JP2019522649A - 健康な皮膚微生物叢の維持及び/又は回復に対する皮膚科調合剤 - Google Patents
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Abstract
Description
細菌株及び増殖条件
ラクトバチルス株(表1)を、de Man、Rogosa及び Sharpe(MRS)の培地(CarlRoth)において37℃で増殖させた。全ての細菌を非振盪条件で増殖させ、グリセロールストック(-80℃)から接種した。固体培地は1.5%(重量/体積)の寒天を含んだ。
分泌された活性な抗微生物性生成物を含む使用済みの培養上清(SCS)を得るため、各種に特異的な増殖培地を前培養物から接種して、24時間インキュベートした。4℃にて6797 g(8000 rpm)で30分間の遠心分離によってSCSを得た。その後、SCSを濾過滅菌した(0.20 μmの酢酸セルロース、VWR)。
選択された細菌の抗微生物活性を、幾つかの小さな改変を伴う標準的な抗微生物試験により調査した。選択された細菌の抗微生物活性をスポットアッセイによって調査した(Schillinger and Lucke1989)。簡潔には、1 μL〜3 μLの各培養物を寒天プレートにスポットした。これらのプレートを株に応じて24時間〜最長72時間インキュベートした。次に病原体の終夜培養物を軟寒天の病原体培地7 mLに希釈し、選択された株のスポットを有するプレートに注いだ。プレートを30℃〜37℃で一晩インキュベートし、その後、阻止帯を測定した。軟寒天を注ぐ前に陽性対照として、ミコナゾール(真菌に対する)及び/又は、0.1%ヘキセチジン及び/又はテトラサイクリン(プロピオニバクテリウム・アクネスに対する)のスポットをスポットプレートに追加した。
さらに、使用済みの培養上清(SCS)の抗微生物活性を、ラクトバチルスと胃腸管病原体との間の競合アッセイについて以前に記載されるプロトコル(Coconnier et al. 1997)により調査した。ミコナゾール(Miconazole)(真菌に対する)及びテトラサイクリン(プロピオニバクテリウム・アクネスに対する)を陽性対照として使用した。無菌の増殖培地を陰性対照として使用した。
時間経過分析を、わずかな改変を伴って以前に記載される(De Keersmaecker et al. 2006)のと同様に行った。簡潔には、50%〜5%のラクトバチルスのSCSで補足した適切な培地50%〜80%で満たしたマイクロプレートのウェルに病原体の終夜培養物を添加した。pH 4.3のMRS、及び適切な濃度の抗生物質又は抗真菌剤を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。細菌又は真菌を増殖させ、Synergy HTXマルチモードリーダー(Biotek)を使用して、3日間に亘って30分間ごとに、590nmで光学密度(OD)を測定した。試験をそれぞれ少なくとも3回行って測定し、平均ODを計算した。陰性対照と比較した、24時間後(定常相)に到達した相対光学密度として、抗微生物活性を表した。
抗生物質感受性をKirby-Bauerディスク拡散試験を使用して評価した。つまり、抗生物質をペーパーディスクにスポットし、寒天プレート上で細菌の阻止帯を測定した。試験した抗生物質は、適切な濃度のエリスロマイシン、ノルモシン(normocin)、テトラサイクリン、アンピシリン及びクリンダマイシンであった。
尋常性座瘡を持つ20名の患者に概念実証臨床試験を行った。患者は軽度の炎症性座瘡を有する12歳〜25歳の男性であった。この概念実証試験の目的は、局所のプロバイオティクスクリーム(1 gの局所クリームACNの塗布当たり、+-10-8コロニー形成単位(CFU)のL.ペントーサスYUN-V1.0、+-10-8 CFUのL.プランタラムYUN-V2.0、及び+-10-8 CFUのL.ラムノーサスYUN-S1.0を含む)の皮膚微生物叢及び座瘡の重症度に対する影響を評価することであった。患者に、56日(8週)間に亘って毎日2回クリームを塗るよう求めた。患者は、最初(治療前)、4週目、8週目及び10週目に皮膚科医の診察を受けた。通院毎に皮膚スワブを採取した。市販のMoBio Powersoilキット(Human Microbiome Projectを参照されたい)によって、これらの試料から細菌DNAを単離した。単離したDNAを、MiSeqIlluminaによる16S rRNAアンプリコン配列決定によって分析し、バイオインフォマティクス分析を行った。さらに、臨床スコアリングを行い、通院毎に写真撮影を行った。
