JPWO2020067554A1 - Manufacturing method and structure of molded product Protein molded product - Google Patents

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JPWO2020067554A1
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アリナ クダシェワ
アリナ クダシェワ
本章 渡邉
本章 渡邉
有希 中山
有希 中山
伸治 平井
伸治 平井
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    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C43/00—Compression moulding, i.e. applying external pressure to flow the moulding material; Apparatus therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Abstract

本開示の成形体の製造方法は、構造タンパク質を含む組成物であって６％以上の水分率を有する上記組成物を加熱および加圧し、成形体を得る成形工程と、上記成形工程で得られる上記成形体を６０％以上の圧下率をもって圧延する圧延工程と、を含む。The method for producing a molded product of the present disclosure is a molding step of heating and pressurizing a composition containing a structural protein having a water content of 6% or more to obtain a molded product, and a molding step obtained by the molding step. It includes a rolling step of rolling the molded product with a rolling reduction of 60% or more.

Description

本発明は、成形体の製造方法および構造タンパク質成形体に関する。 The present invention relates to a method for producing a molded product and a structural protein molded product.

軽量化、コストダウン、成形加工の容易化等を目的として、金属材料を有機材料で代替する試みがなされている。たとえば、特許文献１には、粉末状のクモ糸タンパク質を含む組成物に圧力を加えてモールド成形体を得る技術が記載されている。特許文献２には、粉末状のクモ糸タンパク質に水を加えた後に圧力を加えて成形し、その後乾燥させることで、より高強度のモールド成形体を得る技術が記載されている。 Attempts have been made to replace metal materials with organic materials for the purpose of weight reduction, cost reduction, facilitation of molding, and the like. For example, Patent Document 1 describes a technique for obtaining a molded product by applying pressure to a composition containing a powdered spider silk protein. Patent Document 2 describes a technique for obtaining a molded product having higher strength by adding water to a powdered spider silk protein, molding it by applying pressure, and then drying it.

国際公開第２０１７／０４７５０４号International Publication No. 2017/047504 国際公開第２０１８／０４３６９８号International Publication No. 2018/043698

上記した従来の技術で製造された成形体は、比較的小さな歪みで、脆性破壊を起こす可能性がある。たとえば、それらの成形体は、いずれも数％以下の歪みで脆性破壊を起こす可能性がある。よって、脆性破壊を起こしにくい構造タンパク質成形体が求められている。 The molded product produced by the above-mentioned conventional technique has a possibility of causing brittle fracture with a relatively small strain. For example, all of these moldings can undergo brittle fracture with strains of a few percent or less. Therefore, there is a demand for a structural protein molded product that is less likely to cause brittle fracture.

本発明は、構造タンパク質を含む成形体であって脆性破壊を起こしにくい成形体を得ることができる、成形体の製造方法および構造タンパク質成形体を提供する。 The present invention provides a method for producing a molded product and a structural protein molded product capable of obtaining a molded product containing a structural protein and which is less likely to cause brittle fracture.

本発明は、以下の［１］〜［６］を提供する。
［１］ 構造タンパク質を含む組成物であって６％以上の水分率を有する上記組成物を加熱および加圧し、成形体を得る成形工程と、上記成形工程で得られる上記成形体を６０％以上の圧下率をもって圧延する圧延工程と、を含む成形体の製造方法。
［２］ 上記成形工程に先立って、上記構造タンパク質を含む組成物の水分率を６％以上に調整する水分率調整工程を含む、［１］に記載の成形体の製造方法。
［３］ 上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［１］または［２］に記載の成形体の製造方法。
［４］曲げによる破断歪みが５．３％以上である構造タンパク質成形体。
［５］曲げによる歪みエネルギーが６００Ｊ／ｍ３以上である構造タンパク質成形体。
［６］上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［５］に記載の構造タンパク質成形体。The present invention provides the following [1] to [6].
[1] A molding step of heating and pressurizing the composition containing a structural protein and having a water content of 6% or more to obtain a molded product, and 60% or more of the molded product obtained in the molding step. A method for manufacturing a molded product, which includes a rolling process of rolling with a reduction rate of.
[2] The method for producing a molded product according to [1], which comprises a water content adjusting step of adjusting the water content of the composition containing the structural protein to 6% or more prior to the molding step.
[3] The method for producing a molded product according to [1] or [2], wherein the structural protein is spider silk fibroin.
[4] A structural protein molded product having a breaking strain due to bending of 5.3% or more.
[5] A structural protein molded article having a strain energy of 600 J / m 3 or more due to bending.
[6] The structural protein molded article according to [5], wherein the structural protein is spider silk fibroin.

上記成形体は構造タンパク質を原料とすることから、生分解性を有している。また、成形体の製造方法は、６％以上の水分率を有する組成物を加熱および加圧して成形体を得て（成形工程）、更に６０％以上の圧下率をもって成形体を圧延する（圧延工程）という２つの工程を含むことを特徴としている。これらの特徴に起因して、この製造方法は、脆性破壊を起こしにくい成形体を得ることを可能とする。 Since the molded product is made from a structural protein, it has biodegradability. Further, in the method for producing a molded product, a composition having a moisture content of 6% or more is heated and pressed to obtain a molded product (molding step), and the molded product is further rolled with a rolling reduction of 60% or more (rolling). It is characterized by including two steps (steps). Due to these characteristics, this manufacturing method makes it possible to obtain a molded product that is less likely to cause brittle fracture.

本発明は、構造タンパク質を含む成形体であって脆性破壊を起こしにくい成形体を得ることを可能とする。 The present invention makes it possible to obtain a molded product containing a structural protein and which is less likely to cause brittle fracture.

図１は改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a domain sequence of modified fibroin. 図２は天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the distribution of z / w (%) values of naturally occurring fibroin. 図３は天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the distribution of x / y (%) values of naturally occurring fibroin. 図４は改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the domain sequence of modified fibroin. 図５は改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of the domain sequence of modified fibroin. 図６は比較例１〜４に係る成形体の曲げ試験の試験結果を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the test results of the bending test of the molded product according to Comparative Examples 1 to 4. 図７は比較例５〜７および実施例に係る成形体の曲げ試験の試験結果を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the test results of the bending test of the molded product according to Comparative Examples 5 to 7 and Examples.

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. However, the present invention is not limited to the following embodiments.

本実施形態に係る成形体の製造方法は、構造タンパク質を含む成形体の製造方法である。本実施形態に係る成形体の製造方法では、構造タンパク質を含む組成物が用いられる。 The method for producing a molded product according to the present embodiment is a method for producing a molded product containing a structural protein. In the method for producing a molded product according to the present embodiment, a composition containing a structural protein is used.

［構造タンパク質］
構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。[Structural protein]
Structural proteins are proteins that have a role in constructing biological structures, and are different from functional proteins such as enzymes, hormones, and antibodies. Examples of the structural protein include naturally occurring structural proteins such as fibroin, collagen, resilin, elastin and keratin. As naturally occurring fibroin, fibroin produced by insects and arachnids is known. In this embodiment, the structural protein preferably comprises a spider silk protein.

本実施形態に係る構造タンパク質は、クモ糸フィブロインであることが好ましい。クモ糸フィブロインには、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。すなわち、クモ糸フィブロインには、改変クモ糸フィブロインが含まれる。 The structural protein according to this embodiment is preferably spider silk fibroin. Spider silk fibroin includes natural spider silk fibroin and modified fibroin derived from natural spider silk fibroin. That is, the spider silk fibroin includes modified spider silk fibroin.

（改変フィブロイン）
本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。(Modified fibroin)
The modified fibroin according to the present embodiment has a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein contained. The modified fibroin may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence. The N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to this, but are typically regions that do not have the repetition of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 residues of amino acids.

本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。As used herein, the term "modified fibroin" means artificially produced fibroin (artificial fibroin). The modified fibroin may be a fibroin whose domain sequence is different from the amino acid sequence of the naturally occurring fibroin, or may be a fibroin having the same amino acid sequence as the naturally occurring fibroin. “Naturally derived fibroin” as used herein is also represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m − (A) n motif. It is a protein containing the domain sequence to be used.

「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。 The "modified fibroin" may be one in which the amino acid sequence of naturally-derived fibroin is used as it is, or one in which the amino acid sequence is modified based on the amino acid sequence of naturally-derived fibroin (for example, cloned naturally-derived). It may be a product in which the amino acid sequence is modified by modifying the gene sequence of fibroin, or an artificially designed and synthesized product (for example, a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence) regardless of naturally occurring fibroin. It may have a desired amino acid sequence by chemical synthesis).

本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。As used herein, the term "domain sequence" refers to a fibroin-specific crystalline region (typically corresponding to (A) n motif of amino acid sequence) and an amorphous region (typically, REP of amino acid sequence). An amino acid sequence that produces (corresponding to.)), Which is represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Means an array. Here, the (A) n motif shows an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2-27. (A) The number of amino acid residues of the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16. .. Further, (A) the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues). A plurality of (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of at least seven alanine residues only. REP shows an amino acid sequence consisting of 2 to 200 amino acid residues. REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues. m represents an integer of 2 to 300 and may be an integer of 10 to 300. The plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. The plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.

本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。 The modified fibroin according to the present embodiment is, for example, an amino acid sequence corresponding to, for example, substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues to the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by modifying. Substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be carried out by methods well known to those skilled in the art such as partial mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. It can be carried out according to the method described in the literature such as 10, 6487 (1982), Methods in Energy, 100, 448 (1983).

天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。Naturally-derived fibroin is a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Yes, specifically, for example, fibroin produced by insects or spiders.

昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。 Examples of fibroins produced by insects include Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea perni, tussah, and tussah. ), Silk moth (Samia synthia), Chrysanthemum (Caligra japonica), Chusser silk moth (Antheraea mylitta), Muga silk moth (Antheraea assama) Hornet silk protein can be mentioned.

昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。 More specific examples of insect-produced fibroin include, for example, the silk moth fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (nucleic acid sequence) and AAA27840.1 (amino acid sequence)).

クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。 Examples of fibroins produced by spiders include spiders belonging to the genus Araneus such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders. Spiders belonging to the genus Spider, spiders belonging to the genus Pronus, spiders belonging to the genus Trinofundamashi (genus Cyrtarachne), spiders belonging to the genus Trinofundamashi, and spiders belonging to the genus Cyrtarachne. Spiders belonging to (Gasteracantha genus), spiders belonging to the genus Isekigumo (genus Ordgarius) such as Mameitaisekigumo and Mutsutogaysekigumo, spiders belonging to the genus Koganegumo, Kogatakoganegumo and Nagakoganegumo, etc. Spiders belonging to the genus Arachunura, spiders belonging to the genus Acusilas such as spiders, spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cytophora ) Spiders, spiders, spiders belonging to the genus Cyclosa, such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders Spiders belonging to the genus Tetragnatha, such as Yasagata spider, Harabiroashidaka spider, and Urokoa spider, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders Spiders belonging to the genus Nephila, spiders belonging to the genus Menosira such as spiders, spiders belonging to the genus Dyschiriognatha, spiders such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders Spiders belonging to the genus (Latrodectus) and spiders belonging to the genus Euprostenops (genus Euprostenops) and other spiders belonging to the family Tetragnathidae Examples include pider silk protein. Examples of the spider silk protein include traction thread proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.

クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。 More specific examples of spider silk proteins produced by spiders include, for example, fibroin-3 (aff-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (nucleic acid sequence)). fibroin-4 (aff-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (nucleic acid sequence)), dragline silk protein spidroin 1 [from Nephila clavipes] (GenBank sequence ), U37520 (nucleic acid sequence)), major amplifier spidroin 1 [derived from Latrodictus protein] (GenBank accession number ABR68856 (nucleic acid sequence), EF595246 (nucleic acid sequence)), dragline silk protein (derived from fibroin protein) Numbers AAL32472 (nucleic acid sequence), AF441245 (nucleus acid sequence)), major amplifier spidroin 1 [derived from Europe protein australis] (GenBank accession numbers CAJ00428 (nucleotide sequence), AJ973155 (nucleotide sequence)), and major protein (GenBank accession number CAM32249.1 (nucleic acid sequence), AM490169 (base sequence)), minor amplify silk protein 1 [Nefila clavipes] (GenBank accession number AAC14589.1 (amino acid sequence)), minor amplifier clavipes] (GenBank accession number AAC14591.1 (amino acid sequence)), minor amplify spidroin-like protein [Nefilengys cruentata] (GenBank access) The number ABR3778.1 (amino acid sequence) and the like can be mentioned.

天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。 As a more specific example of naturally occurring fibroin, further, fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank can be mentioned. For example, among the sequence information registered in NCBI GenBank, among the sequences containing INV as DIVISION, spidroin, complete, fibroin, "silk and protein", or "silk and protein" are described as keywords in DEFINITION. It can be confirmed by extracting a sequence, a character string of a specific protein from CDS, and a sequence in which a specific character string is described in TISSUE TYPE from SOURCE.

本実施形態に係る改変フィブロインは、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。改変フィブロインとしては、改変クモ糸フィブロインが好ましい。 The modified fibroin according to the present embodiment may be modified silk fibroin (modified amino acid sequence of silk protein produced by silkworm), or modified spider silk fibroin (spider silk protein produced by spiders). It may be a modified amino acid sequence). As the modified fibroin, modified spider silk fibroin is preferable.

改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。Specific examples of modified fibroin include modified fibroin (first modified fibroin) derived from the large spitting tube bookmarker thread protein produced in the large bottle-shaped gland of spiders, and a domain sequence with a reduced content of glycine residues. Modified fibroin with (second modified fibroin), (A) modified fibroin with a domain sequence with reduced n motif content (third modified fibroin), glycine residue content, and (A) n Modified fibroin with reduced motif content (fourth modified fibroin), modified fibroin with a domain sequence that locally contains a region with a high hydrophobicity index (fifth modified fibroin), and glutamine residue content. A modified fibroin having a reduced domain sequence (sixth modified fibroin) can be mentioned.

第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。Examples of the first modified fibroin include proteins containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. In the first modified fibroin, the number of amino acid residues of the (A) n motif is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, even more preferably an integer of 8 to 20, and an integer of 10 to 20. Is even more preferable, an integer of 4 to 16 is even more preferable, an integer of 8 to 16 is particularly preferable, and an integer of 10 to 16 is most preferable. In the first modified fibroin, the number of amino acid residues constituting REP in the formula 1 is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, and 20 to 100 residues. Is even more preferable, and 20 to 75 residues are even more preferable. In the first modified fibroin, the total number of residues of glycine residue, serine residue and alanine residue contained in the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m is the amino acid residue. It is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and further preferably 70% or more with respect to the total number.

第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。The first modified fibroin contains the unit of the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the C-terminal sequence is the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 or It may be a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the same as the amino acid sequence consisting of 50 residues at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence. It is the same as the amino acid sequence in which 20 residues were removed from the C end of the amino acid sequence shown in No. 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained by removing 29 residues from the C end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has the same amino acid sequence.

第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 As a more specific example of the first modified fibroin, the amino acid sequence shown in (1-i) SEQ ID NO: 4 (recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1), or the amino acid sequence shown in (1-ii) SEQ ID NO: 4 and 90 A modified fibroin containing an amino acid sequence having a sequence identity of% or more can be mentioned. The sequence identity is preferably 95% or more.

配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of ADF3 having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) added to the N-terminal, which consists of a starting codon, a His10 tag, and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site. The 13th repeat region is increased approximately twice and mutated so that the translation terminates at the 1154th amino acid residue. The amino acid sequence at the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (1-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。 The second modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of glycine residues as compared to naturally occurring fibroin. It can be said that the second modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP replaced with another amino acid residue as compared with naturally occurring fibroin. ..

第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The second modified fibroin has a domain sequence of GGX and GPGXX in REP as compared with naturally occurring fibroin (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine. In at least one motif sequence selected from), it has an amino acid sequence corresponding to at least one or a plurality of glycine residues in the motif sequence being replaced with another amino acid residue. You may.

第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。 In the second modified fibroin, the ratio of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more with respect to the total motif sequence.

第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。The second modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and is located closest to the C-terminal side of the domain sequence (A) from the n motif to the above domain sequence. The total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of XGX (where X indicates amino acid residues other than glycine) contained in all REPs in the sequence excluding the sequence up to the C-terminal of is z, and the above domain sequence. When the total number of amino acid residues in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the above domain sequence is w, z / w is 30% or more. It may have an amino acid sequence of 40% or more, 50% or more, or 50.9% or more. (A) The number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).

第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。 The second modified fibroin is preferably one in which the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by substituting one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue. In the second modified fibroin, the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, 6 % Or less is even more preferable, 4% or less is even more preferable, and 2% or less is particularly preferable. The content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.

ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。The method of calculating z / w will be described in more detail. First, in the fibroin (modified fibroin or naturally-derived fibroin) containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m, it is located most on the C-terminal side from the domain sequence (A) n. The amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C end of the domain sequence. The total number of amino acid residues constituting XGX is z. For example, when 50 amino acid sequences consisting of XGX are extracted (no duplication), z is 50 × 3 = 150. Further, for example, when X (center X) contained in two XGX exists as in the case of an amino acid sequence consisting of XGXGX, the calculation is performed by deducting the overlap (in the case of XGXGX, 5 amino acid residues are used). be). w is the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence. For example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 1, w is 4 + 50 + 4 + 100 + 4 + 10 + 4 + 20 + 4 + 30 = 230 ( excluding the (A) n motif located most on the C-terminal side). Next, z / w (%) can be calculated by dividing z by w.

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。Here, z / w in naturally derived fibroin will be described. First, as described above, when the fibroin whose amino acid sequence information was registered in NCBI GenBank was confirmed by the method exemplified, 663 types of fibroin (of which 415 types were derived from spiders) were extracted. Naturally derived fibroin containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m among all the extracted fibroins and having an amino acid sequence consisting of GGX in the fibroin of 6% or less. From the amino acid sequence of fibroin, z / w was calculated by the above-mentioned calculation method. The result is shown in FIG. The horizontal axis of FIG. 2 indicates z / w (%), and the vertical axis indicates frequency. As is clear from FIG. 2, the z / w in naturally-derived fibroin is less than 50.9% (the highest is 50.86%).

第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。 In the second modified fibroin, z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, further preferably 58.7% or more, and 70% or more. Is even more preferable, and 80% or more is even more preferable. The upper limit of z / w is not particularly limited, but may be, for example, 95% or less.

第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。 The second modified fibroin is, for example, modified from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence so as to encode another amino acid residue by substituting at least a part of the base sequence encoding the glycine residue. Obtainable. At this time, one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected as the glycine residue to be modified, or may be replaced so that z / w is 50.9% or more. It can also be obtained, for example, by designing an amino acid sequence satisfying the above embodiment from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In each case, in addition to the modification corresponding to the substitution of the glycine residue in REP with another amino acid residue from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, one or more amino acid residues are further substituted or deleted. , Insertion and / or modification of the amino acid sequence corresponding to the addition may be performed.

上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。 The other amino acid residue described above is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than the glycine residue, but is a valine (V) residue, a leucine (L) residue, an isoleucine (I) residue, and methionine ( Hydrophobic amino acid residues such as M) residue, proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S) ) Residues, hydrophilic amino acid residues such as lysine (K) residue and glutamate (E) residue are preferred, valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, phenylalanine ( F) residues and glutamine (Q) residues are more preferred, and glutamine (Q) residues are even more preferred.

