JP2020501584A - α−コノトキシンペプチドTxIDの新規変異体、医薬組成物、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は生化学及び分子生物学の分野に属する。本発明は、α−コノトキシンペプチドTxIDの変異体、その医薬組成物及びその使用を提供する。TxID変異体は、アセチルコリン受容体(nAChR)、特にα3β4又はα6/α3β4サブタイプを特異的に遮断することができ、禁煙及び解毒及び鎮痛のための医薬、精神病及び癌の治療のための、食欲を調節するための医薬、及び神経科学のための道具医薬(tool medicine)、の製造において応用が期待される。
Description
本発明は生化学及び分子生物学の分野に関し、そしてα−コノトキシンペプチドTxIDの新規変異体、医薬組成物、およびその使用に関する。
コノトキシン(コノペプチド、CTx)は、熱帯の薬用海洋生物であるイモ貝(cone shell)から分泌される神経ペプチドであり、これは捕食及び防御に使用され、動物の様々なイオンチャネル及び受容体に特異的に結合するという特異的な機能を有する(Terlau, H., and Olivera, B. M. (2004) Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiological reviews 84, 41-68. Schroeder, C. I.、及び Craik, D. J. (2012) Therapeutic potential of conopeptides. Future medicinal chemistry 4, 1243-1255)。
アルファコノトキシンは、最適な選択性を有する現在よく見られるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)サブタイプに特異的な遮断剤である。アルファ−コノトキシンとその標的nAChRは、さまざまな疾患機序と薬物開発の研究において極めて有用である。アルファ−コノトキシンは最も初期に発見されたコノトキシンの1つであり、通常は分子量が小さく、そして一般にジスルフィド結合に富む12〜19個のアミノ酸残基からなる。多様な活性と構造を有する多種類のα−コノトキシンがある。
ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)は、動物界において重要な生理学的及び臨床的意義を有する細胞膜タンパク質であり、ヒトによって最初に発見された受容体であり、筋肉アセチルコリン受容体と神経アセチルコリン受容体の2種類に分けることができる。nAChRは細胞膜上のアロステリック膜タンパク質であり、これは中枢及び末梢神経系の多くの生理学的機能(学習、記憶、応答、鎮痛、及び運動制御を含む)を仲介する。nAChRは、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、γ−アミノ酪酸などの様々な神経伝達物質の放出を活性化する(Gotti, C., and Clementi, F. (2004), Neuronal nicotinic receptors: from structure to pathology. Progress in neurobiology 74, 363-396)。nAChRは、疼痛、アルコール依存症及び薬物依存症、精神遅滞、認知症、統合失調症、中枢神経障害、てんかん、パーキンソン病、精神疾患、神経筋ブロック、重症筋無力症、鬱病、高血圧、不整脈、喘息、筋弛緩、脳卒中、乳癌、肺癌を含む広範囲の重要な疾患を治療するための薬物のスクリーニングの重要な標的であることが示されている(Gotti, C., Moretti, M., Bohr, I., Ziabreva , I., Vailati, S., Longhi, R., Riganti, L., Gaimarri, A., McKeith, I.G., Perry, R.H., Aarsland, D., Larsen, J.P., Sher, E., Beattie, R., Clementi, F., and Court, JA (2006) Selective nicotinic acetylcholine receptor subunit deficits identified in Alzheimer's disease, Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies by immunoprecipitation. Neurobiology of disease 23, 481-489. Lee, C.H., Huang, C.S., Chen, C.S., Tu, S.H., Wang, Y.J., Chang, Y.J., Tam, K.W., Wei, P.L., Cheng, T.C., Chu, J.S., Chen, L.C., Wu, C.H., and Ho, Y.S. (2010) Overexpression and Activation of t He alpha9-nicotinic receptor during tumorigenesis in human breast epithelial cells. Journal of the National Cancer Institute 102, 1322-1335. Lee, C.H., Chang, Y.C., Chen, C.S., Tu, S.H., Wang, Y.J., Chen, L.C., Chang , Y.J., Wei, P.L., Chang, H.W., Chang, C.H., Huang, C.S., Wu, C.H., and Ho, Y.S. (2011) Crosstalk between nicotine and estrogen-induced estrogen receptor activation induces alpha 9-nicotinic acetylcholine receptor expression in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Tr 129, 331-345. Rahman, S. (2013) Nicotinic Receptors as Therapeutic Targets for Drug Addictive Disorders. Cns Neurol Disord-Dr 12, 633-640)。nAChRは、それぞれ異なる薬理学的特徴を有する異なるアルファ及びベータサブユニットから、多種多様なサブタイプに組み立てられる。様々なサブタイプのnAChRに対して高い選択性を有するリガンドとしての薬物の開発は、これらの疾患を治療するための鍵となる(Livett BG, Sandall DW, Keays D, Down J, Gayler KR, Satkunanathan N, Khalil Z. Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. Toxicon, 2006, 48(7): 810-829; Taly A, Corringer PJ, Guedin D, Lestage P, Changeux JP. Nicotinic receptors: allosteric transitions and therapeutic targets in the nervous system. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8(9): 733-50; Layla A, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors [J]. Acta Pharmacol Sin 2009 Jun; 30 (6): 771-783)。しかしながら、そのような薬物を開発するための前提は、nAChRの様々なサブタイプに特異的に結合することができ、様々なサブタイプの微細組成及び生理学的機能を研究及び特定するためのツールとして使用でき、又は関連疾患の治療用の医薬として直接使用できる選択的化合物を得ることである。
薬物依存症は、医学的問題でありかつ深刻な社会問題でもある。タバコ依存症はタバコ中のニコチンによって引き起こされ、その体内の受容体はニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)である(Azam L, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 2009; 30(6): 771-783)。α3β4を含有するnAChRを遮断することは、タバコ、モルヒネ、及びコカイン依存症に対する渇望の開始を防止するのに有効であり、喫煙及び薬物摂取に対する欲望を著しく阻害することが、研究により示されている(Brunzell DH, Boschen KE, Hendrick ES, Beardsley PM, McIntosh JM. Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratio responding maintained by nicotine, Neuropsychopharmacology, 2010, 35(3):665-73))。
α3β4 nAChRは、感覚神経中枢及び自律神経中枢における主要なアセチルコリン受容体サブタイプである。α3β4 nAChRはまた、中枢に広がる手綱(habenula)や背部骨髄などの中枢神経系(CNS)ニューロンの分枝でもあり、これは、ニコチンやその他の乱用薬物の依存症に関与している(Millar, N. S.; Gotti, C., Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology 2009,56 (1), 237-46; Tapper, A. R.; McKinney, S. L.; Nashmi, R.; Schwarz, J.; Deshpande, P.; Labarca, C.; Whiteaker, P.; Marks, M. J.; Collins, A. C.; Lester, H. A., Nicotine activation of alpha4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science 2004,306 (5698), 1029-32)。α3β4 nAChRは中心枝ドーパミン経路に関与しており、特定の物質(ニコチン、薬物など)の乱用の報酬効果に非常に重要な役割を果たしている。(Jackson KJ, Sanjakdar SS, Muldoon PP, McIntosh JM, Damaj MI. The α3β4* nicotinic acetylcholine receptor subtype mediates nicotine reward and physical nicotine withdrawal signs independently of the α5 subunit in the mouse. Neuropharmacology. 2013 Jul; 70:228-35)。α3β4 nAChR遮断剤は、コカイン依存症、又はコカインとニコチンの共産薬物依存症を効果的に抑制することができる(Khroyan TV, Yasuda D, Toll L, Polgar WE, Zaveri NT. High affinity α3β4 nicotinic acetylcholine receptor ligands AT-1001 and AT-1012 attenuate ***einduced conditioned place preference and behavioral sensitization in mice. Biochem Pharmacol. 2015 Oct 15; 97(4): 531-41)。さらに、ニコチン誘発運動及び報酬効果は、β−4サブユニットノックアウトマウスにおいて顕著に低下し、これは、α3β4 nAChRがCNSにおけるニコチン中毒において重要な役割を果たすことを意味する。この実験結果は、α3β4 nAChR遮断剤も、渇望及びアルコール依存症の発症を効果的に予防できることを示している。