JP2016516399A - 非機能性tspo遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト生物 - Google Patents
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Abstract
Description
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m、nおよびpは、第14の態様の化合物について定義の通りであり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
本明細書を通じて、「一つの」または「1個の」要素に言及する場合、それは文脈が別の意味を決定するのでない限り、複数形を排除するものではない。
その動物は、非機能性内在性TSPO遺伝子産物の少なくとも一つのコピーを含む細胞を有する生存可能な子孫を生じるように繁殖させることができる動物であることができる。その動物は例えば、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類、ブタ、ネコ、ウサギ、ヤギ、フェレット、モルモット、スナネズミまたはハムスターなど(これらに限定されるものではない)の哺乳動物であることができる。その動物は、ニワトリ、カモまたはウズラなど(これらに限定されるものではない)の鳥であることもできる。その動物は、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)などのショウジョウバエ科に属するものなどのハエ(これに限定されるものではない)などの昆虫であることができる。その動物は、コイ科に属するもの(これに限定されるものではない)などの魚であることもできる。例えば、その魚は、ゼブラフィッシュまたはメダカであることができる。その動物はヒル科に属するヒルであることもできる。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、TSPO機能およびTSPO関連障害に関係するイン・ビボ試験およびTSPO関連遺伝子産物またはTSPOと直接もしくは間接的に相互作用する化合物の試験において特に有用である。しかしながら、その動物は、TSPO機能およびTSPO関連障害のイン・ビトロ試験にも用いることができる。TSPO関連遺伝子産物は、TSPO遺伝子産物に機能的に関連する遺伝子産物である。TSPO関連遺伝子産物は、TSPO遺伝子産物を含むあらゆるシグナル伝達経路の上流もしくは下流である遺伝子産物であることができる。TSPO関連遺伝子産物はタンパク質またはmRNA転写物であることができ、シグナル伝達経路におけるTSPO遺伝子産物のすぐ上流もしくは下流である必要は必ずしもない。例えば、TSPO関連遺伝子産物は、TSPO遺伝子の転写開始領域に結合し、転写を開始する転写因子であることができる。別の例では、TSPO関連遺伝子産物は、細胞においてTSPO介在ステロイド産生に応答して発現されるタンパク質であることができる。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Yが、F、Cl、Br、I、CNおよびOHから選択され;
Zが、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2が独立に、(C1−C3)アルキル、(C1−C3)アルコキシ、(C2−C3)アルケニル、(C5−C6)シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、(C2−C4)アルカノイルおよび(C2−C4)アシルから選択され、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、OH、(C2−C4)アルコキシ、NH2、(C1−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く;
R3およびR4がそれぞれ独立に、水素または(C1−C3)アルキル、(C2−C3)アルケニル、(C5−C6)シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジルおよび(C2−C4)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C3)アルコキシ、NH2、(C−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C3)アルコキシ、NH2、(C1−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良い(C2−C3)アルキリデンであり;
mおよびnが独立に、0または1である化合物などがあるが、それに限定されるものではない。
Xはヨウ素またはそれの同位体であり;
Yはハロゲンであり;
R3およびR4は独立に、水素、(C1−C4)アルキルおよび(C2−C4)アルケニルから選択され、またはR3およびR4が一体となって、(C2−C3)アルキリジンである。
Yはハロゲンであり;
R1は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲンまたはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4は独立に、水素、(C1−C4)アルキルおよび(C2−C4)アルケニルから選択され、またはR3およびR4が一体となって(C2−C3)アルキリジンである。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。
対象者(被験体)は、ヒトであっても良く、非ヒトであっても良い。対象者または個体についての言及は、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、齧歯類の分類の構成員、特にはヒツジ、ウシ、ウマおよびイヌなどの分類の家畜化された構成員など(これらに限定されるものではない)の社会的、経済的もしくは研究的重要性のある生物種の個体などのヒトまたは非ヒトを意味する。
(実施例)
材料および方法
構築物のデザインおよびトランスジェニック動物の作製
TSPOノックアウトマウスの開発はOzgene(Bentley DC, WA, Australia)によってなされた。TSPOノックアウトマウスは、Cre-Lox組換え法を用いて作製された。TSPOノックアウトマウスを作製するために、いくつかの付加を有する、野生型TSPOアレルと相同なターゲティング構築物を作製した(図1を参照されたい)。その構築物は、TSPO開始コドンを含むエクソン2および3の両端に一対のLoxP部位を含有し、さらにターゲティング構築物の獲得成功を選別するためのネオマイシンカセット、およびフリッパーゼ認識標的(FRT)部位も含有していた。FRT部位は、後に条件付きノックアウトマウスの作製を可能にするために含められた。ネオマイシンカセットは、構築物の組込みに成功した細胞にネオマイシン耐性を付与する。構築物は、エレクトロポレーションによってBruce4マウス胚性幹(ES)細胞に導入されたが、そうすることで、ターゲティング構築物由来の改変TSPO配列が相同組換えによって野生型TSPO配列を置き換えることができるようにした。G418は真核細胞のポリペプチド合成をブロックする抗生物質であるが、ネオマイシン遺伝子により与えられるG418耐性を用いて、その後、ターゲティング構築物を含有するES細胞を選別することができる。
動物の繁殖
適当な数のTSPOホモノックアウト、TSPOヘテロノックアウト、およびTSPO野生型動物が利用できるように、TSPOノックアウト動物を繁殖させた。TSPOノックアウトマウスの妊孕性を評価するために、TSPOホモノックアウトマウスを、雌雄のTSPOホモおよびヘテロノックアウトマウスと交配した。
遺伝子型決定
組織ゲノムDNA単離法
安楽死の後、末端尾部領域からマウス組織サンプルを採取した。末端尾部の約1cmを切り取って、gDNA抽出に使用した。gDNAは、PureLink Genomic DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて、メーカーの説明書にしたがって組織サンプルから採取した。簡単に述べると、切り取った尾を滅菌エッペンドルフチューブに入れ、それにPureLink Genomic Digestion Buffer 180μlおよびプロテイナーゼK 20μlを添加した。チューブを短時間ボルテックスし、溶解が完了するまでときどきボルテックスしながら55℃でインキュベートしたが、典型的にはこれに約3-4時間を要した。完全に溶解した後、溶解物を室温にて10000 gで3分間遠心した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、それにリボヌクレアーゼA 20μlを添加した。その後、これを短時間ボルテックス撹拌により混合し、室温にて2分間インキュベートしておいた。
ゲノムDNAを用いたサザンブロット分析
マウス尾部生検材料から単離されたゲノムDNAを用いて、サザンブロット分析によって動物の遺伝子型を決定したが、DNAはScaIで消化され、プローブとハイブリダイズして、野生型アレルについて8.8 kb断片、ならびにノックアウトアレルについて4.2 kb断片を生じた。
糞便サンプルゲノムDNA単離
