JP2020046412A

JP2020046412A - INSPECTION METHOD OF IgG4-RELATED DISEASE

Info

Publication number: JP2020046412A
Application number: JP2018177723A
Authority: JP
Inventors: 雅広塩川; Masahiro Shiokawa; 裕三児玉; Yuzo Kodama
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-03-26

Abstract

To provide an inspection method of IgG4-related disease with higher accuracy.SOLUTION: The inspection method includes an indirect detection step of indirectly detecting an index antibody bonded to a laminin-integrin composite, in an analyte, as an index of IgG4-related disease. The indirect detection step includes: a first step of bringing the composite into contact with an analyte; a second step of bringing the composite after the first step into contact with an antibody for detection being an antibody which bonds to the composite, to which the index antibody is not bonded, but does not bond to the composite, to which the index antibody is bonded, or an antibody which does not bond to the composite, to which the index antibody does not bond, but bonds to the composite, to which the index antibody bonds; and a third step of detecting the antibody for detection bonded to the composite after the second step.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明は、ＩｇＧ４関連疾患の検査方法、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査試薬、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法、及び、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for testing an IgG4-related disease, a test reagent for testing an IgG4-related disease, a method for evaluating the effect of treatment on an IgG4-related disease, and a method for screening a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease. .

ＩｇＧ４関連疾患とは、血清ＩｇＧ４高値とＩｇＧ４陽性形質細胞の組織浸潤または腫瘤形成を特徴とする疾患群である。 The IgG4-related diseases are a group of diseases characterized by high serum IgG4 levels and tissue infiltration or mass formation of IgG4-positive plasma cells.

ＩｇＧ４関連疾患は比較的新しい疾患概念であり、これまでのところ原因は不明である。罹患臓器としては膵臓、胆管、涙腺・唾液腺、中枢神経系、甲状腺、肺、肝臓、消化管、腎臓、前立腺、後腹膜、動脈、リンパ節、皮膚、乳腺等が知られている。病変が複数臓器におよび全身疾患としての特徴を有することが多いが、単一臓器病変の場合もある。 IgG4-related disease is a relatively new concept of disease, the cause of which is unknown so far. Known affected organs include pancreas, bile duct, lacrimal gland / salivary gland, central nervous system, thyroid gland, lung, liver, digestive tract, kidney, prostate, retroperitoneum, artery, lymph node, skin, mammary gland and the like. The lesions are often characterized as multiple organs and as a systemic disease, but may be single organ lesions.

自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、ＩｇＧ４関連腎疾患、ＩｇＧ４関連涙腺唾液腺炎等がＩｇＧ４関連疾患に分類される疾患として知られている。 Autoimmune pancreatitis (AIP), IgG4-related renal disease, IgG4-related lacrimal gland salivary glanditis, and the like are known as diseases classified as IgG4-related diseases.

これまでに自己免疫性膵炎の検査方法として、ＨＳＰ１０と免疫学的に結合する抗体を検出する方法（特許文献１）や、アミラーゼα２−Ａと免疫学的に結合する抗体を検出する方法（特許文献２）が知られている。しかしながら、これらの方法は、自己免疫性膵炎の検査方法として必ずしも満足できるものではなかった。 To date, as a method for testing autoimmune pancreatitis, a method for detecting an antibody that immunologically binds to HSP10 (Patent Document 1) and a method for detecting an antibody that immunologically binds to amylase α2-A (Patent Document 1) Reference 2) is known. However, these methods have not always been satisfactory as methods for testing autoimmune pancreatitis.

従来の方法では、ＩｇＧ４関連疾患であると診断することは容易ではなかった。例えば、ＡＩＰは膵臓での組織浸潤を特徴とするが、組織の観察像からは膵癌との判別が難しく、ＡＩＰが誤って膵癌と診断される可能性もあった。 With conventional methods, it has not been easy to diagnose an IgG4-related disease. For example, although AIP is characterized by infiltration of tissue in the pancreas, it is difficult to discriminate it from pancreatic cancer from the observed image of the tissue, and AIP may be erroneously diagnosed as pancreatic cancer.

そこで本発明者らは、特許文献３において、ＡＩＰ等のＩｇＧ４関連疾患の病原物質が、ラミニンに対する自己抗体及びインテグリンに対する自己抗体であること、及び、血清中における抗ラミニン抗体及び抗インテグリン抗体がＩｇＧ４関連疾患の指標となることを開示した。 Therefore, the inventors of the present invention disclose in Patent Document 3 that the pathogens of an IgG4-related disease such as AIP are autoantibodies to laminin and autoantibodies to integrin, and that the anti-laminin antibody and anti-integrin antibody in serum are IgG4 It has been disclosed that it can be an indicator of related diseases.

特開２００９−２９４０４０号公報JP 2009-294040 A 特開２００８−２７５５２７号公報JP 2008-275527 A 国際公開ＷＯ２０１８／０１６６０７International Publication WO2018 / 016607

特許文献３の実験９では、５１名のＡＩＰ患者のうち、２６名が抗ラミニン抗体陽性かつ抗インテグリン抗体陰性であり、４名が抗ラミニン抗体陰性かつ抗インテグリン抗体陽性であり、２１名が抗ラミニン抗体と抗インテグリン抗体の両方とも陰性であったことが示されている。すなわち、ＡＩＰ患者の５９％（３０名／５１名）で、抗ラミニン抗体及び抗インテグリン抗体の一方が陽性であり、これらはＡＩＰマーカー抗体として有用であることが確認された。しかし、ＡＩＰ患者の残りの４１％（２１名／５１名）については、自己抗体が確認できず偽陰性となるという課題があった。 In Experiment 9 of Patent Document 3, out of 51 AIP patients, 26 were anti-laminin antibody-positive and anti-integrin antibody-negative, 4 were anti-laminin antibody-negative and anti-integrin antibody-positive, and 21 were anti-laminin antibody-positive. Both laminin and anti-integrin antibodies have been shown to be negative. That is, one of the anti-laminin antibody and the anti-integrin antibody was positive in 59% (30/51) of AIP patients, and it was confirmed that these were useful as AIP marker antibodies. However, the remaining 41% (21/51) of AIP patients had a problem that autoantibodies could not be confirmed and false negatives were obtained.

ＡＩＰ等のＩｇＧ４関連疾患を、偽陰性及び偽陽性の可能性が低減された、より高い精度で検査する検査方法の提供が求められている。 There is a need to provide a test method for testing IgG4-related diseases such as AIP with higher accuracy, which has a reduced possibility of false negatives and false positives.

ラミニンとインテグリンは生体内ではラミニン−インテグリン複合体として存在する。本発明者らは、ＩｇＧ４関連疾患の患者が有する抗ラミニン抗体、抗インテグリン抗体等の自己抗体が、ラミニン−インテグリン複合体に結合するときに、該複合体の状態になんらかの変化が生じると推定した。本発明者らは、ＩｇＧ４関連疾患患者の自己抗体のラミニン−インテグリン複合体への結合を直接的に検出するのではなく、自己抗体の結合に伴うラミニン−インテグリン複合体の状態変化を検出することを試みた。そして前記の状態変化を検出する手段として、前記自己抗体が結合していない前記複合体とは免疫学的に結合するが、前記自己抗体が結合している前記複合体とは免疫学的に結合しない抗体、或いは、前記自己抗体が結合していない前記複合体とは免疫学的に結合しないが、前記自己抗体が結合している前記複合体とは免疫学的に結合する抗体である検出用抗体に着目した。そして、ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させ、次いで、前記複合体に前記検出用抗体を接触させ、次いで、前記複合体に結合した前記検出用抗体を検出することで、ＩｇＧ４関連疾患を、偽陰性及び偽陽性がなく高い精度で検査することが可能であることを見出し、この知見に基づいて以下の発明を完成するに至った。 Laminin and integrins exist in vivo as laminin-integrin complexes. The present inventors have presumed that when an autoantibody such as an anti-laminin antibody or an anti-integrin antibody possessed by a patient with an IgG4-related disease binds to a laminin-integrin complex, some change occurs in the state of the complex. . The present inventors do not directly detect the binding of an autoantibody to a laminin-integrin complex of an IgG4-related disease patient, but rather detect a change in the state of the laminin-integrin complex associated with the binding of the autoantibody. Tried. Then, as means for detecting the state change, immunologically binds to the complex to which the autoantibody is not bound, but immunologically binds to the complex to which the autoantibody is bound. No antibody or the complex to which the autoantibody is not bound is not immunologically bound, but the complex to which the autoantibody is bound is an antibody that is immunologically bound. We focused on antibodies. Then, the sample is brought into contact with the laminin-integrin complex, and then the detection antibody is brought into contact with the complex, and then the detection antibody bound to the complex is detected. Was found to be able to be tested with high precision without false negatives and false positives, and based on this finding, the following invention was completed.

（１）ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。
（２）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎である、（１）に記載の方法。
（３）前記検出用抗体が、前記第１の検出用抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ラミニン−インテグリン複合体を構成するインテグリンが、インテグリンα６β１である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記検出用抗体が、インテグリンα６鎖のβプロペラドメインに含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、（４）に記載の方法。
（６）前記検出用抗体が、配列番号１で示されるインテグリンα６鎖のアミノ酸配列の第１位〜第１００位の範囲内に含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）前記検体が血液試料である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）ラミニン及びインテグリンとの組み合わせ、或いは、ラミニン−インテグリン複合体と、
ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体と
を含む、ＩｇＧ４関連疾患の検査キット。
（９）前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎である、（８）に記載のキット。
（１０）前記検出用抗体が、前記第１の検出用抗体である、（８）又は（９）に記載のキット。
（１１）インテグリン又はラミニン−インテグリン複合体を構成するインテグリンが、インテグリンα６β１である、（８）〜（１０）のいずれかに記載のキット。
（１２）前記検出用抗体が、インテグリンα６鎖のβプロペラドメインに含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、（１１）に記載のキット。
（１３）前記検出用抗体が、配列番号１で示されるインテグリンα６鎖のアミノ酸配列の第１位〜第１００位の範囲内に含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、（１１）又は（１２）に記載のキット。
（１４）ラミニン及びインテグリンのうち一方、或いは、ラミニン−インテグリン複合体を、固相に固定された形態で含む、（８）〜（１３）のいずれかに記載のキット。
（１５）前記検出用抗体と免疫学的に結合する、標識された二次抗体を更に含む、（８）〜（１４）のいずれかに記載のキット。
（１６）ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。
（１７）ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記指標抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。 (1) a method for testing an IgG4-related disease,
An indirect detection step of indirectly detecting, as an indicator of an IgG4-related disease, an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.
(2) The method according to (1), wherein the IgG4-related disease is autoimmune pancreatitis.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the detection antibody is the first detection antibody.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the integrin constituting the laminin-integrin complex is integrin α6β1.
(5) The method according to (4), wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region contained in the β-propeller domain of the integrin α6 chain.
(6) the antibody for detection is an antibody that recognizes, as an epitope, a region included in the first to 100th positions of the amino acid sequence of the integrin α6 chain represented by SEQ ID NO: 1 as an epitope; The method according to 5).
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the specimen is a blood sample.
(8) a combination of laminin and an integrin, or a laminin-integrin complex;
The laminin-integrin complex binds immunologically to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody that binds immunologically does not bind, while the laminin-integrin complex to which the indicator antibody binds immunologically binds Laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the first detection antibody that does not bind chemically or the laminin-integrin complex that does not bind to the indicator antibody, but binds to the indicator antibody And a detection antibody that is a second detection antibody that binds immunologically, and a test kit for an IgG4-related disease.
(9) The kit according to (8), wherein the IgG4-related disease is autoimmune pancreatitis.
(10) The kit according to (8) or (9), wherein the detection antibody is the first detection antibody.
(11) The kit according to any of (8) to (10), wherein the integrin constituting the integrin or laminin-integrin complex is integrin α6β1.
(12) The kit according to (11), wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region contained in the β propeller domain of the integrin α6 chain.
(13) The antibody according to (11) or (11), wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region included in the amino acid sequence of the integrin α6 chain represented by SEQ ID NO: 1 within the range from position 1 to position 100. The kit according to 12).
(14) The kit according to any one of (8) to (13), which comprises one of laminin and integrin, or a laminin-integrin complex in a form immobilized on a solid phase.
(15) The kit according to any one of (8) to (14), further comprising a labeled secondary antibody that immunologically binds to the detection antibody.
(16) A method for evaluating the effect of treatment on an IgG4-related disease,
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample obtained from a test animal that has been treated for an IgG4-related disease,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.
(17) A method for screening a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease,
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a specimen obtained from an animal on which a test substance has been acted on,
A step of selecting the test substance as a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease, when the indicator antibody in the sample is reduced by allowing the test substance to act,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

本発明によれば、偽陰性及び偽陽性の可能性が低減されたＩｇＧ４関連疾患の検査方法、ＩｇＧ４関連疾患を検査するための検査キット、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法として有効な手段が提供される。 According to the present invention, a method for testing an IgG4-related disease with reduced possibility of false negatives and false positives, a test kit for testing an IgG4-related disease, a method for evaluating the effect of treatment on an IgG4-related disease, an IgG4-related An effective means is provided as a method for screening a candidate substance for a therapeutic agent for a disease.

