JP2020510418A - トランスフェリン受容体トランスジェニックモデル - Google Patents

Abstract

いくつかの態様では、本発明は、キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。他の態様では、本発明は、キメラＴｆＲトランスジェニック動物モデル、及び血液脳関門を通過できる治療薬を同定するために前記動物モデルを使用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の背景
血液脳関門（ＢＢＢ）は、末梢から脳へのほとんどの高分子の移行を阻止するため、脳への曝露が必要とされる大分子治療薬の使用を制限する。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、ＢＢＢで高度に発現され、受容体媒介性トランスサイトーシスを介してＢＢＢを通過させて上述のような治療薬を輸送するために使用することができる。潜在的な治療薬がＢＢＢを通過する能力を評価する目的で、マウスＴｆＲが完全長のヒトＴｆＲ ｃＤＮＡに置換されたマウスモデルが以前に開発された。しかしながら、これらのトランスジェニックマウスは不健康であり、異常に高いＴｆＲ発現、少ない赤血球数、及び高い血清鉄濃度を示した。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．，６（２６１）：２６１ｒａ１５４（２０１４）（非特許文献1）。結果として、これらの既存のマウスモデルは、脳疾患を治療するためにＢＢＢを通過することができる治療薬を評価するためのツールとしての使用には適しておらず、内因性ＴｆＲの発現及び表現型をより呈するモデルが必要とされる。

Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．，６（２６１）：２６１ｒａ１５４（２０１４）

発明の簡単な概要
一態様では、本開示は、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位、及び配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインを含む、キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位は、天然（例えば、ＴｆＲの膜貫通及び／または細胞内ドメインと同種由来）トランスフェリン結合部位であり、例えば、天然マウストランスフェリン結合部位である。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドの異種頂端ドメインをコードする核酸配列の領域は、配列番号２との少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドの異種頂端ドメインをコードする核酸配列の領域は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲをコードするポリヌクレオチドは、マウストランスフェリン受容体遺伝子のエクソンとイントロンとを含み、及び異種頂端ドメインをコードする核酸配列は、マウストランスフェリン受容体遺伝子の頂端結合ドメインに取って代わるようにマウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている。

別の態様では、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含むキメラＴｆＲポリペプチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然頂端ドメインのみが異種頂端ドメインによって置換されている天然ＴｆＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、天然ＴｆＲ結合部位に対して異種である頂端結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲは、配列番号３との少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

さらなる態様では、上記のようなキメラトランスフェリン受容体を発現する宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、キメラトランスフェリン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞によって発現されるキメラＴｆＲポリペプチドは、（ａ）ＴｆＲポリペプチドの内因性頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインと、（ｂ）内因性トランスフェリン結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、内因性ＴｆＲの頂端ドメインのみが異種頂端ドメインによって置換されているキメラＴｆＲを発現する。いくつかの態様では、宿主細胞は、内因性ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、異種頂端ドメインとを含むキメラＴｆＲを発現する。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内の異種頂端ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞内の頂端ドメインをコードする核酸配列は、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞はエクスビボにある。いくつかの実施形態では、宿主細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞のゲノムは、天然ＴｆＲの頂端ドメインの欠失を含む。

さらなる態様では、本開示は、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供し、キメラＴｆＲポリペプチドは、非ヒトトランスジェニック動物にとって内因性であるＴｆＲポリペプチドの頂端ドメインに取って代わる異種頂端ドメインを含む。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物のゲノムは、非ヒトトランスジェニック動物の内因性ＴｆＲの頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインをコードするトランスフェリン受容体遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、非ヒトトランスジェニック動物のＴｆＲの天然ドメインに代わる異種頂端ドメインと、天然トランスフェリン結合部位とを含む、キメラＴｆＲを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、内因性トランスフェリン受容体の頂端ドメインのみが、異種頂端ドメインによって置換されているキメラトランスフェリン受容体を発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、内因性ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を含む、内因性ＴｆＲ結合部位に対して異種である頂端結合ドメインとを含むキメラＴｆＲポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、上記のような宿主細胞を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、マウスまたはラットである。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲについてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲについてヘテロ接合性である。

別の態様では、キメラＴｆＲに結合する頂端ドメイン結合ポリペプチド（ＡＤＢＰ）をスクリーニングする方法が本明細書に提供され、この方法は、候補ＡＤＢＰを上記のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲポリペプチドを発現する内皮と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、内皮は血液脳関門内皮である。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量は、イムノアッセイによって決定される。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量は、表面プラズモン共鳴によって決定される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰは、エフェクター分子と結合している。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。

さらに別の態様では、キメラＴｆＲポリペプチドに結合するＡＤＢＰの量を測定する方法が本明細書に提供され、この方法は、ＡＤＢＰを上記に開示されたキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、キメラＴｆＲポリペプチドに結合したＡＤＢＰの量をイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴によって決定するステップとを含む。

さらに別の態様では、血液脳関門を通過するＡＤＢＰをスクリーニングする方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）配列番号１との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、本明細書に開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、（ｂ）非ヒトトランスジェニック動物の脳内のＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは、エフェクター分子と結合している。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、決定するステップは、定量的イムノアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、測定するステップは、脳内のエフェクター分子のレベルを決定するために、動物の脳または脳組織を、エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、測定するステップは、エフェクター分子の薬力学的（ＰＤ）効果を測定することを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、抗ＢＡＣＥ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、測定するステップは、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ４０のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。

別の態様では、血液脳関門を通過するＡＤＢＰをモニタリングする方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）配列番号１との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、本明細書に開示される非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、（ｂ）非ヒトトランスジェニック動物の脳内のＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは、エフェクター分子と結合している。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、決定するステップは、定量的イムノアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、決定するステップは、エフェクター分子を、エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在するエフェクター分子のレベルを決定することとを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、測定するステップは、標的に結合するエフェクター分子のＰＤ効果を測定することを含む。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、抗ＢＡＣＥ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、測定するステップは、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ４０のレベルを測定することを含む。

さらに別の態様では、キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を生成する方法が本明細書に提供され、この方法は、非ヒト単一細胞胚の内因性ＴｆＲの頂端ドメインを、配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する異種頂端ドメインで置換することを含む。いくつかの実施形態では、頂端ドメインを置換することは、相同組換えによって実施される。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９タンパク質、少なくとも１つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及び異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含むドナーＤＮＡを接触させることを含み、異種頂端ドメインコード配列が、非ヒト単一細胞胚のゲノム内の内因性ＴｆＲの頂端ドメインを置換するように、異種頂端ドメインは、左の相同アーム及び右の相同アームと隣接している。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、非ヒト単一細胞胚での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、非ヒト単一細胞胚は、マウス胚である。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置される。

さらに別の態様では、非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）上記に開示されたトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を、非ヒト単一細胞胚と同じ動物種の偽妊娠雌に対して移植するステップと、（ｂ）雌より生まれた子孫から非ヒトトランスジェニック動物を選択するステップであって、非ヒトトランスジェニック動物が、内因性ＴｆＲの頂端ドメインが配列番号１との少なくとも８０％の同一性のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインで置換されたキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを含む、ステップとを含む。

さらに別の態様では、キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドを動物の胚細胞内に導入するステップであって、ポリヌクレオチドが、内因性ＴｆＲ頂端ドメインをコードする内因性ＴｆＲ遺伝子の領域を標的とし、配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドが、内因性頂端ドメインをコードする内因性ＴｆＲ遺伝子の領域を置換する、ステップと、（ｂ）細胞またはその子孫を非ヒトトランスジェニック動物へと発達させるステップとを含む。

前述の概略な記載及び以下の詳細な記載は、例示的及び説明的であり、請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図される。他の目的、利点、及び新規の特徴は、本発明の以下の詳細な記載から当業者には容易に明らかになるであろう。

