JP2020121962A - Protein film and method for producing protein film - Google Patents
Protein film and method for producing protein film Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020121962A JP2020121962A JP2019016332A JP2019016332A JP2020121962A JP 2020121962 A JP2020121962 A JP 2020121962A JP 2019016332 A JP2019016332 A JP 2019016332A JP 2019016332 A JP2019016332 A JP 2019016332A JP 2020121962 A JP2020121962 A JP 2020121962A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- silk fibroin
- spider silk
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 222
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 211
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 316
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 claims abstract description 297
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims abstract description 46
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000000465 moulding Methods 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 242
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 174
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 157
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 55
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 26
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 20
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 20
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002108 rapid electrokinetic patterning Methods 0.000 description 17
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 241000238902 Nephila clavipes Species 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 101150082901 ADF3 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000356504 Argiope Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- -1 spider silk Chemical compound 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 108010028210 spidroin 1 Proteins 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001235531 Arachnura Species 0.000 description 2
- 241001157788 Araneus Species 0.000 description 2
- 241000193935 Araneus diadematus Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 2
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000533862 Cyrtarachne Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 2
- 241000238903 Nephila Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000047292 Poltys Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091324 3C proteases Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150003973 ADF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000298979 Acusilas Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010000241 Arthropod Proteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000498637 Brevibacillus agri Species 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000386111 Cyclosa Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000553108 Dyschiriognatha Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N Ethinyl estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N 0.000 description 1
- 241000328437 Euprosthenops australis Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000023946 Gasteracantha Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001387337 Latrodectus hesperus Species 0.000 description 1
- 241000238866 Latrodectus mactans Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000144155 Microbacterium ammoniaphilum Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001419196 Neoscona Species 0.000 description 1
- 241000742192 Nephilengys cruentata Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000533689 Ordgarius Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000607717 Serratia liquefaciens Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001123481 Tetragnatha Species 0.000 description 1
- 241001123483 Tetragnathidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108091014693 glutathione binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009998 heat setting Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000007602 hot air drying Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005312 nonlinear dynamic Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
本発明は、タンパク質フィルム及びタンパク質フィルムの製造方法に関する。 The present invention relates to a protein film and a method for producing a protein film.
環境保全意識の高まりから、石油由来の材料の代替物質の検討が進められており、強度などの点で優れる構造タンパク質がその候補として挙げられる。例えば、構造タンパク質からなるキャストフィルム等の成形体が提案されており、例えば、特許文献１には、結晶化度が２５〜５０％の範囲内であり、可塑剤を２〜３０重量％の範囲内で含む絹フィブロインフィルムが開示されている。
With increasing awareness of environmental protection, studies are underway on alternative substances for petroleum-derived materials, and structural proteins, which are superior in terms of strength, can be cited as candidates. For example, a molded product such as a cast film made of a structural protein has been proposed. For example,
優れた伸度を有するタンパク質フィルムは、果物カバー等の被覆材、医療用フィルム等の用途への応用が期待できる。しかしながら、従来のタンパク質フィルムでは、伸度の点で改善の余地があった。 A protein film having excellent elongation can be expected to be applied to a covering material such as a fruit cover and a medical film. However, conventional protein films have room for improvement in terms of elongation.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、伸度が向上したタンパク質フィルム及びその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a protein film having improved elongation and a method for producing the same.
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
クモ糸フィブロインと、多価アルコールとを含む、タンパク質フィルム。
［２］
多価アルコールが、グリセリンである、［１］に記載のタンパク質フィルム。
［３］
多価アルコールの含有量が、タンパク質フィルムの全質量を基準として、５〜４０質量％である、［１］又は［２］に記載のタンパク質フィルム。
［４］
クモ糸フィブロインを含む、タンパク質フィルムであって、タンパク質フィルムの破断点変位が３００％以上である、タンパク質フィルム。
［５］
タンパク質フィルムのひずみエネルギーが、２５ｍＪ以上である、［４］に記載のタンパク質フィルム。
［６］
タンパク質フィルムのタフネスが、タフネスが、２０ＭＪ／ｍ３以上である、［４］又は［５］に記載のタンパク質フィルム。
［７］
クモ糸フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のタンパク質フィルム。
［８］
クモ糸フィブロイン及び多価アルコールを含むドープ液を用いて、タンパク質フィルムを成形する工程を備える、タンパク質フィルムの製造方法。
［９］
多価アルコールがグリセリンである、［８］に記載のタンパク質フィルムの製造方法。
［１０］
クモ糸フィブロインと多価アルコールとを含むタンパク質フィルムに対して、メタノール処理を行う工程を備える、タンパク質フィルムのタフネスをコントロールする方法。
The present invention relates to the following inventions, for example.
[1]
A protein film containing spider silk fibroin and polyhydric alcohol.
[2]
The protein film according to [1], wherein the polyhydric alcohol is glycerin.
[3]
The protein film according to [1] or [2], wherein the content of the polyhydric alcohol is 5 to 40% by mass based on the total mass of the protein film.
[4]
A protein film comprising spider silk fibroin, wherein the displacement at break of the protein film is 300% or more.
[5]
The protein film according to [4], wherein the strain energy of the protein film is 25 mJ or more.
[6]
The protein film according to [4] or [5], wherein the toughness of the protein film is 20 MJ/m 3 or more.
[7]
The protein film according to any one of [1] to [6], wherein the spider silk fibroin is a modified spider silk fibroin.
[8]
A method for producing a protein film, comprising a step of molding a protein film using a dope solution containing spider silk fibroin and a polyhydric alcohol.
[9]
The method for producing a protein film according to [8], wherein the polyhydric alcohol is glycerin.
[10]
A method for controlling the toughness of a protein film, comprising the step of subjecting a protein film containing spider silk fibroin and a polyhydric alcohol to methanol.
本発明によれば、伸度が向上したタンパク質フィルム及びその製造方法が提供される。本発明に係るタンパク質フィルムは、応力を維持しつつ、伸度が向上しているため、タフネスも向上している。 According to the present invention, a protein film having improved elongation and a method for producing the same are provided. Since the protein film according to the present invention has improved elongation while maintaining stress, it has improved toughness.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, modes for carrying out the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
〔タンパク質フィルム〕
第一の実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロインと、多価アルコールと、を含む。多価アルコールは、当該タンパク質フィルムの内部に含まれているものである。多価アルコールは、タンパク質フィルムの内部に分散して含まれていてよい。多価アルコールはタンパク質フィルムの内部に均一に分散していてよい。
[Protein film]
The protein film according to the first embodiment includes spider silk fibroin and polyhydric alcohol. The polyhydric alcohol is contained inside the protein film. The polyhydric alcohol may be dispersed and contained inside the protein film. The polyhydric alcohol may be uniformly dispersed inside the protein film.
第一の実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロインと、多価アルコールとを含むため、伸度が顕著に向上している。第一の実施形態に係るタンパク質フィルムは、応力を維持しつつ、伸度が向上しているため、タフネスも向上している。 Since the protein film according to the first embodiment contains spider silk fibroin and polyhydric alcohol, the elongation is remarkably improved. Since the protein film according to the first embodiment has improved elongation while maintaining stress, it has improved toughness.
第二の実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロインを含む、タンパク質フィルムであって、タンパク質フィルムの破断点変位が３００％以上である。第二の実施形態に係るタンパク質フィルムは、優れた伸度を有している。第二の実施形態に係るタンパク質フィルムは、多価アルコールを含んでいてよい。第二の実施形態に係るタンパク質フィルムは、タンパク質フィルムの破断点変位が３００％以上であることに加えて、後述するひずみエネルギーが、２５ｍＪ以上であってよい。 The protein film according to the second embodiment is a protein film containing spider silk fibroin, and the displacement at break of the protein film is 300% or more. The protein film according to the second embodiment has excellent elongation. The protein film according to the second embodiment may include a polyhydric alcohol. In the protein film according to the second embodiment, in addition to the breaking point displacement of the protein film being 300% or more, the strain energy described later may be 25 mJ or more.
第三の実施形態の実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロインを含む、タンパク質フィルムであって、タンパク質フィルムのひずみエネルギーが、２５ｍＪ以上である。第三の実施形態に係るタンパク質フィルムは、優れた伸度を有している。第三の実施形態に係るタンパク質フィルムは、優れた伸度を有していることに加えて、タフネスにも優れている。第三の実施形態に係るタンパク質フィルムは、多価アルコールを含んでいてよい。第三の実施形態に係るタンパク質フィルムは、タンパク質フィルムのひずみエネルギーが、２５ｍＪ以上であることに加えて、タンパク質フィルムの破断点変位が３００％以上であってよい。 The protein film according to the embodiment of the third embodiment is a protein film containing spider silk fibroin, and the strain energy of the protein film is 25 mJ or more. The protein film according to the third embodiment has excellent elongation. The protein film according to the third embodiment has excellent elongation as well as excellent toughness. The protein film according to the third embodiment may include a polyhydric alcohol. In the protein film according to the third embodiment, the strain energy of the protein film may be 25 mJ or more, and the breaking point displacement of the protein film may be 300% or more.
本実施形態に係るタンパク質フィルムは、タンパク質であるクモ糸フィブロインを原料としていることから、生分解性も有している。本実施形態に係るタンパク質フィルムは、優れた伸度を有しているため、果物カバー等の被覆材、医療用フィルム等の用途に好適に用いることができる。 The protein film according to the present embodiment is also biodegradable because it uses spider silk fibroin, which is a protein, as a raw material. Since the protein film according to the present embodiment has excellent elongation, it can be suitably used for applications such as a covering material such as a fruit cover and a medical film.
本実施形態に係るタンパク質フィルムの破断点変位は、３００％以上、３５０％以上、４００％以上、４５０％以上、５００％以上、又は５２０％以上であることが好ましい。本実施形態に係るタンパク質フィルムの破断点変位は、例えば、７００％以下、６００％以下、又は５５０％以下であってよい。未延伸フィルムであるタンパク質フィルムの破断点変位が上記範囲内であってよい。 The breaking point displacement of the protein film according to the present embodiment is preferably 300% or more, 350% or more, 400% or more, 450% or more, 500% or more, or 520% or more. The displacement at break of the protein film according to this embodiment may be, for example, 700% or less, 600% or less, or 550% or less. The displacement at break of the protein film, which is an unstretched film, may be within the above range.
本実施形態に係るタンパク質フィルムひずみエネルギーは、２５ｍＪ以上、３０ｍＪ以上、３５ｍＪ以上、又は４０ｍＪ以上であることが好ましい。本実施形態に係るタンパク質フィルムのひずみエネルギーは、例えば、６０ｍＪ以下、又は５５ｍＪ以下であってよい。未延伸フィルムであるタンパク質フィルムのひずみエネルギーが上記範囲内であってよい。 The protein film strain energy according to the present embodiment is preferably 25 mJ or more, 30 mJ or more, 35 mJ or more, or 40 mJ or more. The strain energy of the protein film according to this embodiment may be, for example, 60 mJ or less, or 55 mJ or less. The strain energy of the protein film, which is an unstretched film, may be within the above range.
本実施形態に係るタンパク質フィルムの最大点応力は、例えば、１０ＭＰａ以上、又は１５ＭＰａ以上であってよく、１００ＭＰａ以下であってよい。 The maximum point stress of the protein film according to the present embodiment may be, for example, 10 MPa or more, 15 MPa or more, and 100 MPa or less.
タンパク質フィルムのタフネスは、２５ＭＪ／ｍ３以上、３０ＭＪ／ｍ３以上、３５ＭＪ／ｍ３以上、又は４０ＭＪ／ｍ３以上であることが好ましい。本実施形態に係るタンパク質フィルムのタフネスは、例えば、６０ＭＪ／ｍ３以下、又は５５ＭＪ／ｍ３以下あってよい。未延伸フィルムであるタンパク質フィルムのタフネスが上記範囲内であってよい。 The toughness of the protein film is preferably 25 MJ/m 3 or more, 30 MJ/m 3 or more, 35 MJ/m 3 or more, or 40 MJ/m 3 or more. The toughness of the protein film according to this embodiment may be, for example, 60 MJ/m 3 or less, or 55 MJ/m 3 or less. The toughness of the protein film, which is an unstretched film, may be within the above range.
タンパク質フィルムの破断点変位、最大点応力、ひずみエネルギー及びタフネスは、後述する実施例に記載の引張試験により求めることができる。具体的には、まず、ダンベル形状に切り出したタンパク質フィルムを、試験片として、引張試験により２５℃、相対湿度６０％の条件で測定される破断点変位である。引張試験は、測定長(つかみ具間）は８ｍｍ、測定幅２ｍｍ、両つかみ部位長は７ｍｍ、両つかみ部幅５ｍｍの条件で行うことができる。厚測定は８ｍｍの部分をＮ＝１で測定した。引張試験機はインストロン３３４５を用い、ロードセルを１０Ｎで使用し、引張速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行うことができる。測定数は１水準につき最低３回行い、平均値を用いる。 The displacement at break, maximum stress, strain energy and toughness of the protein film can be determined by a tensile test described in Examples described later. Specifically, first, the displacement at break measured with a protein film cut into a dumbbell shape as a test piece under the conditions of a tensile test at 25° C. and a relative humidity of 60%. The tensile test can be performed under the conditions that the measurement length (between grips) is 8 mm, the measurement width is 2 mm, the length of both grip portions is 7 mm, and the width of both grip portions is 5 mm. For the thickness measurement, a portion of 8 mm was measured with N=1. An Instron 3345 is used as a tensile tester, a load cell is used at 10 N, and a tensile speed is 10 mm/min. The number of measurements is at least 3 times per level, and the average value is used.
