KR20220021906A - 유전자 요법 모니터링 - Google Patents

Abstract

요약서
본 명세서는 무엇보다도 유전자 요법을 개선하기 위한 기술을 제공한다. 다른 것들중에, 본 명세서는 유전자 요법 처치의 하나 또는 그 이상의 특징들 이를 테면, 예를 들면, 페이로드 발현 범위, 수준 및/또는 지속성을 모니터링하고 및/또는 평가하는 기술을 제공한다. 일부 구체예들에서, 제공된 기술은 통합 유전자 요법에 특히 유용하다.

Description

유전자 요법 모니터링

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 4월 15일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 번호 62/833,875에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

서열 목록

본 출원은 "2012538-0082_SL.txt" 제목의 .text 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일은 2020년 4월 10일자로 생성되었으며, 크기는 26,104 바이트이다. 상기 서열 목록의 전체 내용은 여기에 참고자료로 편입된다.

배경

유전된 또는 배아 발달 초기에 획득한 DNA의 변화로 추적할 수 있는 인간 질환의 하위집단이 있다. 유전적 치료요법("유전자 치료요법"이라고도 함)의 개발자에게 특히 관심을 끄는 것은 단성유전인자(monogenic) 질환으로 알려진 단일 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 질병이다. 6,000가지 이상의 단성유전인자 질환이 있는 것으로 본다. 전형적으로, 유전적 돌연변이에 의해 야기되는 임의의 특정 유전적 질환은 상대적으로 드물지만, 전제적으로 고려하면, 유전적-연관 질환의 수는 많다. 잘-알려진 유전병으로는 낭포성 섬유증, 뒤센형(Duchenne) 근이영양증, 헌팅턴(Huntington) 질환, 및 겸상적혈구 빈혈이 내포된다. 다른 종류의 유전적 질환에는 대사성 장애, 이를 테면, 유기산 혈증과 리소좀 저장 질환이 내포되며, 이때 기능이상 유전자는 대사 과정에 결함을 초래하고, 독성 부산물의 축적이 장기적으로 그리고 단기적으로 모두 초래되어, 심각한 이환율 및 사망율로 이어질 수 있다.

유전자 요법은 치료제 후보 개발 측면에서 많은 관심을 받았지만, 유전자 치료요법의 효과와 궤적을 모니터링하고 평가하는 방법에 대해서는 훨씬 주목을 덜 받아 왔다. 하나 또는 그 이상의 추가 치료와 병용하는 것을 비롯하여, 유전자 요법이 효과적으로 적용되도록 하기 위한 새로운 방법 및 조성물이 필요하다.

요약

본 명세서는 무엇보다도 유전자 요법을 개선하기 위한 기술을 제공한다. 다른 것들중에, 본 명세서는 유전자 요법 처치의 하나 또는 그 이상의 특징들 이를 테면, 예를 들면, 페이로드(payload) 발현 범위, 수준 및/또는 지속성을 모니터링하고 및/또는 평가하는 기술을 제공한다. 일부 구체예들에서, 제공된 기술은 통합 유전자 요법에 특히 유용하다.

무엇보다도, 본 명세서에서는 특정 통합 유전자 요법 기술로 신규한 바이오마커 엔터티를 생성시킬 수 있고, 이들 바이오마커의 발현 및/또는 활성은 해당 유전자 요법에 의해 전달되는 관심대상의 페이로드 (가령, 전이유전자(transgene)에 의해 인코드되고, 및/또는 발현되는 산물의 페이로드)의 발현 및/또는 활성과 매우 관련이 높을 수 있음을 보여준다. 더욱이, 본 명세서에서는 이러한 생성으로 유전자 요법 및/또는 이의 성동, 안정성, 유지가능성, 등을 모니터링하고 및/또는 그렇지 않으면 평가하기 위한 전략을 제공할 수 있음이 교시된다.

무엇보다도, 일부 구체예들에서, 현재 개시된 바이오마커는 유전자 요법을 제공받은 대상체로부터 비-침습적으로 채취한 생물학적 샘플에서 직접적으로 평가할 수 있고, 이러한 바이오마커의 평가로 페이로드 상태에 대한 정보를 얻을 수 있음이 밝혀졌으며, 이런 것이 없다면 페이로드의 상태를 결정하기 위해 더 침습적인 절차가 필요할 것이다. 하나의 예로서, 본 명세서에서는 조직에서 페이로드의 전달 또는 발현을 결정하기 위해 조직 생검을 수행할 필요가 없음이 입증된다. 오히려, 순환계로부터 바이오마커의 분석 (가령, 채혈을 통하여)을 평가함으로써 조직에서 해당 페이로드의 발현 및/또는 활성의 하나 또는 그 이상의 측면을 간접적으로 나타낼 수 있다. 이것은 세포내 위치에 전달된 페이로드의 분석을 단순화하고 용이하게 할 수 있다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 유전자 요법 모니터링하는 방법을 제공하는데, 이 방법에는 통합 유전자 요법 처치를 제공받은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에 해당 유전자 요법 처치의 상태에 대한 하나 또는 그 이상의 특징을 대신하여 나타내는 대체자(surrogate)로써 해당 통합 유전자 요법 처치의 통합에 의해 생성된 바이오마커의 수준 또는 활성을 탐지하는 단계가 내포되며, 이때 해당 유전자 요법 처치의 상태에 대한 하나 또는 그 이상의 특징은 페이로드 수준, 페이로드 활성, 세포 집단에서 유전자 요법 처치 통합 수준, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 페이로드를 운반하는 유전자-통합 조성물을 제공받았던 대상체에서 페이로드 운반, 이의 수준 및/또는 이의 활성을 모니터링하는 방법을 제공하며, 이 방법에는 상기 유전자-통합 조성물의 통합에 의해 생성되고, 해당 페이로드의 운반, 이의 수준 및/또는 활성을 대신 나타내는 대체자로써의 바이오마커를 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에서 검출하는 단계가 내포된다.

일부 구체예들에서, 본 명세서은 통합 유전자 요법 처치를 제공받았던 대상체에서 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징을 결정하는 방법을 제공하며, 해당 방법에는 a) 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계, b) 바이오마커 수준을 결정하는 단계, 이때 상기 바이오마커는 해당 대상체의 게놈에서 유전자 요법의 통합에 의해 생성되며, 그리고 c) 상기 바이오마커의 결정된 수준을 기반으로 하여, 해당 대상체에서 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징을 확립하는 단계가 내포되며, 이때 상기 바이오마커의 결정된 수준은 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징에 상응한다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 유전자 요법 처치를 필요로 하는 대상체에게 이러한 처리를 전달하는 방법을 제공하는데, 이 방법에는 a) 해당 대상체에게 통합 유전자 요법 처치를 투여하는 단계, 그리고 b) 해당 대상체의 게놈에서 유전자 요법 처치 통합에 의해 생성된 바이오마커 수준을 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 결정하는 단계가 내포된다.

일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물은 페이로드를 인코드하는 서열을 포함하는 핵산 요소를 해당 대상체의 게놈의 표적 부위로 통합시킨다. 당업자는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용함에 있어서 임의의 다양한 표적 부위들이 적절할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 표적 부위는 폴리펩티드 (가령, 알부민)를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 요소의 통합은 폴리펩티드를 인코드하는 유전자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 일어난다. 일부 구체예들에서, 표적 부위는 알부민을 인코드한다.

다양한 구체예들에 따르면, 본원에서 기술된 바와 같이, 임의의 적용-적합한 페이로드가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 펩티드/폴리펩티드/단백질, 핵산 (가령, shRNA, miRNA), 및 임의의 이들의 조합이거나, 또는 이들을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 세포내에서 발현된 펩티드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 세포외로 분비된 펩티드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 의학적 병태를 치료하기 위한 생물학적 과정을 촉진하는 세포-내재적 활성 또는 세포 -외인적 활성을 갖는 펩티드다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 간 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 간 세포에서 이소성(ectopically)으로 발현되는 펩티드다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 알파-1-항트립신, 또는 인간 Factor IX이다.

본원에서 기술된 바와 같이, 많은 구체예들에는 하나 또는 그 이상의 생물학적 샘플 (가령, 대상체에서 취한 유체 또는 조직의 샘플)의 사용이 내포된다. 본 명세서에 따르면, 다양한 구체예들에서 임의의 다양한 생물학적 샘플들은 양립가능한 것으로 간주된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 생물학적 샘플은 머리카락, 피부, 대변, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 눈물, 유리체액 또는 점액이거나, 또는 이를 포함한다.

본원에서 기술된 바와 같이, 본원에서 기술된 방법 및 조성물에 적용될 때, 검출 (가령, 신호, 이를 테면, 바이오마커 또는 탐지가능한 모이어티)은 임의의 적용-적합한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 검출 단계는 면역학적 분석 또는 핵산 증폭 분석이거나, 또는 이를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 다양한 구체예들에서 임의의 다양한 바이오마커들의 용도는 양립가능한 것으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 페이로드에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 2A 펩티드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 2A 펩티드는 P2A, T2A, E2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 Furin 절단 모티프이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 탐지가능한 모이어티는 바이오마커에 결합하는 제제 (가령, 항체 또는 이의 단편)이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구체예들에서, 핵산 요소의 통합은 표적 부위에서 인코드된 폴리펩티드의 발현을 유의미하게 방해하지 않는다 (가령, 표적 부위에서의 폴리펩티드의 발현은 통합 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받지 않을 때와 같이 실질적으로 계속된다). 일부 구체예들에서, 외인성으로 공급된 뉴클레아제를 사용없이, 통합이 일어난다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 외인성으로 공급된 뉴클레아제의 사용과 함께 통합이 일어난다.

다양한 구체예들에 따르면, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 유전자 요법 섭생과 양립가능한 것으로 간주된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 대상체는 단일 용량의 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 다수 용량 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다.

추가적으로, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 요법 처치 후 다양한 임의의 시간 (가령, 해당 대상체가 유전자 요법을 받은 후 몇시간, 몇일, 몇주 또는 몇달)에 적용가능한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 시점에서 수행된다. 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 다수의 시점에서 수행된다. 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 적어도 3 개월 기간에 걸쳐 (가령, 여러차례) 수행된다.

놀랍게도, 유전자 요법을 제공받게 되는 생애 다양한 단계에 있는 대상체에게 유익한 점 (가령, 치료요법의 모니터링 및/또는 조정을 용이하게)을 제공할 수 있고, 그리고 일부 구체예들에서, 제공된 방법은 대상체가 삶의 단계들 사이의 전환기에 있을 때 사용될 수도 있음이 밝혀졌다. 일부 구체예들에서, 대상체는 유아 시기에 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 성인이 되기 전 (가령, 어린이 시기), 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 성인일 때 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 요법의 적용을 필요로 하는 것에 추가하여, 각각 잠재적으로 교란 또는 복잡한 요인/병태를 갖는 다양한 대상체에 적용가능한 것으로 특히 고려된다. 또한, 일부 형태의 유전자 요법은 잠재적으로 문제 (가령, 자가면역 반응, 사이토킨 폭풍, 등)가 있는 반응을 일으킬 수 있다고, 알려져 있거나 또는 의심된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들은 해당 유전자 요법에 대한 자가면역 반응에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 제공된 방법들은 해당 유전자 요법에 대해 비정상적인 사이토킨 반응 (가령, 사이토킨 폭풍)에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함한다.

본 명세서는 유전자 요법이 시기마다 조정될 필요가 있다 (가령, 강화시키거나 또는 억제시키거나)는 인식 또한 포괄하고 있으며, 다양한 구체예들이 그러한 조정의 필요성을 모니터링하고 및/또는 이러한 조정을 성공적으로 수행하는 데 유리하다는 것이 고려된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들에서 상기 바이오마커의 수준이 해당 통합 유전자 요법의 치료요법적으로 유효량을 나타내는 것보다 낮은 경우라면, 해당 대상체에게 추가 처치 (가령, 활성화 제제)를 투여하는 것을 더 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들에는 상기 바이오마커 수준이 페이로드의 최적 수준 또는 안전한 수준을 나타내는 수준을 초과하는 경우라면, 해당 대상체에게 유전자 요법 처치에 의해 운반되는 페이로드의 발현을 감소 또는 억제시키는 추가 처치 (가형, 비활성화 제제)를 투여하는 것을 더 포함한다.