第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the second modified fibroin, (2-i) SEQ ID NO: 6 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) -Contains an amino acid sequence represented by PRT799) or (2-ii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. Modified fibroin can be mentioned.

（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。The modified fibroin of (2-i) will be described. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is obtained by substituting GQX for all GGX in the REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin. In the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence is further before the C-terminal sequence. One [(A) n motif-REP] is inserted in. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, two alanine residues are inserted on the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and some glutamine (Q) residues are further added. It is substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted so as to have substantially the same molecular weight as that of SEQ ID NO: 7. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences existing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). A predetermined hinge sequence and His tag sequence are added to the C-terminal of the sequence obtained by repeating the above four times.

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。 The value of z / w in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%. The z / w values in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are 58.7%, respectively. It is 70.1%, 66.1% and 70.0%. Further, the values of x / y in the jagged ratio (described later) of 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are They are 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%, respectively.

（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.

（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (2-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. The modified fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。 The modified fibroin of (2-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is contained in REP. However, X indicates an amino acid residue other than glycine.) When the total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of () is z and the total number of amino acid residues in REP in the above domain sequence is w, z / w Is preferably 50.9% or more.

第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。 The second modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization and the like of modified fibroin.

タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。 Examples of the tag sequence include affinity tags that utilize specific affinity (binding, affinity) with other molecules. As a specific example of the affinity tag, a histidine tag (His tag) can be mentioned. The His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel. Therefore, isolation of modified fibroin by metal chelating chromatography (chelating metal chromatography). Can be used for. Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (amino acid sequence including His tag sequence and hinge sequence).

また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。 In addition, tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose-binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.

さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。 Furthermore, an "epitope tag" utilizing an antigen-antibody reaction can also be used. By adding an antigenic peptide (epitope) as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound. Examples of the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like. By utilizing the epitope tag, the modified fibroin can be easily purified with high specificity.

さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。 Further, a tag sequence in which the tag sequence can be separated by a specific protease can also be used. By treating the protein adsorbed via the tag sequence with a protease, the modified fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the modified fibroin containing the tag sequence, the amino acids represented by (2-iii) SEQ ID NO: 12 (PRT380), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799). Examples may be modified fibroins comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in (2-iv) SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. ..

配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 16 (PRT313), SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 (including His tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminal of the indicated amino acid sequence.

（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.

（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (2-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. The modified fibroin of (2-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。 The modified fibroin of (2-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and is contained in REP. However, X indicates an amino acid residue other than glycine.) When the total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of () is z and the total number of amino acid residues in REP in the above domain sequence is w, z / w Is preferably 50.9% or more.

第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The second modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。The third modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin. It can be said that the domain sequence of the third modified fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared with naturally occurring fibroin.

第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。The third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to a 10-40% deletion of the (A) n motif from naturally occurring fibroin.

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。The third modification fibroin its domain sequence, compared to the naturally occurring fibroin, at least from the N-terminal C-terminal one to three toward the side of the (A) n motif every one (A) n motif It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of.

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。 The third modified fibroin has a domain sequence of at least two consecutive (A) n- motif deletions and one (A) from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to naturally occurring fibroin. ) It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the n-motif being repeated in this order.

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。The third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the (A) n motif at least every other two domain sequences from the N-terminal side to the C-terminal side. ..

第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。The third modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and two adjacent [(A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side. -REP] When the number of amino acid residues in the REP of the unit is sequentially compared and the number of amino acid residues in the REP having a small number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues in the other REP is 1.8 to 1. When x is the maximum value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units, which is 11.3, and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence. In addition, it may have an amino acid sequence in which x / y is 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more. (A) The number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).

ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。The calculation method of x / y will be described in more detail with reference to FIG. FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from the modified fibroin. From the N-terminal side (left side), the domain sequence consists of (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n. Motif-Third REP (10 amino acid residues)-(A) n Motif-Fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n Motif-Fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has an arrangement called n motifs.

隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。Two adjacent [(A) n motif-REP] units are sequentially selected from the N-terminal side toward the C-terminal side so as not to overlap. At this time, there may be a [(A) n motif-REP] unit that is not selected. In FIG. 1, pattern 1 (comparison between the first REP and the second REP and comparison between the third REP and the fourth REP), pattern 2 (comparison between the first REP and the second REP, and a comparison). 4th REP and 5th REP comparison), Pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, and 4th REP and 5th REP comparison), Pattern 4 (1st REP and (Comparison of the second REP) is shown. There are other selection methods.

次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。Next, for each pattern, the number of amino acid residues of each REP in two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared. The comparison is performed by finding the ratio of the number of amino acid residues of the other when the one with the smaller number of amino acid residues is set to 1. For example, in the case of comparing the first REP (50 amino acid residues) and the second REP (100 amino acid residues), when the first REP having a smaller number of amino acid residues is 1, the second REP The ratio of the number of amino acid residues is 100/50 = 2. Similarly, in the case of comparing the 4th REP (20 amino acid residues) and the 5th REP (30 amino acid residues), when the 4th REP having a smaller number of amino acid residues is 1, the 5th REP The ratio of the number of amino acid residues in is 30/20 = 1.5.

図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。In FIG. 1, when the one with the smaller number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues of the other is 1.8 to 11.3 [(A) n motif-REP] unit set. Shown by solid line. In the present specification, this ratio is referred to as a jagged ratio. When the one with the smaller number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues of the other is less than 1.8 or more than 11.3 . The set of [(A) n motif-REP] units is indicated by a broken line. Indicated.

各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。In each pattern, add up the total number of amino acid residues of the two adjacent [(A) n motif-REP] units shown by the solid line (not only REP, but also the number of amino acid residues of (A) n motif. be.). Then, the total values added are compared, and the total value (maximum value of the total value) of the pattern in which the total value is maximized is defined as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the maximum.

次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。 Next, x / y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y in the domain sequence.

第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。 In the third modified fibroin, x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 65% or more, still more preferably 70% or more. It is preferably 75% or more, even more preferably 80% or more, and particularly preferably 80% or more. The upper limit of x / y is not particularly limited and may be, for example, 100% or less. When the jagged ratio is 1: 1.9 to 11.3, x / y is preferably 89.6% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.8 to 3.4, x. / Y is preferably 77.1% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the jagged ratio is 1. In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.

第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。When the third modified fibroin is a modified fibroin in which at least 7 of the (A) n motifs present in the domain sequence are composed only of alanine residues, the x / y is 46.4% or more. Is more preferable, 50% or more is more preferable, 55% or more is further preferable, 60% or more is further more preferable, 70% or more is even more preferable, and 80% or more. It is particularly preferable to have. The upper limit of x / y is not particularly limited and may be 100% or less.

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合の結果を図３に示す。Here, x / y in naturally derived fibroin will be described. First, as described above, when the fibroin whose amino acid sequence information was registered in NCBI GenBank was confirmed by the method exemplified, 663 types of fibroin (of which 415 types were derived from spiders) were extracted. Of all the extracted fibroin, x / y from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin composed of the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m by the above calculation method. Was calculated. The results when the jagged ratio is 1: 1.9 to 4.1 are shown in FIG.

図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。 The horizontal axis of FIG. 3 indicates x / y (%), and the vertical axis indicates frequency. As is clear from FIG. 3, the x / y of naturally occurring fibroin is less than 64.2% (the highest is 64.14%).

第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。The third modified fibroin, for example, deletes one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence so that x / y is 64.2% or more. Can be obtained by Further, for example, an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs so that x / y is 64.2% or more is designed and designed from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin. It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the amino acid sequence. In each case, in addition to the modification corresponding to the deletion of (A) n motif from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added. The amino acid sequence corresponding to the above may be modified.

第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the third modified fibroin, (3-i) SEQ ID NO: 17 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) -Contains an amino acid sequence represented by PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by (3-ii) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. Modified fibroin can be mentioned.

（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。The modified fibroin of (3-i) will be described. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 is from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin, every other (A) n from the N-terminal side to the C-terminal side. The motif is deleted, and one [(A) n motif-REP] is inserted before the C-terminal sequence. The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 is as described in the second modified fibroin.

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。 The x / y value of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) at a jagged ratio of 1: 1.8 to 11.3 is 15.0%. The value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is 93.4%. The value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is 92.7%. The value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is 89.8%. The values of z / w in the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are 46.8%, 56.2%, 70.1% and 66. 1% and 70.0%.

（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.

（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (3-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9. The modified fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is N-terminal to C-terminal. When the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other The amino acid residue of two adjacent [(A) n motif-REP] units having a ratio of the number of amino acid residues of REP of 1.8 to 11.3 (giza ratio of 1: 1.8 to 11.3) When x is the maximum value of the total value obtained by adding the numbers of groups and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence, x / y is preferably 64.2% or more.

第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。 The third modified fibroin may contain the tag sequence described above at either or both of the N-terminus and the C-terminus.

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the modified fibroin containing the tag sequence, the amino acids represented by (3-iii) SEQ ID NO: 18 (PRT399), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799). Examples may be modified fibroins comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in (3-iv) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. ..

配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are the N-terminals of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively. The amino acid sequence shown by (including His tag sequence and hinge sequence) is added.

（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.

（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (3-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. The modified fibroin of (3-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and is N-terminal to C-terminal. When the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other Let x be the maximum value of the total value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the number of amino acid residues in REP is 1.8 to 11.3. , When the total number of amino acid residues in the domain sequence is y, x / y is preferably 64.2% or more.

第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The third modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.