タンパク質フィルムの厚みは、タンパク質フィルムの用途に応じて、適宜設定してよい。例えば、タンパク質フィルムの厚みは、伸度のばらつきが抑制されやすくなる観点から、１〜１０００μｍであってよく、１０〜３００μｍであってよく、１０〜１００μｍであってよく、３０〜１００μｍであってよく、５０〜２００μｍであってよく、３０〜７０μｍであることが好ましい。タンパク質フィルムの厚みは、後述する実施例に記載の方法で測定することができる。タンパク質フィルムの厚みは、ドープ液に用いる溶媒の選択等により調整することができる。例えば、ドープ溶媒に水を用いる場合、厚み３０〜１００μｍのタンパク質フィルムが得られやすくなる傾向があり、ドープ溶媒に有機溶媒を用いる場合、厚み５０〜２００μｍのタンパク質フィルムが得られやすくなる傾向がある。 The thickness of the protein film may be appropriately set depending on the application of the protein film. For example, the thickness of the protein film may be 1 to 1000 μm, 10 to 300 μm, 10 to 100 μm, or 30 to 100 μm from the viewpoint of easily suppressing the variation in elongation. The thickness may be 50 to 200 μm, preferably 30 to 70 μm. The thickness of the protein film can be measured by the method described in Examples below. The thickness of the protein film can be adjusted by, for example, selecting the solvent used for the dope solution. For example, when water is used as the dope solvent, a protein film having a thickness of 30 to 100 μm tends to be easily obtained, and when an organic solvent is used as the dope solvent, a protein film having a thickness of 50 to 200 μm tends to be easily obtained. ..
タンパク質フィルムは、未延伸フィルムであってもよく、延伸フィルムであってもよい。延伸フィルムは、１軸延伸フィルム又は２軸延伸フィルムであってよい。 The protein film may be an unstretched film or a stretched film. The stretched film may be a uniaxially stretched film or a biaxially stretched film.
タンパク質フィルムは、メタノール処理がなされていてもよく、メタノール処理がなされていなくてもよい。伸度及びタフネスの観点からは、メタノール処理がなされていないことが好ましく、応力の観点からは、メタノール処理がなされていることが好ましい。メタノール処理は、タンパク質フィルムと、メタノールとを接触させることにより実施することができる。メタノール処理は、メタノールと接触させた後に、メタノールを乾燥させることを含んでいてよい。例えば、メタノール処理は、タンパク質フィルムを室温（２０〜３０℃）でメタノール中に浸漬させ、その後、室温（２０〜３０℃）で乾燥させることにより実施してよい。タンパク質フィルムと、メタノールとを接触させる時間は、例えば、１〜１０分間であってよい。メタノールとしては、和光純薬 試薬特級９９．５％メタノールを用いることができる。 The protein film may or may not have been treated with methanol. From the viewpoint of elongation and toughness, it is preferable that the methanol treatment is not performed, and from the viewpoint of stress, it is preferable that the methanol treatment is performed. The methanol treatment can be carried out by bringing the protein film into contact with methanol. Methanol treatment may include contacting with methanol and then drying the methanol. For example, the methanol treatment may be carried out by immersing the protein film in methanol at room temperature (20 to 30°C) and then drying it at room temperature (20 to 30°C). The contact time of the protein film and methanol may be, for example, 1 to 10 minutes. As the methanol, Wako Pure Chemicals Reagent Special Grade 99.5% methanol can be used.
＜クモ糸フィブロイン＞
本実施形態に係るクモ糸フィブロインは、天然由来のクモ糸フィブロインであってもよく、改変クモ糸フィブロインであってもよい。改変クモ糸フィブロインは、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したフィブロインであってもよく、合成により製造されたフィブロインであってもよい。
<Spider thread fibroin>
The spider silk fibroin according to the present embodiment may be a naturally occurring spider silk fibroin or a modified spider silk fibroin. The modified spider silk fibroin may be a fibroin produced by a microorganism or the like by a gene recombination technique, or may be a synthetically produced fibroin.
本明細書において「改変クモ糸フィブロイン」とは、天然由来のクモ糸フィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するクモ糸フィブロインを意味し、本明細書において「天然由来のクモ糸フィブロイン」とは、天然由来のクモ糸フィブロインと同一のアミノ酸配列を有するクモ糸フィブロインを意味する。 In the present specification, "modified spider silk fibroin" means a spider silk fibroin having an amino acid sequence different from that of naturally-derived spider silk fibroin, and in the present specification, "naturally-derived spider silk fibroin" means naturally-derived spider silk fibroin. Means a spider silk fibroin having the same amino acid sequence as that of the spider silk fibroin.
天然由来のクモ糸フィブロインとしては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質等のクモ類が産生するクモ糸フィブロインが挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。 Examples of naturally-derived spider silk fibroin include spider silk fibroin produced by spiders such as large vesicle guideline thread protein, weft thread protein, and vesicular protein. Since the large yarn ejection guide thread has a repeating region including a crystalline region and an amorphous region (also referred to as an amorphous region), it has high stress and elasticity. The weft thread of the spider thread is characterized by not having a crystalline region but having a repeating region composed of an amorphous region. The weft thread is less in stress than the large spit tube bookmark thread, but has high elasticity.
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。ＡＤＦ３に由来するクモ糸タンパク質は、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。 The large vesicle dragline protein is produced in the large ampullate gland of the spider, and is characterized by excellent toughness. Examples of the large vesicle dragline silk proteins include large ampullate spidroins MaSp1 and MaSp2 derived from Nephila clavipes, and ADF3 and ADF4 derived from Aranius diadematus. ADF3 is one of the two major bookmark thread proteins of the Japanese spider. The spider silk protein derived from ADF3 is relatively easy to synthesize and has excellent properties in terms of strength and elongation and toughness.
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。 Weft thread proteins are produced in the flagelliform gland of the spider. Examples of the weft thread protein include flagelliform silk protein derived from Nephila clavipes.
クモ類が産生するクモ糸フィブロインの更なる例として、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。 As further examples of spider silk fibroin produced by spiders, for example, spiders belonging to the genus Araneus (Araneus) such as Onigumo, Nihononigamo, Akanonigumo, Aonigumo and Maenoonigumo, etc. Spiders belonging to the genus (Neoscona), spiders belonging to the genus Pronous (Pronus genus), such as spiders, and spiders belonging to the genus Cyrtarachne (genus Cyrtarachne), such as A. Spiders belonging to the genus Gasteracantha, such as the spider Spider, spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the Mamei Taisekigumo and the Mutsutogayekigumo, spiders such as Argiope brue, Argiope argiope and Argiope bruei, Argiope brue, Argiope spp. Spiders belonging to the genus Arachnura, such as the spiders belonging to the genus Arachnura, spiders belonging to the genus Acusilas, such as the spider Spider, genus Cytophora, such as the spider spider such as the Spider Spider, the Northern Spider, and the Spider Spider. Spider silks produced by spiders belonging to the genus Poltys (genus Poltys), spiders belonging to the genus Cyclosa, such as spider silk, spider spiders, such as margomo spider, and spider spider Proteins and spiders belonging to the genus Tetragnatha, such as the Japanese spider Spider, Aspergillus sp., Harabiro Ashida spider and Urocore striped spider, etc. Spiders belonging to the genus Nephila, such as Nephila spider, spiders belonging to the genus Ano spider, such as golden spider, and the genus Dyschiriognatha. Spiders belonging to the genus Latrodecus, such as the black widow spider, and spiders belonging to the family Tetragnathidae, such as spiders belonging to the genus Euprostenops. Examples include spider silk proteins produced by moss.
クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。 As a more specific example of the spider silk protein produced by spiders, for example, fibroin-3 (adf-3) [from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin-4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 1 [derived from Nephila clavipes 50 (session amino acid sequence No. AGen04)] ), U37520 (base sequence)), major ampullate spidroin 1 [derived from Latrodectus hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein Nevalina spirain spiroline 2 (base sequence). No. AAL32472 (amino acid sequence), AF441245 (base sequence)), major ampullate spidroin 1 [from Euprosthenops australis] (GenBank Accession No. CAJ00428 (amino acid sequence), AJ9733155 (base sequence)), and major 2 amperoid ampullate ampulate. (GenBank Accession No. CAM32249.1 (amino acid sequence), AM490169 (base sequence)), minor ampullate silk protein 1 [Nephila clavipes] (GenBank accession No. AAC14589. 1 (amino acid sequence)), minor ampulate NPurolate. clavipes] (GenBank Accession No. AAC14591.1 (amino acid sequence)), minor amplify spidroin-like protein [Nephilengys cruentata] (GenBank Accession). No. ABR37278.1 (amino acid sequence) and the like.
本実施形態に係る改変クモ糸フィブロインは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係る改変クモ糸フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。 The modified spider silk fibroin according to the present embodiment is represented by, for example, Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It may be a protein containing a domain sequence. The modified spider silk fibroin according to the present embodiment may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence. The N-terminal sequence and the C-terminal sequence are typically, but not limited to, regions having no repeat of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 amino acids.
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６であってもよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。 As used herein, the term “domain sequence” refers to a crystalline region (typically corresponding to the (A) n motif of an amino acid sequence) unique to fibroin and an amorphous region (typically, to a REP of an amino acid sequence). The amino acid sequence represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif. Means an array. Here, the (A) n motif represents an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2 to 27. (A) The number of amino acid residues of the n motif may be 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16. The ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the (A) n motif may be 40% or more, and is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues). At least seven of the (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of only alanine residues. REP indicates an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues. REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues. m represents an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300. The plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. The plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
改変クモ糸フィブロインは、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のクモ糸フィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。 Modified spider silk fibroin, for example, those that have modified its amino acid sequence depending on the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin (for example, by changing the gene sequence of the cloned naturally-derived spider silk fibroin Modified) or artificially designed and synthesized independently of naturally-derived spider silk fibroin (for example, a desired amino acid sequence can be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence). Those that have).
改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。 The modified spider silk fibroin is, for example, a gene sequence of cloned naturally-derived spider silk fibroin, for example, an amino acid sequence corresponding to one or more amino acid residues replaced, deleted, inserted and/or added. It can be obtained by modification. Amino acid residue substitutions, deletions, insertions and/or additions can be performed by methods well known to those skilled in the art such as partial directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983) and the like.
改変クモ糸フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変クモ糸フィブロイン（第１の改変クモ糸フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第２の改変クモ糸フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第３の改変クモ糸フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第４の改変クモ糸フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変クモ糸フィブロイン（第５の改変クモ糸フィブロイン）、及びグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変クモ糸フィブロイン（第６の改変クモ糸フィブロイン）が挙げられる。 As a specific example of the modified spider silk fibroin, a modified spider silk fibroin (first modified spider silk fibroin) derived from a large vesicular duct bookmark silk protein produced in the large ampullary gland of the spider, the content of glycine residues Modified spider silk fibroin (second modified spider silk fibroin), (A) modified spider silk fibroin having a reduced content of n motif (third modified spider silk fibroin), glycine residue content , And (A) a modified spider silk fibroin having a reduced content of n motif (a fourth modified spider silk fibroin), a modified spider silk fibroin having a domain sequence including a region having a large hydrophobic index locally (the fifth). Modified spider silk fibroin), and a modified spider silk fibroin having a domain sequence with a reduced content of glutamine residues (sixth modified spider silk fibroin).
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変クモ糸フィブロイン（第１の改変クモ糸フィブロイン）としては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変クモ糸フィブロインは、式１中、ｎは３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の改変クモ糸フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の改変クモ糸フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
As a modified spider silk fibroin (first modified spider silk fibroin) derived from a large vaginal canal silk thread protein produced in the large vaginal gland of a spider, a compound represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m Proteins that include the domain sequences that are described. In the
第１の改変クモ糸フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、タンパク質であってもよい。 The first modified spider silk fibroin contains a unit of the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the C-terminal sequence is an amino acid shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3. The protein may be a sequence or an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the same as the amino acid sequence consisting of the amino acids of the C-
第１の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 As a more specific example of the first modified spider silk fibroin, (1-i) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or (1-ii) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 with 90% or more sequence identity Mention may be made of modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having sex. The sequence identity is preferably 95% or more.
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) consisting of a start codon, a His10 tag, and a HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminal, The 13th repeat region was increased to approximately double, and the translation was mutated so that it terminated at the 1154th amino acid residue. The C-terminal amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
（１−ｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (1-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:4.