足白癬を持つ20名の患者に概念実証臨床試験を行った。患者は足白癬を有する18歳〜65歳であった。この概念実証試験の目的は、局所プロバイオティクスクリーム(1 gの局所クリームFNGの塗布当たり、+-10-8コロニー形成単位(CFU)のL.ペントーサスYUN-V1.0、+-10-8 CFUのL.プランタラムYUN-V2.0、及び+-10-8 CFUのL.ラムノーサスYUN-S1.0を含む)の皮膚微生物叢及びトリコフィトン感染症に対する影響を評価することであった。患者に、56日(8週)間に亘って毎日2回クリームを塗るよう求めた。患者は、最初(治療前)、4週目、8週目及び10週目に皮膚科医の診察を受けた。通院毎に皮膚スワブを採取した。市販のMoBio Powersoilキット(Human Microbiome Projectを参照されたい)によって、これらの試料から細菌DNAを単離した。単離したDNAを、MiSeqIlluminaによる16S rRNAアンプリコン配列決定によって分析し、バイオインフォマティクス分析を行った。真菌の存在の分析のため、スワブをトリコフィトン特異的培地(BCCMによって推奨される培地)に蒔いた(plated out)。ユニバーサルITS(「内部転写領域」)プライマーITS1(配列番号6)(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')及びITS4(配列番号7)(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')を使用するコロニーPCRに続いて、配列決定を行い、真菌を同定した。さらに、臨床スコアリングを行い、通院毎に写真撮影を行った。
増殖特性及び乳酸塩の産生
可能性のある有益な株又はプロバイオティクス株を、増殖特性、乳酸塩産生、及び培地のpHを降下させる能力の点で特性評価した。これらの特性が、抗病原性活性にとって重要であると予想される。これらのデータは、ラクトバチルス・ペントーサスYUN-V1.0及びL.プランタラムYUN-V2.0及びL.ラムノーサスYUN-S1.0が最も多量の乳酸を産生することを示す(図1)。
プロピオニバクテリウム・アクネスに対する選択された株の使用済み培養上清(SCS)の抗微生物活性を分析して、時間経過実験を行った。試験株のSCSはいずれもプロピオニバクテリウム・アクネスの増殖を阻害したが、いずれも乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラス及びS.サリバリウス、並びにスタフィロコッカス・エピデルミディスのような他の細菌種のSCSは、P.アクネスの増殖を阻害しなかった。これは、選択されたラクトバチルスの種、またおそらくは株に特異的な特性がP.アクネスに対する抗病原性活性に重要であることを示唆する(図2)。
次の段階では、有益な細菌又はプロバイオティクス細菌を、特定の皮膚病原体に対する抗病原性効果についてスクリーニングした。マラセチア・フルフル、トリコフィトン・ルブルム及びカンジダ・アルビカンスに対するスポットアッセイの結果を表1、表2及び表3にそれぞれ示す。
マラセチア・フルフル
*独立した3回の繰り返しを示す
トリコフィトン・ルブルム
カンジダ・アルビカンス
また、抗生物質耐性遺伝子の拡散の防止に関し、選択された細菌を抗生物質感受性について試験した。ラクトバチルスは、テトラサイクリンに感受性があったL.プランタラム5057を除いて、いずれもエリスロマイシン、ノルモシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクリンダマイシンに感受性があった。この理由で、L.プランタラム5057株は、プロバイオセラピー用の株として使用するのに好適ではないとわかった。
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cgtgtgtagcccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccggcagtctcac cagagtgccc aacttaatgc tggcaactga taataagggt 360
tgcgctcgttgcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtatccatgtccccg aagggaacgt ctaatctctt agatttgcat agtatgtcaa 480
gacctggtaaggttcttcgc gtagcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtcaattcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggaatgctta 600
atgcgttagctgcagcactg aagggcggaa accctccaac acttagcatt catcgtttac 660
ggtatggactaccagggtat ctaatcctgt ttgctaccca tactttcgag cctcagcgtc 720
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前記ラクトバチルス種が、L.プランタラム、L.ペントーサス、及びL.ラムノーサスを含む一覧から選択される、局所使用。
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