1匹のマウスを清潔な動物飼育箱の中に入れることによって糞便サンプルを採取し、典型的には、糞便サンプルは30秒以内に得られた。糞便サンプルはすぐに使用するか、または液体窒素中で急速凍結して、必要になるまで-80℃で保存した。gDNAはQIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)を用いて、メーカーの説明書にしたがって糞便サンプルから採取した。簡単に述べると、糞便サンプルは、ボルテックス撹拌によってホモジナイズし、1 mlピペットを用いてASLバッファー1.6 ml中で粉砕した。その後サンプルを室温にて10000 gで1分間遠心し、上清を新たなチューブに移し、それにInhibitEXタブレットを添加した。InhibitEXタブレットは、溶解するまでボルテックス撹拌し、室温で少なくとも1分間インキュベートしておいた。インキュベーション後、サンプルを室温にて10000 gで3分間遠心し、各サンプルの上清を新たなチューブに移して、再度フルスピードで、もう3分間遠心した。遠心後、上清600μlをピペットで取り、プロテイナーゼK 25μlおよびALバッファー600μlを入れた新たなチューブに入れて、これを15秒のボルテックス撹拌により混合した。次に混合物を70℃にて10分間インキュベートした。
ポリメラーゼ連鎖反応
通常の遺伝子型決定のために、TSPOノックアウトマウスの異なる遺伝子型を区別するようデザインされた1セットの3つのプライマーを用いて、単離されたgDNAについてPCRを実施した。そのプライマーセットは、1つのフォワードプライマー(FP)および2つのリバースプライマー(RP1およびRP2)からなり(図1を参照されたい)、野生型およびノックアウトアレルはそれぞれ、2つ、および1つの、特有のPCR産物サイズを生じる。このことは、標準的なゲル電気泳動および紫外線下での観測によって動物の遺伝子型を決定する、簡単で効率的な方法を可能にする。予想されるPCR産物バンドサイズは、野生型アレルについては489および1501塩基対であり、ノックアウトアレルについては約246塩基対である。図2は、プライマーデザインおよび予想されるゲルイメージの概略図を示す。このデザインの原理は、ノックアウトアレルを示すものとして不検出を回避したので、TSPOノックアウトアレルの存在を、DNA抽出時もしくはPCR設定時の能力不足や誤操作と混同しないという利点をもたらし、遺伝子型決定時の全体の精度を高めている。遺伝子型決定に使用されたプライマーについては表1を参照されたい。
結果
記載の繁殖戦略は、TSPOホモノックアウト、TSPOヘテロノックアウト、またはTSPO野生型動物のいずれかである子孫を生み出すことが可能であり、これらの遺伝子型はいずれもサザンブロット分析および/またはPCRによって明確に決定することができた。はじめに、初代動物をサザンブロット分析で評価したが、図3(a)は、子孫選択のゲノムDNAがTSPOエクソン4に向けられたプローブで検出されることを示す(アニーリング部位については図1を参照されたい)。レーン2(DO44)に8.8 kbおよび4.2 kbの産物が存在することは、ヘテロを示しているが、DO45(レーン3)はTSPOホモノックアウトマウスであり、DO47(レーン7)は野生型マウスである。
材料および方法
膜の調製
T25 デジタルUltra-Turraxホモジナイザー(Ika, Wilmington, NC, USA)を用いて、氷冷Trisバッファー(pH 7.4)約45 ml中で、速度設定値5、または20000 prmにおいて、組織サンプルをホモジナイズし、48000 gの遠心により収集した後、上清を捨てた。次いで、その手順をただちに繰り返したが、これは追加の洗浄ステップとして機能し、放射性リガンド結合に対するいかなる可溶性妨害物質も除去する(Byland et al. 1993)。2回目の遠心および上清除去後、サンプルを約50容の氷冷Trisバッファー(pH 7.4)中に再懸濁した。サンプルを分割し、必要になるまで-80℃で保存した。
タンパク質濃度測定
ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Scoresby, VIC, Australia)を用いて、メーカーの使用説明書にしたがってタンパク質濃度を測定した。手短に述べると、BCA試薬AおよびBCA試薬Bを50:1(BCA試薬A:B)の割合で混ぜ合わせて、BCA作用試薬を作製し、Trisバッファーで希釈したタンパク質サンプルを、BCA作用試薬に20:1(作用試薬:タンパク質)の割合で添加した。次にサンプルを37℃にて30分間インキュベートし、分光光度計で562 nmにおいて測定した。キットと共に提供されるウシ血清アルブミン標準物質を用いて検量線を作製した。
飽和結合
TSPOノックアウトマウス研究のために、3H- PK11195ラセミ化合物を広範な濃度にわたって使用して、放射性リガンド結合を行った(図4)。PK11195はTSPO特異的プローブである。全結合および非特異的結合は、0.56 nMから20 nMまでの8つの濃度の3H-PK11195を用いて測定した。非特異的結合は、すべての濃度の3H-PK11195に5μM PK11195を添加することによって測定した。
結果
野生型、TSPOヘテロ、およびTSPOホモマウス由来の腎組織の分析を図4に示す。野生型マウスは、最高のTSPO発現を示し、TSPOヘテロマウスがそれに次いだ。TSPOノックアウトマウスは、TSPO選択的プローブPK11195の結合を示さない。
材料および方法
急速凍結した組織は、クリオスタットで20μmの切片に切り、融解してポリL-リジンコートスライドグラス上に載せ、実験日まで-80℃で保存した。実験当日に、スライドグラスを室温で解凍し、冷気流で風乾した。全結合および非特異的結合は、130 mM TRIS-HClバッファー(pH 7.4)中で室温にて20分間、3μM PK11195の存在あり、またはなしで、1 nM 3H- PK11195とともにインキュベートすることによって測定した。インキュベート後、室温にて、スライドグラスを130 mM TRIS-HClバッファー中に2回、短時間浸し、新たな130 mM TRIS-HClで2回5分間洗浄した。最後にスライドグラスを冷却した蒸留水で短時間3回すすぎ、冷気流下で乾燥し、一晩風乾しておいた。X線フィルムカセット内で、既知の放射能濃度を有するトリチウム微量スケールとともに、切片をKodak BioMax MRフィルムに暴露した。フィルムは33日後に現像し、GS800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いてデジタル処理した;3H-PK11195結合レベルを評価するために、対象となる領域を組織上に描き、平均黒化濃度/mm2を算出した。個々のフィルムから得られたデータは、フィルム間のばらつきに左右されるので、トリチウム微小スケールの黒化濃度を用いて、他のフィルムに対して標準化した。
結果
フィルムオートラジオグラフィーに使用される、脳、網膜、心臓、腎臓、および精巣などの臓器は、野生型(TSPO+/+)、ヘテロ(TSPO+/-)、およびホモ(TSPO-/-)マウスから切除され、液体窒素中で急速凍結された。18μmのクリオスタット臓器切片をスーパーフロストスライドグラス(Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany)上に載せ、暗下で-20℃にて、実験前に長くても1週間ほど保存した。フィルムオートラジオグラフィーは、3.14 TBq.mmol-1の比放射能を有するR-[N-メチル-3H] PK11195エタノール溶液(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, U.S.A.)を用いて行った。トリチウム標準物質(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)は、それぞれのHyperfilm-3H(Kodak Film)上で4℃にて60日間、臓器切片とともに暴露されるが、その標準物質を用いて、オートラジオグラフィーにより測定される結合を定量化した。Kodak GBX現像液および定着液(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)を用いて、このHyperfilmを現像した。Hyperfilmを一晩風乾した後、ArtixScan 1800fフラットベッドスキャナ(Microtek, Hsinchu, Taiwan)を用いてスキャンしたが、グレースケールは400%の倍率を使用し、光学的分解能は2400ピクセル/インチであった。プレスキャン操作もフィルターも利用しなかった。
材料および方法
顔面神経軸索切断の処置は、シドニー大学の動物倫理委員会によって承認された。イソフルラン麻酔を用いて動物を麻酔した。動物は、処置の間、麻酔の深さを確認するためにさまざまなモニタリング装置を用いて、呼吸、心拍数、酸素飽和度、および体温の組み合わせについてモニターした。足蹠または足底反射をもはや引き起こすことができなくなったら、手術プロセスを開始した。首の同側(右側)の毛を耳から下方に向かって剃り、皮膚を70%エタノールで清潔にした。茎乳突孔を覆う筋肉組織の上の位置に、小さな切開(0.5-0.7 cmの長さ)を行った。顔面神経を特定して分離し、完全に横に切断した。切開した皮膚は医療用接着剤で閉鎖した。同側のひげの動きは術後に消失し、顔面神経軸索切断の成功を示した。動物は、軸索切断の3日後にCO2により安楽死させ、脳幹および小脳の顔面神経核を含めた脳組織をただちに切除し、液体窒素中で急速凍結した後、凍結切片を作製するまで-80℃の冷凍庫で保存した。R-[N-メチル-3H] PK11195を用いたフィルムオートラジオグラフィーによって、TSPO発現レベルが明らかになった。