(Toll L, Zaveri NT, Polgar WE, Jiang F, Khroyan TV, Zhou W, Xie XS, Stauber GB, Costello MR, Leslie FM. AT-1001: a high affinity and selective α3β4 nicotinic acetylcholine receptor antagonist blocks nicotine self-administration in rats. Neuropsychopharmacology. 2012 May; 37(6):1367-76. Cippitelli A, Wu J, Gaiolini KA, Mercatelli D, Schoch J, Gorman M, Ramirez A, Ciccocioppo R, Khroyan TV, Yasuda D, Zaveri NT, Pascual C, Xie XS, Toll L. AT-1001: a high-affinity α3β4 nAChR ligand with novel nicotine-suppressive pharmacology. Br J Pharmacol. 2015 Apr;172(7):1834-45. Slimak MA, Ables JL, Frahm S, Antolin-Fontes B, Santos-Torres J, Moretti M, Gotti C, Ibanez-Tallon I. Habenular expression of rare missense variants of the β4 nicotinic receptor subunit alters nicotine consumption. Front Hum Neurosci. 2014 Jan 27; 8:12. Cippitelli A, Brunori G, Gaiolini KA, Zaveri NT, Toll L. Pharmacological stress is required for the anti-alcohol effect of the α3β4* nAChR partial agonist AT-1001. Neuropharmacology. 2015 Jun; 93:229-36. Rahman S, Prendergast MA. Cholinergic receptor system as a target for treating alcohol abuse and dependence. Recent Pat CNS Drug Discov. 2012 Aug;7(2):145-50)
α3β4 nAChRはまた恐怖反応に重要な役割を果たしており、これはグルタミン酸塩とノルエピネフリンの放出を調節するのに不可欠である (Zhu, P. J.; Stewart, R. R.; McIntosh, J. M.; Weight, F. F., Activation of nicotinic acetylcholine receptors increases the frequency of spontaneous GABAergic IPSCs in rat basolateral amygdala neurons. Journal of neurophysiology 2005, 94 (5), 3081-91. Alkondon, M.; Albuquerque, E. X., A non-alpha7 nicotinic acetylcholine receptor modulates excitatory input to hippocampal CA1 interneurons. Journal of neurophysiology 2002,87 (3), 1651-4. Luo, S.; Kulak, J. M.; Cartier, G. E.; Jacobsen, R. B.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M.; McIntosh, J. M., alpha-conotoxin AuIB selectively blocks alpha3 beta4 nicotinic acetylcholine receptors and nicotine-evoked norepinephrine release. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 1998,18 (21), 8571-9. Kulak, J. M.; McIntosh, J. M.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M., Nicotine-evoked transmitter release from synaptosomes: functional association of specific presynaptic acetylcholine receptors and voltage-gated calcium channels. Journal of neurochemistry 2001,77 (6), 1581-9)。α−コノトキシンを使用することによって、ヒト副腎褐色細胞腫において、α3β4 nAChRが濃縮され、発現されていることが同定される。(Hone AJ, McIntosh JM, Azam L, Lindstrom J, Lucero L, Whiteaker P, Passas J, Blazquez J, Albillos A. α-Conotoxins Identify the α3β4* Subtype as the Predominant Nicotinic Acetylcholine Receptor Expressed in Human Adrenal Chromaffin Cells. Mol Pharmacol. 2015 Nov; 88(5):881-93)。α3β4 nAChRは嗅覚神経において重要な役割を果たしており、これは、僧帽細胞応答のスクリーニング及びフィルタリングを仲介し、僧帽細胞上のα3β4 nAChRを活性化することによって、神経細胞の興奮を刺激する(D'Souza RD, Vijayaraghavan S. Nicotinic receptor-mediated filtering of mitral cell responses to olfactory nerve inputs involves the α3β4 subtype. J Neurosci. 2012 Feb 29; 32(9): 3261-6)。
α3β2及びα3β4サブタイプを含むα3−サブユニット含有nAChRは、主に末梢神経系で発現され、神経痛薬の標的である。α3β2 nAChR又はα3β4 nAChRを遮断するアルファ−コノトキシンは、さまざまな前臨床慢性疼痛モデルにおいて優れた鎮痛作用を示し、中毒性はない。難治性疼痛は世界的な健康問題であり、新しい治療薬が緊急に必要とされている(Napier, I. A.; Klimis, H.; Rycroft, B. K.; Jin, A. H.; Alewood, P. F.; Motin, L.; Adams, D. J.; Christie, M. J., Intrathecal α-conotoxins Vc1.1, AuIB and MII acting on distinct nicotinic receptor subtypes reverse signs of neuropathic pain. Neuropharmacology 2012, 62 (7), 2202-2207. Blyth, F. M.; March, L. M.; Brnabic, A. J.; Jorm, L. R.; Williamson, M.; Cousins, M. J., Chronic pain in Australia: a prevalence study. PAIN 2001, 89 (2-3), 127-34. Cousins, M. J.; Brennan, F.; Carr, D. B., Pain relief: a universal human right. PAIN 2004,112 (1-2), 1-4. Eisenberg, E.; McNicol, E. D.; Carr, D. B., Efficacy and safety of opioid agonists in the treatment of neuropathic pain of nonmalignant origin: systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. JAMA: the journal of the American Medical Association 2005,293 (24), 3043-52)。ある調査によると、痛みは関節炎、神経痛、腫れ、痛みを含めて6人に1人が罹患している。神経因性疼痛は4〜8%の人が罹患し、そして神経痛はアルコール依存症、坐骨神経痛、癌と癌の化学療法、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷と外科的損傷などによって誘発され得る。
α6/α3β4(α6β4*、*は他の可能なサブユニットを示す)nAChRサブタイプの機能もまた非常に重要である。このサブタイプは、ヒト副腎クロム親和性細胞、ラット後根神経節(DRG)ニューロン、青年期ラット海馬、ノルアドレナリン作動性神経終末などの重要な部分に広く分布している。α6β4* nAChRはヒト副腎クロム親和性細胞において優勢であり、一方α3β4 nAChRはげっ歯類副腎クロム親和性細胞において優勢である(Hernandez-Vivanco A, Hone AJ, Scadden ML, Carmona-Hidalgo B, McIntosh JM, Albillos A. Monkey adrenal chromaffin cells express α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. PLoS One. 2014 Apr 11; 9(4):e94142)。後根神経節(DRG)に存在するアセチルコリン受容体は、鎮痛薬の潜在的な標的である。研究により、主にα6β4* nAChR及びα3β4 nAChRを発現するDRG中にニューロンが実際に存在することが示されている(Hone AJ, Meyer EL, McIntyre M., McIntosh JM. Nicotinic acetylcholine receptors in dorsal root ganglion neurons include the α6β4* subtype. FASEB J. 2012 Feb; 26(2): 917-26. Smith NJ, Hone AJ, Memon T, Bossi S, Smith TE, McIntosh JM , Olivera BM, Teichert RW. Comparative functional expression of nAChR subtypes in rodent DRG neurons. Front Cell Neurosci. 2013 Nov 28; 7:225)。従って、末梢神経系DRGにおけるα6β4* nAChR及びα3β4 nAChRは、神経痛薬の潜在的な標的であり、そしてこれら2つのサブタイプに対する遮断剤は新規鎮痛薬として開発されると予想される。
興味深いことに、α3β4 nAChRは小細胞肺癌(SCLC)細胞の増殖を仲介し、この受容体を介したシグナル伝達は肺癌の発症を促進する。α3β4 nAChR遮断剤α−コノトキシンAuIBはSCLC細胞の変動性及び増殖の阻害に有効であり、これは、α3β4 nAChRを特異的に遮断するアンタゴニストが、小細胞肺癌の治療のための新規治療薬として開発されることが期待されることを意味する(Improgo MR, Soll LG, Tapper AR, Gardner PD. Nicotinic acetylcholine receptors mediate lung Cancer growth. Front Physiol. 2013 Sep 17; 4:251)。さらに研究により、白血病、肺癌、及び神経芽細胞腫の腫瘍細胞上のα3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRを特異的に遮断することで抗癌効果を達成することが期待されることが示された(Improgo MR, Soll LG, Tapper AR, Gardner PD. Nicotinic acetylcholine receptors mediate lung Cancer growth. Front Physiol. 2013 Sep 17; 4:251)。