図１Ａ〜１Ｃは、野生型、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}、及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの全血球算定分析の結果を示す。遺伝子型特異的な違いは、総赤血球、ヘモグロビン、またはヘマトクリットにおいて観察されなかった。図内のグラフは、グループごとの平均値±標準偏差、ｎ＝３であることを表す。 図２Ａ〜２Ｂは、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウスに全身投与された抗ＴｆＲの脳血管局在を示す。５ｍｇ／ｋｇのヒト頂端特異的抗ＴｆＲは、Ｃ５７Ｂｌ６野生型またはキメラｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}ヘテロ接合性マウスのいずれかに静脈内投与された。１時間後、マウスは、ＰＢＳを灌流され、脳は、抗体分布のために染色された。代表的な画像は、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}ヘテロ接合体に全身注入された抗ＴｆＲ（頂端ドメイン特異的）は顕著に血管局在であるが、野生型マウスはそうではないことを示す。これは、キメラｈｕＴｆＲタンパク質がＢＢＢで発現されていることを表す。 図３Ａ〜３Ｂは、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスに全身投与された抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の脳実質分布を示す。ｈｕＴｆＲマウスの脳皮質切片の代表的な画像は、静脈注射された抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１（５０ｍｇ／ｋｇ、投与後２４時間）の広範な実質分布を示す。対照的に、抗ＢＡＣＥ１を注入したｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}ｈｕＴｆＲマウスの脳切片では、明らかな染色は観察されなかった。 図４Ａ〜４Ｄは、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異的抗体の脳への取り込み、及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの二重特異的抗体の投与後のＡベータの減少を示す。図４Ａは、マウスが、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１または抗ＢＡＣＥ１を投与され、２４時間後のｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの血漿ｈｕＩｇＧ１濃度を示す。結果は、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１のＴｆＲを介したクリアランスが、抗ＢＡＣＥ１のクリアランスと比較して増強されたことを示した。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝８（未処理の野生型マウスではｎ＝２）であることを表す。 図４Ａ〜４Ｄは、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異的抗体の脳への取り込み、及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの二重特異的抗体の投与後のＡベータの減少を示す。図４Ｂは、抗体の全身投与後の抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の脳への取り込みの平均を示す。結果は、マウス脳内の抗ＢＡＣＥ１の蓄積と比較して、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の蓄積が約２８倍の増加を示した。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝８（未処理の野生型マウスではｎ＝２）であることを表す。 図４Ａ〜４Ｄは、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異的抗体の脳への取り込み、及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの二重特異的抗体の投与後のＡベータの減少を示す。図４Ｃは、抗ＢＡＣＥ１で処理したマウスと比較して、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１で処理したマウスは、脳内のＡベータが４９％減少したことを示す。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝８（未処理の野生型マウスではｎ＝２）であることを表す。 図４Ａ〜４Ｄは、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異的抗体の脳への取り込み、及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの二重特異的抗体の投与後のＡベータの減少を示す。図４Ｄは、未処理の野生型マウスと比較して、抗ＢＡＣＥ１または抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１で処理されたｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの血漿Ａベータレベルの低下を示す。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝８（未処理の野生型マウスではｎ＝２）であることを表す。 図５Ａ〜５Ｄは、野生型マウスと比較した、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの様々な組織におけるＴｆＲの発現を示す。脳（図５Ａ）の総ＴｆＲ発現に顕著な差は観察されなかった。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝４〜８であることを表す。 図５Ａ〜５Ｄは、野生型マウスと比較した、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの様々な組織におけるＴｆＲの発現を示す。肝臓（図５Ｂ）の総ＴｆＲ発現に顕著な差は観察されなかった。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝４〜８であることを表す。 図５Ａ〜５Ｄは、野生型マウスと比較した、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの様々な組織におけるＴｆＲの発現を示す。腎臓（図５Ｃ）の総ＴｆＲ発現に顕著な差は観察されなかった。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝４〜８であることを表す。 図５Ａ〜５Ｄは、野生型マウスと比較した、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの様々な組織におけるＴｆＲの発現を示す。肺（図５Ｄ）の総ＴｆＲ発現に顕著な差は観察されなかった。グラフは、グループごとの平均±標準偏差、ｎ＝４〜８であることを表す。

発明の詳細な説明
非ヒト（例えば、マウス）の哺乳動物トランスフェリン結合部位と、トランスフェリン結合部位を含むドメインとは異種である頂端ドメインとを含む、トランスフェリン受容体のキメラ型を開発した。これらのキメラ受容体は、特にトランスフェリン結合部位がトランスジェニック動物種に由来し、頂端ドメインが霊長類（例えば、ヒトまたはサル）に由来するトランスジェニック動物で発現させることができる。したがって、本発明は、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する頂端ドメインとを含む、キメラトランスフェリン受容体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、非ヒト、例えば、そのようなキメラＴｆＲを発現する非霊長類のトランスジェニック動物、及びインビボでヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）に結合することによりＢＢＢを通過できるポリペプチドをスクリーニングするための非ヒトトランスジェニック動物の使用も提供する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、天然トランスフェリン受容体（マウストランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ）など）を含み、その頂端ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するオーソロガスな頂端ドメインで置換され、それにより、天然トランスフェリン結合部位と、トランスフェリン受容体をコードする配列の大部分、例えば、少なくとも７０％、または少なくとも７５％とをそのままに残す。したがって、この非ヒトトランスジェニック動物は、トランスフェリンに結合して輸送するだけでなく、適切な鉄恒常性を維持する能力も含む非ヒト動物の内因性トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合機能を最大限保持する。結果として、トランスジェニック動物は健康であり、脳疾患を治療するための治療薬の発見及び開発での使用に好適である。

用語
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という単数形には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「１つの抗体」への言及は、２つ以上のかかる分子の組み合わせが任意に含まれる、などである。

本明細書で使用される用語「約」及び「およそ」は、数値または範囲で指定された量を変更するために使用される場合、数値及び当業者に即知である値からの合理的な偏差を示し、例えば、±２０％、±１０％、または±５％は、記載された値の意図した範囲内である。

本明細書で使用される「トランスフェリン受容体」は、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号６に記載されている。他の種からのトランスフェリン受容体タンパク質１配列も知られている（例えば、チンパンジー、受託番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１；アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１；イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１；ウシ、ＮＰ＿００１１９３５０６．１；マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１；ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１；及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。用語「トランスフェリン受容体」は、例示的な参照配列の対立遺伝子バリアント、例えば、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体座の遺伝子によってコードされるヒト配列も包含する。完全長のトランスフェリン受容体タンパク質には、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインが含まれる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン、及び頂端ドメインの３つのドメインによって特徴付けられる。

本明細書で使用される用語「キメラＴｆＲ」は、頂端ドメインの全て、またはサブ領域が、異種トランスフェリン受容体からの対応する頂端ドメイン領域で置換されている、トランスフェリン受容体タンパク質を指す。

本明細書で使用される「トランスフェリン結合部位」は、トランスフェリン、例えば鉄結合トランスフェリンの受容体への結合を媒介するＴｆＲタンパク質のヘリカル及びプロテアーゼ様ドメイン内の領域を指す。トランスフェリン結合部位は、頂端ドメインに対して遠位である。

本明細書で使用される「非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位」は、非ヒト哺乳動物の天然トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位からの配列、または天然非ヒト哺乳動物トランスフェリンに結合することができるその機能的誘導体を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物のトランスフェリン結合部位は、非ヒト哺乳動物の天然トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合部位と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。非ヒト哺乳動物の例は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類などが含まれる。

本明細書で使用される「ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウス」は、マウストランスフェリン受容体の頂端ドメインがヒトトランスフェリン受容体の頂端ドメインで置換されたトランスジェニックマウスであり、トランスジェニックマウスは導入遺伝子についてホモ接合性であることを指す。