結果
顔面神経核の神経炎症は、片側の顔面神経軸索切断によって引き起こされた。切除された脳組織のフィルムオートラジオグラフィーを図6に示す。顔面神経軸索切断は、野生型マウスの同側の顔面神経核において高レベルのTSPO発現を引き起こした(左の画像の右側にある赤い円)。ヘテロマウスではもっと低いTSPO発現が観察された(中央の画像の右側にある円)が、ホモノックアウトマウスではTSPOは検出されなかった(右の画像の右側にある円)。TSPO発現レベルは野生型およびヘテロの軸索切断の対側でも増加したが、ホモマウスでは増加しなかったことに注目すべきである(各画像の左側にある円)。
材料および方法
小動物用Inveon PET/CTスキャナー(Siemens, Knoxville, TN, USA)を用いて、試験マウスのPETスキャンを行った。スキャンする前に、マウスは、5% (v/v) イソフルランで麻酔し、PET/CTスキャナー内に配置した。イソフルランレベルは、それ以後1-2%に維持した。体温は、フィードバック制御された加温パッドで維持し、スキャンする全期間にわたって、生理学的パラメーター(呼吸および体温)をモニターした(BioVet; m2m Imaging Corp.)。マウスが麻酔されている間、マウスの目に、乾燥を防ぐためにLacri-lube(Allergan)を入れた。PETスキャンは、[18F]PBR111 (8-18 MBq/100μL、0.2nmol)の尾静脈注射と同時に開始した。40分のイメージング後、臓器における非特異的蓄積を測定するためにPBR111(1 mg/kg、2%酢酸-生理食塩水中)を尾静脈から注射して、さらに10分間イメージングした。PETスキャンが完了したら、解剖学的情報を求めてマウスを10分間CTスキャンした。実験が終了した時点で、イメージング直後に、動物がまだ完全に麻酔されている間に、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた。
結果
PBR111は、TSPOタンパク質に結合するリガンドである。図7は、左側の画像が野生型マウス(TSPO+/+)で記録された高密度の放射性トレーサー([18F]-PBR111)を示すのに対して、右側のTSPOノックアウト(ホモ型、TSPO-/-)マウスマウスでは放射性トレーサーがまったく観察されなかったことを示す。注目すべき領域は、丸で囲んだ中に示される副腎であったが、それは副腎が野生型マウスでは最大のTSPO発現レベルを示すからである。腎臓は副腎の下に見ることができる。
材料および方法
動物の感覚および反射検査
マウスの神経反射を月齢5ヶ月で調べた。反射は、次の順序で1回調べた:正向、角膜、耳介、洞毛、リーチング、および背地走性反射。反射の存在は次のように判定した:
正向反射:動物を背位に置き、腹部を下にした姿勢を回復する兆候を記録した。
角膜反射:綿棒を用いて目の領域を軽く刺激し、まばたき行動の兆候を記録した。
耳介反射:綿棒を用いて耳道を軽く刺激し、耳を引っ込める、および頭部を動かす兆候を記録した。
洞毛反射:綿棒を用いて洞毛を刺激し、頭部の動き、ひげの可動性、およびまばたき行動を記録した。
リーチング反射:動物を尾の付け根で、ゆっくりとテーブルの表面に向かって降ろし、前肢および後肢を伸ばすことを記録した。
背地走性反射:動物を、斜面上に頭部を下にしておき、上り坂にむかって向き直る傾向を記録した。
結果
結果を下記の表2にまとめて示す。TSPOノックアウトについてホモ型であるマウスはすべて、正常であるとみられた。
材料および方法
不安関連行動の行動テストは、3-4月齢のマウスで実施したが、行動評価に関わるすべてのマウスは、行動実験中のハンドリングストレスの影響を減らすように、離乳後、頻繁にハンドリングした。不安関連行動は、行動テストバッテリーで調べたが、それは次の順序で行った:オープンフィールドテスト、エマージェンス(emergence)テスト、明暗選択テスト、および高架式十字迷路。すべての行動テストは、薄暗い室内で12:30 p.m.から6:30 p.m.までの間に行った。マウスは、実験環境に十分馴化することができるように、テストする少なくとも60分前に、ホームケージ内の一集団として実験室に運ばれた。すべての動物にわたって一貫した行動実験の経験を確保するために、動物は、ケージ内の全動物がテスト終了した時点で、即座にその動物のケージおよび飼育室に戻された。それぞれのテストの開始に先立って、尿および糞をすべて取り除き、その場所を80%エタノールで十分に清掃にし、次のテストが始まる前に乾燥させた。訓練履歴の影響を減らすために、行動テストは、少なくとも7日の間隔を置いて行った。
オープンフィールドテスト
オープンフィールドテストは、一般自発運動活動性ならびに不安関連行動を査定した。テストは、障壁も物体もない、四方の壁で囲まれたオープンな正方形のアリーナで構成された。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであり、アリーナの土台および壁はいずれも、うすく赤色がかったアクリル樹脂製であった。オープンフィールドテストの間、動物はアリーナの縁に沿って探索する傾向があり、より無防備となる中央部に滞在することはまれであった。アリーナの中央部を横切る時間および回数の総計を不安の指標として用いた。
エマージェンステスト
エマージェンステストは、オープンフィールドテストと類似して、同様の原理を利用しており、テストは、小さな隠れ箱を追加したオープンアリーナで実施された。隠れ箱から動物が「出てくる」ときに、テストは探索行動、不安および活動レベルを評価する。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであった。隠れ箱は13×13 cmの大きさで高さ8.5 cmであり、隠れ箱の開口部はアーチ型で4×4 cmの大きさで、動物が実験中に隠れ箱の上に飛び乗らないように、透明なアクリル板が隠れ箱の上部に取り付けられた。隠れ箱はアリーナの一辺の中央に沿って置かれ、入り口はアリーナの中央に向かって面していた。アリーナおよび隠れ箱は、隠れ箱の上の透明アクリル板を除いて、赤いアクリル樹脂製であった。
明暗選択テスト
明暗選択テストは、齧歯類が明るい光および新奇な環境をややストレスが多いと感じているという観察を利用した。このテストはオープンフィールドテストと同じアリーナを使用したが、そのアリーナを暗い区画と明るい区画に分けた。暗い区画は、開口部のある大きな箱を、通路を作るように縁に沿って追加することにより作製された。アリーナは44 cm×44 cmの大きさで、壁の高さは26 cmであった。暗区画の箱は、22 cm×43.5 cmの大きさで高さは26 cmであり、区画箱の開口部はアーチ型で4×4 cmの大きさであった。アリーナおよび暗区画箱はいずれも赤いアクリル樹脂製であった。
高架式十字迷路
高架式十字迷路は、不安関連行動のためのテストであり、危険評価行動も検出することができる。それは、齧歯類が開けた空間を避けて閉ざされた空間にとどまる傾向があるという観察に基づいており、その理由はおそらく、より安全な環境と感じるからであろう。高架式十字迷路は、中央の台に連結された等間隔の4本の長いプラットフォームもしくはアームから構成され、それらは十字の形を形成した。アームは、オープンな、取り囲む壁のない状態と、閉ざされた、壁がアームを取り囲んでいる状態が交互になっている。アームは23 cmの高さに引き上げられ、長さ28 cm、幅6 cmであって、閉ざされたアームの壁は、高さ20 cmであった。高架式十字迷路は、赤色がかったアクリル樹脂、およびアームの上に置かれた白い十字型の取り外し可能な木製のプラットフォームで構成された。
ロータロッドテスト
ロータロッドは、運動の協調性および平衡能を評価するために広く使用されているテストである。一定のスピードで、または速度を上げながら、回転するロッドの上にマウスを載せ、ロッドから落ちる待ち時間を、運動の協調性および平衡能の指標として用いた。TSPOノックアウトマウスは、約5ヶ月齢の時に、European Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screensガイドラインにしたがって、IITCシリーズ8 Rotarod (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA)の上でテストした。手短に述べると、動物を実験室に運び、テストする前に15分間馴化させた。ロータロッドテストは、訓練セッションおよび実験セッションからなる。訓練セッションは、10分間の休憩間隔をおいた3回のトライアルからなり、実験セッションは15分間の休憩間隔をおいた4回のトライアルからなる。訓練および実験セッションの間には30分の休憩間隔をおいた。ロッドの回転方向は、動物が実験者に背を向けるように設定した。ロータロッドは各段階の開始時に、70%エタノールで清掃して乾燥させた。
結果