図１は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）のＩｇＧ４濃度（ｍｇ／ｄｌ）の測定結果を示す。FIG. 1 shows the measurement results of the IgG4 concentration (mg / dl) of the serum of AIP patients (24 cases) and the control serum (20 cases). 図２は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）の抗ヒトラミニン５１１活性断片抗体の定量結果を示す。FIG. 2 shows the quantification results of anti-human laminin 511 active fragment antibody in AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases). 図３は本発明の方法の概要を説明するための模式図である。図３（Ａ）は、固相１０上にヒトラミニン−５１１−Ｅ８（ラミニン５１１活性断片）１を固定し、更に、このラミニン５１１活性断片１にヒトインテグリンα６β１（インテグリン）２を結合させてラミニン−インテグリン複合体３を形成する例を示す。図３（Ｂ１）及び（Ｂ２）は、固相１０に固定された複合体３に血清Ｓを接触させる例を示す。図３（Ｂ１）は、血清Ｓ中に複合体３に結合する自己抗体４が存在する場合に、自己抗体４が複合体３に結合することを示す。図３（Ｂ２）は、血清Ｓ中に複合体３に結合する自己抗体４が存在しない場合を示す。図３（Ｃ１）及び（Ｃ２）は、それぞれ、図３（Ｂ１）及び（Ｂ２）に示した血清Ｓと接触後の複合体３に、自己抗体４が結合していない複合体３と結合することができ、且つ、自己抗体４が結合した複合体３とは結合することができない第１の検出用抗体である一次抗体５を接触させた例を示す。図３（Ｄ１）及び図３（Ｄ２）は、それぞれ、図３（Ｃ１）及び（Ｃ２）に示した一次抗体５と接触後の複合体３に、一次抗体５と結合する、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）７で標識した二次抗体６を接触させた例を示す。二次抗体６を接触させ、インキュベートし、洗浄した後の固相１０上のＨＲＰ７の酵素活性を指標として二次抗体６の定量を行うことで、一次抗体５が定量される。一次抗体５の量は、血清Ｓ中の、自己抗体４の量に反比例する。FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the outline of the method of the present invention. FIG. 3 (A) shows that human laminin-511-E8 (laminin 511 active fragment) 1 is immobilized on solid phase 10, and human integrin α6β1 (integrin) 2 is bound to laminin 511 active fragment 1. An example of forming the integrin complex 3 is shown. 3 (B1) and (B2) show examples in which serum S is brought into contact with the complex 3 fixed on the solid phase 10. FIG. 3 (B1) shows that the autoantibody 4 binds to the complex 3 when the serum 3 contains the autoantibody 4 that binds to the complex 3. FIG. 3 (B2) shows the case where the autoantibody 4 binding to the complex 3 is not present in the serum S. FIGS. 3 (C1) and (C2) show that the complex 3 after the contact with the serum S shown in FIGS. 3 (B1) and (B2) binds to the complex 3 to which the autoantibody 4 is not bound, respectively. An example is shown in which a primary antibody 5, which is a first detection antibody, which is capable of binding to the complex 3 to which the autoantibody 4 has bound cannot be bound. FIGS. 3 (D1) and 3 (D2) show HRP (horseradish) binding to the primary antibody 5 to the complex 3 after contact with the primary antibody 5 shown in FIGS. 3 (C1) and (C2), respectively. An example is shown in which a secondary antibody 6 labeled with (peroxidase) 7 is brought into contact. The secondary antibody 6 is contacted, incubated and washed, and the secondary antibody 6 is quantified using the enzyme activity of HRP7 on the solid phase 10 as an index, whereby the primary antibody 5 is quantified. The amount of the primary antibody 5 is inversely proportional to the amount of the autoantibody 4 in the serum S. 図４は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補１（抗ラミニンα５抗体ＭＡＢ１９２４）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 4 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 1 (anti-laminin α5 antibody MAB1924) was used as the primary antibody. 図５は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補２（抗ラミニンα５抗体ａｂ２１０９５７）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 5 shows the results of measurement of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 2 (anti-laminin α5 antibody ab210957) was used as the primary antibody. 図６は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補３（抗ラミニンβ１抗体ａｂ６９６３３）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 6 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 3 (anti-laminin β1 antibody ab 69633) was used as the primary antibody. 図７は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補４（抗ラミニンβ１抗体ａｂ９８２３２）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 7 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 4 (anti-laminin β1 antibody ab98232) was used as the primary antibody. 図８は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補５（抗ラミニンγ１抗体ＬＳ−Ｃ３１２７３７）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 8 shows the measurement results of the secondary antibody when using AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) as samples and using candidate 5 (anti-laminin γ1 antibody LS-C312737) as the primary antibody. Show. 図９は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補６（抗ラミニンγ１抗体ＬＳ−Ｃ３５６１５１）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 9 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 6 (anti-laminin γ1 antibody LS-C356151) was used as the primary antibody. Show. 図１０は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補７（抗インテグリンα６抗体ａｂ１０５６６９）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 10 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 7 (anti-integrin α6 antibody ab105669) was used as the primary antibody. 図１１は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補８（抗インテグリンα６抗体ａｂ１８１５５１）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 11 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 8 (anti-integrin α6 antibody ab181551) was used as the primary antibody. 図１２は、ＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）を試料とし、一次抗体として、候補９（抗インテグリンβ１抗体ａｂ３０３９４）を用いたときの、二次抗体の測定結果を示す。FIG. 12 shows the measurement results of the secondary antibody when AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) were used as samples and candidate 9 (anti-integrin β1 antibody ab30394) was used as the primary antibody.

＜１．ＩｇＧ４関連疾患＞
本発明においてＩｇＧ４関連疾患とは、血清ＩｇＧ４高値とＩｇＧ４陽性形質細胞の組織浸潤または腫瘤形成を特徴とする疾患群であり、具体的には、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、ＩｇＧ４関連腎疾患、ＩｇＧ４関連涙腺唾液腺炎、ＩｇＧ４関連硬化性胆管炎、ＩｇＧ４関連眼疾患、ＩｇＧ４関連動脈周囲炎、ＩｇＧ４関連下垂体炎、ＩｇＧ４関連肺疾患、ＩｇＧ４関連後腹膜線維症が例示できる。本発明が対象とするＩｇＧ４関連疾患は、典型的には、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）である。 <1. IgG4-related disease>
In the present invention, the IgG4-related diseases are a group of diseases characterized by high serum IgG4 levels and tissue infiltration or mass formation of IgG4-positive plasma cells, and specifically, autoimmune pancreatitis (AIP), IgG4-related kidney disease, Examples include IgG4-related lacrimal salivary glanditis, IgG4-related sclerosing cholangitis, IgG4-related eye disease, IgG4-related periarthritis, IgG4-related pituititis, IgG4-related lung disease, and IgG4-related retroperitoneal fibrosis. The IgG4-related disease targeted by the present invention is typically autoimmune pancreatitis (AIP).

＜２．ラミニン−インテグリン複合体＞
ラミニン−インテグリン複合体は、ラミニンとインテグリンとが結合して形成される複合体である。ラミニンは、細胞外マトリクスの基底膜を構成するタンパク質である。インテグリンは細胞表面に存在し、ラミニンと結合するタンパク質である。生体内では細胞外マトリクスの基底膜のラミニンと細胞表面のインテグリンとが結合することで、細胞外マトリクスと細胞との接着に寄与する。 <2. Laminin-integrin complex>
The laminin-integrin complex is a complex formed by binding laminin and integrin. Laminin is a protein that makes up the basement membrane of the extracellular matrix. Integrins are proteins that exist on the cell surface and bind laminin. In vivo, laminin in the basement membrane of the extracellular matrix and integrin on the cell surface combine to contribute to the adhesion between the extracellular matrix and cells.

ラミニンは、天然型では、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなる巨大なヘテロ３量体分子である。α鎖としてα１〜α５、β鎖としてβ１〜β３、γ鎖としてγ１〜γ３が知られており、それらの組み合わせで１２種類以上のアイソフォームが存在する（表１参照）。本発明においてラミニンのアイソフォームは限定されない。すなわち検出しようとする指標抗体と免疫学的に結合する複合体を構成するラミニンは、α１〜α５から選択される１種のα鎖、β１〜β３から選択される１種のβ鎖、γ１〜γ３から選択される１種のγ鎖からなるものであることができ、具体的には、表１に記載の１２種類のいずれか、或いは他のアイソフォームであることができ、好ましくはα鎖がα５、β鎖がβ１、γ鎖がγ１である「ラミニン−５１１」、及び、α鎖がα５、β鎖がβ２、γ鎖がγ１である「ラミニン−５２１」である。 Laminin is, in its natural form, a large heterotrimeric molecule consisting of three subunit chains, an α chain, a β chain and a γ chain. α1 to α5 are known as α chains, β1 to β3 are known as β chains, and γ1 to γ3 are known as γ chains, and there are 12 or more isoforms in combinations thereof (see Table 1). In the present invention, the laminin isoform is not limited. That is, laminin constituting a complex that immunologically binds to the indicator antibody to be detected is one kind of α chain selected from α1 to α5, one kind of β chain selected from β1 to β3, γ1 It can be composed of one kind of γ chain selected from γ3, and specifically, it can be any one of the twelve kinds shown in Table 1 or other isoforms, preferably an α chain Are "laminin-511" in which α5, β chain is β1, and γ chain are γ1, and “laminin-521”, in which α chain is α5, β chain is β2, and γ chain is γ1.

本発明において、検出しようとする指標抗体と免疫学的に結合する複合体を構成するラミニンの起源は特に限定されないが、ＩｇＧ４関連疾患は通常は自己免疫疾患であることから、被検動物と同じ種のラミニンであることが好ましく、特にヒトが好ましい。ヒト等の哺乳動物の種のラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表２に、ヒトを含む主な哺乳類について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。表２に示すアミノ酸配列を有するラミニンの各鎖が、更に翻訳後修飾を受けたものが、ラミニンを形成してもよい。これら以外の各種哺乳動物のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。 In the present invention, the origin of laminin constituting a complex that immunologically binds to the indicator antibody to be detected is not particularly limited. However, since an IgG4-related disease is usually an autoimmune disease, it is the same as a test animal. It is preferably a species of laminin, especially human. The nucleotide sequence information of the gene encoding the α-chain, β-chain, and γ-chain of laminin of mammalian species such as human and amino acid sequence information of each chain can be obtained from a publicly known database (GenBank or the like). Table 2 shows the accession numbers of each chain constituting laminin for major mammals including humans. Laminin chains having the amino acid sequences shown in Table 2 may be further post-translationally modified to form laminin. Base sequence information and amino acid sequence information of laminin constituent chains of various mammals other than these can also be obtained from a publicly known database (GenBank or the like).

