JP2020500209A - 食用の巨視的な真菌(macroscopic fungal)の抽出物により植物を誘発するための工程 - Google Patents
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Abstract
Description
−植物細胞壁の木化を刺激することによって既存の細胞障壁を強化すること;
−ファイトアレキシンなどの抗生物質活性を有する化合物の植物による合成;
−キチナーゼ又はグルカナーゼなどの病原体の細胞壁を攻撃し得る酵素タンパク質の合成
がある。
a)巨視的な真菌(macroscopic fungi)の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し;
b)ろ過した抽出物を希釈し、それを10〜65℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、65℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止させられ;
c)得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、100kDa未満の分子量の活性分画を単離すること
によって得られることを特徴とする。
a)食用の巨視的な真菌(macroscopic fungi)の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し;
b)ろ過した抽出物を希釈し、それを10〜65℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、65℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止させられ;
c)得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、100kDa未満の分子量の活性分画を単離することにより
それが得られることを特徴とする、組成物でもある。
例1
0.1%の水素化ホウ素ナトリウムを添加した1リットルの8%水酸化ナトリウム中で、100gの乾燥させ、細かく粉砕したカラカサタケ(<1mm)を取り入れる。懸濁液を室温で24時間撹拌する。氷酢酸溶液を添加することによって、培地をpH6.5にする。グルカナーゼを0.1%w/Vの速度で添加し、混合物を室温で20時間撹拌する。加水分解物を遠心分離し、次いでろ過する。次いで、100kDa多孔膜を備えたMILLIPOREにより市販されるPelliconミニタイプの接線限外ろ過(tangential ultrafiltration)システムにおいて溶液を限外ろ過する。次いで、得られた透過物を1kDaの膜限外ろ過に供して、溶液を脱塩する。溶液を濃縮し、凍結乾燥を行う。このようにして、加水分解物EX1を構成する7gのベージュ色粉末を得る。
原材料はキノコ、プレウロツス・オストレアスツ(Pleurotus Ostreatus)の茎からなる。乾燥させ、細かく粉砕した(<1mm)200gのヒラタケの柄を、0.1%水素化ホウ素ナトリウムの存在下で2Lの8%水酸化ナトリウム中に分散させる。機械的に撹拌しながら、室温で24時間抽出を行う。遠心分離により、NaOH/NaBH4中の不溶性分画を除去する。次いで、得られた上清を氷酢酸で中和する。選択した酵素系は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のβ−グルカナーゼであり、0.1%w/Vで抽出物に添加する。全体を室温で3時間維持する。100℃で10分間の変性後、培地を遠心分離する。得られた抽出物をろ過により清澄化する。得られたろ液を0.1μm多孔膜上で、次いで100kDa膜上で、1バールの圧力で精密ろ過する。使用する系は、MILLIPOREにより市販されるPelliconミニタイプの接線限外ろ過(tangential ultrafiltration)システムである。
原材料はボタンマッシュルームである。100gの、乾燥させ細かく粉砕したキノコ(<1mm)を、0.1%水素化ホウ素ナトリウムの存在下で、1.5Lの8%水酸化ナトリウム中で分散させる。磁気撹拌しながら、室温で24時間抽出を行う。次いで培地を酢酸で中和する。遠心分離後、上清を1kDaで限外ろ過する。β−グルカナーゼを0.1w/Vで抽出物に添加する。混合物を室温で24時間撹拌する。100℃で10分間の変性後、培地を遠心分離する。この透過液に対して1kDaの膜上で限外ろ過を行う。これにより保持液が得られ、次いでこれを凍結乾燥する。EX3抽出物を構成する1gのベージュ色の粉末が得られる。
ヒラタケEX2の抽出物によるトマト防御の刺激を示す研究(図1A〜1Dを参照)