グリシン残基の含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第２の改変クモ糸フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変クモ糸フィブロインは、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。 The modified spider silk fibroin having a reduced glycine residue content (second modified spider silk fibroin) has a reduced glycine residue content in its domain sequence as compared to naturally-occurring spider silk fibroin. It has a different amino acid sequence. The second modified spider silk fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one glycine residue in REP being replaced with another amino acid residue, as compared with naturally-occurring spider silk fibroin. Can be said.
第２の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The domain sequence of the second modified spider silk fibroin is GGX and GPGXX in REP (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is a residue other than glycine), as compared with naturally occurring spider silk fibroin. In the at least one motif sequence selected from the above, an amino acid sequence corresponding to the substitution of one glycine residue in at least one or more of the motif sequences with another amino acid residue is You may have.
第２の改変クモ糸フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。 In the second modified spider silk fibroin, the proportion of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more based on the entire motif sequence.
第２の改変クモ糸フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。 The second modified spider silk fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and from the above domain sequence, the (A) n motif located closest to the C-terminal side is described above. The total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of XGX (where X represents an amino acid residue other than glycine) contained in all REPs in the sequence excluding the sequence up to the C-terminal of the domain sequence is defined as z, and When the total number of amino acid residues in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence is defined as w, z/w is 30%. As described above, it may have an amino acid sequence of 40% or more, 50% or more, or 50.9% or more. (A) The number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. It is more preferable that it is 100%, and it is even more preferable that it is 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
第２の改変クモ糸フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。 The second modified spider silk fibroin is preferably one in which the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by substituting one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue. In the second modified fibroin, the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, 6 % Or less is more preferable, 4% or less is still more preferable, and 2% or less is particularly preferable. The content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method of calculating the content ratio (z/w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロイン（改変クモ糸フィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。 The method of calculating z/w will be described in more detail. First, in the spider silk fibroin (modified spider silk fibroin) containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , the (A) n motif located closest to the C-terminal side from the domain sequence. To the C-terminal of the domain sequence, the amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all the REPs contained in the sequence. The total number of amino acid residues constituting XGX is z. For example, when 50 amino acid sequences consisting of XGX are extracted (no duplication), z is 50×3=150. Further, for example, when there is an X (center X) contained in two XGXs, as in the case of an amino acid sequence consisting of XGXGX, calculation is performed by deducting the overlap (in the case of XGXGX, 5 amino acid residues are used. is there). w is the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence from the domain sequence. For example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 1, w is 4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230 (excluding the (A) n motif located at the most C-terminal side). Then, z/w (%) can be calculated by dividing z by w.
第２の改変クモ糸フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。 In the second modified spider silk fibroin, z/w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, further preferably 58.7% or more, 70 % Or more is more preferable, and 80% or more is still more preferable. The upper limit of z/w is not particularly limited, but may be 95% or less, for example.
第２の改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。 The second modified spider silk fibroin is obtained by substituting at least a part of the nucleotide sequence encoding a glycine residue from the gene sequence of the cloned naturally-derived spider silk fibroin to encode another amino acid residue, for example. It can be obtained by modification. At this time, one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected as the glycine residue to be modified, or the glycine residue may be substituted so that z/w is 50.9% or more. In addition, for example, it can be obtained by designing an amino acid sequence satisfying the above-mentioned aspect from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In any case, in addition to the modification corresponding to substituting the glycine residue in REP with another amino acid residue from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin, one or more amino acid residues are further substituted, Amino acid sequence alterations corresponding to deletions, insertions and/or additions may be made.
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。 The above-mentioned other amino acid residue is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than a glycine residue, but is a valine (V) residue, a leucine (L) residue, an isoleucine (I) residue, a methionine ( M) residue, proline (P) residue, hydrophobic amino acid residue such as phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S) ) Residue, lysine (K) residue and hydrophilic amino acid residue such as glutamic acid (E) residue are preferred, and valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue and glutamine ( Q) residues are more preferred, and glutamine (Q) residues are even more preferred.
第２の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the second modified spider silk fibroin, (2-i) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or (2-ii) SEQ ID NO: 6 , Modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
（２−ｉ）の改変クモ糸フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ糸フィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。 The modified spider silk fibroin of (2-i) will be described. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is obtained by substituting GQX for all GGX in REP of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponding to naturally-derived spider silk fibroin. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side toward the C-terminal side, and further before the C-terminal sequence. One [(A) n motif-REP] was inserted into. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and further has a partial glutamine (Q) residue. It is a substitution of serine (S) residue and a part of amino acids on the N-terminal side was deleted so that the molecular weight was almost the same as that of SEQ ID NO:7. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences existing in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C terminus of the sequence repeated 4 times.
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のクモ糸フィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。 The z/w value in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally-derived spider silk fibroin) is 46.8%. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 each have a z/w value of 58.7%, 70.1%, 66.1% and 70.0%. In addition, the values of x/y in the serrated ratios (described later) 1:1.8 to 11.3 of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are: They are 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.3%, respectively.
（２−ｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
（２−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (2-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. The modified spider silk fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（２−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (2-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is contained in REP. When the total number of amino acid residues of an amino acid sequence consisting of XGX (where X represents an amino acid residue other than glycine) is z and the total number of amino acid residues of REP in the above domain sequence is w, z /W is preferably 50.9% or more.
第２の改変クモ糸フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変クモ糸フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。 The second modified spider silk fibroin may include a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection and visualization of the modified spider silk fibroin.
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。 As the tag sequence, for example, an affinity tag utilizing specific affinity (binding property, affinity) with another molecule can be mentioned. A specific example of the affinity tag is a histidine tag (His tag). The His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up and has a property of specifically binding to a metal ion such as nickel. Therefore, isolation of modified fibroin by chelating metal chromatography is performed. Can be used for. Specific examples of the tag sequence include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (amino acid sequence including His tag sequence and hinge sequence).
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。 Further, tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変クモ糸フィブロインを精製することができる。 Furthermore, an "epitope tag" utilizing an antigen-antibody reaction can also be used. By adding a peptide (epitope) showing antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound. Examples of the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like. By utilizing the epitope tag, the modified spider silk fibroin can be easily purified with high specificity.
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変クモ糸フィブロインを回収することもできる。 Further, a tag sequence that can be cleaved with a specific protease can also be used. By treating the protein adsorbed via the tag sequence with a protease, the modified spider silk fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
タグ配列を含む第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４若しく配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the second modified fibroin containing a tag sequence, (2-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or (2-iv) A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 can be mentioned.
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are respectively SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 And an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including a His tag sequence and a hinge sequence) added to the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
（２−ｉｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
（２−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (2-iv) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. The modified spider silk fibroin of (2-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（２−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (2-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and is contained in REP. When the total number of amino acid residues of an amino acid sequence consisting of XGX (where X represents an amino acid residue other than glycine) is z and the total number of amino acid residues of REP in the above domain sequence is w, z /W is preferably 50.9% or more.
第２の改変クモ糸フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The second modified spider silk fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set depending on the type of host.
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第３の改変クモ糸フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。 (A) n motifs modified spider silk fibroin content is reduced (Third modified spider silk fibroin), the domain sequence is compared to the naturally occurring silk fibroin, containing (A) n motif It has a reduced amount of amino acid sequence. It can be said that the domain sequence of the third modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or a plurality of (A) n motifs as compared with naturally-occurring spider silk fibroin.
第３の改変クモ糸フィブロインは、天然由来のクモ糸フィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The third modified spider silk fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the (A) n motif deleted from the naturally occurring spider silk fibroin by 10 to 40%.
第３の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The third modified spider silk fibroin has a domain sequence of 1 to 3 (A) n motifs at least from the N-terminal side to the C-terminal side as compared with the naturally-derived spider silk fibroin ( A) It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the n motif.
第３の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The third modified spider silk fibroin has a domain sequence that has at least two consecutive (A) n motif deletions from the N-terminal side toward the C-terminal side, as compared to naturally-derived spider silk fibroin, and It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of one (A) n motif repeated in this order.
第３の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The third modified spider silk fibroin has a domain sequence having an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least every two (A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side. Good.
第３の改変クモ糸フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。 The third modified spider silk fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and has two adjacent [[A] from the N-terminal side to the C-terminal side. When the number of amino acid residues of REP of the [ n motif-REP] unit is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues of the other REP is 1. The maximum value of the sum of the amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units of 8 to 11.3 is x, and the total number of amino acid residues of the domain sequence is y. When it does, x/y may have an amino acid sequence of 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more. (A) The number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. It is more preferable that it is 100%, and it is even more preferable that it is 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、クモ糸フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。 The method of calculating x/y will be described in more detail with reference to FIG. FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from spider silk fibroin. The domain sequence is (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n from the N-terminal side (left side). Motif-third REP (10 amino acid residues)-(A) n motif-fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n motif-fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has an n motif sequence.
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。 Two adjacent [(A) n motif-REP] units are selected sequentially from the N-terminal side to the C-terminal side so that there is no overlap. At this time, an unselected [(A) n motif-REP] unit may be present. In FIG. 1, pattern 1 (comparison of first REP and second REP, and comparison of third REP and fourth REP), pattern 2 (comparison of first REP and second REP, and 4th REP and 5th REP), pattern 3 (2nd REP and 3rd REP, and 4th REP and 5th REP), pattern 4 (1st REP) (Comparison of the second REP). There are other selection methods besides this.
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。 Next, for each pattern, the number of amino acid residues of each REP in two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared. The comparison is performed by determining the ratio of the number of other amino acid residues when the number of amino acid residues having a smaller number is 1. For example, in the case of comparing the first REP (50 amino acid residues) and the second REP (100 amino acid residues), when the first REP having a smaller number of amino acid residues is 1, the second REP The ratio of the number of amino acid residues is 100/50=2. Similarly, in the case of comparing the fourth REP (20 amino acid residues) and the fifth REP (30 amino acid residues), when the fourth REP having a smaller number of amino acid residues is 1, the fifth REP The ratio of the number of amino acid residues is 30/20=1.5.
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。以下このような比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。 In FIG. 1, when the one having the smaller number of amino acid residues is set to 1, the pair of [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the number of other amino acid residues is 1.8 to 11.3. It is shown by a solid line. Hereinafter, such a ratio will be referred to as a knurled ratio. When the smaller number of amino acid residues is set to 1, the ratio of the number of other amino acid residues is less than 1.8 or more than 11.3, the set of [(A) n motif-REP] units is indicated by a broken line. Indicated.
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
In each pattern, the total number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units shown by solid lines is added (not only REP but also the number of amino acid residues of (A) n motif is is there.). Then, the added total values are compared, and the total value of the patterns having the maximum total value (maximum total value) is set as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。 Then, x/y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y in the domain sequence.
第３の改変クモ糸フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。 In the third modified spider silk fibroin, x/y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 65% or more, and more preferably 70% or more. Even more preferably, it is even more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more. The upper limit of x/y is not particularly limited, and may be 100% or less, for example. When the notch ratio is 1:1.9 to 11.3, x/y is preferably 89.6% or more, and when the notch ratio is 1:1.8 to 3.4, x/y is x. /Y is preferably 77.1% or more, and when the notch ratio is 1:1.9 to 8.4, x/y is preferably not less than 75.9% and the notch ratio is 1 In the case of 1.9 to 4.1, x/y is preferably 64.2% or more.
第３の改変クモ糸フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変クモ糸フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。 When the third modified spider silk fibroin is a modified spider silk fibroin in which at least seven of the (A) n motifs present in the domain sequence are alanine residues only, x/y is 46.4%. It is preferably at least 50%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 55%, even more preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, It is particularly preferably 80% or more. The upper limit of x/y is not particularly limited and may be 100% or less.
第３の改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。 The third modified spider silk fibroin includes, for example, one or more of the sequences encoding the (A) n motif so that x/y is 64.2% or more from the gene sequence of the cloned naturally-derived spider silk fibroin. Can be obtained by deleting In addition, for example, an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs is designed so that x/y is 64.2% or more from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin. Alternatively, it can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In any case, in addition to the modification corresponding to the deletion of the (A) n motif from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin, one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and/or Alternatively, the amino acid sequence corresponding to the addition may be modified.
第３の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号１８、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the third modified spider silk fibroin, (3-i) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, or (3-ii) SEQ ID NO: 18 , A modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
（３−ｉ）の改変クモ糸フィブロインについて説明する。配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ糸フィブロインに相当する配列番号１０で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。 The modified spider silk fibroin of (3-i) will be described. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 lacks the (A) n motif every two amino acids from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponding to naturally-derived spider silk fibroin from the N-terminal side to the C-terminal side. And one [(A) n motif-REP] was inserted in front of the C-terminal sequence. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in which all GGX in REP are replaced with GQX. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted at the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and further has a partial glutamine (Q) residue. It is a substitution of serine (S) residue and a part of amino acids on the N-terminal side was deleted so that the molecular weight was almost the same as that of SEQ ID NO:7. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences existing in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). Is a sequence in which a His tag is added to the C terminus of the sequence repeated 4 times.