본 출원에서 사용된 용어 "약(about)" 및 "대략적으로"란 대등하게 사용된다. 본원에서 간행물, 특허 또는 특허 출원에 대한 모든 인용은 그 전체가 참고자료에 편입된다. "약/대략적으로"의 유무에 관계없이, 본 출원에서 사용된 임의의 숫자는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 임의의 정상적인 변동을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 속성들, 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 자명하다. 그러나, 상세한 설명에서 본 발명의 구체예들은 이에 국한시킨다는 의도가 아니라 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 안에 있는 다양한 변화 및 변형들은 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하기 때문에, 오로지 설명을 위하여 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 게놈 내 표적이 되는 알부민, Alb, 좌에 HR-매개된 통합 전, 그리고 통합 후, GeneRide™ 구조체 (AAV)를 도시한 것이다. GeneRide^TM-편집된 Alb 좌로부터 발현되면 알부민-2A 및 해당 전이유전자가 별개 단백질로 동시에 생산될 수 있다.
도 2는 게놈 DNA (gDNA) 통합을 분석하기 위한 예시적인 방법을 나타낸다. 예시된 바와 같이, 이러한 방법들은 상기 알부민 (Alb) 좌에서 GeneRide^TM-편집된 gDNA의 분석에 적용될 수 있다. 도시된 단계 1에서, 긴-범위 PCR (LR-PCR)에 의해 프라이머 F1/R1를 이용하여 단리된 gDNA로부터 산물을 증폭시킨다. 도시된 단계 2에서, 단계 1의 정제된 산물은 이차(nested) qPCR에서 프라이머 F2/R2로 증폭된다.
도 3은 에피좀 DNA의 정량화를 위한 예시적인 방법을 제시한다. 예시된 바와 같이, 에피좀 카피 수는 선형화된 에피좀 플라스미드로 구축된 표준 곡선을 이용하여 qPCR에 의해 결정될 수 있다.
도 4는 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 mRNA의 분석을 위한 예시적인 방법을 제시한다. 융합된 mRNA 카피 수는 프라이머 세트 Fwd/R_F을 이용한 ddPCR을 통하여 결정된다. 내생적 Alb 카피 수는 프라이머 세트 Fwd/R_E를 이용한 ddPCR을 통하여 결정되고, 정규화(normalization)에 이용된다.
도 5A-도 5B는 혈장에서 폴리펩티드의 검출 및 정량화를 위한 예시적인 방법을 제시한다. 예를 들면, 혈장내 알부민-2A는 예시된 방법들을 통하여 분석될 수 있다. 도 5A)는 캡쳐(capture) 항체 및 검출 항체를 포함하는 샌드위치 ELISA를 도시한다. 예시에서, 알부민-2A의 포획용 항-2A 항체 및 검출용 라벨부착된 항-알부민 항체가 제시된다. 다른 폴리펩티드, 이를 테면 알부민; 인간 Factor IX에 특이적인 캡쳐 항체 및 검출 항체; 그리고 cyno A1AT를 이용하여 혈장에서 이러한 다른 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 도 5B)에서는 PBST 완충액 또는 10% 마우스 혈청에서 재조합 마우스 알부민-2A에 기반을 둔 표준 곡선을 도시한다.
도 6A-도 6C에서는 생체내 에피좀 DNA의 검출 및 분석을 설명한다. 신생(neonatal) 마우스 (p2)에게 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 주사하였다. 도 6A) 주사 후, 에피좀 카피 수가 시간 경과에 따라 기하급수적으로 감수된다. 도 6B) 동물의 간 성장은 주사 후 크게 영향을 받지 않았다. 도 6C) 동물의 체중 증가는 주사 후 크게 영향을 받지 않았다.
도 7A-도 7D에서는 시간 경과에 따른 2A 바이오마커의 생체 내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 C57에게 p2 시점에 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 i.v.로 주사하였고, 주사-후 1, 2, 3, 4 및 8 주에 수거하였다(n=5/그룹). 도 7A) 간에서 2A 바이오마커의 게놈 DNA 통합을 LR-PCR/qPCR로 정량화하고, 내생성 Alb의 퍼센트로 나타낸다. 도 7B-도 7C) 혈장에서 ALB-2A 및 전체 마우스 알부민을 ELISA를 통하여 측정하였다. 도 7D) 도 7B 및 도 7C에 나타낸 데이터의 상관관계. 혈장에서 2A 펩티드-테그된 알부민 대비 총 알부민의 분석은 혈장 ALB-2A의 관찰된 증가가 출생 후 내생성 알부민의 기하급수적인 증가와 관련되어 있음을 확인시켜준다.
도 8A-도 8B에서는 시간 경과에 따른 바이오마커로 운반되는 페이로드의 생체내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 C57에게 p2 시점에 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 i.v.로 주사하였고, 주사-후 1, 2, 3, 4 및 8 주에 수거하였다. 도 8A) 인간 Factor IX는 인간-특이적 Factor IX ELISA에 의해 마우스 혈장에서 정량화되었다. 도 8B) 도 7B 및 도 8A에 나타낸 데이터의 상관관계.
도 9A-9E에서는 2가지 용량과 2개의 연령 그룹에서 바이오마커 및 페이로드 전달의 검출 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 C57 (p2) 또는 어린 마우스 (p21)에게 1e13 또는 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 i.v.로 주사하였고, 그리고 주사-후 8주 시점에 수거하였다 (n=6-8/그룹). 수거 시점에서, p2 시점에서 투여된 동물의 연령은 8-주령이며, p21시점에서 투여된 동물의 연령은 11-주령이었다. 도 9A) ELISA에 의해 측정된 혈장내 ALB-2A. 도 9B) ELISA에 의해 측정된 혈장내 인간 Factor IX. 도 9C) 간에서 융합된 mRNA는 ddPCR에 의해 정량화되고, 내생성 알부민 mRNA의 퍼센트로 나타낸다. 도 9D) 간에서 게놈 DNA 통합을 LR-PCR/qPCR로 정량화하고, 내생성 Alb의 퍼센트로 나타낸다. 도 9E) 간에서 qPCR에 의해 측정된 세포 당 에피좀 카피 수.
도 10A-도 10C에서는 상이한 연령 군의 대상체에게 바이오마커로 운반되는 페이로드의 생체내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 FvB/NJ (p2), 어린 마우스 (p21), 또는 성체 마우스 (p42 및 p63)에게 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 i.v.로 투여하였고, 주사-후 4주 시점에서 수거하였다 (n=6-9/그룹). 수거 시점에서, p2에서 투여된 동물의 연령은 4-주령이며, p21에서 투여된 동물의 연령은 7-주령이었으며, p42에서 투여된 동물의 연령은 11-주령이었으며, 그리고 p63에서 투여된 동물의 연령은 14-주령이었다. 도 10A-도 10B) 혈장내 ALB-2A 및 인간 Factor IX은 ELISA에 의해 측정되었다. 도 10C) 혈장 ALB-2A 대비(vs) 인간 Factor IX의 선형 회귀는 R²=0.93이었다.
도 11A-도 11C에서는 게놈 통합을 위한 상이한 상동성 부문(arm)을 포함하는 바이러스 벡터를 통해 바이오마커와 함께 전달된 페이로드의 생체내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 FvB/NJ (p2)에게 A1AT-DJ를 최종 용량 1e13 또는 1e14 vg/kg으로 i.v.로 주사하였다. HA-750bp는 750bp 상동성 부문(arm)을 가진 전이유전자에 상응하고, HA-1kb는 1kb 상동성 부문(arm)을 가진 전이유전자에 상응한다. 주사-후 6주 시점에 동물을 수거하였다 (n=6-9/그룹). 도 11A-도 11B) 마우스 혈장에서 ALB-2A 및 cyno A1AT는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 11C) ALB-2A 대비 A1AT의 선형 회귀는 R²=0.91이었다.
도 12A-도 12B에서는 시간 경과에 따른 바이오마커로 운반되는 세포-내재성 페이로드의 생체내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 신생 Mut ^-/-;Tg^INS-MCK-Mut 마우스 (p2)에게 상이한 용량(1e13, 3e13 또는 1e14vg/kg)의 DJ-hMUT 을 i.v.로 주사하였고, 3 개월의 기간에 걸쳐 수거하였다. 도 12A) 간에서 게놈 DNA 통합을 LR-PCR/qPCR로 정량화하고, 내생성 Alb의 퍼센트로 나타낸다. 혈장내 ALB-2A는 ELISA로 측정하였다. 도 12B) 통합된 전이유전자인, 인간 MUT의 단백질 발현은 Western 블랏을 이용하여 MCK-MUT 마우스의 간 용해물에서 측정되었다. 순환하는 ALB-2A는 간에서의 게놈 통합 수준 및 MUT 단백질 수준과 선형의 상관관계가 있는 것으로 나타난다.
도 13A-도 13B에서는 단일 투여 후 페이로드의 발현이 증가됨 (가령, GeneRide™-편집된 간세포의 선택적 확장)을 실증하고, 그리고 페이로드 수준의 증가는 바이오마커 수준을 분석함으로써 모니터될 수 있다. 신생 Mut ^{- /-};Tg^INS-MCK-Mut 마우스 (p2)에게 1e14vg/kg의 DJ-hMUT를 i.v.로 주사하였고, 7 개월의 기간에 걸쳐 수거하였다. 도 13A-13B) MUT ^-/- 마우스에서 통합된 전이유전자로부터 발현된 인간 MUT 단백질은 로딩 대조군으로 Western 블랏에서 β-액틴을 로딩 대조군으로 삼고, 간 용애물에서 분석되었다. ALB-2A (2A에 대한 블랏팅) 및 총 알부민 또한 이들 간 용해물에서 분석되었다. 비히클-처리된 MUT ^+/- 마우스 및 야생형 B6 마우스는 참조로 분석되었다. 주석: MUT ^-/- 간세포에서 전이유전자로부터 발현된 MUT 단백질은 인간이며, 한편으로 MUT ^+/- 및 야생형 B6에서의 내생적 단백질은 마우스다.
도 14는 최적화된 ALB-2A ELISA 방법을 이용하여, 오로지 샘플 희석액에서, 또는 1% 마우스 혈장에서 준비된 재조합 마우스 ALB-2A를 기반으로 한 표준 곡선을 도시한다.
도 15A-15B는 야생형 마우스 및 마우스 모델 NAFLD (DIO)에서 바이오마커로 운반되는 페이로드의 생체내 검출, 모니터링 및 분석을 실증한다. 성체 마우스 (~9-주령)에게 1e14 vg/kg의 hF9-DJ를 i.v.로 주사하였고, 혈장 샘플을 1주 시점에, 그리고 그 다음에는 총 16주 동안 2주에 한 번씩 수집하였다. ELISA에 의해 마우스 혈장내 ALB-2A 및 인간 Factor IX를 정량화하였다.
도 16A-16C는 용량-의존적 방식으로 바이오마커 및 페이로드 전달의 검출 및 분석을 실증한다. 신생 마우스 FvB (p2)에게 4.1e12, 1.2e13, 3.7e13, 1.1e14, 3.3e14, 및 1e15 vg/kg의 cA1AT-DJ를 i.v.로 주사하였고, 주사-후 4 시점에 수거하였다 (n=5/그룹). 도 16A-B) ELISA에 의해 혈장에서 측정된 ALB-2A 및 cA1AT 수준을 차례로 보여준다. 도 16C) ALB-2A 대비 A1AT의 선형 회귀는 R² = 0.97임을 보여준다.
도 17A-C는 용량-의존적 방식으로 gDNA 통합 및 페이로드 전달의 검출 및 분석을 실증한다. 신생 Mut ^+/- ; Tg^INS-MCK-Mut 마우스 (p0)에게 저-용량, 중간-용량 및 고-용량의 DJ-mMUT (2.1e13, 6.7e13 또는 2.0e14 vg/kg)를 i.v.로 주사하였고, 주사-후 90일 시점에 수거하였다. 도 17A는 ELISA에 의해 측정된 혈장내 ALB-2A 수준을 나타낸다 (n=18 저-용량, n=19 중간-용량, n=19 고-용량). 도 17B는 간에서 gDNA 통합 퍼센트를 나타낸다 (n=26 저-용량, n=25 중간-용량, n=28 고-용량). 도 17C는 두 분석에서 동물에 대해 ALB-2A와 gDNA 퍼센트간의 상관관계를 보여준다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어들이 아래와 같이 우선적으로 정의된다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가 정의는 본 명세서를 통해 제시될 수 있다.

약(about): 값과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "약(about)"이란 언급된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 내용에 익숙한 당업자는 해당 문맥에서 "약"이란 용어에 포괄된 관련 변동 정도를 이해할 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 용어 "약"이란 언급된 값에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 이 미만 범위 안에 있는 값의 범위를 포괄할 수 있다.

활성화 제제(activating agent) : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성화 제제"란 활성화 제제가 없을 경우 (또는 상이한 수준의 활성화 제제가 있는 경우) 표적의 수준 또는 활성을 관찰한 것과 비교하여, 활성화 제제의 존재 하에 표적의 수준 또는 활성의 상승으로 관련된 경우, 이를 활성화 제제라고 한다. 일부 구체예들에서, 활성화 제제의 존재 또는 수준은 표적 수준 또는 활성과 상관관계가 있는데, 이때 표적의 특정 참조 수준 또는 활성 (가령, 적합한 참조 조건, 이를 테면, 공지의 활성화 제제, 가령, 양성 대조군의 존재 하에서 관찰된)에 필적하거나 또는 더 크다. 일부 구체예들에서, 활성화 제제는 이의 효과를 발휘하기 위해 활성화 요소에 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 활성화 요소와 연합된다.

성인(adult) : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "성인"이란 18세 또는 그 이상의 인간을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 성인 인간의 체중은 약 90 파운드 ~ 약 250 파운드 범위를 갖는다.

연합된(associated) : 2개의 이벤트 또는 엔티티에 있어서, 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것의 존재, 수준 및/또는 형태가 상관되는 경우, 이들 이벤트 또는 엔티티는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 서로 "연합"된다. 예를 들면, 특정 엔터티 (가령, 폴리펩티드, 유전적 시그니쳐, 대사산물, 미생물, 등)는 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련이 있다면 (가령, 관련 집단에 걸쳐), 이들 질환, 장애 또는 병태와 연합된 것으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 두 개 또는 그 이상 엔터티가 서로 직접 또는 간접적으로 상호작용하여, 이들이 서로에 대해 물리적으로 근접해 있거나 및/또는 근접성을 유지하는 경우, 이들은 서로에 대해 물리적으로 "연합된다". 일부 구체예들에서, 서로 물리적으로 연합된 두 개 또는 그 이상 엔터티는 서로 공유적으로 연계되며; 일부 구체예들에서, 서로 물리적으로 연합된 두 개 또는 그 이상 엔터티는 서로 공유적으로 연계되지는 않지만, 비-공유적으로 연합되는데, 예를 들면, 수소 결합, 반-데르-발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기성, 및 이들의 조합에 의해 연합된다.

생물학적 샘플 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"이란 본원에서 기술된 바와 같이, 관심대상의 생물학적 공급처 (가령, 조직 또는 유기체 또는 세포 배양물)로부터 획득되거나, 또는 유래된 샘플을 전형적으로 지칭한다. 일부 구체예들에서, 관심대상의 생물학적 공급처는 유기체, 이를 테면, 동물 또는 인간을 포함한다. 일부 구체예들에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 유체이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 생물학적 샘플은 골수; 피; 혈액 세포; 복수; 조직 또는 가는 바늘 생검 샘플; 세포-함유 체액; 자유로이 부유하는 핵산; 객담; 타액; 소변; 뇌척수액, 복막액; 흉막액; 대변; 림프; 부인과 체액; 피부 스왑(swabs); 질 스왑; 구강 스왑; 비강 스왑; 관 세척 또는 기관지폐포 세척과 같은 씻김(washings) 또는 세척액(lavages); 흡출물; 긁어낸 것들; 골수 표본; 조직 생검 표본; 수술 표본; 대변, 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물; 및/또는 그로부터의 세포 등등이거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 획득한 세포이거나, 또는 이들 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 획득된 세포는 해당 샘플을 획득한 개체의 세포이거나 또는 이들 세포가 내포된다. 일부 구체예들에서, 샘플은 임의의 적합한 수단에 의해 관심대상의 출처로부터 직접적으로 획득한 "일차(primary) 샘플"이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 일차 생물학적 샘플은 생검 (가령, 미세 바늘 흡출 또는 조직 생검), 외과수술, 체액의 집합 (가령, 혈액, 림프, 대변 등.)으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 획득된다. 일부 구체예들에서, 내용으로부터 자명하겠지만, 용어 "샘플"이란 일차 샘플의 가공함을써 (가령, 일차 샘플로부터 하나 또는 그 이상의 성분을 제거하거나, 및/또는 일차 샘플에 하나 또는 그 이상의 제제를 추가하여), 획득된 조제물을 지칭한다. 예를 들면, 반-투막을 이용한 여과. 이러한 "가공된 샘플"은 예를 들어, 샘플로부터 추출된 핵산 또는 단백질, 또는 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등과 같은 기술에 일차 샘플을 적용시켜 획득한 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.

바이오마커 : 용어 "바이오마커"라는 당업계에서 이러한 용어의 사용과 일관되게, 엔터티의 존재, 수준 또는 형태가 관심대상의 특정 생물학적 사건 또는 상태와 상관관계가 있는 경우를 지칭하는데 사용되며, 해당 이벤트 또는 상태의 "마커"로 간주된다. 무엇보다도, 본 명세서는 유전자 요법의 바이오마커를 제공한다 (가령, 유전자 요법 처치의 하나 또는 그 이상의 속성 또는 특징, 이를 테면, 실례로, 페이로드 발현의 정도, 수준 및/또는 지속성을 평가하는데 유용하다). 일부 구체예들에서, 바이오마커는 세포 표면 마커다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 세포내 마커다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 세포외부에서 발견된다 (가령, 혈액, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액 등과 같은 체액으로 세포 외부로 분비되거나 또는 생성되거나 또는 존재한다). 특정 구체예들에서, 본 명세서는 유전자 요법의 하나 또는 그 이상의 속성 또는 특징 평가에 사용을 위해 해당 유전자 요법을 제공받았던 대상체로부터 획득한 샘플에서 검출될 수 있는 바이오마커의 효과를 실증하며; 이러한 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 유전자 요법이 운반된, 및/또는 페이로드가 활성화된 부위가 아닌, 세포, 조직 및/또는 유체의 샘플이다.