本発明においてラミニン、ラミニン−５１１、ラミニン−５２１という各用語は、特に限定しない場合は、α鎖、β鎖及びγ鎖がそれぞれ全長からなる天然型の形態には限定されず、それぞれ、ラミニンの断片、ラミニン−５１１の断片、ラミニン−５２１の断片や、天然型のラミニン、天然型のラミニン−５１１、天然型のラミニン−５２１と等価な形態のものを包含する。従って、検出しようとする指標抗体は、ラミニンの断片を含むラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合するものであってもよい。ラミニンの断片としては、天然型のラミニンの３量体を構成するα鎖、β鎖、γ鎖のうち少なくとも１つが全長よりも短いものが挙げられる。ラミニンの断片は、３量体を形成し、且つ、インテグリン結合活性を有していることがより好ましい。ラミニンの断片が３量体を形成していることは、ラミニンの断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。ラミニンの断片がインテグリン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる。 In the present invention, the terms laminin, laminin-511, and laminin-521 are not limited to natural forms in which the α-chain, β-chain, and γ-chain each have a full length, unless otherwise limited. Fragments, laminin-511 fragments, laminin-521 fragments, natural laminin, natural laminin-511, and forms equivalent to natural laminin-521 are included. Accordingly, the indicator antibody to be detected may be one that immunologically binds to a laminin-integrin complex containing a laminin fragment. Examples of laminin fragments include those in which at least one of the α-chain, β-chain, and γ-chain constituting the trimer of natural laminin is shorter than the full length. More preferably, the laminin fragment forms a trimer and has integrin binding activity. Whether the laminin fragment forms a trimer can be confirmed by subjecting the laminin fragment to SDS-PAGE and detecting the number of bands. The laminin fragment has integrin binding activity can be confirmed by ELISA or the like.

３量体を形成し、且つ、インテグリン結合活性を有するラミニンの断片としては、天然型のラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化して得られる断片が挙げられ、特に好ましくはＥ８フラグメントである。ラミニンのＥ８フラグメントは、α鎖のＣ末端断片から、Ｃ末端の球状（Ｇ）ドメイン４および５が除かれた断片（α鎖Ｅ８）、β鎖のＣ末端断片（β鎖Ｅ８）およびγ鎖のＣ末端断片（γ鎖Ｅ８）が３量体を形成したフラグメントである（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）。ラミニンのＥ８フラグメントは、全長ラミニンを膵エラスターゼにより酵素的に消化して得ることができる。市販のラミニンのＥ８フラグメントとしては、ヒトラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）が例示できる。 The laminin fragment which forms a trimer and has an integrin binding activity includes a fragment obtained by digesting natural laminin with a proteolytic enzyme such as elastase, and particularly preferably an E8 fragment. Laminin E8 fragment is obtained by removing the C-terminal globular (G) domains 4 and 5 from the α-chain C-terminal fragment (α-chain E8), the β-chain C-terminal fragment (β-chain E8), and the γ-chain. Is a fragment in which the C-terminal fragment (γ chain E8) forms a trimer (Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007). The E8 fragment of laminin can be obtained by enzymatically digesting full-length laminin with pancreatic elastase. Examples of commercially available laminin E8 fragments include human laminin-511-E8 (892012, manufactured by Nippi Corporation).

インテグリンは、天然型では、α鎖及びβ鎖の２本のサブユニット鎖からなるヘテロ２量体分子である。α鎖としてα１〜α１１、αＶ、αＸ、αＭ、αＬ、αＤ、αＥ、αＩＩｂ、β鎖としてβ１〜β８が知られており、それらの組み合わせが異なる複数のアイソフォームが存在する。ラミニンのリガンドとなり得るインテグリンのアイソフォームとしては、インテグリンα６β１、インテグリンα３β１、インテグリンα６β４が知られている。本発明においてインテグリンのアイソフォームは限定されないが、好ましくはα鎖がα６、β鎖がβ１である「インテグリンα６β１」である。 Integrin is a heterodimer molecule composed of two subunit chains, α chain and β chain, in its natural form. α1 to α11, αV, αX, αM, αL, αD, αE, αIIb are known as α chains, and β1 to β8 are known as β chains, and there are a plurality of isoforms having different combinations thereof. Integrin α6β1, integrin α3β1, and integrin α6β4 are known as integrin isoforms that can serve as laminin ligands. In the present invention, the integrin isoform is not limited, but is preferably “integrin α6β1” in which the α chain is α6 and the β chain is β1.

本発明において、検出しようとする指標抗体と免疫学的に結合する複合体を構成するインテグリンの起源は特に限定されないが、ＩｇＧ４関連疾患は通常は自己免疫疾患であることから、被検動物と同じ種のインテグリンであることが好ましく、特にヒトが好ましい。ヒト等の哺乳動物の種のインテグリンのα鎖、β鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表３に、ヒトインテグリンを構成する各鎖のアミノ酸配列及び塩基配列のアクセッション番号を示す。ヒトインテグリンのα６鎖及びβ１鎖には、それぞれ、３つのスプライシングバリアントが知られている。表３に示すアミノ酸配列を有するヒトインテグリンのα鎖、β鎖が、更に翻訳後修飾を受けたものが、ヒトインテグリンを形成してもよい。これら以外の各種哺乳動物のインテグリン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。 In the present invention, the origin of the integrin constituting the complex that immunologically binds to the indicator antibody to be detected is not particularly limited. However, since an IgG4-related disease is usually an autoimmune disease, it is the same as the test animal. It is preferably a species integrin, especially human. The nucleotide sequence information of the gene encoding the α-chain and β-chain of the integrin of a mammalian species such as human and the amino acid sequence information of each chain can be obtained from a publicly known database (GenBank or the like). Table 3 shows the amino acid sequence and accession number of the nucleotide sequence of each chain constituting human integrin. Three splicing variants are known for the α6 chain and β1 chain of human integrin, respectively. The human integrin α-chain and β-chain having the amino acid sequence shown in Table 3 may be further post-translationally modified to form human integrin. Base sequence information and amino acid sequence information of integrin constituent chains of various mammals other than these can also be obtained from a publicly known database (GenBank or the like).

本発明においてインテグリン、インテグリンα６β１、インテグリンα３β１という各用語は、特に限定しない場合は、α鎖及びβ鎖がそれぞれ全長からなる形態には限定されず、それぞれ、インテグリンの断片、インテグリンα６β１の断片、インテグリンα３β１の断片や、天然型のインテグリン、天然型のインテグリンα６β１、天然型のインテグリンα３β１と等価な形態のものを包含する。従って、検出しようとする指標抗体は、インテグリンの断片を含むラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合するものであってもよい。インテグリンの断片としては、インテグリンの２量体を構成するα鎖、β鎖のうち少なくとも１つが全長よりも短いものが挙げられる。インテグリンの断片は、２量体を形成していることが好ましく、ラミニン結合活性を有していることがより好ましい。インテグリンの断片が２量体を形成していることは、インテグリンの断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。インテグリンの断片がラミニン結合活性を有していることは、ＥＬＩＳＡ法等により確認することができる。市販のインテグリンとしては、リコンビナントヒトインテグリンα６β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号７８０９−Ａ６）、リコンビナントヒトインテグリンα３β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州、製品番号２８４０−Ａ３）が例示できる。 In the present invention, each of the terms integrin, integrin α6β1, and integrin α3β1 is not limited to a form in which the α chain and the β chain are each composed of a full length, unless otherwise specified. Integrin fragments, integrin α6β1, integrin Includes fragments of α3β1, natural integrin, natural integrin α6β1, and forms equivalent to natural integrin α3β1. Therefore, the indicator antibody to be detected may be one that immunologically binds to a laminin-integrin complex containing an integrin fragment. Examples of integrin fragments include those in which at least one of the α chain and β chain constituting the integrin dimer is shorter than the full length. The integrin fragment preferably forms a dimer, and more preferably has laminin binding activity. The formation of the dimer of the integrin fragment can be confirmed by subjecting the integrin fragment to SDS-PAGE and detecting the number of bands. Whether the integrin fragment has laminin binding activity can be confirmed by ELISA or the like. Examples of commercially available integrins include recombinant human integrin α6β1 (R & D Systems, Minnesota, product number 7809-A6) and recombinant human integrin α3β1 (R & D Systems, Minnesota, product number 2840-A3).

インテグリンの断片としては、市販されているヒトインテグリンα６β１の断片であるＨｕｍａｎＩＴＧＡ６＆ＩＴＧＢ１（中国北京、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、製品番号ＣＴ０１３−Ｈ２５０８Ｈ−２０）が例示できる。 Examples of integrin fragments include Human ITGA6 & ITGB1 (Sino Biological, product number CT013-H2508H-20), which is a commercially available fragment of human integrin α6β1.

ラミニン−インテグリン複合体は、ラミニンとインテグリンとを接触させインキュベートすることで形成することができる。好ましくは、ラミニンとインテグリンのうち一方（好ましくはラミニン）を固相の表面に固定化し、次いで、該固相の表面にラミニンとインテグリンのうち他方（好ましくはインテグリン）を接触させインキュベートすることで、ラミニン−インテグリン複合体を形成することができる。ラミニンとインテグリンとの結合は、適当な緩衝液中で行うことができる。 The laminin-integrin complex can be formed by contacting laminin and integrin and incubating. Preferably, one of laminin and integrin (preferably laminin) is immobilized on the surface of a solid phase, and then the other surface of the solid phase is contacted with the other of laminin and integrin (preferably integrin) and incubated. A laminin-integrin complex can be formed. The binding between laminin and integrin can be performed in a suitable buffer.

＜３．指標抗体＞
本発明では、ＩｇＧ４関連疾患に罹患した動物が特徴的に有する、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する抗体を、ＩｇＧ４関連疾患の指標として間接的に検出する。そこで、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する抗体を「指標抗体」と称する。指標抗体は、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する抗体であればよく、インテグリンとの複合体を形成しない状態のラミニンとも免疫学的に結合する抗ラミニン抗体や、ラミニンとの複合体を形成しない状態のインテグリンとも免疫学的に結合する抗インテグリン抗体や、ラミニン−インテグリン複合体に免疫学的に結合するが、複合体を形成しないラミニン又はインテグリンとは結合しない抗複合体抗体を包含する。例えば、指標抗体は、後述のようにＩｇＧ４関連疾患に罹患した動物の血清などに含まれる。 <3. Indicator antibody>
In the present invention, an antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex, which is characteristic of an animal suffering from an IgG4-related disease, is indirectly detected as an indicator of an IgG4-related disease. Therefore, an antibody that immunologically binds to the laminin-integrin complex is referred to as an “index antibody”. The indicator antibody may be any antibody that immunologically binds to the laminin-integrin complex, and may be an anti-laminin antibody that immunologically binds to laminin that does not form a complex with integrin, or a complex with laminin. Includes anti-integrin antibodies that immunologically bind to integrin that does not form, and anti-complex antibodies that immunologically bind to laminin-integrin complex but do not bind to laminin or integrin that does not form a complex I do. For example, the indicator antibody is contained in the serum of an animal afflicted with an IgG4-related disease as described below.