さらに、いくつかの研究は、マウス実験モデルにおいて視床下部α3β4 nAChRの活性化が、プロ−オピオメラノコルチン(POMC)ニューロンを活性化すること;POMCニューロン及びその後のメラノコルチン4受容体の活性化が、ニコチン誘発食欲減退、すなわちα3β4 nAChRの特異的アゴニスト又は特異的遮断剤による食欲減退(食欲不振)又は食欲増進の調節において重要な役割を果たすこと;α3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRなどのβ4サブユニットを含むnAChR受容体が、哺乳動物における食欲の調節において重要な役割を果たすこと;α3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRの特異的アゴニストがダイエット薬を開発する可能性を有すること;α3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRの特異的アンタゴニストが、食欲不振の治療用の薬物を開発する可能性、又はダイエット薬をスクリーニングする可能性を有すること、を示した(Yann S. Mineur, Alfonso Abizaid, Yan Rao, Ramiro Salas, Ralph J. DiLeone, Daniela Gundisch, Sabrina Diano, Mariella De Biasi, Tamas L Horvath, Xiao-Bing Gao, Marina R. Picciotto. Nicotine Decreases Food Intake through Activation of POMC Neurons. Science, 2011, 332, 1330-1332)。従って、α3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRの特異的遮断剤は、減量薬のスクリーニング、ならびに食欲不振及び体重関連代謝疾患の治療のための新薬の開発に使用されることが期待される。
現在、nAChRの異なるサブタイプを標的とする新しい特異性の高い遮断剤、特にα3β4 nAChR又はα6/α3β4 nAChRに対する特異的遮断剤を開発することが緊急に必要とされている。
本発明者らは、アセチルコリン受容体を特異的に遮断することができるα−コノトキシンペプチドTxIDの一連の新規変異体、特に依存症、疼痛、及び小細胞肺癌の薬物標的であるα3β4 nAChRに対する選択性及び強力な遮断活性を有するもの、及び疼痛薬物標的α6β4*(*は他の可能なサブユニットを示す)nAChRに対して強力な遮断活性を有するもの、及び禁煙、解毒、及び鎮痛用の薬物の調製において、小細胞肺癌、鬱病、認知症、統合失調症、パーキンソン病の治療薬の開発において、及び神経科学のためのツール薬の開発において、優れた応用見通しを有するものを発見するため、鋭意かつ創造的に研究した。従って、以下の発明が提供される。
本発明の1つの態様は、9位のセリンが異なるL型又はD型アミノ酸で置換されている配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、好ましくは、配列番号1に示される配列の9位のセリンは、アラニン、2−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、D−アルギニン、D−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸で置換される。異なるL型又はD型アミノ酸は、そのアミノ酸が9位のセリンとは異なること、すなわち置換後の9位のアミノ酸がL−セリンではないことを意味する。
本発明はまた、配列番号1に示すアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、9位と10位のセリンの間にL型又はD型のアミノ酸が挿入されており、前記L型及びD型アミノ酸ともL−セリンではなく、好ましくは、配列番号1に示される配列の9番目と10番目の間に、アラニン、2−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、D−アルギニン、D−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸が挿入される。
本発明の1つの態様は、それぞれ配列番号2〜3、7、9、11〜33のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。
本発明の1つの実施態様において、前記ポリペプチドのN末端から数えて、
第1システインが第3システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第4システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第4システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第3システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第2システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第3システインが第4システインとジスルフィド結合を形成する。
第1システインが第3システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第4システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第4システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第3システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第2システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第3システインが第4システインとジスルフィド結合を形成する。
本発明の1つの実施態様において、前記ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている。
野生型α−コノトキシンTxIDは本発明者らの以前の特許及び論文に開示されているが、多くの研究は、コノトキシンペプチドについて、配列中の1つの異なるアミノ酸でさえ新しい受容体特異性をもたらし得ることを示しており、これは、受容体の研究において新しい手段が提供されること、及び新薬の開発において新薬候補及び主薬が提供されることを意味する(Conotoxin peptide, Lu Bosong、Huang Peitang、1999年、特許出願第99106070.9号。Halai, R ., Clark, R.J., Nevin, S.T., Jensen, J.E., Adams, D.J., and Craik, D.J. (2009). Scanning mutagenesis of alpha-conotoxin Vc1.1 reveals residues crucial for activity at the alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor. The Journal of Biological Chemistry 284, 20275-20284. Kompella SN, Hung A, Clark RJ, Mari F, Adams D.J., 2015. Alanine scan of alpha-conotoxin RegIIA reveals a selective alpha3beta4 nicotinic acetylcholine receptor antagonist. J Biol Chem 290: 1039-1048)。本発明の知見(表2、表3)はこの事実をさらに裏付けるものである。
本発明は、ジスルフィド結合システイン(Cys、C)の維持を除いて、TxID変異体と2つのサブタイプα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR(表2参照)との間で相互作用する重要なアミノ酸{5位のヒスチジン(TxID[H5A])、6位のプロリン(TxID[P6A])、7位のバリン(TxID[V7A])、11位のメチオニン(TxID[M11A])、13位のプロリン(TxID[P13A])を含む}を同定し、TxID上のこれら5個のアミノ酸は、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR受容体との相互作用において非常に重要な役割を果たし、どのアミノ酸がアラニン(Ala、A)に置き換えられても、2つのサブタイプに対するこれらの遮断活性は完全に失われ、これらの遮断用量(IC50)はすべて10,000nMを超え、すなわち10μMの高濃度でこれらの変異体は2つのサブタイプα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対して50%以下の電流遮断を有するか、又は全く遮断を示さない。詳細は表2を参照されたい。
さらに、TxID上の9位のセリン(Ser、S)もまた、サブタイプα6/α3β4 nAChRの結合に重要である。この位置のセリンをアラニン、アルギニン、又はリジンで置き換える(TxID[S9A]、TxID[S9R]、TxID[S9K])と、α6/α3β4 nAChRによる遮断活性が顕著に低下し、例えば、TxID[S9A]及びTxID[S9R]のα6/α3β4 nAChRに対する遮断活性は、野生型TxIDと比較するとそれぞれ5.2及び7.8倍低下するが、TxID[S9K]のそれは534.8倍低下する。これは、サブタイプα6/α3β4 nAChRの結合のためのTxID上の9位のセリンの重要性を示す。ただし、TxID上の9位のセリンが、それぞれ2−アミノ酪酸(TxID[S9Abu])、ヒスチジン(TxID[S9H])、チロシン(TxID[S9Y])、スレオニン(TxID[S9T])、ロイシン(TxID[S9L])、フェニルアラニン(TxID[S9F])に変異されても、得られた変異体はα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR受容体への結合活性を実質的に維持し、これは、野生型TxIDの活性と有意に異ならない。TxID上の9位のセリンが、それぞれD−アルギニン(TxID[S9(D−Arg)])、D−セリン(TxID[S9(D−Ser)])、グルタミン酸(TxID[S9E])、アスパラギン酸TxID[S9D]に変換されると、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR受容体に対するこれらの得られた変異体の結合活性は少なくとも10倍顕著に低下し、10〜303倍の振幅の低下を伴う(表2)。α3β4 nAChR受容体へのTxID[S9E]の結合活性は100倍以上急激に減弱し、α6/α3β4 nAChR受容体への結合(遮断)活性は完全に失われる(表2)。従って、TxID上の9位のセリンも受容体の結合活性に重要であり、変異体の活性は、その位置を置換するアミノ酸の種類によって変化する。
TxIDの1位のグリシンもまた、受容体の結合活性にとって重要である。グリシンをアラニンで置換した変異体(TxID[G1A])の活性は顕著に低下し、そしてα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR受容体へのその結合活性はそれぞれ17倍及び8.2倍低下する。本発明の結果は、コノトキシンのアミノ酸配列及びその生物学的に活性な機能の多様性が高く、コノトキシン配列中の1つの異なるアミノ酸でさえ機能的変化をもたらし得ることを確認する。