탐지가능한 모이어티 : 용어 "탐지가능한 모이어티"란 본원에서 사용된 바와 같이 임의의 엔터티 (가령, 분자, 복합체, 또는 이의 일부분 또는 성분)를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 탐지가능한 모이어티는 별개의 분자 엔터티로 제공되거나 및/또는 이용되며; 일부 구체예들에서, 이는 또다른 분자 엔터티의 일부이거나, 및/또는 또다른 분자 엔터티와 연합된다. 탐지가능한 모이어티의 예로는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 각종 리간드, 방사성핵종 (가령, ³H, ¹⁴C, ¹⁸F, ¹⁹F, ³²P, ³⁵S, ¹³⁵I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁶⁴Cu, ¹⁸⁷Re, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹⁷⁷Lu, ⁸⁹Zr 등.), 형광 염료 (특이적 예시적인 형광 염료, 하기 참고), 화학발광 제제 (이를 테면, 예를 들면, 아크리디늄 에스테르, 안정화된 디옥세탄, 및 이와 유사한 것들), 생물발광제, 분광-분해성 무기 형광반도체 나노결정 (가령, 양자점), 금속 나노입자 (가령, 금, 은, 구리, 백금, 등.) 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소 (효소의 특이적 예시는 하기 참고), 발색 라벨 (이를 테면, 예를 들면, 염료, 콜로이드성 금, 및 이와 유사한 것들), 바이오틴, 디옥시게닌, 헵텐, 항체, 및/또는 항혈청 또는 단일클론 항체가 이용가능한 단백질.

소아 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "소아"란 2~18세 연령의 인간을 지칭한다. 체중은 연령과 특정 어린이에 따라 크게 다를 수 있으며, 일반적인 범위는 30파운드 ~ 150파운드 사이다.

병용 치료요법(Combination therapy) 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "병용 치료요법"이란 대상체가 두 가지 또는 그 이상의 치료요법적 섭생 (이를 테면, 두 가지 또는 그 이상의 치료요법적 제제, 예를 들면, 유전자 요법 및 비-유전자 요법 치료제 형태)에 동시에 노출되는 상황을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 두 가지 또는 그 이상 섭생은 동시에 투여될 수 있고; 일부 구체예들에서, 이러한 섭생은 순차적으로 투여될 수 있고 (가령, 제 1 섭생의 모든 "용량"은 제 2 섭생의 임의의 용량을 투여하기 전에 투여된다); 일부 구체예들에서, 이러한 제제들은 투여 섭생의 중복으로 투여된다. 일부 구체예들에서, 병용 요법의 "투여"는 다른 제제(들) 또는 형태(들)을 제공받은 대상체에게 하나 또는 그 이상의 제제(들) 또는 형태(들)의 투여가 연루될 수 있다. 명확하게, 병용 요법은 개별 제제가 단일 조성물로 함께 (또는 심지어는 반드시 동시에) 투여될 것을 요구하지 않는다.

조성물 : 용어 "조성물"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 특정 성분들을 포함하는 물리적으로 별개의 엔터티를 지칭하는데 이용될 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 일반적으로, 달리 명시되지 않는 한, 조성물은 임의의 형태 - 가령, 기체, 겔, 액체, 고체, 등이 될 수 있다.

비활성화 제제 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비활성화 제제"란 활성화 제제가 없을 경우 (또는 상이한 수준의 활성화 제제가 있는 경우) 표적의 수준 또는 활성을 관찰한 것과 비교하여, 활성화 제제의 존재 하에 표적의 수준 또는 활성의 감소와 관련된 경우, 이를 비활성화 제제라고 한다. 일부 구체예들에서, 비활성화 제제의 존재 또는 수준은 표적 수준 또는 활성과 상관관계가 있는데, 이때 표적의 특정 참조 수준 또는 활성 (가령, 적합한 참조 조건, 이를 테면, 공지의 활성화 제제, 가령, 양성 대조군의 존재 하에서 관찰된) 에 필적하거나 또는 더 낮다. 일부 구체예들에서, 비활성화 제제는 이의 효과를 발휘하기 위해 비활성화 요소에 결합하거나, 또는 그렇지 않으면 비활성화 요소와 연합된다.

결정하다: 여기에 설명된 많은 방법론에는 "결정" 단계가 내포된다. 본 명세서를 읽는 당업자는 이러한 "결정"이 예를 들어, 본원에서 명시적으로 언급된 특정 기술을 비롯하여, 당업자가 이용할 수 있는 다양한 기술을 이용하거나 또는 이를 통해 달성할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 결정에는 물리적 샘플의 조작이 연루된다. 일부 구체예들에서, 결정은 예를 들어, 관련 분석을 수행하도록 구성된 컴퓨터 또는 기타 처리 장치를 활용하여 데이터 또는 정보의 고려 및/또는 조작이 연루된다. 일부 구체예들에서, 결정에는 공급처로부터 관련 정보 및/또는 자료를 받는 것도 연루되어 있다. 일부 구체예들에서, 결정에는 샘플 또는 엔터티의 하나 또는 그 이상의 속성을 필적되는 참조와의 비교가 연루되어 있다.

유전자 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"란 유전자 산물 (가령, RNA 산물 및/또는 폴리펩티드 산물)을 인코드하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 유전자에는 코딩 서열 (가령, 특정 유전자 산물을 인코딩하는 서열)이 내포되며; 일부 구체예들에서, 유전자에는 넌-코딩 서열이 내포된다. 일부 특정 구체예들에서, 유전자에는 코딩 서열 (가령, 엑손) 및 넌-코딩 (가령, 인트론) 서열이 내포될 수 있다. 일부 구체예들에서, 유전자에는 하나 또는 그 이상의 조절 요소 (가령, 프로모터, 인헨서, 침묵자, 종료 신호)들이 내포되어, 예를 들면, 이들은 유전자 발현의 하나 또는 그 이상의 측면을 제어하거나 또는 영향을 줄 수 있다 (가령, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현). 일부 구체예들에서, 유전자는 게놈(가령, 염색체 내에 또는 염색체 상에 또는 다른 복제가능한 핵산)에 위치해 있거나 또는 발견된다 (또는 위치한 또는 발견되는 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다).

유전자 산물 또는 발현 산물 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"이란 해당 유전자로부터 전사된 RNA를 지칭하거나, 또는 해당 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 인코드된 폴리펩티드 (전-변형되거나 및/또는 후-변형된)를 일반적으로 지칭한다.

"개선시키고", "증가시키고", "저해시키고", 또는 "감소시키고" : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개선시키고", "증가시키고", "저해시키고", "감소시키고", 또는 이와 문법적으로 등가의 것들은 기선 또는 다른 참고 척도와 비교한 값을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 적절한 기준 측정은 특정 작용제 또는 치료제의 존재가 없거나 (예를 들어, 이전 및/또는 이후에), 또는 다른 필적되는 기준물질의 존재 하에 특정 시스템 (예를 들어, 단일 개체에서)에서의 측정이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 적절한 기준 측정은 관련 물질 또는 치료의 존재 하에 특정 방식으로 알려지거나 또는 반응할 것으로 예상되는 유사한 시스템에서의 측정이거나 또는 측정을 포함할 수 있다.

유아: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유아"란 2세 미만의 인간을 지칭한다. 유아의 일반적인 체중은 3파운드에서 최대 20파운드이다.

핵산 : 본원에서 사용된 바와 같이, 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 쇄에 있거나, 또는 혼입될 수 있는 모든 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 핵산은 포스포디에스테르 링키지를 통해 올리고뉴클레오티드 쇄에 있거나, 또는 혼입될 수 있는 모든 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 내용으로부터 자명하겠지만, 일부 구체예들에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기 (가령, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하며; 일부 구체예들에서, "핵산"이란 개별 핵산 잔기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 일부 구체예들에서, "핵산"이란 RNA이거나 또는 이를 포함하며; 일부 구체예들에서, "핵산"이란 DNA이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 일부 구체예들에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 천연 뉴클레오시드 (가령, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체 (가령, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오 메틸화 염기, 삽입 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구체예들에서, 핵산은 기능성 유전자 산물 이를 테면, RNA 또는 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 핵산에는 하나 또는 그 이상의 인트론이 내포된다. 일부 구체예들에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형 (생체내 또는 시험관내)에 기초한 중합에 의한 효소 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 또는 그 이상의 방법에 의해 준비된다. 일부 구체예들에서, 핵산의 길이는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상 잔기다. 일부 구체예들에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 체예들에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 구체예들에서, 핵산은 폴리펩티드를 인코드하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 폴리펩티드를 인코드하는 서열의 보체다. 일부 구체예들에서, 핵산은 효소적 활성을 갖는다.

펩티드 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"란 아미노산의 중합 쇄를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 자연에서 발생되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 자연에서 발생되지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 사람이 수작업을 통해 설계 및/또는 생산된, 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 둘 모두를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 오로지 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산만을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 D-아미노산, L-아미노산, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 오로지 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 오로지 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 펩티드는 선형이다. 일부 구체예들에서, 용어 "펩티드"라는 용어는 참조 펩티드, 활성 또는 구조의 이름에 부속될 수 있고; 그러한 경우에 관련 활성 또는 구조를 공유하고, 따라서 동일한 부류 또는 펩티드 패밀리의 구성원으로 간주될 수 있는 펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 각각의 이러한 클래스에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 공지되어 있는 클래스 내의 예시적인 펩티드를 제공하고, 당업자는 이를 인지하며; 일부 구체예들에서, 이러한 예시적인 펩티드는 펩티드 클래스 또는 패밀리에 대한 참조 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 펩티드 클래스 또는 패밀리의 구성원은 참조 클래스 펩티드와 상당한 서열 상동성 또는 동일성을 나타나고, 이와 공통 서열 모티프 (가령, 특징적인 서열 요소)를 공유하거나, 및/또는 공통 활성 (일부 구체예들에서 필적가능한 수준에서 또는 명시된 범위 내에서)를 공유하고; 일부 구체예들에서 해당 클래스내 모든 펩티드와). 예를 들면, 일부 구체예들에서, 구성원 펩티드는 참조 펩티드와 적어도 약 30-40%, 그리고 대개 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 전반적인 서열 상동성 또는 동일성을 보이고, 및/또는 매우 높은 서열 동일성, 대개 90% 이상 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상을 보이는 적어도 하나의 영역(가령, 일부 구체예들에서 특징적인 서열 요소이거나, 또는 이러한 요소를 포함하는 보존된 영역)이 내포된다. 이러한 보존된 영역은 보통 적어도 3-4개의 아미노산, 대개 최대 20개까지 또는 그 이상의 아미노산을 포괄하며; 일부 구체예들에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트래치를 포괄한다.

폴리펩티드 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 적어도 3개 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 천연 아미노산을 포함하거나, 또는 전부가 천연인 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상이 비-천연 아미노산을 포함하거나, 또는 모두 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 D-아미노산을 포함하거나, 또는 모두 D-아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 L-아미노산을 포함하거나, 또는 모두 L-아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 부속 기 또는 다른 변형, 가령, 하나 또는 그 이상의 아미노산 측쇄, 해당 폴리펩티드의 N-말단, 해당 폴리펩티드의 C-말단을 변형시키거나 또는 이들에 부착되거나, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 변형, 이를 테면, 아세틸화, 아미드화, 아미노에틸화, 바이오틴화, 카르바밀화, 카르보닐화, 시트룰린화, 탈아미드화, 탈이미화, 제거, 글리코실화, 지질화, 메틸화, 페길화, 인산화, 수모일화 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 분자-내 또는 분자-간 이황화 결합에 참여할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 환이거나, 및/또는 환 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 환이 아니거나, 및/또는 임의의 환 부분을 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 선형이다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 스테이플로 묶인(stapled) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 다른 폴리펩티드 (가령, 항체)와 비-공유적 또는 공유적 연합에 의한 비-공유 복합체 형성에 참여한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생되지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 사람이 수작업을 통해 설계 및/또는 생산된, 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 용어 "폴리펩티드"라는 용어는 참조 폴리펩티드, 활성 또는 구조의 이름에 부속될 수 있고; 그러한 경우에 관련 활성 또는 구조를 공유하고, 따라서 동일한 부류 또는 폴리펩티드 패밀리의 구성원으로 간주될 수 있는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 각각의 이러한 클래스에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 공지되어 있는 클래스 내의 예시적인 폴리펩티드를 제공하고, 당업자는 이를 인지하며; 일부 구체예들에서, 이러한 예시적인 폴리펩티드는 폴리펩티드 클래스 또는 패밀리에 대한 참조 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드 클래스 또는 패밀리의 구성원은 참조 클래스 폴리펩티드와 상당한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고, 이와 공통 서열 모티프 (가령, 특징적인 서열 요소)를 공유하거나, 및/또는 공통 활성 (일부 구체예들에서 필적가능한 수준에서 또는 명시된 범위 내에서)를 공유하고; 일부 구체예들에서 해당 클래스내 모든 폴리펩티드와 함께). 예를 들면, 일부 구체예들에서, 구성원 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 적어도 약 30-40%, 그리고 대개 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 전반적인 서열 상동성 또는 동일성을 보이고, 및/또는 매우 높은 서열 동일성, 대개 90% 이상 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상을 보이는 적어도 하나의 영역(가령, 일부 구체예들에서 특징적인 서열 요소이거나, 또는 이러한 요소를 포함하는 보존된 영역)이 내포된다. 이러한 보존된 영역은 보통 적어도 3-4개의 아미노산, 대개 최대 20개까지 또는 그 이상의 아미노산을 포괄하며; 일부 구체예들에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트래치를 포괄한다. 일부 구체예들에서, 유용한 폴리펩티드는 부모계 폴리펩티드의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 유용한 폴리펩티드는 다수의 단편을 포함할 수 있는데, 이들 각 단편은 동일한 부모계 폴리펩티드에서 발견되지만, 관심대상의 폴리펩티드에서 볼 수 없는, 서로에 대해 상이한 공간적 배열을 갖고 (가령, 부모와 직접적으로 연계된 단편들은 관심대상의 폴리펩티드와 공간적으로 분리되어 있을 수 있거나, 또는 그 역이 성립되며, 및/또는 단편들은 부모에 있는 순서와는 상이하게 관심대상의 폴리펩티드에 존재할 수 있음), 따라서 상기 관심대상의 폴리펩티드는 이의 부모 폴리펩티드의 유도체다.

대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"란 유기체, 전형적으로 포유류 (이를 테면, 인간, 일부 구체예들에서 태생기(prenatal) 인간 형태를 비롯하여)를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 구체예들에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태에 민감하여 걸릴 수 있다. 일부 구체예들에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 민감성 또는 위험적인 하나 또는 그 이상의 속성을 갖는 대상체다. 일부 구체예들에서, 대상체는 환자다. 일부 구체예들에서, 대상체는 진단 및/또는 치료요법을 받고 및/또는 투여받았던 개체다.

실질적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로(substantially)"라는 용어는 관심대상의 특성 또는 속성의 전체 또는 거의-전체 범위 또는 정도를 나타내는 질적 조건을 나타낸다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 거의 완료되지 않거나 또는 완전하게 진행되거나 완전한 결과를 달성하거나 회피하는 경우가 거의 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.

