CN114040770A

CN114040770A - 用于治疗、缓和或预防痤疮的组合物

Info

Publication number: CN114040770A
Application number: CN202080043901.2A
Authority: CN
Inventors: C·维德尔; K·B·奥尔森; S·凯鲁夫
Original assignee: Leto Biology Co ltd
Current assignee: Leto Biology Co ltd
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2022-02-11
Also published as: EP3972619A1; US20220211782A1; AU2020279533A1; WO2020234382A1; CA3140493A1

Abstract

本发明涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物，其中与非致病性痤疮丙酸杆菌菌株相比，所述一种或多种细菌菌株对致病性痤疮丙酸杆菌菌株表现出更强的抑制作用。

Description

用于治疗、缓和或预防痤疮的组合物

技术领域

本发明涉及包含细菌菌株的组合物。特别地，本发明涉及包含用于治疗；缓和；抑制；预防；和/或防止病原微生物的生长的细菌菌株的新型局部皮肤病学组合物。

背景技术

痤疮(acne)是目前最常见和最完善的皮肤病之一，在其一生中的某个阶段影响着世界上约90％的人口。该疾病是一种多因素发病机制的皮肤毛囊皮脂腺慢性炎症性皮肤病。它通常在***因荷尔蒙变化而开始，并因遗传因素而进一步恶化。

痤疮丙酸杆菌(以前称为痤疮丙酸杆菌，Probionibacterium acnes)是一种革兰氏阳性厌氧菌，存在于皮脂腺毛囊中，毛囊是毛囊皮脂单位天然菌群的一部分；然而，在痤疮患者中发现痤疮丙酸杆菌的特定核糖型水平升高。在痤疮背景下形成的微环境中，痤疮丙酸杆菌在皮脂产量增加的情况下茁壮成长，将其用作生长的营养物质。毛孔内的痤疮丙酸杆菌水平进一步促进粉刺的发展。

痤疮丙酸杆菌可以同时通过代谢甘油三酯和释放游离脂肪酸来刺激炎症。炎症是通过补体激活和促炎介质的产生引发的，这些介质通过毛囊壁扩散。众所周知，痤疮丙酸杆菌会激活单核细胞和中性粒细胞上的Toll样受体2(TLR2)。然后TLR2的激活导致多种促炎细胞因子的产生，特别是白介素12(IL-12)和白介素8(IL-8)和TNFα。

随着压力的增加和炎症介质的募集，微粉刺可能会随着免疫原性角蛋白、皮脂和细菌挤入真皮而破裂。这会刺激进一步夸大的炎症反应。炎症的程度和所涉及的相应细胞类型决定了皮肤上是否会出现脓疱、发炎的丘疹、结节或囊肿。在严重炎症和组织损伤的痤疮病例中，可能会导致色素沉着过度和疤痕。

存在各种治疗痤疮的方法。一般来说，治疗痤疮的方法是减少油脂分泌、加速皮肤细胞更新、对抗细菌感染、减少炎症或同时进行这四件事。这些类型的痤疮治疗包括非处方局部治疗、抗生素、口服避孕药和整容手术。

痤疮乳液可能会使油变干，杀死细菌并促进死皮细胞脱落。非处方(OTC)乳液通常温和，含有作为其活性成分的过氧化苯甲酰、硫磺、间苯二酚、水杨酸或硫磺。抗生素可能会引起副作用，例如胃部不适、头晕或皮肤变色。这些药物还会增加皮肤对阳光的敏感性，并可能降低口服避孕药的有效性。对于深部囊肿，抗生素可能是不够的。异维A酸(Amnesteem、Claravis、Sotret)是一种强效药物，可用于治疗对其他治疗无反应的囊肿性痤疮或痤疮疤痕。然而，异维A酸有许多副作用，例如皮肤干燥、抑郁、严重的胃痛和肌肉/关节/背痛，并且会导致母亲使用异维A酸的婴儿出生缺陷。化学换肤和微晶换肤术可能有助于控制痤疮。这些美容手术传统上用于减少细纹、晒伤和轻微面部疤痕的出现，与其他痤疮治疗结合使用时最有效。它们可能会导致暂时的、严重的发红、脱屑和起泡，以及皮肤的长期变色。

WO2017/220525描述了使用包含益生菌的组合物的有益效果，该益生菌选择了乳酸杆菌菌株，以对抗导致痤疮的常见皮肤病原体的发展，特别是植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。描述了WO2017/220525中提供的组合物包含酸，例如由作为重要抗微生物因子的选定乳杆菌菌株产生的乳酸。本发明的缺点是提供了对痤疮丙酸杆菌(以及天然皮肤微生物群)的非特异性抑制，由此，两种致病核糖型痤疮丙酸杆菌(导致寻常痤疮的发展)；和非致病性核糖型痤疮丙酸杆菌。

除了目前可用的治疗方法引起的负面副作用外，还没有针对皮肤微生物群的调节和针对痤疮丙酸杆菌的致病核糖型的治疗方法。因此，本领域需要专门针对致病性痤疮丙酸杆菌的方法和治疗，对天然皮肤微生物群具有有限的抗微生物作用，从而支持天然皮肤微生物群对抗痤疮。

发明内容

因此，本发明的一个目的涉及一种包含细菌菌株的组合物，其解决了现有技术的上述问题。

特别地，本发明涉及一种新型组合物，优选一种新型局部皮肤病学组合物，其包含用于治疗；缓和；抑制；预防和/或防止病原微生物在哺乳动物例如人的皮肤上生长的细菌菌株，其解决了现有技术的上述问题，如由痤疮感染引起的痤疮皮肤感染、痤疮皮肤病、皮肤炎症、皮肤干燥和疤痕。

因此，本发明的一方面涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物，其中与非致病性痤疮丙酸杆菌菌株相比，所述一种或多种细菌菌株对致病性痤疮丙酸杆菌菌株表现出更强的抑制作用。

本发明的另一方面涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物，该组合物能够与一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集，相对于一种或多种细菌菌株与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集的能力而言更强。

本发明的另一方面涉及用作药物的包含根据本发明的组合物的产品。

本发明的又一个实施方案涉及包含根据本发明的用于治疗；缓和、抑制；预防和/或防止病原微生物的生长的组合物的产品。

本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的组合物的产品，该组合物包含能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株，以用于治疗；缓和、抑制；预防和/或预防寻常痤疮的一种或多种细菌种类。

本发明的另一个方面涉及包含一种或多种能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的乳酸菌种的组合物，其中所述一种或多种乳酸菌种可以选自具有与选自以下组的一种或多种细菌菌株具有至少95％的遗传同源性：

-LB356R(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteriodes)LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)LB10G，以DSM32906保藏)。

本发明的另一个方面涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物的用途，用于减少或避免一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株对表面的附着和/或用于减少或避免一种或多种痤疮丙酸杆菌的生物膜在表面上形成的用途。

具体实施方式

在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下术语和限定：

术语“核糖型”是指痤疮丙酸杆菌的特定菌株。核糖分型菌株的特征如Fitz-Gibbon et al.J.Investigative Dermatology 133:2152-60(2013)所述。

术语“***发育型”是指痤疮丙酸杆菌的特定菌株。***型菌株的特征如McDowellet al.PLoS ONE 8(9):e70897(2013)所述。

术语“致病性痤疮丙酸杆菌”是指与痤疮疾病和感染痤疮的皮肤相关的核糖型和***发育型。

与治疗主题的方法的化合物的“治疗有效量”是指制剂中化合物的量，当作为(对哺乳动物，最好是人)所需剂量方案的一部分施用时，根据待治疗的病症或状况的临床可接受标准或美容目的减轻症状、改善病症或减缓疾病病症的发作，例如，在适用于任何医疗的合理收益风险比的情况下。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括以改善或稳定受试者病症的方式逆转、减轻或阻止病症的症状、临床体征和潜在病理。

因此，痤疮丙酸杆菌是人类皮肤的主要共生菌。它通过抑制金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌等常见病原体的入侵，有助于保持皮肤健康。它通过水解甘油三酯并释放有助于皮肤表面酸性pH值的游离脂肪酸来实现。另一方面，痤疮丙酸杆菌历史上与寻常痤疮有关，这是一种毛囊皮脂单位的慢性炎症性疾病。一项宏基因组研究表明，痤疮丙酸杆菌是健康个体和痤疮患者毛囊皮脂腺单位中的优势细菌。

已经发现，在菌株水平上，两组菌株之间痤疮丙酸杆菌的种群结构是不同的。这些发现表明，与其他疾病的研究一致，与微生物相关的人类疾病通常是由一个物种的某些菌株而不是整个物种引起的。痤疮丙酸杆菌被分为三种不同的类型，首先揭示了两种不同的痤疮丙酸杆菌表型，称为I型和II型，可以根据血清凝集试验和细胞壁糖分析进行区分。痤疮丙酸杆菌I型和II型通过单克隆抗体分型来区分。此外，他们基于recA基因的核苷酸序列和更易变的溶血素/细胞毒素基因(tly)对痤疮丙酸杆菌菌株进行的***发育分析表明，I型和II型代表不同的谱系。I型谱系内的菌株可以进一步分为两个进化枝，称为IA和IB型，两者都与痤疮疾病有关。另一个***发育组的痤疮丙酸杆菌，称为III型，稍后描述。最近基于多位点序列分型(MLST)的研究进一步将痤疮丙酸杆菌细分为密切相关的簇，其中一些与包括痤疮在内的各种疾病有关。人类微生物组计划(HMP)的结果产生了关于与健康和疾病相关的痤疮丙酸杆菌菌株特定核糖型的知识(McDowell et al.2013,PLoS ONE 8(9):e70897,Dreno et al.2018,JEADV 32(suppl.2),5-14.doi:10.1111/jdv.15043)。已知痤疮丙酸杆菌的特定核糖型是非致病性的，并且是天然健康皮肤微生物群的一部分，而痤疮丙酸杆菌的其他特定核糖型被鉴定为在痤疮感染中具有致病性和优势。因此，已经证明RT4和RT5与痤疮密切相关，而RT6与健康皮肤相关。包括核糖型RT7、RT8、RT9和RT10在内的其他痤疮丙酸杆菌菌株也可能促进该疾病的发展(Fitz-Gibbon et al.2013,J.Invest.Dermatol.133:2152-60.doi:10.1038/jid.2013.21)。

