA(AC ds cDNA)のストランドである、α鎖(AC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のBCVRのBCエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖cDNA(BC ds cDNA)のストランドである、β鎖(BC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)ACストランドをBCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のBCVRまたはACVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。 - 前記核酸配列が、発現した時、前記ACエレメントおよび前記BCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成され、必要に応じて、前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項13に記載の方法。
- 複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項13または14に記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域(ACVR)のα鎖エレメント(ACエレメント)およびβ鎖可変領域(BCVR)のβ鎖エレメント(BCエレメント)をコードする配列を含み、前記ACVRおよび前記BCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のACエレメントおよびBCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。 - 請求項15に記載の方法により作製されたライブラリー。
- a)請求項16に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。 - TCRγ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびTCRδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含む核酸配列であって、GCVRおよびDCVRがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下:
a)以下:
i)細胞由来のGCVRのGCエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖cDNA(GC ds cDNA)のストランドである、γ鎖(GC)ストランド;および
ii)前記細胞由来のDCVRのDCエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖cDNA(DC ds cDNA)のストランドである、δ鎖(DC)ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
b)GCストランドをDCストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のDCVRまたはGCVRをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。 - 前記核酸配列が、発現した時、前記GCエレメントおよび前記DCエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成され、必要に応じて、前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項18に記載の方法。
- 複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項18または19に記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域(GCVR)のγ鎖エレメント(GCエレメント)およびδ鎖可変領域(DCVR)のδ鎖エレメント(DCエレメント)をコードする配列を含み、前記GCVRおよび前記DCVRがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のGCエレメントおよびDCエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。 - 請求項20に記載の方法により作製されたライブラリー。
- a)請求項21に記載のライブラリーを獲得するステップ;および
b)前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。 - a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;
b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド、ならびに
c)第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がDNA合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のLCVRまたはHCVRをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位であって、
必要に応じて、前記第1のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、隔離された産生反応部位。 - 第1のメンバー、第2のメンバー、および前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第1のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第2のメンバーとアニールして、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、
必要に応じて、前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはPEGスペーサーである、オリゴヌクレオチド。 - a)細胞由来のHCVRの重鎖(HC)エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖cDNA(HC ds cDNA)のストランドであるHCストランド;
b)前記細胞由来のLCVRの軽鎖(LC)エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖cDNA(LC ds cDNA)のストランドであるLCストランド;ならびに
c)前記HCストランドおよび前記LCストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、隔離された連結反応部位であって、前記HCVRおよび前記LCVRがマッチしており、前記HCストランドおよび前記LCストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のHCVRまたはLCVRをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位であって、
必要に応じて、リガーゼをさらに含む、隔離された連結反応部位。
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