특정 구체예들의 상세한 설명

본 명세서는 유전자 요법을 모니터링하기 위한, 및/또는 그렇지 않으면 평가하기 위한 기술을 제공한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 본 명세서는 통합 유전자 요법 처치의 결과로써 생성된 바이오마커(들)의 검출 및 평가, 유전자 요법 처치를 통하여 전달된 페이로드에 대한 정보를 나타내는 페이로드의 존재 및 관련 양, 가령, 전달된 페이로드의 존재, 양 및/또는 역학에 관한 정보의 탐지 및 검출에 관계한다. 본 명세서의 한 측면에서, 바이오마커의 존재, 양 및/또는 역학은 전달된 페이로드의 존재, 양 및/또는 동역학의 결정을 위한 가늠자(proxy)로 작용한다. 본 명세서의 일부 구체예들에서, 바이오마커는 통합 유전자 요법 처치를 제공받았던 대상체로부터 취한 생물학적 샘플로부터 평가된다. 본 명세서의 일부 구체예들에서, 바이오마커는 해당 대상체로부터 취한 비-조직 생물학적 샘플에서 평가될 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들에서, 페이로드는 통합 유전자 요법 처치를 제공받았던 대상체의 조직으로 운반되고(가령, 적합한 전이유전자의 전달을 통하여), 그 조직 안에 남아있다.

통합 유전자 요법

유전자 요법은 일반적으로 비정상적인 유전자를 보상할 수 있는 페이로드를 발현시키거나 또는 그렇지 않으면 대상체에게 유익한 효과를 제공하기 위해, 대상체의 세포에 유전 물질을 도입한다. 통합 유전자 요법은 수령 세포 안에 존재하는 유전적 서열 (가령, 표적 부위)로 통합되는 유전적 물질을 도입시킨다.

당업자는 유전 물질이 수령 세포 또는 유기체의 관심대상 표적 부위로 통합되도록 만드는 다양한 기술을 알고 있다. 이러한 통합된 유전적 요소들은 숙주 세포 또는 유기체로 전달되는 페이로드를 인코드하는 핵산 서열 (가령, "본원에서 이용된 용어 전이유전자")을 포함할 수 있다. 전형적으로, 전이유전자는 벡터에서 전달되며; 당업자는 전이유전자 통합을 달성하기 위해 성공적으로 사용될 수 있는 바이러스 및 비-바이러스 벡터 시스템 모두를 알고 있다.

본 명세서는 다양한 통합 유전자 치료 기술에 대한 문제의 원인을 확인시킨다.

예를 들면, 본 명세서는 비효율적이거나 또는 비효과적인 통합이 유전자 치료 전략의 유용성을 제한할 수 있음을 인식한다. 벡터가 통합에 실패하면, 일반적으로 성장 또는 조직 재생 과정에서 세포가 분열할 때 손실되며, 전달된 전이유전자(또는 페이로드)에 의해 제공되거나 제공되었을 모든 이점도 손실된다. 통합이 처음에는 성공적이었지만, 이후 예를 들어, 재조합 이벤트를 통해 또는 수용 세포의 사멸에 의해 통합이 손실된 경우에도 유사한 어려움이 발생된다.

본 명세서는 많은 유전자 통합 기술 또는 이벤트가 표적 통합 부위를 정확하게 제어할 수 없거나 제어하지 못하며, 통합 부위가 이식유전자 발현의 정도 및/또는 시기에 상당한 영향을 미칠 수 있고 및/또는 수용 세포의 건강 또는 심지어 생존력에 영향을 미칠 수 있음을 추가로 인식한다. 더욱이, 본 명세서에서는 일부 "표적이 되는" 유전자 통합 기술은 통합 부위에 의해 부정적 영향을 받을 수 있으며, 전이유전자 발현이 원하는 수준을 얻는데 실패하거나, 및/또는 원하는 기간 동안 유지될 수 없음을 인지한다.

본 명세서에서는 많은 유전자 요법 접근방법이 전이유전자를 프로모터 (가령, 외생적 프로모터)와의 작동가능하도록 연합되도록 도입시키고, 이러한 프로모터의 특징적인 발현은 수령 세포에 부정적으로 영향을 줄 수 있는데, 이를 테면, 제어안된 증식 (가령, 암)의 위험이 잠재적으로 증가되는데, 특히 높은 수준의 유전자 발현을 이끄는 프로모터의 경우에 더욱 그러하다.

따라서, 본 명세서는 많은 통합 유전자 요법 치료의 한 가지 문제의 원인이 특히 시간 경과에 따른 관련 페이로드의 발현의 모니터링을 못하거나, 또는 불능하다라는 통찰을 제공한다. 많은 페이로드가 세포 내에 있거나 또는 있을 수 있고, 및/또는 발현 및/또는 활성화되도록 의도된 조직이 상대적으로 접근하기 어려울 수 있다는 점을 감안할 때, 정기적인 모니터링은 대개 시도되지 않는다.

본 명세서는 특정 유전자 통합 기술이 성공적인 전이유전자 통합 및 페이로드 발현에 있어서 효과적인 바이오마커를 생성할 수 있다는 발견에 기여한다. 더욱이, 본 명세서에서는 이러한 특정 기술로 용이하게 접근가능한 생물학적 샘플 (가령, 혈액, 소변, 눈물, 등)로부터 바이오마커를 생성한다는 것이 실증된다. 따라서, 본 명세서는 통합 유전자 요법을 개선시키는 기술을 제공하는데, 무엇보다도 페이로드의 성공적인 통합 및 발현의 반영에 의해 생성된 바이오마커를 (가령, 많은 구체예들에서 다중 시점에서) 모니터링하는 시스템의 제공을 통하여 개선된다.

다양한 통합 유전자 치료 기술 중 임의의 것이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 비-제한적 예로써, 일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법은 벡터-기반의 시스템 (가령, 바이러스 벡터-기반의 시스템), 비-바이러스 벡터-기반의 시스템, 뉴클레아제-매개된 시스템이거나, 및/또는 GENERIDE™ 시스템의 사용, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

벡터-기반의 시스템

일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법은 벡터-기반의 시스템 (가령, 바이러스 벡터)이거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 전형적으로, 벡터-기반의 시스템에는 세포로 전달하기 위해 외래 DNA의 단편을 삽입시킬 수 있는 바이러스 또는 바이러스 유전 물질이 내포될 것이다. 생명 주기에서 DNA 단계를 포함하는 임의의 바이러스는 본 개시내용의 일부 구체예들의 범위 내에서 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 비-제한적 예로써, 바이러스 벡터-기반의 시스템은 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥의 DNA 바이러스, 생명 주기에서 DNA 단계를 갖는 RNA 바이러스, 예를 들면, 레트로바이러스일 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용가능한 제형, 예를 들면, 리포좀 또는 지질 입자 (가령, 마이크로-입자 또는 나노-입자)를 통하여 운반될 수 있다.

하나의 비-제한적인 예로써, 한 가지 관심대상의 바이러스는 아데노-연합된 바이러스다. 아데노-연합된 바이러스, 또는 "AAV"에서, 이것은 바이러스 자체이거나 또는 이의 유도체를 의미한다. 해당 용어는 모든 하위유형 및 자연 발생적 형태 및 재조합 형태를 모두 포괄하는데, 달리 필요한 경우를 제외하고, 예를 들면, AAV 유형 1 (AAV-1), AAV 유형 2 (AAV-2), AAV 유형 3 (AAV-3), AAV 유형 4 (AAV-4), AAV 유형 5 (AAV-5), AAV 유형 6 (AAV-6), AAV 유형 7 (AAV-7), AAV 유형 8 (AAV-8), AAV 유형 9 (AAV-9), AAV 유형 10 (AAV-10), AAV 유형 11 (AAV-11), 조류 AAV, 소 AAV, 갯과 AAV, 말의 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양의(ovine) AAV, 하이브리드 AAV (가령, 한 가지 AAV 하위유형의 캡시드 단백질과 또다른 하위유형의 게놈 물질 을 포함하는 AAV), 돌연변이체 AAV 캡시드 단백질 또는 키메라 AAV 캡시드 (가령, 두 가지 또는 그 이상의 상이한 AAV의 혈청형, 예를 들면, AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19로부터 유래된 영역 또는 도메인 또는 개별 아미노산을 갖는 캡시드 단백질)를 포함하는 AAV를 포괄한다. "영장류 AAV"란 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, "비-영장류 AAV"란 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하며, "소의 AAV"란 포유동물 소를 감염시키는 AAV를 지칭한다.

표적화된 통합을 촉진시키기 위해 이용된 벡터 (가령, 바이러스 벡터)와 무관하게, 표적화 벡터는 통합 부위에서 상동성 재조합을 허용하는 핵산 서열, 예를 들면, 알부민 유전자, 콜라겐 유전자, 액틴 유전자, 등과 상동성 재조합을 허용하는 서열을 포함한다. 이 공정은 "공여자" 분자, 가령, 표적화 벡터를 이용하는 뉴클레오티드 서열 상동성을 요구하는데, 예를 들면, "표적" 분자 가령, 세포의 게놈에서 가령, 표적 좌에 통합되는 핵산 서열의 주형 복구를 위해, 그리고 공여자로부터 해당 표적으로 유전적 정보의 전달로 이어진다. 이와 같이, 대상 조성물 벡터의 표적화에 있어서, 세포 게놈으로 통합될 전이유전자는 절단 부위에서 게놈 서열에 대해 충분한 상동성, 가령, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상동성을 갖는 서열의 측면에 있을 수 있는데, 가령, 해당 절단 부위의 측면에 있는 뉴클레오티드 서열, 가령, 표적 통합 부위로부터 약 50개 또는 그 미만의 염기, 가령, 약 30개 염기내, 약 15개 염기내, 약 10개 염기내, 약 5개 염기내, 또는 해당 표적 통합 부위 바로 옆에 있어, 이것과 상동성을 갖는 게놈 서열 간의 상동성 재조합을 지원한다. 공여 서열과 게놈 서열 간의 대략적으로 25, 50, 100, 250, 또는 500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열은 이들 간에 상동성 재조합을 지원할 것이다.

비-바이러스 벡터 시스템

일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법은 비-바이러스-벡터-기반의 시스템이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 비-바이러스 벡터 시스템은 플라스미드, 중합체-기반의 입자, ceDNA, 리포좀, 미니서클(minicircle), 및 이들의 조합이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 비-바이러스 벡터 시스템은 화학적 운반체, 전기천공, 탄도성 DNA의 사용(가령, 입자 투하), 초음파천공, 광천공, 마그네토펙션, 하이드로포레이션 및 이의 임의의 조합이거나 또는 이의 이용을 포함할 수 있다.

상기 설명과 유사하게, 표적 통합을 촉진시키기 위해 이용된 비-바이러스 벡터 시스템(들)의 유형에 무관하게, 통합 부위에서 상동 재조합을 허용하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열은 표적 부위에서 사용되거나/전달되어야만 한다.

뉴클레아제-매개된 통합

다양한 구체예들에 따르면, 뉴클레아제-매개된 통합은 박테리아에서 DNA를 절단하는 것으로 최초로 확인된 또는 공작된 효소인 하나 또는 그 이상의 뉴클레아제를 이용한다. 전형적으로, 뉴클레아제- 매개된 통합은 2-단계 공정이다. 우선, 이중-가닥으로된 DNA에서 하나의 가닥 또는 두 가작 모두를 절단시킬 수 있는 외생적 뉴클레아제는 합성 가이드 RNA에 의해 원하는 부위로 지향되고, 특이적 절단이 이루어진다. 상기 뉴클레아제가 원하는 절단을 만든 후, 세포 DNA 복구 기전이 활성화되고, NHEJ 또는 다소 흔하지는 않지만, HDR을 통한 편집 공정을 완성한다.

일부 구체예들에서, NHEJ는 세포가 DNA 절단을 복구할 때, 복제할 DNA 주형이 없을 때 발생할 수 있다. 이것은 세포가 이중-가닥 파손을 복구하는 데 사용하는 일차 또는 디폴트(default) 경로다. NHEJ 메커니즘은 indel로 알려진 작은 삽입 또는 결실의 도입에 사용되어, 유전자 기능의 녹아웃을 초래한다. NHEJ는 복구 모드로 인해 DNA에 삽입 및 삭제를 생성하고, 염색체 이상을 비롯한 표적-빗나간 원치 않는 돌연변이를 도입시킬 수도 있다.

뉴클레아제-매개된 HDR은 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 절단된 DNA와 유사한 DNA 주형의 공동-전달과 함께 발생된다. 결과적으로, 세포는 이 템플릿을 사용하여 복구 DNA를 구축할 수 있으며, 결과적으로 결함이 있는 유전자 서열을 올바른 것으로 교체한다. 일부 구체예들에서, HDR 메커니즘은 높은 충실도로 인해 수정 서열을 삽입하기 위해, 뉴클레아제-기반 접근 방식을 사용할 때 선호되는 복구 경로다. 그러나, 뉴클레아제로 절단된 후 게놈에 대한 복구의 대부분은 계속해서 NHEJ 메커니즘을 사용한다. 더 빈번한 NHEJ 복구 경로는 절단 부위에서 원치 않는 돌연변이를 일으킬 가능성이 있고, 따라서 임의의 뉴클레아제-매개 통합 접근법이 현재 표적으로 삼을 수 있는 질병의 범위가 제한된다.

GeneRide™ 기술 플랫폼

GeneRide™ 은 게놈의 충실도를 유지하기 위해 자연적으로 발생하는 DNA 복구 과정인 상동 재조합 또는 HR을 활용하는 게놈 편집 기술이다. HR을 이용함으로써, GeneRide™ 는 외생적 뉴클레아제를 사용하지 않고, 폴리뉴클레오티드를 특이적 표적이 되는 게놈 위치로 삽입하며, GeneRide™-지향된 폴리뉴클레오티드 통합은 외생적 프로모터와 사용과 연합된 치명적인 문제 없이, 조직-특이적 유전자를 높은 수준으로 발현시키기 위해 이들 표적 위치에서 내생적 프로모터에 영향을 주도록 기획된다. 본 명세서의 일부 구체예들에서, 본 명세서의 일부 구체예들에서, 페이로드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 또는 유기체로 전달하는데 GeneRide™ 를 이용한다.

GeneRide™ 기술을 이용하여 안정적인 치료 효과를 제공하도록 환자의 게놈으로 치료제 페이로드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 정확하게 통합시킬 수 있다. GeneRide™ 는 이러한 내구적인 치료제 효과를 갖도록 기획되었기 때문에, 소아 환자의 장애를 표적화시켜, 돌이킬 수 없는 질환 병리가 발생하기 전, 해당 환자의 생애 초기에 치료를 제공하는 것이 중요하다.

일부 구체예들에서, GeneRide™ 는 세포의 핵으로 유전자를 운반하는 AAV 벡터를 이용한다. 그 다음, HR을 사용하여 교정(corrective) 유전자를 수용자의 게놈에서 내생성 프로모터에 의해 조절되는 위치로 안정적으로 통합되고, 신체가 성장하고, 시간이 지남에 따라 변화하더라도 평생 동안 단백질을 생산하는 잠재력을 이끌어 낸다.