有痤疮的皮肤并不比健康皮肤含有更多的痤疮丙酸杆菌，这是致病性痤疮丙酸杆菌核糖型和非致病核糖型之间的不平衡。

因此，针对致病性痤疮丙酸杆菌的改进的抗微生物活性将是有利的。

本发明涉及益生菌和包含益生菌的组合物，其用于预防或治疗来自病原微生物的感染，例如痤疮皮肤杆菌感染。

本发明的发明人惊奇地发现一些细菌菌株可以抑制痤疮丙酸杆菌的致病核糖型的生长，而痤疮丙酸杆菌的非致病性核糖体的生长受到的影响明显较小，或根本不受影响。

在本发明的一个实施方案中，一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株可以优选地是一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株。

一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株，或一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株，可选自痤疮角质杆菌核糖型RT4；核糖型RT5；核糖型RT7；核糖型RT8；核糖型RT9；和/或核糖型RT10。优选地，一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株可以选自痤疮角质杆菌核糖型RT4；核糖型RT5；和/或核糖型RT8。

在本发明的一个实施方案中，一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株可选自由痤疮切杆菌HL110PA1、痤疮皮肤杆菌HL053PA2、痤疮皮肤杆菌HL043PA1和/或痤疮皮肤杆菌HL038PA1组成的组。

本发明提供了新的微生物菌株和新的组合物，它们可以抑制致病性痤疮丙酸杆菌的生长，而不会导致皮肤刺激和干燥。

在本发明的上下文中，术语“抑制(inhibit)”和“抑制(inhibition)”可涉及完全或部分抑制。

因此，本发明的优选实施方案涉及包含一种或多种能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的细菌菌株的组合物。

优选地，本发明的优选实施方案涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物，其中与非致病性痤疮丙酸杆菌菌株相比，所述一种或多种细菌菌株对致病性痤疮丙酸杆菌菌株表现出更强的抑制作用。

发明人惊奇地发现，特定细菌菌株，特别是特定乳酸细菌菌株，表现出对致病性痤疮丙酸杆菌菌株的作用比非致病性痤疮丙酸杆菌菌株更强。该发现允许提供一种组合物，该组合物包含适用于治疗、缓和、抑制、预防一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株的所述特定细菌菌株。

优选地，抑制涉及痤疮丙酸杆菌菌株的生长抑制，优选地抑制致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生长；痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集抑制，优选痤疮丙酸杆菌致病菌株的共聚集抑制；和/或痤疮丙酸杆菌菌株的生物膜抑制，优选地，致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生物膜抑制。最优选地，抑制涉及抑制痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集，优选抑制致病性痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集；和/或痤疮丙酸杆菌菌株的生物膜抑制，优选地，致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生物膜抑制。

本发明的一实施例中，包含一种或多种细菌菌株的组合物与一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集，相对于一种或多种细菌菌株与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集的能力而言更强。

一种或多种细菌菌株可以优选地是一种或多种乳酸细菌菌株。

一种或多种细菌菌株(优选一种或多种乳酸菌株)能够与一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株以强聚集强度共聚集。通过对聚集的目视检查，可将聚集大小确定为一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株的聚集强度的指示。

在本发明的优选的实施例中，一种或多种细菌菌株(优选一种或多种乳酸菌株)能够与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株以弱聚集强度共聚集。

在本发明的一个更优选的实施例中，相对于与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的聚集强度，该组合物和/或一种或多种细菌菌株(优选是一种或多种乳酸菌)能够以更强的聚集强度与一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集。

共聚集的形成可以使用以下标准从1-5(值越高，聚集强度越强)进行视觉评分：

1：无聚合

2：可视化初始聚合

3：聚集体的形成<0.5mm

4：聚集体的形成>0.5mm和<1mm

5：聚集体的形成>1mm

在本发明的一实施例中，相对于非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的抑制，致病性痤疮丙酸杆菌菌株的抑制强10％或更多，例如强15％或更多，例如强20％或更多，例如强30％或更多，例如强40％或更多，例如强50％或更多，例如强75％或更多，例如强100％或更多，例如强150％或更多，例如强200％或更多，例如强300％或更多。

在本发明的另一个实施方案中，非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的抑制为致病性痤疮丙酸杆菌菌株抑制的90％或更少，例如80％或更少，例如70％或更少，例如60％或更少，例如50％或更少，例如40％或更少，例如30％或更少，例如20％或更少。

本发明的上下文中，术语“更强”或“更强的强度”可互换使用，以及例如在关于协同聚合方面，涉及相对于非致病性痤疮丙酸杆菌菌株对非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的增加的作用，其中与形成的包含非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的聚集体的大小相比，更强的作用可能导致形成更大的包含致病性痤疮丙酸杆菌菌株的聚集体。在生物膜的形成方面，效果更强可能导致形成具有减少数量的致病性痤疮丙酸杆菌菌株的较小生物膜和/或形成具有相对于致病性痤疮丙酸杆菌菌株具有更高比例的非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生物膜。关于对生长的增加作用，更强的作用可能导致相对于非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生长，致病性痤疮丙酸杆菌菌株的生长抑制增加。

本发明的发明人惊奇地发现，通过改善本发明提供的痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集，可以限制、减少或防止表面上的生物膜形成。生物膜的形成始于自由漂浮的微生物附着在表面上。如果不阻止这些第一批殖民者附着在表面上，他们可以更持久地将自己固定在表面上并吸引其他微生物附着，并且该群落可能正在生长并准备生物膜。

本发明的组合物出人意料地显示出限制、减少或防止：

1)痤疮丙酸杆菌菌株最初附着在表面上的第一批开拓者；和/或

2)防止痤疮丙酸杆菌菌株附着在定植微生物上。

据信，痤疮丙酸杆菌引起疾病或感染的能力之一可能与对人体细胞表面的附着和痤疮丙酸杆菌生物膜的形成有关。痤疮丙酸杆菌的这种生物膜形成使得感染更难以预防或治疗，因为生物膜形成保护痤疮丙酸杆菌细菌免受抗微生物活性。

致病性痤疮丙酸杆菌的生物膜形成可以提供对痤疮丙酸杆菌菌株的内在抗性，这是细菌物种通过其固有的结构或功能特征抵抗特定抗微生物剂活性的先天能力，这允许特定药物或抗微生物化合物的耐受性。

本发明的发明人惊奇地发现，根据本发明的细菌菌株，例如，本发明的乳酸菌株能够防止痤疮丙酸杆菌初始结合到表面并抑制随后的生物膜形成。

在本发明的一实施方案中，根据本发明的细菌菌株，例如，本发明的乳酸细菌菌株可能能够防止痤疮丙酸杆菌最初与表面结合并抑制随后生物膜的产生。

优选地，表面可以选自细胞、哺乳动物身体，例如人体，其中躯体可以是哺乳动物例如人的皮肤或粘膜。

本发明的一优选实施方案涉及包含一种或多种细菌菌株的组合物，其能够抑制、减少、限制和/或防止附着于一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的表面和/或抑制、减少、限制和/或防止一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株表面上的生物膜形成。

优选地，抑制、减少、限制和/或防止一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株在表面上附着和/或形成生物膜可以是一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株。

一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株，优选一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株与表面的附着和/或生物膜形成，相对于没有添加细菌菌株的样品，可以减少15％(w/w)或更多，例如减少25％(w/w)或更多，例如50％(w/w)或更多，例如75％(w/w)或更多，例如90％(w/w)或更多，例如95％(w/w)或更多，例如98％(w/w)或更多。

在本发明的实施例中，一种或多种菌株(优选一种或多种乳酸菌株)能够在1小时和/或24小时后以4至5(1-5的等级)以强聚集强度共聚集。优选地，一种或多种菌株(优选一种或多种乳酸菌株)在1小时后能够以强聚集强度共聚集。强聚集强度可以是4到5的分数(在1到5的范围内)。

形成强共聚合的速度越快，例如一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株可能是越好越特效的。

另一方面，一种或多种细菌菌株，优选一种或多种乳酸细菌菌株，可以与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集。这种与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集可被认为具有较弱的聚集强度。

在本发明的一个实施例中，一种或多种细菌菌株(优选一种或多种乳酸菌株)能够以弱聚集强度共聚集，1小时后和/或24小时后值为1-3(以1-5的等级)。

由于根据本发明的一种或多种细菌菌株与致病性痤疮丙酸杆菌菌株和非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的共聚集存在显著差异，其中在一种或多种细菌菌株和致病性痤疮丙酸杆菌菌株之间发现最强的共聚集，本发明的发明人惊奇地发现可以治疗；缓和、抑制；预防；和/或预防由致病性痤疮丙酸杆菌菌株引起的哺乳动物寻常痤疮的发展。同时，发明人惊奇地发现，同时保持非致病性痤疮丙酸杆菌菌株(或其部分)作为健康皮肤微生物群的一部分是可能的。