第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。The fourth modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs and a reduced content of glycine residues as compared with naturally occurring fibroin. Have. The domain sequence of the fourth modified fibroin lacked at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin, plus at least one or more glycine residues in the REP. It can be said that it has an amino acid sequence corresponding to being substituted with another amino acid residue. That is, the fourth modified fibroin is a modified fibroin having the characteristics of the above-mentioned second modified fibroin and the third modified fibroin. Specific aspects and the like are as described in the second modified fibroin and the third modified fibroin.

第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４−ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。 As more specific examples of the fourth modified fibroin, (4-i) SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 13 (PRT410) ), The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 Examples thereof include modified fibroins containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by. Specific embodiments of the modified fibroin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 are as described above.

第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。 The fifth modified fibroin had its domain sequence replaced with one or more amino acid residues in the REP compared to naturally occurring fibroin, and / or REP. It may have an amino acid sequence containing a region having a large hydrophobic index locally, which corresponds to the insertion of one or a plurality of amino acid residues having a large hydrophobic index.

局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。 The region having a locally large hydrophobicity index is preferably composed of consecutive 2 to 4 amino acid residues.

上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。 The amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). It is more preferably a residue.

第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。 In the fifth modified fibroin, one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index as compared with naturally occurring fibroin, and / or one or more amino acid residues in REP. In addition to the modification corresponding to the insertion of an amino acid residue with a high hydrophobicity index, one or more amino acid residues were substituted, deleted, inserted and / or added as compared with naturally occurring fibroin. There may be a modification of the amino acid sequence corresponding to the above.

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。 The fifth modified fibroin, for example, leaves one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in the REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by substituting for a group (eg, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in the REP. Also, for example, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in the REP. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the insertion of and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In each case, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP were replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acids in the REP. In addition to the modification corresponding to the insertion of the residue, the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.

第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。The fifth modified fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the above domain sequence. In all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the above domain sequence, the total number of amino acid residues contained in the region where the average value of the hydrophobicity index of consecutive 4 amino acid residues is 2.6 or more is defined as p. When the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence is q, p / q is 6 It may have an amino acid sequence of .2% or more.

アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。 For the hydrophobicity index of amino acid residues, a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) "A single method for dispensing the hydropathic character of protein. 105-132) is used. Specifically, the hydrophobicity index (hydropathy index, hereinafter also referred to as “HI”) of each amino acid is as shown in Table 1 below.

Figure 2020067554
Figure 2020067554

ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。The method of calculating p / q will be described in more detail. For the calculation, the sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. (Hereinafter referred to as "sequence A") is used. First, in all the REPs contained in the sequence A, the average value of the hydrophobicity index of consecutive 4 amino acid residues is calculated. The average value of the hydrophobicity index is obtained by dividing the total HI of each amino acid residue contained in four consecutive amino acid residues by 4 (the number of amino acid residues). The average value of the hydrophobicity index is obtained for all consecutive 4 amino acid residues (each amino acid residue is used to calculate the average value 1 to 4 times). Next, a region in which the average value of the hydrophobicity index of consecutive four amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to a plurality of "consecutive four amino acid residues having an average value of 2.6 or more of the hydrophobicity index", it should be included as one amino acid residue in the region. become. The total number of amino acid residues contained in the region is p. Further, the total number of amino acid residues contained in the sequence A is q.

例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。For example, when 20 consecutive "4 consecutive amino acid residues having an average hydrophobicity index of 2.6 or more" are extracted (no duplication), the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2. The region of .6 or more contains 20 consecutive 4 amino acid residues (no duplication), and p is 20 × 4 = 80. Further, for example, when two "consecutive four amino acid residues having an average value of 2.6 or more of the hydrophobicity index" are duplicated by one amino acid residue, the hydrophobicity index of the consecutive four amino acid residues is present. A region having an average value of 2.6 or more contains 7 amino acid residues (p = 2 × 4-1 = 7. “-1” is a deduction for duplicates). For example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 4, p is 7 × 4 = because there are seven “consecutive 4 amino acid residues having an average value of the hydrophobicity index of 2.6 or more” without duplication. It becomes 28. Further, for example, in the case of the domain sequence shown in FIG. 4, q is 4 + 50 + 4 + 40 + 4 + 10 + 4 + 20 + 4 + 30 = 170 (excluding the (A) n motif existing at the end of the C-terminal side). Next, p / q (%) can be calculated by dividing p by q. In the case of FIG. 4, 28/170 = 16.47%.

第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。 In the fifth modified fibroin, p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and more preferably 20% or more. Even more preferably, it is even more preferably 30% or more. The upper limit of p / q is not particularly limited, but may be, for example, 45% or less.

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。 The fifth modified fibroin is, for example, one or more hydrophilic amino acid residues (eg, a hydrophobic index) in the REP so that the amino acid sequence of the cloned naturally occurring fibroin satisfies the above p / q condition. (Amino acid residue with a negative value) is replaced with a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index), and / or one or more hydrophobic amino acid residues are inserted in the REP. By doing so, it can be obtained by locally modifying the amino acid sequence to include a region having a large hydrophobicity index. It can also be obtained, for example, by designing an amino acid sequence satisfying the above p / q condition from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence. In each case, one or more amino acid residues in the REP were replaced with amino acid residues with a higher hydrophobicity index compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more in the REP. In addition to the modification corresponding to the insertion of an amino acid residue having a large hydrophobicity index, the modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. ..

疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。 The amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). ) Is preferable, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferable.

第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the fifth modified fibroin, (5-i) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 20 (Met-PRT665) or SEQ ID NO: 21 (Met-PRT666). Alternatively, a modified fibroin containing (5-ii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 can be mentioned.

（５−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。 The modified fibroin of (5-i) will be described. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 consists of 3 amino acid residues in every other REP except for the domain sequence of the terminal on the C-terminal side with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410). The amino acid sequence (VLI) is inserted at two locations, a part of the glutamine (Q) residue is replaced with a serine (S) residue, and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) with one amino acid sequence (VLI) consisting of 3 amino acid residues inserted every other REP. be. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 with two amino acid sequences (VLI) consisting of three amino acid residues inserted every other REP.

（５−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.

（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (5-ii) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21. The modified fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located most on the C-terminal side (A) n. Amino acids contained in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence. When the total number of residues is p and the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence is q. , P / q is preferably 6.2% or more.

第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。 The fifth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus.

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。 As a more specific example of the modified fibroin comprising a tag sequence, the amino acid sequence set forth in (5-iii) SEQ ID NO: 22 (PRT720), SEQ ID NO: 23 (PRT665) or SEQ ID NO: 24 (PRT666), or (5-iv). ) A modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24 can be mentioned.

配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 11 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively. (Including array and hinge array) is added.

（５−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.

（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (5-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24. The modified fibroin of (5-iv) is also a protein containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m. The sequence identity is preferably 95% or more.

（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。The modified fibroin of (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24, and is located most on the C-terminal side (A) n. Amino acids contained in the region where the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence. When the total number of residues is p and the total number of amino acid residues contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence is q. , P / q is preferably 6.2% or more.

第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The fifth modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.

第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。 The sixth modified fibroin has an amino acid sequence with a reduced content of glutamine residues as compared to naturally occurring fibroin.

第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。 The sixth modified fibroin preferably contains at least one motif selected from the GGX motif and the GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.

第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。 When the sixth modified fibroin contains the GPGXX motif in the REP, the GPGXX motif content is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more. The upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited and may be 50% or less, or 30% or less.

本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。In the present specification, the "GPGXX motif content" is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n- motif-REP] m , or Formula 2: [(A) n- motif-REP] m- (A) Fibroin containing a domain sequence represented by n- motif (modified fibroin or naturally derived) In (fibroin), the number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs included in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence. Let s be the number obtained by multiplying the total number by 3 (that is, corresponding to the total number of G and P in the GPGXX motif), and the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is taken from the domain sequence. The GPGXX motif content is calculated as s / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding (A) n motifs.

ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。In the calculation of the GPGXX motif content, "the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence" is targeted at "the most C-terminal side". The sequence from (A) n motif to the C-terminal of the domain sequence located in (A) (sequence corresponding to REP) may contain a sequence having a low correlation with the sequence characteristic of fibroin, and m is small. In this case (that is, when the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content, and this effect is eliminated. When the "GPGXX motif" is located at the C-terminal of the REP, even if "XX" is, for example, "AA", it is treated as a "GPGXX motif".

図５は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。FIG. 5 is a schematic diagram showing the domain sequence of modified fibroin. The calculation method of the GPGXX motif content rate will be specifically described with reference to FIG. First, in the domain sequence of the modified fibroin shown in FIG. 5 (“[(A) n motif-REP] m- (A) n motif” type), all REPs are “located closest to the C-terminal side”. (A) Since it is included in the "sequence obtained by removing the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence" (the sequence shown by "region A" in FIG. 5), s is calculated. The number of GPGXX motifs is 7, and s is 7 × 3 = 21. Similarly, all REPs are "sequences obtained by removing the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence" (the sequence shown in "Region A" in FIG. 5). Since it is contained in.), The total number t of amino acid residues in all REPs excluding the (A) n motif from the sequence is 50 + 40 + 10 + 20 + 30 = 150. Next, s / t (%) can be calculated by dividing s by t, which is 21/150 = 14.0% in the case of the modified fibroin of FIG.

第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。 The sixth modified fibroin has a glutamine residue content of preferably 9% or less, more preferably 7% or less, further preferably 4% or less, and particularly preferably 0%. ..

本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。In the present specification, the "glutamine residue content" is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n motif-REP] m , or formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) fibroin containing a domain sequence represented by n motif (modified fibroin or naturally derived fibroin) In fibroin), all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5). In the REP, the total number of glutamine residues contained in the region is u, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) n. The glutamine residue content is calculated as u / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif. In the calculation of the glutamine residue content, the reason why "the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is excluded from the domain sequence" is the above-mentioned reason. The same is true.