GeneRide™는 교정 유전자를 숙주 세포의 염색체에 정확하고, 부위-특이적이며, 안정적이고, 지속적으로 통합할 수 있다. GeneRide 구조체를 사용한 전-임상 동물 연구에서 게놈의 특정 위치에 교정 유전자가 통합된 것이 관찰되었다.

GeneRide™ 의 모듈은 하나 또는 그 이상의 조직으로 전달되는 다양한 치료제에 걸쳐 재현할 수 있는 강력한 조직-특이적 유전자 발현을 전달하기 위해 적용될 수 있다. GeneRide™ 구조체 내에서 상이한 전이유전자를 대체함으로써, 그 전이유전자는 구조체의 다른 모든 구성요소를 실질적으로 유지하면서, 새로운 치료 적응증을 다루기 위해 전달될 수 있다. 이 접근 방식을 통해 다양한 GeneRide™ 제품 후보 전반에 걸쳐 공통 제조 프로세스 및 분석을 활용할 수 있으며 다른 치료 프로그램의 개발 프로세스를 단축할 수 있다.

비-파괴적 유전자 표적화에 대한 이전 작업은 WO 2013/158309에 설명되어 있으며, 이는 본원 참조자료에 편입된다. 뉴클레아제 없는 게놈 편집에 대한 이전 작업은 WO 2015/143177에 설명되어 있으며, 이는 본원 참조자료에 편입된다.

표적 부위

본 명세서에 따라 사용하기 위한 통합 유전자 요법은 통합된 전이유전자와 활성 내생성 프로모터의 작동적 연합을 달성하는 통합을 이루는 것이 바람직하며, 해당 프로모터로부터의 전사가 전이유전자를 통해 연장되는 전사체를 생성하도록 한다. 더욱이, 많은 구체예들에서, 이러한 전사체에 전이유전자에 대한 것 이외의 개방 판독 프레임이 내포되도록 선택된 표적 부위에서 통합된다.

많은 구체예들에서, 본 명세서에 따르면 사용하기 위한 통합 유전자 요법은 내생적 유전자의 표적 부위 (가령, 내생적 유전자 내 또는 인접한 특정 위치)에서 통합을 달성하고, 그리고 적어도 해당 유전자의 프로모터로부터 전사에 의해 생성된 전사체를 연장시켜, 그것이 전이유전자를 통해 연장되도록 한다.

일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물은 페이로드를 인코드하는 서열을 포함하는 핵산 요소를 해당 대상체의 게놈의 표적 부위로 통합시킨다. 당업자는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용함에 있어서 임의의 다양한 표적 부위들이 적절할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 표적 부위는 폴리펩티드를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 표적 부위는 대상체 (가령, 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있지 않은 대상체)에서 상당히 발현되는 폴리펩티드를 인코드할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 핵산 요소의 통합은 폴리펩티드를 인코드하는 내생적 유전자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 일어난다. 비-제한적 예로써, 일부 구체예들에서, 표적 부위는 알부민을 인코드한다.

유전적 요소 및/또는 전이유전자의 통합 전달은 임의의 조직, 이를 테면, 간, 중추 신경계(가령, 척추), 근육, 신장, 눈의 망막 및 혈액 형성 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 모든 조직에 대해 달성될 수 있다.

페이로드(payloads)

다양한 구체예들에 따르면, 본원에서 기술된 바와 같이, 임의의 적용-적합한 페이로드가 이용될 수 있다. 다양한 구체예들에 따르면, 전이유전자는 하나 또는 그 이상의 페이로드를 인코드한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "페이로드" 및 "관심대상 유전자" (GOI)는 호환사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 펩티드, 핵산 (가령, shRNA, miRNA, 및/또는 하나 또는 그 이상의 펩티드를 인코드하는 핵산), 및 이의 임의의 조합이거나, 또는 이들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법 처치 및/또는 유전자-통합 조성물에는 단일 페이로드가 내포된다. 일부 구체예들에서, 통합 유전자 요법 처치 및/또는 유전자-통합 조성물에는 두 가지 또는 그 이상 페이로드 (가령, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)가 내포된다.

예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 세포내적으로 발현되는 펩티드, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 (가령, 전이유전자)이거나, 또는 이를 포함한다. 비-제한적 예로써, 세포내적으로 발현되는 펩티드에는 메틸말로닐-CoA 뮤타제 (MUT), 페닐알라닌 수산화효소 (PAH), 글루코스-6-포스파타제 촉매 하위단위 (G6PC), 프로피오닐-CoA 카르복실라제, 하위단위 알파 (PCCA), ATP 결합 카세트 하위패밀리 B 구성원 11 (ABCB11), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (OTC), UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 패밀리 1 구성원 A1 (UGT1A1), 산 알파-글루코시다제 (GAA), 리소좀성 산 글루코실세라미다제 (GBA), Frataxin (FTX)가 내포된다.

일부 구체예들에서, 페이로드는 세포외적으로 분비되는 펩티드 및/또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 (가령, 전이유전자)이거나, 또는 이를 포함한다. 비-제한적 예로써, 분비된 펩티드에는 인간 Factor IX (F9), 및 알파-1-항트립신 (SERPINA1)이 내포된다.

일부 구체예들에서, 페이로드는 의학적 병태를 치료하기 위한 생물학적 과정을 촉진하는 세포-내재적 활성 또는 세포-외인적 활성을 갖는 펩티드다.

일부 구체예들에서, 페이로드는 하나 또는 그 이상의 건강한 조직에서 정상적으로 발현되는 펩티드, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 간 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 근육 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 중추신경계 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 눈 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다.

일부 구체예들에서, 페이로드는 하나 또는 그 이상의 건강한 조직에서 정상적으로 발현되지 않는 (가령, 이소성으로 발현됨) 펩티드, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 간 세포에서 이소성으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 근육 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 중추신경계 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 페이로드는 눈 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드다.

일부 구체예들에서, 페이로드는 활성화 요소 (가령, 활성화 제제에 의해 활성화되는)를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 페이로드는 비활성화 요소 (가령, 비활성화 제제에 의해 활성화되는)를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 활성화 제제 또는 비활성화 제제는 소 분자이거나, 또는 이를 포함할 수 있다.

바이오마커

본 명세서는 페이로드의 발현에 대한 가늠자(proxy)로서 작용할 수 있는 검출가능한 바이오마커를 생성하는 통합 유전자 요법 기술을 제공한다.

본 명세서에 따르면, 통합된 이식유전자의 발현은 전이유전자에 의해 인코딩된 페이로드로부터 분리되거나 또는 분리가능한 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 해독가능한 개방 판독 프레임이 내포된 전사체의 생산과 관련되어 있다. 일부 구체예들에서, 전사체의 해독은 바이오마커로부터 페이로드를 분리하기 위해 절단되는 단일 폴리펩타이드를 생성하고; 일부 구체예들에서, 전사체의 해독으로 특징적인 바이오마커 및 페이로드 폴리펩티드가 생성된다.

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 다양한 구체예들에서 임의의 다양한 바이오마커들의 용도는 양립가능한 것으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 페이로드에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 바이오마커를 페이로드와 연합시키면 예를 들어, 페이로드가 내생적 단백질의 변형된 형태이고, 따라서 그렇지 않으면 내생적 버전과 별개로 검출하기 어렵거나 또는 불가능할 때 유리할 수 있다. 일부 구체예들에서, 탐지가능한 모이어티는 바이오마커에 결합하는 제제 (가령, 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 2A 펩티드에 결합하는 항체)이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구체예들에서, 바이오마커는 2A 펩티드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 2A 펩티드는 P2A, T2A, E2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 Furin 절단 모티프이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 비-제한적 예로써, Furin 절단 모티프의 배열은 Tian et al., FurinDB: A Databse of 20-Residue Furin Cleavage Site Motifs, Substrates and Their Associated Drugs, (2011), Int. J. Mol. Sci., vol. 12: 1060-1065에 기술된다. 특정 예시로써, 일부 구체예들에서, 2A 펩티드는 아미노산 서열 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 식별 번호: 1)를 보유하거나 또는 이를 포함할 수 있고, 이러한 2A 펩티드를 인코딩하는 전이유전자는 뉴클레오티드 서열 gccaccaacttcagcctgctgaaacaggccggcgacgtggaagagaaccctggcccc (서열 식별 번호: 2)를 보유하거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 2A 펩티드는 서열 식별 번호: 1 또는 서열 식별 번호: 2에 대해 적어도 80% 동일한 (가령, 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 동일한) 서열을 가질 것이다. 일부 구체예들에서, 2A 펩티드 또는 2A 펩티드를 인코딩하는 전이유전자는 Kim et al., (2011) High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice, PLoS ONE, vol. 6(4):e18556; Wang et al. (2015) 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori, Sci Rep., vol. 5: 16273; Yu et al. (2012) Use of Mutated Self-Cleaving 2A Peptides as a Molecular Rheostat to Direct Simultaneous Formation of Membrane and Secreted Anti-HIV Immunoglobulins. PLoS ONE 7(11): e50438; or Trichas et al. (2008), Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice, BMC Biology, vol. 6:40에서 기술된 것일 수 있거나, 또는 기술된 것과 같이 생성될 수 있다.

일부 구체예들에서, 바이오마커는 테그 (가령, 면역학적 테그), 예를 들면, myc, HA, FLAG, 또는 기타 테그일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 내부 리조솜 진입 부위 (IRES)일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다.

탐지가능한 모이어티의 검출

본원에서 기술된 바와 같이, 본원에서 기술된 방법 및 조성물에 적용될 때, 검출 (가령, 신호, 이를 테면, 바이오마커 또는 탐지가능한 모이어티)은 임의의 적용-적합한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 검출 단계는 면역학적 분석 또는 핵산 증폭 분석이거나, 또는 이를 포함한다.

본원에서 기술된 바와 같이, 많은 구체예들에는 하나 또는 그 이상의 생물학적 샘플 (가령, 대상체로부터 취한 유체 또는 조직의 샘플)의 사용이 내포되며, 바이오마커를 탐지하는 방식은 특정 구체예에서 이용된 생물학적 샘플에 따라 가변적일 수 있다. 본 명세서에 따르면, 다양한 구체예들에서 임의의 다양한 생물학적 샘플들은 양립가능한 것으로 간주된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 생물학적 샘플은 머리카락, 피부, 대변, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 눈물, 유리체액 또는 점액이거나, 또는 이를 포함한다.

다양한 구체예들에 따르면, 그리고 당업자에서 이용된 특이적 바이오마커(들)에 따라, 당업자는 생물학적 샘플에서 바이오마커의 존재 및/또는 양/수준을 검출 또는 결정하는 하나 또는 그 이상의 적합한 방법을 예상할 것이다. 일부 구체예들에서, 형광, 방사능, 화학발광, 전기화학발광, 비색법, FRET, HTRF, 동위원소 방법, 파트너 결합 (가령, 바이오틴/아비딘, 항체, 혼성화), 또는 바이오마커 검출에 대해 기타 알려진 방식을 비롯한 다양한 방식을 사용하여 바이오마커를 검출할 수 있다. 일부 구체예들에서, 바이오마커는 탐지가능한 모이어티 (가령, 외생적으로 추가된 탐지가능한 모이어티) 이를 테면, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 상기 형태에 따른 테그가 내포된 항체, 또는 효소 (가령, 루시퍼라제, β-gal)의 결합을 통하여 검출될 수 있다.

응용 및 추가 측면들

당업자는 본원에 기재된 방법이 유전자 요법을 포함하는 다양한 적용에 유용할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 방법은 원하는 또는 "정상적인" 발현 수준에 비해 페이로드가 과대 또는 과소 발현되는지 여부를 평가하는 데 유용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 설명된 방법은 유전자 요법에 대한 잠재적인 부작용 (가령, 유해한 면역 반응, 예를 들면 항-약물 항체 및/또는 사이토킨 폭풍의 발생)을 예측하거나 특성화하는 데 사용할 수 있고, 따라서 잠재적으로 부작용의 개입 및/또는 완화를 허용한다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 질환, 장애 또는 병태 중 임의의 것에 적용가능하다. 비-제한적 예로써, 일부 구체예들은 그중에서도 치료 과정 또는 산증/아카데미아(academia)(예: 메틸말론산 아카데미아), 요소 순환 장애, 혈우병, 크리글러-나자르병(Crigler-Najjar), 급성 간 포르피린증, 유전성 ATTR 아밀로이드증 및/또는 알파-1 항트립신 결핍(A1ATD)의 매개변수를 모니터링하는 데 유용할 수 있다.

다양한 구체예들에 따르면, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 유전자 요법 섭생과 양립가능한 것으로 간주된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 대상체는 단일 용량의 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 다수 용량 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상)의 하나 또는 그 이상의 유전자 요법 처치 및/또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다.

추가적으로, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 요법 처치(들) 후 다양한 임의의 시간 (가령, 해당 대상체가 유전자 요법을 받은 후 몇시간, 몇일, 몇주 또는 몇달)에 적용가능한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 시점에서 수행된다. 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 다수의 시점에서 수행된다. 일부 구체예들에서, 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 적어도 3 개월 기간에 걸쳐 (가령, 여러차례) 수행된다.

놀랍게도, 유전자 요법을 제공받게 되는 생애 다양한 단계에 있는 대상체에게 유익한 점 (가령, 치료요법의 모니터링 및/또는 조정을 용이하게)을 제공할 수 있고, 그리고 일부 구체예들에서, 제공된 방법은 대상체가 삶의 단계들 사이의 전환기에 있을 때 사용될 수도 있음이 밝혀졌다. 일부 구체예들에서, 대상체는 유아 시기에 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 성인이 되기 전 (가령, 어린이 시기), 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다. 일부 구체예들에서, 대상체는 성인일 때 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는다.

본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 요법의 적용을 필요로 하는 것에 추가하여, 각각 잠재적으로 교란 또는 복잡한 요인/병태를 갖는 다양한 대상체에 적용가능한 것으로 특히 고려된다. 또한, 일부 형태의 유전자 요법은 잠재적으로 문제 (가령, 자가면역 반응, 사이토킨 폭풍, 등)가 있는 반응을 일으킬 수 있다고, 알려져 있거나 또는 의심된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들은 해당 유전자 요법에 대한 자가면역 반응에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들은 해당 유전자 요법에 대해 비정상적인 사이토킨 반응 (가령, 사이토킨 폭풍)에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함한다.

본 명세서는 유전자 요법이 시기마다 조정될 필요가 있다 (가령, 강화시키거나 또는 억제시키거나)는 인식 또한 포괄하고 있으며, 다양한 구체예들이 그러한 조정의 필요성을 모니터링하고 및/또는 이러한 조정을 성공적으로 수행하는 데 유리하다는 것이 고려된다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들에서 상기 바이오마커의 수준이 해당 통합 유전자 요법의 치료요법적으로 유효량을 나타내는 것보다 낮은 경우라면, 해당 대상체에게 추가 처치 (가령, 활성화 제제)를 투여하는 것을 더 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, 일부 구체예들에서, 제공된 방법들에는 상기 바이오마커 수준이 페이로드의 최적 수준 또는 안전한 수준을 나타내는 수준을 초과하는 경우라면, 해당 대상체에게 유전자 요법 처치에 의해 운반되는 페이로드의 발현을 감소 또는 억제시키는 추가 처치 (가형, 비활성화 제제)를 투여하는 것을 더 포함한다.