＜４．検査用抗体＞
既述の通り、ラミニン−インテグリン複合体に結合する前記指標抗体を直接的に検出することは困難である。本発明では、前記指標抗体の結合に伴い状態が変化するラミニン−インテグリン複合体の部位に特異的な検出用抗体の結合の有無を検出することで、ラミニン−インテグリン複合体への前記指標抗体の結合の有無を間接的に検出することに特徴がある。ラミニン−インテグリン複合体の前記部位の状態の変化は、検出用抗体との結合性の変化を生じる前記部位の状態の変化を指し、その具体的な態様は特に限定されないが、例えば、ラミニン−インテグリン複合体への指標抗体の結合に伴う前記部位の立体構造の変化や、前記部位が指標抗体にマスクされることによる前記部位と検出用抗体との結合性の変化などを包含する。 <4. Testing Antibodies>
As described above, it is difficult to directly detect the indicator antibody that binds to the laminin-integrin complex. In the present invention, by detecting the presence or absence of the binding of a specific detection antibody to the site of the laminin-integrin complex whose state changes with the binding of the indicator antibody, the indicator antibody is bound to the laminin-integrin complex. It is characterized in that the presence or absence of binding is indirectly detected. A change in the state of the site of the laminin-integrin complex refers to a change in the state of the site that causes a change in binding to the detection antibody, and the specific embodiment thereof is not particularly limited. Changes in the three-dimensional structure of the site due to the binding of the indicator antibody to the complex, changes in the binding between the site and the detection antibody due to the masking of the site by the indicator antibody, and the like are included.

本発明で用いる検出用抗体は、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体を指す。これらの検出用抗体は、ラミニン−インテグリン複合体において、前記指標抗体の結合の前後で状態が変化する領域をエピトープとして認識する。第１の検出用抗体は、前記指標抗体が結合していない状態でのラミニン−インテグリン複合体の前記領域に特異的に結合する抗体である。第２の検出用抗体は、前記指標抗体が結合している状態でのラミニン−インテグリン複合体の前記領域に特異的に結合する抗体である。検出用抗体としては、第１の検出用抗体が特に好ましい。 The detection antibody used in the present invention immunologically binds to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody is not bound, but immunologically binds to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody is bound. A laminin-integrin complex which does not bind to the first detection antibody or the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but which does not bind to the indicator antibody, Refers to a second detection antibody that binds immunologically. These detection antibodies recognize, as an epitope, a region in the laminin-integrin complex where the state changes before and after the binding of the indicator antibody. The first detection antibody is an antibody that specifically binds to the region of the laminin-integrin complex in a state where the indicator antibody is not bound. The second detection antibody is an antibody that specifically binds to the region of the laminin-integrin complex in a state where the indicator antibody is bound. As the detection antibody, the first detection antibody is particularly preferred.

検出用抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体等であってよい。 The class of the detection antibody is not particularly limited, and may be an IgG antibody, an IgA antibody, an IgM antibody, or the like.

検出用抗体が認識するエピトープは、ラミニン−インテグリン複合体において、前記指標抗体の結合の前後で状態が変化する領域に含まれるものであれば特に限定されない。例えば、ラミニン−インテグリン複合体を構成するインテグリンがインテグリンα６β１である場合には、インテグリンα６鎖のβプロペラドメインに含まれる領域をエピトープとして認識する検出用抗体が好適である。インテグリンα６鎖が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する場合には、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１位〜第１００位の範囲内にβプロペラドメインが存在するため、前記範囲内に含まれる領域をエピトープとして認識する検出用抗体が好適である。このような検出用抗体の具体例としては、インテグリンα６鎖のアミノ酸配列の第１位〜第１００位の領域をエピトープとして認識する抗体である、ａｂｃａｍ社製Ａｎｔｉ−Ｉｎｔｅｇｒｉｎａｌｐｈａ６ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ１８１２４］（ａｂ１８１５５１）が特に好ましい。 The epitope recognized by the detection antibody is not particularly limited as long as it is included in a region of the laminin-integrin complex where the state changes before and after the binding of the indicator antibody. For example, when the integrin constituting the laminin-integrin complex is integrin α6β1, a detection antibody that recognizes, as an epitope, a region contained in the β-propeller domain of the integrin α6 chain is preferable. When the integrin α6 chain has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the β-propeller domain exists within the range of positions 1 to 100 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A detection antibody that recognizes the included region as an epitope is preferable. As a specific example of such an antibody for detection, an antibody recognizing as an epitope the region from position 1 to position 100 of the amino acid sequence of the integrin α6 chain, Anti-Integrin alpha 6 antibody [EPR18124] manufactured by abcam Inc. ab181551) is particularly preferred.

＜５．ＩｇＧ４関連疾患の検査方法＞
本発明は第一に、
ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法に関する。 <5. Test Method for IgG4-Related Disease>
The present invention firstly
A method for testing an IgG4-related disease,
An indirect detection step of indirectly detecting, as an indicator of an IgG4-related disease, an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
And detecting the antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

本発明の検査方法は、ラミニン−インテグリン複合体に結合した指標抗体を直接的に検出するのではなく、指標抗体の結合の有無に応じてラミニン−インテグリン複合体との結合性が変化する検出用抗体を、検体との接触後のラミニン−インテグリン複合体と接触させて、結合した検出用抗体を検出することで、ラミニン−インテグリン複合体に結合した指標抗体を間接的に検出することに特徴がある。この方法によれば、ＩｇＧ４関連疾患を高い精度で検査することができる。 The test method of the present invention is not for directly detecting the indicator antibody bound to the laminin-integrin complex, but for detecting the change in the binding to the laminin-integrin complex depending on the presence or absence of the binding of the indicator antibody. The antibody is contacted with the laminin-integrin complex after contact with the sample, and the bound detection antibody is detected, whereby the indicator antibody bound to the laminin-integrin complex is indirectly detected. is there. According to this method, an IgG4-related disease can be tested with high accuracy.

本発明の検査方法が対象とする被検動物は特に限定されずヒトであってもよいし、他の非ヒト哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒトである。 The test animal targeted by the test method of the present invention is not particularly limited, and may be a human or another non-human mammal, but is preferably a human.

本発明の検査方法に用いる検体としては、被検動物から採取される体液が挙げられる。具体的には、血清、血漿、全血等の血液試料のほか、唾液、髄液、尿などの血液以外の体液試料であってもよい。また、体液に限らず、被検動物から採取される組織の破砕液又は抽出液、例えば、検査しようとするＩｇＧ４関連疾患の疾患部位（例えば膵臓、腎臓、唾液腺等）から採取される組織の破砕液又は抽出液も、検体として用いることができる。検体は、被検動物から分離された形態で本発明の検査方法に用いる。 Samples used in the test method of the present invention include body fluids collected from test animals. Specifically, in addition to blood samples such as serum, plasma and whole blood, body fluid samples other than blood such as saliva, cerebrospinal fluid and urine may be used. Not only body fluids, but also crushed liquids or extracts of tissues collected from test animals, for example, crushed tissues collected from disease sites of an IgG4-related disease to be tested (eg, pancreas, kidney, salivary gland, etc.) Liquids or extracts can also be used as specimens. The sample is used in the test method of the present invention in a form separated from the test animal.

間接検出工程では、ラミニン−インテグリン複合体として、固相に固定されたものを用いることが好ましい。固相の形態としては、プレート、ビーズ、チューブなどの任意の形態であってよい。固相に固定された前記複合体は、既述の通り、ラミニンとインテグリンのうち一方（好ましくはラミニン）を固相の表面に固定化し、次いで、該固相の表面にラミニンとインテグリンのうち他方（好ましくはインテグリン）を接触させインキュベートすることで形成することができる。図３（Ａ）は、固相１０上にヒトラミニン−５１１−Ｅ８（ラミニン５１１活性断片）１を固定し、更に、このラミニン５１１活性断片１にヒトインテグリンα６β１（インテグリン）２を結合させてラミニン−インテグリン複合体３を形成した例の模式図である。 In the indirect detection step, it is preferable to use a laminin-integrin complex immobilized on a solid phase. The form of the solid phase may be any form such as a plate, a bead, or a tube. As described above, the complex immobilized on the solid phase immobilizes one of laminin and integrin (preferably laminin) on the surface of the solid phase, and then immobilizes the other of laminin and integrin on the surface of the solid phase. (Preferably an integrin) can be formed by contacting and incubating. FIG. 3 (A) shows that human laminin-511-E8 (laminin 511 active fragment) 1 is immobilized on solid phase 10, and human integrin α6β1 (integrin) 2 is bound to laminin 511 active fragment 1. It is a schematic diagram of an example in which an integrin complex 3 was formed.

間接検出工程の第１工程は、ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる工程である。第１工程は、検体中に指標抗体が存在する場合に、指標抗体が前記複合体に免疫学的に結合できる条件で行う。第１工程は適当な緩衝液中で行うことができる。第１工程の好ましい実施形態は、検体を緩衝液で希釈した希釈液を、ラミニン−インテグリン複合体と接触させ、一定時間インキュベートすることを含む。図３（Ｂ１）及び（Ｂ２）は、固相１０に固定されたラミニン−インテグリン複合体３に、希釈された血清Ｓ（検体）を接触させる例を示す。図３（Ｂ１）は、血清Ｓ中にラミニン−インテグリン複合体３に結合する自己抗体４（指標抗体）が存在する場合に、自己抗体４がラミニン−インテグリン複合体３に結合することを示す。図３（Ｂ２）は、血清Ｓ中に複合体３に結合する自己抗体４が存在しない場合を示す。 The first step of the indirect detection step is a step of bringing the specimen into contact with the laminin-integrin complex. The first step is performed under conditions where, when the indicator antibody is present in the sample, the indicator antibody can immunologically bind to the complex. The first step can be performed in a suitable buffer. A preferred embodiment of the first step involves contacting a diluent of the analyte with a buffer with the laminin-integrin complex and incubating for a period of time. 3 (B1) and (B2) show an example in which the diluted serum S (sample) is brought into contact with the laminin-integrin complex 3 immobilized on the solid phase 10. FIG. 3 (B1) shows that when the autoantibody 4 (indicator antibody) that binds to the laminin-integrin complex 3 is present in the serum S, the autoantibody 4 binds to the laminin-integrin complex 3. FIG. 3 (B2) shows the case where the autoantibody 4 binding to the complex 3 is not present in the serum S.

第１工程終了後に、ラミニン−インテグリン複合体を洗浄して、残存する検体を除去することが好ましい。 After completion of the first step, it is preferable to wash the laminin-integrin complex to remove the remaining specimen.

間接検出工程の第２工程は、第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、検出用抗体とを接触させる工程である。第２工程は、ラミニン−インテグリン複合体と検出用抗体とが免疫学的に結合できる条件で行う。第２工程もまた適当な緩衝液中で行うことができる。第２工程の好ましい実施形態は、検出用抗体を含む緩衝液を、第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と接触させ、一定時間インキュベートすることを含む。図３（Ｃ１）及び（Ｃ２）は、それぞれ、図３（Ｂ１）及び（Ｂ２）に示した第１工程後のラミニン−インテグリン複合体３に、自己抗体４（指標抗体）が結合していないラミニン−インテグリン複合体３とは免疫学的に結合することができ、且つ、自己抗体４が結合した複合体３とは免疫学的に結合することができない第１の検出用抗体である一次抗体５を接触させた例を示す。 The second step of the indirect detection step is a step of bringing the laminin-integrin complex after the first step into contact with the detection antibody. The second step is performed under conditions that allow the laminin-integrin complex and the detection antibody to bind immunologically. The second step can also be performed in a suitable buffer. A preferred embodiment of the second step comprises contacting the buffer containing the antibody for detection with the laminin-integrin complex after the first step and incubating for a certain time. 3 (C1) and (C2) show that the autoantibody 4 (indicator antibody) is not bound to the laminin-integrin complex 3 after the first step shown in FIGS. 3 (B1) and (B2), respectively. A primary antibody that is a first detection antibody that can immunologically bind to laminin-integrin complex 3 and cannot immunologically bind to complex 3 to which autoantibody 4 has bound 5 shows an example in which 5 is brought into contact.