第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。 The sixth modified fibroin corresponds to its domain sequence being deleted from one or more glutamine residues in the REP or replaced with other amino acid residues as compared to naturally occurring fibroin. It may have an amino acid sequence.

「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。 The "other amino acid residue" may be an amino acid residue other than the glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue. The hydrophobicity index of amino acid residues is as shown in Table 1.

表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。 As shown in Table 1, amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), and methionine (M). ) List amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H). can. Among these, amino acid residues selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) are more preferable. , Isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F) are more preferably amino acid residues.

第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。 The sixth modified fibroin has a REP hydrophobicity of -0.8 or more, more preferably -0.7 or more, further preferably 0 or more, and 0.3 or more. Is even more preferable, and 0.4 or more is particularly preferable. The upper limit of the hydrophobicity of REP is not particularly limited and may be 1.0 or less, or 0.7 or less.

本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。In the present specification, the "hydrophobicity of REP" is a value calculated by the following method.
Formula 1: [(A) n motif-REP] m , or formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) fibroin containing a domain sequence represented by n motif (modified fibroin or naturally derived fibroin) In fibroin), all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5). In the REP of, the sum of the hydrophobicity indexes of each amino acid residue in the region is v, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further ( A) The hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif. In the calculation of the hydrophobicity of REP, the reason for targeting "the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence" is the above-mentioned reason. The same is true.

第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。 The sixth modified fibroin had its domain sequence deleted of one or more glutamine residues in REP as compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP. In addition to the modification corresponding to the replacement of one or more amino acid residues with other amino acid residues, there may be further modification of the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. ..

第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。 The sixth modified fibroin, for example, deletes one or more glutamine residues in REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence and / or removes one or more glutamine residues in REP. It can be obtained by substituting with the amino acid residue of. Also, for example, one or more glutamine residues in REP were deleted from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP were replaced with other amino acid residues. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to this and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.

第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。 As more specific examples of the sixth modified fibroin, (6-i) SEQ ID NO: 25 (Met-PRT888), SEQ ID NO: 26 (Met-PRT965), SEQ ID NO: 27 (Met-PRT889), SEQ ID NO: 28 (Met) -PRT916), SEQ ID NO: 29 (Met-PRT918), SEQ ID NO: 30 (Met-PRT699), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT698), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT966), SEQ ID NO: 41 (Met-PRT917) or SEQ ID NO: Modified fibroin containing the amino acid sequence represented by No. 42 (Met-PRT1028), or (6-ii) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31. , A modified fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42.

（６−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The modified fibroin of (6-i) will be described. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 is obtained by substituting VL for all the QQs in the amino acid sequence (Met-PRT410) shown in SEQ ID NO: 7. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with TS, and the remaining Qs are replaced with A. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VI, and the remaining Qs are replaced with L. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VF, and the remaining Qs are replaced with I.

配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is obtained by substituting VL for all QQs in the amino acid sequence (Met-PRT525) shown in SEQ ID NO: 8. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I.

配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。 In the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 32, all the QQs in the sequence in which the regions of the 20 domain sequences existing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) are repeated twice are replaced with VF. And the remaining Q is replaced with I.

配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。 In the amino acid sequence (Met-PRT917) shown in SEQ ID NO: 41, all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with LI, and the remaining Qs are replaced with V. In the amino acid sequence (Met-PRT1028) shown in SEQ ID NO: 42, all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with IF, and the remaining Qs are replaced with T.

配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 are all residual glutamine. The group content is 9% or less (Table 2).

Figure 2020067554
Figure 2020067554

（６−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroin of (6-i) has SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It may consist of the indicated amino acid sequence.

（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroins of (6-ii) are in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence. The modified fibroin of (6-ii) is also a domain represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.

（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。 The modified fibroin of (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified fibroin of (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.

第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。 The sixth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and the C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization and the like of modified fibroin.

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。 As more specific examples of the modified fibroin containing the tag sequence, (6-iii) SEQ ID NO: 33 (PRT888), SEQ ID NO: 34 (PRT965), SEQ ID NO: 35 (PRT889), SEQ ID NO: 36 (PRT916), SEQ ID NO: 37 (PRT918), Modified fibroin containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 (PRT699), SEQ ID NO: 39 (PRT698), SEQ ID NO: 40 (PRT966), SEQ ID NO: 43 (PRT917) or SEQ ID NO: 44 (PRT1028), or (PRT1028). 6-iv) Amino acid sequences and 90s shown by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. A modified fibroin containing an amino acid sequence having a sequence identity of% or more can be mentioned.

配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。 The amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 are, respectively, SEQ ID NO: 25. , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 shown by SEQ ID NO: 11 at the N-terminal of the amino acid sequence. The amino acid sequence (including His tag sequence and hinge sequence) is added. Since only the tag sequence was added to the N-terminal, there was no change in the glutamine residue content, and SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39. , SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).

Figure 2020067554
Figure 2020067554

（６−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The modified fibroins of (6-iii) are in SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It may consist of the indicated amino acid sequence.

（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。The modified fibroins of (6-iv) are in SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence. The modified fibroin of (6-iv) is also a domain represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.

（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。 The modified fibroin of (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the modified fibroin of (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.

第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。 The sixth modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host. The sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.

改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。 The modified fibroin is at least two or more of the characteristics of the first modified fibroin, the second modified fibroin, the third modified fibroin, the fourth modified fibroin, the fifth modified fibroin, and the sixth modified fibroin. It may be a modified fibroin having the above-mentioned characteristics.

改変フィブロインは、親水性改変フィブロインであってもよく、疎水性改変フィブロインであってもよい。本明細書において、「疎水性改変フィブロイン」とは、改変フィブロインを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ）が０超である改変フィブロインである。疎水性指標は表１に示したとおりである。また、「親水性改変フィブロイン」とは、平均ＨＩが０以下である改変フィブロインである。改変フィブロインとしては、耐燃焼性に優れるという観点から、親水性改変フィブロインが好ましく、吸湿発熱性に優れるという観点からは、疎水性改変フィブロインが好ましい。 The modified fibroin may be a hydrophilic modified fibroin or a hydrophobic modified fibroin. In the present specification, "hydrophobic modified fibroin" is a value obtained by obtaining the total hydrophobicity index (HI) of all amino acid residues constituting the modified fibroin, and then dividing the total by the total number of amino acid residues. A modified fibroin having a (mean HI) greater than 0. The hydrophobicity index is as shown in Table 1. Further, the "hydrophilic modified fibroin" is a modified fibroin having an average HI of 0 or less. As the modified fibroin, hydrophilic modified fibroin is preferable from the viewpoint of excellent combustion resistance, and hydrophobic modified fibroin is preferable from the viewpoint of excellent hygroscopic heat generation.

疎水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号４３で示されるアミノ酸配列、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。 Examples of the hydrophobically modified fibroin include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 35. Examples include modified fibroins comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 44.

親水性改変フィブロインとしては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１８、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１１、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインが挙げられる。 Examples of the hydrophilic modified fibroin include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 14. Or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, amino acid represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. Examples include modified fibroins comprising the amino acid sequence set forth in the sequence, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.

本実施形態に係る改変フィブロインは、１種のみの改変フィブロインを含有するものであってもよく、２種以上の改変フィブロインを組み合わせて含有するものであってもよい。 The modified fibroin according to the present embodiment may contain only one modified fibroin, or may contain a combination of two or more modified fibroins.

（改変フィブロイン以外の構造タンパク質）
構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。(Structural proteins other than modified fibroin)
The structural protein may be a polypeptide derived from the above-mentioned natural structural protein, that is, a recombinant polypeptide.

コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。As a recombinant polypeptide of collagen, for example, a protein containing a domain sequence represented by the formula 3: [REP2] o (where, in formula 3, o represents an integer of 5 to 300. REP2 is Gly-X. An amino acid sequence composed of one Y is shown, and X and Y indicate arbitrary amino acid residues other than Gly. A plurality of REP2s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.) Can be done. Specifically, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 can be mentioned. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 corresponds to the repeat portion and motif of a partial sequence of human collagen type 4 (NCBI Genbank accession number: CAA5635.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database. The amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown by SEQ ID NO: 11 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 301st residue to the 540th residue.

レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４６で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４９で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。As a recombinant polypeptide of resilin, for example, a protein containing a domain sequence represented by the formula 4: [REP3] p (where, in formula 4, p represents an integer of 4 to 300. REP3 is Ser-J1. The amino acid sequence composed of J-Tyr-Gly-U-Pro is shown. J indicates an arbitrary amino acid residue, and it is particularly preferable that it is an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser and Thr. Indicates an arbitrary amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr, and Ser. A plurality of REP3s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Good.) Can be mentioned. Specifically, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 can be mentioned. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 replaces Thr at residue 87 with Ser and Asn at residue 95 in the amino acid sequence of lecillin (NCBI's Genbank accession number NP 61157, Gl: 24654243). The amino acid sequence (tag sequence) shown by SEQ ID NO: 49 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which is replaced with Asp.

エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４７で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。 Examples of the recombinant polypeptide of elastin include proteins having amino acid sequences such as NCBI Genbank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine). Specifically, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47 can be mentioned. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 47 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11 at the N-terminal of the amino acid sequence from residue 121 to 390 of the amino acid sequence of accession number AAC98395 of Genbank of NCBI. And the hinge arrangement) are added.

ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。 Examples of the recombinant polypeptide of keratin include Type I keratin of Capra hilcus. Specifically, a protein containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 48 (amino acid sequence of NCBI Genbank accession number ACY30466) can be mentioned.