不安障害の行動評価の結果を図10から14に示す。野生型とTSPOホモノックアウトの間で明確な相違は報告されず、観察もされなかった。一般的健康状態、繁殖、離乳、成長、活動性の観察結果、遺伝子型の遺伝的分布、および雌雄比の分布は、野生型の対応するものと同じであった。さらに、正向、角膜、耳介、洞毛、リーチング、および背地走性反射の検査を含む神経学的検査では、TSPOノックアウトマウスにおいて、明白な欠点は見られなかった。それに加えて、聴力および視力は外見上正常である。一般的活動性レベル、毛づくろい、毛の状態、社会的活動、および食物/水の消費などの基本的な行動に関する詳細な検査は、すべて、TSPOノックアウトマウスにおいて正常であった。
下記の例に記載の実施例8から13に関連して、例示された実験に適切な材料および方法を記載する具体的なセクションがここに与えられる。しかしながら、当業者には当然のことであるが、対応するデータを得るために、他の同等な方法を行うことができる。
(実施例8〜13)
材料および方法
TSPO-/-マウスの作製
TSPOノックアウトマウスは、エクソン2および3に隣接するloxP部位、およびエクソン3と4の間に挿入されたネオマイシンカセットを含有するターゲティング構築物を用いて作製した。ターゲティング構築物は、C57BL/6 Bruce4胚性幹(ES)細胞にエレクトロポレーションで導入され、相同組換えにより正しく標的化された細胞をアルビノC57BL/6胚盤胞に注入した。雄キメラを雌アルビノC57BL/6マウスと交配し、その結果得られた毛色の黒い子孫を、標的化されたTSPOアレルの存在で選別した。
溶解物(20μgタンパク質)をLaemmliサンプルバッファー(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)と混合し、10分間70℃に加熱して、4-20% Mini-PROTEAN TGXゲル(Bio-Rad)上で分離した。タンパク質は、Trans-Blot Turboトランスファーシステム(Bio-Rad)を用いてニトロセルロース膜に転写した。膜を、1:10000に希釈した抗TSPO抗体(#109497, Abcam, Cambridge, UK)または1:1000に希釈した抗GAPDH(#37168, Abcam)、および1:10000に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体(#A0545, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)とともにインキュベートした。Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Scoresby, VIC, Australia)を使用し、膜はImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia)を用いて可視化した。
組織サンプルはTRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中でホモジナイズし、メーカーの使用説明書にしたがってPureLink RNAミニキット(Life Technologies)をオンカラムDNase処理とともに使用してトータルRNAを単離した。SuperScript III First-Strand Synthesisキット(Life Technologies)を用いて、精製RNA(1μg)をcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCRのために、cDNAを、SsoFastEvaGreen Supermix (Bio-Rad) 2.5μlおよび各プライマーペア0.5μMに添加し最終反応容量5μlとした。以下のプライマーを使用した:Actb(フォワード5’-GGACCTGACGGACTACCTCATG、リバース5’-TCTTTGATGTCACGCACGATTT)32;P450Scc(フォワード5’-ACATGGCCAAGATGGTACAGTTG、リバース5’-ACGAAGCACCAGGTCATTCAC)33;Gapdh(フォワード5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG、リバース5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC)34;StAR(フォワード5’-TCTCTAGTGTCTCCCACTGCATAGC、リバース5’-TTAGCATCCCCTGTTCGTAGCT)33;TSPO(フォワード5’-GGGAGCCTACTTTGTGCGTGG、リバース5’-CAGGTAAGGATACAGCAAGCGGG)35;TSPO2(フォワード5’-CCAGTCGGTGTGAGGATGAG、リバース5’-AGTAGAGACCAAGGGGCAGT)。反応は、CFX 384リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)で、98℃ 30秒;続いて98℃ 5秒および63℃(TSPO2アッセイについては61℃)10秒を45サイクルのサイクリングによって行った。融解曲線分析を行って、各反応の特異性を確認した。各サンプルは2連で実行した。TSPO2プライマーはPrimer-BLASTを用いてデザインされ、特異性はDNA配列決定により確認された。
マウスは標準的な食餌(Rat and Mouse Premium Breeder diet, Gordon’s Specialty Stockfeeds)で維持され、週1回体重を記録した。肥満を引き起こすために、マウスは14週齢で、Specialty Feedsから購入された、高脂肪食(HFD)(SF03-002、エネルギーの59%が脂肪から)またはコントロール食(AIN93M、エネルギーの9%が脂肪から)を与えられた。体重を毎週記録する一方、食物および水の摂取量は毎日測定した。コントロールまたはHFDを食べて9週間後、マウスはブドウ糖負荷試験を受けた。6時間の絶食後、尾静脈から採取した血液を、AlphaTRAK 2グルコース測定器(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)を用いて測定した。マウスは、2 g/kg体重の腹腔内ブドウ糖注射を受け、その後15、30、60、および120分の時点で血糖を測定した。
安楽死させたマウスから採取した血液を氷上のヘパリンチューブに入れ、血漿を除去し、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した後、それを元の容量となるようにPBS中に懸濁した。サンプルを均等に二分割し(各300μl)、一方には1 mM 5-ALA、もう一方には滅菌水を入れて、振盪培養器内で37℃にて4時間インキュベートした。酢酸エチル/酢酸(4:1)を各サンプルに添加し、そこで混合して遠心した後、上清(1 ml)を、1.5 M HCl 1 mlの入った新しいチューブに移した。サンプルを混合して遠心した後、下層のHCl相の一定分量を、蛍光光度計で測定した(励起波長は407 nm、スリット幅は10 nm、発光スペクトルは450から800まで1 nmきざみで)。ガラスチューブおよびコンテナが終始使用され、サンプルは光から保護された。
顔面神経軸索切断(Banati, R. B., Myers, R. & Kreutzberg, G. W. PK ('peripheral benzodiazepine')-binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microautoradiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J Neurocytol 26, 77-82 (1997); Moran, L. B. & Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain Res Brain Res Rev 44, 154-178, doi:10.1016/j.brainresrev.2003.11.004 (2004))を、イソフルランで麻酔したTSPO+/+およびTSPO-/-マウスに実施した。耳の背側で0.5 cm外側の皮膚に小さな切開(0.5-0.7 cm)をして、手術用顕微鏡下で顔面神経を横に切断した。切開部は3M(商標名)Vetbond(商標名)Tissue Adhesive (St. Paul, MN, USA)で閉じた。手術の成功は、同側のひげの動きの消失によって確認した。マウスを注意深くモニターし、手術から3日後にCO2により安楽死させた。脳を切開してOCT内に置き、液体窒素に移し、凍結切片を作製するまで-80℃で保存した。