第２工程終了後に、ラミニン−インテグリン複合体を洗浄して、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合しなかった残存する検出用抗体を除去することが好ましい。 After the completion of the second step, it is preferable to wash the laminin-integrin complex to remove the remaining detection antibody that has not immunologically bound to the laminin-integrin complex.

間接検出工程の第３工程は、第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した検出用抗体を検出する工程である。第３工程において「検出」とは、ラミニン−インテグリン複合体に結合した検出用抗体が存在するか否かを確認することのほか、その量を測定すること、すなわち「定量」すること、も包含する概念である。 The third step of the indirect detection step is a step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step. In the third step, “detection” includes not only confirming whether or not the detection antibody bound to the laminin-integrin complex exists, but also measuring the amount thereof, that is, “quantifying”. It is a concept to do.

第３工程は、ラミニン−インテグリン複合体に結合した検出用抗体を定量的又は定性的に検出可能な方法であればよく、具体的な態様は特に限定されない。例えば、検出用抗体に免疫学的に結合することができる、標識された二次抗体を、第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に接触させインキュベートし、洗浄して、ラミニン−インテグリン複合体上の検出用抗体に結合した二次抗体を、標識を指標に検出することで、検出用抗体を検出することが可能である。標識には、酵素、発色物質等の標識物質を用いることができる。標識された二次抗体を用いる実施形態では、検出用抗体と免疫学的に結合する二次抗体の量は、標識の測定値として求めることができる。図３（Ｄ１）及び図３（Ｄ２）は、それぞれ、図３（Ｃ１）及び（Ｃ２）に示した一次抗体５（検出用抗体）と接触後のラミニン−インテグリン複合体３に、一次抗体５と免疫学的に結合する、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）７で標識した二次抗体６を接触させた例を示す。二次抗体６を接触させ、インキュベートし、洗浄した後の固相１０上のＨＲＰ７による酵素反応を指標として二次抗体６の定量を行うことで、一次抗体５が定量される。一次抗体５の量は、血清Ｓ中の、自己抗体４の量に反比例するため、自己抗体４の量を検出することができる。 The third step may be any method capable of quantitatively or qualitatively detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex, and specific embodiments are not particularly limited. For example, a labeled secondary antibody that is capable of immunologically binding to the detection antibody is contacted with the laminin-integrin complex after the second step, incubated, washed, and placed on the laminin-integrin complex. The detection antibody can be detected by detecting the secondary antibody bound to the detection antibody using the label as an index. A labeling substance such as an enzyme or a coloring substance can be used for labeling. In an embodiment using a labeled secondary antibody, the amount of the secondary antibody that immunologically binds to the detection antibody can be determined as a measurement of the label. FIGS. 3 (D1) and 3 (D2) show the laminin-integrin complex 3 after contact with the primary antibody 5 (detection antibody) shown in FIGS. 3 (C1) and (C2), respectively. An example is shown in which a secondary antibody 6 labeled with HRP (horseradish peroxidase) 7 is immunologically bound to HRP. The primary antibody 5 is quantified by quantifying the secondary antibody 6 using the enzyme reaction by HRP7 on the solid phase 10 after contacting, incubating and washing the secondary antibody 6 as an index. Since the amount of the primary antibody 5 is inversely proportional to the amount of the autoantibody 4 in the serum S, the amount of the autoantibody 4 can be detected.

ラミニン−インテグリン複合体に結合した検出用抗体を定量的又は定性的に検出する方法は、上記で説明した二次抗体を用いる方法には限定されず、他の方法を用いることもできる。例えば、第２工程で、標識物質で標識された検出用抗体を用い、第３工程で、標識を指標にして検出用抗体を直接検出することができる。標識としては酵素、発色物質等の標識物質を用いることができる。 The method for quantitatively or qualitatively detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex is not limited to the method using the secondary antibody described above, and other methods can be used. For example, in the second step, a detection antibody labeled with a labeling substance is used, and in the third step, the detection antibody can be directly detected using the label as an index. As the label, a labeling substance such as an enzyme or a coloring substance can be used.

検体中に、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体が存在するか否かの判定（陽性／陰性の判定）は、被検動物個体（例えば、ＩｇＧ４関連疾患の罹患が疑われるヒト）から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値を、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない動物個体（例えば健常者）から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値と比較することによって行うことができる。ここで、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない個体から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値は、同時に測定して得た値であってもよいし、予め測定して得た値であってもよい。検出用抗体として第１の検出用抗体を用いる実施形態では、被検動物個体から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値が、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない動物個体から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値よりも有意に小さい場合に、陽性と判断することができる。検出用抗体として第２の検出用抗体を用いる実施形態では、被検動物個体から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値が、ＩｇＧ４関連疾患を罹患していない動物個体から得た検体を試料とした場合の第３工程での測定値よりも有意に大きい場合に、陽性と判断することができる。 The determination of whether or not an indicator antibody that immunologically binds to the laminin-integrin complex is present in the sample (positive / negative determination) is based on the test animal individual (for example, suspected of having an IgG4-related disease) The measured value in the third step when a sample obtained from a human) was used as a sample was determined in the third step when a sample obtained from an animal individual not suffering from an IgG4-related disease (eg, a healthy subject) was used as a sample. By comparing with the measured values of Here, in the case where a sample obtained from an individual not suffering from an IgG4-related disease is used as a sample, the measured value in the third step may be a value obtained by measuring at the same time, or a value obtained by measuring in advance. Value may be used. In the embodiment using the first detection antibody as the detection antibody, the measured value in the third step when a sample obtained from the test animal individual is used as a sample is determined from an animal individual not suffering from an IgG4-related disease. When the obtained sample is used as a sample, if it is significantly smaller than the measured value in the third step, it can be determined to be positive. In the embodiment in which the second detection antibody is used as the detection antibody, the measured value in the third step when a sample obtained from the test animal individual is used as a sample is determined from an animal individual not suffering from an IgG4-related disease. If the obtained sample is significantly larger than the measured value in the third step when used as a sample, it can be determined to be positive.

本発明のＩｇＧ４関連疾患の検査方法の、検体中に、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体が検出された場合、検出結果に基づき、検体が由来する被験動物が、ＩｇＧ４関連疾患、特にＡＩＰに罹患していると判断することができる。 When an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex is detected in a sample of the method for testing an IgG4-related disease of the present invention, a test animal from which the sample is derived is identified based on the detection result. It can be determined that the subject suffers from a disease, particularly AIP.

＜６．ＩｇＧ４関連疾患の検査キット＞
本発明は第二に、
ラミニン及びインテグリンとの組み合わせ、或いは、ラミニン−インテグリン複合体と、
ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体と
を含む、ＩｇＧ４関連疾患の検査キット
に関する。 <6. Test Kit for IgG4-Related Disease>
The present invention secondly
A combination with laminin and an integrin, or a laminin-integrin complex,
The laminin-integrin complex binds immunologically to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody that binds immunologically does not bind, while the laminin-integrin complex to which the indicator antibody binds immunologically binds. Laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the first detection antibody that does not bind chemically or the laminin-integrin complex that does not bind to the indicator antibody, but binds to the indicator antibody And a detection antibody that is an immunologically binding second detection antibody.

ここで、ＩｇＧ４関連疾患、ラミニン、インテグリン、ラミニン−インテグリン複合体、検出用抗体については既述の通りである。 Here, the IgG4-related disease, laminin, integrin, laminin-integrin complex, and antibody for detection are as described above.

本発明の検査キットは、上記の本発明の検査方法に使用することができる。
本発明の検査キットの１以上の実施形態は、免疫学的測定に必要な試薬類、例えば、緩衝液、ブロッキング液、洗浄液、検体希釈液、基質液等を必要に応じて含んでよい。 The test kit of the present invention can be used for the above-described test method of the present invention.
One or more embodiments of the test kit of the present invention may optionally include reagents necessary for immunological measurement, for example, a buffer, a blocking solution, a washing solution, a sample diluent, a substrate solution, and the like.

本発明の検査キットにおいて、ラミニン及びインテグリンとの組み合わせ、或いは、ラミニン−インテグリン複合体の形態は特に限定されず、溶液状態であってもよいし、乾燥状態であってもよいし、固相に固定された形態であってもよい。乾燥状態である場合、使用前に溶液状態にするための緩衝液や溶媒を本発明の検査キットに含めてもよい。 In the test kit of the present invention, the combination of laminin and integrin, or the form of the laminin-integrin complex is not particularly limited, and may be a solution state, a dry state, or a solid phase. It may be in a fixed form. When it is in a dry state, a buffer or a solvent for preparing a solution before use may be included in the test kit of the present invention.

本発明の検査キットの１以上の実施形態では、ラミニン及びインテグリンのうち一方、或いは、ラミニン−インテグリン複合体を、固相に固定された形態で含む。固相の形態としては、プレート、ビーズ、チューブなどの任意の形態であってよい。 In one or more embodiments of the test kit of the present invention, one of laminin and integrin, or a laminin-integrin complex, is contained in a form immobilized on a solid phase. The form of the solid phase may be any form such as a plate, a bead, or a tube.

本発明の検査キットの１以上の実施形態では、検出用抗体と免疫学的に結合する、標識された二次抗体を更に含む。本実施形態では更に、標識された二次抗体を検出するための試薬（酵素により標識された二次抗体を検出するための基質等）を必要に応じて含むことができる。 In one or more embodiments of the test kit of the present invention, the test kit further includes a labeled secondary antibody that immunologically binds to the detection antibody. In the present embodiment, a reagent for detecting a labeled secondary antibody (a substrate for detecting a secondary antibody labeled with an enzyme, etc.) can be further included as necessary.

＜７．ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法＞
本発明は第三に、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法に関する。 <7. Method for evaluating the effect of treatment on IgG4-related disease>
Third, the present invention
A method for evaluating the effect of a treatment on an IgG4-related disease, comprising:
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample obtained from a test animal that has been treated for an IgG4-related disease,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
And detecting the antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

上記の「ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法」は、「ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価するための指標を取得する方法」と表現してもよい。 The above “method of evaluating the effect of treatment on an IgG4-related disease” may be expressed as “method of obtaining an index for evaluating the effect of treatment on an IgG4-related disease”.

本発明の検査方法に関して既述の通り、検体中の指標抗体の存在は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として有用である。このため、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の指標抗体は、治療が有効で治癒している場合は低下し、治療が十分に効果を発揮していない場合は治療開始前から変化しない又は上昇する。そこで、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の指標抗体を検出することで、治療の効果を評価することが可能となる。 As described above with respect to the test method of the present invention, the presence of the indicator antibody in the sample is useful as an indicator of an IgG4-related disease. Therefore, the index antibody in a sample obtained from a test animal treated for an IgG4-related disease decreases when the treatment is effective and is cured, and when the treatment is not sufficiently effective, Does not change or rises before the start of treatment. Thus, by detecting an indicator antibody in a sample obtained from a test animal treated for an IgG4-related disease, the effect of the treatment can be evaluated.

被検動物としては、ＩｇＧ４関連疾患の治療を受けたヒトや非ヒト動物が例示できる。
ＩｇＧ４関連疾患の治療としては、ステロイド投与等の、ＩｇＧ４関連疾患の治療が挙げられる。 Examples of test animals include humans and non-human animals that have been treated for an IgG4-related disease.
Examples of the treatment of an IgG4-related disease include treatment of an IgG4-related disease such as steroid administration.

本発明の治療効果の評価方法における、検体、ラミニン、インテグリン、ラミニン−インテグリン複合体、検出用抗体、間接検出工程などの具体的態様は既述の通りである。 Specific embodiments of the specimen, laminin, integrin, laminin-integrin complex, detection antibody, indirect detection step, and the like in the method for evaluating the therapeutic effect of the present invention are as described above.