在本发明的一个实施方案中，一种或多种乳酸细菌菌株可以是乳酸杆菌菌株；明串珠菌菌株；和/或魏斯氏菌菌株。优选地，细菌菌株可以是乳杆菌菌株。

优选地，乳杆菌菌株可以选自植物乳杆菌。在本发明的实施方案中，植物乳杆菌可以选自植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏，或选自植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏。

优选地，明串珠菌菌株可以选自肠膜明串珠菌。在本发明的实施例中，肠膜明串珠菌可以选自以DSM33093保藏的肠膜明串珠菌LB349A。

优选地，韦塞拉菌株可以选自绿色魏斯氏菌。在本发明的实施例中，绿色魏斯菌可以选自绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏。

在本发明的另一个实施例中，能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的一种或多种乳酸细菌菌株可以是以下的组合：

-植物乳杆菌，优选地选自植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏和/或选自植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏；

-肠膜明串珠菌，优选地，选自肠膜明串珠菌LB349A，以DSM33093保藏；和/或

-绿色魏斯氏菌，优选地，选自绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏。

优选地，能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的一种或多种乳酸菌种可以选自与由以下组成的组中的一种或多种细菌菌株具有至少95％的遗传同源性的细菌菌株：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠系膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

本发明的优选的实施例涉及包含一种或多种能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的乳酸菌种的组合物，所述一种或多种乳酸菌种可以选自具有与选自以下组的一种或多种细菌菌株具有至少95％的遗传同源性：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

在本发明的另一实施例中，能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的一种或多种乳酸菌种可以选自与选自由以下组的组中的细菌菌株具有96％；例如至少97％；例如至少98％；例如至少99％；例如至少99.5％；例如至少99.8％；例如至少99.9％；例如100％(相同)的遗传同源性的细菌菌株：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

在本发明的又一实施例中，能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株的一种或多种乳酸菌种可以选自由以下组成的组的细菌菌株：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

在本上下文中，术语“遗传同源性”涉及细菌菌株的遗传序列相对于保藏的细菌菌株的偏差。

根据本发明的细菌菌株(和/或组合物)对病原微生物的影响可能是显著的。

根据本发明的组合物能够抑制痤疮皮肤杆菌的生长。在本发明的一个实施方案中，致病性痤疮丙酸杆菌的生长可以减少至少20％；例如减少至少30％，例如减少至少40％；例如减少至少50％，例如减少至少60％。

在优选的实施方案中，根据本发明的细菌菌株可以是分离的细菌菌株。

-本发明公开了微生物，它们通过功能关系相互关联以形成根据本发明的统一思想，从而它们共享特性和/或作用，即它们抑制病原微生物如痤疮丙酸杆菌的生长，和/或降低与皮肤病相关的病原微生物如痤疮丙酸杆菌的定殖水平。这些乳酸菌尤其包括选自包含以下新的分离的微生物或它们的类似物、片段、裂解物、衍生物、突变体或组合，这些微生物保藏在德国微生物菌种保藏中心(GermanCollection for Microorganisms and CellCultures)：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

本发明包括包含这些新乳酸菌中的至少一种的组合物和包含这些菌株及其类似物、片段、裂解物、衍生物、突变体的任意组合的组合物。

痤疮感染可以与葡萄球菌(Staphylococcus)共同感染，例如可使疾病恶化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的组合物还可包含抗微生物活性。特别地，本发明涉及包含一种或多种细菌菌株并且对与痤疮共感染相关的葡萄球菌具有抗微生物活性的组合物。

在本发明的上下文中，术语“细菌菌株”涉及根据本发明的细菌菌株。优选地，细菌菌株涉及根据本发明的乳酸细菌菌株。

在本发明的上下文中，术语“共聚集”涉及病原菌的聚集，例如病原性痤疮丙酸杆菌菌株与另一种细菌的聚集，即根据本发明的一种或多种细菌菌株，例如乳酸菌株。

优选地，共聚集体可以是人眼清晰可见的。

在本发明的一个实施例中，共聚集体在24小时内形成聚集体粒径大于0.1mm的聚集体；例如0.25mm以上；例如0.5mm以上；例如0.75mm以上；例如1.0mm以上；例如在0.1-0.5mm范围内；优选地，在0.5-1.0mm的范围内；甚至更优选大于1.0mm。

在本发明的另一实施例中，共聚集体在1小时内形成聚集体粒径大于0.1mm的聚集体；例如0.25mm以上；例如0.5mm以上；例如0.75mm以上；例如1.0mm以上；例如在0.1-0.5mm范围内；优选地，在0.5-1.0mm的范围内；甚至更优选大于1.0mm。

本发明的另一方面涉及根据本发明的用于治疗；缓和、抑制；预防和/或防止病原微生物的生长的组合物。

本发明的发明人提供了一种用于治疗或预防感染的治疗组合物，其包含在药学上可接受的载体中的一种或多种细菌菌株的治疗有效浓度，适合施用于哺乳动物的胃肠道和/或局部施用于哺乳动物的皮肤或粘膜，其中所述一种或多种细菌菌株具有抑制病原体生长、定植率和病原体初始附着于感染部位的能力。

在本发明的实施方案中，组合物可以是局部组合物(用于局部治疗)或口腔组合物(用于口腔治疗)或直肠组合物(用于直肠治疗)。优选地，该组合物可以是局部组合物，优选地是用于局部治疗寻常痤疮的局部组合物。

根据本发明的痤疮治疗可以是包括局部治疗和口服治疗的联合治疗。

在本发明的另一实施方案中，组合物可以是局部皮肤病学组合物。

本发明的优选实施方案涉及包含一种或多种根据本发明的细菌菌株的组合物。

细菌菌株，优选一种或多种活菌株的浓度可以在10³至10¹⁴个菌落形成单位(CFU)的范围内；例如在10⁵-10¹³CFU范围内；例如在10⁶-10¹²CFU的范围内；例如在10⁷-10¹¹CFU的范围内；例如在10⁸-10¹⁰CFU的范围内；例如大约10⁹CFU。

细菌菌株(优选一种或多种死/灭活菌株、一种或多种菌株裂解物)；一种或多种菌株代谢物的浓度,相对于局部组合物可以在0.001％(w/w)至20％(w/w)的浓度范围内；例如在0.01％(w/w)至18％(w/w)的范围内；例如在0.1％(w/w)至15％(w/w)的范围内；例如在0.5％(w/w)至10％(w/w)的范围内；例如在1％(w/w)到5％(w/w)的范围内。

本文定义的细菌菌株可以以死细菌菌株的形式提供在根据本发明的组合物中。死细菌菌株可以作为完整死细胞或作为从死细胞获得的裂解物、代谢物、衍生物、类似物、馏分或提取物提供。

在本发明的一个实施方案中，一种或多种细菌菌株可以作为一种或多种活菌株、一种或多种死菌株或灭活菌株、一种或多种菌株裂解物；一种或多种菌株代谢物或其组合来提供。

优选地，菌株裂解物可以通过酸处理，例如使用HCl，和/或通过超声处理提供。

在组合物中，根据本发明的细菌菌株可以作为一种或多种活菌株、一种或多种死菌株或灭活菌株、一种或多种菌株裂解物；一种或多种菌株代谢物；一种或多种类似物、一种或多种片段、一种或多种衍生物、一种或多种突变体或其组合(裂解物所在)提供；一种或多种菌株代谢物；一种或多种类似物、一种或多种片段、一种或多种衍生物、一种或多种突变体或其组合(如从本发明的细菌菌株中获得的)可以治疗；缓和；抑制；预防；和/或防止至少一种病原微生物的生长，例如，痤疮丙酸杆菌菌株。

痤疮丙酸杆菌是人类肠道微生物群的正常栖息者，并定植于肠道。因此，致病核糖型的肠道定植也可能影响皮肤微生物群，因此具有抗痤疮丙酸杆菌活性的益生菌可以有利地用作口服组合物。

在本发明的一实施方案中，其中组合物可以是局部组合物和/或口腔组合物，优选组合物是局部组合物。

在本发明的一实施方案中，其中组合物可以是局部组合物和/或口腔组合物，优选组合物是口腔组合物。

在本发明的实施方案中，组合物可以具有酸性pH值，优选组合物的pH值为pH6.5或更低；例如pH 6或以下；例如pH 5.5或以下；例如pH 5或以下；例如pH 4.5或以下；例如在pH4-6.5的范围内；例如在pH 4.5-6.0范围内；例如在pH 4.7-5.5的范围内。

在本发明的又一实施方案中，组合物在施用于表面例如人的皮肤时可导致表面(皮肤)的酸性pH值，优选pH值为pH6.5或以下；例如pH 6或以下；例如pH 5.5或以下；例如pH5或以下；例如pH 4.5或以下；例如在pH 4-6.5的范围内；例如在pH 4.5-6.0范围内；例如在pH 4.7-5.5的范围内。