本明細書で使用される「ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウス」は、マウストランスフェリン受容体の頂端ドメインがヒトトランスフェリン受容体の頂端ドメインで置換されたトランスジェニックマウスであり、トランスジェニックマウスは導入遺伝子についてヘテロ接合性であることを指す。

本明細書で使用する場合、トランスフェリン受容体またはそのドメインに関する用語「野生型」、「天然」、及び「自然発生」は、天然に存在する配列を有するトランスフェリン受容体またはそのドメインを指す。

本明細書で使用される「内因性」トランスフェリン受容体またはそのドメインは、細胞または非ヒト動物で自然に生じる、すなわち、細胞または動物に対する遺伝子修飾が存在しないトランスフェリン受容体を指す。

本明細書で使用される場合、トランスフェリン受容体のあるドメイン、例えば、頂端ドメインに関して「異種」という用語は、トランスフェリン受容体のあるドメインが、その天然の状況の外で発現されるものであり、例えば、通常天然では近接しているトランスフェリン受容体配列から分離されているか、または、通常は近接していないトランスフェリン受容体配列に隣接している（または連続している）ことを指す。

用語「アミノ酸」は、自然発生及び合成のアミノ酸、ならびに自然発生アミノ酸と類似する挙動で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。

自然発生アミノ酸は、それらが遺伝暗号によってコードされたアミノ酸、及びそれらが後で修飾されるアミノ酸であり、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。自然発生α−アミノ酸は、限定されないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせを含む。自然発生α−アミノ酸の立体異性体は、限定されないが、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リジン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−スレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせを含む。

本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨する１文字記号のいずれかで言及され得る。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに自然発生アミノ酸ポリマー及び非自然発生アミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、完全なＬ−アミノ酸、完全なＤ−アミノ酸、またはＬアミノ酸とＤアミノ酸との混合物を含み得る。

「保存的に修飾されたバリアント」は、同様の特徴を有すると分類できる別のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす変化を指す。この方法で定義された保存的アミノ酸グループのカテゴリの例は、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リジンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性グループ」、Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族グループ」、ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（スレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族グループ」を含む。それぞれのグループのなかで、サブグループも識別できる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓを含む「正電荷サブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負電荷サブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性サブグループ」を含むサブグループに細分化できる。別の例では、芳香族グループまたは環状グループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分化できる。別のさらなる例は、脂肪族グループは、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族微極性のサブグループ」のサブグループに分割できる。保存的変異のカテゴリの例は、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、これらに限定されないが、正電荷を維持できるような、Ａｒｇに対してＬｙｓまたはＬｙｓに対してＡｒｇ、負電荷を維持できるような、Ａｓｐに対してＧｌｕまたはＧｌｕに対してＡｓｐ、遊離−ＯＨを維持できるような、Ｔｈｒに対してＳｅｒまたはＳｅｒに対してＴｈｒ、及び遊離−ＮＨ_２を維持できるような、Ａｓｎに対してＧｌｎまたＧｌｎに対してＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、疎水性を維持するために、例えば、活性部位で自然発生疎水性アミノ酸の代わりに用いられる。

２つ以上のポリペプチド配列の文脈における用語「同一」またはパーセントの「同一性」は、同じであるまたは指定された割合のアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれを超え、比較ウィンドウ、もしくは配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アライメント及び目視検査で測定された指定された領域で、最大の相応性のために比較及び整列された場合、特定の領域で同じであることを指す。

ポリペプチドの配列比較では、通常、１つのアミノ酸配列が参照配列として機能し、候補配列と比較される。アライメントは、当業者が利用可能な様々な方法、例えば、視覚的なアライメントを使用して、または最大のアライメントを達成するために既知のアルゴリズムを使用する公的に利用可能なソフトウェアを使用して実行できる。そのようなプログラムは、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が含まれる。最大のアライメントを達成するためにアライメントに使用されるパラメータは、当業者によって決定され得る。この用途の目的のためのポリペプチド配列の配列比較のために、２つのタンパク質配列を既定のパラメータと整列させるためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズム標準タンパク質ＢＬＡＳＴが使用される。

用語「含む」は、組成物及び方法に示されている要素が含まれているが、他の要素が排除されないことを意味するように意図されている。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」とは、特定の材料またはステップ、及び特許請求される発明の基本的及び新規特性（複数可）に実質的に影響しないものを指す。「からなる」とは、微量を超える他の成分及び記載されている実質的な方法ステップを除外することを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を持つことができ、既知または未知の任意の機能を実行できる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られ得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、重合化後にさらに修飾され得る。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。別途明記または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、その二本鎖形態を構成することで知られているか、または構成すると予想される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。

ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基の特定の配列で構成されている：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンに対してウラシル（Ｕ）。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットによる表示である。

用語「ノックイン」は、所定の遺伝子座におけるＤＮＡ配列情報の１対１の置換、または座内に見られない配列情報の挿入を指す。当業者は、様々な遺伝的アプローチ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾン媒介挿入を使用して、ゲノムの特定の遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列をノックインする方法を容易に理解するであろう。

用語「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、中枢神経系（ＣＮＳ）の脳細胞外液から循環血液を分離する高度に選択的な半透膜障壁を指す。血液脳関門は、タイトジャンクションによって接続されている脳内皮細胞によって形成される。

トランスフェリン受容体
トランスフェリン受容体は、リガンドが占有するトランスフェリン受容体の受容体媒介性エンドサイトーシスを介して鉄の細胞への取り込みをもたらす。ＴｆＲは、ヒトならびに霊長類及びげっ歯類などの非ヒト種の両方に存在する。天然ヒトＴｆＲ（ｈｕＴｆＲ）、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６、配列番号６は、ホモ二量体ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞質ドメイン、膜貫通領域、及び頂端ドメインとトランスフェリン結合ドメインとを含む細胞外ドメインを持つ。ｈｕＴｆＲの各モノマーは、構造的に異なる３つのドメイン、膜に近接したプロテアーゼ様ドメイン、全ての二量体の接触を担うヘリカルドメイン、及び膜遠位頂端ドメイン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６（１９９９），ｐｐ．７７９−７８２）を有する。ＨｕＴｆＲダイマーは、約１９０，０００ダルトンの分子量を有する。配列番号１の配列（配列番号２によりコードされる）を有するｈｕＴｆＲの頂端ドメインは、トランスフェリンとＴｆＲとの間の相互作用に関与しない。このドメインは、他のタンパク質がＴｆＲに結合するための接触面を提供し得ると推測される。天然カニクイザル、天然アカゲザル、及び天然チンパンジーのＴｆＲもまた、例えば、受託番号ＸＰ＿００５５４５３１５、ＮＰ＿００１２４４２３２．１、及びＸＰ＿００３３１０２３８．１のそれぞれで言及されるように即知である。天然カニクイザル、天然アカゲザル、及び天然チンパンジーのＴｆＲの頂端ドメインは、それぞれ配列番号１の天然ヒトＴｆＲの頂端ドメインとの約９６％、９５％、及び９８％の配列同一性を共有する。

天然マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６２３５１、配列番号５は、ｈｕＴｆＲとの約７７％のアミノ酸配列同一性を有する。天然ｍＴｆＲの頂端ドメインは、天然ｈｕＴｆＲの頂端ドメインと約７４％同一である。ｍＴｆＲは、ヒトの対応物に類似した３つの構造的に異なるドメインを含む。注釈されたエクソンとイントロンとを含むマウスＴｆＲの完全な遺伝子配列は、ＮＣＢＩデータベース（遺伝子ＩＤ：２２０４２）から見出すことができる。マウスＴｆＲは、１６番染色体（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００８２．６）上で見出される。