本発明の治療効果の評価方法における間接検出工程で得た、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の指標抗体の定量結果を、例えば、前記治療を開始する前の同一動物個体から得た検体中の指標抗体の定量結果と比較して、前者が後者よりも小さい場合には、治療が有効であると評価することができる。一方、前者が後者と同程度或いは後者よりも大きい場合には、治療が有効でない又は十分でないと評価することができる。この評価結果に基づいて、治療を更に継続する、治療方針を変更する、治療を中止するなどの判断が可能である。 The quantitative result of the indicator antibody in the sample obtained from the test animal treated with the IgG4-related disease obtained in the indirect detection step in the method for evaluating the therapeutic effect of the present invention is, for example, the value before starting the treatment. If the former is smaller than the latter, as compared to the result of quantification of the indicator antibody in the specimen obtained from the same animal individual, it can be evaluated that the treatment is effective. On the other hand, when the former is about the same as or larger than the latter, it can be evaluated that the treatment is not effective or not sufficient. Based on this evaluation result, it is possible to make a decision such as continuing treatment, changing the treatment policy, or stopping treatment.

また、本発明の治療効果の評価方法における間接検出工程で得た、ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の指標抗体の定量結果を、例えば、同一動物種の健常個体から得た検体中の指標抗体の定量結果と比較して、前者が後者と同程度である又はより小さい場合には、治療が有効であると評価することができる。一方、前者が後者よりも大きい場合には、治療が有効でない又は十分でないと評価することができる。この評価結果に基づいて、治療を更に継続する、治療方針を変更する、治療を中止するなどの判断が可能である。 In addition, the results of the quantification of the indicator antibody in a sample obtained from a test animal treated with an IgG4-related disease obtained in the indirect detection step in the method for evaluating a therapeutic effect of the present invention may be, for example, a healthy animal of the same animal species. When the former is comparable to or smaller than the latter in comparison with the result of quantification of the indicator antibody in a sample obtained from an individual, it can be evaluated that the treatment is effective. On the other hand, if the former is greater than the latter, it can be assessed that the treatment is not effective or not sufficient. Based on this evaluation result, it is possible to make a decision such as continuing treatment, changing the treatment policy, or stopping treatment.

＜８．ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法＞
本発明は第四に、
ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記指標抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法に関する。 <8. Method for Screening Candidate Drugs for Treatment of IgG4-Related Disease>
Fourth, the present invention
A method for screening a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease, comprising:
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a specimen obtained from an animal on which a test substance has been acted on,
A step of selecting the test substance as a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease, when the indicator antibody in the sample is reduced by allowing the test substance to act,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
And detecting the antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

既述の通り、検体中の指標抗体は、ＩｇＧ４関連疾患の指標として有用である。このため、試験物質を作用させたことにより前記検体中の指標抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することが可能となる。 As described above, the indicator antibody in the sample is useful as an indicator of an IgG4-related disease. Therefore, when the indicator antibody in the sample decreases due to the action of the test substance, the test substance can be selected as a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease.

本発明のスクリーニング方法における、検体、ラミニン、インテグリン、ラミニン−インテグリン複合体、検出用抗体、間接検出工程などの具体的態様は既述の通りである。 Specific aspects of the screening method of the present invention, such as the specimen, laminin, integrin, laminin-integrin complex, detection antibody, and indirect detection step, are as described above.

本発明のスクリーニング方法において、試験物質としては、新規医薬の候補となる可能性のある試験物質であり特に限定されない。試験物質を作用させる動物は、典型的には、ＩｇＧ４関連疾患の非ヒトモデル動物等の、健常個体と比較して、ラミニンと免疫学的に結合する抗体の検体中での量が大きい動物である。 In the screening method of the present invention, the test substance is a test substance that may be a candidate for a novel drug, and is not particularly limited. The animal on which the test substance is allowed to act is typically an animal such as a non-human model animal of an IgG4-related disease, in which the amount of an antibody that immunologically binds to laminin in a specimen is larger than that in a healthy individual. is there.

本発明のスクリーニング方法における選抜工程では、間接検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の指標抗体の定量結果を、例えば、前記試験物質を作用させる前の同一動物個体から得た検体中の指標抗体の定量結果と比較して、前者が後者よりも小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の指標抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。 In the selection step in the screening method of the present invention, the quantitative result of the indicator antibody in the sample obtained from the animal to which the test substance has acted, obtained in the indirect detection step, is, for example, the same animal individual before the test substance is acted. Compared with the quantification result of the indicator antibody in the sample obtained from the, if the former is smaller than the latter, it is determined that the indicator antibody in the sample was reduced by the action of the test substance, the test The substance can be selected as a candidate substance for a therapeutic agent for an IgG4-related disease.

また、本発明のスクリーニング方法における選抜工程では、間接検出工程で得た、試験物質を作用させた動物から得た検体中の指標抗体の定量結果を、例えば、同一動物種の健常個体から得た検体中の指標抗体の定量結果と比較して、前者が後者と同程度である又はより小さい場合には、前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の指標抗体が減少したと判断し、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜することができる。 Further, in the selection step in the screening method of the present invention, the quantitative result of the indicator antibody in the sample obtained from the animal on which the test substance was obtained, obtained in the indirect detection step, for example, obtained from a healthy individual of the same animal species Compared with the result of quantification of the indicator antibody in the sample, if the former is about the same as or smaller than the latter, it is determined that the indicator antibody in the sample has decreased by allowing the test substance to act, The test substance can be selected as a candidate substance for a therapeutic agent for an IgG4-related disease.

以下の実験は全て室温条件で行った。 The following experiments were all performed at room temperature.

１．血清試料
自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）と診断された２４名の患者から取得した血清を、ＡＩＰ患者血清とした。 1. Serum samples Serum obtained from 24 patients diagnosed with autoimmune pancreatitis (AIP) was defined as AIP patient serum.

一方、健常人、ＡＩＰ以外の自己免疫疾患の患者及び悪性腫瘍患者の計２０名から取得した血清を、対照血清とした。 On the other hand, sera obtained from a total of 20 healthy persons, patients with autoimmune diseases other than AIP, and patients with malignant tumors were used as control sera.

２．血清ＩｇＧ４値の測定
常法に従い、上記のＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）のＩｇＧ４値（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。 2. Measurement of serum IgG4 value The IgG4 value (mg / dl) of the above-mentioned AIP patient serum (24 cases) and control serum (20 cases) was measured according to a conventional method.

結果を図１に示す。カットオフ値は、ＩｇＧ４関連疾患の診断でカットオフ値として一般的に使用されている１３５ｍｇ／ｄＬである。 The results are shown in FIG. The cutoff value is 135 mg / dL, which is generally used as a cutoff value in the diagnosis of an IgG4-related disease.

２４例のＡＩＰ患者血清のうち、２０例がＩｇＧ４高値であり、４例がＩｇＧ４低値であった。 Of the 24 AIP patient sera, 20 had high IgG4 and 4 had low IgG4.

２０例の対照血清のうち、５例がＩｇＧ４高値であり、１５例がＩｇＧ４低値であった。 Of the 20 control sera, 5 had high IgG4 and 15 had low IgG4.

このように、ＡＩＰ患者血清と非ＡＩＰ患者血清は、血清ＩｇＧ４値のみを指標とする判別方法では、正確に判別することができない場合がある。 As described above, it is sometimes impossible to accurately distinguish between AIP patient serum and non-AIP patient serum by the discrimination method using only serum IgG4 value as an index.

３．血清中の抗ラミニン抗体
本発明者らの特許文献３（国際公開ＷＯ２０１８／０１６６０７）に記載の方法により、上記のＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）中の抗ラミニン抗体を定量した。 3. Anti-laminin antibody in serum Quantification of anti-laminin antibody in the serum of AIP patients (24 cases) and the control serum (20 cases) by the method described in Patent Document 3 (International Publication WO2018 / 016607) of the present inventors. did.

具体的な手順は特許文献３の実験４に記載の通りであるが、その概要は次の通りである。 The specific procedure is as described in Experiment 4 of Patent Document 3, and the outline is as follows.

測定はＥＬＩＳＡＳｔａｒｔｅｒＡｃｃｅｓｓｏｒｙＫｉｔ（Ｅ１０１，ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。前記キットのマイクロウェルプレートのウェルに、抗原としてヒトラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）（ラミニン−５１１活性断片）を固定した。次いで、前記ウェルに、上記のＡＩＰ患者血清（２４例）及び対照血清（２０例）の希釈液を加えてインキュベートした。次いで、前記ウェルに、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲートされた二次抗体（ａｂｃａｍ６７５９，ウサギ抗ヒトＩｇＧＨ＆Ｌ（ＨＲＰ），ポリクローナル）の希釈液を加えてインキュベートした。最後に、前記ウェルに、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加えてインキュベートし、ＨＲＰによるＴＭＢの酸化反応を行い、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの波長にて、前記酸化反応の生成物による呈色を測定した。 The measurement was performed using ELISA Starter Accessory Kit (E101, Bethyl Laboratories). Human laminin-511-E8 (892012, manufactured by Nippi Corporation) (laminin-511 active fragment) was immobilized as an antigen in the wells of the microwell plate of the kit. Subsequently, the above-mentioned diluted solution of the serum of the AIP patient (24 cases) and the control serum (20 cases) was added to the wells and incubated. Next, a diluted solution of a secondary antibody (abcam6759, rabbit anti-human IgG H & L (HRP), polyclonal) conjugated with HRP (horseradish peroxidase) was added to the wells and incubated. Finally, a TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) solution is added to the wells and incubated, and an oxidation reaction of TMB by HRP is performed. The wavelength is 450 nm using a microplate reader. The coloration due to the products of the oxidation reaction was measured.

結果を図２に示す。図２において縦軸は、抗体の血清中濃度に比例する４５０ｎｍでの吸光度の相対値を示す。カットオフ値は、本発明者らによる論文（Ｓｈｉｏｋａｗａｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１０，ｅｅａｑ０９９７（２０１８））に記載の、対照血清１２２例での吸光度の測定値の平均値に標準偏差（ＳＤ）の２倍の値を加えた値である。 The results are shown in FIG. In FIG. 2, the vertical axis indicates the relative value of the absorbance at 450 nm, which is proportional to the serum concentration of the antibody. The cut-off value is a standard deviation from the average value of the measured absorbance of 122 control sera described in a paper by the present inventors (Shiokawa et al., Sci. Transl. Med. 10, eeq0997 (2018)). This is a value obtained by adding twice the value of (SD).

２４例のＡＩＰ患者血清のうち、ヒトラミニン５１１活性断片に対する抗体の陽性が１４例、陰性が１０例であった。 Out of 24 cases of AIP patient sera, 14 cases were positive for antibodies to human laminin 511 active fragment and 10 cases were negative for antibodies.

２０例の対照血清のうち、ヒトラミニン５１１活性断片に対する抗体の陽性が６例、陰性が１４例であった。 Out of the 20 control sera, 6 cases were positive for the antibody to the human laminin 511 active fragment and 14 cases were negative for the antibody.

このように、ＡＩＰ患者血清と非ＡＩＰ患者血清は、ヒトラミニン５１１活性断片に対する抗体のみを指標とする判別方法では、正確に判別することができない場合がある。 As described above, there are cases where AIP patient serum and non-AIP patient serum cannot be accurately distinguished by a discriminating method using only an antibody against the human laminin 511 active fragment as an index.

４．新規判別方法の検討
本実験の概要を図３に示す模式図を参照して説明する。 4. Examination of New Discrimination Method The outline of this experiment will be described with reference to the schematic diagram shown in FIG.