根据本发明的组合物可优选包含药学上或化妆品可接受的载体或赋形剂。在本发明的实施方案中，组合物可以以固体形式、液体形式、粘性形式、乳液或作为干燥形式提供。

口服组合物可优选配制成糊剂、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、粉剂、滑石粉、颗粒剂、珠粒、锭剂、泡腾片、锭剂、***片、咀嚼片、舌下片剂、油、液体、溶液、酊剂、乳剂、果汁、浓缩物、糖浆、喷雾剂、雾剂、饮用安瓿、凝胶、口香糖、片剂、包衣药丸或作为食物或饲料产品或饮料。

用于局部应用的组合物可优选配制成糊剂；滑石粉；一种粉末；乳液；蛋羹(custard)；泡沫；奶油；油、血清或软膏。

在本发明的一实施方案中，局部组合物可以是包含水合硅酸镁(滑石)和至少一种本发明的细菌菌株的粉末组合物。

在根据本发明的进一步实施方案中，用于局部施用的粉末组合物包含水合硅酸镁、至少一种碳水化合物和至少一种本发明的细菌菌株。

在优选的实施方案中，局部组合物可以配制成洗剂；蛋羹；泡沫；奶油；软膏、油、血清、凝胶或乳液。

在优选的实施方案中，局部组合物是植物油。

在优选的实施方案中，治疗是局部组合物和包含本发明细菌菌株的口腔组合物的联合治疗。

除了根据本发明的细菌菌株之外，该组合物可以，进一步包含其他益生菌、益生元、抗微生物剂、抗生素或其他活性抗菌物质和/或优选还可以含有一种或多种选自以下物质：抗氧化剂、维生素、辅酶、脂肪酸、氨基酸和辅助因子。

在本发明的另一实施例中，根据本发明的细菌菌株可以与：

-治疗有效剂量的抗生素。作为联合治疗或抗生素治疗后；

-治疗浓度的抗生素，包括但不限于：夫西地酸；万古霉素；庆大霉素；苯唑西林；四环素；呋喃妥因；氯霉素；氯林可霉素；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑；头孢菌素抗生素家族的成员(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢克肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、氯碳头孢等)；青霉素抗生素家族的成员(例如氨比西林、阿莫西林/克拉维酸盐(Clavulanate)、巴坎西林、氯唑西林、青霉素VK等)；与氟喹诺酮类抗生素的成员(例如，环丙沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星、曲伐沙星等)；或大环内酯类抗生素家族的成员(例如，阿奇霉素、红霉素等)；

-治疗有效剂量的抗炎药。作为联合治疗或治疗后；和/或

-治疗浓度的抗炎药。

在本发明的实施例中，该组合物可以是药物、兽医或食品或食品补充剂或食品补充剂组合物。组合物(优选用于口服给药)可优选包含一种或多种增稠剂，和/或一种或多种甜味剂和/或一种或多种人造甜味剂，其中增稠剂优选选自纤维素醚、多糖，选自包括以下的组：黄原胶、明胶、高度分散的二氧化硅、淀粉、卡拉胶、藻酸盐、黄芪胶、琼脂、***树胶、果胶和聚乙烯酯，甜味剂选自包含以下的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖浆、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甜菊糖甙、糖精、甜蜜素、安赛蜜K和/或阿斯巴甜。

本发明意义上的优选食品和营养补充剂可包括泡腾片、维生素片、膳食补充剂、矿物质片、微量元素片、饮料粉、饮料、果汁、乳饮料、酸奶、矿泉水、非碳酸水、糖果、咀嚼片、果汁或糖浆、包衣药丸和锭剂以及气雾剂。

此外，该组合物还可包含助洗剂、酶、电解质、pH调节剂、增稠剂、益生元、荧光增白剂、灰化抑制剂、泡沫调节剂和/或着色剂。

现有技术中没有公开使用益生菌菌株来预防或治疗由痤疮丙酸杆菌的致病核糖型引起的特定致病性痤疮感染的感染。

完全令人惊讶的是，可以鉴定出一组具有相同优势特性的乳酸菌。无细菌，特别是无乳酸菌，结合治疗；缓和、抑制；预防；和/或防止病原微生物的生长这些特性，同时也是非致病性的，不会对皮肤或微生物群造成任何损害或影响。

应当理解，在下文中，与本发明的一个宽泛方面相关的优选实施例同样适用于上述本发明的其他宽泛方面中的每一个。将进一步理解的是，除非上下文另有说明，否则可以组合以下描述的优选实施例。当在本文中使用时，术语局部包括指适用于身体表面(例如皮肤或粘膜)的制剂。

本发明的实施例涉及根据本发明的用于治疗；缓和、抑制；预防和/或防止病原微生物的生长的组合物。

本发明的一实施方案涉及根据本发明的组合物用于治愈由细菌感染引起的疤痕和伤口。

更优选地，本发明可提供本文定义的组合物，用于治疗、缓和、抑制；预防哺乳动物中的一种或多种病原性细菌感染。

更优选地，本发明可以提供用于防止病原微生物生长的本文定义的组合物。

细菌感染可以优选是哺乳动物的痤疮丙酸杆菌感染。

本发明的一实施方案涉及用于治疗；缓和；抑制；和/或预防由痤疮丙酸杆菌感染引起的疾病的如本文所定义的组合物。

在本发明的另一实施方案中，组合物包含至少一种细菌菌株(或其裂解物、代谢物、衍生物、类似物、馏分或提取物)以治疗由痤疮丙酸杆菌引起的皮肤感染。

优选发明的实施方案涉及用作预防或医学治疗痤疮丙酸杆菌感染的组合物。

微生物可以有利地以活的或杀死的/死亡的形式存在于组合物中。细菌菌株可以以包封的、微包封的、喷雾干燥的和/或冻干的形式提供。此外，细菌菌株可以以细胞裂解物、代谢物、衍生物、类似物、馏分或提取物的形式提供。

微生物可以有利地以活的形式存在于组合物中。细菌菌株可在油制剂中以包封的、微包封的、喷雾干燥的和/或冻干的形式提供。

在本发明的优选实施例中，油是选自杏仁油、***油(hemp oil)、CBD油、***油(cannabis oil)、月见草油、琉璃苣油、杏仁甜油、玫瑰果油、荷荷巴金油、荷荷巴油、洋甘菊油、金盏花油、沙棘油、红花油和芝麻油。

在本发明的优选实施例中，组合物包含选自杏仁油、***油、CBD油、***油、月见草、琉璃苣油、杏仁甜油、玫瑰果油、荷荷巴金油、荷荷巴油、洋甘菊油、金盏花油、沙棘油、红花油和/或芝麻油中的至少一种。

在本发明的优选实施方案中，组合物包含至少10％(w/w)的荷荷巴油或荷荷巴蜡或荷荷巴金油。

在本发明的实施例中，相对于局部组合物，细菌菌株可以按重量计0.001％(w/w)至20％(w/w)的量存在于组合物中；例如在0.01％(w/w)至18％(w/w)的范围内；例如在0.1％(w/w)至15％(w/w)的范围内；例如在0.5％(w/w))至10％(w/w)的范围内；例如在1％(w/w)到5％(w/w)的范围内。

本发明的优选实施方案涉及每天施用大约1×10³至1×10¹⁴CFU的活细菌，更优选地大约1×10⁴至1×10¹⁰，最优选地每天大约5×10⁴至1×10⁹CFU的活细菌。当待治疗的病症涉及抗生素抗性病原体并且患者是成年人时，典型剂量为每天大约1×10²至1×10¹⁴CFU的活细菌，优选大约1×10⁸至1×10¹⁰，更优选大约2.5×10⁸至1×10¹⁰CFU每天存活的细菌。

本发明涉及新的细菌菌株，以及权利要求中的一般参考涉及活细胞、死的/杀死细胞和裂解物、代谢物、衍生物、类似物、馏分或提取物以及包含这些活细胞、死/死细胞和裂解物、代谢物、衍生物、类似物，馏分或提取物的组合物。

本发明的组合物可适用于治疗；缓和，抑制；预防；和/或预防病原微生物的生长，例如痤疮丙酸杆菌，这些存在于儿童、青少年、健康人、妇女、老年人、免疫抑制人群、单发或复发性痤疮丙酸杆菌感染者和/或使用抗生素的耐药细菌感染的人群中。

因此，本发明的组合物可用于制备有益于治疗或预防痤疮丙酸杆菌生长的药物。在本发明的实施方案中，该组合物可用于治疗或预防，例如与益生菌和/或益生元组合物组合。

根据本发明的组合物和益生菌菌株的组合提供了一种组合组合物，与没有细菌菌株的生长相比，该组合物能够通过将痤疮丙酸杆菌的生长降低至少50％来抑制共培养中痤疮丙酸杆菌的生长。其中生长以痤疮丙酸杆菌的菌落形成单位来衡量。

在本发明的实施方案中，本文定义的细菌菌株可以是组合物中存在的唯一细菌。仅包含如本文定义的细菌菌株的组合物显示与没有细菌菌株的生长相比，痤疮丙酸杆菌的生长减少至少50％。

在本发明的另一实施方案中，如本文所定义的一种或多种细菌菌株构成组合物的总细菌含量的至少10％(w/w)；例如至少25％(w/w)；例如至少50％(w/w)；例如至少75％(w/w)；例如至少85％(w/w)；例如至少90％(w/w)；例如至少95％(w/w)；例如至少98％(w/w)；例如至少100％(w/w)。

与不存在本发明的细菌菌株的生长期相比，生长的“减少”可以是“统计显著的”，并且可以包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少。