5% (v/v)イソフルランで麻酔され1-2%に維持されたマウスを、既述の方法(Disselhorst, J. A. et al. Image-quality assessment for several positron emitters using the NEMA NU 4-2008 standards in the Siemens Inveon small-animal PET scanner. J Nucl Med 51, 610-617, doi:10.2967/jnumed.109.068858 (2010); Mattner, F. et al. Central nervous system expression and PET imaging of the translocator protein in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. J Nucl Med 54, 291-298, doi:10.2967/jnumed.112.108894 (2013))にしたがって、小動物用Inveon PET/CTスキャナー(Siemens, Knoxville, TN, USA)を用いてスキャンした。体温はフィードバック制御された加温パッドで維持し、呼吸をモニターした(BioVet; m2m Imaging Corp, Cleveland, OH, USA)。スキャンは、[18F]PBR111 (8-18 MBq/100μL、0.2nM)の尾静脈注射から開始した。40分のイメージング後、臓器における非特異的蓄積を測定するためにPBR111(1 mg/kg、2%酢酸-生理食塩水中)を注射して、10分間イメージングした。その後、マウスは、解剖学的情報のために10分間のCTスキャンを受けた。すべてのPETデータは、OSEM3D-MAPアルゴリズムにより、放射能濃度(kBq/ml)の発生PET量に対して補正、標準化、および再構成された。
TSPO+/+、TSPO+/-およびTSPO-/-マウスから得られた組織切片を、室温にて20分間、1 nM [3H]PK11195(比放射能84 Ci/mmol; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)含有170 mM Tris-HCl pH 7.4中でインキュベートし、170 mM Tris-HCl中で5分間、2回洗浄し、氷冷MilliQ H2Oに3回浸漬してすすいで乾燥した。追加の切片は、氷上で1時間、3 nM [125I]CLINDE(比放射能100 Ci/mmol;ANSTO Life Sciencesにより合成された)含有50 mM Tris-HCl pH 7.4中でインキュベートし、氷冷50 mM Tris-HCl中で2分間2回、氷冷MilliQ H2O中1分間洗浄し、乾燥した。PK11195(10μM)、CLINDE(10μM)およびPBR-111(10μM)の存在下で置換結合を行った。片面乳剤フィルムを切片および標準品(14Cもしくは 3H)に、3時間([125I]CLINDE)または10週間([3H]PK11195)暴露した。
既述のように免疫組織化学検査を行った((Banati, R. B. et al. The peripheral benzodiazepine binding site in the brain in multiple sclerosis: quantitative in vivo imaging of microglia as a measure of disease activity. Brain 123 ( Pt 11), 2321-2337 (2000); Graeber, M. B., Streit, W. J. & Kreutzberg, G. W. Axotomy of the Rat Facial-Nerve Leads to Increased Cr3 Complement Receptor Expression by Activated Microglial Cells. J Neurosci Res 21, 18-24, doi:DOI 10.1002/jnr.490210104 (1988) ; Liu, G. J., Nagarajah, R., Banati, R. B. & Bennett, M. R. Glutamate induces directed chemotaxis of microglia. European Journal of Neuroscience 29, 1108-1118, doi:10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x (2009))。組織切片(オートラジオグラフィーに使用した)を3.7%ホルムアルデヒドのPBS溶液で5分間固定した後、氷冷アセトンで透過化処理した。非特異的結合を10%ウマ血清および2% BSAのPBS溶液によりブロックした。切片を、TSPOモノクローナル抗体(Abcam #109497)とともに4℃にて一晩、さらにHRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(Sigma #A0545)とともにRTにて1時間インキュベートした。HRPの活性は、ペルオキシダーゼ 3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩 液体基質システム(Sigma-Aldrich)で検出した。切片をエタノールで脱水して、キシレンと共にインキュベートし、スライドグラスはD.P.X.封入剤の中でカバーグラスによりマウントした。切片は、Olympus BX51倒立顕微鏡(オリンパス、東京、日本)下で可視化され、Q-イメージングカメラおよびImagePro 5.1プログラムにより記録された。
既述の方法にしたがって(Liu, G. J., Nagarajah, R., Banati, R. B. & Bennett, M. R. Glutamate induces directed chemotaxis of microglia. Eur J Neurosci 29, 1108-1118, doi:EJN6659 [pii]10.1111/j.1460-9568.2009.06659.x (2009))、0〜2日齢TSPO+/+およびTSPO-/- マウスからミクログリアを培養した。手短に述べると、全脳を切除して、小片に切り分け、0.025%トリプシン(Sigma-Aldrich)で処理した。それを、10%ウシ胎仔血清(FBS; Life Technologies)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(Sigma-Aldrich)および0.5 ng/ml GM-CSF(Abcam)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM/F12; Sigma-Aldrich)で培養した。
Seahorse XF 96 Analyzerを用いて、初代ミクログリア培養物の酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)を測定した。OCSはミトコンドリア呼吸の指標であり、ECARは主として解糖の結果である(Brand, M. D. & Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical journal 435, 297-312, doi:10.1042/BJ20110162 (2011); Yadava, N. & Nicholls, D. G. Spare respiratory capacity rather than oxidative stress regulates glutamate excitotoxicity after partial respiratory inhibition of mitochondrial complex I with rotenone. J Neurosci 27, 7310-7317, doi:10.1523/JNEUROSCI.0212-07.2007 (2007))。実験の前日、Seahorse XF Calibrant(pH 7.4)200μlを、XF 96ウェルユーティリティプレートの各ウェルに添加した。センサーカートリッジをプレートの上に置き、non-CO2インキュベーター内で37℃にて16時間水和させた。37℃での細胞の基礎測定のためのプロトコール(スタート、プローブのキャリブレート、平衡化、2分混合、1分猶予、3分測定)を2回繰り返した。次にミトコンドリアのストレス化合物(オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA)をインジェクトし、続いて2分混合、1分猶予、3分測定した(3回繰り返した)。
臓器をホモジナイズし、氷冷50 mM Tris-HCl (pH 7.4)に入れて48000 x gで遠心することにより2回洗浄し、50容の氷冷50 mM Tris-HClに再懸濁して、タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)により測定した。BmaxおよびKdは、膜タンパク質(60μl)を氷上で[3H]PK11195 (0.56 nM- 20 nM)とともに90分間インキュベートしてから、0.5%ポリエチレンイミン溶液中にあらかじめ浸しておいたWhatman GF/Cフィルター(GE Healthcare Life Science, Australia)で急速濾過することにより、飽和結合を用いて決定された。非特異的結合は、5μMPK11195を用いて測定された。フィルターを12時間シンチレーションカクテル(Perkin Elmer)の中に入れ、放射能を、Tri-Carb 2100TR液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)を用いて測定した。BmaxおよびKd値は、GraphPad Prism 5.04 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いた非線形回帰によって、全結合および非特異的結合をあてはめることにより得られた。