図３（Ａ）に示すように、固相１０上にヒトラミニン−５１１−Ｅ８（ラミニン５１１活性断片）１を固定し、更に、このラミニン５１１活性断片１にヒトインテグリンα６β１（インテグリン）２を結合させて複合体３を形成する。 As shown in FIG. 3 (A), human laminin-511-E8 (laminin 511 active fragment) 1 is immobilized on the solid phase 10, and human integrin α6β1 (integrin) 2 is further bound to the laminin 511 active fragment 1. To form a complex 3.

固相１０に固定された前記複合体３に血清Ｓを接触させる。図３（Ｂ１）に示すように、血清Ｓ中に前記複合体３に結合する「指標抗体」である自己抗体４（ヒトラミニン−５１１−Ｅ８、ヒトインテグリンα６β１、或いは、前記複合体に対する自己抗体）が存在する場合、前記自己抗体４は前記複合体３に結合する。図３（Ｂ２）は、血清Ｓ中に前記複合体３に結合する自己抗体４が存在しない場合を示す。次いで、自己抗体４が結合していない複合体３と結合することができ、且つ、自己抗体４が結合した複合体３とは結合することができない「第１の検出用抗体」である一次抗体５を固相１０上に添加しインキュベートする（図３（Ｃ１）、図３（Ｃ２）参照）。一次抗体５のインキュベート後に固相１０を洗浄し、更に、一次抗体５と結合する、ＨＲＰ７とコンジュゲートした二次抗体６を添加しインキュベートする（図３（Ｄ１）、図３（Ｄ２）参照）。二次抗体６のインキュベート後に固相１０を洗浄する。最後に、固相１０上のＨＲＰ７による酵素反応を指標として二次抗体６の定量を行う。この実験では、図３（Ｂ１）に示すように、血清Ｓ中に前記複合体３に結合する自己抗体４（指標抗体）が存在する場合は、一次抗体５（第１の検出用抗体）は前記複合体３に結合することができず（図３（Ｃ１））、二次抗体６が固相１０に結合できない（図３（Ｄ１））ため、二次抗体６が検出されない。一方、図３（Ｂ２）に示すように、血清Ｓ中に前記複合体３に結合する自己抗体４（指標抗体）が存在しない場合は、一次抗体５（第１の検出用抗体）は前記複合体３に結合することができ（図３（Ｃ２））、二次抗体６が固相１０に結合できる（図３（Ｄ２））ため、二次抗体６が検出される。 The serum 3 is brought into contact with the complex 3 immobilized on the solid phase 10. As shown in FIG. 3 (B1), autoantibody 4 (human laminin-511-E8, human integrin α6β1, or an autoantibody to the complex) which is an “indicator antibody” that binds to the complex 3 in serum S Is present, the autoantibody 4 binds to the complex 3. FIG. 3 (B2) shows a case where the autoantibody 4 binding to the complex 3 is not present in the serum S. Next, a primary antibody that is a “first detection antibody” that can bind to the complex 3 to which the autoantibody 4 has not bound, and cannot bind to the complex 3 to which the autoantibody 4 has bound. 5 is added to the solid phase 10 and incubated (see FIGS. 3 (C1) and 3 (C2)). After the primary antibody 5 is incubated, the solid phase 10 is washed, and a secondary antibody 6 conjugated to HRP7, which binds to the primary antibody 5, is added and incubated (see FIG. 3 (D1) and FIG. 3 (D2)). . After the incubation of the secondary antibody 6, the solid phase 10 is washed. Finally, the secondary antibody 6 is quantified using the enzyme reaction of the HRP 7 on the solid phase 10 as an index. In this experiment, as shown in FIG. 3 (B1), when the autoantibody 4 (index antibody) that binds to the complex 3 is present in the serum S, the primary antibody 5 (first detection antibody) Since the secondary antibody 6 cannot bind to the complex 3 (FIG. 3 (C1)) and cannot bind to the solid phase 10 (FIG. 3 (D1)), the secondary antibody 6 is not detected. On the other hand, as shown in FIG. 3 (B2), when there is no autoantibody 4 (index antibody) binding to the complex 3 in the serum S, the primary antibody 5 (first detection antibody) Since the secondary antibody 6 can bind to the body 3 (FIG. 3 (C2)) and the secondary antibody 6 can bind to the solid phase 10 (FIG. 3 (D2)), the secondary antibody 6 is detected.

自己抗体（指標抗体）が結合していないラミニン−インテグリン複合体と結合することができ、且つ、自己抗体（指標抗体）が結合したラミニン−インテグリン複合体とは結合することができない一次抗体（第１の検出用抗体）の候補１〜９として、エピトープの異なる以下の抗体を用いた。また、一次抗体（第１の検出用抗体）の各候補に応じて異なるＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いた。 A primary antibody (primary antibody) that can bind to a laminin-integrin complex to which an autoantibody (indicator antibody) has not bound and cannot bind to a laminin-integrin complex to which an autoantibody (indicator antibody) has bound. The following antibodies having different epitopes were used as candidates (1) for detection (1). In addition, different HRP-conjugated secondary antibodies were used depending on each candidate for the primary antibody (first detection antibody).

以下の試験では、特に明示しない場合は、ＥＬＩＳＡＳｔａｒｔｅｒＡｃｃｅｓｓｏｒｙＫｉｔ（Ｅ１０１，ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。 In the following tests, an ELISA Starter Accessory Kit (E101, Bethyl Laboratories) was used unless otherwise specified.

コーティングバッファー（ＣｏａｔｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）、洗浄溶液（ＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ）、ブロッキング溶液（ＢｌｏｃｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ）、コンジュゲート希釈剤（ＣｏｎｊｕｇａｔｅＤｉｌｕｅｎｔ）は全て前記キットの指示書に従い調製した。 Coating Buffer, Wash Solution, Blocking Solution, and Conjugate Diluent were all prepared according to the kit instructions.

４．１．抗原（ラミニン５１１−Ｅ８）によるコーティング
（１）ヒトラミニン−５１１−Ｅ８（８９２０１２，株式会社ニッピ製）（ラミニン−５１１活性断片）を前記キットのコーティングバッファーに希釈して２μｇ／ｍｌ濃度溶液とした。この溶液を、前記キットのマイクロウェルプレートに、１つのウェルあたり１００μｌとなるように加えた。
（２）上記のマイクロウェルプレートを６０分間インキュベートした。
（３）インキュベート後に各ウェルから溶液を吸引除去した。
（４）各ウェルを前記キットの洗浄溶液により洗浄した。具体的には、各ウェルに前記洗浄溶液を満たし、次いで、前記洗浄溶液を吸引除去する洗浄操作を３回行った。 4.1. Coating with antigen (laminin 511-E8) (1) Human laminin-511-E8 (892012, manufactured by Nippi Co., Ltd.) (laminin-511 active fragment) was diluted in the coating buffer of the kit to give a 2 μg / ml concentration solution. This solution was added to the microwell plate of the kit at 100 μl per well.
(2) The microwell plate was incubated for 60 minutes.
(3) After the incubation, the solution was removed by suction from each well.
(4) Each well was washed with the washing solution of the kit. Specifically, each well was filled with the washing solution, and then a washing operation of sucking and removing the washing solution was performed three times.

４．２．ブロッキング
（１）前記キットのブロッキング溶液２００μｌを各ウェルに添加した。
（２）３０分間インキュベートした。
（３）インキュベート後、前記ブロッキング溶液を除去し、各ウェルを３回洗浄した。 4.2. Blocking (1) 200 μl of the blocking solution of the kit was added to each well.
(2) Incubated for 30 minutes.
(3) After incubation, the blocking solution was removed, and each well was washed three times.

４．３．インテグリンα６β１のインキュベート
（１）ヒトインテグリンα６β１（７８０９−Ａ６−０５０、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）を、１ｍＭマンガン（Ｍｎ）を添加した前記キットのコンジュゲート希釈剤中で、２μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この希釈溶液を、ブロッキング後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。
（２）６０分間インキュベートした。
（３）インキュベート後、前記希釈溶液を除去し、１ｍＭマンガンを添加した前記キットの洗浄溶液により各ウェルを３回洗浄した。 4.3. Incubation of integrin α6β1 (1) Human integrin α6β1 (7809-A6-050, R & D system) was diluted to a concentration of 2 μg / ml in the conjugate diluent of the kit to which 1 mM manganese (Mn) was added. 100 μl of this diluted solution was added to each well of the microwell plate after blocking.
(2) Incubated for 60 minutes.
(3) After the incubation, the diluted solution was removed, and each well was washed three times with the washing solution of the kit to which 1 mM manganese was added.

４．４．患者血清又は対照血清のインキュベート
（１）前記ＡＩＰ患者血清（ｎ＝２４）又は前記対照血清（ｎ＝２０）を、１ｍＭマンガンを添加した前記キットのコンジュゲート希釈剤により１：１００の割合で混合し希釈した。
（２）前記希釈により得られた血清希釈液を、インテグリンα６β１インキュベート後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。
（３）６０分間インキュベートした。
（４）インキュベート後、前記血清希釈液を除去し、１ｍＭマンガンを添加した前記キットの洗浄溶液により各ウェルを３回洗浄した。 4.4. Incubation of patient sera or control sera (1) The AIP patient sera (n = 24) or the control sera (n = 20) were mixed at a ratio of 1: 100 with the conjugate diluent of the kit to which 1 mM manganese was added. And diluted.
(2) 100 μl of the serum dilution obtained by the dilution was added to each well of the microwell plate after integrin α6β1 incubation.
(3) Incubated for 60 minutes.
(4) After incubation, the serum dilution was removed, and each well was washed three times with the washing solution of the kit to which 1 mM manganese was added.

４．５．一次抗体
（１）前記の一次抗体の候補１〜９を、１ｍＭマンガンを添加した前記キットのコンジュゲート希釈剤により１：２０００の割合で混合し希釈した。
（２）前記希釈により得られた一次抗体希釈液を、血清インキュベート後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。
（３）６０分間インキュベートした。
（４）インキュベート後、前記一次抗体希釈液を除去し、１ｍＭマンガンを添加した前記キットの洗浄溶液により各ウェルを３回洗浄した。 4.5. Primary antibody (1) The primary antibody candidates 1 to 9 were mixed and diluted at a ratio of 1: 2000 with the conjugate diluent of the kit to which 1 mM manganese was added.
(2) 100 μl of the primary antibody dilution obtained by the above dilution was added to each well of the microwell plate after the serum incubation.
(3) Incubated for 60 minutes.
(4) After the incubation, the primary antibody diluent was removed, and each well was washed three times with the washing solution of the kit to which 1 mM manganese was added.

４．６．ＨＲＰコンジュゲート二次抗体
（１）ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲートされた前記二次抗体を、１ｍＭマンガンを添加した前記キットのコンジュゲート希釈剤（ＣｏｎｊｕｇａｔｅＤｉｌｕｅｎｔ）により１：５０００の割合で混合し希釈した。
（２）前記希釈により得られた二次抗体希釈液を、一次抗体インキュベート後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。
（３）６０分間インキュベートした。
（４）インキュベート後、前記二次抗体希釈液を除去し、１ｍＭマンガンを添加した前記キットの洗浄溶液により各ウェルを５回洗浄した。 4.6. HRP-conjugated secondary antibody (1) The secondary antibody conjugated to HRP (horseradish peroxidase) was mixed at a ratio of 1: 5000 with a conjugate diluent (Conjugate Diluent) of the kit to which 1 mM manganese was added. And diluted.
(2) The secondary antibody dilution obtained by the above dilution was added to each well of the microwell plate after the primary antibody incubation in an amount of 100 μl.
(3) Incubated for 60 minutes.
(4) After incubation, the secondary antibody diluent was removed, and each well was washed five times with the washing solution of the kit to which 1 mM manganese was added.