さらに本発明者らは、5つの新しいTxID変異体を見出し、これらは、TxID[S9A]である配列番号7、TxID[S9R]である配列番号19、TxID[S9K]である配列番号24、TxID[14D]である配列番号29、及びTxID[S9E]である配列番号31であり、これらは、45倍を超える識別範囲で2つのサブタイプα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRに対して良好な識別を有し、さらにこれらを完全に識別することさえでき、すなわち、これらはα3β4 nAChRに対して遮断活性を有するが、α6β4* nAChRに対してはほとんど遮断活性を有さない(表3)。その中でも、TxID[S9E]はα3β4 nAChR受容体に対して良好な選択性を示し、一方α3β4 nAChR受容体に対するその遮断活性は弱いが、α6/α3β4 nAChR受容体に対する結合活性を完全に喪失している。この独特の利点は、上記ポリペプチドを、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRのような類似のサブタイプの区別において重要な科学的意義及び高い応用価値を有するツールとしている。これらすべての結果は、これらが、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRサブタイプの構造的及び機能的研究における分子プローブの設計及び開発ならびに新薬開発に、極めて高い応用価値を有することを示している。
本発明において、新規なα−コノトキシン(新規変異体としてα−CTx TxIDと命名される)が得られ、これはα3β4 nAChRの強力な遮断剤であり、またこれまでに発見された中で最も活性の高いα3β4 nAChR遮断剤であり、またα6/α3β4 nAChRに対する強力な又は特定の遮断効果を有するが、他のnAChRサブタイプに対する遮断活性は全くないか又は極めて弱い。2つの類似のサブタイプ、α3β4 nAChRα6β4* nAChRとを効果的に区別することができるリガンド材料は非常に少ない。従って、α−コノトキシンTxIDシリーズの新規変異体は、α3β4又はα6β4* nAChRの構造及び機能を研究するための新規ツールであり、依存症、疼痛、癌、恐怖などのための治療薬の開発に貢献する。
本発明の1つの実施態様において、ポリペプチドは、神経系疾患又は癌の治療及び/又は予防に使用するための、あるいは有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進に使用するためのものであり;
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり;
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛(multi-point motor neuralgia)、急性の激しい自発性神経痛(acute strenuous spontaneous neuralgia)、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、又は乳癌である。
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛(multi-point motor neuralgia)、急性の激しい自発性神経痛(acute strenuous spontaneous neuralgia)、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、又は乳癌である。
上記ポリペプチドは、化学的に合成されたアミノ酸配列(例えば、実施例1の方法を参照することにより合成)であるか、又は遺伝子組換えによってヌクレオチドを発現させることによって得られるポリペプチド(ヌクレオチド配列の調製は、分子生物学の従来の方法を参照することができる)でもよく、次の方法を参照しても得ることもできる。
本発明のポリペプチドの調製方法は以下の工程を含む:
1)ペプチド合成機又はマニュアルの方法により線状ポリペプチドが合成される工程であって、Fmocアミノ酸の側鎖保護基は、Pmc(Arg)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)であり、システインの保護基はTrt又はAcmである工程;
2)工程1)で得られた線状ポリペプチドを樹脂から切断し、そして粗製線状ポリペプチドを沈殿させて回収し、氷ジエチルエーテルで洗浄し、そして分取逆相HPLC C18カラム(Vydac)を使用して精製する工程;
3)工程2)で得られた生成物を2工程酸化的折り畳みにかける工程。
1)ペプチド合成機又はマニュアルの方法により線状ポリペプチドが合成される工程であって、Fmocアミノ酸の側鎖保護基は、Pmc(Arg)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)であり、システインの保護基はTrt又はAcmである工程;
2)工程1)で得られた線状ポリペプチドを樹脂から切断し、そして粗製線状ポリペプチドを沈殿させて回収し、氷ジエチルエーテルで洗浄し、そして分取逆相HPLC C18カラム(Vydac)を使用して精製する工程;
3)工程2)で得られた生成物を2工程酸化的折り畳みにかける工程。
本発明のさらなる態様は、少なくとも1つの本発明のポリペプチドを含む単離された融合タンパク質に関する。
本発明はまた、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドを包含し、ここで追加のペプチド/ポリペプチドは、本発明のα−コノトキシンペプチドのN末端及び/又はC末端で融合している。融合ポリペプチドを製造するための技術は、当技術分野において公知であり、本発明のペプチドをコードするコード配列を追加のペプチド/ポリペプチドをコードするコード配列と連結して、これらが同じ読みとり枠内にあり、かつ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターによって制御されるようにすることを含む。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、好ましくは、核酸構築物は組換えベクターであり;好ましくは、核酸構築物は組換え発現ベクターである。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の核酸構築物を含む形質転換細胞に関する。
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドを含む、場合により医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
本医薬組成物は、依存症、神経痛、癌、精神遅滞、疼痛、パーキンソン病、精神病、鬱病、重症筋無力症などに関連する疾患又は状態を、研究、診断、改善、又は治療するために使用することができる。1つの実施態様において、治療有効量の本発明のペプチドを含む医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を考慮して、医薬的に許容し得る方法で処方及び投与される。従って本明細書で使用される用語「有効量」は、これらの考慮事項によって決定される。
治療有効量の本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、非経口的に、経口的に、大槽内に、髄腔内などに投与される。用語「医薬的に許容し得る担体」は、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル材料、又は任意の種類の配合賦形剤を意味する。本明細書で使用される用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、髄腔内、及び関節内注射及び注入を含む投与様式を指す。本発明のポリペプチドはまた、徐放系によっても適切に投与することができる。
本発明のさらなる態様は、アセチルコリン受容体を遮断するための医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用に関し、好ましくはアセチルコリン受容体は、α3β4アセチルコリン受容体、又はα6/α3β4アセチルコリン受容体などのα6β4*アセチルコリン受容体である。
本発明のさらなる態様は、神経系疾患又は癌の治療及び/又は予防のための医薬の製造における、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用に関し、
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり、
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり、
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血球、神経芽細胞腫、又は乳癌である。
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血球、神経芽細胞腫、又は乳癌である。
先行技術の研究は、α3β4 nAChRが、ニコチン、モルヒネ、及びコカインによって引き起こされる依存症、神経痛、小細胞肺癌、パーキンソン病、認知症、統合失調症、鬱病、恐怖などの精神神経疾患の治療のための薬物標的であることを示している。さらに、α6β4* nAChRはまた、多くの疾患に対する潜在的な標的であり、また鎮痛薬に対する作用標的でもある(背景技術中の関連する参考文献を参照)。従って、本発明の新規α−コノトキシンTxID変異体は、上記疾患のメカニズムの研究、診断、及び治療において極めて高い応用価値を有する。
本発明のさらなる態様は、インビボ又はインビトロでアセチルコリン受容体を遮断するか又はアセチルコリンのレベルを調節する方法であって、有効量の本発明のポリペプチド又は医薬組成物を被験体に投与するか又は細胞にを投与する工程を含む方法に関し、好ましくは、アセチルコリン受容体は、α3β4アセチルコリン受容体、又はα6/α3β4アセチルコリン受容体などのα6β4* アセチルコリン受容体である。
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明のポリペプチド又は医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、神経系疾患又は癌を治療及び/又は予防する方法、あるいは有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進をする方法に関する。
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり、
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、依存症は、以下の要因:例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、神経痛は、以下:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経細胞腫、又は乳癌である。
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経細胞腫、又は乳癌である。
投与量は、治療される状態の重症度、患者又は動物の性別、年齢、体重、及び個々の反応、ならびに治療されるべき患者の状態及び以前の病歴などのいくつかの要因に依存する。所望の治療効果を達成するのに必要な量より低い用量から始めて、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当技術分野で一般的な方法である。
本発明において用語「依存症」とは、精神活性物質を繰り返し使用している被験体が周期的又は慢性の中毒状態にあることを意味する。精神活性物質とは、ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、その他の麻薬、及び正式に規制されていて中毒を引き起こす可能性がある向精神薬を指す。依存症は、脳内で生成される大量のドーパミンと関連する。これは、好ましい物質の制御できない使用、及び自己管理の困難さ、又は使用行動の修正の困難さとして現れる。良好な感情を達成するための又は禁断症状の痛みを回避するための精神活性物質を得るためには、被験体は思慮がなくなる。典型的には、許容度が増加し、物質の使用を中止するとしばしば禁断症状が起きる。依存者の生活は、物質的な使用(material use)によって支配される可能性があり、すなわち他の重要な活動及びすべての責任に対して深刻な影響を及ぼし、さらにはこれらを放棄さえする。従って、物質の使用は個人と社会の両方に害を及ぼす。アルコールで使用すると、それは慢性アルコール依存症の概念と同等である。依存症という用語はまた、肉体的側面と心理的側面の両方を含む。心理的依存症は飲酒や薬物摂取の損なわれた自己管理の経験を強調しているのに対し、身体的依存症は耐性(tolerance)や禁断症状を意味する。