P450Scc代謝は、Tuckey (Tuckey, R. C., Woods, S. T. & Tajbakhsh, M. Electron transfer to cytochrome P-450scc limits cholesterol-side-chain-cleavage activity in the human placenta. European journal of biochemistry / FEBS 244, 835-839 (1997)) およびSlominski (Slominski, A. T. et al. Cytochrome P450scc-dependent metabolism of 7-dehydrocholesterol in placenta and epidermal keratinocytes. The international journal of biochemistry & cell biology 44, 2003-2018, doi:10.1016/j.biocel.2012.07.027 (2012))にしたがって、マウス精巣で測定された。手短に述べると、250 mMスクロース、50 mM Tris (pH7.4)中で遠心することによって、濃縮されたミトコンドリア画分を調製し、コレステロールからプレグネノロンへの酵素的変換を、次の条件下で最大2時間の時点まで実施した:50 mM HEPES pH7.4、250 mMスクロース、20 mM KCl、5 mM MgSO4、0.2 mM EDTA、1 mg/ml BSA、8μMトリロスタン(Trilostane)、0.05μCi3H-コレステロール、500 mMイソクエン酸、5 mM NaNADP。反応は、4℃のジクロロメタン添加によって終了させた。有機相はためておき、水相はジクロロメタン中に、あと2回再抽出した。抽出物を合わせて、窒素下で乾燥し、100μlの酢酸エチルに溶解した。プレグネノロンおよびコレステロールは、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸(15:15:1)の移動相を用いて、薄層クロマトグラフィーで分離され、各スポットの放射能量は、液体シンチレーション計数により定量化した。
雄および雌TSPO+/-およびTSPO+/+マウスの血清プレグネノロンは、メーカーの使用説明書(Abnova Cooperation, Taiwan)にしたがって実施される酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定された。手短に述べると、血液を採取し、放置して血餅を凝集させて、血清を収集した。スタンダード、コントロールおよびサンプルは2連として、密封されたプレート内で、コンジュゲートおよび抗体とともに、または、それらなしで、室温にて1時間、200 rpmのプレートシェーカー(KS4000ic, IKA, Selangor, Malaysia)上でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを空にして5回洗浄し、糸くずの出ないペーパータオル上でプレートを軽くたたいて、残りのバッファーを除去した。ウェルをHRPコンジュゲートとともに、200rpmのプレートシェーカー上で室温にて30分間インキュベートし、5回洗浄して、TMB基質とともに室温で10分間インキュベートした。停止液を各ウェルに添加し、20分後に450 nmの光学濃度を測定した。データを血液量に対して標準化し、4パラメーターロジスティック曲線フィッティングプログラムMasterPlex ReaderFit:Curve-Fitting Software for ELISA Analysis (Hitachi Solution America, San Francisco, CA, USA)を用いて解析した。
行動実験に使用した30匹のマウス(10 TSPO+/+、10 TSPO+/-、10 TSPO-/-、5月齢、雄/雌均等分布)は、CO2で安楽死させた。下大静脈を切断することによって肺腔から血液を採取し、ヘパリン(血液学およびリンパ球分析)またはゲル血餅アクチベーター(生化学分析)とともにマイクロチューブに入れた。脾臓を採取して氷冷滅菌PBS10 mlに入れた。血液(室温)および脾臓(氷上)は、フローサイトメトリー分析および生化学分析のために(採取から3-7時間以内に)Australian Phenomics Facilityに送られた。
***は、TSPO+/+およびTSPO-/-マウスの精巣上体尾部から、それぞれの尾部を外科用メスで切断することによって放出され、あらかじめ加温されたBiggers-Whitten-Whittingham (BWW)培地150μl中で37℃にて5分間インキュベートした。インキュベーション後、追加のBWW培地250μlを添加し、組織を除去して、コンピューター支援***解析(CASA)システム(Hamilton Thorne, Beverly, MA, USA)を用いて***を評価した。評価されるパラメーターは、全体的運動性、前進運動性、進行方向性速度平均(VAP)、直線地点移動平均(VSL)および曲線地点移動平均(VCL)とした。
行動テストは、3-4月齢のマウスで実施し、実験中のハンドリングストレスの影響を減らすために、頻繁にハンドリングした。不安関連行動は下記によって調べた:オープンフィールドテスト、エマージェンステスト、明暗選択テスト、および高架式十字迷路。それぞれのテストでは、マウスは15分間装置内を自由に探索させた。各区画に入っている時間および回数、総移動距離、活動時間、および排糞数を評価した。高架式十字迷路では、危険評価は、動物の頭がオープンアームの方向に向き、体の15%より多くがオープンアームの中にあるが、重心は壁のあるアームまたは中央のプラットフォームの中に維持している場合として定義された。動物の遺伝子型は、実験中、実験者に伏せられている。訓練履歴の影響を減らすために、テストは、少なくとも7日の間隔を置いて行った(Paylor, R. & Lindsay, E. Mouse models of 22q11 deletion syndrome. Biol Psychiatry 59, 1172-1179, doi:10.1016/j.biopsych.2006.01.018 (2006))。すべての実験は、オーバーヘッドカメラでDVDに記録し、その後Motman Tracker 4.5ソフトウェア(Motion Mensura, Cooks Hill, NSW, Australia)を用いて解析した。
提示された結果は、少なくとも3つのウェルおよびバッチのミクログリア培養物から得られたものであるが、この(n)は、ミトコンドリア呼吸のためにサンプリングされたウェルの数を表す。他の実験では、一群あたり少なくとも3匹の動物を使用した。データは、SDが与えられるPET定量およびコレステロール輸送データを除いて、平均±SEMとして示される。群間の比較は、Bonferroniの事後検定による分散の単変量解析によって行った。P値 £ 0.05が、統計的に有意であるとみなされた。
結果
TSPO遺伝子のエクソン2および3を除去した結果、生存可能なTSPO+/- およびTSPO-/- 動物が得られた。TSPOの破壊は、サザンブロット、PCR、RT-qPCR、ウェスタンブロット、(図15〜18)、特異的抗体染色(図19、20、および21a〜21g)、TSPOリガンド[18F]PBR111を用いたin vivoトレーサー動態PET/CT 研究(図21hおよびi;図24)、受容体-オートラジオグラフィー、ならびに[3H]PK11195および[125I]CLINDEを用いた膜受容体結合(それぞれ図21aおよび21b)によって確認された。
結果
600匹以上の動物の観察は、ヘテロ型TSPO+/-またはホモ型TSPO-/-動物のいずれにおいても、通常の摂餌および居住条件下で、明白な臨床上の障害も、付随的な病変の増加も示さず、これらの動物はいずれも、性比、成長速度、および経時的な体重増加がコロニーコントロールの野生型TSPO+/+動物と同じであった(図25)。同様に、妊孕性もしくは生存期間に減少の兆候はなく、最高齢動物はこれまでのところ病気もなく20ヶ月を越えた。***の生存率および機能の検査は、TSPO+/+ (平均運動性:82.7±9.33%;平均前進性:47.7±10.2%;平均速度VAP:98.6±13.0μm/s、VSL: 65.7±8.90μm/s、およびVCL:179±20.2μm/s)、およびTSPO-/- 動物(平均運動性:86.1±5.74%;平均前進性:49.6±5.32%;平均速度VAP:105±6.54μm/s、VSL:67.5±5.08μm/s、およびVCL:197±11.2μm/s)由来の***の間で相違をもたらさなかった。標準的なオープンフィールド、emergence、明暗選択、および高架式十字迷路テストは、すべての遺伝子型で類似した行動を示した(表3)。
結果
雄および雌のTSPO-/-マウスのいずれにおいても、すべての血清プレグネノロン濃度は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)で測定され、コロニーコントロール野生型(TSPO+/+: 雄、131±46.5 ng/ml; 雌、150±36.5 ng/ml)および(TSPO-/-: 雄、145±44.8 ng/ml; 雌、141±26.8 ng/ml)に見られる正常範囲内であった(図22a)。