４．７．酵素基質反応
（１）製造元の推奨条件に従ってＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を調製した。
（２）前記ＴＭＢ溶液を、二次抗体インキュベート後のマイクロウェルプレートの各ウェルに１００μｌ加えた。
（３）５分間インキュベートし、ＨＲＰによるＴＭＢの酸化反応を行った。
（４）前記酸化反応後に、０．１８ＭＨ_２ＳＯ_４１００μｌを、各ウェルに加えた。
（５）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの波長にて、前記酸化反応の生成物による呈色を測定した。 4.7. Enzyme substrate reaction (1) A TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) solution was prepared according to the manufacturer's recommended conditions.
(2) 100 μl of the TMB solution was added to each well of the microwell plate after the secondary antibody incubation.
(3) After incubation for 5 minutes, the oxidation reaction of TMB by HRP was performed.
(4) After the oxidation reaction, 100 μl of 0.18 MH ₂ SO ₄ was added to each well.
(5) Using a microplate reader, the coloration due to the product of the oxidation reaction was measured at a wavelength of 450 nm.

４．８．結果
結果を図４〜１２に示す。 4.8. Results The results are shown in FIGS.

図４は、一次抗体として、候補１（抗ラミニンα５抗体ＭＡＢ１９２４）を用いたときの結果を示す。 FIG. 4 shows the results when candidate 1 (anti-laminin α5 antibody MAB1924) was used as the primary antibody.

図５は、一次抗体として、候補２（抗ラミニンα５抗体ａｂ２１０９５７）を用いたときの結果を示す。 FIG. 5 shows the results when candidate 2 (anti-laminin α5 antibody ab210957) was used as the primary antibody.

図６は、一次抗体として、候補３（抗ラミニンβ１抗体ａｂ６９６３３）を用いたときの結果を示す。 FIG. 6 shows the results when candidate 3 (anti-laminin β1 antibody ab69633) was used as the primary antibody.

図７は、一次抗体として、候補４（抗ラミニンβ１抗体ａｂ９８２３２）を用いたときの結果を示す。 FIG. 7 shows the results when candidate 4 (anti-laminin β1 antibody ab98232) was used as the primary antibody.

図８は、一次抗体として、候補５（抗ラミニンγ１抗体ＬＳ−Ｃ３１２７３７）を用いたときの結果を示す。 FIG. 8 shows the results when candidate 5 (anti-laminin γ1 antibody LS-C312737) was used as the primary antibody.

図９は、一次抗体として、候補６（抗ラミニンγ１抗体ＬＳ−Ｃ３５６１５１）を用いたときの結果を示す。 FIG. 9 shows the results when candidate 6 (anti-laminin γ1 antibody LS-C356151) was used as the primary antibody.

図１０は、一次抗体として、候補７（抗インテグリンα６抗体ａｂ１０５６６９）を用いたときの結果を示す。 FIG. 10 shows the results when candidate 7 (anti-integrin α6 antibody ab105669) was used as the primary antibody.

図１１は、一次抗体として、候補８（抗インテグリンα６抗体ａｂ１８１５５１）を用いたときの結果を示す。 FIG. 11 shows the results when candidate 8 (anti-integrin α6 antibody ab181551) was used as the primary antibody.

図１２は、一次抗体として、候補９（抗インテグリンβ１抗体ａｂ３０３９４）を用いたときの結果を示す。 FIG. 12 shows the results when candidate 9 (anti-integrin β1 antibody ab30394) was used as the primary antibody.

図４〜１２において縦軸は、固相上の二次抗体量に比例する４５０ｎｍでの吸光度の相対値を示す。カットオフ値は、前記対照血清での前記相対値の平均値から、標準偏差（ＳＤ）の２倍の値を引いた値である。 4 to 12, the vertical axis indicates the relative value of the absorbance at 450 nm which is proportional to the amount of the secondary antibody on the solid phase. The cutoff value is a value obtained by subtracting twice the standard deviation (SD) from the average value of the relative values in the control serum.

一次抗体として、インテグリンα６の第１〜１００位アミノ酸の領域と結合する候補８の抗体を用いた場合に、図１１に示すように、ＡＩＰ患者血清では二次抗体が検出されず、対照血清で二次抗体が検出されることが確認された。すなわち、ヒトラミニン５１１活性断片に対する抗体のみを指標とする判別方法では判別が難しかったＡＩＰ患者血清と対照血清とを、正確に判別することが可能であった。この候補８は、ＡＩＰ患者の自己抗体が結合していないラミニンα５β１γ１−インテグリンα６β１複合体と結合することができ、且つ、ＡＩＰ患者の自己抗体が結合した前記複合体とは結合することができない一次抗体であることが分かる。ラミニンα５β１γ１−インテグリンα６β１複合体に、ＡＩＰ患者の自己抗体が結合するとき、インテグリンα６のＮ末端近傍部分の状態が変化することが推測される。そして、インテグリンα６のＮ末端近傍部分を認識する抗体は、ＡＩＰ患者の自己抗体が結合していないラミニンα５β１γ１−インテグリンα６β１複合体を定量するために利用可能であることが推測される。 When the candidate 8 antibody that binds to the region of amino acids 1 to 100 of integrin α6 was used as the primary antibody, as shown in FIG. It was confirmed that the secondary antibody was detected. That is, it was possible to accurately discriminate between AIP patient serum and control serum, which were difficult to discriminate by a discrimination method using only an antibody against the human laminin 511 active fragment as an index. This candidate 8 is capable of binding to the laminin α5β1γ1-integrin α6β1 complex to which the autoantibody of the AIP patient is not bound, and is not capable of binding to the complex to which the autoantibody of the AIP patient is bound. It turns out that it is an antibody. It is presumed that when an autoantibody of an AIP patient binds to the laminin α5β1γ1-integrin α6β1 complex, the state of the N-terminal portion of integrin α6 changes. It is presumed that an antibody recognizing a portion near the N-terminus of integrin α6 can be used for quantifying a laminin α5β1γ1-integrin α6β1 complex to which an autoantibody of an AIP patient is not bound.

一方、一次抗体として、候補１〜７、９の抗体を用いた場合には、図４〜１０、１２に示すように、ＡＩＰ患者血清と対照血清のどちらでも二次抗体が検出された。これらの抗体は、ＡＩＰ患者の自己抗体の結合の有無にかかわらず、ラミニンα５β１γ１−インテグリンα６β１複合体と結合することが推測される。 On the other hand, when the antibodies of candidates 1 to 7 and 9 were used as the primary antibodies, as shown in FIGS. 4 to 10 and 12, the secondary antibodies were detected in both the AIP patient serum and the control serum. It is presumed that these antibodies bind to the laminin α5β1γ1-integrin α6β1 complex irrespective of the presence or absence of autoantibody binding in AIP patients.

Claims

ＩｇＧ４関連疾患の検査方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患の指標として、検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。 A method for testing an IgG4-related disease,
An indirect detection step of indirectly detecting, as an indicator of an IgG4-related disease, an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎である、請求項１に記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein the IgG4-related disease is autoimmune pancreatitis.

前記検出用抗体が、前記第１の検出用抗体である、請求項１又は２に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the detection antibody is the first detection antibody.

ラミニン−インテグリン複合体を構成するインテグリンが、インテグリンα６β１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the integrin constituting the laminin-integrin complex is integrin α6β1.

前記検出用抗体が、インテグリンα６鎖のβプロペラドメインに含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region contained in the β propeller domain of the integrin α6 chain.

前記検出用抗体が、配列番号１で示されるインテグリンα６鎖のアミノ酸配列の第１位〜第１００位の範囲内に含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、請求項４又は５に記載の方法。 The antibody according to claim 4, wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region included in the amino acid sequence of the integrin α6 chain represented by SEQ ID NO: 1 within the range from position 1 to position 100. Method.

前記検体が血液試料である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the specimen is a blood sample.

ラミニン及びインテグリンとの組み合わせ、或いは、ラミニン−インテグリン複合体と、
ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体と
を含む、ＩｇＧ４関連疾患の検査キット。 A combination with laminin and an integrin, or a laminin-integrin complex,
The laminin-integrin complex binds immunologically to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody that binds immunologically does not bind, while the laminin-integrin complex to which the indicator antibody binds immunologically binds. Laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the first detection antibody that does not bind chemically or the laminin-integrin complex that does not bind to the indicator antibody, but binds to the indicator antibody And a detection antibody that is a second detection antibody that binds immunologically, and a test kit for an IgG4-related disease.

前記ＩｇＧ４関連疾患が、自己免疫性膵炎である、請求項８に記載のキット。 The kit according to claim 8, wherein the IgG4-related disease is autoimmune pancreatitis.

前記検出用抗体が、前記第１の検出用抗体である、請求項８又は９に記載のキット。 The kit according to claim 8, wherein the detection antibody is the first detection antibody.

インテグリン又はラミニン−インテグリン複合体を構成するインテグリンが、インテグリンα６β１である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 8 to 10, wherein the integrin constituting the integrin or laminin-integrin complex is integrin α6β1.

前記検出用抗体が、インテグリンα６鎖のβプロペラドメインに含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、請求項１１に記載のキット。 The kit according to claim 11, wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region contained in the β propeller domain of the integrin α6 chain.

前記検出用抗体が、配列番号１で示されるインテグリンα６鎖のアミノ酸配列の第１位〜第１００位の範囲内に含まれる領域をエピトープとして認識する抗体である、請求項１１又は１２に記載のキット。 The antibody according to claim 11 or 12, wherein the detection antibody is an antibody that recognizes, as an epitope, a region included in the range of positions 1 to 100 of the amino acid sequence of the integrin α6 chain represented by SEQ ID NO: 1. kit.

ラミニン及びインテグリンのうち一方、或いは、ラミニン−インテグリン複合体を、固相に固定された形態で含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 8 to 13, comprising one of laminin and integrin, or a laminin-integrin complex in a form immobilized on a solid phase.

前記検出用抗体と免疫学的に結合する、標識された二次抗体を更に含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 8 to 14, further comprising a labeled secondary antibody that immunologically binds to the detection antibody.

ＩｇＧ４関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
ＩｇＧ４関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。 A method for evaluating the effect of a treatment on an IgG4-related disease, comprising:
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a sample obtained from a test animal that has been treated for an IgG4-related disease,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.

ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニン−インテグリン複合体と免疫学的に結合する指標抗体を間接的に検出する間接検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記指標抗体が減少した場合に、前記試験物質を、ＩｇＧ４関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含み、
間接検出工程が、
ラミニン−インテグリン複合体と、検体とを接触させる第１工程と、
第１工程後のラミニン−インテグリン複合体と、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合するが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しない第１の検出用抗体、或いは、前記指標抗体が結合していないラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合しないが、前記指標抗体が結合しているラミニン−インテグリン複合体とは免疫学的に結合する第２の検出用抗体である検出用抗体とを接触させる第２工程と、
第２工程後のラミニン−インテグリン複合体に結合した前記検出用抗体を検出する第３工程と
を含む方法。 A method for screening a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease, comprising:
An indirect detection step of indirectly detecting an indicator antibody that immunologically binds to a laminin-integrin complex in a specimen obtained from an animal on which a test substance has been acted on,
A step of selecting the test substance as a candidate substance for a therapeutic drug for an IgG4-related disease, when the indicator antibody in the sample is reduced by allowing the test substance to act,
Indirect detection process,
A first step of contacting the specimen with the laminin-integrin complex;
Although the laminin-integrin complex after the first step is immunologically bound to the laminin-integrin complex not bound to the indicator antibody, the laminin-integrin complex bound to the indicator antibody is A first detection antibody that does not immunologically bind, or a laminin-integrin complex that does not immunologically bind to the laminin-integrin complex to which the indicator antibody does not bind, but binds to the indicator antibody. A second step of contacting the body with a detection antibody that is a second detection antibody that immunologically binds;
A third step of detecting the detection antibody bound to the laminin-integrin complex after the second step.