（改変フィブロインの製造方法）
以下、改変フィブロインの製造方法を例として説明するが、以下の製造方法は、改変フィブロイン以外の構造タンパク質に対しても同様に適用可能である。上記いずれの実施形態に係る改変フィブロインも、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。(Manufacturing method of modified fibroin)
Hereinafter, a method for producing modified fibroin will be described as an example, but the following production method can be similarly applied to structural proteins other than modified fibroin. The modified fibroin according to any of the above embodiments is a host transformed with an expression vector having, for example, a nucleic acid sequence encoding the modified fibroin and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Therefore, it can be produced by expressing the nucleic acid.

改変フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したフィブロインのアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、改変フィブロインの精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変フィブロインをコードする核酸を合成してもよい。 The method for producing the nucleic acid encoding the modified fibroin is not particularly limited. For example, the nucleic acid is produced by a method of amplifying and cloning by a polymerase chain reaction (PCR) or the like using a gene encoding natural fibroin and modifying it by a genetic engineering method, or a method of chemically synthesizing it. can do. The chemical synthesis method of nucleic acid is not particularly limited, and for example, based on the amino acid sequence information of fibroin obtained from NCBI's web database, etc., AKTA oligonucleotide plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.), etc. Genes can be chemically synthesized by ligating automatically synthesized oligonucleotides by PCR or the like. At this time, in order to facilitate purification and / or confirmation of the modified fibroin, a nucleic acid encoding the modified fibroin consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a starting codon and a His10 tag is added to the N-terminal of the above amino acid sequence is synthesized. You may.

調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。 The regulatory sequence is a sequence that controls the expression of modified fibroin in the host (for example, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host. As the promoter, an inducible promoter that functions in the host cell and can induce the expression of modified fibroin may be used. An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducing substance (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.

発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。 The type of expression vector can be appropriately selected depending on the type of host, such as a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phosmid vector, and an artificial chromosome vector. As the expression vector, a vector that can be autonomously replicated in a host cell or can be integrated into the chromosome of the host and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding modified fibroin can be transcribed is preferably used.

宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。 As the host, any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.

原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。 Preferred examples of prokaryotic hosts include bacteria belonging to the genera Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacillus, Corinebacterium, Pseudomonas and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia marcescens and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus satirus and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Microbacterium include Microbacterium, Ammonia Philum and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatum and the like. Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium and Ammonia Genes. Examples of microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida and the like.

原核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。 When a prokaryote is used as a host, as a vector into which a nucleic acid encoding modified fibroin is introduced, for example, pBTrp2 (manufactured by Beringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, Examples thereof include pNCO2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-238569).

真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。 Eukaryotic hosts include, for example, yeast and filamentous fungi (molds, etc.). Examples of the yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like. Examples of filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, and the like.

真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。 When a eukaryote is used as a host, examples of the vector into which the nucleic acid encoding the modified fibroin is introduced include YEP13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051). As a method for introducing an expression vector into the host cell, any method for introducing DNA into the host cell can be used. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method and the like can be mentioned.

発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。 As a method for expressing nucleic acid by a host transformed with an expression vector, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition. ..

改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該改変フィブロインを生成及び蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。 The modified fibroin can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the modified fibroin in the culture medium, and collecting the modified fibroin from the culture medium. The method of culturing the host in the culture medium can be carried out according to the method usually used for culturing the host.

宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。 When the host is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and the host can be efficiently cultured. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.

炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。 The carbon source may be any assimilated by the transforming microorganisms, for example, glucose, fructose, sucrose, carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolysate containing them, acetic acid, propionic acid and the like. Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used. Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract and corn steep liquor. Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digested products thereof can be used. As the inorganic salts, for example, primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate and calcium carbonate can be used.

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。 Culturing of prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast can be carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is, for example, 15-40 ° C. The culture time is usually 16 hours to 7 days. The pH of the culture medium during culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0. The pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.

また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 In addition, antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium during the culture, if necessary. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as needed. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, and indol acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter. Acids and the like may be added to the medium.

発現させた改変フィブロインの単離及び精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。 Isolation and purification of the expressed modified fibroin can be carried out by a commonly used method. For example, when the modified fibroin is expressed in a lysed state in cells, after the culture is completed, the host cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then an ultrasonic crusher, a French press, or a manton. Crush the host cells with a gaulin homogenizer, dynomil, or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a method usually used for isolating and purifying a protein, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using sulfuric acid, a desalting method, or an organic solvent is used. Precipitation method, anion exchange chromatography method using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -cepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), positive using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia). Ion exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoresis method such as isoelectric point electrophoresis Purified preparations can be obtained by using the above methods alone or in combination.

また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。当該改変フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該改変フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。 When the modified fibroin is expressed by forming an insoluble matter in the cells, the insoluble matter of the modified fibroin is recovered as a precipitate fraction by similarly collecting the host cell, crushing the host cell, and centrifuging the cell. The insoluble form of the recovered modified fibroin can be solubilized with a protein denaturing agent. After the operation, a purified preparation of modified fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as described above. When the modified fibroin is secreted extracellularly, the modified fibroin can be recovered from the culture supernatant. That is, a purified sample can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation to obtain a culture supernatant, and using the same isolation and purification method as described above from the culture supernatant.

［成形体の製造方法］
本実施形態に係る成形体の製造方法は、たとえば上述のようにして得られる構造タンパク質を含む組成物を加熱および加圧し、成形体を得る成形工程を含む。この成形工程において、組成物は、６％以上の水分率を有してもよく、好ましくは７．５％以上の水分率を有する。本実施形態に係る成形体の製造方法は、成形工程に先立って、組成物の水分率を６％以上に調整する水分率調整工程を含んでもよく、好ましくは７．５％以上に調整する水分率調整工程を含んでもよい。水分率調整工程が最初に実施されることにより、構造タンパク質が得られた時点における組成物の水分率に関わらず、脆性破壊を起こしにくい成形体を確実に得ることができる。本実施形態に係る構造タンパク質成形体では、曲げによる破断歪みが５．３％以上である。本実施形態に係る構造タンパク質成形体では、曲げによる応力が（脆性破壊を起こさずに）１６５ＭＰａ以上になり得る。本実施形態に係る構造タンパク質成形体では、曲げによる歪みエネルギーが６００Ｊ／ｍ３以上である。[Manufacturing method of molded product]
The method for producing a molded product according to the present embodiment includes, for example, a molding step of heating and pressurizing a composition containing a structural protein obtained as described above to obtain a molded product. In this molding step, the composition may have a moisture content of 6% or more, preferably 7.5% or more. The method for producing a molded product according to the present embodiment may include a moisture content adjusting step of adjusting the moisture content of the composition to 6% or more, preferably 7.5% or more, prior to the molding step. A rate adjustment step may be included. By carrying out the water content adjusting step first, it is possible to surely obtain a molded product that is less likely to cause brittle fracture regardless of the water content of the composition at the time when the structural protein is obtained. In the structural protein molded product according to the present embodiment, the breaking strain due to bending is 5.3% or more. In the structural protein molded article according to the present embodiment, the stress due to bending can be 165 MPa or more (without causing brittle fracture). In the structural protein molded product according to the present embodiment, the strain energy due to bending is 600 J / m 3 or more.

組成物は、構造タンパク質を含んでいればよい。組成物は、構造タンパク質のみであってもよく、構造タンパク質及び任意の添加成分（例えば、可塑剤、着色剤、フィラー、合成樹脂等）を含んでいてもよい。上記添加成分の含有量は、構造タンパク質の合計量の５０質量％以下にすることが好ましい。組成物は、典型的には粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸して得られる繊維等）の形状を有している。成形組成物は、そのような形状の構造タンパク質を含む組成物の融着体であり得る。 The composition may include a structural protein. The composition may be a structural protein only, or may contain a structural protein and any additive component (eg, a plasticizer, a colorant, a filler, a synthetic resin, etc.). The content of the additive component is preferably 50% by mass or less of the total amount of structural proteins. The composition typically has a powdery (lyophilized powder, etc.) or fibrous (spinning, etc.) shape. The molding composition can be a fusion of compositions containing structural proteins of such shape.

組成物の水分率は、公知の水分計を用いて計測することができる。水分率の計測方法としては、たとえば、近赤外線法、電気抵抗法、電気容量法、乾燥重量法、またはカールフィッシャー法を含む化学測定法等の各種の計測方法が挙げられる。公知の計測方法のうちいずれかの方法を用いて、組成物の水分率の計測を行うことができる。たとえば、組成物を十分に撹拌して均一化した後に、その一部分を取り出して、その部分の水分率を計測してもよい。組成物の水分率を調整する場合には、組成物を所定の雰囲気下に置いて組成物を乾燥または加湿しつつ、組成物を所望の水分率に調整することができる。 The moisture content of the composition can be measured using a known moisture meter. Examples of the method for measuring the water content include various measurement methods such as a near-infrared method, an electric resistance method, an electric capacitance method, a dry gravimetric method, and a chemical measurement method including a Karl Fischer method. The water content of the composition can be measured by using any of the known measurement methods. For example, after the composition is sufficiently stirred and homogenized, a part thereof may be taken out and the moisture content of the part may be measured. When adjusting the moisture content of the composition, the composition can be adjusted to a desired moisture content while drying or humidifying the composition by placing the composition in a predetermined atmosphere.

組成物の水分率は、成形工程の開始時において、６％以上であってよく、好ましくは７．５％以上である。組成物の水分率は、成形工程の開始時において、１５％未満であることが好ましく、９％未満であることがより好ましい。 The water content of the composition may be 6% or more, preferably 7.5% or more at the start of the molding process. The water content of the composition is preferably less than 15%, more preferably less than 9% at the start of the molding process.