結果
同様に、定量的RT-qPCRは、StAR、P450Scc、およびTSPO2の遺伝子発現プロファイルが、TSPOを発現すると判明している主な臓器のすべてにわたって、遺伝子型を越えて類似していることを示したが、これは、TSPOのグローバルな欠損が、ステロイド合成の制御因子としてTSPOともっとも密接に関連していると考えられるそれらの遺伝子の、代償的な転写制御を引き起こさなかったことを示唆した(図22b)。
結果
セルソーティングを含めた血液の分析から、雌雄ともに血液表現型はそのまま、TSPO遺伝子のヘテロ型もしくはホモ型欠損による影響をほとんど受けず、唯一の例外は、雌TSPO+/+と比べて雌TSPO-/-マウスでのナチュラルキラー(NK)細胞の統計上有意な増加傾向であることが示された(表4)。したがって、TSPO-/-マウスは、ゼブラフィッシュTSPO遺伝子サイレンシング実験で観察された血液細胞成分の変化を示さなかった。
結果
標準的な食餌では、TSPO+/+ およびTSPO-/-動物の間に体重増加の差異はなかったが、高脂肪食では、TSPO-/-動物は、同じ食餌および水の摂取にもかかわらずTSPO+/+動物とは異なり、相対的な体重増加が有意に減少した(図22d〜22fおよび表5)。高脂肪食に起因する耐糖能の有意な変化は、TSPO-/-動物では観察されなかったが、TSPO+/+動物は、予想される耐糖能異常傾向を示した(図22g)。
1) 基礎ミトコンドリア酸素消費速度(OCR)が有意に低い(図23b);
2) オリゴマイシンで複合体Vを阻害した後、ATP生産が低下する(図23d);
3) 脱共役、すなわちFCCPによるプロトン勾配の低下の後、最大呼吸(予備能力)が有意に低下する(図23f);ならびに
4) ロテノンおよびアンチマイシンAの組み合わせによる複合体IおよびIIIの阻害下でのOCR(図23h)から、オリゴマイシンで阻害されたOCR(図23dに示す)を差し引くことにより計算される、プロトンリーク(図23j)が有意に増加する
ことが判明した。
考察
TSPOのオルソログは、真正細菌、古細菌、および真核生物に広く見いだされる(Gavish, M. et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol Rev 51, 629-650 (1999); Papadopoulos, V. et al. Translocator protein (18kDa): new nomenclature for the peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and molecular function. Trends Pharmacol Sci 27, 402-409, doi:S0165-6147(06)00153-2 [pii] 10.1016/j.tips.2006.06.005 (2006))。ほとんどのTSPOタンパク質ファミリーメンバーは、イソキノリンカルボキサミドPK11195に特異的な結合部位を含有しており、このPK11195は、TSPOを薬理学的に明示し、GABAA受容体タンパク質複合体などの他のベンゾジアゼピン結合受容体から区別するためにこれまで使用されてきた(Gavish, M. et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol Rev 51, 629-650 (1999); Le Fur, G. et al. Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of PK 11195, 1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-methylpropyl)-3 isoquinolinecarboxamide. II. In vivo studies. Life Sci 32, 1849-1856 (1983))。進化的に若いC末端コレステロール認識アミノ酸コンセンサス(CRAC)ドメインは、主に動物門に見られる。TSPOのパラログ、TSPO2は、遺伝子重複の結果として鳥類および哺乳類に存在するものであって、これはCRACドメインを保持しているがイソキノリン結合部位を失っている(Fan, J., Rone, M. B. & Papadopoulos, V. Translocator protein 2 is involved in cholesterol redistribution during erythropoiesis. J Biol Chem 284, 30484-30497, doi:10.1074/jbc.M109.029876 (2009))。
Claims (50)
- 非機能性内在性TSPO遺伝子の少なくとも一つのコピーを有する細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記細胞が機能性TSPO遺伝子を含まない請求項1に記載の動物。
- 前記非機能性TSPO遺伝子が、欠失、挿入、フレームシフト突然変異、転位または置換からなる群から選択される少なくとも一つの突然変異を含む請求項1または2に記載の動物。
- 前記突然変異が構成的である請求項1から3のいずれか1項に記載の動物。
- 前記突然変異が条件的である請求項1から3のいずれか1項に記載の動物。
- 前記変異が、前記TSPO遺伝子内のエキソン1、2、3および/または4の全てもしくは一部の欠失を含む請求項3または4に記載の動物。
- 前記突然変異が、前記TSPO遺伝子内のエキソン2および/または3の全てもしくは一部の欠失を含む請求項3から5のいずれか1項に記載の動物。
- 前記動物がショウジョウバエ、ヒル、マウスまたはコイからなる群から選択される科からのものである前記請求項のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記動物がマウスである請求項8に記載の動物。
- 請求項1から9のいずれかに記載の動物の後代。
- 請求項9のマウスをpKZ1マウス、Brca2ホモ接合マウス、Tg(CAT)(+/+)マウス、A−T変異ヘテロ接合/ホモ接合マウス、Csbm/mマウス、インシュリン様成長因子1ヘテロ接合およびホモ接合マウス、P53ヘテロ接合およびホモ接合マウス、放射線感受性および抵抗性トランスジェニックマウス、統合失調症DISC1ノックアウトマウス、統合失調症ニューレグリン1ノックアウトマウス、遺伝子工学モデル腫瘍マウス、神経炎症モデルマウス、アルツハイマー病モデルマウス、パーキンソン病モデルマウスまたはインシュリン抵抗性および食餌誘発肥満に対して感受性である2型脱ヨウ素酵素遺伝子(D2KO)の標的欠失を有するマウスと異種交配することで発生する後代。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を請求項1から9のいずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代に投与すること、および前記非ヒト動物の表現型に対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、候補化合物を請求項1から9のいずれか1項に記載の非ヒト動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代に投与すること、およびTSPO関連遺伝子産物または非ヒト動物に存在し得るTSPO遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニング方法であって、請求項1から9のいずれか1項に記載の被験非ヒト動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代、および同じ種の野生型非ヒト動物に候補化合物を投与すること、およびTSPO関連遺伝子産物または野生型非ヒト動物に存在し得るTSPO遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、TSPO関連遺伝子産物または被験非ヒト動物に存在し得るTSPO遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の確認に使用される場合の、請求項1から9のいずれか1項に記載の動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性のスクリーニングに使用される場合の、請求項1から9のいずれか1項に記載の動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の診断に使用される場合の、請求項1から9のいずれか1項に記載の動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の動物または請求項10もしくは請求項11に記載の後代由来の細胞、組織または不死化細胞系。
- 生体サンプルにおけるTSPO遺伝子産物を検出するための陰性対照としての請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