在本发明的一实施例中，生长抑制可以被确定为生长减少至少25％。优选地，生长抑制被确定为生长减少至少50％。甚至更优选地，生长抑制被确定为生长减少至少90％。

与不存在本发明细菌菌株的情况下的CFU/ml数量相比，微生物数量的“减少”可以是“统计显著的”，并且可以包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.9％或100％减少。

微生物的数量测量为菌落形成单位CFU/ml。

根据本发明的微生物可以优选为分离的或纯化的形式，其中术语“分离的”特别是指乳酸菌源自它们的培养基，包括例如它们的天然培养基。术语“纯化”不限于绝对纯度。

在本发明的实施方案中，益生菌菌株可用作稳定形式的活的分离微生物。用于稳定的合适方法是本领域技术人员已知的并且包括涉及不同冷冻保护剂的冷冻干燥或冻干。

在本发明的另一实施方案中，菌株可用作活的分离菌株。

优选地，该菌株可以用作活的分离的稳定菌株。甚至更优选地，该菌株可以用作通过冻干稳定的活的分离菌株。甚至更优选地，该菌株可以用作通过冻干稳定并包含冷冻保护剂的活的分离菌株。

本发明涉及存活和/或死亡(被杀死)的细菌菌株，两种形式都可以包括在本发明的范围内。

合适的杀灭方法(例如，生物、化学或物理杀灭方法)是本领域技术人员非常熟悉的。然而，在本案中，细菌菌株也可以冻干形式使用。微生物的杀死形式可以包括发酵液和任何存在的代谢物。

术语“杀死的”或“死亡的”涉及不能进行细胞***并且没有任何代谢活性的灭活的乳酸菌。死亡或被杀死的乳酸菌可能具有完整或破裂的细胞膜。

“裂解物”、“衍生物”、“类似物”、“馏分”或“提取物”可以从死亡或杀死的乳酸菌中获得。这些裂解物、馏分、衍生物、类似物和提取物优选具有减少病原微生物在第一受试者的表面和第二受试者的表面之间转移的特性，其中“裂解物”以及术语“提取物”特别是指根据本发明的微生物细胞在水性介质中的溶液或悬浮液，并且包括例如大分子，例如DNA、RNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物等以及细胞碎屑。裂解物优选包括细胞壁或细胞壁成分，包括结合受体。生产裂解物的方法是本领域技术人员众所周知的，包括例如使用“法式压榨”或酶促裂解、具有玻璃珠或铁珠的球磨机。细胞可以通过酶促、物理或化学方法破碎。酶促细胞裂解的实例可包括单独的酶以及酶混合物，例如蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶、糖苷酶；化学裂解可能由离子载体、去污剂(如SDS)、酸或碱诱导；物理方法也可以通过使用高压来实施，例如法式压滤器、渗透压、温度或冷热交替。此外，当然可以组合化学、物理和酶促方法。

在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和/或细菌菌株适用于治疗；缓和、抑制；预防与哺乳动物病原微生物感染相关的疾病。

本发明还涉及一种减少痤疮感染患者皮肤上的痤疮丙酸杆菌数量的方法。

在本发明的实施例中，包含至少一种细菌菌株的组合物可用于将炎症性皮肤病患者皮肤上痤疮丙酸杆菌的数量控制在痤疮丙酸杆菌不会导致皮肤感染一定水平。

在本发明的又一实施方案中，包含至少一种细菌菌株的组合物可用于控制患有炎症性皮肤病的患者皮肤上痤疮丙酸杆菌的数量，其中痤疮丙酸杆菌的水平低于约10⁷CFU/cm³的皮肤。

本领域技术人员将清楚，这里以及在本发明中给出的范围的所有陈述中，以诸如“大约(about)”或“大约(approximately)”等术语为特征，不需要指明精确的数值范围，但是，即使是关于所指示的数字的向上或向下的微小偏差仍然在本发明的范围内。在本发明的实施例中，次要偏差可以包括5％或更少的偏差，例如4％或更少的偏差，例如4％或更少的偏差，例如3％或更少的偏差，例如2％或更少的偏差，例如1％或更少的偏差。

在本发明的实施方案中，可以提供一种或多种本发明的细菌菌株的生物学纯培养物。

术语“有效量”可能取决于其应用的上下文。在施用组合物以降低痤疮丙酸杆菌感染的风险和/或施用组合物以降低受试者中痤疮丙酸杆菌感染的严重性和/或减少痤疮丙酸杆菌的量的情况下，本文所述组合物的有效量是足以治疗和/或改善痤疮丙酸杆菌感染以及降低痤疮丙酸杆菌感染的严重性和/或降低其可能性的量。受试者中致病性痤疮丙酸杆菌量的减少可以是痤疮丙酸杆菌感染的严重程度或被感染的可能性减少10％、减少20％、减少30％、减少40％、减少50％、减少60％、减少70％、减少80％、减少90％、减少95％、减少98％、减少99％或减少99.9％。

有效量可以在一次或多次给药中作为组合物给药。

有效量的组合物可以作为局部给药、口服给药或其组合给药。优选作为局部给药。

在本发明的一实施方案中，组合物包含至少一种根据本发明的细菌菌株和益生元。

“益生元”是不易消化的食物成分，可促进特定微生物的生长。“合生元”是包含至少一种益生菌和至少一种益生元的组合物。此类组合物被理解为促进有益细菌(例如益生菌)的生长。因此，强大的合生元是基于益生菌的特定菌株与精心挑选的益生元的组合。它们可以为哺乳动物带来重要的健康益处。

根据本发明的另一方面，提供了包含益生菌微生物和至少一种更多活性成分的益生菌组合物。

益生元是指诱导共生微生物(例如细菌和真菌)生长和/或活动的化学产品，这些微生物有助于宿主的健康。益生元是不可消化的碳水化合物，它们未经消化就通过胃肠道的上部，并刺激定植于大肠或皮肤微生物的有益细菌的生长和/或活性。

一些用作益生元的低聚糖是低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)、聚葡萄糖、果胶、低聚半乳糖(GOS)或人乳低聚糖(HMO)。此外，双糖如乳果糖或一些单糖如乳糖或塔格糖也可用作益生元。

在本发明的实施方案中，至少一种益生元化合物可包含在本发明的组合物中。在一个非常广泛的概念中，益生元是所有可以被益生菌代谢的化合物。

优选地，益生元是哺乳动物不可消化的或难以消化的。据信，益生元(其中许多是不易消化的碳水化合物)促进益生菌的生长。益生元天然存在于例如卷心菜、洋葱、全谷类、香蕉、大蒜、蜂蜜、韭菜、洋蓟、强化食品和饮料以及膳食补充剂中。益生元是本领域众所周知的，并且当用于本发明时，对益生元本身没有特别限制。

然而，在实施例中，组合物中的至少一种益生元产品选自以下化合物和组合物：不易消化的碳水化合物、β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、低聚果糖、人乳低聚糖(HMO)、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、低聚果糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖(glycosilsucrose)、甜菜碱、维生素E或其变体(其中变体选自α、β、γ、δ生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)。任选地，可以优选甘露寡糖和/或菊粉。HMO可能包括乳-N-四糖、乳-N-岩藻糖五糖、乳-N-丙糖、3'-唾液酸乳糖、乳-N-新岩藻糖五糖、唾液酸、L-岩藻糖、2-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、乳-N-新四糖和3-岩藻糖基乳糖。

益生元也可用于本发明的局部组合物中。

在一实施方案中，至少一种以下益生元化合物用于本发明的局部组合物中；乳糖、β-葡聚糖、甘露寡糖、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、低聚乳果糖、半乳三糖、低聚果糖(FOS)、纤维二糖、纤维糊精、环糊精、麦芽糖醇、乳糖醇、葡糖基蔗糖、甜菜碱、维生素E或其变体(其中变体选自α、β、γ、δ生育酚、生育三烯酚和生育单烯酚)、乳-N-四糖、乳-N-岩藻糖五糖、乳-N-丙糖、3'-唾液酸乳糖、乳-N-新岩藻糖五糖、唾液酸、2-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、乳-N-新四糖和3-岩藻糖基乳糖。任选地，可以优选乳糖和/或甘露寡糖和/或菊粉。