−ガラス下で育成されるマルマンデトマト植物を二葉期で使用する(BBCH 12 102)。対照バッチは12個の鉢に分配された24個の植物からなり;処理したバッチについても同様である。
−t=0に、流出するまで葉面散布を行うことにより、0.4g/Lの濃度で調製したヒラタケEX2の抽出物で各植物を処理する。
−7日間にわたり毎日、植物を回収し、次いで根及び地上部に分ける。タンパク質を適切な緩衝液中で抽出し、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)及びペルオキシダーゼの酵素活性を対応する抽出物中で測定する。これらの活性は植物の防御のマーカーであり:PALはファイトアレキシンの生合成に関与し、一方でペルオキシダーゼは植物細胞の壁を構成するリグニンの形成に関与する。
−比酵素活性は、未処理対照植物に対する、処理植物について得られた値のパーセンテージの形で表す。
図1A:根のPAL活性
図1B:地上部のPAL活性
図1C:根のペルオキシダーゼ活性
図1D:地上部ペルオキシダーゼ活性
ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)の存在下でのカラカサタケ抽出物によるトマトにおける防御の刺激を示す試験(図2参照)
−ガラス下で栽培されるマルマンデトマト植物を二葉期で使用する(BBCH 12 102)。植物の各バッチは、3個の鉢に分配される6個の植物からなる。
−t=0に、流出するまで葉面散布を行うことにより、0.4g/Lの溶液の形態でカラカサタケEX1の抽出物で各植物を処理する。操作はt=2日及びt=5日に再開する。対照植物を、同じ周期であるが、0.5重量%の「Tween」の商標下で販売される界面活性剤の水溶液で処理する。
−t=7日に、植物に病原性真菌(ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、University of Western BrittanyからのUBOCC−A−101100株)を植菌する。0.5重量%の「Tween」の商標で販売される界面活性剤の水溶液中の分生子の懸濁液(分生子約105個/mL)を、液滴(100μL/植物)を規則的に分布させた形態でいくつかの葉の上に沈着させる。
−t=14日に、各植物から葉片を採取することによって植物を回収し、これを−80℃で凍結する。葉の試料からRNAを抽出する。
−既知及び選択された遺伝子に特異的な分子プローブを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)増幅技術によって、防御遺伝子の発現レベルを定量する。
−これらの遺伝子は、PALをコードするもの及び病態形成のいくつかのタンパク質(PRタンパク質)に対応する:PR1(植物の全身性反応のタンパク質マーカー)、PR2(グルカナーゼ型タンパク質)及びPR3(キチナーゼ型タンパク質)。
−構成遺伝子であるチューブリンの発現レベルを参照することによって、遺伝子発現レベルを定量する。結果は、防御工程に関する遺伝子の発現レベルとチューブリンの発現レベルとの間の比として表す。
ヒラタケの抽出物によるリンゴの木における防御の刺激を示す試験(図3参照)
−リンゴの木(マルス・ドメスティカ(Malus domestica)、ゴールデン・デリシャス(Golden Delicious)品種)は発芽からガラス下(20〜25℃、自然周期)で得た。それらを4〜6葉期で使用し、試験手順ごとに30本の植物のブロックに配置する。
−各ブロックに対して流出するまで葉面散布処理を行う。
ヒラタケ抽出物は、0.7g/L乾燥物質の濃度で施用する。
−病原体による攻撃を模倣するために過酸化水素を噴霧することによって、「+H202ブロック」により示されるブロックをJ=1(Jは日を意味する)に処理する(国際公開第2011/161388号パンフレット)。J=3に、植物から葉片を採取する(手順1回あたり葉片10片)。液体窒素中で凍結した後、RNAを抽出し、防御遺伝子(表1で列挙)の発現をqPFD(登録商標)ツール(前述の特許)を用いて定量的PCRにより測定する。
−相対的発現レベルは、いわゆる2−ΔΔCt法を用いて計算した:それらは、3つの参照遺伝子(TuA、アクチン、GAPDH)の相対的発現の幾何平均によって正規化した、WATER対照に対する相対的発現である。これらの相対的発現をlog2に変換して、遺伝子の誘導及び抑制に同じ重みを与える。
ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)の存在下でのカラカサタケ抽出物によるブドウにおける防御の刺激を示す試験(図4参照)
−苗床からの幼若ブドウ植物(カベルネ・ソーヴィニョン(Cabernet Sauvignon)ブドウ品種)をガラス下(20〜25℃、自然光周期)で生育させる。これらは、6枚のよく発達した葉がある少なくとも1本の枝が形成されたときに使用する(BBCH16期)。