本明細書で定義される「核酸構築物」という用語は、1本鎖又は2本鎖核酸分子、好ましくは人工的に構築された核酸分子である。任意選択的に核酸構築物はさらに、1つ又はそれ以上の作動可能に連結された調節配列を含む。
本発明において、用語「作動可能に連結された」とは、2つまたはそれ以上のヌクレオチド領域又は核酸配列の機能性の空間的配置をいう。「作動可能に連結された」は、遺伝子組換えによって達成され得る。
本発明において「ベクター」という用語は、特定のタンパク質を阻害するポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。例えば、ベクターには以下が含まれる:ファスミド;ファージミド;コスミド;人工染色体、例えば酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、又はP1由来人工染色体(PAC);ファージ、例えばλファージ又はM13ファージ;及び動物ウイルスなど。ベクターとして使用される動物ウイルスには、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルスなど)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス(SV40など)が含まれる。ベクターは発現を制御する様々な要素を含み得る。
本発明において用語「宿主細胞」とは、ベクターが導入される細胞を指し、大腸菌又は枯草菌などの原核細胞、例えば酵母細胞又はアスペルギルスなどの真菌細胞、例えばS2ショウジョウバエ細胞又はSf9などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK293細胞などの動物細胞、又はヒト細胞などの多くの細胞型を含む。
「有効量」という用語は、被験体において、本明細書に記載の疾患又は状態の治療、予防、軽減、及び/又は改善を達成することができる用量を指す。
「疾患及び/又は状態」という用語は、本明細書に記載の疾患及び/又は状態に関連する被験体の身体的状態を指す。
「被験体」という用語は、本発明の疾患又は状態を治療、予防、改善、及び/又は緩和するために、本発明の医薬組成物を投与される患者又は他の動物、特に哺乳動物、例えばヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマなどを指すことができる。
本発明において、特に別の指定がなければ、濃度の単位μMはμmol/Lを表し、mMはmmol/Lを表し、nMはnmol/Lを表す。
本発明において、細胞への投与量が言及される場合は、特に別の指定がなければ、通常、投与後の薬物の最終濃度を意味する。
本発明において用語「アミノ酸」又は特定のアミノ酸名が言及される場合、特に別の指定がなければ、それはL型アミノ酸を意味する。
本発明は、α3β4 nAChRの強力な遮断剤であり、かつこれまでに発見された中で最も活性の高いα3β4 nAChR遮断剤でもある、新規なα−コノトキシン(新規変異体としてα−CTx TxIDと命名される)を得た。さらにこれはまた、α6/α3β4 nAChRに対して強力な又は特定の遮断効果を有するが、他のnAChRサブタイプに対する遮断活性は全く無いか又は極めて弱い。2つの類似のサブタイプ、α3β4 nAChRとα6β4* nAChRを効果的に区別するリガンド材料は非常に少ない。本発明の新規TxID変異体のいくつかは、2つのサブタイプα3β4 nAChRとα6β4* nAChR、例えば表1〜3の配列番号7、19、24、29に示されるもの、すなわち、7.TxID[S9A]、19.TxID[S9R]、24.TxID[S9K]、及び29.TxID[14D]を良好に識別する(45倍を超え、さらには完全に識別可能である)。このように、α−コノトキシンTxIDシリーズの新規変異体は、α3β4 nAChR又はα6β4* nAChRの構造と機能を研究するための新しいツールであり、依存症、疼痛、癌、鬱病、恐怖などに対する治療薬の開発に貢献する。
本発明の実施態様を実施例により以下に詳細に説明する。以下の実施例は単に本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを当業者は認識するであろう。実施例において、具体的な技術又は条件が示されていない場合、それらは当該分野の文献(例えば、J. Sambrookら, Huang Peitangら, Molecular Cloning Experimental Guide, Third Edition, Science Press参照)に記載されている技術又は条件、又は製品マニュアルに従って実施される。使用される試薬又は機器が製造業者によって示されていない場合、それらは商業的に入手することができる通常の製品である。
実施例1:α−コノトキシンTxIDの新規変異体の配列設計及び人工合成
α−コノトキシンTxID成熟ペプチド(そのアミノ酸配列は以下の表1の配列番号1に示され、そのC末端はアミド化されている)に基づいて、本発明者らは一連の新規ポリペプチド変異体を創造的に設計した。そのアミノ酸配列を下記表1の配列番号2〜37に示す。
α−コノトキシンTxID成熟ペプチド(そのアミノ酸配列は以下の表1の配列番号1に示され、そのC末端はアミド化されている)に基づいて、本発明者らは一連の新規ポリペプチド変異体を創造的に設計した。そのアミノ酸配列を下記表1の配列番号2〜37に示す。
表1に列記したポリペプチドの線状ペプチドは、Fmoc法により人工的に合成した。具体的な方法は以下の通りである。
樹脂ペプチドをFmoc化学的方法によって人工的に合成し、樹脂ペプチドはペプチド合成機又はマニュアルの合成法によって合成することができた。システインに加えて、残りのアミノ酸を標準的な側鎖保護基で保護した。各ポリペプチドの第1システイン及び第3システイン(Cys)の−SH基はTrt(S−トリチル)により保護し、そして第2システイン及び第4システインの−SH基はAcm(S−アセトアミドメチル)により保護し、そして酸化的折り畳み後のジスルフィド結合は、Cys1−Cys3及びCys2−Cys4、すなわちCys(1−3、2−4)であった。合成手順は以下の通りであった:固相合成においてFmoc法及びFastMoc法によって、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置で線状ペプチドを合成した。Fmocアミノ酸の側鎖保護基は、Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)であった。Fmoc HOBT DCC法を用いて、樹脂及びFmocアミノ酸をRinkによってアミド化し、そして機器合成マニュアルを参照して合成工程を実施した。反応を完了させるために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間を適切に延長し、そして不応性アミノ酸を二重カップリングして樹脂ペプチドを得た。線状ペプチドを試薬K(トリフルオロ酢酸/水/エタンジチオール/フェノール/チオアニソール;90:5:2.5:7.5:5、v/v/v/v/v)を用いて樹脂から切断し、沈殿させ、そして氷ジエチルエーテルで洗浄して、粗製線状ペプチドをリサイクルした。
分取用逆相HPLC C18カラム(Vydac)を精製に使用し、溶出勾配は0〜20分で10〜40%B90であった。溶媒B90は、90%ACN(アセトニトリル)、0.5%TFA(トリフルオロ酢酸)、及び残りの純水からなり、溶媒Aは0.65%TFAの水溶液であった。UV吸収分析は214nmの波長で行った。精製した線状ペプチドを、分析用HPLC C18カラム(Vydac)を用いて純度検出にかけ、溶出勾配は上記と同じであった。これは95%以上の純度を有し、酸化的折り畳みのために使用した。
文献(Dowell, C.; Olivera, B.M.; Garrett, J.E.; Staheli, S.T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J.M.; McIntosh, J.M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience. 2003, 23 (24), 8445-52)に従って、上記の線状ペプチドの2段階酸化的折り畳み反応が以下のように記載された。
まずジスルフィド結合の最初の対を、フェリシアン化カリウム酸化(20mMのフェリシアン化カリウム、0.1Mのトリス、pH7.5、30分)によって、Trt保護基の2つのシステイン間に形成した。単環式ペプチドを逆相HPLC C18カラム(Vydac)により精製し、次いでヨウ素(H2O中10mMのヨウ素:トリフルオロ酢酸:アセトニトリル、78:2:20容量、10分)で酸化し、他の2つのシステイン上のAcmを除去し、これらの2つのサイクルの間に、ジスルフィド結合の第2の対を形成した。2環式ペプチドを逆相HPLC C18カラム(Vydac)により精製し、そして溶出の直線勾配は0〜20分以内でなお10〜40%B90であった。214nmの波長で紫外線吸収分析を行った。こうして、対応するシステイン間にN末端からC末端に向かってジスルフィド結合が配向して形成されたα−コノトキシンが得られた。
2対のジスルフィド結合を有する精製ペプチドを、HPLCと質量分析法によって純度及び分子量について試験したところ、結果はすべて正しかった。HPLCクロマトグラフィー条件は以下の通りであった:Vydac C18 HPLC逆相分析カラム、10%〜40%の溶液B及び90%〜60%の溶液Aを用いて20分間の勾配溶出を行い。ここで、溶液Aは0.65%トリフルオロ酢酸(TFA)、溶液Bは0.5%TFA及び90%アセトニトリルの水溶液であった。UV分析波長は214nmであり、TxICのピーク時間、すなわち保持時間は23.366分であった。
例えば図1A〜1Dは、TxID及びTxID[S9A]のHPLCクロマトグラム及び質量スペクトルを示す。TxIDのピーク時間は23.31分(図1A)であり、質量分析(ESI−MS)(図1B)により正しいことが同定された。酸化的折り畳み後のTxIDのモノアイソトピック質量は、測定された分子量と一致した:TxIDの理論的分子量は1488.559Daであり、測定されたTxIDの分子量は1488.56Daであった。TxID[S9A]のピーク時間は25.08分(図1C)であり、ESI−MS質量分析(図1D)によっても確認された。酸化的に折り畳まれたTxID[S9A]のモノアイソトピック質量もまた、測定された分子量と一致した:TxID[S9A]の理論的分子量は1472.564Daであり、そしてTxID[S9A]の測定された分子量は1472.56Daであった。
上記工程を経て、表1に列記した37個のポリペプチド全てが正しく合成され、そしてCys(1−3、2−4)のジスルフィド結合を有する酸化的に折り畳まれたペプチドが形成され、これらはその後の活性研究及び構造分析に使用できた。
ポリペプチドの濃度は、280nmの波長で比色法によって決定され、そしてポリペプチドの濃度及び質量は、Beer−Lambertの式に従って計算され、そして以下の実施例における実験で使用された。
実施例2:α3β4 nAChRサブタイプを特異的に遮断するα−コノトキシンTxID新規変異体の実験
文献(Luo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rate α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry. 2013, 56: 9655-9663. Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino acid residues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32)中の方法、並びにインビトロ転写キット(mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX))の仕様中の方法を参照して、種々のラット神経nAChRサブタイプ(α3β4、α6/α3β4、α9α10、α4β2、α4β4、α3β4、α2β2、α2β4、α7)、ヒトα3β4及びα6/α3β4、ならびにマウス筋肉nAChR(α1β1δε)cRNAを調製し、それらの濃度を測定し、UV 260nmでのOD値により計算した。アフリカツメガエルを解剖し、卵母細胞(カエルの卵)を採取し、サブユニット当たり5〜10ngのcRNAをカエルの卵に注入した。カエルの卵をND−96で培養した。カエルの卵を採取後1〜2日以内にcRNAを注入し、注入後1〜4日以内にnAChRの電圧クランプを記録した。