구체예

실시예 1 : 바이오마커 및 페이로드 검출을 위한 예시적인 방법들

본 실시예는 본 명세서에 따라 바이오마커 및/또는 페이로드의 검출, 모니터링 및/또는 분석에 적용시킬 수 있는 예시적인 방법들을 설명한다. 실시예 2-7은 본원에서 기술하고 있는 방법 및 재료를 이용하였다.

게놈 DNA 통합 (INT) 분석: 긴 범위 qPCR

게놈 DNA (gDNA)는 Qiagen's DNeasy 키트를 이용하여 마우스의 냉동된 간 조직으로부터 단리되었다. 프라이머 F1/R1 (단계 1)를 이용하여 증폭된 긴-범위 PCR (LR-PCR) 산물을 SPRI 자성 비드를 이용하여 정제하였고, 프라이머 세트 F2/R2를 이용하여 이차(nested) qPCR (단계 2)에 이용하였다 (도 2). 5' 상동성 부문(arm)에서 관심 유전자(GOI)(~2.1Kb)까지 상류의 단편을 포괄하는 합성 dsDNA를 사용하여 표준 곡선을 생성했다. 표준은 샘플과 나란히 실행되었다. 정규화를 위한 로딩 대조군으로 Tfrc를 이용하였다.

에피좀 DNA 분석

게놈 DNA (gDNA)는 Qiagen's DNeasy 키트를 이용하여 마우스의 간으로부터 단리되었다. 에피좀 카피 수는 선형화된 에피좀 플라스미드로 구축된 표준 곡선을 이용하여 qPCR에 의해 결정되었다(도 3). 정규화를 위한 로딩 대조군으로 Tfrc를 이용하였다. 내생적 Alb 유전자와 프라이머의 교차-반응성으로 인해, 게놈에서 Alb의 2개 사본에 대해 분석의 검출 한계는 2이다.

융합된 mRNA 분석

마우스 간으로부터 Qiagen's RNeasy 키트를 이용하여 RNA를 단리시켰다. 융합된 mRNA 카피 수는 프라이머 세트 Fwd/R_F를 이용한 ddPCR에 의해 확인되었다 (도 4). 내생적 Alb 카피 수는 프라이머 세트 Fwd/R_E를 이용한 ddPCR을 통하여 결정되었고, 정규화(normalization)에 이용된다.

알부민-2A ELISA

혈장 내 알부민-2A는 캡쳐용 토끼 다클론성 항-2A 항체 및 검출용 HRP-라벨된 다클론성 양(sheep)의 항-알부민 항체(BioRad AHP102P)를 사용하여 화학발광 ELISA로 측정했다 (도 5A). 포유류 세포에서 발현되고, 친화력-정제된 재조합 마우스 알부민-2A를 사용하여 매트릭스 효과를 설명하기 위해 10% 대조군 마우스 혈장에서 표준 곡선을 구축하였다 (도 5B). 1%의 카세인(Thermo 37528)을 차단에 사용하고, 0.1%의 샘플 희석을 PBST에 사용했다.

알부민 ELISA

혈장 내 총 마우스 알부민은 캡쳐용으로 다중클론성 염소의 항-마우스 알부민 항체 (abcam ab19194)를 이용하고, 검출용으로 다중클론성 양(sheep)의 HRP-라벨된 항-알부민 항체 (BioRad AHP102P)를 이용하여 화학발광 ELISA로 측정했다. 마우스 알부민 표준은 Sigma (SLBX6058)에서 구입하였다. 1%의 카세인(Thermo 37528)을 차단에 사용하고, 0.1%의 샘플 희석을 PBST에 사용했다.

고-민감성 알부민-2A ELISA

원래의 알부민-2A ELISA 프로토콜을 최적화시켜, 분석의 감도를 개선하고 매트릭스 간섭을 최소화하였다. 전매성(proprietary) 재조합 토끼 단일클론성 항-2A 항체를 개발하였고, 이를 캡쳐용으로 이용하였으며, HRP-라벨된 다중클론성 염소 항-알부민 항체 (abcam ab19195)는 검출용으로 이용하였다 (도 5A). 포유류 세포에서 발현되고, 친화력-정제된 (순도 >95%) 재조합 마우스 알부민-2A을 표준으로 삼아, ≤1% 대조군 마우스 혈장 또는 혈청에서 표준 곡선을 구축하였다 (도 14). 1% 무-지방 분유로 구성된 완충액을 차단에 사용하고, 샘플을 PBST 중 1% BSA에 희석했다. 이 최적화된 프로토콜의 검출 하한은 <1ng/mL이다.

인간 Factor IX ELISA

혈장에서 인간 Factor IX는 캡쳐용 단일클론성 마우스 항-인간 Factor IX 항체 (Sigma F2645)을 이용하고, 검출용으로 염소 다중클론성 HRP-라벨된 항-인간 Factor IX 항체 (Affinity Biologicals GAFIX-APHRP)를 이용하여 화학발광 ELISA에 의해 측정되었다. 인간 Factor IX 표준은 abcam(ab62544)에서 구입했으며, 표준 곡선은 매트릭스 효과를 설명하기 위해 6% 대조군 마우스 혈장에서 구축되었다. 3%의 BSA를 차단에 사용하고, 1%의 샘플 희석을 PBST에 사용했다.

Cyno A1AT ELISA

혈장에서 Cyno A1AT는 캡쳐용으로 염소 다중클론성 항-A1AT 항체 (MP Biomedical 55030)를 이용하고, 검출용으로 다중클론성 HRP-라벨된 항-A1AT 항체 (abcam ab8768)를 이용하여 화학발광 ELISA에 의해 측정되었다. 포유류 세포에서 발현된 재조합 cyno A1AT를 사용하여 매트릭스 효과를 설명하기 위해 10% 대조군 마우스 혈장에서 표준 곡선을 구축하였다. 3%의 BSA를 차단에 사용하고, 1%의 샘플 희석을 PBST에 사용했다.

MUT Western 블랏

MP Biomedicals Lysing Matrix D (#116913050)를 이용하여 2 라운드의 비드 비팅 (라운드 당 3500 rpm에서 20초간)과 함께, Roche 미니-태블릿 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된, 0.5% Igepal-630, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) 용해 완충액에서 냉동된 간 조직 (~60 mg)을 균질화시켰다. 간 용해물은 원심분리에 의해 정화되었고, 총 단백질은 BCA 분석에 의해 정량화되었다. 용해물 (6 μg/라인)을 Trans-Turbo Blot 시스템(Bio-Rad)의 니트로셀룰로오스 막으로 옮기기 전, MES 완충액을 사용하여 4-12% NuPAGE BisTris midi-hel(Life Technologies)에서 분해시켰다. LI-COR ODyssey 차단 완충액에서 차단시킨 후, 막을 (a) 토끼 단일클론성 항-MUT 항체 (abcam ab14128) 또는 (b) 토끼 다중클론성 항-2A 항체 (전매성) 및 마우스 다중클론성 항-알부민 (abcam ab19194)과 함께 항온처리하였다. 이차 항체 (항-토끼 IRDye800CW 및 항-마우스 IRDye680CT)와 함께 항온처리 후, LI-COR Odyssey 시스템에서 블랏을 스캔하였고, ImageStudio 소프트웨어로 이미지를 분석하였다.

전이유전자 및 벡터

인간 Factor IX 전이유전자: 5'-단부에 P2A 코딩 서열을 갖는 코돈 최적화된 인간 F9 cDNA는 Alb 중지 코돈에서 상류 상동성 부문 1.3Kb, 그리고 하류 1.4Kb의 측면에 있다 (서열 식별 번호: 3).

인간 메틸말로닐-CoA 뮤타제 전이유전자: 5'-단부에 P2A 코딩 서열을 갖는 코돈 최적화된 인간 MUT cDNA는 Alb 중지 코돈에서 상류 상동성 부문 1Kb, 그리고 하류 1Kb의 측면에 있다 (서열 식별 번호: 4).

마우스 메틸말로닐-CoA 뮤타제 전이유전자: 5'-단부에 P2A 코딩 서열을 갖는 마우스 MUT cDNA는 Alb 중지 코돈에서 상류 상동성 부문 1Kb, 그리고 하류 1Kb의 측면에 있다 (서열 식별 번호: 5).

시노몰구스 알파-1-항트립신 (cyno-A1AT) 전이유전자: 5'-단부에 P2A 코딩 서열을 갖는 코돈 최적화된 시노몰구스 SERPINA1 cDNA는 Alb 중지 코돈에서 상류 및 하류 상동성 부문 1Kb (서열 식별 번호: 6) 또는 750bp (서열 식별 번호: 7)의 측면에 있다.

벡터 준비: rAAV 생산을 위한 모든 플라스미드는 Qiagen's EndoFree Plasmid Gigaprep 키트를 사용하여 준비되었다.

부착성 HEK-293 세포에서 삼중 형질감염을 사용하고, hF9 및 MUT에 대한 CsCl 구배 정제, 그리고 현탁액 HEK-293F 세포에서 삼중 형질감염을 사용하고, cyno-A1AT에 대한 요오딕사놀 구배가 뒤따르는 친화성 정제에 의해 DJ 벡터를 연구 등급 규모로 생성시켰다. 물리적 역가는 qPCR에 의해 정량화되었다.

생체내 연구

모든 동물 절차는 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침에 따라 수행되었다.

C57BL/6 및 FvB/NJ 마우스는 신생 마우스 (p2) 및 소아기 마우스(p21) 주사를 위한 자손을 생산하기 위한 번식 쌍으로 사용하기 위해 잭슨 연구소에서 구입했다. 2-일령의 마우스에게 ~10 μL의 벡터를 1e13 또는 1e14 vg/kg의 최종 용량으로, 또는 비히클 그룹의 경우 PBS를 안면 정맥을 통하여 정맥(i.v.)으로 주사하였다. 21-일령의 마우스에게 ~100 μL의 벡터를 1e13 또는 1e14 vg/kg의 최종 용량으로, 또는 비히클 그룹의 경우 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 i.v.로 주사하였다. 성체 (>6-주령) 마우스에게 ~200 μL의 벡터를 1e13 또는 1e14 vg/kg의 최종 용량으로, 또는 비히클 그룹의 경우 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 i.v.로 주사하였다. 동물 체중을 매주 모니터링했다. 살아있는 상태에서 채혈은 뺨-출혈에 의해 수행되었고, 말단 출혈은 심장 천자로 수행되었고, p7 동물은 참수되었다. 수거 시, 마우스를 CO₂ 흡입으로 안락사시키고, 간을 수집하고, 절편화하고, 바로 급속-냉동시켰다.

Dr. Charles Venditti (National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health)로부터 MUT 마우스 모델 (Mut ^-/-;Tg^INS-MCK-Mut)를 구하였다. 신생 마우스 (p1-2)에게 ~10 μL의 hMUT-DJ벡터를 1e13, 3e13 또는 1e14 vg/kg의 최종 용량으로, 또는 비히클 그룹의 경우 PBS를 안면 정맥을 통하여 i.v.로 주사하였다.

실시예 2 : 에피좀 DNA의 검출

본 실시예는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 에피솜 DNA를 검출하고 분석하는 적용을 입증한다.

신생 마우스에게 내생적 알부민 표적 부위에 통합되도록 설계된 P2A 코딩 서열 및 인간 Factor IX 전이유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하였다 (실시예 1에서 기술된 인간 Factor IX 전이유전자 설명부분 참고).

에피좀 카피 수가 시간 경과에 따라 기하급수적으로 감수되었다 (도 6A). 간 성장 (p7에서 0.15 g로부터 8-주령시 1 g로)에 따라 에피좀 카피의 감소가 관찰되었다 (도 6B). 시간이 지남에 따라 세포당 에피좀 카피의 감소함에도 불구하고, GeneRide™를 사용하여 달성한 것과 같이, 첫 주 이내에 게놈으로 전이유전자가 안정적으로 통합된 후 예상되는 전이유전자 발현이 높게 유지되었다 (가령, 도 7A 및 도 8A 참고).

이 데이터는 세포당 에피좀 DNA가 간의 성장에 따른 시간 경과에 따라 감소한다는 것을 보여준다. 이 데이터는 동물의 성장과 발달이 높은 역가의 AAV(여기서는 1e14 vg/kg)를 투여해도 영향을 받지 않는다는 것을 추가로 보여준다(도 6B-6C). 이들 데이터는 또한 생체내 전달된 바이러스 벡터의 에피좀 카피 수가 투여 및 조직 성장에 대한 가늠자가 될 수 있음을 입증한다. 특히, 에피솜 카피 수는 동물이 노출된 용량에 비례한다. 예를 들면, 만약 동물이 잘못 투여된 경우(신생 마우스에게 i.v.로 주사할 때 발생할 수 있음), 해당 동물의 에피좀 카피는 완전히 투여된 동물보다 훨씬 낮아질 것이다.

실시예 3 : 혈장내 ALB-2A 검출 및 내생적 알부민 발현에서의 변화와의 상관관계

본 실시예는 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 요소의 생체내 운반 후, 2A-펩티드-테그된 알부민의 검출 및 모니터링을 실증한다. 본 실시예는 혈장 내 ALB-2A 수준의 변화가 내생성 알부민 발현의 변화와 연관될 수 있음을 또한 입증한다.

신생 마우스에게 실시예 2에서 기술된 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하였다. 게놈 통합은 빠르면 주사 1주 후에 감지할 수 있으며, 2주 후에는 이미 안정기에 도달했다 (도 7A). 순환계에서 ALB-2A는 처음 3-4주 동안 증가하고, 그 이후 안정화된다 (도 7B). 혈장 ALB-2A의 관찰된 증가는 출생 후 내생성 알부민의 기하급수적인 증가와 관련되어 있다. (도 7C 및 도 7D).

이들 데이터에서 본 명세서에 따라 이용된 방법으로 혈장내 ALB-2A의 검출 및/또는 분석이 가능하며, 혈장내 ALB-2A의 검출 및/또는 분석은 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산의 생체내 전단 후 상대적으로 일찍(가령 1주일 이내) 이루어질 수 있음이 증명된다. 이들 데이터에서 혈장내 ALB-2A의 수준은 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 요소의 최초 전달 후 여러 시간 간격에서 모니터링이 가능하며, 혈장내 ALB-2A 수준은 상기 2A 펩티드의 통합을 위한 표적 부위 (가령, 알부민 표적 부위)에 인코딩된 내생적 폴리펩티드 수준의 변화와 관련됨을 추가로 실증한다.

실시예 4 : 바이오마커 및 페이로드의 조기 검출 및 분석

본 실시예에서는 본 명세서에 따른 방법은 페이로드를 인코딩하는 핵산 및 바이오마커를 인코딩하는 핵산의 생체내 전달 후, 조기에 페이로드의 생체내 검출 및 분석이 허용된다는 것을 실증한다. 본 실시예는 페이로드 발현의 역학이 바이오마커 발현의 역학과 유사하게 나타난다는 것을 또한 입증한다.

신생 마우스에게 실시예 2에서 기술된 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하였다. 통합된 전이유전자로부터 발현되는 인간 Factor IX의 혈장 수준은 ALB-2A에 대한 초기 역학과 매우 유사하게 나타난다 (차례로 도 8A-8B). 혈장에서의 ALB-2A 역학에 유사하게, 출생 후 내생적 알부민이 증가될 때, Factor IX 수준도 증가하였다.