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のクモ糸フィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１０、配列番号１８、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。 The x/y value of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally-derived spider silk fibroin) at a serrated ratio of 1:1.8 to 11.3 is 15.0%. The values of x/y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 are both 93.4%. The value of x/y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is 92.7%. The value of x/y in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is 89.3%. The values of z/w in the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are 46.8%, 56.2%, 70.1%, 66. 1% and 70.0%.
（３−ｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
（３−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (3-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. The modified spider silk fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（３−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and has C from the N-terminal side. When the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared toward the terminal side, and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is set to 1 , The ratio of the number of amino acid residues of the other REP is 1.8 to 11.3 (giza ratio is 1:1.8 to 11.3), and the two [(A) n motif-REP] units are adjacent to each other. It is preferable that x/y is 64.2% or more, where x is the maximum value of the total sum of the number of amino acid residues and y is the total number of amino acid residues of the domain sequence.
第３の改変クモ糸フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。 The third modified spider silk fibroin may include the above-described tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.
タグ配列を含む第３の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the third modified spider silk fibroin containing a tag sequence, (3-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, or (3-iv ) A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 can be mentioned.
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１８、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are respectively SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 And an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including a His tag sequence and a hinge sequence) added to the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
（３−ｉｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
（３−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (3-iv) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. The modified spider silk fibroin of (3-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（３−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and has C from the N-terminal side. When the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared toward the terminal side, and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is set to 1 , The ratio of the number of amino acid residues of the other REP is 1.8 to 11.3, the maximum value of the total value obtained by adding the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units When x is set and x is the total number of amino acid residues in the domain sequence, x/y is preferably 64.2% or more.
第３の改変クモ糸フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The third modified spider silk fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set depending on the type of host.
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第４の改変クモ糸フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変クモ糸フィブロインのドメイン配列は、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変クモ糸フィブロインは、上述したグリシン残基の含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第２の改変クモ糸フィブロイン）と、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変クモ糸フィブロイン（第３の改変クモ糸フィブロイン）の特徴を併せ持つ改変クモ糸フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変クモ糸フィブロイン、及び第３の改変クモ糸フィブロインで説明したとおりである。 The modified spider silk fibroin (the fourth modified spider silk fibroin) in which the content of glycine residues and the content of the (A) n motif are reduced is compared with that of naturally-derived spider silk fibroin. , (A) has an amino acid sequence with a reduced content of glycine residues in addition to a reduced content of n motifs. The domain sequence of the fourth modified spider silk fibroin has at least one or more (A) n motifs deleted as compared to naturally-occurring spider silk fibroin, as well as at least one or more of the REPs. It can be said that the glycine residue has an amino acid sequence corresponding to the substitution of another amino acid residue. That is, in the fourth modified spider silk fibroin, the content of the modified spider silk fibroin (second modified spider silk fibroin) in which the content of the glycine residue was reduced and the content of the (A) n motif were reduced. A modified spider silk fibroin having the characteristics of the modified spider silk fibroin (third modified spider silk fibroin). Specific aspects and the like are as described for the second modified spider silk fibroin and the third modified spider silk fibroin.
第４の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列、（４−ｉｉ）配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む改変クモ糸フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。 As a more specific example of the fourth modified spider silk fibroin, (4-i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 can be mentioned. Specific embodiments of the modified spider silk fibroin containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 are as described above.
局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変クモ糸フィブロイン（第５の改変クモ糸フィブロイン）は、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。 A modified spider silk fibroin having a domain sequence containing a region having a locally large hydrophobic index (fifth modified spider silk fibroin) has a domain sequence of 1 in REP as compared with naturally-derived spider silk fibroin. Alternatively, a plurality of amino acid residues are replaced by amino acid residues having a high hydrophobicity index, and/or one or more amino acid residues having a high hydrophobicity index are inserted into the REP, which are locally localized. It may have an amino acid sequence containing a region having a large hydrophobicity index.
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。 It is preferable that the region having a locally large hydrophobicity index is composed of consecutive 2 to 4 amino acid residues.
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。 The above-mentioned amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). More preferably, it is a residue.
第５の改変フィブロインは、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。 The fifth modified fibroin has one or more amino acid residues in REP replaced with an amino acid residue having a large hydrophobicity index, and/or 1 in REP, as compared with naturally-derived spider silk fibroin. Or, in addition to modification corresponding to insertion of a plurality of amino acid residues having a large hydrophobicity index, further substitution, deletion, insertion of one or more amino acid residues as compared with naturally-derived spider silk fibroin And/or there may be amino acid sequence modifications corresponding to the additions.
第５の改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。 The fifth modified spider silk fibroin has, for example, one or more hydrophilic amino acid residues (for example, an amino acid residue having a negative hydrophobicity index) in REP from the cloned gene sequence of naturally-derived spider silk fibroin. It can be obtained by substituting a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index) and/or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP. Further, for example, one or more hydrophilic amino acid residues in REP are replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin, and/or one or more hydrophobic amino acids in REP. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the insertion of a residue and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In any case, one or more hydrophilic amino acid residues in REP were substituted with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin, and/or one or more hydrophobic amino acids in REP. In addition to the modification corresponding to the insertion of the amino acid residue, an amino acid sequence modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acid residues may be performed.
第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。 The fifth modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and extends from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the above domain sequence. In all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the domain sequence, the total number of amino acid residues contained in the region where the average hydrophobic index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more is p, When the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence is q, the p/q is 6 It may have an amino acid sequence of 2% or more.
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。 Regarding the hydrophobic index of amino acid residues, a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) “A simple method for displaying the hydropathic charactor of a pro. 105-132). Specifically, the hydrophobicity index (hydropathic index, hereinafter also referred to as "HI") of each amino acid is as shown in Table 1 below.
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
The method for calculating p/q will be described in more detail. For the calculation, a sequence obtained by removing the sequence from the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m to the C-terminal of the domain sequence (A) n motif located at the most C-terminal side. (Hereinafter, referred to as “array A”) is used. First, in all REPs contained in the sequence A, the average value of the hydrophobicity index of four consecutive amino acid residues is calculated. The average value of the hydrophobicity index is obtained by dividing the total HI of each amino acid residue contained in four consecutive amino acid residues by 4 (the number of amino acid residues). The average value of the hydrophobicity index is obtained for all four consecutive amino acid residues (each amino acid residue is used for calculating the
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図２の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。 For example, when 20 consecutive “4 consecutive amino acid residues having an average hydrophobicity index of 2.6 or more” are extracted (no overlap), the average hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2 A region of 0.6 or more includes 20 consecutive 4 amino acid residues (no duplication), and p is 20×4=80. Further, for example, when two “4 consecutive amino acid residues having an average value of the hydrophobicity index of 2.6 or more” overlap by 1 amino acid residue, the hydrophobicity index of the consecutive 4 amino acid residues The region having an average value of 2.6 or more contains 7 amino acid residues (p=2×4-1=7. “−1” is a deduction for the overlap). For example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 2, since seven “4 consecutive amino acid residues having an average value of the hydrophobicity index of 2.6 or more” do not overlap, p is 7×4= 28. Further, for example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 2, q is 4+50+4+40+4+10+4+20+4+30=170 ((A) n motif present at the end on the C-terminal side is not included). Next, p/q(%) can be calculated by dividing p by q. In the case of FIG. 2, 28/170=16.47%.
第５の改変クモ糸フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。 In the fifth modified spider silk fibroin, p/q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and 20% or more. It is even more preferable, and it is even more preferable that it is 30% or more. The upper limit of p/q is not particularly limited, but may be 45% or less, for example.
第５の改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。 The fifth modified spider silk fibroin is, for example, one or more hydrophilic amino acid residues in REP (for example, the amino acid sequence of the cloned naturally-derived spider silk fibroin so that the above p/q condition is satisfied). , An amino acid residue having a negative hydrophobicity index) with a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue having a positive hydrophobicity index), and/or one or more hydrophobic amino acids in REP It can be obtained by inserting a residue and locally modifying it into an amino acid sequence containing a region having a large hydrophobicity index. Alternatively, for example, it can be obtained by designing an amino acid sequence satisfying the above p/q condition from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In any case, one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a large hydrophobicity index, and/or 1 or more in REP, as compared with naturally-derived spider silk fibroin. In addition to modification corresponding to the insertion of a plurality of amino acid residues having a large hydrophobicity index, further modification corresponding to substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acid residues is performed. Good.
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。 The amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A ) Is preferable, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferable.
第５の改変クモ糸フィブロインの具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a specific example of the fifth modified spider silk fibroin, (5-i) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 21, or (5-ii) SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
（５−ｉ）の改変クモ糸フィブロインについて説明する。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のクモ糸フィブロインの（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つになるよう欠失したものである。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対し、各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつ配列番号２２で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。 The modified spider silk fibroin of (5-i) will be described. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is one obtained by deleting the amino acid sequence of continuous alanine residues in the (A) n motif of naturally-derived spider silk fibroin so that the number of continuous alanine residues is five. Is. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO:19 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22 by inserting an amino acid sequence (VLI) consisting of three amino acid residues at every other REP at two positions, and shown by SEQ ID NO:22. A part of amino acids on the C-terminal side is deleted so that the molecular weight is almost the same as that of the amino acid sequence. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO:23 is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22 by inserting two alanine residues at the C-terminal side of each (A) n motif and further leaving a part of glutamine (Q) residue. The amino acid sequence is obtained by substituting the group with a serine (S) residue and deleting a part of the amino acids on the C-terminal side so that the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 has almost the same molecular weight. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO:20 is obtained by inserting an amino acid sequence (VLI) consisting of three amino acid residues at every other REP at one position into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:23. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 with two amino acid sequences (VLI) each consisting of three amino acid residues inserted every other REP.
（５−ｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
（５−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (5-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21. The modified spider silk fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（５−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located at the most C-terminal side (A ) In all REPs included in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence, it is included in the region where the average value of the hydrophobic index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more. The total number of amino acid residues contained is p, and the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence is q. At times, it is preferable that p/q is 6.2% or more.
第５の改変クモ糸フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。 The fifth modified spider silk fibroin may include a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.
タグ配列を含む第５の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the fifth modified spider silk fibroin containing a tag sequence, (5-iii) SEQ ID NO: 24, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, or (5-iv) SEQ ID NO: 24 , A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 12 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively. (Including sequences and hinge sequences).
（５−ｉｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.
（５−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (5-iv) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26. The modified spider silk fibroin of (5-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m . The sequence identity is preferably 95% or more.
（５−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号２４、配列番号２５若しくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26, and is located at the most C-terminal side (A ) In all REPs included in the sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence, it is included in the region where the average value of the hydrophobic index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more. The total number of amino acid residues contained is p, and the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence is q. At times, it is preferable that p/q is 6.2% or more.
第５の改変クモ糸フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The fifth modified spider silk fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set depending on the type of host.
グルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変クモ糸フィブロイン（第６の改変クモ糸フィブロイン）は、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。 The modified spider silk fibroin having a domain sequence with a reduced content of glutamine residues (sixth modified spider silk fibroin) has a reduced content of glutamine residues as compared to naturally-derived spider silk fibroin. It has an amino acid sequence.
第６の改変クモ糸フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。 The sixth modified spider silk fibroin preferably contains at least one motif selected from the GGX motif and the GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.
第６の改変クモ糸フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。 When the sixth modified spider silk fibroin contains a GPGXX motif in the REP, the GPGXX motif content is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more. The upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited and may be 50% or less, or 30% or less.
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
In the present specification, the “GPGXX motif content rate” is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n Motif-REP] m or Formula 2: [(A) n Motif-REP] m- (A) n The most C-terminal of the spider silk fibroin containing the domain sequence represented by the n motif. In all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located on the side to the C terminus of the domain sequence, the total number of GPGXX motifs contained in the region is tripled ( That is, the total number of G and P in the GPGXX motif is set as s, and the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further (A) n When the total number of amino acid residues of all REPs excluding the motif is t, the GPGXX motif content rate is calculated as s/t.
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、クモ糸フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。 In the calculation of the GPGXX motif content, "the sequence in which the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence" is "the most C-terminal side". (A) sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence" (the sequence corresponding to REP) may include a sequence having a low correlation with the sequence characteristic of spider silk fibroin, and m Is small (that is, when the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content rate, and is for eliminating this effect. When the “GPGXX motif” is located at the C-terminal of REP, it is treated as a “GPGXX motif” even if “XX” is “AA”.
図３は、クモ糸フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図３を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図３に示したクモ糸フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図３中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図３のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。 FIG. 3 is a schematic diagram showing a domain sequence of spider silk fibroin. A method of calculating the GPGXX motif content rate will be specifically described with reference to FIG. First, in the spider silk fibroin domain sequence shown in FIG. 3 (“[(A) n motif-REP] m- (A) n motif” type.), all REPs are “most C-terminal position. (A) Since it is included in the “sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” (the sequence shown as “region A” in FIG. 3), s is calculated. The number of GPGXX motifs is 7, and s is 7×3=21. Similarly, all REPs are “sequences obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence” (the sequence shown as “region A” in FIG. 3). .), the total number t of amino acid residues of all REPs excluding the (A) n motif from the sequence is 50+40+10+20+30=150. Then, s/t (%) can be calculated by dividing s by t, which is 21/150=14.0% in the case of fibroin in FIG.