−t=0で、地上部の新芽に対してカラカサタケ抽出物の葉面散布処理を行う(スプレッドリーフ(spread leaf)1枚あたり200μLの0.4g/L水溶液(乾燥物質)を1回散布)。操作はt=2日及びt=5日に再開する。対照は処理しない。
−t=7日に、植物全てに病原性真菌(ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea)、University of Western BrittanyからのUBOCC−A−101100菌株)を植菌する。液滴(1000μL/植物)を規則的に分布させた形態で、「Tween」の商標で販売される界面活性剤の0.5重量%の水溶液中の分生子の懸濁液(分生子およそ105個/mL)を数枚の葉に沈着させる。
−t=14日に、処理し、植菌した葉を回収し、対応する抽出物中のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)及びペルオキシダーゼ酵素活性を測定するために、適切な緩衝液中でタンパク質を抽出する。
−比酵素活性は、未処理対照植物に対する、処理植物について得られた値のパーセンテージとして表す。
露地試験におけるジャガイモ葉枯れ病症状の軽減に対するカラカサタケ抽出物の有効性
−葉枯れ病(フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans))に対するカラカサタケ抽出物防御の有効性を判定するために、Auchy−les−Mines(62,France)で2014年にジャガイモ(ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)、Ditta変異株)に対して野外試験を行った。植え付けは2014年4月18日に行った。
−実験プロットにおいて、処置条件あたり4個のマイクロプロットを統計学的に分布させた。
−カラカサタケの抽出物を用いて5回の処理を行った:6月11日(40cm期)、2014年6月18日(BBCH60期)、2014年6月25日(BBCH70期)及び2014年7月9日(BBCH74期)。
−試験開始時には、葉枯れ病の圧力が顕著であり、合成殺真菌剤ジタンの施用が必要であった(2014年6月1日、5cm期〜2014年6月7日、20cm期)。
−次いで、その後の病害発生に対してあまり好ましくない気象条件を考慮して、プロットの2回の人工汚染を行った:1回目は、大量の廃棄物からの汚染葉からの胞子の懸濁によるものであり(2014年5月30日)、2回目は、2014年6月2日の実験室(Eurofins,Loos en Gohelle)からの植菌によるものであった。これらの2回の汚染により、プロット上で得ようとする葉枯れ病の均一な圧力が得られた。
露地試験中のブドウのべと病(プラスモパラ・ビチコラ(Plasmopara viticola))の症状の軽減に対するヒラタケ抽出物の有効性(図6参照)。
−実験プロット上で、処理条件あたり4個のマイクロプロットを統計学的に分布させ;試験は、5月17日に、各基本プロットの第1の株に限定された人工的汚染での管理条件下で行われ、全体的な湿度は規則的な散水により維持した。
−2015年5月12日〜2015年7月6日の間に200L/haの用量で行った処理を表2で示す。対照は処理せず;「銅」処理は、ボルドー混合物を2015年5月12日〜2015年7月6日の間に750gCu/haと同等の用量で施用することからなる(合計7回施用)。ヒラタケ抽出物EX2を、単独で、又はボルドー混合物(ヒラタケ抽出物/Cu)と交互に、の何れかで、35g/haの水溶液の形態で施用する。銅処理が7回ではなく3回施用される同じ用量でのボルドー混合物に基づく処理の有効性を評価することを目的とした手順もまた評価した(Cu1/2)。
BB:ボルドー混合物;Ple:ヒラタケ抽出物;−:未処理
野外試験中のブドウにおけるウドンコ病(エリシフェ・ネカトル(Erysiphe necator))に関連する症状の軽減に対するヒラタケ抽出物の有効性(図7参照)。
−実験プロットにおいて、処置条件あたり4個のマイクロプロットを統計学的に分布させた。
−ウドンコ病は、葉上で非常に離散した相(discrete phase)の後、房上で比較的遅く現れた。6月25日の最初の計数(BBCH77生長期)時に、未処理対照プロットでの病害の正確なレベルが、70.50%の頻度及び30.25%の強度の発病であることが分かった。7月23日の2回目の計数(BBCH85生長期)では、頻度が77.50%、強度が40.60%の発病が観察された。