이들 데이터에서 페이로드 (가령, Factor IX)의 발현은 바이러스 벡터의 전달 후 상대적으로 일찍 (가령, 1 주 이내)에 검출되고 및/또는 분석될 수 있음을 입증한다. 이들 데이터는 페이로드 (가령, 2A 펩티드)의 최초 전달 후 여러 시간 간격에서 해당 페이로드와 함께 전달된 바이오마커의 혈장 수준의 역학과 매우 유사한 발현 역학을 또한 입증한다.

실시예 5 : 통합 효율, 혈장 ALB-2A 및 전이유전자는 투약 시점의 동물 연령에 영향을 받지 않는다.

본 실시예는 본 명세서 따라 이용된 방법이 매우 어린 (예를 들어, 유아) 발달 단계 및 성체 전 단계를 포함하여, 이러한 치료를 받는 대상체의 상이한 연령에서 투여되는 유전자 치료 치료에 적용될 수 있음을 입증한다. 본 실시예는 본원에 기술된 방법이 성장이 낮거나 또는 높은 조직으로 전달되는 유전자 요법의 분석에 적용될 수 있음을 추가로 입증한다.

신생 (p2) 마우스 또는 어린 (p21) 마우스에게 실시예 2에 기재된 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하고, 주사-후 8주에 수거하였다. 테스트된 투여 당시 연령에 관계 없이, 혈장내 ALB-2A 및 인간 Factor IX (차례로 도 9A 및 9B) 뿐만 아니라 2A 바이오마커의 RNA 통합(도 9C)로 용이하게 검출가능하다. 게놈 DNA의 통합 효율은 투여를 받는 시점의 동물 연령에 따라 크게 영향을 받지 않는다 (도 9D). 주사-후 8주 시점에서 에피좀 카피 수는 p21에서 투여된 동물에서 여전히 높으며 (도 9E), 이는 어린 동물에서 간 성장이 더 낮다는 점에 상응할 것이다.

이들 데이터는 바이오마커 (가령, 2A) 및 페이로드 (가령, Factor IX) 발현은 상이한 발생 단계 (대상체의 다양한 연령에서, 및/또는 조직-지정 전달의 경우 조직의 상이한 성장 단계를 포함)에 있는 대상체에게 전술한 바이오마커 및 페이로드를 전달한 후 검출 및/또는 분석될 수 있다. 본 실시예에서 2A 및 페이로드를 간으로 전달하기 위한 DJ 벡터 표적화된 핵산이 이용된다.

실시예 6 : 상이한 연령의 투여에 있어서 페이로드 수준에 대한 가늠자로써 바이오마커 수준

본 실시예는 본 명세서에 따라 이용된 방법들이 페이로드 수준에 대한 가늠자로써 바이오마커의 검출 및 분석을 가능하게 함을 실증한다. 본 실시예는 페이로드 및 바이오마커 전달에 있어서 다양한 연령대의 대상체에서 바이오마커를 가늠자로 사용하여 실행될 수 있음을 또한 보여준다.

신생 마우스 (p2), 어린 마우스 (p21) 또는 성체 마우스 (p42 및 p63)에게 실시예 2에 기재된 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하고, 주사-후 4주에 수거하였다. 비히클 처치와 비교하였을 때, 테스트된 각 연령 그룹에서 혈장에서 ALB-2A (도 10A) 및 인간 Factor IX (도 10B)의 즉시 검출이 관찰되었다. ALB-2A의 상대적 수준은 테스트된 연령 그룹중에서 인간 Factor IX 수준을 나타낸다 (도 10C).

이들 데이터는 바이오마커 (가령, ALB-2A)는 페이로드 (가령, Factor IX) 발현을 나타냄을 실증한다. 이들 데이터는 바이오마커의 검출 및 분석이 대상체에게 전달되는 페이로드 수준에 대한 가늠자로서 유용할 수 있음을 추가로 설명한다. 더욱이, 페이로드 수준에 대한 가늠자로써 바이오마커 수준의 이러한 측정은 다양한 연령 그룹의 대상체들에게 전달되는 페이로드 분석에 유용할 수 있다.

실시예 7 : 벡터 기획에서의 변화에서 페이로드 수준에 대한 가늠자로써 바이오마커 수준이 관찰된다.

신생 마우스에게 P2A 코딩 서열, 시노몰구스 SERPINA1 cDNA, 그리고 내생적 알부민 표적 부위에 통합되도록 기획된 1Kb 또는 750bp의 상동성 부문(arms)을 포함하는 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하였다 (실시예 1에서 기술된 시노몰구스 알파-1-항트립신 (cyno-A1AT) 전이유전자). 주사-후 6주 시점에 동물을 수거하였다. ALB-2A의 혈장 수준 (도 11A)은 750bp 및 1Kb 둘 모두의 상동성 부문(arms)을 포함하는 바이러스 벡터로 전달 후 검출되었다. 통합된 전이유전자로부터 발현된 시노몰구스 A1AT의 수준은 테스트된 상동성 부문 두 세트 모두에서 바로 탐지가능하였다 (도 11B). ALB-2A의 상대적 수준은 시노몰구스 A1AT 수준을 나타내었다 (도 11C).

실시예 8 : 세포-내재적 페이로드의 통합 및 발현에 대한 가늠자로써 혈장 바이오마커 수준

Mut ^-/-;Tg^INS-MCK-Mut 마우스 (본원에서 MCK-Mut로 지칭됨)라고 지칭된 MMA 뮤린 모델이 본 실시예에서 이용되었다. 이 마우스 모델에서, 마우스 Mut 유전자의 기능적 복제는 근육 세포에서 Mut 발현을 가능하게 하는 크레아틴 키나제 프로모터의 제어 하에 있다. 신생 MCK-Mut 마우스 (p2)에게 P2A 코딩 서열 및 코돈 최적화된 인간 MUT cDNA (실시예 1에서 기술된 인간 메틸말로닐-CoA 뮤타제 전이유전자 참고)를 포함하는 바이러스 벡터를 상이한 용량으로 i.v.로 주사하였다. 3개월 기간에 걸쳐 동물을 수거하였다. 혈장 ALB-2A 및 간에서 게놈 통합이 바로 탐지가능하였다 (도 12A). 간과 혈장에서 ALB-2A의 상대적 수준은 간에서 MUT 단백질 수준을 나타내었다 (도 12B).

이들 데이터는 본 명세서에 따라 이용된 방법은 세포-내재적 페이로드 (가령, MUT)의 발현을 허용하고, 이의 발현은 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드 유전자 (가령, ALB-2A)에 융합된 탐지가능한 모이어티의 발현을 검출하고, 이를 분석함으로써 평가될 수 있다. 이들 데이터에서는 세포-내재적 페이로드 (가령, MUT) 발현에서의 변화는 탐지가능한 모이어티 (가령, 2A 펩티드)의 혈장 수준에서의 유사한 변화에 반영될 수 있고, 이러한 탐지가능한 모이어티의 혈장 수준 검출이 세포-내재적 페이로드 검출의 가늠자로 작용할 수 있음을 추가로 실증한다. 추가적으로, 이들 데이터는 세포-내재적 페이로드 자체 검출 (가령, 간 생검을 통하여)없이, 실-시간으로 세포-내재적 페이로드의 수준을 모니터하는 능력을 실증한다.

실시예 9 : 시간 경과에 따라 페이로드 수준 변화에 대한 가늠자로써 바이오마커 수준

신생 MUT-MCK 마우스 (p2)에게 1e14vg/kg의 DJ-hMUT를 i.v.로 주사하였고, 7 개월의 기간에 걸쳐 수거하였다. GeneRide에 의해 편집된 간세포는 기능적 MUT를 발현하여 Mut ^-/- 내생적 간세포에 비해 선택적 성장 이점을 제공한다. 결과적으로, 유전자 편집 집단이 예상되며, 더 빨리 성장하는 것으로 관찰된다. 이러한 확장은 전이유전자 뿐만 아니라 ALB-2A (도 13A-도 13B)의 증가된 수준으로 탐지될 수 있다.

이들 데이터는 페이로드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 단백질의 야생형 발현이 결여된 조직에서 단일 용량 전달 후 페이로드의 수준이 시간이 지남에 따라 증가할 수 있음을 예증한다. 이들 데이터는 바이오마커의 수준 증가는 페이로드 수준의 증가를 따른다 것을 추가로 입증한다. 당업자는 본 명세서에 개시된 방법을 적용하여 세포내 페이로드 (예를 들어, MUT)의 발현에 대한 가늠자로서 ALB-2A와 같은 혈장 바이오마커를 검출 및 분석할 수 있을 것이다.

실시예 10 : 장기적 바이오마커 및 페이로드 검출 및 분석

본 실시예에서는 본 명세서에 따른 방법은 페이로드를 인코딩하는 핵산 및 바이오마커를 인코딩하는 핵산의 생체내 전달 후, 페이로드 발현의 생체내 연장된 평가가 허용된다는 것을 실증한다. 본 실시예는 페이로드 발현의 역학이 바이오마커 발현의 역학과 유사하게 나타난다는 분석의 확증을 또한 설명한다.

성체 마우스에게 실시예 2에서 기술된 바이러스 벡터를 i.v.로 주사하였다. 통합된 전이유전자로부터 발현되는 인간 Factor IX의 혈장 수준은 1주차 내지 16주차까지 ALB-2A에 대한 초기 역학과 매우 유사하게 나타나는데 (도 15A-15B), 정상 상태에 도달할 때까지 주사 후 첫 몇 주 이내에 급격히 증가한다.

이들 데이터에서 페이로드 (가령, Factor IX)의 발현은 바이러스 벡터를 통한 전달 후 연장된 기간 (가령, 최대 16주까지)에 걸쳐 평가될 수 있음을 입증한다. 중요한 것은, 이들 데이터는 페이로드 (가령, 2A 펩티드)의 최초 전달 후 여러 시간 간격에서 해당 페이로드와 함께 전달된 바이오마커의 혈장 수준의 역학과 매우 유사한 발현 역학을 또한 실증한다.

실시예 11 : 용량-의존적 바이오마커, gDNA, 및 페이로드 검출과 분석

본 실시예에서는 본 명세서에 따른 방법은 페이로드를 인코딩하는 핵산 및 바이오마커를 인코딩하는 핵산의 생체내 전달 후, 페이로드의 용량-의존적 생체내 검출 및 분석이 허용된다는 것을 실증한다.

이들 데이터는 본 명세서에 따라 이용된 방법은 페이로드, 여기에서 세포-내재적 페이로드 (가령, MUT) 또는 분비된 페이로드 (가령, cA1AT)의 용량-의존적 발현을 허용하고, 이의 발현은 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드 유전자 (가령, ALB-2A)에 융합된 탐지가능한 모이어티의 발현을 검출하고, 이를 분석함으로써 평가될 수 있다. 이들 데이터에서는 분비된 페이로드 (가령, cA1AT) 발현에서의 용량-의존적 변화는 탐지가능한 모이어티 (가령, 2A 펩티드)의 혈장 수준에서의 유사한 변화에 반영될 수 있고, 이러한 탐지가능한 모이어티의 혈장 수준 검출이 분비된 페이로드 검출의 가늠자로 작용할 수 있음을 추가로 실증한다. (도 16A-C). 추가적으로, 이들 데이터는 세포-내재적 페이로드에 대한 게놈 통합 수준은 탐지가능한 모이어티의 혈장 수준에서 유사한 변화와 또한 관련될 수 있음을 실증한다 (도 17A-C).

균등물 및 범위

당업계 숙련자는 일반적인 실험만을 통하여 본 명세서에서 설명된 발명의 특정 구체예들에 대등한 다수의 등가물을 인지할 수 있거나, 또는 알아낼 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 제한되지 않으며, 그보다는 첨부한 청구범위에 제시된 바와 같다.