第６の改変クモ糸フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。 The sixth modified spider silk fibroin preferably has a glutamine residue content of 9% or less, more preferably 7% or less, further preferably 4% or less, and 0%. Particularly preferred.
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
In the present specification, the "glutamine residue content rate" is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n Motif-REP] m or Formula 2: [(A) n Motif-REP] m- (A) n The most C-terminal of the spider silk fibroin containing the domain sequence represented by the n motif. In all the REPs contained in the sequence (sequence corresponding to “region A” in FIG. 3) in which the sequence from the (A) n motif located on the side to the C terminus of the domain sequence is excluded from the domain sequence, The total number of glutamine residues contained is defined as u, and the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further, the (A) n motif is removed from all REPs. When the total number of amino acid residues is t, the glutamine residue content rate is calculated as u/t. In the calculation of the glutamine residue content rate, the reason why “the sequence in which the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence” is the target is the same as the above-mentioned reason. It is the same.
第６の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。 The sixth modified spider silk fibroin has one or more glutamine residues in REP deleted in its domain sequence, or has been substituted with another amino acid residue, as compared with the naturally-occurring spider silk fibroin. It may have a corresponding amino acid sequence.
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。 The "other amino acid residue" may be any amino acid residue other than the glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue. The hydrophobicity index of amino acid residues is shown in Table 1.
表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。 As shown in Table 1, as amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues, isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M ) An amino acid residue selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H) can be mentioned. it can. Among these, an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) is more preferable. More preferably, it is an amino acid residue selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F).
第６の改変クモ糸フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。 The sixth modified spider silk fibroin has a REP hydrophobicity of preferably −0.8 or more, more preferably −0.7 or more, further preferably 0 or more, and 0.1. It is even more preferably 3 or more, and particularly preferably 0.4 or more. The upper limit of the hydrophobicity of REP is not particularly limited and may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むクモ糸フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図３の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
In the present specification, “hydrophobicity of REP” is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n Motif-REP] m or Formula 2: [(A) n Motif-REP] m- (A) n The most C-terminal of the spider silk fibroin containing the domain sequence represented by the n motif. In all REPs contained in the sequence (sequence corresponding to “region A” in FIG. 3) in which the sequence from the (A) n motif located on the side to the C terminus of the domain sequence is excluded from the domain sequence, The sum of the hydrophobicity indices of each amino acid residue was defined as v, and the sequence from the (A) n motif located closest to the C terminus to the C terminus of the domain sequence was removed from the domain sequence, and further the (A) n motif was removed. The hydrophobicity of REP is calculated as v/t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs. In the calculation of the hydrophobicity of REP, the reason why "the sequence in which the sequence from the (A) n motif located at the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence" is the target is the same as the above-mentioned reason. It is the same.
第６の改変クモ糸フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のクモ糸フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。 The sixth modified spider silk fibroin has a domain sequence in which one or more glutamine residues in REP are deleted, and/or one or more in REP, as compared to naturally occurring spider silk fibroin. In addition to the modification corresponding to the substitution of the glutamine residue of the above with another amino acid residue, the modification of the amino acid sequence corresponding to the replacement, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acid residues It may be.
第６の改変クモ糸フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のクモ糸フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のクモ糸フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。 The sixth modified spider silk fibroin includes, for example, deleting one or more glutamine residues in REP from the cloned gene sequence of naturally-derived spider silk fibroin, and/or one or more glutamine in REP. It can be obtained by substituting a residue for another amino acid residue. Further, for example, one or more glutamine residues in REP were deleted from the amino acid sequence of naturally-derived spider silk fibroin, and/or one or more glutamine residues in REP were replaced with other amino acid residues. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the substitution and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
第６の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロイン、又は（６−ｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the sixth modified spider silk fibroin, (6-i) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: Modified spider silk fibroin comprising the amino acid sequence represented by 43, or (6-ii) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: A modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 43 can be mentioned.
（６−ｉ）の改変クモ糸フィブロインについて説明する。 The modified spider silk fibroin of (6-i) will be described.
配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つにする等の生産性を向上させるためのアミノ酸の改変を行ったものである。一方、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０は、グルタミン残基（Ｑ）の改変は行っていないため、グルタミン残基含有率は、天然由来のフィブロインのグルタミン残基含有率と同程度である。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) is (A) n based on the base sequence and amino acid sequence of naturally-occurring fibroin, Nephila clavipes (GenBank Accession Nos.: P46804.1, GI: 1174415). This is a modification of amino acids for improving productivity, such as increasing the number of consecutive alanine residues to 5 in the amino acid sequence in which alanine residues are consecutive in the motif. On the other hand, in Met-PRT410, since the glutamine residue (Q) is not modified, the glutamine residue content is about the same as the glutamine residue content of naturally occurring fibroin.
配列番号２７で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８８）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (M_PRT888) is obtained by replacing all QQ in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VL.
配列番号２８で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９６５）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (M_PRT965) is obtained by replacing all QQ in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with TS and replacing the remaining Q with A.
配列番号２９で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ８８９）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (M_PRT889) is obtained by replacing all QQ in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VL and replacing the remaining Q with I.
配列番号３０で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１６）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。 The amino acid sequence (M_PRT916) shown in SEQ ID NO: 30 is obtained by replacing all QQ in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VI and replacing the remaining Q with L.
配列番号３１で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ９１８）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 (M_PRT918) is obtained by replacing all QQ in Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7) with VF and replacing the remaining Q with I.
配列番号３４で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ５２５）は、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０（配列番号７）に対し、アラニン残基が連続する領域（Ａ５）に２つのアラニン残基を挿入し、Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側のドメイン配列２つを欠失させ、かつグルタミン残基（Ｑ）１３箇所をセリン残基（Ｓ）又はプロリン残基（Ｐ）に置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (M_PRT525) has a molecular weight of Met-PRT410 in which two alanine residues are inserted into a region (A 5 ) where alanine residues are continuous, with respect to Met-PRT410 (SEQ ID NO: 7). Two domain sequences on the C-terminal side were deleted so as to be almost the same as, and 13 positions of glutamine residues (Q) were replaced with serine residues (S) or proline residues (P).
配列番号３２で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９９）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。 The amino acid sequence (M_PRT699) shown in SEQ ID NO: 32 is obtained by substituting VL for all QQ in M_PRT525 (SEQ ID NO: 34).
配列番号３３で示されるアミノ酸配列（Ｍ＿ＰＲＴ６９８）は、Ｍ＿ＰＲＴ５２５（配列番号３４）中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 (M_PRT698) is obtained by replacing all QQ in M_PRT525 (SEQ ID NO: 34) with VL and replacing the remaining Q with I.
配列番号４３で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｃ末端に配列番号４２で示されるアミノ酸配列が付加される前のアミノ酸配列）中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO:43 (Met-PRT966) has all the QQ in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:9 (the amino acid sequence before the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:42 is added to the C-terminal) being VF And the remaining Q is replaced with I.
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 43 all have a glutamine residue content of 9% or less. Yes (Table 2).
（６−ｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (6-i) consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 43. It may be one.
（６−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (6-ii) has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 43 and 90. It includes an amino acid sequence having a sequence identity of% or more. The modified spider silk fibroin of (6-ii) is also represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif. It is a protein containing a domain sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
（６−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified spider silk fibroin of (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
第６の改変クモ糸フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変クモ糸フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。 The sixth modified spider silk fibroin may include a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection and visualization of the modified spider silk fibroin.
タグ配列を含む第６の改変クモ糸フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉｉｉ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（６−ｉｖ）配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変クモ糸フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the sixth modified spider silk fibroin containing a tag sequence, (6-iii) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or a modified fibroin comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:44, or (6-iv) SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 or An example is a modified spider silk fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:44.
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号４３で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 44 are SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, respectively. , The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (including His tag sequence and hinge sequence) was added to the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 43. It is a thing. Since only the tag sequence was added to the N-terminal, the glutamine residue content did not change, and SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41. And the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:44 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).
（６−ｉｉｉ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified spider silk fibroin of (6-iii) consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 or SEQ ID NO:44. It may be one.
（６−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (6-iv) has amino acid sequences 90 and 90 shown in SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 44. It includes an amino acid sequence having a sequence identity of% or more. The modified spider silk fibroin of (6-iv) is also represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif. It is a protein containing a domain sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
（６−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｖ）の改変クモ糸フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。 The modified spider silk fibroin of (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified spider silk fibroin of (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
第６の改変クモ糸フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The sixth modified spider silk fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set depending on the type of host.
改変クモ糸フィブロインは、第１の改変クモ糸フィブロイン、第２の改変クモ糸フィブロイン、第３の改変クモ糸フィブロイン、第４の改変クモ糸フィブロイン、第５の改変クモ糸フィブロイン、及び第６の改変クモ糸フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変クモ糸フィブロインであってもよい。 The modified spider silk fibroin includes a first modified spider silk fibroin, a second modified spider silk fibroin, a third modified spider silk fibroin, a fourth modified spider silk fibroin, a fifth modified spider silk fibroin, and a sixth modified spider silk fibroin. The modified spider silk fibroin may have at least two or more of the characteristics of the modified spider silk fibroin.
改変クモ糸フィブロインは、親水性改変クモ糸フィブロインであってもよく、疎水性改変クモ糸フィブロインであってもよい。疎水性改変クモ糸フィブロインとは、改変クモ糸フィブロインを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ）が０以上である改変クモ糸フィブロインである。疎水性指標は表１に示したとおりである。また、親水性改変クモ糸フィブロインとは、上記の平均ＨＩが０未満である改変クモ糸フィブロインである。 The modified spider silk fibroin may be a hydrophilic modified spider silk fibroin or a hydrophobic modified spider silk fibroin. The hydrophobic modified spider silk fibroin is a value obtained by calculating the sum of hydrophobicity indices (HI) of all amino acid residues constituting the modified spider silk fibroin, and then dividing the sum by the total number of amino acid residues (average HI ) Is 0 or more modified spider silk fibroin. The hydrophobicity index is as shown in Table 1. The hydrophilic modified spider silk fibroin is a modified spider silk fibroin having an average HI of less than 0.
疎水性改変クモ糸フィブロインとしては、例えば、上述した第６の改変フィブロインを挙げることができる。疎水性改変クモ糸フィブロインのより具体的な例としては、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む改変クモ糸フィブロインが挙げられる。 Examples of the hydrophobic modified spider silk fibroin include the above-described sixth modified fibroin. More specific examples of the hydrophobic modified spider silk fibroin include amino acids represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 43. The modified spider silk fibroin containing the amino acid sequence shown by the sequence, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 or SEQ ID NO:44.
親水性改変クモ糸フィブロインとしては、例えば、上述した第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、及び第５の改変フィブロインを挙げることができる。親水性クモ糸タンパク質のより具体的な例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む改変クモ糸フィブロインが挙げられる。 Examples of the hydrophilic modified spider silk fibroin include the above-mentioned first modified fibroin, second modified fibroin, third modified fibroin, fourth modified fibroin, and fifth modified fibroin. More specific examples of the hydrophilic spider silk protein include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: A modified spider silk fibroin containing the amino acid sequence represented by 15, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
上述した改変クモ糸フィブロインは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 The modified spider silk fibroin described above may be used alone or in combination of two or more.
改変クモ糸フィブロインは、例えば、当該改変クモ糸フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。 Modified spider silk fibroin, for example, by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the modified spider silk fibroin and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence, It can be produced by expressing a nucleic acid.
改変クモ糸フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、改変クモ糸フィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したクモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等で自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、改変クモ糸フィブロインの精製及び／又は確認を容易にするため、Ｎ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を合成してもよい。 The method for producing the nucleic acid encoding the modified spider silk fibroin is not particularly limited. For example, the nucleic acid can be produced by a method of amplifying and cloning by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or a method of chemically synthesizing, using a gene encoding modified spider silk fibroin. The method for chemically synthesizing a nucleic acid is not particularly limited, and for example, based on the amino acid sequence information of the spider silk protein obtained from the NCBI web database or the like, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan KK) A gene can be chemically synthesized by a method of ligating an oligonucleotide automatically synthesized by, for example, PCR. At this time, in order to facilitate purification and/or confirmation of the modified spider silk fibroin, a nucleic acid encoding the modified spider silk fibroin consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag added to the N-terminus was synthesized. May be.
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とする改変クモ糸フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。 The regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (eg, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host. As a promoter, an inducible promoter that functions in a host cell and is capable of inducing expression of the target modified spider silk fibroin may be used. The inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。 The type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, or an artificial chromosome vector. As the expression vector, one that can autonomously replicate in the host cell or can be integrated into the host chromosome and contains a promoter at a position where the nucleic acid encoding the modified spider silk fibroin can be transcribed is preferably used. ..
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。 As the host, any of prokaryote and eukaryote such as yeast, filamentous fungus, insect cell, animal cell and plant cell can be preferably used.