−2015年4月17日〜2015年6月26日の間に180L/haの用量で処理を行い、処理を表3で与える。対照は処理を受けない。「イオウ」処理は、商品名「Thiovit」で販売される製品を8/kg/haと同等の用量で、2015年4月14日〜2015年6月26日に施用することからなる(合計8回施用)。ヒラタケ抽出物EX2を、単独で、又は上述の「Thiovit」(ヒラタケ抽出物/イオウ)と交互に、の何れかで、35g/ha溶液の形態で施用する。イオウ処理と同じ用量であるが7回ではなく4回施用した上述の製品「Thiovit」に基づく処理の有効性を評価することを目的とした手順もまた評価した(S1/2)。
フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)存在下でのブラキポディウム・ディスタチオン(Brachypodium distachyon)に対するヒラタケ抽出物及びボタンマッシュルーム抽出物による防御の刺激を示す試験
植菌の第10日後にフザリウム萎凋の症状が観察された。
真菌バイオマスを定量し、定量的PCRによって決定された10ngの全ゲノムDNA(植物+真菌)に対するF.グラミネアラム(F.graminearum)ゲノムDNAのngで表した。標準範囲を参照することにより、真菌ゲノムDNAの量を決定するために、F.グラミネアラム(F.graminearum)TUB2遺伝子の特異的プライマーを使用した。
Claims (31)
- 農学的に有用な植物又は観賞用植物における誘発によって病原体に対する防御を付与するのに適した方法であって、前記植物の地上部の少なくとも一部を水性組成物で処理することからなり、その必須活性剤が真菌からの抽出により得られ、前記組成物の活性剤が以下により得られることを特徴とする方法:
a)食用の巨視的な真菌(macroscopic fungi)の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和すること;
b)ろ過した抽出物を希釈し、それを10〜65℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解を、65℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止すること;
c)得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、100kDa未満の分子量の活性分画を単離すること。 - アルカリ抽出段階が、pHが10を超えるアルカリ性水溶液中で5〜15重量部のキノコ粉末の懸濁液を撹拌下で維持しながら、20〜100℃の温度で行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- アルカリ抽出段階により得られる溶液の中和が有機又は無機酸を用いて行われ、得られた沈殿物が除去されることを特徴とする、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- 液相から酸性塩(単数又は複数)及び単純糖を分離するために、アルカリ性抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を撹拌しながら24時間維持することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- アルカリ抽出に供される食用真菌が、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に4〜8のpHを有する組成物を噴霧することによる処理からなり、活性剤の濃度が1.5〜4重量%であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、その乾燥物質に対して5〜15重量%のタンパク質含量を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、乾燥物質に対して60〜80重量%の全糖含量を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、38〜50%グルコース、18〜28%ガラクトース、20〜30%マンノース及び0.5〜4%グルコサミン及び/又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有することを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、その乾燥物質に対して35〜45重量%のグルカンを含有することを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 処理しようとする植物の地上部に噴霧される組成物が、30〜50重量%の、分子量が10kDaより大きい乾燥物質を含有することを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 同時に又は逐次的に又は交互に施用される従来の植物衛生剤による処理済み植物の地上部の処理に関連することを特徴とする、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 