SEQUENCE LISTING <110> LogicBio Therapeutics, Inc. <120> MONITORING GENE THERAPY <130> 2012538-0082 <150> 62/833875 <151> 2019-04-15 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 gccaccaact tcagcctgct gaaacaggcc ggcgacgtgg aagagaaccc tggcccc 57 <210> 3 <211> 4172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 aggttcgaac cctgctgaag ggagaggttc caatactaca aaatgtagcg ggatattgtc 60 atcacctttg gggacatgtc atcatggtcc ccagacagag ttacaaaact catcccctac 120 acagcactat gtctctggta ctgtttgttc tacagatgtc aacaacagag gcccagccat 180 ctcctattgc ttggcttgtc agtctttcta gcctccccat tattaatttc aaatggggca 240 ggtgttagga gggcaaaaat ccacatatta agtgcaaagc ctttcaggag atttcctgaa 300 actagacaaa acccgtgtga ctggcatcga 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 ctgaaactag acaaaacccg tgtgactggc atcgattatt ctatttgatc tagctagtcc 60 tagcaaagtg acaactgcta ctcccctcct acacagccaa gattcctaag ttggcagtgg 120 catgcttaat cctcaaagcc aaagttactt ggctccaaga tttatagcct taaactgtgg 180 cctcacattc cttcctatct tactttcctg cactggggta aatgtctcct tgctcttctt 240 gctttctgtc ctactgcagg gctcttgctg agctggtgaa gcacaagccc aaggctacag 300 cggagcaact gaagactgtc atggatgact ttgcacagtt cctggataca tgttgcaagg 360 ctgctgacaa ggacacctgc ttctcgactg aggtcagaaa cgtttttgca ttttgacgat 420 gttcagtttc cattttctgt gcacgtggtc aggtgtagct ctctggaact cacacactga 480 ataactccac caatctagat gttgttctct acgtaactgt aatagaaact gacttacgta 540 gcttttaatt tttattttct gccacactgc tgcctattaa atacctatta tcactatttg 600 gtttcaaatt tgtgacacag aagagcatag ttagaaatac ttgcaaagcc tagaatcatg 660 aactcattta aaccttgccc tgaaatgttt ctttttgaat tgagttattt tacacatgaa 720 tggacagtta ccattatata tctgaatcat ttcacattcc ctcccatggc ctaacaacag 780 tttatcttct tattttgggc acaacagatg tcagagagcc tgctttagga attctaagta 840 gaactgtaat taagcaatgc aaggcacgta cgtttactat gtcattgcct atggctatga 900 agtgcaaatc ctaacagtcc tgctaatact tttctaacat ccatcatttc tttgttttca 960 gggtccaaac cttgtcacta gatgcaaaga cgccttagcc ggcagcggcg ccaccaactt 1020 cagcctgctg aaacaggccg gcgacgtgga agagaaccct ggcccctctt ctgtctcatg 1080 gggcgtcctc ctgctggctg gcctgtgctg cctgctcccc ggctctctgg ctgaggatcc 1140 ccagggagat gctgcccaaa aaacggatac atccctccat gatcaagacc acccaaccct 1200 caacaagatc acccccagcc tggctgagtt cggcttcagc ctataccgcc agctggcaca 1260 ccagtccaac agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc atcgctacag cctttgcaat 1320 gctctccctg gggaccaagg ctgacactca cagtgaaatc ctggagggcc tgaatttcaa 1380 cgtcacggag attccggagg ctcaggtcca tgaaggcttc caggaactcc tccataccct 1440 caacaagcca gacagccagc tccagctgac caccggcaac ggcctgttcc tcaacaagtc 1500 actcaaagta gtggataagt ttttggagga tgtcaaaaaa ctgtaccact cagaagcctt 1560 ctctgtcaac tttgaggaca ccgaagaggc caagaaacag atcaacaatt acgtggagaa 1620 ggaaactcaa gggaaaattg tggatttggt caaggagctt gacagagaca cagtttttgc 1680 tctggtgaat tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga ccctttgacg ttgaggccac 1740 caaggaagag gacttccacg tggaccaggc gaccaccgtg aaggtgccca tgatgaggcg 1800 tttaggcatg tttaacatct accactgtga gaagctgtcc agctgggtgc tgctgatgaa 1860 atacctgggc aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat gaggggaaac tgcagcacct 1920 ggaaaatgaa ctcacccatg atatcatcac caagttcctg gaaaatgaaa acagcaggtc 1980 tgccaactta catttaccca gactggccat tactggaacc tatgatctga agacagtcct 2040 gggccacctg ggtatcacta aggtcttcag caatggggct gacctctcag ggatcacgga 2100 ggaggcaccc ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct gtgctgacca tcgatgagaa 2160 agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccata cccatgtcta ttccccccga 2220 ggtcaagttc aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa caaaatacca agtctcccct 2280 cttcatggga aaagtggtga atcccaccca gaaagagcag aagctgatca gcgaggagga 2340 cctgtaaaca catcacaacc acaaccttct caggtaacta tacttgggac ttaaaaaaca 2400 taatcataat catttttcct aaaacgatca agactgataa ccatttgaca agagccatac 2460 agacaagcac cagctggcac tcttaggtct tcacgtatgg tcatcagttt gggttccatt 2520 tgtagataag aaactgaaca tataaaggtc taggttaatg caatttacac aaaaggagac 2580 caaaccaggg agagaaggaa ccaaaattaa aaattcaaac cagagcaaag gagttagccc 2640 tggttttgct ctgacttaca tgaaccacta tgtggagtcc tccatgttag cctagtcaag 2700 cttatcctct ggatgaagtt gaaaccatat gaaggaatat ttggggggtg ggtcaaaaca 2760 gttgtgtatc aatgattcca tgtggtttga cccaatcatt ctgtgaatcc atttcaacag 2820 aagatacaac gggttctgtt tcataataag tgatccactt ccaaatttct gatgtgcccc 2880 atgctaagct ttaacagaat ttatcttctt atgacaaagc agcctccttt gaaaatatag 2940 ccaactgcac acagctatgt tgatcaattt tgtttataat cttgcagaag agaatttttt 3000 aaaatagggc aataatggaa ggctttggca aaaaaattgt ttctccatat gaaaacaaaa 3060 aacttatttt tttattcaag caaagaacct atagacataa ggctatttca aaattatttc 3120 agttttagaa agaattgaaa gttttgtagc attctgagaa gacagctttc atttgtaatc 3180 ataggtaata tgtaggtcct cagaaatggt gagacccctg actttgacac ttggggactc 3240 tgagggacca gtgatgaaga gggcacaact tatatcacac atgcacgagt tggggtgaga 3300 gggtgtcaca acatctatca gtgtgtcatc tgcccaccaa gtaa 3344 <210> 7 <211> 2844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 ctactgcagg gctcttgctg agctggtgaa gcacaagccc aaggctacag cggagcaact 60 gaagactgtc atggatgact ttgcacagtt cctggataca tgttgcaagg ctgctgacaa 120 ggacacctgc ttctcgactg aggtcagaaa cgtttttgca ttttgacgat gttcagtttc 180 cattttctgt gcacgtggtc aggtgtagct ctctggaact cacacactga ataactccac 240 caatctagat gttgttctct acgtaactgt aatagaaact gacttacgta gcttttaatt 300 tttattttct gccacactgc tgcctattaa atacctatta tcactatttg gtttcaaatt 360 tgtgacacag aagagcatag ttagaaatac ttgcaaagcc tagaatcatg aactcattta 420 aaccttgccc tgaaatgttt ctttttgaat tgagttattt tacacatgaa tggacagtta 480 ccattatata tctgaatcat ttcacattcc ctcccatggc ctaacaacag tttatcttct 540 tattttgggc acaacagatg tcagagagcc tgctttagga attctaagta gaactgtaat 600 taagcaatgc aaggcacgta cgtttactat gtcattgcct atggctatga agtgcaaatc 660 ctaacagtcc tgctaatact tttctaacat ccatcatttc tttgttttca gggtccaaac 720 cttgtcacta gatgcaaaga cgccttagcc ggcagcggcg ccaccaactt cagcctgctg 780 aaacaggccg gcgacgtgga agagaaccct ggcccctctt ctgtctcatg gggcgtcctc 840 ctgctggctg gcctgtgctg cctgctcccc ggctctctgg ctgaggatcc ccagggagat 900 gctgcccaaa aaacggatac atccctccat gatcaagacc acccaaccct caacaagatc 960 acccccagcc tggctgagtt cggcttcagc ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac 1020 agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc atcgctacag cctttgcaat gctctccctg 1080 gggaccaagg ctgacactca cagtgaaatc ctggagggcc tgaatttcaa cgtcacggag 1140 attccggagg ctcaggtcca tgaaggcttc caggaactcc tccataccct caacaagcca 1200 gacagccagc tccagctgac caccggcaac ggcctgttcc tcaacaagtc actcaaagta 1260 gtggataagt ttttggagga tgtcaaaaaa ctgtaccact cagaagcctt ctctgtcaac 1320 tttgaggaca ccgaagaggc caagaaacag atcaacaatt acgtggagaa ggaaactcaa 1380 gggaaaattg tggatttggt caaggagctt gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat 1440 tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga ccctttgacg ttgaggccac caaggaagag 1500 gacttccacg tggaccaggc gaccaccgtg aaggtgccca tgatgaggcg tttaggcatg 1560 tttaacatct accactgtga gaagctgtcc agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc 1620 aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat gaggggaaac tgcagcacct ggaaaatgaa 1680 ctcacccatg atatcatcac caagttcctg gaaaatgaaa acagcaggtc tgccaactta 1740 catttaccca gactggccat tactggaacc tatgatctga agacagtcct gggccacctg 1800 ggtatcacta aggtcttcag caatggggct gacctctcag ggatcacgga ggaggcaccc 1860 ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct gtgctgacca tcgatgagaa agggactgaa 1920 gctgctgggg ccatgttttt agaggccata cccatgtcta ttccccccga ggtcaagttc 1980 aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa caaaatacca agtctcccct cttcatggga 2040 aaagtggtga atcccaccca gaaagagcag aagctgatca gcgaggagga cctgtaaaca 2100 catcacaacc acaaccttct caggtaacta tacttgggac ttaaaaaaca taatcataat 2160 catttttcct aaaacgatca agactgataa ccatttgaca agagccatac agacaagcac 2220 cagctggcac tcttaggtct tcacgtatgg tcatcagttt gggttccatt tgtagataag 2280 aaactgaaca tataaaggtc taggttaatg caatttacac aaaaggagac caaaccaggg 2340 agagaaggaa ccaaaattaa aaattcaaac cagagcaaag gagttagccc tggttttgct 2400 ctgacttaca tgaaccacta tgtggagtcc tccatgttag cctagtcaag cttatcctct 2460 ggatgaagtt gaaaccatat gaaggaatat ttggggggtg ggtcaaaaca gttgtgtatc 2520 aatgattcca tgtggtttga cccaatcatt ctgtgaatcc atttcaacag aagatacaac 2580 gggttctgtt tcataataag tgatccactt ccaaatttct gatgtgcccc atgctaagct 2640 ttaacagaat ttatcttctt atgacaaagc agcctccttt gaaaatatag ccaactgcac 2700 acagctatgt tgatcaattt tgtttataat cttgcagaag agaatttttt aaaatagggc 2760 aataatggaa ggctttggca aaaaaattgt ttctccatat gaaaacaaaa aacttatttt 2820 tttattcaag caaagaacct atag 2844

Claims (50)

1. 유전자 요법을 모니터링하는, 다음 단계들을 포함하는 방법:
   통합 유전자 요법 처치를 제공받은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에 해당 유전자 요법 처치의 상태에 대한 하나 또는 그 이상의 특징을 대신하여 나타내는 대체자로써 해당 통합 유전자 요법 처치의 통합에 의해 생성된 바이오마커의 수준 또는 활성을 탐지하는 단계가 내포되며, 이때 해당 유전자 요법 처치의 상태에 대한 하나 또는 그 이상의 특징은 페이로드 수준, 페이로드 활성, 세포 집단에서 유전자 요법 처치 통합 수준, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
2. 페이로드를 운반하는 유전자-통합 조성물을 제공받았던 대상체에서 해당 페이로드 활성의 운반, 수준 및/또는 활성을 모니터링하는, 다음 단계들을 포함하는 방법:
   상기 유전자-통합 조성물의 통합에 의해 생성되고, 해당 페이로드의 운반, 이의 수준 및/또는 활성을 대신 나타내는 대체자(surrogate)로써의 바이오마커를 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에서 검출하는 단계가 내포된다.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 이때 상기 페이로드는 세포내에서 발현되는 펩티드이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 이때 상기 페이로드는 세포외로 분비되는 펩티드이거나, 또는 이런 펩티드를 포함하는, 방법.
5. 청구항 1-4중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 페이로드는 의학적 병태를 치료하기 위한 생물학적 과정을 촉진하는 세포-내재적 활성 또는 세포-외인적 활성을 갖는 펩티드이거나, 또는 이런 펩티드를 포함하는, 방법.
6. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 페이로드는 간 세포에서 정상적으로 발현되는 펩티드이거나, 또는 이런 펩티드를 포함하는, 방법.
7. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 페이로드는 간 세포에서 이소성적으로(ectopically) 발현되는 펩티드이거나, 또는 이런 펩티드를 포함하는, 방법.
8. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 페이로드는 메틸말로닐-CoA 뮤타제 또는 인간 Factor IX이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
9. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 통합 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물은 해당 대상체의 게놈 상의 표적 부위로 상기 페이로드를 인코드하는 서열을 포함하는 핵산 요소를 통합시키는, 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 이때 해당 표적 부위는 폴리펩티드를 인코드하는, 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 이때 상기 핵산 요소의 통합은 폴리펩티드를 인코드하는 유전자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 일어나는, 방법.
12. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 표적 부위는 알부민을 인코드하는, 방법.
13. 청구항 9-11중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산 요소의 통합은 해당 표적 부위에 인코드된 폴리펩티드의 발현을 유의미하게 방해하지 않는, 방법.
14. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 머리카락, 피부, 대변, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 눈물, 유리체액 또는 점액이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
15. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 검출 단계는 면역학적 분석 또는 핵산 증폭 분석이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
16. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
17. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 페이로드에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
18. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 2A 펩티드 또는 Furin 절단 모티프인, 탐지가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 이때 상기 2A 펩티드는 P2A, T2A, E2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
20. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 단일 용량의 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는, 방법.
21. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 시점에서 수행되는, 방법.
22. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 다중 시점에서 수행되는, 방법.
23. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받은 후, 적어도 3 개월 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
24. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 유아일 때 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는, 방법.
25. 청구항 1-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 성인이 되기 전, 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는 방법.
26. 청구항 1-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 성인일 때, 해당 유전자 요법 처치 또는 유전자-통합 조성물을 제공받는 방법.
27. 상기 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 해당 유전자 요법에 대한 자가면역 반응에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함하는 방법.
28. 통합 유전자 요법 처치를 제공받았던 대상체에게서 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징을 결정하는 방법에 있어서, 전술한 방법은 다음을 포함하는 방법:
    a) 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
    b) 바이오마커 수준을 결정하고, 이때 상기 바이오마커는 해당 대상체의 게놈 안에 해당 유전자 요법의 통합에 의해 생성되며; 그리고
    c) 상기 바이오마커의 결정된 수준을 기반으로 하여, 해당 대상체에서 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징을 확립하는 단계가 내포되며, 이때 상기 바이오마커의 결정된 수준은 유전자 요법 처치 상태에 관한 하나 또는 그 이상의 특징에 상응한다.
29. 치료를 필요로 하는 대상체에게 유전자 요법 처치를 전달하는 방법에 있어서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함하는, 방법:
    a. 통합 유전자 요법 처치를 해당 대상체에게 투여하는 단계; 그리고
    b. 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에 해당 대상체의 게놈에서 유전자 요법 처치의 통합에 의해 생성된 바이오마커 수준을 결정하는 단계.
30. 청구항 29에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는, 방법:
    상기 바이오마커의 수준이 해당 통합 유전자 요법의 치료요법적으로 유효량을 나타내는 것보다 낮은 경우라면, 해당 대상체에게 추가 처치를 투여한다.
31. 청구항 28-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 통합 유전자 요법 처치는 해당 대상체의 게놈 상의 표적 부위로 상기 페이로드를 인코드하는 서열을 포함하는 핵산 요소를 통합시키는, 방법.
32. 청구항 31에 있어서, 이때 해당 표적 부위는 폴리펩티드를 인코드하는, 방법.
33. 청구항 32에 있어서, 이때 상기 핵산 요소의 통합은 폴리펩티드를 인코드하는 유전자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 일어나는, 방법.
34. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 표적 부위는 알부민을 인코드하는, 방법.
35. 청구항 31-33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산 요소의 통합은 해당 표적 부위에 인코드된 폴리펩티드의 발현을 유의미하게 방해하지 않는, 방법.
36. 청구항 28-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 머리카락, 피부, 대변, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 타액, 눈물, 유리체액 또는 점액이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
37. 청구항 28-36중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 결정 단계는 면역학적 분석 또는 핵산 증폭 분석이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
38. 청구항 28-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
39. 청구항 28-38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 표적 부위에 의해 인코드된 폴리펩티드의 해독 후, 해당 페이로드에 의해 인코드된 폴리펩티드에 융합된 탐지가능한 모이어티이거나, 또는 이를 포함하는, 방법.
40. 청구항 28-39중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 바이오마커는 2A 펩티드인, 탐지가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
41. 청구항 40에 있어서, 이때 상기 2A 펩티드는 P2A, T2A, E2A 및 F2A로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
42. 청구항 28-41중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 단일 용량의 유전자 요법 처치를 제공받는, 방법.
43. 청구항 28-42중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 결정 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치를 제공받은 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 시점에서 수행되는, 방법.
44. 청구항 28-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 검출 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치를 제공받은 후, 다중 시점에서 수행되는, 방법.
45. 청구항 28-44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 결정 단계는 해당 대상체가 해당 유전자 요법 처치를 제공받은 후, 적어도 3 개월 기간에 걸쳐 수행되는, 방법.
46. 청구항 28-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 성인일 때, 해당 유전자 요법 처치를 제공받는 방법.
47. 청구항 28-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 성인이 되기 전, 해당 유전자 요법 처치를 제공받는 방법.
48. 청구항 28-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 대상체는 성인일 때, 해당 유전자 요법 처치를 제공받는 방법.
49. 청구항 28-48중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 해당 유전자 요법에 대한 자가면역 반응에 대해 해당 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함하는 방법.
50. 청구항 1-49중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 바이오마커 수준이 페이로드의 최적 수준 또는 안전한 수준을 나타내는 수준을 초과하는 경우라면, 해당 대상체에게 유전자 요법 처치에 의해 운반되는 페이로드의 발현을 감소 또는 억제시키는 추가 처치를 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.

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