一態様では、キメラＴｆＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲは、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、ｈｕＴｆＲの頂端ドメイン、配列番号１との例えば、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する異種頂端ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、異種頂端ドメインは、配列番号１、配列番号７、配列番号８、または配列番号９の配列を有する。

キメラＴｆＲの非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位は、非哺乳動物トランスフェリンのキメラＴｆＲへの特異的結合を可能とする。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位は、天然トランスフェリン結合部位、例えばマウストランスフェリン受容体結合部位である。

いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然頂端ドメインのみが異種頂端ドメインによって置換されている天然ＴｆＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、天然ＴｆＲ結合部位と、例えば、頂端ドメインに加えて少なくとも１つのドメインまたはその領域が非天然アミノ酸配列を有する、天然ＴｆＲ結合部位に対して異種である頂端結合ドメインとを含む。

いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、配列番号３との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、マウストランスフェリン受容体遺伝子のエクソン及びイントロンと、ｈｕＴｆＲ頂端ドメインをコードする核酸配列とを含む。一実施形態では、例えば、非ヒト哺乳動物ＴｆＲ遺伝子の対応するエクソンをｈｕＴｆＲ頂端ドメイン配列で置換することにより、非ヒト哺乳動物ＴｆＲ頂端ドメインはｈｕＴｆＲ頂端ドメインコード配列で置換される。例示的な実施形態では、非ヒト哺乳動物ＴｆＲ遺伝子は、マウスＴｆＲ遺伝子である。一実施形態では、ｍＴｆＲ頂端ドメインは、ｈｕＴｆＲ頂端ドメインコード配列により置換され、これは、例えば、キメラＴｆＲを生成するために、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置される。

いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラＴｆＲポリペプチドを含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドの異種頂端ドメインをコードする核酸配列の領域は、天然ｈｕＴｆＲの頂端ドメインのコード配列、配列番号２との少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の核酸配列同一性を共有する。

別の態様では、本明細書に記載のキメラトランスフェリン受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。

コドン最適化
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲのコード配列、特にｈｕＴｆＲ頂端ドメインをコードする配列は、マウスでのキメラＴｆＲの発現を改善するためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲよりアクセスできるオプティマイザ、及びＤＮＡ ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなど、容易に利用可能である。好ましい実施形態では、コード配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）アルゴリズムを使用して、マウスでの発現のためにコドン最適化される。

非ヒト哺乳動物トランスフェリン受容体の頂端ドメインを所望の頂端ドメインに置換する方法
本明細書に開示される異種頂端ドメインのノックインを含む非ヒトトランスジェニック動物は、様々な方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、テールエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、トランスポゾン媒介システム、及びＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムを使用して生成することができる。これらの方法は、典型的には、１つまたは複数のヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを細胞に投与し、ＤＮＡが切断されてＤＮＡ鎖に５’及び３’切断末端が生じることにより内因性遺伝子の修飾を媒介することを含む。５’末端から５’方向に伸びる配列及び３’末端から３’方向に伸びる配列に実質的に相同な左右の相同アームと隣接しているドナー配列の存在下で、該ドナーは、相同性指向修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）を介してヌクレアーゼの標的となる内因性遺伝子に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ノックインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して実施される。例えば、異種頂端ドメインをコードする核酸配列が、内因性ＴｆＲ遺伝子に導入され、キメラＴｆＲを生成し、その結果、頂端ドメインをコードする自然発生の配列が置換されるが、遺伝子の全体的な構造は維持される。

ＣＲＩＳＰＲ
いくつかの実施形態では、配列番号１と少なくとも８０％同一である頂端ドメインのノックインは、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムを使用して実施される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにはＣａｓ９タンパク質、及び置換されるトランスフェリン受容体の頂端ドメイン内の標的モチーフにＣａｓ９タンパク質を向けて、この標的モチーフにハイブリダイズできる少なくとも１つまたは２つのリボ核酸が含まれる。これらのリボ核酸は、一般に「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。次に、Ｃａｓ９タンパク質が標的モチーフを切断し、二本鎖切断または一本鎖切断を引き起こす。２つの相同アームと隣接しているｈｕＴｆＲ頂端ドメインコード配列を含むドナーＤＮＡの存在下で、該ドナーＤＮＡが標的トランスフェリン受容体ＤＮＡに挿入され、頂端ドメインが置換される。

本発明で使用されるＣａｓ９タンパク質は、自然発生Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的誘導体であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天然配列のフラグメント、ならびに天然配列ポリペプチド及びそのフラグメントの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、Ｃａｓ９の機能的誘導体がＤＮＡ基質を加水分解してフラグメントにする能力である。Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのフラグメントの好適な機能的誘導体は、Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメントの変異体、融合体、共有結合修飾を含むが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメインと、ｓｇＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメインとを含む、２つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓ９の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性は、プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）として知られる短い保存配列（２〜５ヌクレオチド）が、標的配列内の標的モチーフの３’の直後に続くことも必要とする。いくつかの実施形態では、ＰＡＭモチーフはＮＧＧモチーフである。例示的な一実施形態では、マウス遺伝子のエクソン４と９との間の領域に対してｓｇＲＮＡによって指向されるＣａｓ９タンパク質を使用することによって、マウスの頂端ドメインが置換される。ドナーＤＮＡは、反応に対して導入される。ドナーＤＮＡは、エクソン４の上流から始まるマウスＴｆＲ配列に相同な左の相同アームとエクソン９内で始まるマウスＴｆＲ配列に相同な右の相同アームとの間にある、ヒト頂端ドメインコード配列を含む。ある特定の実施形態では、左の相同アームは、エクソン４の上流から始まる８１７ヌクレオチドがマウスＴｆＲ配列と重複し、右の相同アームは、エクソン９内で始まる８０７ヌクレオチドがマウスＴｆＲ配列と重複する。結果として、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するような所望の頂端ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第４のマウスのエクソンの後に挿入することができ、挿入されたヌクレオチド配列は、その３’末端に、適切に続くマウスエクソンが隣接する。いくつかの実施形態では、マウスＴｆＲ遺伝子に挿入されるヒト頂端ドメインコード配列は、マウス発現のためにコドン最適化されている。

ｓｇＲＮＡは、使用する特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて選択できる。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、１〜２個のリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計され、標的モチーフは、置換されるゲノム配列に隣接する。ガイドＲＮＡは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕなどの簡単に入手できるソフトウェアを使用して設計できる。キメラＴｆＲトランスジェニックマウスを生成するために使用できる例示的なｓｇＲＮＡには、配列番号１０〜１１が含まれる。