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、改変クモ糸フィブロインをコードする核酸、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 When a prokaryote such as a bacterium is used as a host, the expression vector is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time, contains a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid encoding a modified spider silk fibroin, and a transcription termination sequence. It is preferably a vector. A gene that controls the promoter may be included.
原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。 Examples of prokaryotes include microorganisms belonging to the genus Escherichia, the genus Brevibacillus, the genus Serratia, the genus Bacillus, the genus Microbacterium, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium and the genus Pseudomonas. Examples of the microorganism belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli. Examples of the microorganism belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri. Examples of microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia liquefaciens. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis. Examples of microorganisms belonging to the genus Microbacterium include Microbacterium ammoniaphilum and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatum. Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammoniagenes and the like. Examples of the microorganism belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida and the like.
原核生物を宿主とする場合、改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。 When using a prokaryote as a host, examples of a vector for introducing a nucleic acid encoding a modified spider silk fibroin include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, Examples thereof include pUB110 and pNCO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238569).
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。 Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (mold and the like). Examples of yeasts include yeasts belonging to the genera Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, and the like. Examples of the filamentous fungus include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, and the like.
真核生物を宿主とする場合、改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。 When a eukaryote is used as a host, examples of the vector into which the nucleic acid encoding the modified spider silk fibroin is introduced include YEp13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051). As a method for introducing the expression vector into the host cell, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method and the like.
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。 As a method for expressing a nucleic acid by a host transformed with an expression vector, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition. ..
改変クモ糸フィブロインは、例えば、形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に改変クモ糸フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。形質転換された宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。 The modified spider silk fibroin can be produced, for example, by culturing a transformed host in a culture medium, producing and accumulating the modified spider silk fibroin in the culture medium, and collecting the modified spider silk fibroin from the culture medium. The method of culturing the transformed host in the culture medium can be performed according to the method usually used for culturing the host.
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。 When the host is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by the host to efficiently culture the host. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it is a medium that can be used.
炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。 The carbon source may be any one that can be assimilated by the host, and examples thereof include glucose, fructose, sucrose, and molasses containing these, carbohydrates such as starch and starch hydrolysates, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. , And alcohols such as ethanol and propanol can be used.
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。 As the nitrogen source, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digested products thereof can be used.
無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。 As the inorganic salts, for example, potassium dihydrogenphosphate, dipotassium hydrogenphosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate can be used.
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。 Cultivation of prokaryotic organisms such as Escherichia coli or eukaryotic organisms such as yeast can be carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture. The culture temperature is, for example, 15 to 40°C. Cultivation time is usually 16 hours to 7 days. The pH of the culture medium during culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0. The pH of the culture medium can be adjusted using inorganic acids, organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 If necessary, antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium during culturing. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium, if necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like is used, and when culturing a microorganism transformed with the expression vector using the trp promoter, indole acrylic is used. You may add an acid etc. to a culture medium.
形質転換された宿主により生産された改変クモ糸フィブロインは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、改変クモ糸フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。 The modified spider silk fibroin produced by the transformed host can be isolated and purified by a method commonly used for protein isolation and purification. For example, when the modified spider silk fibroin is expressed in a lysed state in the cells, after culturing, the host cells are recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, ultrasonic crusher, French press, A cell-free extract is obtained by crushing the host cells with a Manton-Gaulin homogenizer, Dynomill and the like. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a method usually used for isolation and purification of proteins, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent is used. Precipitation method, anion-exchange chromatography method using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), and cation using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia). Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using butyl sepharose, phenyl sepharose, etc. resins, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, electrophoretic methods such as isoelectric focusing The above method can be used alone or in combination to obtain a purified preparation.
上記クロマトグラフィーとしては、フェニル−トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ−１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。 As the above-mentioned chromatography, column chromatography using Phenyl-Toyopearl (Tosoh), DEAE-Toyopearl (Tosoh), and Sephadex G-150 (Pharmacia Biotech) is preferably used.
また、改変クモ糸フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変クモ糸フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変クモ糸フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変クモ糸フィブロインの精製標品を得ることができる。 Further, when the modified spider silk fibroin is expressed by forming an insoluble matter in the cell, similarly, after recovering the host cell, crushing and centrifuging, the insoluble matter of the modified spider silk fibroin is obtained as a precipitate fraction. Collect. The recovered insoluble matter of modified spider silk fibroin can be solubilized with a protein denaturing agent. After this operation, a purified preparation of modified spider silk fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as above.
改変クモ糸フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から改変クモ糸フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。 When the modified spider silk fibroin is secreted extracellularly, the modified spider silk fibroin can be recovered from the culture supernatant. That is, a purified sample can be obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation to obtain a culture supernatant, and using the same isolation and purification method as described above from the culture supernatant.
改変クモ糸フィブロインの含有量は、タンパク質フィルムの全質量を基準として、５０〜９０質量％であってよく、６０〜８５質量％であってよく、６５〜８０質量％であってよい。タンパク質フィルム中の改変クモ糸フィブロインの含有量は、例えば、水及び多価アルコールの含有量を測定し、全質量と水及び多価アルコールの質量との差を求めることにより算出することができる。 The content of the modified spider silk fibroin may be 50 to 90% by mass, 60 to 85% by mass, or 65 to 80% by mass, based on the total mass of the protein film. The content of the modified spider silk fibroin in the protein film can be calculated, for example, by measuring the contents of water and polyhydric alcohol and determining the difference between the total mass and the mass of water and polyhydric alcohol.
＜多価アルコール＞
多価アルコールは、分子内に２個以上のヒドロキシ基を有するアルコールを意味する。多価アルコールのヒドロキシ基数は、例えば、２〜１０であってよく、２〜８であってよく、２〜６であってよく、３〜５であってよく、３であってよい。
<Polyhydric alcohol>
The polyhydric alcohol means an alcohol having two or more hydroxy groups in the molecule. The number of hydroxy groups of the polyhydric alcohol may be, for example, 2 to 10, may be 2 to 8, may be 2 to 6, may be 3 to 5, and may be 3.
多価アルコールの炭素原子数は、例えば、１２以下、１０以下、８以下、又は６以下であってよく、２以上、又は３以上であってよい。 The number of carbon atoms of the polyhydric alcohol may be, for example, 12 or less, 10 or less, 8 or less, or 6 or less, and 2 or more, or 3 or more.
多価アルコールとしては、低級アルコール、糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。 Examples of polyhydric alcohols include lower alcohols, sugars, sugar alcohols, polyethylene glycols and the like.
低級アルコールは、炭素原子数２〜５の直鎖状又は分岐鎖状アルコールを意味する。低級アルコールとしては、グリセリン、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、エチレングリコールが挙げられる。低級アルコールは、タンパク質フィルムの伸度をより一層向上させることができる観点から、グリセリンであることが好ましい。 The lower alcohol means a straight chain or branched chain alcohol having 2 to 5 carbon atoms. Examples of the lower alcohol include glycerin, propylene glycol, diethylene glycol and ethylene glycol. The lower alcohol is preferably glycerin from the viewpoint that the elongation of the protein film can be further improved.
糖類としては、例えば、単糖類、二糖類が挙げられる。単糖類としては、例えば、グルコース等を挙げることができる。二糖類としては、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトースを挙げることができる。 Examples of saccharides include monosaccharides and disaccharides. Examples of monosaccharides include glucose. Examples of disaccharides include sucrose, lactose, trehalose, and maltose.
糖アルコールとしては、ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。 Examples of sugar alcohols include sorbitol and mannitol.
多価アルコールの含有量は、タンパク質フィルムの全質量を基準として、５〜４０質量％であってよく、１０〜３５質量％であってよく、１５〜３０質量％であってよい。多価アルコールの含有量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（例えば、島津製作所社製Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ５０４Ｈ）により測定することができる。 The content of the polyhydric alcohol may be 5 to 40% by mass, 10 to 35% by mass, or 15 to 30% by mass, based on the total mass of the protein film. The content of the polyhydric alcohol can be measured by gel permeation chromatography (for example, Prominence 504H manufactured by Shimadzu Corporation).
＜他の成分＞
タンパク質フィルムは、クモ糸フィブロイン及びグリセリンのみからなっていてもよく、他の成分を含んでいてよい。他の成分としては、水、有機溶剤、高分子可塑剤を含んでいてよい。
<Other ingredients>
The protein film may consist only of spider silk fibroin and glycerin, and may contain other components. Other components may include water, an organic solvent, and a polymer plasticizer.
タンパク質フィルムが水を含む場合、タンパク質フィルムの水分率は、例えば、タンパク質フィルムの伸度がより一層向上する観点から、５０〜９０質量％、又は６０〜８５質量％であってよく、８０〜８５％であることが好ましい。タンパク質フィルムの水分率とは、タンパク質フィルムの全質量を基準とする水の含有量である。タンパク質フィルムは、内部に水を含んでいてもよい。タンパク質フィルムの水分率は、カールフィッシャー水分計ＭＫＨ−７００（京都電子工業（株）、加熱乾燥式水分計ＭＸ−５０（エーアンドデイ株式会社）等により測定することができる。 When the protein film contains water, the water content of the protein film may be, for example, 50 to 90% by mass, or 60 to 85% by mass, and 80 to 85% from the viewpoint of further improving the elongation of the protein film. % Is preferable. The water content of the protein film is the content of water based on the total mass of the protein film. The protein film may contain water inside. The moisture content of the protein film can be measured by a Karl Fischer moisture meter MKH-700 (Kyoto Electronics Industry Co., Ltd., heat-drying moisture meter MX-50 (A&D Corporation), or the like.
有機溶剤としては、例えば、酢酸、ギ酸、ＨＦＩＰ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等の非プロトン性極性溶媒が挙げられる。タンパク質フィルムが有機溶剤を含む場合、タンパク質フィルム中の有機溶剤の含有量は、２〜２０質量％、又は２〜１０質量％であってよい。有機溶剤の含有量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（例えば、島津製作所社製Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ５０４Ｈ）により測定することができる。 Examples of the organic solvent include aprotic polar solvents such as acetic acid, formic acid, HFIP, dimethyl sulfoxide (DMSO), N,N-dimethylformamide (DMF) and N,N-dimethylacetamide (DMAc). When the protein film contains an organic solvent, the content of the organic solvent in the protein film may be 2 to 20% by mass, or 2 to 10% by mass. The content of the organic solvent can be measured, for example, by gel permeation chromatography (for example, Prominence 504H manufactured by Shimadzu Corporation).
本実施形態に係るタンパク質フィルムは、不可避的な成分、例えば、タンパク質に含まれていた夾雑物を含み得る。 The protein film according to the present embodiment may include inevitable components, for example, impurities contained in the protein.
〔タンパク質フィルムの製造方法〕
本実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロイン及び溶媒を含むドープ液を基材表面にキャスト成形し、乾燥及び／又は脱溶媒を行うことで製造することができる。多価アルコールは、ドープ液に予め添加しておいてもよい。ドープ液が多価アルコールを含む場合も、同様にして目的とするタンパク質フィルムを得ることができる。ドープ液が多価アルコールを含む場合、上述の方法に従って成形することで内部に多価アルコールが分散して含まれるタンパク質フィルムを得ることができる。ドープ液が多価アルコールを含まない場合、上述の方法に従って成形したタンパク質フィルムを多価アルコールに浸漬させることにより、内部に多価アルコールが分散して含まれるタンパク質フィルムを得ることができる。
[Method for producing protein film]
The protein film according to the present embodiment can be produced by casting a dope solution containing spider silk fibroin and a solvent on the surface of a base material, and drying and/or removing the solvent. The polyhydric alcohol may be added to the dope solution in advance. Even when the dope contains polyhydric alcohol, the target protein film can be obtained in the same manner. When the dope contains polyhydric alcohol, the protein film containing the polyhydric alcohol dispersed therein can be obtained by molding according to the method described above. When the dope does not contain a polyhydric alcohol, the protein film formed according to the above-mentioned method is dipped in the polyhydric alcohol to obtain a protein film containing the polyhydric alcohol dispersed therein.
一実施形態に係るタンパク質フィルムは、クモ糸フィブロイン、多価アルコール及び溶媒を含むドープ液を用いて、タンパク質フィルムを成形する成形工程を備える。 The protein film according to one embodiment includes a molding step of molding the protein film using a dope solution containing spider silk fibroin, a polyhydric alcohol, and a solvent.
ドープ液は、クモ糸フィブロイン及び多価アルコールと、これらを溶解する溶媒とを含む。溶媒としては、タンパク質を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）及びギ酸等のプロトン性極性溶媒、並びにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等の非プロトン性極性溶媒が挙げられる。 The dope liquid contains spider silk fibroin and polyhydric alcohol, and a solvent that dissolves them. The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the protein, and examples thereof include a protic polar solvent such as hexafluoro-2-propanol (HFIP) and formic acid, and dimethyl sulfoxide (DMSO), N,N-dimethylformamide. Examples include aprotic polar solvents such as (DMF) and N,N-dimethylacetamide (DMAc).