文献(Luo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rate α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry. 2013, 56: 9655-9663. Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino acid residues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32)中の方法、並びにインビトロ転写キット(mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX))の仕様中の方法を参照して、種々のラット神経nAChRサブタイプ(α3β4、α6/α3β4、α9α10、α4β2、α4β4、α3β4、α2β2、α2β4、α7)、ヒトα3β4及びα6/α3β4、ならびにマウス筋肉nAChR(α1β1δε)cRNAを調製し、それらの濃度を測定し、UV 260nmでのOD値により計算した。アフリカツメガエルを解剖し、卵母細胞(カエルの卵)を採取し、サブユニット当たり5〜10ngのcRNAをカエルの卵に注入した。カエルの卵をND−96で培養した。カエルの卵を採取後1〜2日以内にcRNAを注入し、注入後1〜4日以内にnAChRの電圧クランプを記録した。
cRNAを注入した1つのカエルの卵を30μLのSylgard記録溝(深さ4mm×直径2mm)に入れ、0.1mg/mlのBSA(ウシ血清アルブミン)を含有するND96灌流液(96.0mM NaCl、2.0mM KCl、1.8mM CaCl2、1.0mM MgCl2、5mM HEPES、pH7.1〜7.5)、又は1mMアトロピンを含有するND96(ND96A)を1ml/分の流速で流して、重力注入を行った。全てのコノトキシン溶液はまた、毒素の非特異的吸着を減らすために0.1mg/mlのBSAを含み、切り替え弁(SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA)を用いて、毒素の注入とアセチルコリン(ACh)の注入を切り替え、一連の三方電磁弁(モデル161TO31、Neptune Research, Northboro, MA)を用いて灌流ND96とAChを自由に切り替えた。Achゲート電流を2電極電圧クランプ増幅器(モデルOC−725B、Warner Instrument Corp., Hamden, CT)によって「低速」クランプに設定し、クランプゲインを最大(×2000)位置に設定したときに、オンライン記録を行った。ガラス電極を、1mmの外径×0.75mmの内径を有するガラスキャピラリー(ファイバー充填ホウケイ酸キャピラリー、WPI Inc., Sarasota, FL)から引き出し、そして電圧及び電流電極として3MのKClを充填した。膜電圧を−70mVにクランプ固定した。システム全体はコンピューターによって制御され記録された。AChパルスは、5分毎に1秒間のAChの自動灌流であった。AChの濃度は、筋肉のnAChR及びニューロンのα9α10 nAChRについては10μM、発現ニューロン nAChRのα7については200μM、及び他のサブタイプについては100μMであった。異なる毒素濃度に対して特定のサブタイプを発現する少なくとも5個の卵の電流応答及び電流トレースを記録した。
試験の電流データをGraphPad Prismソフトウェア(San Diego, CA)によって統計解析し、そして用量応答曲線を描いて、nAChRを遮断する毒素について、半遮断濃度IC50などのコノトキシンの様々なパラメーターを計算した。
実験結果を下記表2に示す。これらの変異体のα3β4 nAChRに対する遮断活性とTxIDのそれとの比も表2に要約されている。
結果は次のとおりである:
配列番号2〜3、7、9、11〜32に示す26個の変異体(実施例1で調製)はすべてラットα3β4 nAChRに対するナノモル遮断活性を有し(表2、図2A〜2D、図3A〜3D参照、図4A〜4D、及び図5A〜5Dを参照)、ならびにそれらの半遮断用量(IC50)は1.87nM〜379.5nMの範囲で変動した(表2)。これらの中で、ほとんどの変異体(合計23個のポリペプチド)はα3β4 nAChRに対する強力な遮断活性を維持し、そしてそれらのIC50値はすべて100nM未満であった。そして19個のポリペプチドはα3β4 nAChRに対してより強い遮断活性を有し、そしてそれらのIC50は全て36nM未満であった。
配列番号2〜3、7、9、11〜32に示す26個の変異体(実施例1で調製)はすべてラットα3β4 nAChRに対するナノモル遮断活性を有し(表2、図2A〜2D、図3A〜3D参照、図4A〜4D、及び図5A〜5Dを参照)、ならびにそれらの半遮断用量(IC50)は1.87nM〜379.5nMの範囲で変動した(表2)。これらの中で、ほとんどの変異体(合計23個のポリペプチド)はα3β4 nAChRに対する強力な遮断活性を維持し、そしてそれらのIC50値はすべて100nM未満であった。そして19個のポリペプチドはα3β4 nAChRに対してより強い遮断活性を有し、そしてそれらのIC50は全て36nM未満であった。
ほとんどの変異体は、α3β4 nAChRに対して強い遮断活性を有し、それらのIC50値はTxIDのそれに近く、そして全て10nM未満であり、そしてそれらのうちのいくつかはTxIDの遮断活性よりもさらに強力であった(IC50、3.6nM)。例えば、配列番号17のTxID[S9Abu]及び配列番号18のTxID[S9H]のIC50値は、それぞれわずか1.87nM及び2.61nMであり(表2)、これらは、これまでに発見された最強の遮断活性を有する、α3β4 nAChRに対する特異的遮断剤であった。
α3β4 nAChRの電流を遮断した後のTxID及びその新規変異体の溶出速度は異なっていた(図2A〜2D、図3A〜3D、図4A〜4D、図5A〜5D)。図2A〜2Dに示されるように、1μMの新規変異体TxID[S9H]、TxID[S9L]、及びTxID[S9Y]がα3β4 nAChRの電流を遮断した後、溶出は非常に遅く、2分の溶出後の電流はほぼ0nAであった。しかしながら1μMの野生型TxIDで遮断した後、その電流は溶出の2分以内に対照電流「C」のレベルに戻った。また、TxID[S9Abu]及びTxID[S9F](4A−4D)がα3β4 nAChRの電流を遮断した後も、溶出は非常に遅かった。残りのポリペプチドの溶出速度は比較的速かったが、それぞれの溶出速度は異なっていた(図3A〜3D、図4A〜4D、図5A〜5D)。溶出速度は、ポリペプチドと受容体との間の結合の重要な特徴、すなわち反応結合が解離する速度を反映していた。
3つの変異体ポリペプチド、配列番号30のTxID[S9(D−Ser)]、配列番号31のTxID[S9E]、配列番号32のTxID[S9D]のみが、115〜380nMのIC50を有した。α3β4 nAChRに対する遮断活性を喪失した10個のポリペプチド、配列番号4、5、6、8、10、及び33〜37があり(表2、図6A〜6E)、10μMの高濃度で、α3β4 nAChRの電流に対するそれらの遮断活性は50%未満であり、それらのIC50は10000nM超であった(表2、及び図6A〜6E参照)。
さらに、本発明者らはまた、ヒトα3β4 nAChRに対するTxID及びその新規変異体(表1など)の遮断活性も測定し、それらの活性はラットα3β4 nAChRに対するものと同様であり、2つの種の間に有意差はなかった。
実施例3:α6/α3β4 nAChRサブタイプを特異的に遮断するα−コノトキシンTxID新規変異体の実験
実施例2の電気生理学的方法を参照して、α6/α3β4(α6β4*に相当、*は残りの可能なサブユニットを表す)nAChRに対する表1のTxID及びその新規突然変異体の全ポリペプチドの遮断活性を測定し、結果を表2ならびに図7A〜図7D、図8A〜図8D、図9A〜図9D、図10A〜図10D、及び図11A〜図11C示した。α6/α3β4 nAChRに対するこれらの変異体の遮断活性とTxIDとの比も表2にまとめた。
実施例2の電気生理学的方法を参照して、α6/α3β4(α6β4*に相当、*は残りの可能なサブユニットを表す)nAChRに対する表1のTxID及びその新規突然変異体の全ポリペプチドの遮断活性を測定し、結果を表2ならびに図7A〜図7D、図8A〜図8D、図9A〜図9D、図10A〜図10D、及び図11A〜図11C示した。α6/α3β4 nAChRに対するこれらの変異体の遮断活性とTxIDとの比も表2にまとめた。
結果は次のとおりである。
合計24個の新規ペプチド、配列番号2〜3、7、9、11〜23、25〜30、及び33(実施例1で調製)は、ラットα6/α3β4 nAChRに対して異なる程度の遮断効果(表2、ならびに図7A〜7D、図8A〜8D及び図9A〜9Dを参照)と、4.91nM〜3492.82nMの範囲の半遮断用量(IC50)(表2)を有した。
合計24個の新規ペプチド、配列番号2〜3、7、9、11〜23、25〜30、及び33(実施例1で調製)は、ラットα6/α3β4 nAChRに対して異なる程度の遮断効果(表2、ならびに図7A〜7D、図8A〜8D及び図9A〜9Dを参照)と、4.91nM〜3492.82nMの範囲の半遮断用量(IC50)(表2)を有した。
これらの中で、全部で22個のポリペプチド中のほとんどの変異体がα6/α3β4 nAChRに対する遮断活性を維持し、それらのIC50はすべて1000nM未満であり、このうち7個のポリペプチド、すなわち配列番号2、7、13、19、27、28、及び30は、100〜1000nMの範囲のα6/α3β4 nAChRに対するIC50を示した。α6/α3β4 nAChRに対してより強い遮断活性を有する15個の変異体があり、これらのIC50値はTxIDのそれに近く、全て100nM未満であり、これらのいくつかは、α6/α3β4 nAChRに対するTxIDの遮断活性(IC50、33.9nM)よりも強かった:例えば、配列番号20、23、25、及び26のIC50値は、それぞれ17.76nM、28.98nM、16.18nM、及び7.11nMであった(表2)。1μM〜10μMの範囲のIC50を示した2つの変異体ポリペプチド、配列番号29及び配列番号33が存在した。
さらに、α6/α3β4 nAChRに対する遮断活性をほとんど失っており(表2、図10A〜10D、及び図11A〜11C)、及びそれらのIC50値が10000nM(すなわち10μM)より大きかった12個のポリペプチド、配列番号4〜6、8、10、24、31〜32、34〜37があった。
α6/α3β4 nAChRの電流を遮断した後のTxID及びその新規変異体の溶出速度は異なっていた(図7A〜7D、図8A〜8D、図9A〜9D)。図7A〜7Dに示されるように、TxID[S9F]の溶出速度は他のポリペプチドのそれよりも著しく遅かった。一般にこれらは、α6/α3β4 nAChRの電流を遮断した後の野生型TxIDの溶出速度及びピーク形状に類似し(図7A〜7D、図8A〜8D、図9A〜9D)、そして一般に2分間の溶出後の対照電流「C」のレベルに戻ることができた。
さらに、本発明者らはまた、ヒトα6/α3β4 nAChRに対するTxID及びその新規変異体(表1に示す)の遮断活性も測定し、これらの活性が、ラットα6/α3β4 nAChRに対するものと同様であり、2つの種の間に有意差がないことを示した。
実施例4:α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRの2つのサブタイプに対するα−コノトキシンTxID新規変異体の活性の比較
本発明者らは、上記表2の実験データに従って、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRの2つのサブタイプに対するα−コノトキシンTxID新規変異体の活性を比較し、比較結果を識別の程度[識別の程度=(ラットα6/α3β4上の変異体のIC50/ラットα3β4上の変異体のIC50)]によって表し、単位はnMであった。結果を下記表3に示す。さらに本発明者らはまた、文献調査により、α3β4 nAChRに作用する現在知られているコノトキシン、ならびに2つの非常に類似したサブタイプα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR間のそれらの識別を、表3に列記する。