本明細書に開示されるドナーＤＮＡは、配列番号１と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、配列番号１をコードする配列、または配列番号１との少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２との少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列を含む。本明細書で開示されるドナーＤＮＡは、頂端ドメインコード配列に隣接し、Ｃａｓ９タンパク質による切断部位に対して５’及び３’エクソン配列と重複するように設計された左の相同アーム及び右の相同アームをさらに含む。相同アームは、５’及び３’エクソン配列を超えて延び得、各相同アームは少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、または１５０ヌクレオチド長であり得る。当業者は、実験に必要な相同アームの最適な長さを容易に決定できる。例示的な一実施形態では、ドナーＤＮＡの左相同アームは配列番号４のヌクレオチド１〜８１７に及び、右相同アームは配列番号４のヌクレオチド１５２３〜２３２９に及ぶ。いくつかの実施形態では、左相同アームは、配列番号４のヌクレオチド１〜８１７との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、右相同アームは、配列番号４のヌクレオチド１５２３〜２３２９との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡはまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択できる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのオフターゲット効果を最小限に抑えるために、１〜２つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つの不一致を含む標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。当業者は、オフターゲット効果を最小化するための好適な標的モチーフを選択するために様々な技術（例えば、バイオインフォマティクス分析）が使用できることを理解するであろう。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して遺伝子発現を低減する方法は、様々な出版物、例えば、米国特許公開第２０１４／０１７０７５３号、及び第２０１６／０２５７９７４号に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲは、ＺＦＮを使用してｈｕＴｆＲ頂端ドメインをノックインすることによって生成される。ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（Ｎ）とジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）とを含む融合タンパク質である。ＺＮＦのペアは、標的遺伝子の特定の遺伝子座を認識するために関与しており、一方は修飾される部位の上流の配列を認識し、もう一方は修飾される部位の下流の配列を認識する。ＺＦＮのヌクレアーゼ部分は、特定の遺伝子座で切断する。次に、上記のようなドナーＤＮＡは、特定の遺伝子座に挿入できる。ＺＦＮを使用して遺伝子発現を低減する方法は、例えば、米国特許第９，０４５，７６３号、及びさらにＤｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：Ｃｕｓｔｏｍ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｓｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（１８）：５９７８−５９９０（２００５）にも開示されているように周知であり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲは、ｈｕＴｆＲ頂端ドメインをＴＡＬＥＮと共にノックインすることにより生成される。ＴＡＬＥＮは、ゲノム部位の周囲にペアとして結合し、同じ非特異的ヌクレアーゼＦｏｋＩに指示して特定の部位でゲノムを切断するという点でＺＦＮと類似するが、ＤＮＡの三塩基を認識する代わりに、各ドメインが単一のヌクレオチドを認識する。ＺＦＮを使用して遺伝子発現を低減する方法は、例えば、米国特許第９，００５，９７３号、及びさらにＣｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８６（２）：７５７−７６１（２０１０）にも開示されているように周知であり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

キメラＴＦＲを発現する宿主細胞／トランスジェニック動物
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、上記のキメラトランスフェリン受容体をコードする核酸配列を含むキメラＴｆＲを発現する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。上記のノックイン方法のいずれか、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、宿主細胞内の天然トランスフェリン受容体の頂端ドメインを、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインで置換することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核生物、例えば、配列番号１と少なくとも８０％同一のマウス細胞である。いくつかの場合では、宿主細胞は、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９、異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含むドナーＤＮＡと接触され、該核酸配列は、左右の相同アームと隣接している。ｓｇＲＮＡ及び相同アームは、異種頂端ドメインコード配列がゲノム内の位置に挿入され、宿主細胞の天然トランスフェリン受容体の頂端ドメインのコード配列を置換するような配列を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの非霊長類哺乳動物由来の細胞である。

いくつかの実施形態では、キメラトランスフェリン受容体ポリペプチドを発現する胚性幹（ＥＳ）細胞を産生するために、ＥＳ細胞でノックインする方法が実施される。次いで、胚性幹細胞は、ゲノムがキメラトランスフェリン受容体ポリペプチドをコードする核酸を含む子孫細胞または非ヒトトランスジェニック動物へと発達し得る。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞は、胚盤胞に導入され、偽妊娠雌に移植される。いくつかの場合では、導入遺伝子を保有する始祖の雄が選択され、野生型の雌と交配させてＦ１ヘテロ接合マウスを生成できる。ホモ接合の非ヒト動物は、Ｆ１世代のヘテロ接合の非ヒト動物の繁殖から引き続き生成することができる。ＥＳ細胞を培養し、ヌクレオチド配列を導入してＥＳ細胞のゲノムを標的にしてトランスジェニック動物を生成する方法は、例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８５５−８７８（１９９３）、及び米国特許公開第２０１３／０３１８６４３号に開示されているように周知であり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のキメラＴｆＲを有するトランスジェニック動物由来の胚性幹細胞は、トランスジェニック動物の子孫を提供するための供給源として使用することができる。

いくつかの実施形態では、ノックインの方法は、単一細胞の非ヒト動物で実行される。例示的な一実施形態では、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、及びドナーポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％同一である頂端ドメインコード配列を含み、コード配列は、左の相同アーム及び右の相同アームと隣接しており、前核のマイクロインジェクションを介して単一細胞胚に導入される。その後、レシピエントの胚は偽妊娠雌に移植される。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成し、非ヒト動物胚のトランスフェリン受容体の頂端ドメインのコード配列を標的にする。結果として、非ヒト動物のトランスフェリン受容体頂端ドメインは切断され、ドナーポリヌクレオチドからのトランスフェリン受容体頂端ドメインコード配列で置換される。いくつかの場合では、導入遺伝子を保有する始祖の雄が選択され、野生型の雌と交配させてＦ１ヘテロ接合マウスを生成できる。ホモ接合の非ヒト動物は、Ｆ１世代のヘテロ接合の非ヒト動物の繁殖から引き続き生成することができる。本明細書に開示されるトランスジェニック動物はげっ歯類、例えばマウスまたはラットであり得る。

例示的な一実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物、例えば非霊長類哺乳動物がイントロン及び天然ＴｆＲのトランスフェリン結合ドメインを保持するという事実に一部起因し、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する頂端ドメインをノックインすることによって生成されたトランスジェニック動物は、一般的に健康であり、同種の野生型マウスの生理的状態と同様の生理的状態を示す。一実施形態では、ＴｆＲの頂端ドメイン外の全てのイントロンが保持される。例えば、ＴｆＲの発現レベルは、同種の野生型動物に類似し、トランスジェニックマウスの発現レベルは、野生型マウスの発現レベルよりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以内低く、または野生型マウスよりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、または５００％以内高い。赤血球数、ヘモグロビンのレベル、及び／またはヘマトクリットのレベルも、同種の野生型動物と同様であり、差は５０％未満、例えば４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満である。典型的な実施形態では、本発明によるトランスジェニック動物は、栄養素及びタンパク質の取り込みを可能にする選択的ＢＢＢ輸送を保持し、毒素からＣＮＳを保護する能力を保持し、導入遺伝子の存在は、下記の頂端ドメインに結合する抗体へのトランスフェリン結合またはＦｃＲｎ結合を阻害しない。通常、トランスジェニック動物でのＴｆＲを介した細胞輸送は、これらの野生型動物にも類似する。本発明によるトランスジェニック動物は、ヒトＴｆＲを完全に欠く野生型マウスまたはｈｕＴｆＲ細胞外ドメイン全体を発現する（例えば、ｈｕＴｆＲタンパク質全体を発現する）トランスジェニック動物モデルよりも、ヒトＢＢＢ浸透性薬物の薬物動態または薬力学的研究のモデルとしてより好適である。

本発明は、実施例に示されるようにマウスで説明されているが、当業者には、他の非ヒト哺乳動物、例えば、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ラクダ科動物、非ヒト霊長類、及び他の哺乳動物も同様に操作してキメラＴｆＲを発現させることができることが理解され、これらのトランスジェニック動物は、本明細書に開示される用途にも使用できる。

頂端ドメイン結合ポリペプチド
本明細書で使用される「頂端ドメイン結合ポリペプチド」または「ＡＤＢＰ」は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する頂端ドメインに結合するポリペプチドを指す。ＡＤＢＰは、キメラＴｆＲのｈｕＴｆＲの頂端ドメインに結合することができる抗体または任意のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは、血液脳関門を通過して送達される薬剤である。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは、例えば共有結合によりそれに結合したエフェクター分子をさらに含む。エフェクター分子は、治療薬、標識薬、または診断薬であり得る。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、治療用または診断用抗体などのポリペプチド、または酵素もしくはシグナル伝達分子に対して酵素活性もしくは阻害活性を有するポリペプチドである。ある特定の実施形態では、エフェクター分子は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰは二重特異的抗体であり、頂端ドメイン結合領域は頂端ドメインを認識する抗体、エフェクター分子は異なる抗原、例えば酵素またはシグナル伝達分子を認識する抗体であり、エフェクター部分の結合は、酵素またはシグナル伝達分子を活性化または阻害する。