ドープ液中のクモ糸フィブロインの含有量は、クモ糸フィブロイン、多価アルコール及び溶媒の種類等に応じて、適宜設定してよい。例えば、ドープ液中のクモ糸フィブロインの含有量は、ドープ液の全質量を基準として、１〜３０質量％、２〜２５質量％、３〜２０質量％、４〜１５質量％、又は５〜１０質量％であってよい。 The content of spider silk fibroin in the dope solution may be appropriately set depending on the types of spider silk fibroin, polyhydric alcohol and solvent. For example, the content of spider silk fibroin in the dope liquid is 1 to 30 mass%, 2 to 25 mass%, 3 to 20 mass%, 4 to 15 mass%, or 5 to 5 mass% based on the total mass of the dope liquid. It may be 10% by weight.
ドープ液中の多価アルコールの含有量は、０．１質量％以上、０．３質量％以上、０．５質量％以上、１．０質量％以上、又は３．０質量％以上であってよく、１５質量％以下、１０質量％以下、８質量％以下、又は６質量％以下であってよい。 The content of the polyhydric alcohol in the dope solution is 0.1% by mass or more, 0.3% by mass or more, 0.5% by mass or more, 1.0% by mass or more, or 3.0% by mass or more. Well, it may be 15 mass% or less, 10 mass% or less, 8 mass% or less, or 6 mass% or less.
ドープ液の粘度は、適宜設定すればよい。ドープ液の粘度は、例えば、３５℃、撹拌数１０００ＲＰＭにおいて１５〜１０００ｃＰ（センチポイズ）とすることができる。ドープ液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。 The viscosity of the dope solution may be set appropriately. The viscosity of the dope solution can be, for example, 15 to 1000 cP (centipoise) at 35° C. and a stirring number of 1000 RPM. The viscosity of the dope solution can be measured using, for example, a product name “EMS viscometer” manufactured by Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd.
成形工程では、まず、ドープ液を基材表面に所定の厚みで（例えば、乾燥及び／又は脱溶媒後の厚みで１〜１０００μｍとなるように）塗布する。 In the molding step, first, the dope solution is applied to the surface of the substrate at a predetermined thickness (for example, the thickness after drying and/or solvent removal is 1 to 1000 μm).
基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、キャスト成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、好ましくは樹脂基板である。樹脂基板としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、ＤＭＳＯ溶媒に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、より好ましくは、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムである。 The base material may be a resin substrate, a glass substrate, a metal substrate, or the like. The base material is preferably a resin substrate from the viewpoint that the film after cast molding can be easily peeled off. The resin substrate may be, for example, a polyethylene terephthalate (PET) film, a fluororesin film such as polytetrafluoroethylene, a polypropylene (PP) film, or a release film having a silicone compound immobilized on the surface of these films. The base material is more stable to the DMSO solvent, the cast solution of the dope can be stably cast, and the film after molding can be easily peeled off. More preferably, the silicone compound is immobilized on the PET film or the surface of the PET film. It is a release film that has been turned into a film.
成形工程では、次に、基材上に塗布されたドープ液の乾燥及び／又は脱溶媒を行う。乾燥及び／又は脱溶媒は、例えば、真空乾燥、熱風乾燥、及び風乾から選ばれる少なくとも一種の手段で行われる。溶媒はできるだけ脱離したほうが好ましい。脱溶媒は、フィルムを延伸させた後に行ってもよい。 In the molding step, next, the dope solution applied on the base material is dried and/or desolvated. Drying and/or solvent removal is performed by at least one means selected from vacuum drying, hot air drying, and air drying, for example. It is preferable to remove the solvent as much as possible. Desolvation may be performed after stretching the film.
乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸フィルムは、１軸延伸又は２軸延伸することができる。１軸延伸又は２軸延伸は、水中で行ってもよい。２軸延伸は、逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、好ましくは１．０１〜６倍、より好ましくは１．０５〜４倍である。この範囲であると応力−歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、２０〜９０℃の水温で行われることが好ましい。延伸後のフィルムは、５０〜２００℃の乾熱で５〜６００秒間熱固定することが好ましい。この熱固定により、常温における寸法安定性が得られる。なお、１軸延伸したフィルムは１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。 The unstretched film after drying and/or solvent removal can be uniaxially stretched or biaxially stretched. The uniaxial stretching or the biaxial stretching may be performed in water. The biaxial stretching may be sequential stretching or simultaneous biaxial stretching. You may perform multistage drawing of two or more steps. The stretching ratio is preferably 1.01 to 6 times, and more preferably 1.05 to 4 times in both length and width. Within this range, the stress-strain is easily balanced. The underwater stretching is preferably performed at a water temperature of 20 to 90°C. The stretched film is preferably heat-set for 5 to 600 seconds by dry heat at 50 to 200°C. By this heat setting, dimensional stability at room temperature can be obtained. The uniaxially stretched film becomes a uniaxially oriented film, and the biaxially stretched film becomes a biaxially oriented film.
乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸フィルム、又は未延伸フィルムを延伸して得られる延伸フィルムは、メタノールと接触させることによりメタノール処理を行ってもよい。メタノール処理により、より硬いタンパク質フィルムを得ることが可能となる。メタノール処理は、伸度及びタフネスを更に向上させる観点から、実施しなくてもよい。メタノール処理の条件については、記述のとおりである。クモ糸フィブロインと多価アルコールとを含むタンパク質フィルムに対して、メタノール処理を行うことにより、タンパク質フィルムのタフネスをコントロールすることができる。したがって、本発明の一実施形態として、クモ糸フィブロインと多価アルコールとを含むタンパク質フィルムに対して、メタノール処理を行う工程を備える、タンパク質フィルムのタフネスをコントロールする方法が提供される。 The unstretched film that has been dried and/or desolvated or the stretched film obtained by stretching the unstretched film may be treated with methanol by contacting with methanol. The methanol treatment makes it possible to obtain a harder protein film. The methanol treatment may not be performed from the viewpoint of further improving the elongation and toughness. The conditions for the methanol treatment are as described. The toughness of the protein film can be controlled by subjecting the protein film containing spider silk fibroin and polyhydric alcohol to methanol treatment. Therefore, as one embodiment of the present invention, there is provided a method for controlling the toughness of a protein film, which comprises a step of subjecting a protein film containing spider silk fibroin and polyhydric alcohol to methanol treatment.
タンパク質フィルムは、カラーフィルムであってもよい。この場合、染料などの着色剤を例えばＤＭＳＯ溶媒に溶解又は分散させてＤＭＳＯ着色液を作製し、この着色液とドープ液とを混合して得られた溶液を、上述したのと同様にキャスト成形によりフィルムを作製する。その後、乾燥及び／又は脱溶媒して未延伸着色フィルムにするか、又は延伸して延伸フィルムとする。カラーフィルムは、反射板、マーカー、紫外線防止膜、スリット糸などに応用できる。 The protein film may be a color film. In this case, a colorant such as a dye is dissolved or dispersed in a DMSO solvent to prepare a DMSO coloring liquid, and the solution obtained by mixing the coloring liquid and the dope liquid is cast-molded in the same manner as described above. To produce a film. Then, it is dried and/or desolvated to give an unstretched colored film, or stretched to give a stretched film. The color film can be applied to a reflector, a marker, a UV protection film, a slit thread, and the like.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（ＰＲＴ７９９）
［試験例１：改変クモ糸フィブロインの製造］
＜（１−１）クモ糸タンパク質（改変クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ７９９）の製造＞
（クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。
(PRT799)
[Test Example 1: Production of modified spider silk fibroin]
<Production of (1-1) Spider Silk Protein (Modified Spider Silk Fibroin: PRT799)>
(Synthesis of gene encoding spider silk protein and construction of expression vector)
A modified fibroin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 (hereinafter referred to as “PRT799” based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of fibroin (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415) derived from Nephila clavipes. It is also called.).
配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号１２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 has an amino acid sequence in which amino acid residue substitutions, insertions and deletions have been carried out for the purpose of improving productivity, with respect to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus.
Next, a nucleic acid encoding PRT799 was synthesized. An NdeI site was added to the 5'end and an EcoRI site was added downstream of the stop codon to the nucleic acid. The nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Then, the same nucleic acid was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI and cut out, and then recombined into a protein expression vector pET-22b(+) to obtain an expression vector.
ＰＲＴ７９９をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。 E. coli BLR(DE3) was transformed with the pET22b(+) expression vector containing the nucleic acid encoding PRT799. The transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours. The culture solution was added to 100 mL of seed culture medium (Table 4) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005. The temperature of the culture solution was maintained at 30° C., and flask culture was performed until the OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。 The seed culture was added to a jar fermenter to which 500 ml of production medium (Table 5 below) was added so that the OD 600 was 0.05. The temperature of the culture solution was maintained at 37° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. The dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。 Immediately after the glucose in the production medium was completely consumed, the feed solution (glucose 455 g/1 L, Yeast Extract 120 g/1 L) was added at a rate of 1 mL/min. The temperature of the culture solution was maintained at 37° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture medium was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturated concentration, and the culture was carried out for 20 hours. After that, 1M isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture medium to a final concentration of 1 mM to induce expression of PRT799. At 20 hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged to collect the bacterial cells. SDS-PAGE was performed using the cells prepared from the culture solution before and after the addition of IPTG, and the expression of PRT799 was confirmed by the appearance of a band having a size corresponding to PRT799 depending on the addition of IPTG.
（ＰＲＴ７９９の精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
(Purification of PRT799)
The cells collected 2 hours after the addition of IPTG were washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The washed cells were suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing about 1 mM PMSF, and the cells were disrupted with a high-pressure homogenizer (GEA Niro Soavi). The disrupted cells were centrifuged to obtain a precipitate. The obtained precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) until it became highly pure. The washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) at a concentration of 100 mg/mL, and the suspension was adjusted to 60°C. The mixture was stirred for 30 minutes with a stirrer and dissolved. After the dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein (PRT799) obtained after dialysis was recovered by centrifugation, the water was removed by a freeze dryer, and a freeze-dried powder was recovered.
得られた凍結乾燥粉末におけるＰＲＴ７９９の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＰＲＴ７９９の精製度は約８５％であった。 The degree of purification of PRT799 in the obtained freeze-dried powder was confirmed by image analysis of the result of polyacrylamide gel electrophoresis of the powder using Totallab (nonlinear dynamics ltd.). As a result, the degree of purification of PRT799 was about 85%.
［試験例２：タンパク質フィルムの製造及び評価１］
＜（２−１）タンパク質フィルムの製造＞
試験例１の（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を、水及びエタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７：３（質量比））に１１０℃で溶解させた。得られたクモ糸フィブロイン含有液に、グリセリンを添加して、ドープ液とした。グリセリンの添加量（含有量）は、ドープ液全量に対して、０．５質量％又は５．０質量％とした。ドープ液は、ステンレススチール瓶内で、２００ｒｐｍの条件で、４０分間攪拌した後、１０分間冷却し、ごみ及び泡を取り除いた。以上の操作により、ドープ液全量に対して、クモ糸フィブロインを１０．０質量％、水を６２．７質量％、エタノールを２６．９質量％、グリセリンを０．５質量％含む、ドープ液１、及び、ドープ液全量に対して、クモ糸フィブロインを１０．０質量％、水を５９．５質量％、エタノールを２５．５質量％、グリセリンを５．０質量％含む、ドープ液２を調製した。
[Test Example 2: Production and
<(2-1) Production of protein film>
The spider silk fibroin (PRT799) obtained in (1-1) of Test Example 1 was dissolved in a mixed solvent of water and ethanol (water:ethanol=7:3 (mass ratio)) at 110°C. Glycerin was added to the obtained spider silk fibroin-containing liquid to prepare a dope liquid. The amount of glycerin added (content) was 0.5% by mass or 5.0% by mass with respect to the total amount of the dope solution. The dope solution was stirred in a stainless steel bottle at 200 rpm for 40 minutes and then cooled for 10 minutes to remove dust and bubbles. By the above operation, the
次の手順で、ドープ液１及びドープ液２からそれぞれ実施例１及び実施例２のタンパク質フィルムを製造した。すなわち、シリコン製の四角形モールド（サイズ（横×幅×高さ）：２インチ×２インチ×２インチ）に、２ｍＬのドープ液１又はドープ液２をキャスト成形し、濡れ膜を作製した。濡れ膜は、室温（２５℃）で、２４時間静置することにより、乾燥させた。乾燥後に、シリコン製モールドから、タンパク質フィルムを剥離した。得られたタンパク質フィルムの厚さは、４０〜５０μｍ程度であった。タンパク質フィルムの厚みは、新潟精機社製、テシタル外側マイクロメータを使用して測定した。
The protein films of Example 1 and Example 2 were produced from the
実施例１〜２のタンパク質フィルムをメタノールに１分間浸漬させた。タンパク質フィルムをメタノールから取り出し、イオン交換水で、５分間洗浄した。得られたフィルムは、室温（２０〜３０℃）で、２４時間静置し、乾燥させた。これらの操作により実施例１〜２のタンパク質フィルムから得たメタノール処理後のタンパク質フィルムをそれぞれ実施例３〜４のタンパク質フィルムとした。 The protein films of Examples 1 and 2 were immersed in methanol for 1 minute. The protein film was taken out from methanol and washed with ion-exchanged water for 5 minutes. The obtained film was left to stand at room temperature (20 to 30° C.) for 24 hours and dried. The methanol-treated protein films obtained from the protein films of Examples 1 and 2 by these operations were used as the protein films of Examples 3 and 4, respectively.