本発明者らは、上記表2の実験データに従って、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRの2つのサブタイプに対するα−コノトキシンTxID新規変異体の活性を比較し、比較結果を識別の程度[識別の程度=(ラットα6/α3β4上の変異体のIC50/ラットα3β4上の変異体のIC50)]によって表し、単位はnMであった。結果を下記表3に示す。さらに本発明者らはまた、文献調査により、α3β4 nAChRに作用する現在知られているコノトキシン、ならびに2つの非常に類似したサブタイプα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChR間のそれらの識別を、表3に列記する。
表2と表3から以下が明らかである:
α−コノトキシンTxIDの新規変異体のほとんどは、2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChRとα6β4* nAChRに対する遮断活性を保持し(表2)、2つのサブタイプ間の識別度はほとんど10倍以内であった。2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChRとα6β4* nAChR間の野生型TxIDの識別はわずか9.3倍であった(表3)。
α−コノトキシンTxIDの新規変異体のほとんどは、2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChRとα6β4* nAChRに対する遮断活性を保持し(表2)、2つのサブタイプ間の識別度はほとんど10倍以内であった。2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChRとα6β4* nAChR間の野生型TxIDの識別はわずか9.3倍であった(表3)。
しかし、表2〜3に示すとおり、2つのサブタイプα3β4 nAChRとα6β4* nAChRとの間の良好な識別が、5つの新規TxID変異体(TxID[S9A]である配列番号7、TxID[S9R]である配列番号19、TxID[S9K]である配列番号24、TxID[14D]である配列番号29、及びTxID[S9E]である配列番号31を含む)において観察された。これらのうち、配列番号7、19、及び29のポリペプチドは、2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChR及びα6β4* nAChR間で高度の識別性を有し、3つのポリペプチドの識別度は比較的似ており、そして識別度は45〜50倍の範囲であった。
新規変異体の配列番号24であるTxID[S9K]が、2つのサブタイプ間の最良の識別を有することが見出され、そしてこれまでで2つの同様のサブタイプα3β4 nAChR及びα6β4* nAChR間の最も高い識別度を有することが見出されたリガンド物質であったことが、特に注目される。TxID[S9K]はわずか10.13nMの半遮断用量でα3β4 nAChRに対して高活性であり、一方α6β4* nAChRに対する遮断活性は失われ、その遮断電流は、10μMの高濃度で50%未満であり、そしてその半遮断用量は>10000nMであった(表2、表3、図11C)。配列番号31、すなわちTxID[S9E]は、α3β4 nAChRに対して比較的弱い活性を有し、その半遮断用量は307.61nMであったが、α6β4* nAChRに対する遮断活性は消失し、10μMの高濃度でα6β4* nAChRに対する遮断活性は有しておらず(図11B、表2、表3)、この変異体ペプチドは、2つの類似のサブタイプのα3β4 nAChR及びα6β4* nAChR間で十分な識別を示した。
しかしながら、先行技術において見いだされたコノトキシンの全ては、2つのサブタイプに関して20倍未満の識別度を有し(表3)、例えば、RegIIA、RegIIA[N11、12A]、PeIA、PIA、BuIAは、2つのサブタイプについて3.1〜17.3倍の識別度を示す。
さらに本発明者らはまた、α3β4 nAChR及びα6β4* nAChRの2つのサブタイプに対する、それぞれ異なる濃度の野生型TxID、変異体TxID[S9A]、及び変異体TxID[S9K]の電流遮断効果も詳細に分析した。結果を図12〜14に示す。具体的な実験工程は、上記の実施例2〜3を参照されたい。
図12及び図13は、それぞれα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRの2つのサブタイプに対する野生型TxIDと変異体TxID[S9A]との電流遮断効果の比較(図12A〜12H)、及び濃度−用量応答曲線(図13A〜13B)を示す。
100nM又は10nMのTxIDは、2つのサブタイプに対して同様の電流遮断強度を示した(図12A、12B、12E、12F)。100nMのTxIDは、2つのサブタイプのα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRの電流をそれぞれ97%及び85%遮断した(図12A〜12B)。10nMのTxIDは、2つのサブタイプのα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRの電流をそれぞれ67%及び46%遮断した(図12E〜12F)。
100nM又は10nMのTxID[S9A]は、2つの受容体サブタイプの電流遮断について大きく異なる効果を示し、これらを区別することができた(図12C、12D、12G、12H)。100nMのTxID[S9A]は、2つのサブタイプα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRの電流をそれぞれ98%及び26%遮断し(図12C〜12D)、有意差を示した。10nMのTxID[S9A]はα3β4 nAChRサブタイプの電流を75%遮断し(図12G)、そして10nMのTxID[S9A]はα6β4* nAChRサブタイプに対する遮断活性を完全に喪失し(図12H)、その電流は対照電流と同じであった。
図13A〜13Bの濃度用量応答曲線はまた、TxID[S9A]が2つのサブタイプのα3β4 nAChR及びα6β4* nAChRについて良好な識別をしたことを反映している。
1μMのTxID[S9K]は、α3β4 nAChRの電流を完全に遮断し(図14A〜14B)、一方10μMの高濃度のTxID[S9K]は、α6/α3β4 nAChRに対して極めて弱い遮断活性、すなわち対照電流の1/4未満の活性を示した(図14A〜14B)。
実施例5:核磁気共鳴(NMR)によるTxID及びTxID[S9A]の空間構造分析
本発明者らはさらに、核磁気共鳴(NMR)及びLuo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. 2013a. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rat α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry 56: 9655-9663 に記載された具体的方法により、TxID及びTxID[S9A]の空間構造を分析した。図15は、TxID[S9A](異性体1)及びTxID(異性体1)の2次化学シフト(縦軸)の分析結果を示す。
本発明者らはさらに、核磁気共鳴(NMR)及びLuo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. 2013a. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rat α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry 56: 9655-9663 に記載された具体的方法により、TxID及びTxID[S9A]の空間構造を分析した。図15は、TxID[S9A](異性体1)及びTxID(異性体1)の2次化学シフト(縦軸)の分析結果を示す。
NMR構造分析は、TxID[S9A]が、水溶液中に異性体1(トランス−トランス異性体、トランス異性体)及び異性体2(シス−トランス異性体)と呼ばれる2つの配座異性体を有することを示した。308Kで、2つの空間異性体の比率は70:30であった。これらの空間異性体は、6位及び13位のプロリン(Pro、P)に先行するペプチド結合のシス−トランス異性化によって形成された。2次αH化学シフトがランダムカール値より0.1ppm大きい場合、それはポリペプチドが典型的な構造的特徴を有することを示し、すなわち、正のシフトはβ型折り畳み構造を表し、負のシフトはαらせん構造を表す(Wishart DS, Bigam CG. , Holm A, Hodges RS, Sykes BD. 1995. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. 1. Investigations of nearest-neighbor effects. Journal of Biomolecular NMR 5: 67-81)。図15は、TxID[S9A]のトランス異性体(異性体1)が、TxIDのトランス異性体と比較して、2次構造特性において大きな差がないことを示す。TxIDの9位のセリン(Ser−9)をアラニン(Ala−9)に変異させると、ポリペプチドの中央部分のα−らせん構造が増強された。シス及びトランス異性体については、TxID及びTxID[S9A]の両方が、ランダムコイル構造を採用する傾向があった(データは示されていない)。
Yu ら. 2012 (Yu, R., Kaas, Q., and Craik, DJ (2012). Delineation of the unbinding pathway of alpha-conotoxin ImI from the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor. The Journal of Physical Chemistry B 116 , 6097-6105) の方法を参照して、α−コノトキシンTxIDとラットα3β4 nAChR又はα6β4 nAChRのリガンド結合ドメインとの相互作用の分子ドッキング分析を行った。元の相同性モデルは、Modeller9v13(Sali and Blundell 1993)ソフトウェア及び2つの分子鋳型を使用して構築された。これら2つの分子鋳型は、それぞれアセチルコリン結合タンパク質(AChBP)及びα−コノトキシンTxIA変異体(PDB識別子2uz6)の結晶構造(Dutertre, S., Ulens, C., Buttner, R., Fish, A., van Elk, R., Kendel, Y., Hopping, G., Alewood, PF, Schroeder, C., Nicke, A. ら. (2007). AChBP-targeted alpha-conotoxin correlates distinct binding orientations With nAChR subtype selectivity. The EMBO Journal 26, 3858-3867)と、単離されたヒトα9サブユニットの結晶構造(PDB識別子4d01)であった(Zouridakis ら. 2014)。α3β4 nAChR及びα6β4 nAChRは、2つのαサブユニット及び3つのβサブユニットからなる五量体であり、受容体へのコノトキシンの結合部位は、α(右側)サブユニットとβ(相補側)サブユニットとの間に形成される界面であると考えられた。分子動力学(MD)シミュレーションソフトウェア及びアンバーff99SB−ILDN(Lindorff-Larsen, K., Piana, S., Palmo, K., Maragakis, P., Klepeis, J.L., Dror, R.O., and Shaw, D.E. (2010). Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field. Proteins 78, 1950-1958)分子力場及びGromacs 5.1 MDエンジン(Pronk, S., Pall, S., Sc Hulz, R., Larsson, P., Bjelkmar, P., Apostolov, R., Shirts, M.R., Smith, J.C., Kasson, P.M., van der Spoel, D.ら. (2013). GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29, 845-854)を用いる方法を使用して、TxIDとラットα3β4 nAChR又はα6β4 nAChRとの相互作用の分子ドッキング結合モデルをそれぞれ改良し、3つの分子動力学(MD)シミュレーション結果を得た(図16)。