キメラＴｆＲに結合するＡＤＢＰのスクリーニング
本明細書に開示されるキメラＴｆＲを使用して、ＴｆＲに結合することができるＡＤＢＰをスクリーニングすることができる。スクリーニングする方法は、候補ＡＤＢＰを上記に開示されたキメラＴｆＲと接触させるステップと、キメラＴｆＲに結合する候補ＡＤＢＰの量を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰをキメラＴｆＲと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲを発現する宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの場合では、候補ＡＤＢＰをキメラＴｆＲと接触させるステップは、ＡＤＢＰを、キメラＴｆＲを発現する内皮と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、内皮はＢＢＢ内皮である。

候補ＡＤＢＰとＴｆＲとの間の相互作用は、当技術分野で周知の方法、例えばイムノアッセイまたはＳＰＲを使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰのキメラＴｆＲへの結合は、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム、または免疫共沈降によって測定される。

ＢＢＢを通過できるＡＤＢＰのスクリーニング
上記のキメラＴｆＲを発現する非ヒトトランスジェニック動物を使用して、キメラＴｆＲの頂端ドメインに結合するＡＤＢＰの能力、及び最終的にＢＢＢを通過する能力を特徴付けることができる。

典型的に、ＡＤＢＰがＢＢＢを通過する能力を評価するために、好ましくは静脈注射により、ＡＤＢＰは、本明細書に開示されるキメラＴｆＲを保有するトランスジェニック動物に投与される。一定時間後、例えば、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、少なくとも１２０分、少なくとも１８０分、または少なくとも２４０分、トランスジェニック動物は屠殺され、脳組織が分析されてＡＤＢＰの存在を決定する。ＡＤＢＰの存在は、ＡＤＢＰ及び／またはそれに結合したエフェクター分子の存在についてアッセイすることにより決定することができる。いくつかの実施形態では、脳組織は生理食塩水、例えばＰＢＳで灌流され、検出前に固定される。切片内のエフェクター分子の存在は、標準的な撮像法、例えば免疫組織化学法または免疫蛍光法を使用して検出できる。脳組織内のエフェクター分子の陽性検出は、エフェクター分子がＢＢＢを通過できることを示す。いくつかの場合では、脳内のＡＤＢＰの存在の決定は、定量的イムノアッセイの実施が含まれる。キメラＴｆＲトランスジェニックマウスを使用してＢＢＢを通過する輸送を測定するアッセイは強固であり、ＡＤＢＰの取り込みの１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍を超える改善を測定できる。

いくつかの実施形態では、脳内のＡＤＢＰの存在を検出するための撮像法またはイムノアッセイの使用に加えて、エフェクター分子の基質の変化を検出する方法も使用して、エフェクター分子の脳への取り込みを評価することができる。例示的な一実施形態では、ＡＤＢＰは、脳内の酵素の酵素活性を阻害することができるエフェクター分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＢＰの脳への取り込み、すなわち、ＢＢＢ輸送の能力を示すのは、ＡＤＢＰまたはそれに結合したエフェクター分子のいずれかによって調節される酵素の酵素活性を評価することにより測定できる。

いくつかの実施形態では、候補ＡＤＢＰの脳への取り込みは、脳内で測定される。血漿もモニタリングでき、薬物動態プロファイルを評価できる。候補エフェクター分子の投与後、非ＢＢＢ通過性分子と比較した脳対血漿比の増加は、候補ＡＤＢＰがＢＢＢを通過できることを示す。

いくつかの場合では、キメラＴｆＲをコードするポリヌクレオチドを含む非ヒトトランスジェニック動物を、ある特定の疾患表現型を示すように操作された非ヒトトランスジェニック動物と交配させることができる。いくつかの場合では、非ヒトトランスジェニック動物は、様々なマウスモデル、例えば米国特許第８，４７６，４８５号に記載されるようなＡＬＳマウスモデル、米国特許第５，８９８，０９４号及び米国特許第６，１７５，０５７号に記載されるようなＡＤマウスモデル、米国特許公開第２０１６／００５０８９５号に記載されるようなＴＳＰＯマウスモデル、米国特許公開第２０１４／００４１０６２号に記載されるような自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）マウスモデルと交配できるトランスジェニックマウスである。これらの前述の特許及び特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの場合では、そのような交配によって生成されたハイブリッドマウスを使用して、脳内のエフェクター分子を含むＡＤＢＰの分布と、脳疾患の治療におけるＡＤＢＰまたはエフェクター分子の有効性との両方を評価できる。

キット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラトランスフェリン受容体ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを発現する細胞を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、上記のＡＤＢＰのスクリーニングに使用するためのものである。

いくつかの実施形態では、キットは、キメラＴｆＲポリペプチドと候補ＡＤＢＰとの間の結合を検出するアッセイで使用できる緩衝液及び容器をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法の実施のための指示（すなわち、プロトコル）を含む説明資料（例えば、血液脳関門を通過して組成物を投与するためのキットの使用説明書）をさらに含む。通常、説明書は文書または印刷物を含むが、これに限定されない。そのような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が、本発明によって企図される。そのような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような説明書を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれ得る。

以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、特許請求される発明の限定として解釈されるべきではない。同様に、意図する発明を首尾よく実行することを可能にする、当業者が利用可能な様々な代替技術及び手順がある。

実施例１：ｈｕＴｆＲマウスの生成及び特徴付け
ノックイン／ノックアウトマウスを生成する方法は文献に発表されており、当業者には周知である。簡単に説明すると、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用して、単細胞胚への前核マイクロインジェクションを介してヒトの頂端ＴｆＲマウス系統のノックインを生成し、続いて偽妊娠雌へ胚移植した。具体的には、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、配列番号１０〜１１、及びドナーＤＮＡ、配列番号４が胚に導入された。ドナーＤＮＡは、マウスでの発現のためにコドン最適化されたヒト頂端ドメインコード配列、配列番号２を含んでいた。頂端ドメインコード配列は、左の相同アーム（配列番号４のヌクレオチド１〜８１７）及び右の相同アーム（配列番号４のヌクレオチド１５２３〜２３２９）と隣接していた。ドナー配列は、この方法で設計され、頂端ドメインが第４のマウスエクソンの後に挿入され、その３’末端に第９のマウスエクソンが直接隣接した。胚を移植された雌の子孫からの始祖の雄は、野生型の雌と交配させて、Ｆ１ヘテロ接合マウスを生成した。続いて、ホモ接合マウスは、Ｆ１世代のヘテロ接合マウスの繁殖から生成された。

実施例２：抗体の脳への取り込みをモニタリングするためのツール抗体の生成
ヒトＴｆＲまたはヒト／マウスＢＡＣＥ１を標的とするツール抗体は、重鎖と軽鎖とをコードするＤＮＡを含む発現プラスミドでＥｘｐｉ２９３またはＥｘｐｉＣＨＯ細胞を形質転換し、当業者に周知のプロトコルを使用して生成された。二重特異的抗体は、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」技術を使用して生成され、ｋｎｏｂとｈｏｌｅとのハーフ抗体は別々に発現され、公開された方法を使用して結合された。抗体は、最初にプロテインＡで精製し、次にサイズ排除クロマトグラフィで精製された。これらの研究のために生成された抗体は以下である：
抗ＴｆＲ：ヒトＴｆＲ頂端ドメインに結合するヒトＩｇＧ１抗体。
抗ＢＡＣＥ１：ヒトＢＡＣＥ１に結合し、マウスＢＡＣＥ１と交差反応するヒトＩｇＧ１抗体。この抗体は、ＢＡＣＥ１の酵素活性を阻害する。
抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１：ヒトＴｆＲ頂端ドメインならびにヒト及びマウスＢＡＣＥ１に結合するヒトＩｇＧ１ ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ二重特異的抗体。ｋｎｏｂハーフ抗体は、抗ＢＡＣＥ１抗体からの可変ドメインを有し、ｈｏｌｅハーフ抗体は、抗ＴｆＲ抗体からの可変ドメインを有する。