＜（２−２）タンパク質フィルムの評価＞
実施例２のタンパク質フィルムを、ダンベル形状に切り出し、試験片（８ｍｍ×２ｍｍ×厚み）とした。試験片を用い、島津製作所社製引張試験装置により、引張試験を実施した。引張試験は、２５℃、相対湿度６０％の条件で実施した。引張試験により、破断点変位（ひずみ）（％）、最大点応力（ＭＰａ）、及びひずみエネルギー（［ｍＪ］）、タフネス（［ＭＪ］／［ｍ３］）、ヤング率（ＧＰａ）を測定した。３回行った測定の平均値を表６に示す。タフネスは、下記式により求められる。
応力［Ｎ／ｍ２］×歪み［ｍｍ／ｍｍ］＝エネルギー［Ｎｍ］／体積［ｍ３］＝エネルギー［Ｊ］／体積［ｍ３］
<(2-2) Evaluation of protein film>
The protein film of Example 2 was cut into a dumbbell shape to obtain a test piece (8 mm×2 mm×thickness). Using the test piece, a tensile test was conducted with a tensile tester manufactured by Shimadzu Corporation. The tensile test was carried out under the conditions of 25° C. and 60% relative humidity. The tensile test measured displacement (strain) (%) at break, maximum stress (MPa), strain energy ([mJ]), toughness ([MJ]/[m 3 ]), and Young's modulus (GPa). .. Table 6 shows the average values of the three measurements. The toughness is calculated by the following formula.
Stress [N/m 2 ]×strain [mm/mm]=energy [Nm]/volume [m 3 ]=energy [J]/volume [m 3 ]
破断点変位が高いほど、伸度に優れる（高い伸度を有する）ことを示し、最大点応力（ＭＰａ）が高いほど、応力に優れる（高い応力を有する）ことを示し、ひずみエネルギーが高いほど、タフネス（靭性）に優れることを示す。 The higher the displacement at break, the better the elongation (having a higher elongation), the higher the maximum point stress (MPa), the better the stress (having a higher stress), the higher the strain energy. Shows that the toughness is excellent.
グリセリンを添加しなかったこと以外は、実施例２と同様にして、比較例１のタンパク質フィルムの製造及び評価を行った。 The protein film of Comparative Example 1 was produced and evaluated in the same manner as in Example 2 except that glycerin was not added.
改変クモ糸フィブロインと、多価アルコールと、を含む、タンパク質フィルムは、高い破断点変位を有しており、伸度に優れることが示された（実施例２と、比較例１との対比）。 It was shown that the protein film containing the modified spider silk fibroin and the polyhydric alcohol had a high breaking point displacement and was excellent in elongation (comparison between Example 2 and Comparative Example 1). ..
＜（２−３）メタノール処理による効果＞
実施例１、３〜４のタンパク質フィルムは、実施例２と同様の方法で、最大点応力、ひずみエネルギー、タフネス及びヤング率を測定した。結果を表７に示す。
<(2-3) Effect of methanol treatment>
For the protein films of Examples 1, 3 and 4, the maximum point stress, strain energy, toughness and Young's modulus were measured by the same method as in Example 2. The results are shown in Table 7.
メタノール処理により、より硬いタンパク質フィルムが得られた。メタノール処理によりタフネスをコントロール可能であることが示された。 The methanol treatment resulted in a stiffer protein film. It was shown that the toughness can be controlled by treating with methanol.
＜（２−４）タンパク質フィルムの分析＞
実施例１〜４のタンパク質フィルムをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５０ ＦＴ−ＩＲ 分光光度計（フーリエ変換型赤外分光光度計）及び株式会社エアーテック社製の乾燥空気発生装置「ＡＩＲ−ＴＥＣＨ」を用いて、タンパク質二次構造及び含有成分（グリセリン）について分析した。結果を図４に示す。
<(2-4) Analysis of protein film>
The protein films of Examples 1 to 4 were used with a Thermo Fisher Nicolet iS50 FT-IR spectrophotometer (Fourier transform infrared spectrophotometer) and a dry air generator "AIR-TECH" manufactured by Airtec Co., Ltd. The protein secondary structure and contained components (glycerin) were analyzed. The results are shown in Fig. 4.
１６５０ｃｍ−１付近のピークはペプチド結合におけるＣ＝Ｏの伸縮振動でアミドＩバンドに相当する。３２００ｃｍ−１付近のピークは、タンパク質とグリセリンとの水素結合に由来するＯ−Ｈの伸縮振動を示す。メタノール処理が、タンパク質フィルムのβシート結晶度（アミドＩバンドの波形を示す）に影響を与えることを認められた。 The peak around 1650 cm −1 corresponds to the amide I band due to the stretching vibration of C═O in the peptide bond. The peak near 3200 cm −1 indicates the O—H stretching vibration derived from the hydrogen bond between the protein and glycerin. It was observed that the methanol treatment affected the β-sheet crystallinity of the protein film, which shows the waveform of the amide I band.
［試験例３：タンパク質フィルムの製造及び評価２］
＜（３−１）タンパク質フィルムの製造＞
試験例１の（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に９０℃で溶解させた。得られたクモ糸フィブロイン含有液に、グリセリンを添加して、ドープ液とした。グリセリンの添加量（含有量）は、ドープ液全量に対して、２．１質量％とした。ドープ液は、ステンレススチール瓶内で、２００ｒｐｍの条件で、３０分間攪拌した後、１０分間冷却し、ごみ及び泡を取り除いた。以上の操作により、ドープ液全量に対して、クモ糸フィブロインを５．０質量％、ＤＭＳＯを９２．９質量％、グリセリンを２．１質量％含む、ドープ液５を調製した。
[Test Example 3: Production and evaluation 2 of protein film]
<(3-1) Production of protein film>
The spider silk fibroin (PRT799) obtained in (1-1) of Test Example 1 was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 90°C. Glycerin was added to the obtained spider silk fibroin-containing liquid to prepare a dope liquid. The addition amount (content) of glycerin was 2.1% by mass with respect to the total amount of the dope liquid. The dope solution was stirred in a stainless steel bottle at 200 rpm for 30 minutes and then cooled for 10 minutes to remove dust and bubbles. By the above operation, the dope liquid 5 containing 5.0 mass% of spider silk fibroin, 92.9 mass% of DMSO and 2.1 mass% of glycerin was prepared with respect to the total amount of the dope liquid.
シリコン製の四角形モールド（サイズ（横×幅×高さ）：２インチ×２インチ×２インチ）に、２ｍＬのドープ液５をキャスト成形し、濡れ膜を作製した。濡れ膜を６０℃の条件で、真空乾燥機内で、３時間以上乾燥させ、一部のＤＭＳＯを除去した。これにより、実施例５のタンパク質フィルムを得た。 2 mL of the dope solution 5 was cast-molded on a silicon square mold (size (width×width×height): 2 inches×2 inches×2 inches) to form a wet film. The wet film was dried at 60° C. for 3 hours or more in a vacuum dryer to remove a part of DMSO. Thereby, the protein film of Example 5 was obtained.
実施例５のタンパク質フィルム中のＤＭＳＯ及びグリセリンの含有量をガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＣ）島津製作所製ＧＣ−２０１０ｐｌｕｓ（装置の型番））を用いて測定した。実施例５のタンパク質フィルムにおいて、タンパク質フィルムの全質量を基準として、ＤＭＳＯの含有量は、４．４質量％であり、グリセリンの含有量は、２３．２質量％であった。 The content of DMSO and glycerin in the protein film of Example 5 was measured using gas chromatography (Gas Chromatography, GC) Shimadzu Corporation GC-2010plus (device model number). In the protein film of Example 5, the DMSO content was 4.4% by mass and the glycerin content was 23.2% by mass, based on the total mass of the protein film.
実施例５のタンパク質フィルムは、試験例２と同様の方法で、最大点応力、破断点変位（ひずみ）及びひずみエネルギーを測定した。結果を表８に示す。 For the protein film of Example 5, the maximum point stress, the breaking point displacement (strain) and the strain energy were measured in the same manner as in Test Example 2. The results are shown in Table 8.
ドープ液を調製するための溶媒にＤＭＳＯを用いた場合においても、改変クモ糸フィブロインと、多価アルコールと、を含む、タンパク質フィルムは、高い破断点変位を有しており、伸度に優れることが示された。 Even when DMSO is used as the solvent for preparing the dope solution, the modified spider silk fibroin and the polyhydric alcohol are contained, and the protein film has a high breaking point displacement and is excellent in elongation. It has been shown.
Claims (10)
前記タンパク質フィルムの破断点変位が３００％以上である、タンパク質フィルム。 A protein film containing spider silk fibroin,
A protein film in which the breaking point displacement of the protein film is 300% or more.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019016332A JP2020121962A (en) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | Protein film and method for producing protein film |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019016332A JP2020121962A (en) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | Protein film and method for producing protein film |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020121962A true JP2020121962A (en) | 2020-08-13 |
Family
ID=71993461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019016332A Pending JP2020121962A (en) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | Protein film and method for producing protein film |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2020121962A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021066078A1 (en) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Muscle tissue-regenerating agent |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006504450A (en) * | 2002-06-24 | 2006-02-09 | タフツ ユニバーシティー | Silk biomaterial and method of using the same |
| JP2012505297A (en) * | 2008-10-09 | 2012-03-01 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Modified silk film containing glycerol |
| WO2017131196A1 (en) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Molded article, production method for same, and method for improving toughness of molded article |
| JP2018511677A (en) * | 2015-03-12 | 2018-04-26 | タフツ・ユニバーシティ | Shape memory silk material |
| WO2018221680A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | Protein molded article and method for producing same, protein solution, and protein molded article plasticizer |
-
2019
- 2019-01-31 JP JP2019016332A patent/JP2020121962A/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006504450A (en) * | 2002-06-24 | 2006-02-09 | タフツ ユニバーシティー | Silk biomaterial and method of using the same |
| JP2012505297A (en) * | 2008-10-09 | 2012-03-01 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Modified silk film containing glycerol |
| JP2018511677A (en) * | 2015-03-12 | 2018-04-26 | タフツ・ユニバーシティ | Shape memory silk material |
| WO2017131196A1 (en) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Molded article, production method for same, and method for improving toughness of molded article |
| WO2018221680A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | Protein molded article and method for producing same, protein solution, and protein molded article plasticizer |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021066078A1 (en) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Muscle tissue-regenerating agent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6959482B2 (en) | A molded product, a method for manufacturing the molded product, and a method for improving the toughness of the molded product. | |
| JP6337252B1 (en) | High shrinkage artificial fibroin fiber, method for producing the same, and method for shrinking artificial fibroin fiber | |
| WO2018164234A1 (en) | Method for producing protein fiber, and method for shrinking protein fiber | |
| JP2020150945A (en) | Modified fibroin | |
| WO2018221680A1 (en) | Protein molded article and method for producing same, protein solution, and protein molded article plasticizer | |
| WO2020022395A1 (en) | Artificial hair fiber, method for manufacturing same, and artificial hair | |
| WO2019151429A1 (en) | Method for manufacturing protein fiber | |
| JPWO2018164189A1 (en) | Protein molded article, method for producing the same, and protein solution | |
| WO2019151435A1 (en) | Carbon nanotube dispersant, carbon nanotube dispersion liquid, and method for dispersing carbon nanotubes | |
| JP2020121962A (en) | Protein film and method for producing protein film | |
| WO2019151440A1 (en) | Production method for protein molded article, production method for protein solution, and production method for protein | |
| JPWO2020067554A1 (en) | Manufacturing method and structure of molded product Protein molded product | |
| WO2019151437A1 (en) | Manufacturing method for protein spun yarn | |
| JPWO2019066047A1 (en) | Protein fiber manufacturing method, protein fiber manufacturing equipment, and protein fiber processing method | |
| WO2021065794A1 (en) | Method for manufacturing protein molded body | |
| JPWO2019066053A1 (en) | Protein fiber manufacturing method, protein fiber manufacturing equipment, and protein fiber processing method | |
| JP2020055904A (en) | Hygroscopic exothermicity imparting agent, and method for imparting hygroscopic exothermicity | |
| WO2019151436A1 (en) | Manufacturing method for protein crimped staple | |
| WO2019151432A1 (en) | Method for preparing oil adhesion protein crimped fiber | |
| WO2020158900A1 (en) | Method for producing synthetic hair fibres, method for producing synthetic hair, synthetic hair fibres, and synthetic hair | |
| JP2020122237A (en) | Method for producing protein fiber | |
| JP2021055222A (en) | Small-diameter fiber with void formed therein | |
| JP2022001669A (en) | Method of manufacturing protein fiber | |
| JP2020122249A (en) | Method for producing fibroin fiber and fibroin solution | |
| JP2021167277A (en) | Artificial fibroin fiber |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220128 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20221223 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230110 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230704 |