本実施形態に係る成形体の製造方法は、たとえば、水分率調整工程で水分率が調整された組成物を加熱および加圧して成形体を得る成形工程を含む。なお、水分調整工程が省略されてもよい。すなわち、成形工程では、６％以上の水分率を有する組成物、好ましくは７．５％以上の水分率を有する組成物を用意し、この組成物を加熱および加圧してもよい。 The method for producing a molded product according to the present embodiment includes, for example, a molding step of heating and pressurizing a composition whose water content has been adjusted in the water content adjusting step to obtain a molded product. The moisture adjustment step may be omitted. That is, in the molding step, a composition having a water content of 6% or more, preferably a composition having a water content of 7.5% or more may be prepared, and this composition may be heated and pressurized.

成形工程では、たとえば、構造タンパク質を含む組成物を鋳型（モールド）に導入し、組成物を加熱および加圧しつつ成形加工して、成形体（モールド成形体）を得る。成形工程では、たとえば加圧成形機を用いることができる。この加圧成形機の構成は、特に限定はされないが、たとえば、上記特許文献２（国際公開第２０１８／０４３６９８号）に記載された加圧成形機と同じ構成を有する加圧成形機が用いられ得る。加圧成形機は、たとえば金型を加熱する機能を有する。加熱および加圧の方法についても、特許文献２に記載された方法が用いられ得る。加圧成形機は、金型を加熱することにより、内部の成形体を加熱する。加圧成形機は、たとえば、内部の成形体の温度を計測するように構成されてもよい。なお、上記装置および方法に限られず、他の公知の成形方法、および成形体の加熱加圧方法が採用されてもよい。 In the molding step, for example, a composition containing a structural protein is introduced into a mold (mold), and the composition is molded while being heated and pressed to obtain a molded product (mold molded product). In the molding step, for example, a pressure molding machine can be used. The configuration of this pressure molding machine is not particularly limited, but for example, a pressure molding machine having the same configuration as the pressure molding machine described in Patent Document 2 (International Publication No. 2018/043698) is used. obtain. The pressure molding machine has a function of heating, for example, a mold. As for the heating and pressurizing methods, the methods described in Patent Document 2 can also be used. The pressure molding machine heats the molded body inside by heating the mold. The pressure molding machine may be configured to measure the temperature of the molded body inside, for example. In addition, the present invention is not limited to the above-mentioned apparatus and method, and other known molding methods and a method for heating and pressurizing a molded product may be adopted.

成形工程における加熱は、たとえば、金型の温度が８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく、５〜３０分が更に好ましい。加熱成形機が内部の成形体の温度を計測するように構成されている場合には、成形工程における加熱は、たとえば、成形体の温度が８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。 The heating in the molding step is preferably performed at, for example, a mold temperature of 80 to 300 ° C., more preferably 100 to 180 ° C., still more preferably 100 to 130 ° C. Pressurization is preferably performed at 5 kN or higher, more preferably 10 kN or higher, and even more preferably 20 kN or higher. Further, after reaching a predetermined heating and pressurizing condition, the time (heat retention condition) for continuing the treatment under that condition is preferably 0 to 100 minutes, more preferably 1 to 50 minutes, still more preferably 5 to 30 minutes. When the heat molding machine is configured to measure the temperature of the molded body inside, the heating in the molding step is preferably performed, for example, at a temperature of the molded body of 80 to 300 ° C., preferably 100 to 180 ° C. Is more preferable, and 100 to 130 ° C. is even more preferable.

本実施形態に係る成形体の製造方法は、更に、成形工程で得られる成形体を圧延する圧延工程を含む。この圧延工程では、成形工程で得られる成形体を圧縮して延伸する。圧延工程では、たとえば延伸機を用いることができる。この延伸機の構成は、特に限定はされないが、たとえば、２本の円筒状のロールを有する延伸機が用いられる。圧延工程では、たとえば２本のロールで成形体を挟み込んで圧力を加えつつ、２本のロールをそれぞれ回転させて送り出す。これにより、成形体の全体を圧縮延伸する。この圧延工程において、成形体を加熱してもよいし、加熱しなくてもよい。成形体を圧延しながら加熱する場合、加熱延伸機が用いられ得る。 The method for producing a molded product according to the present embodiment further includes a rolling step of rolling the molded product obtained in the molding step. In this rolling step, the molded product obtained in the molding step is compressed and stretched. In the rolling step, for example, a stretching machine can be used. The configuration of this stretching machine is not particularly limited, but for example, a stretching machine having two cylindrical rolls is used. In the rolling process, for example, the molded product is sandwiched between two rolls and pressure is applied to rotate the two rolls to feed them. As a result, the entire molded product is compressed and stretched. In this rolling step, the molded product may or may not be heated. When heating the molded product while rolling it, a heating and stretching machine can be used.

本実施形態の圧延工程では、成形体を６０％以上の圧下率をもって圧延してもよい。本実施形態の圧延工程では、好ましくは、成形体を６９．３％以上の圧下率をもって圧延する。本明細書において、圧下率とは、板厚（成形体の厚み）の減少率である。圧延工程において、圧下率は高い方がより高強度の成形体が得られるが、圧下率は用途に応じて定めることができる。２本のロール（上ロールおよび下ロール）を有する圧延機を用いる場合には、これらのロールの位置（間隔）が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。 In the rolling step of the present embodiment, the molded product may be rolled with a rolling reduction of 60% or more. In the rolling step of the present embodiment, the compact is preferably rolled with a rolling reduction of 69.3% or more. In the present specification, the reduction rate is a reduction rate of the plate thickness (thickness of the molded product). In the rolling process, the higher the rolling reduction, the higher the strength of the molded product, but the rolling ratio can be determined according to the application. When a rolling mill having two rolls (upper roll and lower roll) is used, the rolling reduction ratio of the molded product can be set by determining the positions (intervals) of these rolls.

圧延工程において加熱を行う場合、加熱は、８０〜２００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１２０〜１６０℃が更に好ましい。 When heating is performed in the rolling step, the heating is preferably performed at 80 to 200 ° C., more preferably 100 to 180 ° C., and even more preferably 120 to 160 ° C.

なお、圧延工程は、２本のロールを用いた形態に限られず、圧縮延伸を行い得る他の形態によって行われてもよい。たとえば、平板状の基盤とロールとを備える延伸機を用い、基盤上に成形組成物を置き、その上からロールを転がしつつ押し当てることで、成形組成物を圧縮延伸してもよい。あるいは、平板状の上金型および下金型を備える延伸機を用い、上金型および下金型により成形組成物を挟み込んで圧力を加えることで、成形組成物を圧縮延伸してもよい。圧下率の設定は、２本のロールの場合と同様である。上の部材と下の部材の位置（間隔）が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。 The rolling step is not limited to the form using two rolls, and may be performed in another form capable of performing compression stretching. For example, the molding composition may be compression-stretched by placing the molding composition on the substrate using a stretching machine provided with a flat plate-shaped substrate and a roll, and pressing the roll while rolling the roll from the forming composition. Alternatively, the molding composition may be compression-stretched by sandwiching the molding composition between the upper mold and the lower mold and applying pressure using a stretching machine provided with a flat upper mold and a lower mold. The setting of the reduction rate is the same as in the case of two rolls. By determining the positions (intervals) between the upper member and the lower member, the reduction rate of the molded product can be set.

これらの水分率調整工程、成形工程、および圧延工程を経て、成形体が製造される。組成物の水分率および成形体の圧下率を上記した範囲とすることにより、脆性破壊を起こしにくい成形体が得られる。たとえば、数％以上（たとえば５％以上）の大きい歪みでも、脆性破壊を起こさない成形体が得られる。すなわち、数％以上（たとえば５％以上）の大きい歪みでも、破断しない成形体、もしくは折れない成形体が得られる。 A molded product is manufactured through these moisture content adjusting steps, molding steps, and rolling steps. By setting the water content of the composition and the reduction rate of the molded product within the above ranges, a molded product that is less likely to cause brittle fracture can be obtained. For example, a molded product that does not cause brittle fracture can be obtained even with a large strain of several percent or more (for example, 5% or more). That is, a molded product that does not break or does not break even with a large strain of several% or more (for example, 5% or more) can be obtained.

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

（１）構造タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。(1) Preparation of Structural Protein Expressing Strain The nucleotide sequence and amino acid sequence of fibroin (GenBank accession number: P4684.1, GI: 11744415) derived from Nephila clavipes are obtained from the GenBank web database and then produced. Amino acids shown in SEQ ID NO: 13 are substituted, inserted and deleted for the purpose of improving sex, and the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 11 is added to the N-terminal. A modified fibroin having a sequence (hereinafter, also referred to as “PRT410”) was designed.

次に、ＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を合成委託した。その結果、遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び３’末端直下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した遺伝子を得た。当該遺伝子をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした後、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組み換えた。 Next, the gene encoding PRT410 was outsourced for synthesis. As a result, a gene having an NdeI site immediately upstream of the 5'end and an EcoRI site immediately downstream of the 3'end was obtained. The gene was cloned into a cloning vector (pUC118), treated with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and recombined into a protein expression vector pET-22b (+).

（２）タンパク質の発現
上記で得られたＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、表４に示すシード培養用培地１００ｍＬに、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコにて、さらに約１５時間培養を行い、シード培養液を得た。

Figure 2020067554
(2) Expression of protein Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with the pET22b (+) expression vector containing the gene encoding PRT410 obtained above. The transformed Escherichia coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours, and then the same culture solution was added to 100 mL of the seed culture medium shown in Table 4 so that the OD 600 was 0.005. The temperature of the culture solution was kept at 30 ° C., and the cells were further cultured in a flask for about 15 hours until the OD 600 reached 5, to obtain a seed culture solution.
Figure 2020067554

得られたシード培養液を、表５に示す生産培地５００ｍＬを添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定になるように制御し、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにして培養した。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。The obtained seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium shown in Table 5 was added so that the OD 600 was 0.05. The temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., controlled to be constant at pH 6.9, and the culture was carried out so that the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration. As the antifoaming agent, ADEKANOLG-295S (manufactured by ADEKA Corporation) was used.