D-和L-岩藻糖加强皮肤的天然防御，刺激表皮免疫防御和/或预防和/或治疗皮肤自身免疫疾病。在本发明的实施方案中，组合物包含D-或L-岩藻糖。

在本发明的一实施方案中，组合物进一步包含组合物中浓度为10mM至500mM的L-岩藻糖。

根据所描述的优选实施方案中的更进一步特征，该组合物进一步包含至少一种活性成分。

在本发明的一实施例中，组合物包含至少一种本发明的细菌菌株与至少一种选自另一种细菌、酵母或霉菌的其他益生菌微生物的组合。

根据本发明的组合物可以包含至少一种根据本发明的细菌菌株与至少一种另外的益生菌微生物的组合，其中所述至少一种另外的益生菌微生物可以选自但不限于：乳双歧杆菌DSM10140、乳双歧杆菌LKM512、乳双歧杆菌DSM20451、两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、来自Zaidanhojin Nihon Bifizusukin Senta(日本双歧杆菌中心)的长双歧杆菌BB-536，EP2823822中描述的双歧杆菌NCIMB 41675。可从DuPontNutrition Biosciences ApS获得的两歧双歧杆菌BB-225、青春双歧杆菌BB-102、短双歧杆菌BB-308、乳双歧杆菌HN019(Howaru)，可从Groupe Danone获得的乳双歧杆菌DN 173 010，可从Chr.Hansen A/S,获得的乳双歧杆菌Bb-12,可从DuPont Nutrition Biosciences ApS获得的乳双歧杆菌420，短双歧杆菌Bb-03、乳双歧杆菌BI-04、可获自DuPont NutritionBiosciences ApS的乳双歧杆菌Bi-07、，两歧双歧杆菌Bb-02、两歧双歧杆菌Bb-06、长双歧杆菌KC-1和长双歧杆菌913(DuPont Nutrition Biosciences ApS)、短双歧杆菌M-16V(森永，Morinaga)和/或具有益生菌作用的乳杆菌，并且可以是以下任何菌株；鼠李糖乳杆菌LGG(Chr.Hansen)、嗜酸乳杆菌NCFM(DuPont Nutrition Biosciences ApS)、保加利亚乳杆菌1260(DuPont Nutrition Biosciences ApS)、类干酪乳杆菌Lpc-37(DuPont NutritionBiosciences ApS)、可获自DuPont Nutrition Biosciences ApS的鼠李糖乳杆菌HN001(Howaru)、可获自DuPont Nutrition Biosciences ApS的嗜热链球菌715和嗜热链球菌ST21，类干酪乳杆菌亚种，类干酪CRL431(ATCC 55544)，来自Medipharm,Inc.的类干酪乳杆菌菌株F-19，类干酪乳杆菌LAFTI L26(DSM Food Specialties，荷兰)和类干酪乳杆菌CRL431(Chr.Hansen)、嗜酸乳杆菌PTA-4797、唾液乳杆菌Ls-33和弯曲乳杆菌853(DuPontNutrition Biosciences ApS)。芬兰专利92498,Valio Oy中描述的类干酪乳杆菌鼠李糖亚种LC705、乳杆菌DSM15527(Bifodan)、乳杆菌DSM15526(Bifodan)、描述于美国专利5,032,399的鼠李糖乳杆菌GG(LGG)(ATCC53103)和鼠李糖乳杆菌LC705(DSM7061)、丙酸细菌(例如，费氏丙酸杆菌谢氏亚种)PJS(DSM 7067)更详细地描述于芬兰专利92498,Valio Oy中、亚硝化单胞菌D23(ABIome)、人葡萄球菌A9、C2、AMT2、AMT3、AMT4-C2、AMT4-Gl和/或AMT4-D12(均来自Matrisys Bioscience)、表皮葡萄球菌菌(Staphylococcus epidermidis)M034、M038、All、AMT1、AMT5-C5和/或AMT5-G6(均来自Matrisys Bioscience)、植物乳杆菌YUN-V2.0(BCCM LMG P-29456)、戊糖乳杆菌YUN-V1.0(BCCN LMG P-29455)、鼠李糖乳杆菌YUN-S1.0(BCCM LMG P-2961)、绿色魏斯氏菌LB10G(DSM 32906)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LB113R(DSM 32907)、植物乳杆菌LB244R(DSM 32996)、类干酪乳杆菌LB116R(DSM 32908)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)LB276R(DSM 32997)、植物乳杆菌LB316R(DSM33091)、植物乳杆菌LB356R(DSM 33094)、植物乳杆菌LB312R(DSM33098)和/或其任何组合。

在本发明的实施方案中，组合物包含至少一种如本文定义的细菌菌株与至少一种选自能够改善紧密连接完整性的乳酸菌的菌株的组合。

在本发明的另一实施方案中，组合物包含至少一种如本文所定义的细菌菌株与至少一种选自由以下组成的组的菌株结合：鼠李糖乳杆菌LGG(Chr.Hansen)、嗜酸乳杆菌NCFM(杜邦)、唾液乳杆菌的Ls-33(杜邦)、詹氏丙酸杆菌P63(杜邦)、乳双歧杆菌420(杜邦)和嗜酸乳杆菌La-14(杜邦)；和/或益生菌菌株的细胞裂解物和/或可溶性代谢物。

如本文所用，并且如本领域所熟知，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。出于本主题的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病的预防、延迟或减缓疾病进展，和/或改善或缓解疾病状态。

降低可以是并发症或症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。

在本发明的一实施例中，可以提供一种处理哺乳动物皮肤的方法。该方法包括向有需要的受试者(例如哺乳动物)施用治疗有效量的至少一种细菌菌株，从而治疗皮肤以减少定植和/或携带者水平和/或感染。

在本发明的另一实施方案中，皮肤定植可由抗生素抗性微生物引起。皮肤定植可能是由抗性痤疮丙酸杆菌引起的。

本发明可以提供几个优点。特别是，由于可能产生抗性微生物种类而对抗痤疮产品的使用产生不利影响，因此需要进行不使用常规抗微生物剂的抗微生物处理。因此，本发明无助于产生后代的抗生素抗性病原体。

本发明可以提供几个优点。尤其是，由于抗痤疮产品的使用会导致皮肤显著干燥，因此在使用抗痤疮产品时会产生不利影响，因此需要进行不引起任何皮肤干燥的抗微生物处理。因此，本发明不会导致皮肤干燥。

本发明可以提供几个优点。特别是，由于可能引起皮肤刺激和/或炎症，因此对使用抗痤疮产品有不利影响，期望具有不会引起皮肤刺激或进一步炎症的抗微生物处理。

本发明可以提供几个优点。特别是，由于由此产生的皮肤变色(色素沉着)和阳光敏感性，对使用抗痤疮产品有不利影响，需要进行不引起皮肤任何变色或对阳光敏感的抗微生物处理。因此，本发明不会导致着色或阳光敏感性。本发明的另一个优点是本发明减少了色素沉着和变色的出现，作为对痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性的进一步益处。

本发明的优选实施方案涉及用作药物的包含根据本发明的组合物的药物组合物。

此外，本发明的一个优选实施方案涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的组合物，以用于治疗；缓和，抑制；预防；和/或防止病原微生物的生长。

此外，本发明的优选实施方案涉及包含根据本发明的组合物的药物组合物，所述组合物包含能够共聚集一种或多种痤疮丙酸杆菌菌株用于治疗；缓和、抑制；预防；和/或预防寻常痤疮的一种或多种细菌种类。

本发明的又一实施例涉及一种治疗；缓和、抑制；预防；和/或防止病原微生物的生长的方法，特别是一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株，例如，哺乳动物例如人中的寻常痤疮，该方法包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本文定义的包含一种或多种细菌种类的组合物，例如一种或多种本文定义的乳酸菌，例如一种或多种选自由以下组成的组的细菌菌株：

-LB356R(植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏)

-LB244R(植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏)

-LB349R(肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏)

-LB10G(绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏)。

因此，本发明的一方面涉及新的分离的细菌菌株和/或包含一种或多种细菌菌株的组合物，其对致病性痤疮丙酸杆菌具有抗微生物活性。

本发明的另一方面涉及具有针对致病性痤疮丙酸杆菌的生长抑制活性的新分离细菌菌株。

本发明的另一方面涉及能够与致病性痤疮丙酸杆菌共聚集的新的分离细菌菌株。

本发明的另一方面涉及包含具有抗病原性痤疮丙酸杆菌的抗微生物活性和/或生长抑制活性和/或共聚集活性的细菌菌株的组合物。

本发明的又一方面是提供组合物的用途，所述组合物包括对致病性痤疮丙酸杆菌具有抗微生物活性和/或生长抑制活性和/或共聚集活性的细菌菌株。

本发明的另一方面是提供一种用于治疗由痤疮丙酸杆菌引起的感染的组合物。

生物材料的保藏

以下生物材料，微生物，已存放在德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollection for Microorganisms and Cell Cultures)：

植物乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏

植物乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏

肠膜明串珠菌LB349R，以DSM33093保藏

绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏。

应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用整体并入本文。

现在将在以下非限制性示例中更详细地描述本发明。

示例

例1菌株筛选鉴定

样品

为了鉴定和选择根据本发明的细菌菌株，建立乳酸菌(LAB)菌株集合。收集了来自不同来源的样本，例如自制酸菜、泡菜和健康人类供体样本(***、口腔、***、皮肤)，以分离至少995种乳酸菌。在Man Rogosa Sharp(MRS,Sigma-Aldrich)培养液和琼脂培养基上收集样品，在37℃下厌氧培养过夜或直至菌落形成。将分离物铺板并传代培养，直到获得纯菌落。纯菌落在-80℃下储存在含有25％甘油的MRS培养液中以备将来使用。使用16S rRNASanger测序标准方法鉴定菌株。

示例2-共同聚合

从BEI资源获得的痤疮丙酸杆菌菌株用作筛选的研究测试生物。

痤疮丙酸杆菌ATCC 6919(美国模式培养物集存库，America Type CultureCollection)用作痤疮丙酸杆菌的分型菌株。

在所有实验中都使用鼠李糖乳杆菌LGG(Chr.Hansen)作为对照益生菌菌株，和含有活乳酸菌的YUN产品ACN+乳膏(YUN Probiotherapy，网上商店：www.shop.yun.be)用作局部使用的市售益生菌乳酸菌的对照。如示例中所述，鼠李糖乳杆菌LBB和YUN菌株在MRS上作为LAB生长。