実施例３：ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの血液分析
血液は、野生型Ｃ５７Ｂｌ６、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウス（ｎ＝３／グループ）から採取され、標準的な全血球算定（ＣＢＣ）分析が実施された。遺伝子型特異的な違いは、総赤血球、ヘモグロビン、及びヘマトクリットレベルを含む全ての赤血球パラメータにおいて観察されなかった（図１）。

実施例４：ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスにおけるＴＦＲ標的抗体の脳局在
この例では、抗ＴｆＲ抗体は、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウスにおけるＴｆＲ標的治療薬の脳への取り込みを評価するために生成された。ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウスまたは野生型Ｃ５７Ｂｌ６は、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲ抗体を静脈注射された。１時間後、マウスは屠殺され、ＰＢＳで灌流された。半脳は、４％ＰＦＡ内に一晩入れて固定した後、３０％スクロースで保存した。矢状脳切片（３５μｍ）はミクロトームを使用して切断され、５％ＢＳＡ＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でブロックされた後、Ａｌｅｘａ４８８抗ｈｕＩｇＧ１（１：５００）で蛍光二次染色した。脳画像は、２０倍の対物レンズを備えたＺｅｉｓｓの広視野顕微鏡を使用して撮影された。有意な血管染色がｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウスで観察され、ＴｆＲが高度に発現しているＢＢＢの脳内皮細胞上のヒト頂端特異的抗ＴｆＲの強固な結合が示された（図２）。対照的に、ごく少量の染色が野生型マウスで観察された。

ＴｆＲ特異的ＢＢＢ輸送を確認するために、抗ＢＡＣＥ１抗体及び抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性抗体は、上記と同様のアプローチを使用して試験された。ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスは、５０ｍｇ／ｋｇのどちらかの一方の抗体を静脈注射された。２４時間後、マウスはＰＢＳで灌流され、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／−}マウスについて上記したように、半脳を処理して染色した。広範な脳実質の染色が抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１で観察されたが、抗ＢＡＣＥ１では染色は観察されず、ＴｆＲ頂端ドメイン結合ポリペプチドが、これらのマウスのＢＢＢのトランスサイトーシスに必要とされることを示した（図３）。

実施例５：ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスにおける抗体の脳及び血漿のＰＫ／ＰＤ
この実施例では、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスは、５０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＡＣＥ１抗体または抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異的抗体のどちらか一方を静脈注射された。２４時間後、血液は心臓穿刺を介して採取され、マウスはＰＢＳで灌流された。脳組織は、１０倍の組織重量のＰＢＳ中に１％ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液で均質化された。血液は、ＥＤＴＡチューブに採取され凝固するのを防止し、血漿を分離するために１４０００ｒｐｍで７分間回転させた。マウス血漿及び脳溶解物中の抗体濃度は、製造元の指示に従って、一般的なヒトＩｇＧアッセイ（ＭＳＤ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｋｉｔ ＃Ｋ１５０ＪＬＤ）を使用して定量された。簡単に説明すると、事前にコーティングしたプレートは、ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａで３０分間ブロックされた。血漿試料は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｉｍｂｕｓリキッドハンドラを使用して１：１０，０００に希釈され、ブロックされたプレートに二重に添加された。脳試料は、１％ＮＰ４０溶解緩衝液で均質化され、溶解物をＰＫ分析用に１：１０に希釈した。投与溶液もまた同じプレートで分析され、正確な投与量を確認した。０．７８〜２００ｎｇ／ｍＬのＩｇＧの標準曲線は、４パラメータロジスティック回帰を使用して適合された。

２４時間後、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の血漿レベルは、抗ＢＡＣＥ１のレベルよりも低く、おそらく、末梢で発現したｈｕＴｆＲ^頂端への結合を介したこの抗体のクリアランスのためである（図４Ａ）。脳内では、抗ＢＡＣＥ１と比較して、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の濃度の約２８倍の増加が観察された（図４Ｂ）。抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１の顕著な蓄積は、ＢＢＢでのＴｆＲを介したトランスサイトーシスによるものであり、この結果は、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスがヒトＴｆＲ頂端ドメイン結合ポリペプチドのＢＢＢ取り込みを測定するためのツールであることを立証する。

アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断のＢＡＣＥ１阻害は、血漿及び脳における抗体活性の薬力学的読み出しとして使用された。脳組織は、１０倍の組織重量の５Ｍグアニジン−ＨＣｌで均質化され、次いでＰＢＳ中の０．２５％カゼイン緩衝液で１：１０に希釈された。血漿及び脳溶解物中のマウスＡβ４０レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定された。３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレートは、Ａβ４０ペプチドのＣ末端に特異的なポリクローナル捕捉抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢＮ２４０）で一晩コーティングされた。カゼイン希釈グアニジン脳溶解物は、ＥＬＩＳＡプレートでさらに１：２に希釈され、検出抗体であるビオチン化Ｍ３．２と同時に添加された。血漿は、１：５希釈で分析された。試料は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、続いてＴＭＢ基質を加える前に４℃で一晩培養された。標準曲線、０．７８〜５０ｐｇ／ｍＬのｍｓＡβ４０は、４パラメータロジスティック回帰を使用して適合された。

抗ＢＡＣＥ１と比較して、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１治療はｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスのＡベータの減少を増加させ、脳内におけるＢＡＣＥ１標的の関与が抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１を使用して達成されることを示す（図４Ｃ）。血漿Ａベータは、未処理の野生型マウスと比較して、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１及び抗ＢＡＣＥ１の両方で同程度に減少された（図４Ｄ）。これらのデータは、特にヒトＴｆＲ頂端ドメイン結合ポリペプチドの評価のために、ヒトＴｆＲを介した脳への取り込みを必要とする標的に関与する研究におけるｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスの使用を支持する。

実施例６：ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスにおけるＴｆＲの発現
ＴｆＲ発現レベルがｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスで変化するかを決定するために、野生型及びｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスから脳及び様々な末梢組織が分離された。脳、肝臓、肺、及び腎臓は、ＰＢＳの灌流後のマウスから採取された。組織は、１０倍の組織重量のＰＢＳ中に１％ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液で均質化された。試料はウエスタンブロットで実施され、ＴｆＲ発現レベルはＴｆＲの細胞内部分を認識し、その結果野生型とｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}との両方に対して交差反応するＴｆＲ抗体（１：２０００；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１３−６８００）を使用して決定された。ＴｆＲ発現の定量化は、アクチンとの比として表された（１：５０００；Ａｂｃａｍ ８２２７）。図５Ａ〜５Ｄは、ｈｕＴｆＲ^{頂端＋／＋}マウスにおけるＴｆＲ発現が、野生型マウスにおける脳（図５Ａ）、肝臓（図５Ｂ）、腎臓（図５Ｃ）、及び肺（図５Ｄ）と非常に類似していることを示す。

本明細書に記載される実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、配列受託番号、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

例示的な配列の表
配列番号１：ヒト頂端ドメイン挿入物のタンパク質配列

配列番号２：ヒト頂端ドメイン挿入物のＤＮＡ配列

配列番号３：トランスジェニックマウスにおいて発現したキメラＴｆＲ配列（斜体部分は細胞質ドメインを表し、太字部分は膜貫通ドメインを表し、灰色の部分は細胞外ドメインを表し、ならびに太字及び下線が引かれた部分は頂端ドメインを表す）

配列番号４：完全なドナーＤＮＡの配列（左の相同アーム：１〜８１７、右の相同アーム：１５２３〜２３２９、ヒト頂端ドメイン：９４１〜１４９２、コドン最適化配列：８２１〜１５２２）