Figure 2020067554
Figure 2020067554

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。 Immediately after the glucose in the production medium was completely consumed, the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min. The culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and the culture was carried out for 20 hours. Then, a 1 M aqueous solution of isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target protein. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged and the cells were collected. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture broth before and after the addition of IPTG, and the expression of the target protein was confirmed by the appearance of a band of the target protein size depending on the addition of IPTG.

（３）構造タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。(3) Purification of Structural Protein The cells collected 2 hours after the addition of IPTG were washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The washed cells were suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing about 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and the cells were disrupted with a high-pressure homogenizer (GEA Niro Soavi). The crushed cells were centrifuged to obtain a precipitate. The resulting precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) until high purity. The washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL and at 60 ° C. Stir with a stirrer for 30 minutes to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, water was removed with a freeze dryer, and the freeze-dried powder was recovered.

＜成形体の作製＞
次に、得られた凍結乾燥粉末の水分を調整した。比較例１〜４に係る成形体を作製するため、加熱乾燥式水分計（(株)エー・アンド・デイ製、ＭＳ−７０）を用い、１分間の重量変化率が０．０１ｗｔ％以下になるまで１３０℃で粉末を乾燥し、これを２３℃、６０％ＲＨの雰囲気下に５分間置き、水分率５．８％のクモ糸フィブロイン粉末（構造タンパク質粉末）を得た。また、比較例５〜７および実施例に係る成形体を作製するため、上記と同様の装置および条件で粉末を乾燥し、これを２３℃、６０％ＲＨの雰囲気下に７分間置き、水分率７．５％のクモ糸フィブロイン粉末（構造タンパク質粉末）を得た。<Making a molded product>
Next, the water content of the obtained lyophilized powder was adjusted. In order to prepare the molded product according to Comparative Examples 1 to 4, a heat-drying moisture meter (MS-70, manufactured by A & D Co., Ltd.) was used, and the weight change rate per minute was 0.01 wt% or less. The powder was dried at 130 ° C. until it became dry, and this was placed in an atmosphere of 23 ° C. and 60% RH for 5 minutes to obtain a spider fibroin powder (structural protein powder) having a water content of 5.8%. Further, in order to prepare the molded products according to Comparative Examples 5 to 7 and Examples, the powder was dried under the same equipment and conditions as described above, and the powder was placed in an atmosphere of 23 ° C. and 60% RH for 7 minutes to have a moisture content. 7.5% spider silk fibroin powder (structural protein powder) was obtained.

続いて、加圧成形機を用いて、上記粉末を加熱および加圧し、成形体を得た。この加圧成形機の金型は、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する金型である。上記粉末を加圧成形機の金型の貫通孔内に導入し、金型を加熱するとともに、ハンドプレス機（商品名：ＮＴ−１００Ｈ−Ｖ０９、ＮＰａシステム(株)製）を用いて、４０ｋＮ（２７．５５ＭＰａ）に加圧した。成形体の温度が１３０℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラー（商品名：ＴＳ−２５ＥＰ−１、トラスコ中山(株)製）で成形体を冷却し、成形体の温度が５０℃になったところで成形体を金型から取り出した。比較例１〜７および実施例において、成形工程は同じ（共通）である。比較例１〜７および実施例のそれぞれにつき、３５ｍｍ×１５ｍｍ×３ｍｍの直方体形状のモールド成形体を得た。 Subsequently, the powder was heated and pressed using a pressure molding machine to obtain a molded product. The mold of this pressure molding machine is a mold having a rectangular through hole having a cross section of 35 mm × 15 mm. The above powder is introduced into the through hole of the mold of the pressure molding machine, the mold is heated, and 40 kN is used using a hand press machine (trade name: NT-100H-V09, manufactured by NPa System Co., Ltd.). The pressure was increased to (27.55 MPa). When the temperature of the molded product reaches 130 ° C, heating is stopped, and the molded product is cooled with a spot cooler (trade name: TS-25EP-1, manufactured by TRUSCO NAKAYAMA Co., Ltd.), and the temperature of the molded product reaches 50 ° C. At that point, the molded product was taken out of the mold. In Comparative Examples 1 to 7 and Examples, the molding steps are the same (common). For each of Comparative Examples 1 to 7 and Examples, a molded product having a rectangular parallelepiped shape of 35 mm × 15 mm × 3 mm was obtained.

続いて、延伸機を用いて、成形体を圧延した。なお、比較例１，５ではこの圧延工程を実施せず、上記のモールド成形体を曲げ試験に供した。手動式加熱延伸機（井元製作所(株)製、ＩＭＣ−１９８９型）を用い、比較例２〜４，６〜７および実施例に係る各モールド成形体を直接ロールに挟み込み、延伸させた。比較例２〜４，６〜７に係るモールド成形体において、圧下率（板厚の減少率）は２５．４〜５８．８％とした（詳しくは表６参照）。実施例に係るモールド成形体において、圧下率（板厚の減少率）は６９．３％とした。 Subsequently, the molded product was rolled using a stretching machine. In Comparative Examples 1 and 5, this rolling step was not carried out, and the above-mentioned molded product was subjected to a bending test. Using a manual heating and stretching machine (manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd., IMC-1989 type), the molded bodies of Comparative Examples 2 to 4, 6 to 7 and Examples were directly sandwiched between rolls and stretched. In the molded product according to Comparative Examples 2 to 4, 6 to 7, the reduction rate (decrease rate of plate thickness) was set to 25.4 to 58.8% (see Table 6 for details). In the molded product according to the example, the reduction rate (decrease rate of plate thickness) was 69.3%.

＜曲げ試験＞
上記のように作製した各成形体に対し、卓上形精密万能試験機（（株）島津製作所製、オートグラフＡＧＳ−Ｘ）を用いて三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであり、支点間距離は２７ｍｍ、測定速度は１ｍｍ／分とした。この試験により得られる歪みと応力の数値データを用い、応力を歪みで積分することで、歪みエネルギーを算出した。<Bending test>
Each molded product produced as described above was subjected to a three-point bending test using a tabletop precision universal testing machine (manufactured by Shimadzu Corporation, Autograph AGS-X). The load cell used was 50 kN, the distance between the fulcrums was 27 mm, and the measurement speed was 1 mm / min. Using the numerical data of strain and stress obtained by this test, the strain energy was calculated by integrating the stress with strain.

曲げ試験の結果を表６、図６および図７に示す。比較例１〜６では、いずれも３％未満の歪みで、破断すなわち脆性破壊が起こった。比較例７では、５．２％の歪みで、破断すなわち脆性破壊が起こった。実施例では、歪みが１０％となっても（すなわちオートグラフの動作範囲を超えても）破断すなわち脆性破壊は起こらなかった。すなわち、実施例では、歪みが１０％となっても、モールド成形体は折れなかった。実施例のように、外力または衝撃を受けた際に折れにくいレジンが得られた。なお、表６において、実施例に関しては塑性変形時の応力が示されている。実施例における歪み１０％での応力は、２１９ＭＰａであった。 The results of the bending test are shown in Table 6, FIG. 6 and FIG. In Comparative Examples 1 to 6, fracture, that is, brittle fracture occurred with a strain of less than 3%. In Comparative Example 7, fracture, that is, brittle fracture occurred at a strain of 5.2%. In the examples, fracture, that is, brittle fracture, did not occur even when the strain was 10% (that is, even if the operating range of the autograph was exceeded). That is, in the example, the molded product did not break even when the strain was 10%. As in the examples, a resin that is hard to break when subjected to an external force or an impact was obtained. In Table 6, the stress at the time of plastic deformation is shown for the examples. The stress at 10% strain in the examples was 219 MPa.

Figure 2020067554
Figure 2020067554

本発明は、構造タンパク質を含む成形体であって脆性破壊を起こしにくい成形体を得ることを可能とする。 The present invention makes it possible to obtain a molded product containing a structural protein and which is less likely to cause brittle fracture.

Claims (6)

構造タンパク質を含む組成物であって６％以上の水分率を有する前記組成物を加熱および加圧し、成形体を得る成形工程と、
前記成形工程で得られる前記成形体を６０％以上の圧下率をもって圧延する圧延工程と、を含む成形体の製造方法。A molding step of heating and pressurizing the composition containing a structural protein and having a water content of 6% or more to obtain a molded product, and
A method for producing a molded product, comprising a rolling step of rolling the molded product obtained in the molding step with a rolling reduction of 60% or more. 前記成形工程に先立って、前記構造タンパク質を含む組成物の水分率を６％以上に調整する水分率調整工程を含む、請求項１に記載の成形体の製造方法。 The method for producing a molded product according to claim 1, further comprising a water content adjusting step of adjusting the water content of the composition containing the structural protein to 6% or more prior to the molding step. 前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１または２に記載の成形体の製造方法。 The method for producing a molded product according to claim 1 or 2, wherein the structural protein is spider silk fibroin. 曲げによる破断歪みが５．３％以上である構造タンパク質成形体。 A structural protein molded product having a breaking strain due to bending of 5.3% or more. 曲げによる歪みエネルギーが６００Ｊ／ｍ３以上である構造タンパク質成形体。A structural protein molded article having a strain energy of 600 J / m 3 or more due to bending. 前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項５に記載の構造タンパク質成形体。 The structural protein molded article according to claim 5, wherein the structural protein is spider silk fibroin.
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