根据已知方法Cisar,J.O.et al.(1979)“Specificity of CoaggregationReactions between Human Oral Streptococci and Strains of Actinomyces Viscosusor Actinomyces Naeslundii”Infection and Immunity 24(3):742-52确定共聚集。所有乳酸菌(LAB)的接种物在MRS培养液中厌氧生长过夜，并且痤疮丙酸杆菌菌株在BHI培养液中在37℃下厌氧生长至细胞密度约为10⁸CFU/ml(2-3天)。通过离心(转速6000rpm，时间为2分钟)收获过夜细胞样品，并从沉淀中去除上清液。沉淀在1XPBS缓冲液中洗涤两次。

将细胞沉淀重悬在1XPBS中，将500μl痤疮丙酸杆菌和LAB菌株等分到24孔板中。将板在振荡器(200rpm)上温育。在1小时、2小时、3小时和24小时后目视观察自聚集和共聚集的形成。

作为自聚集(auto-aggregation)的对照，每个菌株在每孔中以1500ul的终体积与PBS混合。

通过混合痤疮丙酸杆菌和LAB菌株来确定共聚集。每个菌株悬浮在PBS缓冲液中，并在每孔中以1500ul的终体积1:1混合。

将板在振荡器上以大约200rpm的速度温育24小时。在1小时、2小时、3小时和24小时后观察到共聚集形成。

共聚集的形成使用以下等级从1-5目视评分：

1：无聚合

2：可视化初始聚合

3：聚集体的形成<0.5mm

4：聚集体的形成>0.5mm和<1mm

5：聚集体的形成>1mm

表1：使用从1到5的视觉评估测量共聚集(见上面的等级)。显示1小时和24小时孵育的数据

34个LAB菌株被鉴定为能够与致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集，在表1中列出了4个菌株(LB10G、LB244R、LB349R和LB356R)的共聚集体，与非致病性核糖型(RT6)相比，这些菌株与痤疮丙酸杆菌的致病性核糖型(RT4、RT5和RT8)相对更多地共聚集。

ATCC型菌株在测试中的表现一般略有不同，该菌株也更容易生长，并且可以在BHI中厌氧生长过夜至OD(600)>1。

来自YUN的商业产品中的对照LGG和菌株未显示任何与痤疮丙酸杆菌共聚集的能力。

共聚集可以抑制生物体的生长并影响产生生物膜的能力。因此，能够与痤疮丙酸杆菌共聚集的LAB可以抑制生物膜形成并降低痤疮菌株的毒力。

示例3–pH值对共聚集的影响。

根据如上所述的已知方法Cisar,J.O.et al.(1979)测定共聚集。

所有乳酸菌(LAB)的接种物在MRS培养液中厌氧生长过夜，并且痤疮丙酸杆菌菌株在BHI培养液中在37℃下厌氧生长至细胞密度约为10⁸CFU/ml(2-3天)。通过离心(转速6000rpm，时间为2分钟)收获过夜细胞样品，并从沉淀中去除上清液。分别在用于共聚集测试的pH调节缓冲液中洗涤小球两次。

从Merck(产品69947)获得的MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)和从Sigma(产品M2933)获得的MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液以100mM的浓度使用。MES用于pH4.5、pH5、pH5.5、pH6和pH6.5。MOPS用于pH6.5、pH7、pH7.5和pH8。

发现与PBS缓冲液相比，惰性缓冲液MES和MOPS中的共聚集略少。MES和MOPS允许评估pH值对广泛pH值范围内共聚集的影响，限制了缓冲液的任何影响。

将每种菌株的细胞沉淀重新悬浮在每种缓冲液中，并将500μl痤疮丙酸杆菌和LAB菌株等分到具有每个pH值的24孔板中。将板在振荡器(200rpm)上温育。在1小时、2小时、3小时和24小时后目视观察自聚集和共聚集的形成。

作为自聚集(auto-aggregation)的对照，每个pH值的每个菌株被包括在孔中1000ul的最终体积中。发现自聚集在不同的pH值下没有显著差异。对于任何测试菌株，均未观察到显著的自聚集。

通过混合痤疮丙酸杆菌和LAB菌株来确定共聚集。每个菌株悬浮在PBS缓冲液中，并在每孔中以1000ul的终体积1:1混合。

共聚集的形成使用以下等级从1-5目视评分：

1：无聚合

2：可视化初始聚合

3：聚集体的形成<0.5mm

4：聚集体的形成>0.5mm和<1mm

5：聚集体的形成>1mm

表2：使用从1到5的视觉评估测量共聚集(见上面的等级)。显示了1小时温育和2个菌株LB244R和LB356R以及致病性痤疮丙酸杆菌HM-513和非致病性痤疮丙酸杆菌HM-554的数据。

对于能够共聚集的菌株，结果通常是相同的。pH值的降低导致共聚集增加。当降低pH值时，4种菌株LB244R、LB356R、LB10G和LB349R都导致共聚集增加。与致病性和非致病性痤疮丙酸杆菌共聚集之间的比率是恒定的，并且似乎不受pH变化的显著影响。因此，在低pH值下，与非致病性痤疮丙酸杆菌相比，菌株与致病性痤疮丙酸杆菌的共聚集量仍然更多。

对照LGG和来自YUN的商业产品中的菌株在任何缓冲液中均未显示出与痤疮丙酸杆菌共聚集的任何能力。

共聚集可以抑制生物体的生长并影响产生生物膜的能力。因此，能够与痤疮丙酸杆菌共聚集的LAB可以抑制生物膜形成并降低痤疮菌株的毒力。因此，这种效果有望在pH值低于7时得到进一步改善。

示例4-草坪上的斑点检测

使用Zhang P.et al.(2015)Interstrain interactions between bacteriaisolated from vacuum-packaged refrigerated beef.Appl Environ Microbiol 81:2753–2761.doi:10.1128/AEM.03933-14和Arena,M.P.et al.(2016)测试了草坪上的生长抑制和抗菌代谢物的现场试验。使用植物乳杆菌菌株作为对抗食源性致病微生物的生物控制策略。Frontiers in Microbiology 7(APR)：1-10.https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00464。

将来自示例1的细菌菌株从储存样品中培养到24孔板中的2mLMRS培养液中。每个痤疮丙酸杆菌测试菌株在约200mL锥形瓶中的BHI培养液中厌氧培养48-72小时(OD600>1)。LAB分离株在37℃下生长过夜。痤疮丙酸杆菌过夜培养物的细胞密度在BHI培养液中调节至600nm处的光密度(OD600)为1，然后在PBS缓冲液中稀释至10^-2稀释度。将200微升细胞悬液涂在BHI琼脂平板上。将带有痤疮丙酸杆菌草坪的平板放置在无菌空气中干燥约10-20分钟。在痤疮丙酸杆菌草坪上发现了3份20μL分离LAB。将板晾干，然后在37℃下厌氧培养48小时。抑菌圈以mm为单位测量，作为斑点周围的清除区，直径测量为斑点的全直径。观察到生长抑制，因为LAB能够在表2中以(+)表示的斑点区域中过度生长痤疮丙酸杆菌菌株。如果痤疮丙酸杆菌菌株能够超过斑点细菌菌株的生长，则未检测到生长抑制，如表2中的(-)所示。

15株能够超过所有痤疮丙酸杆菌菌株，5株LAB菌株被鉴定对痤疮丙酸杆菌具有显著的生长抑制作用，并且在斑点周围具有超过1mm的抑菌圈。

鼠李糖乳杆菌LGG(Chr.Hansen)和Yun产品用作对照商业益生菌菌株。鼠李糖乳杆菌和YUN菌株都不能抑制任何致病性痤疮丙酸杆菌试验菌株的生长，鼠李糖乳杆菌LGG或YUN产品也没有产生任何清除区。

痤疮丙酸杆菌ATCC 6919似乎更容易抑制生长，许多菌株被鉴定为对ATCC 6919具有生长抑制活性,但似乎对致病性分离株(RT4、RT5和RT8)或甚至对非致病性分离株(RT6)没有任何生长抑制活性，

表3：

以类型菌株(痤疮丙酸杆菌ATCC 6919)为目标的点检测，每个菌株测量的抑制剂区具有效果。

*直径是抑制区的三个测量值的平均值。**抑制剂区的长度是从细菌斑点边缘到痤疮丙酸杆菌生长的三个测量值的平均值。

表4以HM-523作为目标菌株的点检测，每个菌株测量的抑制剂区具有效果。*直径是抑制区的三个测量值的平均值。**抑制剂区的长度是从细菌斑点***到HM-523生长的三个测量值的平均值。

表5：生长抑制和抗菌代谢物。抑制区确定为三个测量值的平均值。

示例5-细菌裂解物的评价。

使用3种不同的方法产生细菌裂解物。

LAB分离物(LB356R)在MRS中在37℃生长过夜。

裂解液1：将具有15ml过夜培养物的管置于冰批中，并使用Q125超声仪(QSonica)通过超声处理30分钟来裂解细胞。

裂解液2：用0.1M HCl将15ml过夜培养物调节至pH3，在45摄氏度温育2天。

裂解液3：15ml过夜培养物加入5％SDS(Sigma-Aldrich L3771)并在-20摄氏度下储存1小时，在50摄氏度下温育1小时。将温度从-20度更改为+50度的循环进行了2×8小时。

分别在裂解液处理后评估每种裂解液的活细胞。

通过如示例3中所述测试共聚集的能力来评估裂解物对痤疮丙酸杆菌HM-512的维持活性，并且还通过将每种裂解物与接种HM-512的BHI共温育大约至10⁴CFU/ml来评估生长抑制活性并通过使用分光光度计测量OD(600nm)来跟踪生长和生长抑制。