配列番号５：マウスＴｆＲタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６２３５１）（斜体部分は細胞質ドメインを表し、太字部分は膜貫通ドメインを表し、灰色の部分は細胞外ドメインを表し、ならびに太字及び下線が引かれた部分は頂端ドメインを表す）

配列番号６：ヒトＴｆＲタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６）（斜体部分は細胞質ドメインを表し、太字部分は膜貫通ドメインを表し、灰色の部分は細胞外ドメインを表し、ならびに太字及び下線が引かれた部分は頂端ドメインを表す）

配列番号７：アカゲザル（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ））ＴｆＲの頂端ドメイン（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２４４２３２．１）であり、天然ヒトＴｆＲの頂端ドメインとの９５％の同一性を有する。

配列番号８：チンパンジーＴｆＲの頂端ドメイン（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００３３１０２３８．１）であり、天然ヒトＴｆＲの頂端ドメインと９８％同一である。

配列番号９：カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ））ＴｆＲの頂端ドメイン（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５４５３１５）であり、天然ヒトＴｆＲの頂端ドメインと９６％同一である。

配列番号１０：

配列番号１１：

Claims (67)

1. 非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含むキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
2. 前記異種頂端ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記異種頂端ドメインが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位が、天然マウストランスフェリン結合部位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号３との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記キメラＴｆＲポリペプチドの前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列の領域が、配列番号２との少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記キメラＴｆＲポリペプチドの前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列の領域が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 前記キメラＴｆＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、マウストランスフェリン受容体遺伝子のエクソンとイントロンとを含み、かつ前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列が、マウストランスフェリン受容体遺伝子の頂端結合ドメインに取って代わるように前記マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチド。
11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
12. マウス細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、（ａ）ＴｆＲポリペプチドの内因性頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインと、（ｂ）内因性トランスフェリン結合部位とを含む、宿主細胞。
14. 前記異種頂端ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の宿主細胞。
15. 前記異種頂端ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の宿主細胞。
16. 前記細胞内の前記異種頂端ドメインをコードする核酸配列が、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１３、１４、または１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
17. マウス細胞である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
18. 前記細胞内の前記頂端ドメインをコードする前記核酸配列が、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている、請求項１７に記載の宿主細胞。
19. エクスビボにある、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
20. 胚性幹細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. 前記宿主細胞のゲノムが、内因性ＴｆＲの頂端ドメインの欠失を含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
22. キメラＴｆＲポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、前記非ヒトトランスジェニック動物にとって内因性であるＴｆＲポリペプチドの頂端ドメインに取って代わる異種頂端ドメインを含む、前記非ヒトトランスジェニック動物。
23. 前記非ヒトトランスジェニック動物のゲノムが、前記非ヒトトランスジェニック動物の天然ＴｆＲの頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインを含む、請求項２２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
24. 請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
25. げっ歯類である、請求項２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
26. マウスである、請求項２５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
27. ラットである、請求項２５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
28. 前記キメラＴｆＲについてホモ接合性である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
29. 前記キメラＴｆＲについてヘテロ接合性である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
30. キメラＴｆＲに結合する頂端ドメイン結合ポリペプチド（ＡＤＢＰ）をスクリーニングする方法であって、
    候補ＡＤＢＰを、請求項１０に記載のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、
    前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量を決定するステップと
    を含む、方法。
31. 前記候補ＡＤＢＰを前記キメラＴｆＲポリペプチドと接触させる前記ステップが、前記ＡＤＢＰを、前記キメラＴｆＲポリペプチドを発現する宿主細胞と接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記候補ＡＤＢＰを前記キメラＴｆＲポリペプチドと接触させる前記ステップが、前記ＡＤＢＰを、前記キメラＴｆＲポリペプチドを発現する内皮と接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記内皮が血液脳関門内皮である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する前記候補ＡＤＢＰの量が、イムノアッセイによって決定される、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する前記候補ＡＤＢＰの量が、表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項３０に記載の方法。
36. 前記接触させるステップが、インビボで実施される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記候補ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記エフェクター分子がポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項３９に記載の方法。
41. キメラＴｆＲに結合するＡＤＢＰの量を測定する方法であって、
    ＡＤＢＰを、請求項１０に記載のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、
    前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合したＡＤＢＰの量をイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴によって決定するステップと
    を含む、方法。
42. 血液脳関門を通過するＡＤＢＰをスクリーニングする方法であって、
    （ａ）配列番号１との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、
    （ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物の脳内の前記ＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップと
    を含む、方法。
43. 前記ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、請求項４２に記載の方法。
44. 前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、請求項４３に記載の方法。
45. 前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
46. 前記決定するステップが、定量的イムノアッセイを実施することを含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記測定するステップが、前記動物の脳または脳組織を、前記エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在する前記エフェクター分子のレベルを決定することとを含む、請求項４３に記載の方法。
48. 前記測定するステップが、前記エフェクター分子の薬力学的（ＰＤ）効果を測定することを含む、請求項４２に記載の方法。
49. 前記エフェクター分子が、抗ＢＡＣＥ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ前記測定するステップが、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ４０のレベルを測定することを含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記エフェクター分子が、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４３に記載の方法。
51. 血液脳関門を通過するＡＤＢＰをモニタリングする方法であって、
    （ａ）配列番号１との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、
    （ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物の脳内の前記ＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップと
    を含む、方法。
52. 前記ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、請求項５１に記載の方法。
53. 前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
54. 前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５３に記載の方法。
55. 前記決定するステップが、定量的イムノアッセイを実施することを含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記決定するステップが、前記エフェクター分子を、前記エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在する前記エフェクター分子のレベルを決定することとを含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記エフェクター分子が、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
58. 前記測定するステップが、前記標的に結合する前記エフェクター分子のＰＤ効果を測定することを含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記エフェクター分子が、抗ＢＡＣＥ１抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ前記測定するステップが、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ４０のレベルを測定することを含む、請求項５７に記載の方法。
60. キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を生成する方法であって、前記非ヒト単一細胞胚の内因性ＴｆＲの頂端ドメインを、配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する異種頂端ドメインで置換することを含む、方法。
61. 前記頂端ドメインを置換することが、相同組換えによって実施される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記方法が、Ｃａｓ９タンパク質と、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと、前記異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含むドナーＤＮＡとを接触させることを含み、
    前記異種頂端ドメインコード配列が、前記非ヒト単一細胞胚のゲノム内の前記内因性ＴｆＲの前記頂端ドメインを置換するように、前記異種頂端ドメインは、左の相同アーム及び右の相同アームと隣接している、
    請求項６０または６１に記載の方法。
63. 前記異種頂端ドメインが、前記非ヒト単一細胞胚での発現のためにコドン最適化されている、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記非ヒト単一細胞胚がマウス胚である、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
65. 前記ドナーＤＮＡが、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第４のエクソンの後に配置される、請求項６４に記載の方法。
66. 非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
    （ａ）請求項６０〜６５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を、前記非ヒト単一細胞胚と同じ動物種の偽妊娠雌に対して移植するステップと、
    （ｂ）前記雌より生まれた子孫から非ヒトトランスジェニック動物を選択するステップであって、前記非ヒトトランスジェニック動物は、内因性ＴｆＲの頂端ドメインが配列番号１との少なくとも８０％の同一性のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインで置換されたキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを含む、ステップと
    を含む、方法。
67. キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
    （ａ）配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドを、動物の胚細胞内に導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、内因性ＴｆＲ頂端ドメインをコードする内因性ＴｆＲ遺伝子の領域を標的とし、かつ配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する前記頂端ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記内因性頂端ドメインをコードする前記内因性ＴｆＲ遺伝子の前記領域を置換する、ステップと、
    （ｂ）前記細胞またはその子孫を非ヒトトランスジェニック動物へと発達させるステップと
    を含む、方法。

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