真菌性病害、特にブドウ、果樹、野菜作物及び穀類の病害によって形成される群から選択されるもの、及び特にべと病(プラスモパラ・ビチコラ(Plasmopara viticola))、ウドンコ病(エリシフェ・ネカトル(Erysiphe necator))、ブドウの灰色かび病(ボトリティス・シネレア(Botrytis cinerea))、ジャガイモの葉枯れ病(フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans))、黄サビ病(プチニア・ストリイフォルミス(Puccinia striiformis))、セプトリア葉枯病(セプトリア種(Septoria sp.))、コムギのフザリウム赤かび病(フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum))及びリンゴ黒星病(ベンチュリア・イナクアリス(Venturia inaequalis))に対する予防処理を含むことを特徴とする、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 初期生長期及び/又は成体及び生殖生長期に実施されることを特徴とする、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 反復される時間間隔により、必要な頻度で、好ましくは8〜15日ごとに、実施されることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、
a)食用の巨視的な真菌(macroscopic fungi)の粉末に対してアルカリ抽出を行い、次いで得られた抽出物をそのろ過に進む前に中和し;
b)ろ過した抽出物を希釈し、それを10〜65℃でグリコシダーゼに供し、このようにして行われる加水分解が、65℃を超える温度で酵素を不活性化することによって停止され;
c)得られた加水分解物に対してろ過段階を行い、100kDa未満の分子量の活性分画を単離すること
により得られることを特徴とする、組成物。 - アルカリ抽出段階が、pHが10を超えるアルカリ性水溶液中で5〜15重量部のキノコ粉末の懸濁液の撹拌を維持しながら、20〜100℃の温度で行われることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- アルカリ抽出段階により得られる溶液の中和が有機又は無機酸を用いて行われ、得られた沈殿物が除去されることを特徴とする、請求項17又は18のいずれかに記載の組成物。
- 液相から酸性塩(単数又は複数)及び単純糖を分離するために、アルカリ性抽出物の中和後に得られる生成物に対してろ過を数回行うことを特徴とする、請求項17〜19のいずれかに記載の組成物。
- グリコシダーゼを用いて行われる酵素による加水分解を撹拌しながら24時間維持することを特徴とする、請求項17〜20のいずれかに記載の組成物。
- アルカリ抽出に供される食用真菌が、ヒラタケ、カラカサタケ及びボタンマッシュルームによって形成される群から選択される種であることを特徴とする、請求項17〜21のいずれかに記載の組成物。
- 活性剤のその濃度が150〜400mg/Lであることを特徴とする、請求項17〜22のいずれかに記載の組成物。
- その乾燥物質に対して5〜15重量%のタンパク質含量を含むことを特徴とする、請求項17〜23のいずれかに記載の組成物。
- その乾燥物質に対して60〜80重量%の総糖含量を含むことを特徴とする、請求項17〜24のいずれかに記載の組成物。
- 38〜50%グルコース、18〜28%ガラクトース、20〜30%マンノース及び0.5〜4%グルコサミン及び/又はアセチル化グルコサミンの重量割合に対応する単糖処方を有することを特徴とする、請求項17〜25のいずれかに記載の組成物。
- その乾燥物質に対して35〜45重量%のグルカンを含有することを特徴とする、請求項17〜26のいずれかに記載の組成物。
- 30〜50重量%の、分子質量が10kDaよりも大きい乾燥物質を含有することを特徴とする、請求項17〜27のいずれかに記載の組成物。
- 少なくとも1つの相溶性の処方剤を含有することを特徴とする、請求項17〜28のいずれかに記載の組成物。
- 殺真菌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、殺虫剤及び生物的防除剤からなる群から選択される少なくとも1つの抗植物病原性剤を含むことを特徴とする、請求項29に記載の組成物。
- 同時施用のための植物に対する少なくとも1つの栄養素を含有することを特徴とする、請求項17〜29のいずれかに記載の組成物。
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