α3β4 nAChR及びα6β4* nAChRに対するTxIDの分子ドッキング結合モデル(図16A〜16B)は、2つの間の全体的な差は非常に小さいが、主に結合部位の形状が異なるために、そしてα3サブユニット及びα6サブユニットの結合部位付近のアミノ酸種の違いのために、依然として差があることを示す。50ns以内に行った分子動力学(MD)シミュレーションは、α6β4* nAChRへの結合部位において、弱い水素結合がTxIDのSer−9とβ4 Lys−81との間に形成されたが(図16B)、α3β4 nAChRへの結合部位には水素結合が存在しなかった(図16A)。
TxIDのSer−9側鎖ヒドロキシル基とβ4 Lys−81側鎖窒素原子との間の時間依存性距離を図16Cに示した。Ser−9をアラニンで置換すると、この水素結合相互作用が破壊された。結果は、α6β4* nAChRに対するTxID[S9A]の遮断活性がTxIDのそれと比較して5倍低下したことを示し、これは、300Kでこの点突然変異が約1kcal/molのエネルギー減少(これは水素結合を失うエネルギーと一致する)を引き起こしたという事実に帰せられるかもしれない(Bowie JU. 2011. Membrane protein folding: how important are hydrogen bonds? Curr Opin Struct Biol 21: 42-49)。対照的に、α3β4 nAChRへの結合部位では、TxIDのSer−9と受容体との間に相互作用はなく、従ってS9Aの置換はα3β4 nAChRの遮断活性に影響を及ぼさず、これは実験結果と一致した(表2〜3、図16A)。
TxIDの1位のグリシン(Gly−1)がアラニン(G1A)で置換された場合、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対する遮断活性は、それぞれ17倍及び8倍低下した。図16の分子ドッキング結合モデルによれば、β4サブユニット上の負に荷電したAsp−192とTxIDの1位のグリシンとの間に電荷相互作用があるかもしれない。この相互作用は、野生型α−コノトキシンTxIDと比較して、TxID[G1A]の骨格のコンフォメーション(bone conformation)の変化によって弱められる可能性がある。TxIDの11位のメチオニン(Met−11)をイソロイシン(Ile)(M11l)で置き換えると、α3β4 nAChRに対する遮断活性は20倍低下したが、α6/α3β4 nAChRに対する遮断活性は低下しなかった。分子ドッキングモデルによれば、Met−11は、α3サブユニットのC−ループ上のCys−218と接触しており、より大きい側鎖が立体障害を引き起こすため、M11Aの置換は結合様式の変化を引き起こし得る。M11A変異は、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRの両方に対する遮断活性の完全な喪失をもたらし、そしてそれらの半遮断用量は10000nMを超えた(表2)。対照的に、α6β4への結合モデルでは、α6サブユニット上の結合部位への立体障害を引き起こさずに、Met−11をIleで置換することができ、従ってα6/α3β4 nAChRに対する野生型TxID及び点突然変異TxID[M11I]の遮断活性に影響を及ぼさなかった(図16A〜図16B、表2)。
実施例6:α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRの2つのサブタイプに対するα−コノトキシンTxIDのいくつかの新規変異体の遮断活性の再アッセイ
ラットα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対するTxIDのいくつかの新規変異体の遮断活性を、新たに購入したアフリカツメガエル卵母細胞を使用して実施例2の電気生理学的方法によって再度測定した。結果を表4に示す。結果は、これらの変異体の遮断活性が、それらの半遮断用量(IC50)がわずかに変化(これらは、通常の誤差の変動内であった)したことを除いて、基本的に実施例2及び3の活性と同じであった。これらの結果は、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対する上記変異体の遮断活性をさらに確認した。
ラットα3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対するTxIDのいくつかの新規変異体の遮断活性を、新たに購入したアフリカツメガエル卵母細胞を使用して実施例2の電気生理学的方法によって再度測定した。結果を表4に示す。結果は、これらの変異体の遮断活性が、それらの半遮断用量(IC50)がわずかに変化(これらは、通常の誤差の変動内であった)したことを除いて、基本的に実施例2及び3の活性と同じであった。これらの結果は、α3β4 nAChR及びα6/α3β4 nAChRに対する上記変異体の遮断活性をさらに確認した。
本発明の特定の実施態様を詳細に説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして詳細の様々な修正及び変更が可能であることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
Claims (14)
- 9位のセリンが異なるL型又はD型アミノ酸で置換されている配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドであって、好ましくは、配列番号1に示される配列の9位のセリンが、アラニン、2−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、D−アルギニン、D−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸で置換された、上記ポリペプチド。
- それぞれ配列番号2〜3、7、9、11〜33のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
- 請求項1又は2に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドのN末端から数えて、
第1システインが第3システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第4システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第4システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第2システインが第3システインとジスルフィド結合を形成するか;又は、第1システインが第2システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第3システインが第4システインとジスルフィド結合を形成し、
好ましくは、前記ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、上記ポリペプチド。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを含む単離された融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、好ましくは前記核酸構築物は組換えベクターであり、好ましくは前記核酸構築物は組換え発現ベクターである、上記核酸構築物。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチド又は請求項6に記載の核酸構築物を含む形質転換細胞。
- 場合により医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の少なくとも1つのポリペプチドを含む医薬組成物。
- アセチルコリン受容体を遮断するための医薬の製造における請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用であって、好ましくは前記アセチルコリン受容体は、α3β4アセチルコリン受容体、又はα6β4* アセチルコリン受容体、例えばα6/α3β4アセチルコリン受容体である、上記使用。
- 神経系疾患又は癌の治療及び/又は予防のための医薬の製造における、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用であって、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり;
好ましくは、前記依存症は、以下の要因:ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記使用。 - 有効量の請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを被験体に投与するか又は細胞にを投与する工程を含む、インビボ又はインビトロでアセチルコリン受容体を遮断するか又はアセチルコリンのレベルを調節する方法であって、好ましくはアセチルコリン受容体は、α3β4アセチルコリン受容体、又はα6/α3β4アセチルコリン受容体などのα6β4* アセチルコリン受容体である、上記方法。
- アセチルコリン受容体を遮断するのに使用される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、好ましくは前記アセチルコリン受容体は、α3β4アセチルコリン受容体、又はα6/α3β4アセチルコリン受容体などのα6β4* アセチルコリン受容体である、上記ポリペプチド。
- 神経系疾患又は癌の治療及び/又は予防に使用されるか、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進に使用される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり;
好ましくは、前記依存症は、以下の要因:ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血球、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記ポリペプチド。 - 神経系疾患又は癌を治療及び/又は予防する方法、又は有害生物を駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進をする方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを投与する工程を含み、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも1つであり;
好ましくは、前記依存症は、以下の要因:ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン(アイス)、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質)のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記神経痛は、以下:坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛)の少なくとも1つから選択され;
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因:癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、AIDS、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、***、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症/膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギー)のうちの少なくとも1つによって引き起こされ;
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記方法。
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