所有三种裂解物均显示出抑制HM-512的生长。发现裂解物1和2的共聚集与活LB356R细胞相当，而使用示例2中的量表，发现裂解物3的共聚集少于具有3共聚集评分的活细胞。

示例6

菌株LAB菌株LB356R在包含荷荷巴油和杏仁油(1:1)的植物油中配制。以大约10⁸CFU/ml油的浓度添加菌株。

每天一次用该组合物治疗具有易长粉刺皮肤的10名青少年(15-19岁)。痤疮严重程度的视觉评估通过治疗前(图1a)和治疗后(图1b)的图片确定。观察到所有测试人员的视觉改善，并且平均而言，在治疗3-4天后可检测到改善。

示例7：

在由Episkin(Lyon,France)(Batch 19-RHE-164)制造的重建人表皮(RHE)的3D组织模型上测定LAB细胞的抗炎活性。用每种LAB菌株处理RHE细胞。MRS中每个菌株的过夜培养物在盐水中稀释至OD＝0.8并与RHE细胞一起温育4小时。通过TSLP、TNF-a、IL-8、TLR-2和HBD2的qRT-PCR确定基因表达。通过将提取的RNA加载到1％琼脂糖凝胶上来评估RNA的完整性：检测到核糖体条带18S和28s。高容量cDNA逆转录试剂盒用于从RNA合成cDNA。对于实时PCR，使用Applied Biosystems 7500Fast实时荧光定量Taqman PCR检测。GAPDH用作内源性控制基因以标准化输入量。对于所有4种LAB菌株，均观察到显著的HBD2上调。益生菌菌株可有效增强宿主对感染的先天免疫防御。

示例8：

生物膜形成被确定为微生物开始与表面结合并在表面上生长的能力。

所有乳酸菌(LAB)的接种物在MRS培养液中厌氧生长过夜，并且痤疮丙酸杆菌菌株在BHI培养液中在37℃下厌氧生长至细胞密度约为10⁸CFU/ml(2-3天)。通过离心(转速6000rpm，时间为2分钟)收获过夜细胞样品，并从沉淀中去除上清液。沉淀在1XPBS缓冲液中洗涤两次。

将细胞沉淀重悬于BHI培养液中并稀释至细胞浓度约为10⁶CFU/ml。将100μL痤疮丙酸杆菌和100μL LAB菌株分装到96孔板(Sigma细胞培养板SIAL0596-50EA，平底)中。将板在37℃下孵育1小时，使细胞附着在孔的底面。微量滴定板从培养液中倒空，孔底用PBS洗涤一次。

每孔加入200μL无菌BHI培养液，并且表面附着细胞的水平使用每个菌株的标准曲线通过吸光度测量确定，OD测量值(在600nm处检测)与细胞数之间的相关性通过平板计数确定为CFU/ml，并计算为附着的活CFU/孔数。

最初的早期生物膜形成之后使用来自丹麦BioSense解决方案的oCelluScope进行显微镜检查和图像分析。在37℃(厌氧条件下)观察生物膜生长4小时。发现生物膜生长与表面附着细胞的数量直接相关。

对照包括用于LAB的选择性培养基(MRS)，以减少LAB对生物膜的贡献。以及每个痤疮菌株的单一培养生物膜形成的控制。oCelluScope允许进行视觉和图像分析，以根据细胞形态评估生物膜中的主要应变。

表6：初始附着于表面(细胞数附着在孔底部，数量显示为三重测量的平均值)：

	HM-523	HM-513	HM-512	HM-554	HM-555
						No LAB	6.4×10<sup>3</sup>	3.5×10<sup>3</sup>	8.3×10<sup>3</sup>	2×10<sup>2</sup>	4×10<sup>1</sup>
LB10G	3.1×10<sup>1</sup>	3.1×10<sup>1</sup>	3.1×10<sup>1</sup>	3.1×10<sup>1</sup>	3.1×10<sup>1</sup>
						LB244R	1.4×10<sup>1</sup>	1.4×10<sup>1</sup>	1.4×10<sup>1</sup>	1.4×10<sup>1</sup>	1.4×10<sup>1</sup>
LB349R	0.6×10<sup>1</sup>	0.6×10<sup>1</sup>	0.6×10<sup>1</sup>	0.6×10<sup>1</sup>	0.6×10<sup>1</sup>
						LB356R	0.1×10<sup>1</sup>	0.1×10<sup>1</sup>	0.1×10<sup>1</sup>	0.1×10<sup>1</sup>	0.1×10<sup>1</sup>
LGG	2.8×10<sup>3</sup>	3.4×10<sup>3</sup>	4.1×10<sup>3</sup>	3.9×10<sup>1</sup>	7.4×10<sup>1</sup>
						YUN产品	4.7×10<sup>3</sup>	2.1×10<sup>3</sup>	3.4×10<sup>3</sup>	1.3×10<sup>3</sup>	4.8×10<sup>1</sup>

据观察，与致病菌株(HM-523、HM-513和HM-512)相比，非致病菌株(HM-554和HM-555)通常较少附着于表面。当不存在益生菌菌株时，非致病菌株的初始附着水平约为每孔10至500个细胞。而当不存在益生菌菌株时，致病菌株的初始附着约为每孔1000至10000个细胞。LB10G、LB244R、LB349R和LB356R的存在显著抑制了致病菌株的初始附着。因此，观察到这4种益生菌菌株的初始附着减少了2log单位，这种减少是唯一测量到的显著变化。没有观察到两种对照LAB菌株(LGG和YUN)对防止初始附着于表面有任何影响。

参考文献

Fitz-Gibbon et al.2013,J.Invest.Dermatol.133:2152-60.doi:10.1038/jid.2013.21

McDowell et al.2013,PLoS ONE 8(9):e70897

Dreno et al.2018,JEADV 32(suppl.2),5-14.doi:10.1111/jdv.15043

WO 2017/220525

PCT/RO/134表

Claims

1.一种包含一种或多种细菌菌株的组合物，其中与非致病性痤疮丙酸杆菌菌株相比，所述一种或多种细菌菌株对致病性痤疮丙酸杆菌菌株表现出更强的抑制作用。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中抑制是痤疮丙酸杆菌菌株的生长抑制、共聚集抑制、生物膜抑制或其组合。

3.根据权利要求1或2任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种细菌菌株，其能够与一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株共聚集，相对于一种或多种细菌菌株与一种或多种非致病性痤疮丙酸杆菌共聚集的能力而言更强。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的组合物，其中，相对于非致病性痤疮丙酸杆菌菌株的抑制，致病性痤疮丙酸杆菌菌株的抑制强10％或更多，例如强15％或更多，例如强20％或更多，例如强30％或更多，例如强40％或更多，例如强50％或更多，例如强75％或更多，例如强100％或更多，例如强150％或更多，例如强200％或更多，例如强300％或更多。

5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中一种或多种致病性痤疮丙酸杆菌菌株选自痤疮角质杆菌核糖型RT4；核糖型RT5；和/或核糖型RT8。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种菌株为一种或多种乳酸菌株，优选地，所述一种或多种乳酸菌株为乳杆菌菌株；明串珠菌菌株；和/或魏斯氏菌菌株，优选地，细菌菌株是乳杆菌菌株。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述乳杆菌菌株选自天文乳杆菌，优选地，天文乳杆菌选自天文乳杆菌LB356R，以DSM33094保藏或天文乳杆菌LB244R，以DSM32996保藏；或其组合；明串珠菌选自肠膜明串珠菌，优选地，肠膜明串珠菌选自肠膜明串珠菌LB349A，以DSM33093保藏；和/或魏斯氏菌菌株选自绿色魏斯氏菌，优选地，魏斯氏菌选自绿色魏斯氏菌LB10G，以DSM32906保藏。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，共聚集体在1小时内形成聚集体粒径大于0.1mm的聚集体；如0.25mm以上；例如0.5mm以上；如0.75mm以上；例如1.0mm以上；如在0.1-0.5mm范围内；优选地，在0.5-1.0mm的范围内；甚至更优选大于1.0mm。

9.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物是局部组合物(用于局部治疗)或口腔组合物(用于口腔治疗)或直肠组合物(用于直肠治疗)，优选地，该组合物是用于局部治疗寻常痤疮的局部组合物。

10.根据本发明的组合物，其中一种或多种细菌菌株作为一种或多种活菌株提供。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中一种或多种细菌菌株的浓度，优选一种或多种活菌株的浓度可以在10³至10¹⁴个菌落形成单位(CFU)的范围内；如在10⁵-10¹³CFU范围内；例如在10⁶-10¹²CFU的范围内；比如在10⁷-10¹¹CFU的范围内；例如在10⁸-10¹⁰CFU的范围内；例如大约10⁹CFU。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH为pH6.5或更低；例如pH6或以下；例如pH值5.5或以下；例如pH5或以下；例如pH值4.5或以下；例如在pH4-6.5的范围内；例如在pH4.5-6.0范围内；例如在pH4.7-5.5的范围内。

13.一种包含根据权利要求1-12中任一项所述的组合物用作药物的药物组合物。

14.一种药物组合物，包含权利要求1-12任一项所述的组合物，用于治疗、缓和、抑制、预防和/或防止病原微生物的生长。

15.一种药物组合物，包含权利要求1-12任一项所述的组合物，用于治疗、缓和、抑制、预防和/或预防寻常痤疮。