- TSPO関連疾患もしくは障害を有するかそれを有すると推定される対象者からの生体サンプル中のTSPO遺伝子産物を検出するための陰性対照としての請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の診断のための請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系の使用。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物を確認するのに使用される場合の、請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性 をスクリーニングするのに使用される場合の、請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害 の診断に使用される場合の、請求項8に記載の細胞、組織または不死化細胞系。
- TSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、および前記細胞、組織または不死化細胞系の表現型に対する前記候補薬剤の効果を評価することを含む方法。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される化合物の同定方法であって、請求項18に記載の細胞、組織または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびTSPO関連遺伝子産物または前記細胞、組織または不死化細胞系に存在し得るTSPO遺伝子産物の発現レベルに対する当該候補化合物の効果を評価することを含む方法。
- 対象者におけるTSPO関連疾患もしくは障害の治療で使用される候補化合物の結合の特異性もしくは選択性をスクリーニングする方法であって、野生型細胞、野生型組織または野生型不死化細胞系、および請求項18に記載の細胞または不死化細胞系を候補化合物に曝露すること、およびTSPO関連遺伝子産物または野生型細胞、野生型組織もしくは野生型不死化細胞系に存在し得るTSPO遺伝子産物に対する当該候補化合物の結合の特異性もしくは選択性を、TSPO関連遺伝子産物または請求項18に記載の細胞、組織もしくは不死化細胞系に存在し得るTSPO遺伝子産物に対する候補化合物の結合の特異性もしくは選択性と比較することを含む方法。
- 前記TSPO関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項 12から14または25から27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TSPO関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項15から17のいずれか1項に記載の動物または後代。
- 前記TSPO関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項20または請求項21に記載の使用。
- 前記TSPO関連疾患もしくは障害が、癌、神経炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳損傷、虚血−再潅流損傷、急性および慢性ストレスなどの行動障害または神経もしくは精神障害、不安障害、気分障害、ならびに統合失調症、末梢神経障害、多発性硬化症、神経因性疼痛、肥満、糖尿病および悪液質からなる群から選択される請求項22から24のいずれか1項に記載の細胞、組織もしくは不死化細胞系。
- 請求項12、13、25、26または28のいずれか1項に記載の方法によって確認される場合の化合物。
- TSPO機能を阻害するための下記一般式(I)の化合物の使用。
Xは、非存在、ヨウ素もしくはそれの同位体であり;
Yは、F、Cl、Br、I、OH、SH、NH2、CNおよびCOOHから選択され;
Zは、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないかハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素または(C1−C4)アルキル、(C2−C4)アルケニル、(C2−C4)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリール(C1−C4)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C4)アルキル、複素環、(C1−C4)アルコキシカルボニルおよび(C2−C5)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C1−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良い(C2−C7)アルキリデンであり;
mおよびnは独立に、0、1または2であり;
pは1であり;
各場合で、
(i)アルケニルは、エチレン性モノもしくはジ不飽和のアルキルまたはエチレン性モノもしくはジ不飽和のシクロアルキルの意味を有し;
(ii)シクロアルキルは、環状アルキル、またはアルキル置換された環状アルキルの意味を有し;
(iii)ヘテロアリールは、芳香族複素環系の単一、多核、共役および縮合残基の意味を有する。] - 前記使用が、肥満に対する保護を提供する請求項33から39のいずれか1項に記載の使用。
- 前記使用が、高脂肪食餌誘発体重増に対する保護を提供する請求項33から39のいずれか1項に記載の使用。
- 本発明の一部の実施形態において、nが0である請求項33から38または請求項41のいずれか1項に記載の使用。
- Yが、F、Cl、Br、I、CNおよびOHから選択され;Zが、N(R3)C(O)R4およびC(O)NR3R4から選択され;
R1およびR2が独立に、(C1−C3)アルキル、(C1−C3)アルコキシ、(C2−C3)アルケニル、(C5−C6)シクロアルキル、フェニル、ナフチル、フェノキシ、ナフチルオキシ、ベンジル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、ジオキサニル、(C2−C4)アルカノイルおよび(C2−C4)アシルから選択され、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、OH、(C2−C4)アルコキシ、NH2、(C1−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く;
R3およびR4がそれぞれ独立に、水素または(C1−C3)アルキル、(C2−C3)アルケニル、(C5−C6)シクロアルキル、フェニル、ナフチル、ベンジルおよび(C2−C4)アシルから選択される基であり、それらはそれぞれ置換されていないか、ハロゲン、OH、(C1−C3)アルコキシ、NH2、(C−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良く、
またはR3およびR4が一体となって、ハロゲン、OH、(C1−C3)アルコキシ、NH2、(C1−C3)アルキルアミノ、ジ((C1−C3)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C3)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソおよびアミドからなる群から選択される置換基で置換されていても良い(C2−C3)アルキリデンであり;
mおよびnが独立に、0または1である、請求項33から38または請求項41のいずれか1項に記載の使用。 - Xが125Iであり;
YがClであり;
R3およびR4がCH2CH3である請求項44に記載の使用。 - 前記化合物が[125I]CLINDEである請求項45に記載の使用。
- 前記式(I)の化合物が、下記式(IB)の誘導体である請求項33から38または請求項41のいずれか1項に記載の使用。
Yはハロゲンであり;
R1は独立に、(C1−C6)アルキル、(C1−C6)アルコキシ、(C2−C6)アルケニル、(C2−C6)アルキニル、(C3−C6)シクロアルキル、(C6−C12)アリール、(C6−C12)アリールオキシ、(C6−C12)アリール(C1−C6)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−C6)アルキル、複素環、(C2−C6)アルカノイルおよび(C2−C7)アシルから選択され、それらはそれぞれ、置換されていないか、ハロゲンもしくはそれの同位体、OH、(C1−C4)アルコキシ、SH、NH2、(C1−C4)アルキルアミノ、ジ((C1−C4)アルキル)アミノ、カルボキシ、(C1−C4)アルコキシカルボニル、(C2−C4)アルカノイル、オキソ、アミド、CN、CNS、SCN、CNO、OCNおよびNHOHからなる群から選択される1から3個の置換基で置換されていても良く;
R3およびR4は独立に、水素、(C1−C4)アルキルおよび(C2−C4)アルケニルから選択され、またはR3およびR4が一体となって、(C2−C3)アルキリジンである。] - YがClであり;
R1がOCH2CH2 18Fであり;
R3およびR4がCH2CH3である請求項47に記載の使用。 - 前記化合物が[18F]PBR111である請求項48に記載の使用。
- 前記突然変異が、前記TSPO遺伝子内のエキソン2および3の欠失である請求項3から6のいずれか1項に記載の動物。
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